WO2012146865A1 - Nouveaux biomateriaux multiphasiques et procede de fabrication - Google Patents

Nouveaux biomateriaux multiphasiques et procede de fabrication Download PDF

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WO2012146865A1
WO2012146865A1 PCT/FR2012/050895 FR2012050895W WO2012146865A1 WO 2012146865 A1 WO2012146865 A1 WO 2012146865A1 FR 2012050895 W FR2012050895 W FR 2012050895W WO 2012146865 A1 WO2012146865 A1 WO 2012146865A1
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WO
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sodium alginate
solution
biomaterial
crosslinking
airbrush
Prior art date
Application number
PCT/FR2012/050895
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Laurent Jacques GROSSIN
Jean-Claude Voegel
Gilbert SCHAAF
Pierre GILET
Christel Odette HENRIONNET
Patrick Netter
Original Assignee
Universite De Lorraine
Centre National De La Recherche Scientifique
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Publication date
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    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
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    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/24—Materials or treatment for tissue regeneration for joint reconstruction

Definitions

  • the present invention describes novel crosslinked sodium alginate-based filler materials for medical applications and in particular for filling tissue lesions having an organization in layers of variable compositions, such as cartilage, skin , or the epithelium.
  • These new biomaterials have the peculiarities of being multiphase, composite and functionalized, for a medical use and in particular for the treatment of tissue lesions presenting an organization in layers of variable compositions.
  • These biomaterials are particularly suitable for the treatment of focal lesions of articular cartilage.
  • the method of manufacturing these new biomaterials, implementing different steps of crosslinking of the sodium alginate solution and a very particular method of depositing the different layers, is detailed.
  • the different medical applications of these new multiphasic, composite and functionalized biomaterials are also described.
  • cartilaginous tissue of replacement or filling One of the major issues in the treatment of articular cartilage lesions is essentially the creation of a multiphasic cartilaginous tissue of replacement or filling.
  • the treatment of cartilaginous lesions is currently approached surgically according to several axes including bone stimulation (microfracture surgery for example), mosaic plasty, periosteum or perichondrial grafts, autografts and osteochondral allografts, as well as repair-based procedures. cells (transplantation of autologous chondrocytes for example).
  • the goal of bone stimulation techniques is to repair joint damage through arthroscopy.
  • the lesion area to be filled and / or regenerated is perforated to expose the underlying bone.
  • the subchondral bone is also perforated to generate a blood clot within the injured portion that contains potential mesenchymal stem cells precursors of bone cells and cartilaginous.
  • One of the potential disadvantages of these methods is inadequate filling of the chondral cavity.
  • the filling fabric obtained is often fibrocartilage which has less good mechanical properties than hyaline cartilage. In this case it takes about 8 weeks for the blood clot to turn into fibrous tissue and it takes 4 months to become fibrocartilage. This is not without impact for rehabilitation and there is a significant risk that the symptoms will reappear 2 to 3 years after the initial operation.
  • Plasma mosaic involves small cylindrical bone rods covered with healthy cartilage being removed from a non - bearing area of the joint by arthroscopy. Small holes are then made at the site of the lesion of the cartilage to be treated. Cylindrical rods bearing healthy cartilage fit perfectly into the cavities thus formed. This technique is only possible with lesions not exceeding 2 to 3 cm 2 because it is conceivable to remove only a very limited amount of healthy osteochondral tissue.
  • the disadvantage of this technique is the possibility of problems of histocompatibility and ethics.
  • the cell-based techniques (ACI for Autologous Chondrocyte Implantation or implantation of autologous chondrocytes) are based on the principle of replacement of articular cartilage damaged by autologous cartilage of the same type.
  • the disadvantage of this technique is the generation of fibrocartilage or, in the best case, a combination of hyaline tissue and fibro-cartilaginous tissue, this being due to the absence of "guardian materials".
  • chondrocyte implantation procedures are cell - based repair procedures aimed at generating more functional hyaline neo - tissues. During the surgical procedure, chondrocyte cells are injected and applied to the damaged area in combination with a membrane (periosteum). Each of these procedures has advantages and disadvantages.
  • the patent application published under the number WO 2010/116321 Describes a process for obtaining a composite calcium phosphate foam comprising the steps of: forming a polymeric foam by stirring or blowing of gas in an aqueous polymer solution comprising gelatin, 1 1 sodium alginate, a polymer derived from soy or combinations thereof; and mixing the previously obtained foam with a calcium phosphate cement powder.
  • the invention also relates to the calcium phosphate composite foam obtainable by the process of the present invention and its use as a biomaterial in bone regeneration and / or scaffolding for bone tissue engineering.
  • This patent application describes a filling foam that is composite and functionalized but not multiphase. Although a three-dimensional network is constituted, it is not regular or homogeneous and its thickness is difficult to control.
  • the patent application published under the number WO2010079496 describes a membrane comprising sodium alginate, at least one hydrophilic polymer and at least one plasticizer.
  • This membrane is flexible and allows cell adhesion, cell proliferation or cell differentiation.
  • the invention further relates to the use of a membrane of the invention for the preparation of implantable devices, including cell delivery systems, cell growth surfaces and biomaterials.
  • the invention relates to in addition, methods for promoting tissue regeneration in an area with tissue loss, by applying the membranes of the invention. These membranes may contain stem cells.
  • the biomaterials according to the invention allow the filling of lesions and / or cavities in ligamentous, tendinous, cartilaginous, dental or bone tissues, but their three-dimensional organization is irregular and non-homogeneous.
  • Bioprinting can be defined as the use of computer-assisted transfer processes to design and assemble living and non-living elements in a given two-dimensional or three-dimensional organization, with the aim of producing biocompatible structures that can be used in areas of regenerative medicine, pharmacokinetic studies or basic studies of cell biology.
  • calcium sulphate (CaSO 4 ) is a perfectly suitable compound for the crosslinking of a sodium alginate solution.
  • sodium alginate is a polysaccharide extracted from dried brown algae (Laminara Macrocystis). The monomers are D-acids mannuronic and L-glucuronic. It is commonly used as a food additive under the name E401 as a texturizing, emulsifying or gelling agent.
  • E401 a texturizing, emulsifying or gelling agent.
  • the sodium ions are displaced and participate in the formation of a network by polymerization.
  • the different polysaccharide chains thus formed constitute a gel.
  • this gel is a three-dimensional geometric assembly that is ion-reversible and non-thermoreversible.
  • the polymer chains are parallel to it.
  • the texture and quality of the gel are a function of the ion concentration of the reaction medium, the concentration of sodium alginate and its nature (in particular its viscosity). All these mechanical and physical properties make it a good candidate for the development of a biomaterial intended for the filling of focal osteoarticular lesions.
  • the use of three-dimensional matrices to create an in vitro neo-cartilage using biomaterials to fill a loss of osteochondral substance is known (Frenkel SR et al., Front Biosciences, 1999, 4: 671-685) of the prior art .
  • a process for the production of an alginate gel (Tritz et al. Soft Matter, 2010) in which chondrocytes are dispersed is known in particular in the literature.
  • the cell suspension comprising the chondrocytes and the alginate solution is injected into a mold.
  • the crosslinking is obtained by rapid dipping of the mold comprising the suspension in a 102 mM calcium chloride (CaCl 2 ) bath.
  • This document also describes a spraying system that can replace the mold.
  • This system consists of a pistol, operating with a compressor, and is connected to a container containing the alginate solution. Once sprayed onto a sterile glass plate, the crosslinking is again obtained by soaking in a 102 mM CaCl 2 bath.
  • this technique has drawbacks: in particular, it is not possible to obtain a multiphasic biomaterial comprising a plurality of layers that can be of different composition, which are not confused but interact with each other. Indeed, according to this method, a single layer, of small thickness, can be deposited, because of the extreme fluidity of the pulverized alginate solution.
  • the material used in this document, and in particular the gun would not allow to deposit a material having a higher viscosity; Indeed, the nozzles of these guns have a diameter too small to allow a satisfactory spraying of a more viscous solution.
  • the spray pressure by the gun should be increased, which would result in a detrimental effect on the cells.
  • alginate gel comprising chondrocytes.
  • the alginate solution Prior to the molding step, the alginate solution is mixed with a highly concentrated solution of calcium sulfate CaSO 4 (20 mg / mL) and then deposited in a mold. It is possible to deposit two layers of alginate and, in this case, one of the layers is treated by means of a strip of paper impregnated with a citrate solution to promote an interaction of the alginate chains. the first layer with the second layer.
  • This technique has many disadvantages: on the one hand, it requires the use of citrate to promote an interaction between the two layers of alginate; thus, it is not possible to obtain continuity between the two layers. The process is, because of the citrate treatment, heavy to implement and it makes it difficult to obtain a biomaterial with a number greater than two layers.
  • Another disadvantage of this technique lies in the fact that the diffusion of citrate by a pre-impregnated paper web is poorly controlled.
  • citrate may have adverse effects on the cells dispersed in the alginate solution.
  • the high concentration of CaSO 4 causes complete crosslinking of the alginate, which makes it difficult its implementation. Accordingly, the method described by Lee et al.
  • the structure of the alginate gel thus obtained is not optimal for its use as a filler biomaterial.
  • the very high concentration of CaSO 4 is also likely to cause the formation of crystals that may have an adverse osteoinductive effect on the cells encapsulated in the alginate solution.
  • the present invention describes novel crosslinked sodium alginate-based filler materials, which make it possible to overcome the disadvantages of the state of the art, for applications in the medical field and in particular for the filling of tissue lesions presenting organization into layers of varying compositions, such as cartilage, skin, or epithelium.
  • the novel biomaterials according to the invention are multiphasic, composite and onctionalized. This invention is part of the development of new therapies based on the use of biomaterials containing autologous cells.
  • the new biomaterials according to the invention are easily adaptable to the dimensions of the lesion to be filled and their structure is close to that of the target tissue. This allows to consider a perfect integration in the target area and especially the generation of a filling fabric with good mechanical and biological properties.
  • the new biomaterial according to the invention when it is enriched, also makes it possible to envisage the delivery of therapeutic molecules in a localized manner in order to reinforce the therapeutic arsenal existing to date (anti-inflammatories for example). This is not conceivable with already-structured prior art fillers such as foams or sponges of collagens.
  • the cells are distributed homogeneously in the biomaterial. This is very original and can only be difficult to envisage with already structured materials such as the foams or sponges of collagen described in the prior art.
  • the novel filler biomaterials according to the invention consist of a solution based on crosslinked sodium alginate deposited using airbrush pens. These different layers are precisely and homogeneously deposited, forming a multiphase material, composite and functionalized, on an inert or functionalized support. This support is chosen according to the target area to be treated.
  • the present invention relates to a crosslinked sodium alginate based filler material consisting of at least two layers of crosslinked sodium alginate deposited on each other by means of airbrush stylets preferentially associated with a compressor.
  • the structure and the mechanical properties of the new biomaterial are dependent on the nature of the sodium alginate solution, the successive crosslinking processes and the means for spraying the different layers of sodium alginate.
  • the researchers have implemented a succession of steps, including initiation of crosslinking by calcium sulphate and crosslinking by means of calcium chloride, to obtain a filling biomaterial having suitable mechanical properties.
  • the invention relates to a cross-linked sodium alginate-based filler material consisting of at least two layers of sodium alginate, the crosslinking of which has been initiated by calcium sulfate, deposited on one another by means of airbrush pens and one compressor.
  • the filler biomaterial according to the present invention comprises a number of layers greater than two.
  • the multiphasic biomaterial thus formed undergoes a new crosslinking by calcium chloride initiated by nebulization using an airbrush stylet and finalized by a bath in a calcium chloride solution.
  • This can be summed up by the fact that the addition of calcium sulphate initiates the crosslinking of the sodium alginate in a hydrogel.
  • the hydrogel obtained allows the deposition of several successive layers on the same support. These layers will not be confused but will interact with each other while remaining united over time.
  • the thickness of the final biomaterial can be much greater than that which can be obtained with a solution of simple sodium alginate hydrogel, that is to say without the crosslinking of the sodium alginate solution.
  • the crosslinking of the gel is then carried out by a nebulization step using calcium chloride and finalized by a bath of the complete biomaterial, including support, in calcium chloride.
  • the building thus obtained has a continuity that can not be obtained when using additional solutions to treat the deposited layers to allow an interaction between them, in particular by a citrate solution (Lee et al.) Or by polyelectrolytes (Grossin et al.)
  • airbrush means a material capable of spraying a solution, more or less viscous, on any surface, using compressed air.
  • An airbrush is therefore combined with a compressor.
  • the airbrush controls both the airflow and the flow rate of the spray solution.
  • the airbrush stylus has a nozzle whose opening diameter is substantially higher than that of a gun nozzle, thus allowing a spraying of solutions having a certain viscosity, which is not the case for guns traditionally used.
  • an airbrush allows perform very precise spraying. Airbrushes are commonly used in the fields of painting and illustration, but also in the culinary field. Stylets are the means of directing the spray solution to the chosen support.
  • the stylets are equipped with nozzles whose diameter is selected according to the spray solution.
  • Paasche® double action styli VL202-Set or Colani series Harder & Steenbeck® stylus are used, and a compressor 30 1 / min, 6 bar maximum.
  • biomaterials in the present invention the fact of rendering a biomaterial, which is generally inert and biocompatible, more suitable for the adhesion and proliferation of cells or the synthesis of an extracellular matrix by other elements. used.
  • a biomaterial which is generally inert and biocompatible, more suitable for the adhesion and proliferation of cells or the synthesis of an extracellular matrix by other elements.
  • crosslinking creates a regular network that allows adhesion and cellular development. This is a first level of functionalization.
  • Surface treatments using different chemical compounds are also possible to optimize the functionalization of a sodium alginate hydrogel. This constitutes a second level of functionalization.
  • a third level of functionalization can be based on the association of a cellular contingent with the basic biomaterial, which will confer on the biomaterial new properties; indeed, said cells will modify the initial composition of the base matrix by synthesizing their own extracellular matrix.
  • the cell density and the cell phenotype can be adapted according to the area to be regenerated (to regenerate a cartilage zone for example, it is useful to reproduce the zonal organization of the hyaline articular cartilage).
  • “functionalized support” is meant in the present invention the fact of making an inert solid support more suitable for the adhesion and proliferation of cells or other elements used.
  • the carrier will undergo chemical modification through bioactive polymers or other compounds.
  • the structure and / or the surface of the solid support can be functionalized.
  • composite biomaterial in the present invention the fact of depositing layers of biomaterials of different composition, the base being sodium alginate which can be associated with other molecules.
  • base sodium alginate which can be associated with other molecules.
  • hydroxyapatite molecules which, in addition to their biological activity, modify the biochemical composition of the base hydrogel.
  • multiphase biomaterial in the present invention the fact of being able to construct buildings, alternating successive layers whose composition, both in terms of the associated materials (alginate, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, hydroxyapatite) and on the plan of the phenotypic characteristics of the cells and their density, can be modulated in order to better reproduce the stratified organization of the hyaline articular cartilage.
  • the biomaterial according to the invention comprises at least two layers but may comprise a number greater than two layers, which may have different compositions, this number of layers depending in particular on the size of the biomaterial that it is desired to obtain to allow the filling.
  • the biomaterial according to the invention may consist of a solution of sodium alginate enriched in eukaryotic cells but also in molecules having a biological activity such as hyaluronic acid, chondroitin sulfate or hydroxyapatite microparticles (5-30 microns).
  • the eukaryotic cells are resistant to the different crosslinking steps applied to the biomaterial during its preparation. They remain viable after the initiation steps of the calcium sulphate crosslinking and adapt perfectly to the three-dimensional network thus formed.
  • the researchers conducted viability studies to show that in the case of articular chondrocytes, the latter do not show a decrease in mitochondrial activity compared with eukaryotic cells encapsulated in a poly (alginate) hydrogel.
  • the pressure exerted on the solution of sodium alginate in the airbrush pens must be adapted to the survival of said eukaryotic cells.
  • the pressure exerted must then be between 1.0 and 1.5 bars. In a preferred embodiment, the pressure is 1.2 bar.
  • the sodium alginate solution according to the invention is concentrated in a proportion of 1.5% to 3.0%, preferably 1, 5% to 2.0%.
  • the biomaterial according to the invention consists of a solution of sodium alginate at 1.7%.
  • the initiation of the crosslinking of this biomaterial is then carried out with a solution of calcium sulphate (CaSO 4 ).
  • the CaSO 4 solution advantageously has a concentration of between
  • this CaSO concentration is substantially equal to 3.0 mg / ml.
  • the crosslinking of the biomaterial is initiated by a solution of calcium sulfate (CaSO 4 ) at a concentration of 3.0 mg / ml at the rate of 1.0 ml for 5.5 ml of sodium alginate. .
  • CaSO 4 calcium sulfate
  • the present invention is based on an original process which implements several techniques for crosslinking a solution of sodium alginate.
  • the successive implementation of these different crosslinking steps makes it possible to obtain a composite, multiphase and functionalized biomaterial, which can be enriched or not.
  • the present invention discloses a novel method of manufacturing a crosslinked sodium alginate based filler material comprising the steps of:
  • the airbrush stylets and the compressor used in the implementation of the method according to the invention are materials classics known to those skilled in the art (Harder & Steenbeck® or Paasche® styli).
  • the opening diameter of the stylet is a decisive element in the implementation of the method according to the invention because, if it does not have a sufficient diameter, the nebulization of the sodium alginate solution, the crosslinking of which has already been initiated by addition of calcium sulphate, is made difficult and results in a non-homogeneous dispersion. Indeed, clogging of the nozzles may occur because of the viscosity of the sodium alginate solution formed during step b) above.
  • the concentration of sodium alginate determines the diameter of the stylus nozzle to be used.
  • the nozzle of the airbrush pen must have a diameter of between 1.0 mm and 1.2 mm.
  • the airbrush stylet has an aperture diameter of 1 mm. If the biomaterial concentration used is greater than 2.5%, a nozzle with a diameter greater than 1.2 mm should be used. Such stylets, however, do not appear to be available on the market today. Such an application is however contemplated in the present description.
  • the steps using the airbrush stylets are carried out under pressure.
  • the compressor used has a pressure of between 1.0 and 1.5 bar. In a preferred embodiment, the compressor exerts a pressure of 1.2 bar.
  • the sodium alginate solution can be enriched by eukaryotic cells and / or by other molecules such as hyaluronic acid, chondroitin sulfates or hydroxyapatite particles.
  • the pressure exerted in the airbrush pens must respect these cells and not be too high not to affect their survival and development.
  • the sodium alginate solution should then be concentrated to 1.5% to 2.0%.
  • the method of manufacturing a Filling material based on crosslinked sodium alginate according to the invention implements a solution based on sodium alginate enriched in eukaryotic cells and concentrated to 1.7% sodium alginate.
  • the eukaryotic cells are resistant to the various crosslinking steps exerted on the biomaterial being developed. They remain viable after the initiation steps of the calcium sulphate crosslinking and adapt perfectly to the three-dimensional network thus formed.
  • the sodium alginate solution is enriched with other molecules such as hyaluronic acid, chondroitin sulphates or hydroxyapatite particles, then the sodium alginate concentration should be decreased. Indeed, these other molecules increase the viscosity of the solution obtained in step b) of the process according to the invention.
  • the technique of deposition using airbrush pens can only be used with a certain range of viscosity. It may also be envisaged to use stylus nozzles with a larger diameter. However, some technical limitations exist and it is difficult to find nozzles with a diameter greater than 1.2 mm. Such material may however be developed in order to adapt the process according to the invention to solutions having a higher viscosity.
  • the support used in step c) of the process according to the invention for depositing the sodium alginate solution of step b) of the process according to the invention may be inert or functionalized.
  • the support is functionalized to obtain a Biomaterial fillers have optimal mechanical and biological properties.
  • the concentration of the calcium sulphate solution used in step b) is between 2.0 mg / ml and 4.0 mg / ml, and more preferably still substantially equal to 3, 0 mg / ml.
  • the calcium sulphate is added at a rate of 1 ml to 3 to 8 ml of sodium alginate solution, preferably 1 ml for 5 to 6 ml. More preferably, the The volume used for the crosslinking of the sodium alginate solution is 1.0 ml per 5.5 ml of sodium alginate.
  • the pressure implemented during step c) of the process is substantially equal to 1.2 bars.
  • the concentration of calcium chloride of steps e) and e) is substantially equal to 102 mM.
  • the method according to the invention comprises the following steps:
  • This original process combines several factors determining the quality of the biomaterial according to the invention: the homogeneous deposition using airbrush pens of a sodium alginate solution enriched in eukaryotic cells, a spray pressure adapted to the cells eukaryotes and the crosslinking in several stages, including in particular an initiation of crosslinking, the various layers deposited.
  • the biomaterial thus obtained has all the properties necessary for the filling of focal lesions of human or animal cartilage.
  • One of the major pitfalls of the nebulization deposition process of a sodium alginate hydrogel is that the air pressure used to deposit the viscous biomaterial " s ⁇ o ⁇ 2rti " is effect of causing the solution to flow out of the support.
  • Fig. 1 which describes the steps of the process for producing a crosslinked sodium alginate filler material enriched in eukaryotic cells:
  • Fig. 2 illustrates the viability of cells encapsulated in biomaterials according to the prior art (monolayer and bilayer) by measuring mitochondrial activity.
  • the alginate solution is sterilized by soaking in a 70% ethanol solution.
  • the alginate solution is sterilized by autoclaving at 121 ° C for 20 minutes. It is then taken up with a solution of NaCl at 0.9%.
  • the concentration of sodium alginate thus obtained is 2%, ie 2 g per 100 ml.
  • the sodium alginate solution is stirred for 24 hours.
  • nebulization cup sterilized beforehand and rinsed with a sterile NaCl solution, a volume of 5.5 ml of sodium alginate is mixed with 1 ml of CaSO 4 solution and then actively mixed in order to obtain a solution of which the viscosity is compatible with nebulization.
  • a first deposit is made using an airbrush spray at a pressure of 1.2 bar at a distance of 10.0 cm to 15.0 cm of the inert support laid flat. It can be envisaged the use of a functionalized support. Once the entire volume of sodium alginate solution combined with CaSO 4 deposited in a uniform layer and after waiting for 5 minutes, the second layer is deposited in the same manner as before.
  • the biomaterial is then placed in a CaCl 2 bath at a concentration of 102 mM for a period of between 20 and 25 minutes following the number of layers of crosslinked sodium alginate deposited (approximately 10 minutes per deposited layer).
  • the alginate solution is sterilized by soaking in a 70% ethanol solution.
  • the alginate solution is sterilized by autoclaving at 121 ° C for 20 minutes. It is then taken up with a solution of NaCl at 0.9%.
  • the concentration of sodium alginate thus obtained is 2%, ie 2 g per 100 ml.
  • the sodium alginate solution is stirred for 24 hours.
  • the selected cells are recovered by trypsinization and washed. They are then combined with the sodium alginate solution at a concentration of 3.10 6 cells / ml of alginate. A solution of sodium alginate enriched in eukaryotic cells is obtained.
  • nebulization cup previously sterilized and rinsed with sterile NaCl solution, a volume of 5.5 ml of sodium alginate enriched with eukaryotic cells is mixed with 1 ml of CaSO 4 solution and then mixed actively to remove obtain a solution whose viscosity is compatible with nebulization.
  • a first deposit is made using an airbrush spray with a pressure of 1.2 bar at a distance of 10.0 cm to 15.0 cm of the support laid flat.
  • This support can be inert or functionalized.
  • the biomaterial is then placed in a CaCl 2 bath at a concentration of 102 mM for a period of between 20 and 25 minutes depending on the number of layers of crosslinked alginate deposited (approximately 10 minutes per deposited layer). This bath should not exceed 30 minutes because the eukaryotic cells would have a viability rate largely decreased.
  • This test is based on the mitochondrial activity of viable cells: yellow-colored MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide) is reduced in the presence of succinate dehydrogenase mitochondrial formazan blue crystals.
  • the cells used here are human chondrocytes in primoculture.
  • a calibrated biopsy of gel containing sodium alginate, human chondrocytes, enriched or not with hydroxyapatite (HAp), is placed in a well, with 125 ⁇ l of complete medium and 25 ⁇ l of a solution of MTT (Sigma ®) at 5 mg / ml diluted in PBS.
  • the plates are incubated for 4 hours at 37 ° C.
  • the liquid is removed and then replaced by an SDS-DMF buffer (Sodium Dodecyl Sulfate, DiMethylFormamide H 2 O, pH 4.7) allowing the beads to be lysed.
  • the whole is incubated for 24 hours at 37 ° C.
  • Absorbance at 580 nm is measured using a spectrophotometer (Multiskan EX, ThermoLabsystems).
  • Single-layer or bilayer gels are made and the mitochondrial activity is measured in the days following the spraying of the cells on the different gels.
  • the results of the MTT test are shown in FIG. 2. It can be observed that the cells exhibit mitochondrial activity in a gel made of sodium alginate-based biomaterial until 21 days after spraying. These cells are therefore viable.

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Abstract

La présente invention décrit de nouveaux biomatériaux de comblement à base d'alginate de sodium réticulé et son procédé de fabrication, pour des applications dans le domaine médical et en particulier destinés au comblement de lésions de tissus présentant une organisation en strates de compositions variables, comme le cartilage, la peau, ou l' épithélium. Ces nouveaux biomatériaux présentent les particularités d'être multiphasiques, composites et fonctionnalisés, pour un usage médical et en particulier pour le traitement de lésions de tissus présentant une organisation en strates de compositions variables. Ces biomatériaux sont particulièrement adaptés pour le traitement des lésions focales du cartilage articulaire.

Description

NOUVEAUX BIOMATÉRIAUX MULTIPHASIQUES ET PROCÉDÉ DE FABRICATION
La présente invention décrit de nouveaux biomatériaux de comblement à base d' alginate de sodium réticulé , pour des applications dans le domaine médical et en particulier destinés au comblement de lésions de tissus présentant une organisation en strates de compositions variables, comme le cartilage, la peau, ou l' épithélium. Ces nouveaux biomatériaux présentent les particularités d'être multiphasiques , composites et fonctionnalisés, pour un usage médical et en particulier pour le traitement de lésions de tissus présentant une organisation en strates de compositions variables . Ces biomatériaux sont particulièrement adaptés pour le traitement des lésions focales du cartilage articulaire. Le procédé de fabrication de ces nouveaux biomatériaux, mettant en œuvre différentes étapes de réticulation de la solution d' alginate de sodium et une méthode très particulière de dépôt des différentes couches, est détaillé. Les différentes applications médicales de ces nouveaux biomatériaux multiphasiques, composites et fonctionnalisés sont également décrites.
L'un des enjeux majeurs du traitement des lésions du cartilage articulaire est essentiellement la création d'un tissu cartilagineux multiphasique de remplacement ou de comblement. Le traitement des lésions cartilagineuses est actuellement abordé de façon chirurgicale selon plusieurs axes dont la stimulation osseuse (chirurgie des microfractures par exemple) , la mosaïque plastie, les greffes de périoste ou de périchondre, les autogreffes et allogreffes ostéochondrales ainsi que les réparations à base de cellules (transplantation de chondrocytes autologues par exemple) . Les techniques de stimulation osseuse ont pour objectif de réparer les lésions articulaires par le biais d'une arthroscopie . La zone lésionnelle à combler et/ou régénérer est perforée pour exposer l'os sous-jacent. L'os sous- chondral est également perforé pour générer un caillot de sang à l'intérieur de la partie lésée qui contient des cellules souches mésenchymateuses précurseurs potentiels des cellules osseuses et cartilagineuses. L'un des inconvénients potentiels de ces méthodes est l'insuffisance du comblement de la cavité chondrale. Par ailleurs le tissu de comblement obtenu est souvent du fibrocartilage qui présente de moins bonnes propriétés mécaniques que le cartilage hyalin. Dans ce cas il faut environ 8 semaines au caillot de sang pour se transformer en tissu fibreux et il lui faut 4 mois pour se transformer en fibrocartilage . Ceci n'est pas sans incidence pour la réhabilitation et il existe un risque important de voir réapparaître les symptômes 2 à 3 ans après l'opération initiale. En effet, le fibrocartilage s'use de manière précoce en raison de la composition de sa matrice extracellulaire qui n'est pas faite pour supporter les contraintes mécaniques appliquées lors de la sollicitation de l'articulation, ce qui entraîne la nécessité d'une nouvelle opération chirurgicale du cartilage articulaire. Ces techniques de stimulation osseuse, et notamment la chirurgie des microfractures, sont dès lors considérées comme des thérapies intermédiaires plutôt que définitives. La mosaïque plastie implique que de petits bâtonnets cylindriques d' os recouverts de cartilage sain soient prélevés dans une zone non- portante de l'articulation par le biais d'une arthroscopie . De petits forages sont ensuite réalisés à l'endroit de la lésion du cartilage à traiter. Les bâtonnets cylindriques portant du cartilage sain s'intègrent parfaitement dans les cavités ainsi formées. Cette technique n'est possible qu'avec des lésions ne dépassant pas 2 à 3 cm2 parce qu'il n'est envisageable de supprimer qu'une quantité très limitée de tissu ostéochondral sain. Ceci est l'inconvénient majeur de cette technique. Les autogreffes et allogreffes ostéochondrales nécessitent des sections de transplantation de l'os et du cartilage. Dans un premier temps, la section endommagée de l'os et du cartilage est détachée de l'articulation. Ensuite une nouvelle clavette d'os sain avec son cartilage est prélevée par perforation sur la même articulation et réimplantée dans la cavité créée par le retrait de l'ancien os endommagé avec son cartilage. L'os sain et son cartilage sont prélevés sur une zone non-portante de l'articulation afin d'éviter le dysfonctionnement de l'articulation. En fonction de la gravité et de la taille de la lésion, différentes clavettes peuvent éventuellement être requises pour réparer l'articulation de manière adéquate. Cette procédure peut s'avérer difficile pour une autogreffe ostéochondrale . Dans le cas d'une allogreffe ostéochondrale , les clavettes sont prélevées sur des donneurs décédés . Ceci présente l'avantage qu'une plus grande quantité de tissu ostéochondral est disponible et que des lésions de taille plus importante peuvent être réparées. L'inconvénient de cette technique est l'éventualité de problèmes d' histocompatibilité et d'éthique. Les techniques à base de cellules (thérapie cellulaire, ACI pour « Autologous Chondrocyte Implantation » ou implantation de chondrocytes autologues) sont basées sur le principe de remplacement du cartilage articulaire endommagé par du cartilage autologue de même type. L'inconvénient de cette technique est la génération de fibrocartilage ou, dans le meilleur des cas, une combinaison de tissu hyalin et de tissu fibro-cartilagineux , ceci étant du à l'absence de « matériaux tuteur ». Les procédures d' implantation de chondrocytes autologues sont des procédures de réparation à base de cellules visant à générer des néo-tissus hyalins plus fonctionnels. Durant l'intervention chirurgicale, des cellules chondrocytes sont injectées et appliquées sur la zone endommagée en combinaison avec une membrane (périoste) . Chacune de ces procédures présente des avantages et des inconvénients .
Ces techniques sont lourdes car elles nécessitent une première opération pour collecter les cellules dans une zone non-portante de l'articulation puis une seconde pour la réimplantation dans la zone lésée. Ces techniques donnent généralement de bons résultats. Toutefois, grâce au développement des techniques de bioingénierie, l'utilisation des biomatériaux représente une alternative sérieuse aux techniques précitées (MACI pour « Matrix-induced Autologous Chondrocyte Implantation » ou implantation de matrices colonisées par des chondrocytes autologues) . Les techniques de bioingénierie, ou ingénierie tissulaire, permettent la culture cellulaire dans des matrices artificielles tridimensionnelles présentant certaines propriétés mécaniques et biologiques proches de celles du tissu cartilagineux. Les matrices artificielles décrites à ce jour sont de nature synthétique, protéique ou polysaccharidique . Ces techniques permettent notamment d' obtenir des matériaux présentant une bonne résistance mécanique, une biocompatibilité et une biodégradabilité contrôlables, qui sont utilisés en tant que matériaux de comblement pour traiter en particulier les lésions focales du cartilage.
La demande de brevet publiée sous le numéro WO 2010/116321 {Ginebra Mollns et al.) décrit un procédé pour l'obtention d'une mousse composite de phosphate de calcium comprenant les étapes consistant à : former une mousse polymérique par agitation ou soufflage de gaz dans une solution aqueuse de polymère comprenant de la gélatine , de 11 alginate de sodium , un polymère issu de soja ou des combinaisons de ceux-ci; et mélanger la mousse obtenue précédemment avec une poudre de ciment de phosphate de calcium. L'invention porte également sur la mousse composite de phosphate de calcium pouvant être obtenue par le procédé de la présente invention et sur son utilisation comme biomatériau dans la régénération osseuse et/ou comme échafaudage pour l'ingénierie tissulaire osseuse. Cette demande de brevet décrit une mousse de comblement qui est composite et fonctionnalisée mais non multiphasique . Bien qu'un réseau tridimensionnel soit constitué, il n'est pas régulier ni homogène et son épaisseur est difficilement contrôlable.
La demande de brevet publiée sous le numéro WO2010079496 décrit une membrane comprenant de l'alginate de sodium, au moins un polymère hydrophile et au moins un plastifiant. Cette membrane est souple et permet l'adhérence cellulaire, la prolifération cellulaire ou la différenciation cellulaire. L'invention concerne en outre l'utilisation d'une membrane de l'invention pour la préparation de dispositifs implantables , dont des systèmes d'administration de cellules, des surfaces de croissance cellulaire et des biomatériaux. L'invention concerne en outre des méthodes permettant de favoriser la régénération tissulaire dans une zone comportant des pertes de substance tissulaire, par application des membranes de l'invention. Ces membranes peuvent contenir des cellules souches . Les biomatériaux selon l'invention permettent le comblement de lésions et/ou de cavités dans des tissus ligamentaire, tendineux, cartilagineux, dentaire ou osseux, mais leur organisation tridimensionnelle est irrégulière et non homogène.
Pour remplir les conditions nécessaires à l'obtention d'un biomatériau de comblement efficace, il faut que ledit matériau en plus d'être multiphasique, soit poreux pour permettre une colonisation cellulaire et ainsi remplir les fonctions qui lui incombent. Or pour conférer à une solution d'alginate de sodium une certaine porosité, il est connu de l'art antérieur qu'il convient de procéder à sa réticulation. Cette réticulation est communément réalisée à l'aide d'ions calcium et notamment de chlorure de calcium.
L'alginate de sodium, enrichi ou non, est maintenant couramment utilisé pour des techniques d' impression d' éléments biologiques (« bioprinting » en anglais) ou de moulage (Guillemot et al., Biofabrication 2, 2010, 010201). Le « bioprinting » peut être défini comme l'utilisation de procédés de transferts assistés par ordinateur pour concevoir et assembler des éléments vivants et non-vivants selon une organisation bidimensionnelle ou tridimensionnelle donnée, dans l'objectif de réaliser des structures biocompatibles susceptibles de servir dans les domaines de la médecine régénérative , les études pharmacocinétiques ou les études de base de biologie cellulaire. Il existe de nombreuses publications mettant en œuvre des solutions à base d' alginate de sodium ou d'alginate de calcium, qui sont fonctionnalisées.
Il a été démontré récemment que le sulfate de calcium (CaS04) est un composé parfaitement adéquat pour la réticulation d'une solution d'alginate de sodium. En effet, l'alginate de sodium est un polysaccharide extrait d' algues brunes séchées (Laminara Macrocystis) . Les monomères sont des acides-D- mannuroniques et L-glucuroniques . Il est communément utilisé comme additif alimentaire sous l'appellation E401 en tant qu'agent de texture, émulsifiant ou gélifiant. En présence d'ions calcium, les ions sodium sont déplacés et participent à la formation d'un réseau par polymérisation. Les différentes chaînes de polysaccharides ainsi formées constituent un gel. Concrètement ce gel est un assemblage géométrique tridimensionnel régulier ionoréversible et non thermoréversible. Les chaînes polymériques y sont parallèles. En pratique, la texture et la qualité du gel sont fonction de la concentration en ions du milieu de réaction, de la concentration en alginate de sodium et de sa nature (notamment de sa viscosité) . Toutes ces propriétés mécaniques et physiques en font un bon candidat pour le développement d' un biomatériau destiné au comblement de lésions focales ostéo-articulaires . L'utilisation de matrices tridimensionnelles pour créer un néo-cartilage in vitro en utilisant des biomatériaux pour combler une perte de substance ostéochondrales est connu (Frenkel SR et al., Front Biosciences, 1999, 4 : 671-685) de l'art antérieur.
On connaît notamment dans la littérature un procédé permettant la réalisation d'un gel d' alginate (Tritz et al, Soft Matter, 2010) dans lequel sont dispersés des chondrocytes. La suspension cellulaire comportant les chondrocytes et la solution d' alginate est injectée dans un moule. La réticulation est obtenue par trempage rapide du moule comportant la suspension dans un bain de chlorure de calcium (CaCl2) à 102 mM. Ce document décrit également un système de pulvérisation pouvant remplacer le moule. Ce système est composé d'un pistolet, fonctionnant avec un compresseur, et il est relié à un contenant dans lequel se trouve la solution d' alginate . Une fois pulvérisée sur une plaque stérile de verre, la réticulation est à nouveau obtenue par trempage dans un bain de CaCl2 à 102 mM.
Cette technique présente cependant des inconvénients : notamment, il n'est pas possible d'obtenir un biomatériau multiphasique comportant une pluralité de couches pouvant être de composition différentes, qui ne se confondent pas mais interagissent entre elles. En effet, selon ce procédé, une seule couche, de faible épaisseur, peut être déposée, du fait de l'extrême fluidité de la solution d' alginate pulvérisée. Cependant, le matériel utilisé dans ce document, et en particulier le pistolet, ne permettrait pas de déposer un matériau présentant une viscosité plus importante ; en effet, les buses de Ces pistolets présentent un diamètre trop faible pour permettre une pulvérisation satisfaisante d'une solution plus visqueuse. De plus, si la viscosité de la solution était augmentée, la pression de pulvérisation par le pistolet devrait être augmentée, ce qui aurait pour conséquence un effet néfaste sur les cellules .
On connaît encore, dans la littérature (Lee et al, Biomaterials , 2007), un autre procédé pour la fabrication d'un gel d' alginate comportant des chondrocytes . Préalablement à l'étape de moulage, la solution d' alginate est mélangée à une solution hautement concentrée en sulfate de calcium CaS04 (20mg/mL) , puis déposée dans un moule. Il est possible de déposer deux couches d' alginate et, dans ce cas de figure, une des couches est traitée par l'intermédiaire d'une bande de papier imprégnée d'une solution de citrate pour favoriser une interaction des chaînes d' alginate de la première couche avec la seconde couche .
Cette technique présente de nombreux inconvénients : d' une part, elle nécessite l'utilisation de citrate pour favoriser une interaction entre les deux couches d' alginate ; ainsi, il n'est pas possible d'obtenir une continuité entre les deux couches. Le procédé est, du fait du traitement au citrate, lourd à mettre en œuvre et il permet difficilement d'obtenir un biomatériau comportant un nombre supérieur à deux couches . Un autre inconvénient de cette technique réside dans le fait que la diffusion de citrate par une bande de papier pré-imprégnée est mal maîtrisée. De plus, le citrate peut présenter des effets néfastes sur les cellules dispersées dans la solution d' alginate . De plus , la concentration élevée en CaS04 entraine une réticulation complète de l' alginate, ce qui rend difficile sa mise en œuvre. En conséquence, le procédé décrit par Lee et al. comporte deux systèmes de réticulation ; le premier par ajout de CaS0 en forte concentration et le second par trempage du gel d' alginate dans un bain de chlorure de calcium. La structure du gel d' alginate ainsi obtenue n'est pas optimale pour son utilisation en tant que biomatériau de comblement. De plus, la concentration très élevée en CaS04 est également susceptible d' entrainer la formation de cristaux pouvant avoir un effet osthéoinducteur néfaste sur les cellules encapsulées dans la solution d' alginate .
Il est encore connu de l'art antérieur un procédé mis au point par Grossin et al (Grossin et al., Advanced Material , 2009) dans lequel l'interaction entre les couches d' alginate est assurée par des couches de polyélectrolytes , tels que la poly-L- lysine ou l'acide hyaluronique , lesdites couches étant alternées avec des couches d' alginate incorporant les cellules . Ce procédé est cependant lourd à mettre en œuvre et ne permet pas d'obtenir une continuité au sein de l'édifice, du fait de la nécessité d' alterner plusieurs couches d' alginate avec des couches de polyélectrolytes .
La présente invention décrit de nouveaux biomatériaux de comblement à base d' alginate de sodium réticulé, permettant de remédier au inconvénients de l'état de la technique, pour des applications dans le domaine médical et en particulier destinés au comblement de lésions de tissus présentant une organisation en strates de compositions variables, comme le cartilage, la peau, ou l' épithélium. Les nouveaux biomatériaux selon l'invention sont multiphasiques , composites et onctionnalisés. Cette invention s'inscrit dans le développement de nouvelles thérapies reposant sur l'utilisation de biomatériaux contenant des cellules autologues . Les nouveaux biomatériaux selon l'invention sont facilement adaptables aux dimensions de la lésion à combler et leur structure est proche de celle du tissu cible . Ceci permet d' envisager une parfaite intégration dans la zone cible et surtout la génération d'un tissu de comblement présentant de bonnes propriétés mécaniques et biologiques . Par ailleurs le nouveau biomatériau selon l'invention, lorsqu' il est enrichi , permet également d' envisager la délivrance de molécules thérapeutiques de façon localisée afin de renforcer l'arsenal thérapeutique existant à ce jour (anti-inflammatoires par exemple). Ceci n'est pas envisageable avec des matériaux de comblement de l'art antérieur déjà structurés tels les mousses ou les éponges de collagènes. Enfin, selon le nouveau procédé selon l'invention, les cellules sont réparties de façon homogène dans le biomatériau. Ceci est très original et ne peut être que difficilement envisagé avec des matériaux déjà structurés tels les mousses ou les éponges de collagène décrites dans l'art antérieur .
Les nouveaux biomatériaux de comblement selon l'invention sont constitués d'une solution à base d'alginate de sodium réticulé déposée à l'aide de stylets aérographes. Ces différentes couches sont déposées de façon précise et homogène, formant un matériau multiphasique , composite et fonctionnalisé, sur un support inerte ou fonctionnalisé. Ce support est choisi en fonction de la zone cible à traiter. La présente invention porte sur un biomatériau de comblement à base d' alginate de sodium réticulé constitué d' au moins deux couches d' alginate de sodium réticulé déposées les unes sur les autres grâce à des stylets aérographes préférentiellement associé à un compresseur.
La structure et les propriétés mécaniques du nouveau biomatériau sont dépendantes de la nature de la solution à base d'alginate de sodium, des procédés successifs de réticulation et du moyen de pulvérisation des différentes couches d' alginate de sodium. Les chercheurs ont mis en application une succession d' étapes , comportant un amorçage de la réticulation par le sulfate de calcium puis une réticulation au moyen du chlorure de calcium, pour obtenir un biomatériau de comblement présentant des propriétés mécaniques adaptées. L'invention décrit un biomatériau de comblement à base d' alginate de sodium réticulé constitué d'au moins deux couches d'alginate de sodium, dont la réticulation a été amorcée par le sulfate de calcium, déposées les unes sur les autres grâce à des stylets aérographes et un compresseur. Préférentiellement , le biomatériau de comblement selon la présente invention comporte un nombre de couches supérieur à deux. Le biomatériau multiphasique ainsi formé subit une nouvelle réticulation par le chlorure de calcium initiée par nébulisation à l'aide d'un stylet aérographe et finalisée par un bain dans une solution de chlorure de calcium. Ceci peut se résumer par le fait que l'addition de sulfate de calcium amorce la réticulation de l'alginate de sodium en un hydrogel . L'hydrogel obtenu permet le dépôt de plusieurs couches successives sur un même support. Ces couches ne vont pas se confondre mais vont interagir entre elles tout en restant solidaires au cours du temps. Ainsi, l'épaisseur du biomatériau final peut être bien supérieure à ce qui peut être obtenu avec une solution d' hydrogel d' alginate de sodium simple, c'est-à- dire sans que la réticulation de la solution d' alginate de sodium ne soit initiée, comme décrit dans la littérature (Tritz et al., Grossin et al.). Selon l'invention, la réticulation du gel est ensuite réalisée par une étape de nébulisation à l'aide de chlorure de calcium et finalisée par un bain du biomatériau complet, support compris, dans du chlorure de calcium. L'édifice ainsi obtenu présente une continuité qui ne peut être obtenue lorsqu' on utilise des solutions additionnelles pour traiter les couches déposée afin de permettre une interaction entre ces dernières, notamment par une solution de citrate (Lee et al.) ou par des polyélectrolytes (Grossin et al.).
Par aérographe on entend un matériel capable de vaporiser une solution, plus ou moins visqueuse, sur n'importe quelle surface, à l'aide d'air comprimé. Un aérographe est donc combiné à un compresseur. Par opposition à un « pistolet » qui projette des solutions, l' aérographe permet de contrôler à la fois le débit d'air et le débit de la solution à pulvériser. De plus, le stylet aérographe présente une buse dont le diamètre d' ouverture est sensiblement plus élevé que celui d'une buse de pistolet, permettant ainsi une pulvérisation de solutions présentant une certaine viscosité, ce qui n'est pas le cas des pistolets traditionnellement utilisés. De plus, un aérographe permet de réaliser des pulvérisations très précises . Les aérographes sont couramment utilisés dans les domaines de la peinture et de l'illustration, mais également dans le domaine culinaire. Les stylets sont les moyens de diriger la solution à pulvériser vers le support choisi . Les stylets sont munis de buses dont le diamètre est sélectionné en fonction de la solution à pulvériser. Dans la présente invention, on utilise des stylets Paasche® double action VL202-Set ou des stylets Harder & Steenbeck® Série Colani , et un compresseur 30 1/mn, 6 bars maximum .
Par « biomatériaux fonctionnalisé » on entend dans la présente invention le fait de rendre un biomatériau, qui est généralement inerte et biocompatible, plus adapté à l'adhésion et la prolifération des cellules ou à la synthèse d'une matrice extracellulaire par d' autres éléments utilisés . Dans le cas de l'alginate de sodium, la réticulation crée un réseau régulier qui permet l'adhésion et le développement cellulaire. C'est un premier niveau de fonctionnalisation. Des traitements de surface à l'aide de différents composés chimiques sont également possibles pour optimiser la fonctionnalisation d'un hydrogel à base d'alginate de sodium. Ceci constitue un second niveau de fonctionnalisation. Enfin un troisième niveau de fonctionnalisation peut reposer sur l'association d'un contingent cellulaire au biomatériau de base , ce qui va conférer audit biomatériau de nouvelles propriétés ; en effet lesdites cellules vont modifier la composition initiale de la matrice de base en synthétisant leur propre matrice extracellulaire. La densité cellulaire et le phénotype cellulaire peuvent être adaptés en fonction de la zone à régénérer (pour régénérer une zone de cartilage par exemple, il est utile de reproduire l'organisation zonale du cartilage articulaire hyalin) .
Par « support fonctionnalisé » on entend dans la présente invention le fait de rendre un support solide inerte plus adapté à l'adhésion et la prolifération des cellules ou autres éléments utilisés. Typiquement, le support subira une modification chimique par l'intermédiaire de polymères bioactifs ou d'autres composés. La structure et/ou la surface du support solide peuvent être fonctionnalisés .
Par « biomatériau composite », on entend dans la présente invention le fait de déposer des couches de biomatériaux de composition différente, la base étant l'alginate de sodium qui peut être associé à d'autres molécules. On citera à titre d'exemple non limitatif l'adjonction de molécules d'hydroxyapatite, qui en plus de leur activité biologique, modifient la composition biochimique de l'hydrogel de base.
Par « biomatériau multiphasique », on entend dans la présente invention le fait de pouvoir construire des édifices , faisant alterner des couches successives dont la composition, tant sur le plan des matériaux associés (alginate, acide hyaluronique , chondroïtines sulfate, hydroxyapatite) que sur le plan des caractéristiques phénotypiques des cellules et de leur densité, peut être modulée afin de reproduire au mieux l'organisation stratifiée du cartilage articulaire hyalin. Le biomatériau selon 1 ' invention comporte au moins deux couches mais peut comporter un nombre supérieur à deux couches , pouvant présenter des compositions différentes, ce nombre de couches dépendant notamment de la taille du biomatériau que l'on souhaite obtenir pour permettre le comblement.
Le biomatériau selon l'invention peut être constitué d'une solution d' alginate de sodium enrichie en cellules eucaryotes mais également en molécules ayant une activité biologique telles que l'acide hyaluronique, les chondroïtines sulfate ou des microparticules d'hydroxyapatite (5-30 microns). Les cellules eucaryotes sont résistantes aux différentes étapes de réticulation appliquées au biomatériau lors de son élaboration. Elles demeurent viables après les étapes d' initiation de la réticulation au sulfate de calcium et s'adaptent parfaitement au réseau tridimensionnel ainsi formé. Les chercheurs ont réalisé des études de viabilité pour démontrer que dans le cas de chondrocytes articulaires, ces derniers ne présentent pas de diminution d'activité mitochondriale par comparaison avec des cellules eucaryotes encapsulées dans un hydrogel d' alginate de sodium préparé selon une méthode classique de l'art antérieur (Fig. 2) . Les inventeurs ont par ailleurs vérifié que la viabilité des cellules eucaryotes déposées dans chaque couche d'alginate de sodium réticulé n'est pas affectée par les dépôts successifs. Des expériences similaires ont été réalisées avec des cellules souches mésenchymateuses issues de moelle osseuse et ont montré le même comportement avant et après réticulation , c'est-à-dire pas d'effets néfastes du processus de préparation de l'édifice.
Dans le cas d'un enrichissement en cellules eucaryotes, la pression exercée sur la solution d' alginate de sodium dans les stylets aérographes doit être adaptée à la survie desdites cellules eucaryotes. La pression exercée doit alors être comprise entre 1,0 et 1,5 bars. Dans un mode de réalisation préféré, la pression est de 1,2 bars. Dans le cas d'un enrichissement en cellules eucaryotes, pour ne pas présenter une viscosité trop importante, la solution d'alginate de sodium selon l'invention est concentrée à raison de 1,5 % à 3,0 %, préférentiellement de 1,5 % à 2,0 %. Dans un mode de réalisation particulier, le biomatériau selon l'invention est constitué d'une solution d'alginate de sodium à 1,7 %. L'initiation de la réticulation de ce biomatériau est alors réalisée par une solution de sulfate de calcium (CaS04) . Pour permettre une telle initiation de la réticulation, la solution de CaS04 présente avantageusement une concentration comprise entre
1,0 et 10,0 mg/ml, plus avantageusement entre 2,0 et 4,0 mg/ml et, de façon tout particulièrement intéressante, cette concentration en CaS0 est sensiblement égale à 3,0 mg/ml.
Dans un mode de réalisation particulier la réticulation du biomatériau est amorcée par une solution de sulfate de calcium (CaS04) à une concentration de 3,0 mg/ml à raison de 1,0 ml pour 5,5 ml d'alginate de sodium.
Dans le cas d'un enrichissement par d'autres éléments tels l'acide hyaluronique , des chondroïtines sulfates ou des particules d' hydroxyapatite , la viscosité de la solution augmente par rapport à celle décrite ci-dessus . Il convient donc soit de diminuer la concentration en alginate de sodium dans la solution de départ, soit d'augmenter le diamètre de la buse des stylets aérographes utilisés . Des expériences complémentaires ont été réalisées avec des solutions d' alginate de sodium enrichies par de l'acide hyaluronique . Les résultats ont montré qu'un dépôt est réalisable en utilisant une buse d'un diamètre de 1,2 mm (stylet Harder & Steenbeck® série Colani) tout en conservant une pression de 1,2 bars.
La présente invention repose sur un procédé original qui met en œuvre plusieurs techniques de réticulation d'une solution d' alginate de sodium. La mise en œuvre successive de ces différentes étapes de réticulation permet l'obtention d'un biomatériau composite, multiphasique et fonctionnalisé, pouvant être enrichi ou non. La présente invention décrit un nouveau procédé de fabrication d'un biomatériau de comblement à base d' alginate de sodium réticulé qui comprend les étapes suivantes :
a) préparer une solution à base d' alginate de sodium à raison de 1,5 % à 3,0 % ;
b) amorcer la réticulation de la solution à base d' alginate de sodium par ajout d'une quantité définie en concentration et en volume de sulfate de calcium ;
c) déposer la solution ainsi obtenue sur un support inerte ou fonctionnalisé grâce à des stylets aérographes ; d) réitérer les étapes a) à c) pour superposer dif érentes couches d' alginate de sodium réticulé sur un même support ;
e) une fois l'épaisseur désirée obtenue, procéder à l'initiation de la réticulation finale du biomatériau par nébulisation de chlorure de calcium à l'aide d'un stylet aérographe ;
f) procéder à la réticulation finale par trempage de la totalité du biomatériau ainsi obtenu dans un bain de chlorure de calcium.
Les stylets aérographes et le compresseur utilisés dans la mise en œuvre du procédé selon l'invention sont des matériels classiques connus de l'homme de l'art (stylets de marque Harder & Steenbeck® ou Paasche®) . Le diamètre d'ouverture du stylet est un élément déterminant dans la mise en œuvre du procédé selon l'invention car s'il ne possède pas un diamètre suffisant, la nébulisation de la solution d' alginate de sodium, dont la réticulation a d'ores et déjà été amorcée par ajout de sulfate de calcium, est rendue difficile et résulte en une dispersion non homogène. En effet, une obstruction des buses peut se produire à cause de la viscosité de la solution à base d' alginate de sodium formée durant l'étape b) ci-dessus. D'une manière générale, la concentration en alginate de sodium détermine le diamètre de la buse du stylet à utiliser. Dans un mode de réalisation particulier la buse du stylet aérographe doit avoir un diamètre compris entre 1,0 mm et 1,2 mm. Dans un mode de réalisation préféré, le stylet aérographe a un diamètre d'ouverture de 1 mm. Si la concentration en biomatériau utilisée est supérieure à 2,5 % , il conviendra d' utiliser une buse avec un diamètre supérieur à 1,2 mm. De tels stylets ne semblent cependant pas disponibles sur le marché à ce jour. Une telle application est cependant envisagée dans la présente description .
Les étapes mettant en œuvre les stylets aérographes sont réalisées sous pression. Le compresseur utilisé exerce une pression comprise entre 1,0 et 1,5 bars . Dans un mode de réalisation préféré, le compresseur exerce une pression de 1,2 bars .
Par ailleurs , la solution d' alginate de sodium peut être enrichie par des cellules eucaryotes et/ou par d'autres molécules comme de l'acide hyaluronique , des chondroïtines sulfates ou des particules d' hydroxyapatite .
Dans le cas d'un enrichissement en cellules eucaryotes, la pression exercée dans les stylets aérographes doit respecter ces cellules et ne pas être trop élevée pour ne pas en affecter la survie et le développement. La solution d' alginate de sodium doit alors être concentrée à 1,5 % à 2,0 %. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de fabrication d'un biomatériau de comblement à base d' alginate de sodium réticulé selon l'invention met en œuvre une solution à base d' alginate de sodium enrichie en cellules eucaryotes et concentrée à 1,7 % d' alginate de sodium. Comme décrit ci-dessus, les cellules eucaryotes sont résistantes aux différentes étapes de réticulation exercées sur le biomatériau en cours d'élaboration. Elles demeurent viables après les étapes d' initiation de la réticulation au sulfate de calcium et s'adaptent parfaitement au réseau tridimensionnel ainsi formé. Les chercheurs ont réalisé des études de viabilité pour démontrer que dans le cas de chondrocytes , ces derniers ne présentent pas de diminution d'activité mitochondriale par comparaison avec des cellules eucaryotes encapsulées dans un hydrogel d' alginate de sodium préparé selon une méthode classique de l'art antérieur (Fig. 2). Les inventeurs ont par ailleurs vérifié que la viabilité des cellules eucaryotes déposées dans chaque couche d' alginate de sodium réticulé n'est pas affectée par les dépôts successifs.
Si la solution en alginate de sodium est enrichie en d'autres molécules comme l'acide hyaluronique , les chondroïtines sulfates ou les particules d' hydroxyapatite , alors la concentration en alginate de sodium doit être diminuée . En effet, ces autres molécules augmentent la viscosité de la solution obtenue dans l'étape b) du procédé selon l'invention. La technique de dépôt par le biais de stylets aérographes ne peut être utilisée qu'avec une certaine plage de viscosité. Il peut également être envisagé d'utiliser des buses de stylets avec un diamètre supérieur. Cependant, certaines limites techniques existent et il est délicat de trouver des buses présentant un diamètre supérieur à 1,2 mm. Un tel matériel peut cependant être développé afin d'adapter le procédé selon l'invention à des solutions présentant une viscosité supérieure.
Le support utilisé dans l'étape c) du procédé selon l'invention, pour déposer la solution à base d' alginate de sodium de l'étape b) du procédé selon l'invention peut être inerte ou fonctionnalisé. Dans un mode de réalisation particulier le support est fonctionnalisé pour obtenir un biomatériau de comblement présentent des propriétés mécaniques et biologiques optimales .
Les chercheurs ont découvert de façon surprenante qu'un biomatériau de comblement très intéressant est obtenu par mise en œuvre du procédé selon 1 ' invention comprenant les étapes suivantes :
a) préparer une solution à base d' alginate de sodium à raison de 1,5 à 3%, ladite solution étant enrichie en cellules eucaryotes ;
b) amorcer la réticulation de la solution à base d' alginate de sodium par ajout d'une solution de sulfate de calcium présentant une concentration comprise entre 1 , 0 et 10,0 mg/ml.
c) déposer la solution ainsi obtenue sur un support inerte ou fonctionnalisé grâce à des stylets aérographes sous une pression comprise entre 1 et 1,5 bars ;
d) réitérer lés étapes a) à c) pour superposer différentes couches d' alginate de sodium réticulé sur un même support .
e) une fois l'épaisseur désirée obtenue, procéder à l'initiation de la réticulation finale du biomatériau par nébulisation de chlorure de calcium à l'aide d'un stylet aérographe, la concentration de chlorure de calcium étant comprise entre 80 et 120 mM ;
f) procéder à la réticulation finale par trempage de la totalité du biomatériau ainsi obtenu dans un bain de chlorure de calcium dont la concentration est comprise entre 80 et 120 mM.
Selon un exemple de réalisation préférentiel, la concentration de la solution de sulfate de calcium utilisé dans l'étape b) est comprise entre 2,0 mg/ml et 4,0 mg/ml, et est plus préférentiellement encore sensiblement égale à 3,0 mg/ml.
Préférentiellement , le sulfate de calcium est ajouté à raison de 1 ml pour 3 à 8 ml de solution d' alginate de sodium, de préférence de 1 ml pour 5 à 6 ml . Plus avantageusement, le volume utilisé pour la réticulation de la solution d' alginate de sodium est de 1,0 ml pour 5,5 ml d' alginate de sodium.
Selon un mode de réalisation intéressant, la pression mise en œuvre lors de l'étape c) du procédé est sensiblement égale à 1,2 bars.
Préférentiellement , la concentration en chlorure de calcium des étapes e) et £) est sensiblement égale à 102 mM.
Ainsi, de façon particulièrement avantageuse, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes :
a) préparer une solution à base d' alginate de sodium à 1,7 % , enrichie en cellules eucaryotes ;
b) amorcer la réticulation de la solution à base d' alginate de sodium par ajout de sulfate de calcium à 3 mg/ml à raison de 1 ml pour 5 , 5 ml de solution d' alginate de sodium ;
c) déposer la solution ainsi obtenue sur un support inerte ou fonctionnalisé grâce à des stylets aérographes sous une pression de 1,2 bars ;
d) réitérer les étapes a) à c) pour superposer différentes couches d' alginate de sodium réticulé sur un même support ;
e) une fois l'épaisseur désirée obtenue, procéder à l'initiation de la réticulation finale du biomatériau par nébulisation de chlorure de calcium à 102 mM à l'aide d'un stylet aérographe ;
f) procéder à la réticulation finale par trempage de la totalité du biomatériau ainsi obtenu dans un bain de chlorure de calcium à 102 mM.
Ce procédé original allie plusieurs facteurs déterminants pour la qualité du biomatériau selon l'invention : le dépôt homogène à l'aide des stylets aérographes d'une solution à base d' alginate de sodium enrichie en cellules eucaryotes , une pression de pulvérisation adaptée aux cellules eucaryotes et la réticulation en plusieurs étapes, comportant notamment un amorçage de la réticulation, des différentes couches déposées. Le biomatériau ainsi obtenu présente toutes les propriétés nécessaires au comblement de lésions focales du cartilage humain ou animal. L'un des écueils majeurs du procédé de dépôt par nébulisation d'un hydrogel à base d' alginate de sodium repose sur le fait que la pression d' air utilisée pour déposer la "s~o~2rti"ôn visqueuse de biomatériau a pour effet d'entraîner un écoulement de la solution à l'extérieur du support. Cet écueil est contourné en utilisant le sulfate de calcium pour initier la réticulation de la solution à déposer, ce qui a pour conséquence directe d' obtenir une surface de dépôt moins sensible à cette pression d'air. Ceci permet donc de déposer plus de substance et par conséquent d'obtenir une épaisseur plus importante. Ceci est totalement impossible si l'on utilise une solution d' alginate de sodium dont la réticulation n' a pas été initiée préalablement au dépôt .
La présente invention est illustrée par les figures suivantes. La Fig. 1 qui décrit les étapes du procédé de fabrication d'un biomatériau de comblement à base d' alginate de sodium réticulé enrichi en cellules eucaryotes :
(1) Dépôt de la première couche d'une solution d' alginate de sodium, de sulfate de calcium et de cellules eucaryotes à l'aide de stylets aérographes ;
(2) Dépôt de la seconde couche d' alginate de sodium, de sulfate de calcium et de cellules eucaryotes à l'aide de stylets aérographes ;
(3) Initiation de la réticulation par une nébulisation d'une solution de CaCl2 à l'aide de stylets aérographes ;
(4) Réticulation finale du biomatériau par trempage dans une solution de CaCl2.
La Fig. 2 illustre la viabilité des cellules encapsulées dans des biomatériaux selon l'art antérieur (monocouche et bicouche) par une mesure d'activité mitochondriale .
La mise en œuvre de tout moyen équivalent dans la réalisation du procédé selon l'invention est à considérer comme entrant dans la portée de la présente demande de brevet d' invention . La présente invention est mise en oeuvre et détaillée dans les exemples ci-dessous et les figures correspondantes. Ces exemples ne sont en aucun cas limitatifs quant à la portée de l'invention décrite et revendiquée dans les présentes.
Exemples
1. Réalisation d' un biomatériau non enrichi
L'ensemble du matériel est stérilisé par trempage dans une solution d' éthanol à 70 %. La solution d' alginate est stérilisée par autoclavage à 121 °C pendant 20 minutes. Elle est ensuite reprise avec une solution de NaCl à 0,9 % . La concentration d' alginate de sodium ainsi obtenue est de 2 %, soit 2 g pour 100 ml. La solution d' alginate de sodium est mise à agiter pendant 24 heures .
Extemporanément une solution de CaS0 est préparée à une concentration de 3 mg/ml et filtrée sur une membrane de 0,22 um.
Dans un godet de nébulisation, stérilisé au préalable et rincé par une solution de NaCl stérile, un volume de 5,5 ml d' alginate de sodium est mélangé avec 1 ml de solution de CaS04 puis mélangé activement afin d' obtenir une solution dont la viscosité est compatible avec la nébulisation.
Un premier dépôt est réalisé à l'aide d'un spray aérographe sous une pression de 1,2 bars à une distance de 10,0 cm à 15,0 cm du support inerte posé à plat. Il peut être envisagé l'utilisation d'un support fonctionnalisé. Une fois l'intégralité du volume de solution d' alginate de sodium combinée au CaS04 déposée en une couche uniforme et après une attente de 5 minutes, la seconde couche est déposée selon les mêmes modalités que précédemment.
Une fois le nombre de couches successives désiré est atteint, l'ensemble du matériau ainsi créé est soumis à une nébulisation à l'aide d'une solution de CaCl2 pendant 20 secondes. Une nouvelle réticulation est alors initiée. Ceci permet une manipulation du biomatériau en cours d'élaboration.
Le biomatériau est alors placé dans un bain de CaCl2 à une concentration de 102 mM pendant une période comprise entre 20 et 25 minutes suivant le nombre de couches d' alginate de sodium réticulé déposé (environ 10 minutes par couche déposée) .
Les différentes étapes de ce procédé sont détaillées dans la Fig. 1.
2. Réalisation d' un biomatériau enrichi en cellules eucaryotes
L'ensemble du matériel est stérilisé par trempage dans une solution d' éthanol à 70 %. La solution d' alginate est stérilisée par autoclavage à 121 °C pendant 20 minutes. Elle est ensuite reprise avec une solution de NaCl à 0,9 % . La concentration d' alginate de sodium ainsi obtenue est de 2 %, soit 2 g pour 100 ml. La solution d' alginate de sodium est mise à agiter pendant 24 heures .
Extemporanément une solution de CaS04 est préparée à une concentration de 3 mg/ml et filtrée sur une membrane de 0,22 um.
Pour fonctionnaliser ou enrichir le biomatériau, les cellules sélectionnées sont récupérées par trypsination et lavées. Elles sont ensuite associées à la solution d' alginate de sodium à une concentration de 3.106 cellules/ml d' alginate. On obtient une solution d' alginate de sodium enrichie en cellules eucaryotes .
Dans un godet de nébulisation, préalablement stérilisé et rincé par une solution de NaCl stérile, un volume de 5,5 ml d' alginate de sodium enrichi par des cellules eucaryotes, est mélangé avec 1 ml de solution de CaS04 puis mélangé activement afin d'obtenir une solution dont la viscosité est compatible avec la nébulisation.
Un premier dépôt est réalisé à l'aide d'un spray aérographe avec une pression de 1,2 bars à une distance de 10,0 cm à 15,0 cm du support posé à plat. Ce support peut être inerte ou fonctionnalisé. Une fois l'intégralité du volume de la solution d' alginate de sodium enrichie et réticulée par le CaSO, déposée en une couche uniforme, et après une attente de 5 minutes, le dépôt de la seconde couche est réalisé selon les mêmes modalités que précédemment. Une fois le nombre de couches successives désiré est atteint, l'ensemble du matériau ainsi créé est soumis à une nébulisation à l'aide d'une solution de CaCl2 pendant 20 secondes. Une nouvelle réticulation est alors initiée. Ceci permet une manipulation du biomatériau en cours d'élaboration.
Le biomatériau est alors placé dans un bain de CaCl2 à une concentration de 102 mM pendant une période comprise entre 20 et 25 minutes suivant le nombre de couches d' alginate réticulé déposé (environ 10 minutes par couche déposée) . Ce bain ne doit pas excéder 30 minutes car les cellules eucaryotes auraient un taux de viabilité largement diminué .
Les différentes étapes de ce procédé, à l'exception de l'étape d'enrichissement en cellules eucaryotes, sont détaillées dans la Fig . 1.
3. Analyse de la viabilité des cellules encapsulées dans des biomatériaux (simple couche et bicouche) par une mesure de l'activité mitochondriale (Test MTT) .
Ce test repose sur l'activité mitochondriale des cellules viables : le MTT (Bromure de 3- [4, 5-diméthylthiazol-2-yl] -2 , 5- diphényl-tétrazolium) de couleur jaune est réduit en présence de la succinate déshydrogénase mitochondriale sous forme de cristaux bleus de formazan. Les cellules utilisées ici sont des chondrocytes humains en primoculture.
Une biopsie calibrée de gel contenant de l' alginate de sodium, des chondrocytes humains, et enrichi ou non en hydroxyapatite (HAp) , est placée dans un puits , avec 125 μΐ de milieu complet et 25 μΐ d'une solution de MTT (Sigma®) à 5 mg/ml dilué dans du PBS . Les plaques sont incubées 4 heures à 37 °C. Le liquide est éliminé puis remplacé par un tampon SDS-DMF (Sodium Dodécyl Sulfate ; DiMéthylFormamide H20 ; pH 4,7) permettant de lyser les billes. L'ensemble est incubé 24 heures à 37 °C. L'absorbance à 580 nm est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre (Multiskan EX, ThermoLabsystems) .
On réalise des gels simple couche ou bicouche et on mesure l'activité mitochondriale dans les jours suivant la pulvérisation des cellules sur les différents gels . Les résultats du test MTT sont présentés dans la Fig. 2. On peut observer que les cellules présentent une activité mitochondriale dans un gel réalisé en biomatériau à base d' alginate de sodium jusqu'à 21 jours après leur pulvérisation. Ces cellules sont donc viables .

Claims

REVENDICATIONS
Procédé de fabrication d'un biomatériau de comblement à base d'alginate de sodium réticulé caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
a) préparer une solution à base d'alginate de sodium à raison de 1,5 % à 3,0 % ;
b) amorcer la réticulation de la solution à base d'alginate de sodium par ajout d'une quantité définie en concentration et en volume de sulfate de calcium ;
c) déposer la solution ainsi obtenue sur un support inerte ou fonctionnalisé grâce à des stylets aérographes ;
d) réitérer les étapes a) à c) pour superposer différentes couches d'alginate de sodium réticulé sur un même support ;
e) une fois l'épaisseur désirée obtenue, procéder à l'initiation de la réticulation finale du biomatériau par nébulisation de chlorure de calcium à l'aide d'un stylet aérographe ;
f) procéder à la réticulation finale par trempage de la totalité du biomatériau ainsi obtenu dans un bain de chlorure de calcium.
Procédé de fabrication d'un biomatériau de comblement à base d'alginate de sodium réticulé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la solution de sulfate de calcium présente une concentration comprise entre 1,0 et 10,0 mg/ml, préférentiellement entre 2,0 et 4,0 mg/ml, préférentiellement sensiblement égale à 3 , 0 mg/ml . Procédé de fabrication d'un biomatériau de comblement à base d'alginate de sodium réticulé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que le sulfate de calcium est ajouté à raison de 1 ml pour 3 à 8 ml de solution d'alginate de sodium, de préférence de 1 ml pour 5 à 6 ml, de préférence le sulfate de calcium est ajouté à raison de 1 ml pour 5,5 ml de solution d'alginate de sodium.
Procédé de fabrication d'un biomatériau de comblement à base d'alginate de sodium réticulé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que l'initiation de la réticulation finale est obtenue par nébulisation de chlorure de calcium présentant une concentration comprise entre 80 et 120 mM, de préférence sensiblement égale à 102 mM.
Procédé de fabrication d'un biomatériau de comblement à base d'alginate de sodium réticulé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la réticulation finale est obtenue par trempage dans un bain de chlorure de calcium présentant une concentration comprise entre 80 et 120 mM, de préférence sensiblement égale à 102 mM.
Procédé de fabrication d'un biomatériau de comblement à base d'alginate de sodium réticulé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le support est fonctionnalisé.
Procédé de fabrication d'un biomatériau de comblement à base d'alginate de sodium réticulé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la solution à base d'alginate de sodium est enrichie en cellules eucaryotes et concentrée à 1,7 % d'alginate de sodium. Procédé de fabrication d'un biomatériau de comblement à base d'alginate de sodium réticulé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le diamètre minimal d'ouverture de la buse du stylet aérographe est comprise entre 1,0 mm et 1,2 mm, préférentiellement 1,0 mm.
Procédé de fabrication d'un biomatériau de comblement à base d'alginate de sodium réticulé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) préparer une solution à base d'alginate de sodium à 1,7 %, enrichie en cellules eucaryotes ;
b) amorcer la réticulation de la solution à base d'alginate de sodium par ajout de sulfate de calcium à 3 mg/ml à raison de 1 ml pour 5,5 ml de solution d'alginate de sodium ;
c) déposer la solution ainsi obtenue sur un support inerte ou fonctionnalisé grâce à des stylets aérographes sous une pression de 1,2 bars ;
d) réitérer les étapes a) à c) pour superposer différentes couches d'alginate de sodium réticulé sur un même support ;
e) une fois l'épaisseur désirée obtenue, procéder à l'initiation de la réticulation finale du biomatériau par nébulisation de chlorure de calcium à 102 mM à l'aide d'un stylet aérographe ;
f) procéder à la réticulation finale par trempage de la totalité du biomatériau ainsi obtenu dans un bain de chlorure de calcium à 102 mM.
Biomatériau de comblement à base d'alginate de sodium réticulé susceptible d'être obtenu selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé en ce qu'il est multiphasique et constitué d'au moins deux couches d'alginate de sodium dont la réticulation a été amorcée par du sulfate de calcium, lesdites couches étant déposées les unes sur les autres grâce à des stylets aérographes. 11. Biomatériau de comblement à base d'alginate de sodium réticulé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est constitué d'au moins deux couches d'alginate de sodium déposées les unes sur les autres grâce à des stylets aérographes et un compresseur, puis le biomatériau multiphasique ainsi formé subit une nouvelle réticulation par le chlorure de calcium initiée par nébulisation à l'aide d'un stylet aérographe et finalisée par un bain dans une solution de chlorure de calcium.
12. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que la solution d'alginate de sodium est enrichie par un élément sélectionné parmi des cellules eucaryotes, ou parmi des molécules ayant une activité biologique telles que l'acide hyaluronique, les chondroïtines sulfate ou des microparticules d'hydroxyapatite.
13. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que la concentration en alginate de sodium est comprise entre 1,5 % et 3,0 %, préférentiellement 1,7 %.
14. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé en ce que la solution de sulfate de calcium a une concentration comprise entre 1,0 et 10,0 mg/ml, de préférence entre 2,0 et 4,0 mg/ml, préférentiellement sensiblement égale à 3,0 mg/ml .
15. Biomatériau selon la revendication 14 caractérisé en ce que le volume utilisé pour la réticulation de la solution d'algxnate de sodium est de 1 ml pour 3 à 8 ml de solution d'algxnate de sodium, de préférence 1 ml pour 5 à 6 ml, de préférence 1 ml pour
5,5 ml d'algxnate de sodium.
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