WO2012143591A1 - Microorganismos capaces de hidrolizar lípidos y su utilización en depuración de aguas - Google Patents

Microorganismos capaces de hidrolizar lípidos y su utilización en depuración de aguas Download PDF

Info

Publication number
WO2012143591A1
WO2012143591A1 PCT/ES2012/070256 ES2012070256W WO2012143591A1 WO 2012143591 A1 WO2012143591 A1 WO 2012143591A1 ES 2012070256 W ES2012070256 W ES 2012070256W WO 2012143591 A1 WO2012143591 A1 WO 2012143591A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
microorganism
source
solid support
wastewater
oil
Prior art date
Application number
PCT/ES2012/070256
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Amalia ROCA HERNÁNDEZ
Jennifer Solano Parada
Original Assignee
Bio-Iliberis Research & Development S.L.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio-Iliberis Research & Development S.L. filed Critical Bio-Iliberis Research & Development S.L.
Publication of WO2012143591A1 publication Critical patent/WO2012143591A1/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • C02F3/343—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used for digestion of grease, fat, oil
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F2101/00—Nature of the contaminant
    • C02F2101/30—Organic compounds
    • C02F2101/301—Detergents, surfactants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas
    • C12R2001/39—Pseudomonas fluorescens

Definitions

  • the invention relates to a strain of Pseudomonas fluorescens with lipid and proteolytic activity, capable of forming biofilms on plastic supports and resistant to bleach and detergents. It is also related to its applications in the treatment of urban, industrial and agricultural wastewater. BACKGROUND OF THE INVENTION
  • lipases and proteases occupy a preferential place due to their stability against organic solvents, their substrate specificity and their enantioselectivity.
  • Lipases catalyze the hydrolysis of lipids releasing fatty acids and glycerol
  • Biological processes are predominant in the treatment of domestic and industrial wastewater. Proteins, polysaccharides and lipids are one of the biggest problems in urban and industrial spills. This is particularly relevant in companies in the agribusiness sector, slaughterhouses, hotels and restaurants, which generate waste with large amounts of fats and oils.
  • the high concentration of fat often causes problems in water purification processes, since fat floats on the surface of the water creating a layer that decreases oxygen transfer and affects aerobic processes. Therefore, it is essential to make a prior separation of this type of compounds. Frequently, the separation of fats, oils and proteins is carried out by physical processes, including decantation; However, these processes require a subsequent collection of this waste, which increases its cost.
  • lipases of microbial origin is a less expensive alternative, in addition to being more efficient and ecological, since the biological process converts this waste into carbon dioxide, water and biomass, which can be reused after drying as an organic amendment [Bhumibhamon , A. Koprasertsak and S. Funthong. (2002) Biotreatment of high fat and oil wastewater by Upase producing microorganisms. Kasetsart J Nat Sci. 36: 261-267; Kaeberlein T, Lewis K, Epstein S. (2002) Isolating "uncultivable" microorganisms in a simulated natural environment. Science 296: 1127-1129].
  • the inventors have isolated and characterized a microorganism of the species Pseudomonas fluorescens, called P. fluorescens BIRD-4 and deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT) on January 20, 2011 with accession number CECT 7850, which has the capacity to degrading lipids and proteins, which allows the use of said microorganism in the elimination of fats and oils, thus avoiding the inconveniences associated with the use of physical-chemical techniques in industrial processes that include the elimination of said fats and oils.
  • said microorganism is able to form a biofilm on solid supports, grow in Presence of non-ionic detergents and survive in the presence of 0.1% sodium hypochlorite.
  • microorganism as provided by this invention [P. BIRD-4 fluorescens (CECT 7850)] was carried out by the procedure described in Examples 1 and 2. Said microorganism has lipase activity (Example 4) and protease (Example 6) as well as ability to form biofilms on solid supports (Example 3) and grow in non-ionic detergents (Example 5) and in the presence of relatively high bleach concentrations (Example 8).
  • the invention relates to a microorganism of the species Pseudomonas fluorescens deposited in the Spanish Type Culture Collection with access number CECT 7850, which has the ability to hydrolyze lipids and proteins, or a mutant of said microorganism which maintains said ability to hydrolyze lipids and proteins.
  • the invention relates to a biologically pure culture of a microorganism according to the invention.
  • the invention relates to an active solid support comprising a solid support and a microorganism according to the invention.
  • the invention in another aspect, relates to a method for the microbiological degradation, in aerobic conditions, of a fat and / or an oil in an aqueous medium, comprising contacting said aqueous medium containing a fat and / or an oil with a microorganism or with an active solid support according to the invention.
  • the invention in another aspect, relates to a method for the microbiological degradation, under aerobic conditions, of a protein in an aqueous medium, which comprises contacting said aqueous medium containing a protein with a microorganism or with an active solid support according to the invention.
  • the invention relates to a method for the microbiological degradation, in aerobic conditions, of a fat, an oil and / or a protein present in a wastewater, comprising:
  • the invention relates to a process for the formation of a biofilm as a monoculture of a microorganism, comprising the application of an effective amount of a microorganism according to the invention to a culture containing a solid support and an oil as a source. of carbon or a source of protein as a source of carbon and nitrogen.
  • the invention relates to a method for the isolation of a microorganism that has the ability to degrade lipids (fats and oils) and proteins, which comprises:
  • step b) add to the suspension obtained in step a) a carbon source consisting of one or more types of lipids, a source of phosphorus and a nitrogen source;
  • step c) incubating the suspension resulting from step b) under aerobic conditions that allow the growth of microorganisms capable of hydrolyzing lipids;
  • step d) incubate the seeded plates of step d) for a period of time between 1 and 7 days at a temperature between 25 ° C and 30 ° C;
  • step e isolate and purify the colonies of the microorganisms, obtained in the incubation of step e);
  • step f) sowing in colonies of differential solid medium the colonies of the isolated and purified microorganisms in step f), in order to select those that exhibit lipolytic activity, in a medium of culture containing a lipid as a substrate, a carbon source, a phosphorus source, a nitrogen source and a fluorescent dye in ultraviolet light; incubating the plates for a period of time between 1 and 7 days at a temperature between 25 ° C and 30 ° C, selecting those that at the end of the incubation period have a fluorescent orange halo when exposed to ultraviolet light;
  • step g) sow in colonies of differential solid medium the colonies of the microorganisms selected in step g), in a culture medium containing skimmed milk as a substrate, a carbon source, a source of phosphorus and a source of nitrogen, with the in order to analyze the proteolytic activity, incubating the plates for a period of time comprised between 1 and 7 days at a temperature between 25 ° C and 30 ° C, selecting those that after the incubation period have a transparent halo; and
  • the inventors have isolated and characterized a microorganism of the species Pseudomonas fluorescens, called P. fluorescens BIRD-4 and deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT) on January 20, 2011 with accession number CECT 7850, which has the capacity to Degrade lipids and proteins and, in addition, form a biofilm on solid supports, grow in the presence of non-ionic detergents and resist up to 0.1% of sodium hypochlorite, which allows the use of said microorganism in the elimination of fats and oils, avoiding thus the disadvantages associated with the use of physicochemical techniques in industrial processes that include the elimination of said fats and oils.
  • CECT Spanish Type Culture Collection
  • the isolation of the microorganism provided by this invention was carried out by the procedure described in Examples 1 and 2. Briefly, a 10 g sample of an agricultural soil was suspended in a minimum medium M9 [April MA, Michan C, Timmis KN , Ramos JL. 1989. Regulator and enzyme specificities of the TOL plasmid-encoded upper pathway for degradation of aromatic hydrocarbons and expansion of the substrate range of the pathway. J Bacteriol. 171: 6782-90], without carbon source, to which olive oil was subsequently added until reaching a concentration of 1% (v / v). After incubating the resulting suspension, dilutions were seeded in solid growth plates of general growth and colonies having a different macroscopic morphology were selected.
  • Example 3 the ability of said microorganism to form biofilms on solid supports (Example 3) was analyzed, its lipase activity (Example 4) and protease (Example 6) were quantified, its growth in non-ionic detergents (Example 5) was evaluated, its use of proteins as the sole source of carbon (Example 6), and the minimum inhibitory concentration was determined using commercial sodium hypochlorite (Example 8).
  • P. fluorescens a microorganism of the species P. fluorescens was identified, called P.
  • fluorescens BIRD-4 and with deposit number CECT 7850 which has the ability to degrade or hydrolyze lipids and proteins and, in addition, form a biofilm on solid supports, grow in the presence of non-ionic detergents and survive in the presence of 0.1% sodium hypochlorite.
  • the invention relates to a microorganism of the species Pseudomonas fluorescens deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT) with accession number CECT 7850, hereinafter, microorganism of the invention, which has the ability to hydrolyze lipids and proteins, or a mutant of said microorganism that maintains said ability to hydrolyze lipids and proteins.
  • CECT Spanish Type Culture Collection
  • Hydrolysis is a reaction that involves breaking chemical bonds through the intervention of water molecules, and can be acidic (when performed in the presence of strong acidic solutions, for example, HC1, H 2 SO 4 , etc.), basic (when it is produced in the presence of a basic solution, for example, NaOH, BaOH, etc.) or enzymatic (when the reaction is carried out by enzymes (in general, called "hydrolases").
  • acidic when performed in the presence of strong acidic solutions, for example, HC1, H 2 SO 4 , etc.
  • basic when it is produced in the presence of a basic solution, for example, NaOH, BaOH, etc.
  • enzymatic when the reaction is carried out by enzymes (in general, called “hydrolases").
  • lipid in the present invention, “ability to hydrolyse lipids” means the ability of a microorganism to break the ester bonds that bind fatty acids to alcohols, for example, glycerin or glycerol.
  • lipid includes oils, fats, etc.
  • ability to hydrolyze proteins is understood as the ability of a microorganism to break the peptide bonds that bind the amino acids giving rise to oligopeptides and the free amino acids themselves.
  • protein includes both proteins and peptides in general (including oligopeptides and polypeptides).
  • the ability of a microorganism to hydrolyze lipids and proteins can be determined by any conventional procedure known in the state of the art.
  • the ability of a microorganism to hydrolyze lipids can be tested by incubating said microorganism in a liquid medium with olive oil or butter as the sole source of carbon and observing the growth of the microorganism in the culture medium over time as shown in Example 2, or, alternatively, incubating the microorganism in a complex solid medium that incorporates a lipid emulsion and an indicator identified as "Rhodamine B" [Kouker G, Jaeger KE. 1987. Specific and sensitive p ⁇ ate assay for bacterial Upases. Appl Environ Microbiol. 53: 211-3], as the bacteria are selected in Example 1.
  • a microorganism to hydrolyze proteins can be verified by incubating said microorganism in a minimum medium M9 [April et al, cited above], with albumin as the sole source of carbon or, alternatively, incubating the microorganism in a complex solid medium that incorporates a skim milk and observing the formation of a halo around the bacterial colony [Sokol PA, Ohman DE, Iglewski BH. 1979. A More Sensitive P ⁇ ate Assay for Detection of Protease Production by Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol. 9 (4): 538-40], as shown in Example 7.
  • microorganism of the invention all those mutant microorganisms of the P. fluorescens BIRD-4 strain (CECT 7850) that maintain said ability to hydrolyze lipids and proteins are also contemplated.
  • mutant includes any microorganism resulting from a mutation or change in the DNA of a gene in an organism that results in a character (phenotype) that is not found in the wild-type. ) in a specific embodiment, said mutant is a mutant of P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850) that maintains essentially the same characteristics as those of the parental strain [P. BIRD-4 fluorescens (CECT 7850)], such as the ability to hydrolyze lipids and proteins.
  • the microorganism of the invention in addition to hydrolyzing lipids and proteins, has the ability to form a biofilm on a solid support. Therefore, in a particular embodiment, the microorganism of the invention also has the ability to form a biofilm on a solid support.
  • biofilm means the organized microbial ecosystem formed by one or more microorganisms associated with a surface, with functional characteristics and complex structures. This type of microbial conformation occurs when planktonic cells adhere to a surface or substrate, forming a community, which is characterized by the excretion of a protective adhesive extracellular matrix.
  • a biofilm can contain approximately 15% cells and 85% extracellular matrix. This matrix is usually formed of exopolysaccharides, which form channels through which water, enzymes, nutrients, and waste circulate. There the cells establish relationships and dependencies: they live, cooperate and communicate through chemical signals (quorum sensing), which regulate the expression of genes differently in different parts of the community, such as a tissue in a multicellular organism.
  • the ability of a microorganism to form a biofilm on a solid support can be determined by any conventional procedure, for example, culturing the microorganism in liquid medium, on a plastic support (for example, polystyrene), changing the medium periodically and observing the adhesion of the microorganism to the surface of the container until it covers all of it (Example 3) [Andersson S, Nilsson M, Dalhammar G, KuttUva R. 2008. Assessment of carrier materials for biofilm formation and denitrification. Vatten 64: 201-207].
  • solid support means any surface which, advantageously, has a high specific surface that facilitates the adsorption of the microorganisms of the invention.
  • materials that can form the solid support include polymeric materials, in particular cellulosic materials and materials derived from cellulose, nitrocellulose, cellulose acetate, polyacrylamide, polyvinylchloride, crosslinked dextran, agarose, polyacrylate, polyethylene , polypropylene, poly (4-methylbutene), glass, metal, ceramics and the like. These materials can be used alone or in combination with each other depending on the needs.
  • the invention relates to an active solid support, hereinafter active solid support of the invention, comprising a support of a plastic material and the microorganism of the invention which, in a particular embodiment, can Be part of a biofilm.
  • the solid support material is a plastic material.
  • the inventors have verified that the microorganism of the invention can grow in the presence of a non-ionic detergent. Therefore, in another particular embodiment, the microorganism of the invention has the ability to grow in a culture medium comprising a non-ionic detergent.
  • non-ionic detergent includes any chemical compound that stabilizes oil and water mixtures by reducing the tension at the interface between the oil and water molecules, and whose chemical structure has no net charge.
  • non-ionic detergent includes any chemical compound that stabilizes oil and water mixtures by reducing the tension at the interface between the oil and water molecules, and whose chemical structure has no net charge.
  • non-ionic detergent includes any chemical compound that stabilizes oil and water mixtures by reducing the tension at the interface between the oil and water molecules, and whose chemical structure has no net charge.
  • non-ionic detergent include, but are not limited to, cetyl alcohol, stearyl alcohol, oleyl alcohol, decyl glycoside, lauryl glycoside, octyl glycoside, Triton X-100, etc.
  • the ability of a microorganism to grow in a culture medium comprising a non-ionic detergent can be determined by any conventional process of the prior art, for example, by culturing the microorganism in solid medium with a polysorbate and observing the growth of the microorganism in the plaque with a halo around the colony, indicating degradation of the polysorbate as described in Example 5 [Thomson CA, Delaquis PJ, Mazza G. 1999. Detection and Measurement of Microbial Lipase Activity: A Review. Crit Rev Food Sci Nutn 39 (2): 165-87].
  • the microorganism of the invention also has the ability to grow in a culture medium comprising sodium hypochlorite in a concentration of up to 0.1%.
  • the ability of a microorganism to grow in the presence of sodium hypochlorite can be determined by any conventional procedure, for example, by culturing the microorganism in LB medium together with sodium hypochlorite and observing the growth of the microorganism, as described in Examples 8 and 9 [Arancegui N, Cabanillas M, Mart ⁇ nez A, Funosas E, Maestri L, Hermida Lucena P. 1999. Quality control of decontaminating agents. Odontol Latinoam Act. 12: 83-8].
  • a biologically pure culture of a microorganism of the invention constitutes an additional aspect of the present invention.
  • biologically pure culture is understood as that culture in which the microorganism of the invention is in a proportion equal to or greater than 95% with respect to the rest of microorganisms present in the culture.
  • the microorganism of the invention P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850) is capable of hydrolyzing lipids and proteins and, in addition, is capable of forming a biofilm on a solid support, growing in the presence of a detergent non-ionic, and grow in the presence of sodium hypochlorite in a concentration of up to 0.1%). Therefore, all these capacities make the microorganism of the invention can be used successfully in microbiological degradation processes aerobic fats, oils and proteins in, for example, urban wastewater and industrial waste.
  • anobic microbiological degradation is understood as the transformation in the presence of oxygen of complex compounds (for example, polymers) into simple compounds (eg, monomers) by the action of microorganisms or derived products of their metabolism.
  • the invention relates to a process for microbiological degradation in aerobic conditions of a lipid in an aqueous medium, which comprises contacting said aqueous medium containing a lipid with the microorganism of the invention or with the active solid support of the invention.
  • lipid as used herein includes fats and oils.
  • fat is used to designate several kinds of lipids, although it generally refers to acylglycerides, that is, esters in which one, two or three fatty acids bind to a glycerin molecule, forming monoglycerides, diglycerides and triglycerides respectively. Fats are present in many organisms and have both structural and metabolic functions. Solid triglycerides at room temperature are called fats, while liquid triglycerides at room temperature are known as oils.
  • said lipid is an oil, such as an oil of vegetable origin, an oil of animal origin, and mixtures thereof.
  • Vegetable oils include all those oils that come from the fruits and seeds of oilseeds. Examples of vegetable oils include, but are not limited to, palm oil, coconut oil, olive oil, sunflower oil, peanut oil, almond oil, palm kernel oil, flax oil, safflower oil, castor, rapeseed oil, corn oil, sesame oil, soybean oil, etc.
  • Animal oils include all those oils from animal fat. Examples of animal oils include, but are not limited to, cod liver oil, whale oil, seal oil, lard oil, hypoglossal liver oil, ox foot oil, shark oil, dolphin oil, etc.
  • the invention in another aspect, relates to a method for microbiological degradation, under aerobic conditions, of a protein in a medium. aqueous, which comprises contacting said aqueous medium containing a protein with the microorganism of the invention or with the active solid support of the invention.
  • the aqueous medium comprises a protein selected from a protein of plant origin, a protein of animal origin and mixtures thereof.
  • Proteins of plant origin include, without limitation, proteins from legumes, cereals, nuts, etc.
  • Proteins of animal origin include, but are not limited to, proteins from meat, fish, milk, cheese, eggs, etc.
  • the invention relates to a method for microbiological degradation, under aerobic conditions, of a lipid and / or a protein present in a wastewater, which comprises
  • wastewater means water contaminated with the materials generated as a result of human activity, which, for reasons of public health, cannot be discharged without treatment in conventional lakes or streams.
  • the main sources of water pollution can be classified as urban (formed by the sewage of homes and commercial establishments), industrial (formed by wastewater from industrial processes) and agricultural (formed by wastewater from, for example, of agriculture, commercial livestock and poultry farms).
  • the wastewater to be treated is a domestic wastewater, an industrial wastewater or an agricultural wastewater.
  • the microorganism of the invention can be applied directly to the wastewater to be treated or it can be added together with a solid support as described previously, to give rise to an active solid support.
  • the microorganism of the invention is applied directly to the wastewater to be treated or, alternatively, in another particular embodiment, it is applied as part of an active solid support comprising a biofilm as a monoculture of the microorganism of the invention on a solid support, preferably a solid support of a plastic material.
  • the microorganism of the invention has the ability to form a biofilm, for which it is necessary to contact the microorganism of the invention with a solid support in the appropriate conditions (light, temperature, pH, nutrients, etc.) to allow biofilm formation.
  • the invention relates to a process for the formation of a biofilm as a monoculture of a microorganism, which comprises the application of an effective amount of the microorganism of the invention to a culture containing a support of a plastic material and an oil as a source of carbon or a source of protein as a source of carbon and nitrogen.
  • oils and proteins that can be degraded by the microorganism of the invention have been previously described and are applicable to the present inventive aspect.
  • said oil is an olive oil and said protein source is a serum of animal origin.
  • the invention relates to a method for the isolation of a microorganism that has the ability to degrade lipids, such as fats and oils, and proteins, hereinafter, a method of isolation of the microorganism of the invention, comprising:
  • step b) add to the suspension obtained in step a) a carbon source consisting of one or more types of lipids, a phosphorus source and a nitrogen source; c) incubating the suspension resulting from step b) under aerobic conditions that allow the growth of microorganisms capable of hydrolyzing lipids;
  • step d) incubate the seeded plates of step d) for a period of time between 1 and 7 days at a temperature between 25 ° C and 30 ° C;
  • step e isolate and purify the colonies of the microorganisms, obtained in the incubation of step e);
  • step f) sowing in colonies of differential solid medium the colonies of the isolated and purified microorganisms in step f), in order to select those that exhibit lipolytic activity, in a culture medium containing a lipid as a substrate, a carbon source , a phosphorus source, nitrogen source and a fluorescent dye in ultraviolet light; incubating the plates for a period of time between 1 and 7 days at a temperature between 25 ° C and 30 ° C, selecting those that at the end of the incubation period have a fluorescent orange halo when exposed to ultraviolet light;
  • the first stage of the process for the isolation of the microorganism of the invention comprises collecting a soil sample, such as, for example, a soil sample from an agricultural soil. Once the sample is collected, it suspended in a minimum culture medium that lacks a carbon source.
  • a soil sample such as, for example, a soil sample from an agricultural soil.
  • a minimum culture medium that lacks a carbon source.
  • Any culture medium minimum of those described in the state of the art can be used in the implementation of the method of isolation of the microorganism of the invention, such as M9 minimum medium whose specific composition per liter is: 7.0 g, Na 2 HP0 4 xl2 H 2 0; 3.0 g KH 2 P0 4 , 1.0 g; H 4 C1; 0.5 g NaCl, IX trace element solution and lmL / L 6% ferric citrate or (w / v) [April MA et al.
  • lipase production medium which is composed of: 1% olive oil, 6% peptone, 0.5% of K 2 HP0 4 , 0.1% MgS0 4 -7H 2 0.04% gum arabic [Peng R, Lin J, Wei D. 2010. Purification and characterization of an organic solvent-tolerant Upase from Pseudomonas aeruginosa CS- 2 Appl Biochem Biotechnol. 162: 733-43].
  • any fat or oil is added as a carbon source, a phosphorus source and a nitrogen source.
  • a carbon source examples of fats and oils that can be used in the context of the present invention as a carbon source have been described in detail previously.
  • the carbon sources used are olive oil as vegetable oil and butter as animal fat.
  • any nitrogen source assimilable by the microorganisms to be identified for example, ammonium compounds, nitrate, urea, amino acids, etc. can be used as a nitrogen source.
  • the amount of nitrogen source that can be added to the suspension obtained in step a) can vary within a wide range; however, in a particular embodiment, a source of nitrogen is added in an amount suitable to reach a concentration between 5 and 10 mM.
  • trace elements can be added, for example, in the form of mineral salts.
  • Mineral salts are the source of anions and cations for microorganisms, among which are: K, Mg, Ca, Fe. Apart from these ions, which are required in higher concentrations, bacteria need tiny amounts of other elements, such as: Mn + , Co 2+ , Ni + , Mo + , Zn 2+ , among others.
  • the trace elements were added in a concentration between 0.07 and 1 mM.
  • phosphorus both organic and inorganic phosphates can be used.
  • the phosphorus source was added in the form of phosphates.
  • step c) the incubation of the suspension resulting from stage b) is carried out at a temperature between 25 ° C and 30 ° C, for a period of time between 1 and 7 days, with optional agitation, under aerobic conditions to allow the growth of microorganisms.
  • step d) dilutions of the suspension resulting from the culture obtained in step c) are seeded to inoculate general growth agar plates.
  • Any general growth agar can be used in the implementation of the present inventive aspect.
  • the composition per liter of the growth agar is 4.3 g of meat peptone, 4.3 g of casein peptone, 6.4 g of sodium chloride and 15 g of agar [Hasan F, Shah AA, Hameed A. (2009) Methods for detection and characterization of Upases: A comprehensive review. Biotechnol Adv. 27: 782-98].
  • the agar plates are inoculated, they are incubated at a temperature between 25 ° C and 30 ° C, for a period of time between 1 and 7 days [step e)].
  • step f) of the procedure all colonies obtained in stage e) are isolated and purified, using, for example, a general means of growth as used in the previous stage.
  • step g) the colonies that have lipolytic activity are selected, sowing all the bacteria purified in stage f) in plates of differential solid medium, whose composition per liter is, for example: 4.3 g of meat peptone, 4.3 g of casein peptone, 6.4 g of sodium chloride and 15 g of agar and contains up to 3% (v / v) of a vegetable oil as single source of phosphorus and a rhodamine B as a dye at a final concentration of 0.001% [Kouker G, Jaeger KE. (1987) Specific and sensitive p ⁇ ate assay for bacterial Upases. Appl Environ microbiol.
  • step g) the plates seeded in step g) are incubated at a temperature between 25 ° C and 30 ° C, for a period of time comprised between 1 and 7 days, selecting those that after the incubation period have an orange halo fluorescent when exposed to ultraviolet light.
  • the proteolytic activity of all the bacteria selected in step g) is analyzed, inoculating plates of differential solid medium containing skimmed milk as a substrate, a carbon source, a phosphorus source and a nitrogen source.
  • the specific composition per liter of said differential medium is, for example: 70 g of Na 2 HP0 4 x 12 H 2 0; 30 g of KH 2 P0 4 , 10 g of H 4 C1; 5 g of NaCl, IX trace element solution and lml / 1 of 6% ferric citrate or [Jha, BK, MG Pragash, J. Cletus, G. Raman and N. Sakthivel, (2009).
  • All bacteria selected in step h) were identified by amplifying a 1550 bp fragment from the 16S rRNA gene, using GM3 primers [5'- AGAGTTTGATCMTGGC-3 '(SEQ ID NO: 1)], where M is A or C, and GM4 [5'-ACCTTGTTACGACTT-3 '(SEQ ID NO: 2)] [Blóthe M, Akob DM, Kostka JE, Góschel K, Drake HL, kusel K. (2008). pH gradient - induced heterogeneity of Fe (III) - reducing microorganisms in coal mining - associated lake sediments. Applied Environmental Microbiology. 74: 1019-1029].
  • One of the isolated colonies, the so-called Pseudomonas fluorescens BIRD-4 was deposited on January 20, 2011 in the Spanish Type Culture Collection with the accession number CECT 7850.
  • Isolation of bacteria A sample of 10 g of agricultural soil was suspended in a minimum medium, in a 1: 10 ratio (w / v).
  • Said medium is a minimum medium without a carbon source whose specific composition per liter is: 7.0 g of Na 2 HP0 4 x l2 H 2 0, 3.0 g of KH 2 P0 4 , 1.0 g of H 4 C1 , 0.5 g of NaCl, IX of trace elements solution, 1 mM MgS0 4 and 1 ml of ferric ammonium citrate (6 g / 1).
  • an olive oil was added in sufficient quantity to reach a concentration of 1% (v / v) [April MA, Michan C, Timmis KN, Ramos JL. . 1989. Regulator and enzyme specificities of the TOL plasmid-encoded upper pathway for degradation of aromatic hydrocarbons and expansion of the substrate range of the pathway. J Bacteriol. 171: 6782-90].
  • the resulting suspension was incubated at a temperature between 25 ° C and
  • All selected and purified bacteria were inoculated in a selective medium, consisting of a nutrient medium whose composition per liter is: 4.3 g of meat peptone, 4.3 g of casein peptone, 6.4 g of sodium chloride and 15 g agar, supplemented with 3% olive oil and 0.001% rhodamine B.
  • oils and fats as the sole source of carbon, in aerobic conditions
  • Example 1 The ability of the bacteria isolated in Example 1 to grow in liquid medium with olive oil or butter as the sole source of carbon was analyzed. To do this, bacteria previously isolated and identified individually (Example 1), M9 (7.0 g of Na 2 HP0 4 x l2 H 2 0, 3.0 g of KH 2 P0 4 , 1.0 g of H 4 C1, 0.5 g of inoculated in a minimum medium NaCl, IX of trace elements solution, 1 mM MgS0 4 and 1 ml of ammonium ferric citrate (6 g / 1)) [April MA et al, cited above], with 3% olive oil or 3% butter, as Only carbon source.
  • M9 7.0 g of Na 2 HP0 4 x l2 H 2 0, 3.0 g of KH 2 P0 4 , 1.0 g of H 4 C1, 0.5 g of inoculated in a minimum medium NaCl, IX of trace elements solution, 1 mM MgS0 4 and 1 ml of
  • the cultures were incubated with shaking (between 50 and 200 rpm) in a Kühner orbital incubator. Over time, counts of viable microorganisms were performed, observing that the population density increased 4 orders of magnitude in approximately 24 hours with each of the carbon sources.
  • a culture of bacteria from the colony identified as Pseudomonas fluorescens BIRD-4 has been deposited on 01/20/2011, in the Spanish Type Culture Collection (CECT), Burjasot (Valencia, Spain), with access number CECT 7850 .
  • the cultures were incubated with shaking (between 50 and 200 rpm) in a Kühner orbital incubator.
  • the culture medium was changed every 2 days, with a daily observation. This bacterium is able to cover the entire surface of the plastic support (polystyrene) after 10 days.
  • the lipase activity was quantified from the culture supernatant of the P. fluorescens BIRD-4 bacteria (CECT 7850).
  • said bacterium was inoculated in a minimum medium M9 (7.0 g of Na 2 HP0 4 x l2 H 2 0, 3.0 g of KH 2 P0 4 , 1.0 g of NH 4 C1, 0.5 g of NaCl, IX trace elements, 1 mM MgS0 4 and 1 ml of ferric ammonium citrate (6 g / 1)) [April MA, et al, cited supra], with 25 mM glucose, as a carbon source.
  • M9 7.0 g of Na 2 HP0 4 x l2 H 2 0, 3.0 g of KH 2 P0 4 , 1.0 g of NH 4 C1, 0.5 g of NaCl, IX trace elements, 1 mM MgS0 4 and 1 ml of ferric ammonium citrate (6 g / 1)
  • the cultures were incubated with shaking (between 50 and 200 rpm) in a Bruhner orbital incubator. After approximately 18 hours the culture was centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes collecting the supernatant. Subsequently, 1 ml of the supernatant, 2 ml of distilled water, 1 ml of Tris-HCl pH 7.7, and 1 ml of lipase substrate (Sigma, Ref: 62314) were mixed. The mixture was incubated at 37 ° C for 30 minutes. After the incubation time, 3 ml of 95% (v / v) ethanol and 4 drops of 0.9% (w / v) Thimolpthalein were added. A blank was prepared to which the same components were added but replacing the culture medium supernatant with 1 ml of culture medium without bacteria.
  • Lipase activity VNaOH x M Na oH x 1 000 x 21 Vs n
  • NaOH is the volume (in mi) of NaOH added to the sample minus the volume (in mi) of NaOH added to the blank;
  • Vsn is the volume (in me) of supernatant.
  • the enzyme activity determined in the culture supernatant was 60 of
  • the growth capacity of P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850) in solid medium was analyzed with a polysorbate (Tween®).
  • said bacterium was inoculated in a minimum medium M9 (7.0 g of Na 2 HP0 4 x l2 H 2 0, 3.0 g of KH 2 P0 4 , 1.0 g of H 4 C1, 0.5 g of NaCl, IX trace elements, MgS0 4 1 mM and 1 ml of ammonium ferric citrate (6 g / 1)) [April MA, et al, cited above], with 15 g agar and 2% Tween ® 20. Cultures were incubated at 25 ° C to 30 ° C for 1-7 days. After the incubation time, growth was observed on the agar plate and a halo around the colony indicating the degradation of the polysorbate (Tween ® 20).
  • the diameter of the degradation halo was determined.
  • the diameters of the degradation halos were determined by measuring the diameter of each halo with respect to the outer margin of the colony. Were used different strains of Pseudomonas fluorescens as a reference to compare degradation halos and check their greater proteolytic activity (larger halo diameter compared to the reference strains). Degradation halos were observed after 24 and 48 hours of incubation. This test is similar to that presented by different authors to detect protease activity in bacteria of the Pseudomonas aeruginosa species [Brown and Foster, 1970. A simple diagnostic milk medium for Pseudomonas aeruginosa. Sokol et al, 1979. A More Sensitive P ⁇ ate Assay for Detection of Protease Production by Pseudomonas aeruginosa]. EXAMPLE 8
  • the minimum concentration of sodium hypochlorite at which the growth of P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850) is inhibited was determined. This determination was made using LB culture medium (composition per liter: 10 g of bactotriptone, 10 g of NaCl and 5 g of yeast extract), and different concentrations of sodium hypochlorite: 1, 0.5, 0.25 , 0.125, 0.0625, 0.0313, 0.0156 and 0.0078% (v / v) from a 4% aqueous solution (w / v), which correspond to 25, 12.5, 6 , 25, 3, 125, 1,563, 0.7813, 0.3906 and 0.1953% (v / v) of bleach.
  • fluorescens BIRD-4 (CECT 7850) was inoculated at a concentration of 10 4 cfu / ml per treatment. The cultures were incubated between 25 ° C and 30 ° C for 1-7 days. After the incubation time, the turbid concentrations were observed, observing that said microorganism (P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850)) has a natural resistance of 0.0313% sodium hypochlorite (corresponding to 0.7813% of bleach).
  • LB medium composition per liter: 10 g of bactotriptone, 10 g of NaCl and 5 g of yeast extract
  • the bleach resistance of the biofilm formed by P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850) was determined. For this, a multiwell plate with 10 8 cfu / ml of said microorganism was inoculated and incubated at a temperature between 25 ° C and 30 ° C with stirring, for 1-7 days or until the biofilm is completely formed.
  • the culture medium was replaced by a solution with different concentrations of sodium hypochlorite: 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.0313, 0.0156 and 0.0078% (v / v), which correspond to 25, 12.5, 6.25, 3, 125, 1,563, 0.7813, 0.3906 and 0.1953% (v / v) bleach .
  • the plate was incubated for 1 hour at room temperature, renewing the sodium hypochlorite solution every 20 minutes.
  • the disinfectant solution sodium hypochlorite
  • the concentration of viable microorganisms and the maintenance of metabolic activity lipolytic and proteolytic activity
  • Examples 4 and 7 were analyzed, observing that at a concentration of 0, 1% (v / v) of sodium hypochlorite the microorganism (P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850)) maintains its metabolic activity.
  • Microorganisms capable of hydrolyzing lipids and their applications in depuration of water Microorganisms capable of hydrolyzing lipids and their use in water purification.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Hydrology & Water Resources (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Se ha aislado e identificado una cepa de Pseudomonas fluorescens con actividad lipídica y proteolítica, capaz de formar biopelículas sobre soportes plásticos y resistente a lejía y detergentes, útil en la depuración de aguas residuales urbanas, industriales y agrícolas.

Description

MICROORGANISMOS CAPACES DE HIDROLIZAR LÍPIDOS Y SU UTILIZACIÓN EN DEPURACIÓN DE AGUAS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona con una cepa de Pseudomonas fluorescens con actividad lipídica y proteolítica, capaz de formar biopelículas sobre soportes plásticos y resistente a lejía y detergentes. También se relaciona con sus aplicaciones en la depuración de aguas residuales urbanas, industriales y agrícolas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La preservación del medio ambiente es de gran importancia para la humanidad y ha cobrado gran relevancia para los gobiernos en la última década. Una de las acciones para preservar el medio ambiente consiste en reemplazar una amplia serie de compuestos químicos empleados en diferentes procesos por enzimas microbianas, ya que éstas son biodegradables y por lo tanto tienen un menor impacto sobre el medio ambiente.
Entre las enzimas de interés industrial las lipasas y proteasas, entre otras, ocupan un lugar preferente debido a su estabilidad frente a disolventes orgánicos, su especificidad de sustrato y su enantioselectividad.
Las lipasas catalizan la hidrólisis de los lípidos liberando ácidos grasos y glicerol
[Ferrato F, Carriere F, Sarda L, Verger R. (1997) A critical reevaluation of the phenomenon of interfacial activation. Method Enzymo. 286:327-347; Arpigny JL, Jaeger KE. (1999) Bacterial lipolytic enzymes: classification and properties. Biochem J 343 : 177-183], y las proteasas atacan los enlaces peptídicos degrando las proteínas [Rao MB, Tanksale AM, Ghatge MS, Deshpande VV. (1998) Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol Mol Biol Rev. 62:597-635].
El uso de estas enzimas en la industria es muy variado e incluyen la industria agroalimentaria, peletera, cosmética, farmacéutica, síntesis de edulcorantes, elaboración de detergentes, síntesis de biosurfactantes y tratamiento de aguas residuales.
Los procesos biológicos son predominantes en el tratamiento de aguas residuales domésticas e industriales. Las proteínas, polisacáridos y lípidos son uno de los mayores problemas en los vertidos urbanos e industriales. Esto es particularmente relevante en las empresas del sector agroindustrial, mataderos, hoteles y restaurantes, que generan residuos con grandes cantidades de grasas y aceites. La alta concentración de grasa causa a menudo problemas en los procesos de depuración del agua, ya que la grasa flota en la superficie del agua creando una capa que disminuye la transferencia de oxígeno y afecta los procesos aerobios. Por ello, es imprescindible hacer una separación previa de este tipo de compuestos. Frecuentemente la separación de grasas, aceites y proteínas se realiza mediante procesos físicos, entre los que se incluye la decantación; sin embargo, estos procesos requieren una recogida posterior de estos residuos lo que aumenta su coste.
La adición de lipasas de origen microbiano es una alternativa menos costosa, además de ser más eficaz y ecológica, ya que el proceso biológico convierte estos residuos en dióxido de carbono, agua y biomasa, la cual se puede reutilizar tras secado como enmendante orgánico [Bhumibhamon, A. Koprasertsak and S. Funthong. (2002) Biotreatment of high fat and oil wastewater by Upase producing microorganisms. Kasetsart J Nat Sci. 36: 261-267; Kaeberlein T, Lewis K, Epstein S. (2002) Isolating "uncultivable" microorganisms in a simulated natural environment. Science. 296: 1127-1129].
Por lo tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de disponer de un método de tratamiento de aguas residuales que permita una fácil separación y/o eliminación de grasas, aceites y proteínas del agua a tratar, evitando el empleo del proceso físico de decantación y disminuyendo así el coste de todo el proceso.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Los inventores han aislado y caracterizado un microorganismo de la especie Pseudomonas fluorescens, denominado P. fluorescens BIRD-4 y depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) el 20 de enero de 2011 con número de acceso CECT 7850, que tiene capacidad de degradar lípidos y proteínas, lo que permite el empleo de dicho microorganismo en la eliminación de grasas y aceites, evitando así los inconvenientes asociados con el uso de técnicas físico-químicas en los procesos industriales que comprenden la eliminación de dichas grasas y aceites. Además, dicho microorganismo es capaz de formar una biopelícula sobre soportes sólidos, crecer en presencia de detergentes no iónicos y sobrevivir en presencia de hipoclorito sódico al 0, 1%.
El aislamiento de un microorganismo como el proporcionado por esta invención [P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850)] se llevó a cabo mediante el procedimiento descrito en los Ejemplos 1 y 2. Dicho microorganismo tiene actividad lipasa (Ejemplo 4) y proteasa (Ejemplo 6) así como capacidad para formar biopelículas sobre soportes sólidos (Ejemplo 3) y crecer en detergentes no iónicos (Ejemplo 5) y en presencia de concentraciones de lejía relativamente altas (Ejemplo 8).
Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un microorganismo de la especie Pseudomonas fluorescens depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo con número de acceso CECT 7850, que tiene la capacidad de hidrolizar lípidos y proteínas, o un mutante de dicho microorganismo que mantiene dicha capacidad de hidrolizar lípidos y proteínas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un cultivo biológicamente puro de un microorganismo según la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un soporte sólido activo que comprende un soporte sólido y un microorganismo según la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la degradación microbiológica, en condiciones aeróbicas, de una grasa y/o un aceite en un medio acuoso, que comprende poner en contacto dicho medio acuoso que contiene una grasa y/o un aceite con un microorganismo o con un soporte sólido activo según la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la degradación microbiológica, en condiciones aeróbicas, de una proteína en un medio acuoso, que comprende poner en contacto dicho medio acuoso que contiene una proteína con un microorganismo o con un soporte sólido activo según la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la degradación microbiológica, en condiciones aeróbicas, de una grasa, un aceite y/o una proteína presente en un agua residual, que comprende:
- añadir un microorganismo según la invención a dicho agua residual a tratar, y, opcionalmente, repetir la aplicación de dicho microorganismo hasta la degradación total o parcial de la grasa, aceite y/o proteína presente en el agua residual a tratar; o alternativamente,
añadir dicho agua residual a tratar un cultivo de un microorganismo según la invención, a una concentración de, al menos, 103 unidades formadoras de colonia (ufe) por litro de agua residual a tratar; o alternativamente,
añadir a dicho agua residual a tratar un soporte sólido activo según la invención. En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la formación de una biopelícula como monocultivo de un microorganismo, que comprende la aplicación de una cantidad eficaz de un microorganismo según la invención a un cultivo que contiene un soporte sólido y un aceite como fuente de carbono o una fuente de proteínas como fuente de carbono y nitrógeno.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para el aislamiento de un microorganismo que tiene la capacidad de degradar lípidos (grasas y aceites) y proteínas, que comprende:
a) suspender una muestra de un suelo, en un medio de cultivo que carece de fuente de carbono;
b) añadir a la suspensión obtenida en la etapa a) una fuente de carbono constituida por uno o más tipos de lípidos, una fuente de fósforo y una fúente de nitrógeno;
c) incubar la suspensión resultante de la etapa b) bajo condiciones aeróbicas que permitan el crecimiento de microorganismos con capacidad para hidrolizar lípidos;
d) sembrar diluciones de la suspensión resultante de la etapa c) en placas de medio sólido;
e) incubar las placas sembradas de la etapa d) durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 7 días a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C;
f) aislar y purificar las colonias de los microorganismos, obtenidas en la incubación de la etapa e);
g) sembrar en placas de medio sólido diferencial las colonias de los microorganismos aisladas y purificadas en la etapa f), con el fin de seleccionar aquellos que presentan actividad lipolítica, en un medio de cultivo que contiene un lípido como sustrato, una fuente de carbono, una fuente de fósforo, una fuente de nitrógeno y un colorante fluorescente a luz ultravioleta; incubando las placas durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 7 días a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C, seleccionando aquellas que finalizado el periodo de incubación presentan un halo naranja fluorescente al ser expuesta a luz ultravioleta;
h) sembrar en placas de medio sólido diferencial las colonias de los microorganismos seleccionados en la etapa g), en un medio de cultivo que contiene leche desnatada como sustrato, una fuente de carbono, una fuente de fósforo y una fuente de nitrógeno, con el fin de analizar la actividad proteolítica, incubando las placas durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 7 días a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C, seleccionando aquellas que finalizado el periodo de incubación presentan un halo transparente; e
i) identificar las colonias que presentan actividad lipolítica y proteolítica, seleccionadas en la etapa g) y h).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los inventores han aislado y caracterizado un microorganismo de la especie Pseudomonas fluorescens, denominado P. fluorescens BIRD-4 y depositado en la Colección Española de Cultivos tipo (CECT) el 20 de enero de 2011 con número de acceso CECT 7850, que tiene capacidad de degradar lípidos y proteínas y, adicionalmente, formar una biopelícula sobre soportes sólidos, crecer en presencia de detergentes no iónicos y resistir hasta 0, 1% de hipoclorito sódico, lo que permite el empleo de dicho microorganismo en la eliminación de grasas y aceites, evitando así los inconvenientes asociados con el uso de técnicas fisicoquímicas en los procesos industriales que comprenden la eliminación de dichas grasas y aceites.
El aislamiento del microorganismo proporcionado por esta invención se llevó a cabo mediante el procedimiento descrito en los Ejemplos 1 y 2. Brevemente, una muestra de 10 g de un suelo agrícola se suspendió en un medio mínimo M9 [Abril MA, Michan C, Timmis KN, Ramos JL. 1989. Regulator and enzyme specificities of the TOL plasmid-encoded upper pathway for degradation of aromatic hydrocarbons and expansión of the substrate range of the pathway. J Bacteriol. 171 :6782-90], sin fuente de carbono, al que posteriormente se le añadió aceite de oliva hasta alcanzar una concentración del 1% (v/v). Tras incubar la suspensión resultante, se sembraron diluciones en placas de medio sólido de crecimiento general y se seleccionaron las colonias que presentaban una morfología macroscópica diferente. Todas las bacterias seleccionadas y purificadas se inocularon en un medio selectivo suplementado con aceite de oliva y rodamina B, tras lo cual, se seleccionaron las colonias que presentaron un halo fluorescente naranja. Cada una de las colonias seleccionadas como positivas fueron aisladas en cultivo axénico e identificadas mediante la amplificación y secuenciación del gen ARNr 16S (Ejemplo 1). Posteriormente, se analizó la capacidad de las bacterias aisladas de crecer en medio líquido con aceite de oliva o mantequilla como única fuente de carbono, lo que permitió aislar el microorganismo proporcionado por la presente invención (Ejemplo 2). Adicionalmente, se analizó la capacidad de dicho microorganismo de formar biopelículas sobre soportes sólidos (Ejemplo 3), se cuantificó su actividad lipasa (Ejemplo 4) y proteasa (Ejemplo 6), se evaluó su crecimiento en detergentes no iónicos (Ejemplo 5), su utilización de proteínas como única de fuente de carbono (Ejemplo 6), y se determinó la concentración mínima inhibitoria empleando hipoclorito de sodio comercial (Ejemplo 8). Como resultado, se identificó un microorganismo de la especie P. fluorescens, denominado P. fluorescens BIRD-4 y con número de depósito CECT 7850, que tiene capacidad de degradar o hidrolizar lípidos y proteínas y, adicionalmente, formar una biopelícula sobre soportes sólidos, crecer en presencia de detergentes no iónicos y sobrevivir en presencia de hipoclorito sódico al 0, 1%. A continuación, se describirá en detalle el microorganismo objeto de la invención junto con los distintos aspectos inventivos derivados del mismo.
1. MICROORGANISMO DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, la invención se relaciona con un microorganismo de la especie Pseudomonas fluorescens depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de acceso CECT 7850, de aquí en adelante, microorganismo de la invención, que tiene la capacidad de hidrolizar lípidos y proteínas, o un mutante de dicho microorganismo que mantiene dicha capacidad de hidrolizar lípidos y proteínas. La hidrólisis es una reacción que implica la rotura de enlaces químicos mediante la intervención de moléculas de agua, y puede ser ácida (cuando se realiza en presencia de soluciones ácidas fuertes, por ejemplo, HC1, H2SO4, etc.), básica (cuando se produce en presencia de una solución básica, por ejemplo, NaOH, BaOH, etc.) o enzimática (cuando la reacción se lleva a cabo mediante enzimas (en general, denominadas "hidrolasas").
En la presente invención se entiende por "capacidad de hidrolizar lípidos", la capacidad de un microorganismo de romper los enlaces ésteres que unen los ácidos grasos a los alcoholes, por ejemplo, glicerina o glicerol. En el sentido utilizado en esta descripción el término "lípido" incluye aceites, grasas, etc.
Asimismo, en la presente invención, se entiende por "capacidad de hidrolizar proteínas", la capacidad de un microorganismo de romper los enlaces peptídicos que unen los aminoácidos dando lugar a oligopéptidos y a los propios aminoácidos libres. En el sentido utilizado en esta descripción el término "proteína" incluye tanto proteínas como péptidos en general (incluyendo oligopéptidos y polipéptidos).
La capacidad de un microorganismo de hidrolizar lípidos y proteínas puede ser determinada por cualquier procedimiento convencional de los conocidos en el estado de la técnica. Así, la capacidad de un microorganismo de hidrolizar lípidos puede comprobarse incubando dicho microorganismo en un medio líquido con aceite de oliva o mantequilla como única fuente de carbono y observando el crecimiento del microorganismo en el medio de cultivo a lo largo del tiempo tal como se muestra en el Ejemplo 2, o, alternativamente, incubando el microorganismo en un medio sólido complejo que incorpora una emulsión de lípidos y un indicador identificado como "Rhodamina B" [Kouker G, Jaeger KE. 1987. Specific and sensitive píate assay for bacterial Upases. Appl Environ Microbiol. 53 : 211-3], tal como se seleccionan las bacterias en el Ejemplo 1.
Asimismo, la capacidad de un microorganismo de hidrolizar proteínas puede comprobarse incubando dicho microorganismo en un medio mínimo M9 [Abril et al, citado supra], con albúmina como única fuente de carbono o, alternativamente, incubando el microorganismo en un medio sólido complejo que incorpora una leche desnatada y observando la formación de un halo alrededor de la colonia bacteriana [Sokol PA, Ohman DE, Iglewski BH. 1979. A More Sensitive Píate Assay for Detection of Protease Production by Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol. 9(4):538-40], tal como se muestra en el Ejemplo 7.
Como entiende el experto en la materia, dentro del concepto "microorganismo de la invención", también están contemplados todos aquellos microorganismos mutantes de la cepa P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850) que mantienen dicha capacidad de hidrolizar lípidos y proteínas.
Tal como aquí se utiliza, el término "muíante" incluye cualquier microorganismo resultante de una mutación o cambio en el ADN de un gen de un organismo que da como resultado un carácter (fenotipo) que no se encuentra en el tipo salvaje (wild-type) en una realización concreta, dicho mutante es un mutante de P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850) que mantiene esencialmente las mismas características que las de la cepa parental [P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850)], tal como la capacidad de hidrolizar lípidos y proteínas.
Por otro lado, los inventores han comprobado que el microorganismo de la invención, además de hidrolizar lípidos y proteínas, tiene la capacidad de formar una biopelícula sobre un soporte sólido. Por lo tanto, en una realización particular, el microorganismo de la invención tiene, además, la capacidad de formar una biopelícula sobre un soporte sólido.
En el contexto de la presente invención se entiende por "biopelícula" el ecosistema microbiano organizado formado por uno o varios microorganismos asociados a una superficie, con características funcionales y estructuras complejas. Este tipo de conformación microbiana ocurre cuando las células planctónicas se adhieren a una superficie o sustrato, formando una comunidad, que se caracteriza por la excreción de una matriz extracelular adhesiva protectora. Una biopelícula puede contener aproximadamente un 15% de células y un 85% de matriz extracelular. Esta matriz generalmente está formada de exopolisacáridos, que forman canales por donde circulan agua, enzimas, nutrientes, y residuos. Allí las células establecen relaciones y dependencias: viven, cooperan y se comunican a través de señales químicas (quorum sensing), que regulan la expresión de genes de manera diferente en las distintas partes de la comunidad, como un tejido en un organismo multicelular.
La capacidad de un microorganismo de formar una biopelícula sobre un soporte sólido puede determinarse por cualquier procedimiento convencional, por ejemplo, cultivando el microorganismo en medio líquido, sobre un soporte plástico (por ejemplo, poliestireno), cambiando el medio periódicamente y observando la adhesión del microorganismo a la superficie del recipiente hasta cubrir la totalidad de mismo (Ejemplo 3) [Andersson S, Nilsson M, Dalhammar G, KuttUva R. 2008. Assessment of carrier materials for biofilm formation and denitrification. Vatten. 64:201-207].
Como entiende el experto en la materia, cualquier soporte sólido de los disponibles en el estado de la técnica puede emplearse en el contexto de la presente invención. En la presente invención, se entiende por "soporte sólido" cualquier superficie que, ventajosamente, posee una elevada superficie específica que facilita la adsorción de los microorganismos de la invención. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de materiales que pueden formar el soporte sólido incluyen materiales poliméricos, en particular materiales celulósicos y materiales derivados de la celulosa, nitrocelulosa, acetato de celulosa, poliacrilamida, poli(vinilcloruro), dextrano entrecruzado, agarosa, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), cristal, metal, cerámica y similares. Estos materiales pueden ser usados en solitario o en combinación unos con otros en función de las necesidades.
Por lo tanto, en otro aspecto la invención se relaciona con un soporte sólido activo, de aquí en adelante soporte sólido activo de la invención, que comprende un soporte de un material plástico y el microorganismo de la invención que, en una realización particular, puede estar formando parte de una biopelícula. En otra realización particular, el material del soporte sólido es un material plástico.
Adicionalmente, los inventores han comprobado que el microorganismo de la invención puede crecer en presencia de un detergente no iónico. Por tanto, en otra realización particular, el microorganismo de la invención tiene la capacidad de crecer en un medio de cultivo que comprende un detergente no iónico.
En la presente invención, por "detergente no iónico" se incluye cualquier compuesto químico que estabiliza mezclas de aceite y agua reduciendo la tensión en la interfase entre las moléculas de aceite y agua, y cuya estructura química no presenta carga neta. Los términos "detergente no iónico", "tensioactivo no iónico" y "surfactante no iónico" son sinónimos y pueden ser empleados indistintamente a lo largo de la descripción. Ejemplos de detergentes no iónicos incluyen, sin limitar a, cetil alcohol, estearil alcohol, oleil alcohol, decil glucósido, lauril glucósido, octil glucósido, Tritón X-100, etc.
La capacidad de un microorganismo de crecer en un medio de cultivo que comprende un detergente no iónico puede determinarse por cualquier procedimiento convencional del estado de la técnica, por ejemplo, cultivando el microorganismo en medio sólido con un polisorbato y observando el crecimiento del microorganismo en la placa con un halo alrededor de la colonia, lo que indica la degradación del polisorbato tal como se describe en el Ejemplo 5 [Thomson CA, Delaquis PJ, Mazza G. 1999. Detection and Measurement of Microbial Lipase Activity: A Review. Crit Rev Food Sci Nutn 39(2): 165-87].
En otra realización particular, el microorganismo de la invención tiene, además, la capacidad de crecer en un medio de cultivo que comprende hipoclorito sódico en una concentración de hasta un 0, 1%
La capacidad de un microorganismo de crecer en presencia de hipoclorito de sodio puede determinarse por cualquier procedimiento convencional, por ejemplo, cultivando el microorganismo en medio LB junto con hipoclorito de sodio y observar el crecimiento del microorganismo, tal como se describe en los Ejemplos 8 y 9 [Arancegui N, Cabanillas M, Martínez A, Funosas E, Maestri L, Hermida Lucena P. 1999. Quality control of decontaminating agents. Acta Odontol Latinoam. 12:83-8].
Un cultivo biológicamente puro de un microorganismo de la invención constituye un aspecto adicional de la presente invención. En la presente invención se entiende por "cultivo biológicamente puro", a aquel cultivo en el que el microorganismo de la invención se encuentra en una proporción igual o superior al 95% respecto al resto de microorganismos presentes en el cultivo.
2. APLICACIONES DEL MICROORGANISMO DE LA INVENCIÓN
Tal como se ha explicado previamente, el microorganismo de la invención P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850) es capaz de hidrolizar lípidos y proteínas y, además, es capaz de formar una biopelícula sobre un soporte sólido, crecer en presencia de un detergente no iónico, y crecer en presencia hipoclorito sódico en una concentración de hasta 0, 1%). Por tanto, todas estas capacidades hacen que el microorganismo de la invención pueda emplearse con éxito en procesos de degradación microbiológica aerobia de grasas, aceites y proteínas en, por ejemplo, aguas residuales urbanas y vertidos industriales.
En el contexto de la presente invención, se entiende por "degradación microbiológica aerobia" a la transformación en presencia de oxígeno de compuestos complejos (por ejemplo, polímeros) en compuestos sencillos (por ejemplo, monómeros) por acción de los microorganismos o los productos derivados del metabolismo de los mismos.
Por lo tanto, en otro aspecto la invención se relaciona con un procedimiento para la degradación microbiológica en condiciones aeróbicas de un lípido en un medio acuoso, que comprende poner en contacto dicho medio acuoso que contiene un lípido con el microorganismo de la invención o con el soporte sólido activo de la invención.
Como se ha mencionado previamente el término "lípido", tal como aquí se utiliza incluye grasas y aceites. El término "grasa" se emplea para designar varias clases de lípidos, aunque generalmente se refiere a los acilglicéridos, es decir, ésteres en los que uno, dos o tres ácidos grasos se unen a una molécula de glicerina, formando monoglicéridos, diglicéridos y triglicéridos respectivamente. Las grasas están presentes en muchos organismos y tienen funciones tanto estructurales como metabólicas. Los triglicéridos sólidos a temperatura ambiente son denominados grasas, mientras que los triglicéridos líquidos a temperatura ambiente son conocidos como aceites.
En una realización particular, dicho lípido es un aceite, tal como un aceite de origen vegetal, un aceite de origen animal, y sus mezclas. Aceites de origen vegetal incluyen todos aquellos aceites que proceden de los frutos y semillas de oleaginosas. Ejemplos de aceites de origen vegetal incluyen, sin limitar a, aceite de palma, aceite de coco, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de cacahuete, aceite de almendra, aceite de palmito, aceite de lino, aceite de cártamo, aceite de ricino, aceite de colza, aceite de maíz, aceite de sésamo, aceite de soja, etc. Aceites de origen animal incluyen todos aquellos aceites procedentes de la grasa de los animales. Ejemplos de aceites animales incluyen, sin limitar a, aceite de hígado de bacalao, aceite de ballena, aceite de foca, aceite de manteca de cerdo, aceite de hígado de hipogloso, aceite de pie de buey, aceite de tiburón, aceite de delfín, etc.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la degradación microbiológica, en condiciones aerobias, de una proteína en un medio acuoso, que comprende poner en contacto dicho medio acuoso que contiene una proteína con el microorganismo de la invención o con el soporte sólido activo de la invención.
En una realización particular, el medio acuoso comprende una proteína seleccionada entre una proteína de origen vegetal, una proteína de origen animal y sus mezclas. Proteínas de origen vegetal incluyen, sin limitar a, proteínas procedentes legumbres, cereales, frutos secos, etc. Proteínas de origen animal incluyen, sin limitar a, proteínas procedentes de la carne, el pescado, la leche, el queso, el huevo, etc.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la degradación microbiológica, en condiciones aeróbicas, de un lípido y/o una proteína presente en un agua residual, que comprende
añadir el microorganismo de la invención a dicho agua residual a tratar, y, opcionalmente, repetir la aplicación de dicho microorganismo hasta la degradación total o parcial de dicho lípido y/o proteína presente en el agua residual a tratar; o alternativamente,
añadir dicho agua residual a tratar un cultivo del microorganismo de la invención, a una concentración de, al menos, 103 unidades formadoras de colonia (ufe) por litro de agua residual a tratar; o alternativamente, añadir a dicho agua residual a tratar el soporte sólido activo de la invención.
En la presente invención se entiende por "agua residual" al agua contaminada con los materiales generados como consecuencia de la actividad humana, la cual, por razones de salud pública, no puede ser vertida sin tratamiento en lagos o corrientes convencionales. Las principales fuentes de contaminación acuática pueden clasificarse como urbanas (formada por las aguas residuales de los hogares y establecimientos comerciales), industriales (formada por las aguas residuales procedentes de los procesos industriales) y agrícolas (formada por las aguas residuales procedentes, por ejemplo, de la agricultura, el ganado comercial y las granjas avícolas). En una realización particular de la invención, el agua residual a tratar es un agua residual doméstica, un agua residual industrial o un agua residual agrícola.
Como entiende el experto en la materia, el microorganismo de la invención puede aplicarse directamente al agua residual a tratar o puede añadirse unido a un soporte sólido tal como los descritos previamente, para dar lugar a un soporte sólido activo.
Por lo tanto, en otra realización particular, el microorganismo de la invención se aplica directamente sobre el agua residual a tratar o, alternativamente, en otra realización particular, se aplica formando parte de un soporte sólido activo que comprende una biopelícula como monocultivo del microorganismo de la invención sobre un soporte sólido, preferiblemente, un soporte sólido de un material plástico.
Por otro lado, tal como se ha explicado previamente, el microorganismo de la invención tiene la capacidad de formar un biopelícula, para lo cual es preciso poner en contacto el microorganismo de la invención con un soporte sólido en las condiciones adecuadas (luz, temperatura, pH, nutrientes, etc.) para permitir la formación de la biopelícula.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la formación de una biopelícula como monocultivo de un microorganismo, que comprende la aplicación de una cantidad eficaz del microorganismo de la invención a un cultivo que contiene un soporte de un material plástico y un aceite como fuente de carbono o una fuente de proteínas como fuente de carbono y nitrógeno.
Varios ejemplos de aceites y proteínas que pueden ser degradadas por el microorganismo de la invención han sido descritos previamente y son aplicables al presente aspecto inventivo. En una realización particular, dicho aceite es un aceite de oliva y dicha fuente de proteínas es un suero de origen animal.
3. AISLAMIENTO DEL MICROORGANISMO DE LA INVENCIÓN
En otro aspecto la invención se relaciona con un procedimiento para el aislamiento de un microorganismo que tiene la capacidad de degradar lípidos, tales como grasas y aceites, y proteínas, de aquí en adelante, procedimiento de aislamiento del microorganismo de la invención, que comprende:
a) suspender una muestra de un suelo, en un medio de cultivo que carece de fuente de carbono;
b) añadir a la suspensión obtenida en la etapa a) una fuente de carbono constituida por uno o más tipos de lípidos, una fuente de fósforo y una fuente de nitrógeno; c) incubar la suspensión resultante de la etapa b) bajo condiciones aeróbicas que permitan el crecimiento de microorganismos con capacidad para hidrolizar lípidos;
d) sembrar diluciones de la suspensión resultante de la etapa c) en placas de medio sólido;
e) incubar las placas sembradas de la etapa d) durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 7 días a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C;
f) aislar y purificar las colonias de los microorganismos, obtenidas en la incubación de la etapa e);
g) sembrar en placas de medio sólido diferencial las colonias de los microorganismos aisladas y purificadas en la etapa f), con el fin de seleccionar aquellos que presentan actividad lipolítica, en un medio de cultivo que contiene un lípido como sustrato, una fuente de carbono, una fuente de fósforo, fuente de nitrógeno y un colorante fluorescente a luz ultravioleta; incubando las placas durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 7 días a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C, seleccionando aquellas que finalizado el periodo de incubación presentan un halo naranja fluorescente al ser expuesta a luz ultravioleta;
h) sembrar en placas de medio sólido diferencial las colonias de los microorganismos seleccionados en la etapa g), en un medio de cultivo que contiene un leche desnatada como sustrato, una fuente de carbono, una fuente de fósforo y una fuente de nitrógeno, con el fin de analizar la actividad proteolítica, incubando las placas durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 7 días a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C, seleccionando aquellas que finalizado el periodo de incubación presentan un halo transparente; e
i) identificar las colonias que presentan actividad lipolítica y proteolítica, seleccionadas en la etapa g) y h).
La primera etapa del procedimiento para el aislamiento del microorganismo de la invención comprende recoger una muestra de suelo, tal como, por ejemplo, una muestra de suelo procedente de un suelo agrícola. Una vez recogida la muestra, se suspende en un medio de cultivo mínimo que carece de fuente de carbono. Cualquier medio de cultivo mínimo de los descritos en el estado de la técnica puede emplearse en la puesta en práctica del procedimiento de aislamiento del microorganismo de la invención, tal como medio mínimo M9 cuya composición específica por litro es: 7,0 g, Na2HP04 xl2 H20; 3,0 g KH2P04, 1,0 g; H4C1; 0,5 g NaCl, IX solución de oligoelementos y lmL/L citrato férrico amónico 6%o (p/v) [Abril MA et al. citado supra]. Existen otros medios de cultivos que pueden emplearse para el aislamiento de bacterias lipolíticas, tales como, por ejemplo, medio de producción de lipasas, el cual está compuesto por: aceite de oliva 1%, peptona 6%, 0,5% de K2HP04, 0,1% de MgS04-7H20, 0,04% de goma arábiga [Peng R, Lin J, Wei D. 2010. Purification and characterization of an organic solvent-tolerant Upase from Pseudomonas aeruginosa CS- 2. Appl Biochem Biotechnol. 162:733-43].
Posteriormente, a la suspensión obtenida en la etapa a) se le añade cualquier grasa o aceite como fuente de carbono, una fuente de fósforo y una fuente de nitrógeno. Ejemplos de grasas y aceites que pueden ser utilizadas en el contexto de la presente invención como fuente de carbono se han descrito en detalle previamente. No obstante, en una realización particular, las fuentes de carbono empleadas son aceite de oliva como aceite de origen vegetal y mantequilla como grasa animal.
Como fuente de nitrógeno puede utilizarse cualquier fuente de nitrógeno asimilable por los microorganismos a identificar, por ejemplo, compuestos amónicos, nitrato, urea, aminoácidos, etc. La cantidad de fuente de nitrógeno que puede añadirse a la suspensión obtenida en la etapa a) puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realización particular, se añade una fuente de nitrógeno en una cantidad adecuada para alcanzar una concentración comprendida entre 5 y 10 mM.
Adicionalmente, pueden añadirse oligoelementos por ejemplo, en forma de sales minerales. Las sales minerales son la fuente de aniones y de cationes para los microorganismos, entre los cuales están: K , Mg , Ca , Fe . Aparte de estos iones, que se requieren en mayores concentraciones, las bacterias necesitan minúsculas cantidades de otros elementos, tales como: Mn+, Co2+, Ni+, Mo+, Zn2+, entre otros. En una realización particular, los oligoelementos se añadieron en una concentración comprendida entre 0,07 y 1 mM. Como fuente de fosforo, puede emplearse tanto fosfatos orgánicos como inorgánicos. En una realización particular, la fuente de fosforo se añadió en forma de fosfatos.
En la siguiente etapa del procedimiento de aislamiento del microorganismo de la invención, es decir, la etapa c), se lleva a cabo la incubación de la suspensión resultante de la etapa b) a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C, durante un período de tiempo comprendido entre 1 y 7 días, con agitación opcional, bajo condiciones aeróbicas para permitir el crecimiento de los microorganismos.
A continuación, en la etapa d), se siembran diluciones de la suspensión resultante del cultivo obtenido en la etapa c) para inocular placas de agar de crecimiento general. Cualquier agar de crecimiento general puede emplearse en la puesta en práctica del presente aspecto inventivo. En una realización particular, la composición por litro del agar de crecimiento es 4,3 g de peptona de carne, 4,3 g de peptona de caseína, 6,4 g de cloruro de sodio y 15 g de agar [Hasan F, Shah AA, Hameed A. (2009) Methods for detection and characterization of Upases: A comprehensive review. Biotechnol Adv. 27:782-98]. Una vez inoculadas las placas de agar, se procede a la incubación de las mismas a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 7 días [etapa e)].
Posteriormente [etapa f) del procedimiento], se aislan y purifican todas las colonias obtenidas en la etapa e), empleando, por ejemplo, un medio general de crecimiento como el empleado en la etapa anterior.
En la siguiente etapa del procedimiento de aislamiento [etapa g)], se procede a la selección de aquellas colonias que poseen actividad lipolítica, sembrando todas las bacterias purificadas en la etapa f) en placas de medio sólido diferencial, cuya composición por litro es, por ejemplo: 4,3 g de peptona de carne, 4,3 g de peptona de caseína, 6,4 g de cloruro de sodio y 15 g de agar y contiene hasta un 3% (v/v) de un aceite vegetal como única fuente de fósforo y un rodamina B como colorante a una concentración final de 0,001% [Kouker G, Jaeger KE. (1987) Specific and sensitive píate assay for bacterial Upases. Appl Environ microbiol. 53 :211-3; Hasan F, Shah AA, Hameed A. (2009) Methods for detection and characterization of Upases: A comprehensive review. Biotechnol Adv. 27:782-98]. Aunque prácticamente cualquier aceite vegetal o grasa animal puede ser utilizado, en una realización particular, dicha fuente de carbono está constituida por aceite de oliva y/o la grasa animal es mantequilla. A continuación, las placas sembradas de la etapa g) se incuban a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 7 días, seleccionando aquellas que finalizado el periodo de incubación presentan un halo naranja fluorescente al ser expuestas a luz ultravioleta.
Finalmente, se analiza la actividad proteolítica de todas las bacterias seleccionadas en la etapa g), inoculando placas de medio solido diferencial que contiene leche desnatada como sustrato, una fuente de carbono, una fuente de fosforo y una fuente de nitrógeno. La composición específica por litro de dicho medio diferencial es, por ejemplo: 70 g de Na2HP04 x 12 H20; 30 g de KH2P04, 10 g de H4C1; 5 g de NaCl, IX solución de oligoelementos y lml/1 de citrato férrico amónico 6%o [Jha, B.K., M.G. Pragash, J. Cletus, G. Raman and N. Sakthivel, (2009). Simultaneous phosphate solubilization potential and antifungal activity of new fluorescent pseudomonad strains, Pseudomonas aeruginosa, P. plecoglossicida and P. mosselii. World J. Microbiol. Biotechnol, 25: 573-581]. Las placas se incuban durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 7 días a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C, seleccionando aquellas que finalizado el periodo de incubación presentan un halo transparente [etapa h)]. Todas las bacterias seleccionas en la etapa h) fueron identificadas por medio de la amplificación de un fragmento de 1550 pb a partir del gen ARNr 16S, empleando los cebadores GM3 [5'- AGAGTTTGATCMTGGC-3 ' (SEQ ID NO: 1)], donde M es A o C, y GM4 [5'-ACCTTGTTACGACTT-3' (SEQ ID NO: 2)] [Blóthe M, Akob DM, Kostka JE, Góschel K, Drake HL, Küsel K. (2008). pH gradient - induced heterogeneity of Fe(III) - reducing microorganisms in coal mining - associated lake sediments. Applied Environmental Microbiology. 74: 1019-1029]. Una de las colonias aisladas, la denominada Pseudomonas fluorescens BIRD-4, fue depositada el 20 de enero de 2011 en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de acceso CECT 7850.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no pretenden ser limitativos del alcance de la misma.
EJEMPLO 1
Aislamiento de las bacterias Se suspendió una muestra de 10 g de un suelo agrícola en un medio mínimo , en una relación 1 : 10 (p/v). Dicho medio es un medio mínimo sin fuente de carbono cuya composición específica por litro es: 7,0 g de Na2HP04 x l2 H20, 3,0 g de KH2P04, 1,0 g de H4C1, 0,5 g de NaCl, IX de solución de oligoelementos, MgS04 1 mM y 1 mi de citrato férrico amónico (6 g/1). A dicho medio, se añadió posteriormente un aceite de oliva en cantidad suficiente para alcanzar una concentración de 1% (v/v) [Abril MA, Michan C, Timmis KN, Ramos JL. . 1989. Regulator and enzyme specificities of the TOL plasmid-encoded upper pathway for degradation of aromatic hydrocarbons and expansión of the substrate range of the pathway. J Bacteriol. 171 :6782-90].
La suspensión resultante se incubó a una temperatura comprendida entre 25°C y
30°C, con agitación, durante una semana, en condiciones aeróbicas. Posteriormente, se sembraron diluciones apropiadas (10"3, 10"4 y 10"5) de dicha suspensión en placas de medio sólido de crecimiento general, cuya composición por litro es: 4,3 g de peptona de carne, 4,3 g de peptona de caseína, 6,4 g de cloruro de sodio y 15 g de agar. Todas las colonias que presentaron una morfología macroscópica diferente fueron seleccionadas y sembradas en cultivo axénico.
Todas las bacterias seleccionadas y purificadas se inocularon en un medio selectivo, constituido por medio nutritivo cuya composición por litro es: 4,3 g de peptona de carne, 4,3 g de peptona de caseína, 6,4 g de cloruro de sodio y 15 g de agar, suplementado con aceite de oliva al 3% y rhodamina B al 0,001%.
Tras incubar entre 1 y 7 días a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C, se observaron y seleccionaron las colonias que presentaron halo fluorescente naranja bajo la exposición a luz ultravioleta (365 nm). Cada una de las colonias seleccionadas como positivas fueron aisladas en cultivo axénico e identificadas mediante la amplificación y secuenciación del gen ARNr 16S.
EJEMPLO 2
Utilización de aceites y grasas como única fuente de carbono, en condiciones aeróbicas
Se analizó la capacidad de las bacterias aisladas en el Ejemplo 1 de crecer en medio líquido con aceite de oliva o mantequilla como única fuente de carbono. Para ello, las bacterias previamente aisladas e identificadas de manera individual (Ejemplo 1), se inocularon en un medio mínimo M9 (7,0 g de Na2HP04 x l2 H20, 3,0 g de KH2P04, 1,0 g de H4C1, 0,5 g de NaCl, IX de solución de oligoelementos, MgS04 1 mM y 1 mi de citrato férrico amónico (6 g/1)) [Abril MA et al, citado supra], con 3% de aceite de oliva ó 3% de mantequilla, como única fuente de carbono. Los cultivos se incubaron con agitación (entre 50 y 200 rpm) en un incubador orbital tipo Kühner. A lo largo del tiempo se realizaron conteos de los microorganismos viables, observándose que la densidad de la población aumentaba 4 órdenes de magnitud en 24 horas aproximadamente con cada una de las fuentes de carbono.
Un cultivo de bacterias procedentes de la colonia identificada como Pseudomonas fluorescens BIRD-4 ha sido depositado el 20/01/2011, en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Burjasot (Valencia, España), con el número de acceso CECT 7850.
EJEMPLO 3
Formación de biopelículas sobre soportes plásticos
Se analizó la capacidad de formación de biopelículas por parte de dichas bacterias en medio líquido con aceite de oliva como única fuente de carbono. Para ello, la bacteria P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850), se inoculó en un medio mínimo M9 (7,0 g de Na2HP04 x l2 H20, 3,0 g de KH2P04, 1,0 g de H4C1, 0,5 g de NaCl, IX de solución de oligoelementos, MgS04 1 mM y 1 mi de citrato férrico amónico (6 g/1)) [Abril MA et al., citado supra], con 3% de aceite de oliva, como única fuente de carbono. Los cultivos se incubaron con agitación (entre 50 y 200 rpm) en un incubador orbital tipo Kühner. El medio de cultivo fue cambiado cada 2 días, realizándose una observación diaria. Dicha bacteria es capaz de cubrir la totalidad de la superficie del soporte plásticos (poliestireno) al cabo de 10 días.
EJEMPLO 4
Cuantificación de la actividad lipasa mediante titulación
Se cuantificó la actividad lipasa a partir del sobrenadante del cultivo de la bacteria P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850). Para ello, dicha bacteria fue inoculada en un medio mínimo M9 (7,0 g de Na2HP04 x l2 H20, 3,0 g de KH2P04, 1,0 g de NH4C1, 0,5 g de NaCl, IX oligoelementos, MgS04 1 mM y 1 mi de citrato férrico amónico (6 g/1)) [Abril MA, et al, citado supra], con glucosa 25 mM, como fuente de carbono. Los cultivos se incubaron con agitación (entre 50 y 200 rpm) en un incubador orbital tipo Kühner. Pasadas 18 horas aproximadamente el cultivo fue centrifugado a 10.000 rpm durante 5 minutos recolectándose el sobrenadante. Posteriormente, se mezclaron 1 mi del sobrenadante, 2 mi de agua destilada, 1 mi de Tris-HCl pH 7,7, y 1 mi sustrato lipasa (Sigma, Ref: 62314). La mezcla fue incubada a 37°C durante 30 minutos. Pasado el tiempo de incubación, se añadieron 3 mi de etanol al 95% (v/v) y 4 gotas de Thimolpthalein al 0,9% (p/v). Se preparó un blanco al que se añadieron los mismos componentes pero reemplazando el sobrenadante del medio de cultivo por 1 mi de medio de cultivo sin bacteria.
Tanto el blanco como la muestra fueron titulados con NaOH 50 mM. La cuantificación de la actividad lipasa (en U/ml de enzima) fue determinada mediante la siguiente fórmula: Actividad lipasa = VNaOH x MNaoH x 1 000 x 21 Vsn donde:
" NaOH" es el volumen (en mi) de NaOH añadido a la muestra menos el volumen (en mi) de NaOH añadido al blanco;
"ΜΝ3ΟΗ" es la molaridad de la solución de NaOH;
"1.000" es el factor de conversión de miliequivalentes a microequivalentes;
"2" es el factor de conversión del tiempo de 30 min a 1 horas (definición de unidad); y
"Vsn" es el volumen (en mi) de sobrenadante.
La actividad de enzima determinada en el sobrenadante del cultivo fue 60 de
U/ml.
EJEMPLO 5
Crecimiento de P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850) con detergentes no iónicos
Se analizó la capacidad de crecimiento de P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850) en medio solido con un polisorbato (Tween®). Para ello, dicha bacteria se inoculó en un medio mínimo M9 (7,0 g de Na2HP04 x l2 H20, 3,0 g de KH2P04, 1,0 g de H4C1, 0,5 g de NaCl, IX oligoelementos, MgS04 1 mM y 1 mi de citrato férrico amónico (6 g/1)) [Abril MA, et al, citado supra], con 15 g de agar y 2% de Tween® 20. Los cultivos se incubaron de 25°C a 30°C durante 1-7 días. Pasado el tiempo de incubación se observó crecimiento sobre la placa de agar y un halo alrededor de la colonia que indicaba la degradación del polisorbato (Tween® 20).
EJEMPLO 6
Utilización de proteínas como única fuente de carbono por P. fluorescens BIRD-4
(CECT 7850)
Se analizó la capacidad de P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850) de utilizar albúmina como única fuente de carbono. Para ello, dicha bacteria se inoculó en un medio mínimo M9 (7,0 g de Na2HP04 x l2 H20, 3,0 g de KH2P04, 1,0 g de H4C1, 0,5 g de NaCl, IX oligoelementos, MgS04 1 mM y 1 mi de citrato férrico amónico (6 g/1)) [Abril MA, et al., citado supra], con 1% (p/v) de albúmina, como única fuente de carbono. Los cultivos se incubaron con agitación (entre 50 y 200 rpm) en un incubador orbital tipo Kühner. A lo largo del tiempo se realizaron conteos de los microorganismos viables, observándose que la densidad de la población aumentaba varios órdenes de magnitud en 24 horas.
EJEMPLO 7
Cuantificación de la actividad proteasa
Para la determinación y cuantificación de la actividad proteolítica de P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850) se utilizó un medio Skim Milk, cuya composición por litro es: 7,0 g de Na2HP04 x l2 H20, 3,0 g de KH2P04, 1,0 g de NH4C1, 0,5 g de NaCl, IX de solución de oligoelementos, MgS04 1 mM y 1 mi de citrato férrico amónico (6 g/1), suplementado al 0,7% (p/v) con leche desnatada. Tras incubar entre 1 y 7 días a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C, se observaron y seleccionaron las colonias que presentaron un halo transparente. Posteriormente, se determinó el diámetro del halo de degradación. Para realizar una estimación de la actividad proteolítica se determinaron los diámetros de los halos de degradación midiéndose el diámetro de cada halo con respecto al margen externo de la colonia. Se emplearon distintas cepas de Pseudomonas fluorescens como referencia para comparar los halos de degradación y comprobar su mayor actividad proteolítica (mayor diámetro del halo en comparación con las cepas de referencia). Los halos de degradación se observaron tras 24 y 48 horas de incubación. Este ensayo es similar al presentado por distintos autores para detectar actividad proteasa en bacterias de la especie Pseudomonas aeruginosa [Brown y Foster, 1970. A simple diagnostic milk médium for Pseudomonas aeruginosa. Sokol et al, 1979. A More Sensitive Píate Assay for Detection of Protease Production by Pseudomonas aeruginosa]. EJEMPLO 8
Determinación de la concentración mínima inhibitoria empleando hipoclorito de sodio comercial (lejía)
Se determinó la concentración mínima de hipoclorito de sodio a la cual se inhibe el crecimiento de P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850). Dicha determinación se realizó empleando como medio de cultivo LB (composición por litro: 10 g de bactotriptona, 10 g de NaCl y 5 g de extracto de levadura), y diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio: 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0313, 0,0156 y 0,0078% (v/v) a partir de una solución acuosa al 4% (p/v), las cuales corresponden a 25, 12,5, 6,25, 3, 125, 1,563, 0,7813, 0,3906 y 0, 1953% (v/v) de lejía. El microorganismo (P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850)) fue inoculado a una concentración de 104 ufc/ml por tratamiento. Los cultivos se incubaron entre 25°C y 30°C durante 1-7 días. Pasado el tiempo de incubación se observaron las concentraciones que presentaban turbidez, observándose que dicho microorganismo (P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850)) presenta una resistencia natural al 0,0313% de hipoclorito de sodio (correspondiente a 0,7813% de lejía).
EJEMPLO 9
Cinética de muerte con hipoclorito sódico
La cinética de muerte se realizó inoculando el microorganismo (P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850)) en medio LB (composición por litro: 10 g de bactotriptona, 10 g de NaCl y 5 g de extracto de levadura) a una concentración 108 ufc/ml; este cultivo fue incubado a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C con agitación hasta alcanzar una DO660 nm =0,8. Una vez se alcanzó la concentración adecuada el cultivo fue dividido en 5 alícuotas de igual volumen, las cuales fueron sometidas a 4 concentraciones diferentes de hipoclorito de sodio (1%, 0,1%, 0,01% y 0,001% (v/v)), mientras que la quinta alícuota permaneció como control. Estos cultivos fueron incubados a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C con agitación. A partir de cada una de las 5 alícuotas se realizaron diluciones seriadas y recuento en placa a 3 tiempos diferentes (10, 30 y 60 minutos), observándose que dicho microorganismo (P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850)) resiste hasta un 0, 1% (v/v) de hipoclorito sódico. EJEMPLO 10
Determinación de la resistencia de la biopelícula formada por P. fluorescens BIRD-
4 (CECT 7850) frente a lejía
Se determinó la resistencia a lejía de la biopelícula formada por P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850). Para ello se inoculó una placa multipocillo con 108 ufc/ml de dicho microorganismo y se incubó a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C con agitación, durante 1-7 días o hasta la completa formación de la biopelícula. Una vez finalizado el periodo de formación de la biopelícula el medio de cultivo se sustituyó por una solución con diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio: 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0313, 0,0156 y 0,0078% (v/v), las cuales corresponden a 25, 12,5, 6,25, 3, 125, 1,563, 0,7813, 0,3906 y 0, 1953% (v/v) de lejía. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, renovándose la solución de hipoclorito de sodio cada 20 minutos. Transcurrido el tiempo de tratamiento se removió la solución desinfectante (hipoclorito sódico) y se analizó la concentración de microorganismos viables y el mantenimiento de la actividad metabólica (actividad lipolítica y proteolítica) [Ejemplos 4 y 7], observándose que a una concentración de 0, 1% (v/v) de hipoclorito sódico el microorganismo (P. fluorescens BIRD-4 (CECT 7850)) mantiene su actividad metabólica.
TRADUCCIÓN DE LOS TÉRMINOS EMPLEADOS EN LA LISTA DE SECUENCIAS "Microorganisms capable of hydrolyzing lipids and their applications in depuration of water": Microorganismos capaces de hidrolizar lípidos y su utilización en depuración de aguas.
"Artificial sequence": Secuencia artificial
"Primer": Cebador

Claims

REIVINDICACIONES
Un microorganismo de la especie Pseudomonas fluorescens BIRD-4 depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de acceso CECT 7850, que tiene la capacidad de hidrolizar lípidos y proteínas, o un mutante de dicho microorganismo que mantiene dicha capacidad de hidrolizar lípidos y proteínas.
Microorganismo según la reivindicación 1, que, además, tiene la capacidad de formar una biopelícula sobre un soporte sólido.
Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que, además, tiene la capacidad de crecer en un medio de cultivo que comprende un detergente no iónico.
Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que, además, tiene la capacidad de crecer en un medio de cultivo que contiene una concentración de hasta 0, 1% de hipoclorito sódico.
Un cultivo biológicamente puro de un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
Un soporte sólido activo que comprende un soporte sólido y un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
Soporte sólido activo según la reivindicación 6, en donde el soporte sólido es de un material plástico.
8. Un procedimiento para la degradación microbiológica, en condiciones aeróbicas, de un lípido en un medio acuoso, que comprende poner en contacto dicho medio acuoso que contiene un lípido con un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o con un soporte sólido activo según la reivindicación 6 ó 7.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicho lípido comprende un aceite seleccionado entre un aceite de origen vegetal, un aceite de origen animal y sus mezclas.
10. Un procedimiento para la degradación microbiológica, en condiciones aeróbicas, de una proteína en un medio acuoso, que comprende poner en contacto dicho medio acuoso que contiene una proteína con un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o con un soporte sólido activo según la reivindicación 6 ó 7.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho medio acuoso comprende una proteína seleccionada entre una proteína de origen vegetal, una proteína de origen animal y sus mezclas.
12. Un procedimiento para la degradación microbiológica, en condiciones aeróbicas, de un lípido y/o una proteína presente en un agua residual, que comprende: añadir un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 a dicho agua residual a tratar, y, opcionalmente, repetir la aplicación de dicho microorganismo hasta la degradación total o parcial de dicho lípido y/o proteína presente en el agua residual a tratar; o alternativamente, añadir dicho agua residual a tratar un cultivo de un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, a una concentración de, al menos, 103 unidades formadoras de colonia (ufe) por litro de agua residual a tratar; o alternativamente, añadir a dicho agua residual a tratar un soporte sólido activo según la reivindicación 6 ó 7.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho agua residual es un agua residual doméstica.
14. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho agua residual es un agua residual industrial.
15. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho agua residual es un agua residual agrícola.
16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que dicho microorganismo se aplica directamente sobre el agua residual a tratar.
17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que se añade dicho soporte sólido activo al agua residual a tratar, comprendiendo dicho soporte sólido activo una biopelícula como monocultivo de dicho microorganismo sobre un soporte de un material plástico.
18. Un procedimiento para la formación de una biopelícula como monocultivo de un microorganismo, que comprende la aplicación de una cantidad eficaz de un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 a un cultivo que contiene un soporte sólido y un aceite como fuente de carbono o una fuente de proteínas como fuente de carbono y nitrógeno.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, en donde el soporte sólido es de un material plástico.
20. Procedimiento según la reivindicación 18 ó 19, en el que dicho aceite aceite de oliva.
21. Procedimiento según la reivindicación 18 ó 19, en el que dicha fuente de proteínas es un suero de origen animal.
22. Un procedimiento para el aislamiento de un microorganismo que tiene la capacidad de degradar lípidos y proteínas, que comprende: a) suspender una muestra de un suelo, en un medio de cultivo que carece de fuente de carbono; b) añadir a la suspensión obtenida en la etapa a) una fuente de carbono constituida por uno o más tipos de lípidos, una fuente de fósforo y una fuente de nitrógeno; c) incubar la suspensión resultante de la etapa b) bajo condiciones aeróbicas que permitan el crecimiento de microorganismos con capacidad para hidrolizar lípidos; d) sembrar diluciones de la suspensión resultante de la etapa c) en placas de medio sólido; e) incubar las placas sembradas de la etapa d) durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 7 días a una temperatura comprendida entre 25°C y
30°C; f) aislar y purificar las colonias de los microorganismos, obtenidas en la incubación de la etapa e); g) sembrar en placas de medio sólido diferencial las colonias de los microorganismos aisladas y purificadas en la etapa f), con el fin de seleccionar aquellos que presentan actividad lipolítica, en un medio de cultivo que contiene un lípido como sustrato, una fuente de carbono, una fuente de fósforo, fuente de nitrógeno y un colorante fluorescente a luz ultravioleta; incubando las placas durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 7 días a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C, seleccionando aquellas que finalizado el periodo de incubación presentan un halo naranja fluorescente al ser expuesta a luz ultravioleta; h) sembrar en placas de medio sólido diferencial las colonias de los microorganismos seleccionados en la etapa g), en un medio de cultivo que contiene un leche desnatada como sustrato, una fuente de carbono, una fuente de fósforo y una fuente de nitrógeno, con el fin de analizar la actividad proteolítica, incubando las placas durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 7 días a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C, seleccionando aquellas que finalizado el periodo de incubación presentan un halo transparente; e i) identificar las colonias que presentan actividad lipolítica y proteolítica, seleccionadas en la etapa g) y h).
PCT/ES2012/070256 2011-04-19 2012-04-18 Microorganismos capaces de hidrolizar lípidos y su utilización en depuración de aguas WO2012143591A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES201130630A ES2390743B1 (es) 2011-04-19 2011-04-19 Microorganismos capaces de hidrolizar lípidos y su utilización en depuración de aguas.
ESP201130630 2011-04-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012143591A1 true WO2012143591A1 (es) 2012-10-26

Family

ID=47041083

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2012/070256 WO2012143591A1 (es) 2011-04-19 2012-04-18 Microorganismos capaces de hidrolizar lípidos y su utilización en depuración de aguas

Country Status (2)

Country Link
ES (1) ES2390743B1 (es)
WO (1) WO2012143591A1 (es)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109467280A (zh) * 2018-12-25 2019-03-15 重庆市沃利克环保设备有限公司 一种海鲜加工市场污水处理方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTEN G.L. ET AL.: "Selected properties of lipase and protease of Pseudomonas fluorescens 27 produced in four media", JOURNAL OF DAIRY SCIENCE, vol. 67, no. 8, 1984, pages 1680 - 1687 *
DEVLIEGHER W. ET AL.: "Survival and plant growth promotion of detergent-adapted Pseudomonasfluorescens ANP15 and Pseuomonas aeruginosa 7NSK2", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 61, no. 11, November 1995 (1995-11-01), pages 3865 - 3871 *
NORWOOD D.E. ET AL.: "The growth and resistance to sodium hypochlorite of Listeria monocytogenes in steady-state multispecies biofilm", JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY, vol. 88, 2000, pages 512 - 520 *
O'TOOLE G.A. ET AL.: "Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis", MOLECULAR MICROBIOLOGY, vol. 28, no. 3, 1998, pages 449 - 461, XP001002134, DOI: doi:10.1046/j.1365-2958.1998.00797.x *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109467280A (zh) * 2018-12-25 2019-03-15 重庆市沃利克环保设备有限公司 一种海鲜加工市场污水处理方法
CN109467280B (zh) * 2018-12-25 2021-08-06 重庆市沃利克环保设备有限公司 一种海鲜加工市场污水处理方法

Also Published As

Publication number Publication date
ES2390743B1 (es) 2013-08-19
ES2390743A1 (es) 2012-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lee et al. Lipase‐Secreting Bacillus Species in an Oil‐Contaminated Habitat: Promising Strains to Alleviate Oil Pollution
Vivek et al. Extremophilic lipases for industrial applications: A general review
Chaturvedi et al. Diversity of culturable sodium dodecyl sulfate (SDS) degrading bacteria isolated from detergent contaminated ponds situated in Varanasi city, India
Ziervogel et al. Changes in the spectrum and rates of extracellular enzyme activities in seawater following aggregate formation
Sonune et al. Isolation, characterization and identification of extracellular enzyme producer Bacillus licheniformis from municipal wastewater and evaluation of their biodegradability
Taskin et al. Lipase production with free and immobilized cells of cold-adapted yeast Rhodotorula glutinis HL25
Khadka et al. Biodegradation kinetics of diethyl phthalate by three newly isolated strains of Pseudomonas
Liu et al. Isolation and identification of an iopromide-degrading strain and its application in an A2/O system
Biswas et al. Bacterial consortium based petrochemical wastewater treatment: from strain isolation to industrial effluent treatment
JP5867954B2 (ja) 乳脂肪分解能を有する南極産担子菌酵母及びその利用方法
Jaiganesh et al. Isolation, purification, and characterization of lipase from Bacillus sp. from kitchen grease
ES2390743B1 (es) Microorganismos capaces de hidrolizar lípidos y su utilización en depuración de aguas.
Anggriani et al. Lipase-producing ability of bacteria from inasua (fish fermented product) from Central Moluccas, Indonesia
Tzirita et al. A study of the suitability of three commercial bioaugmentation products for use in grease traps
TWI756538B (zh) 油分解微生物
RU2501852C2 (ru) Препарат для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов
Roets-Dlamini et al. Use of Bacillus spp in the bioremediation of fats, oils and greases (FOG's), and other waste substrates in food processing effluents
RU2660196C1 (ru) Биопрепарат для очистки сточных вод от масложировых загрязнений
RU2675940C1 (ru) Штамм бактерий Bacillus sp. ВКМ В-2815D - деструктор нефти и нефтепродуктов
JPWO2020009232A1 (ja) 脂肪酸含有油脂を分解する新規微生物
JP3091758B1 (ja) 油脂分解菌及びそれを用いる油脂含有排水の処理方法
Afzal et al. Characterization, antibiotic sensitivity assay and phylogenetic analysis of bacterial isolates of river water
Yassin et al. Screening For the Production of Lipase and Its Optimum Conditions from Bacterial Isolates
Ahmad et al. Biodegradation of chicken feather wastes in submerged fermentation containing high concentrations of heavy metals by Bacillus sp. khayat
JP7260369B2 (ja) 油脂の新規分解微生物

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12773626

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12773626

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1