WO2012128338A1 - タンパク質および核酸の超高感度測定法およびキット、並びに新規な酵素基質 - Google Patents

タンパク質および核酸の超高感度測定法およびキット、並びに新規な酵素基質 Download PDF

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    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)

Definitions

  • the present invention relates to a highly sensitive assay method and kit for proteins and nucleic acids using enzyme immunoassay and nucleic acid probe assay.
  • the present invention avoids inhibition in the thio-NAD cycling method used to measure the activity of these enzymes by using specific enzyme substrates for the enzymes that label antibodies or nucleic acid probes.
  • the present invention relates to a method that enables highly sensitive measurement.
  • the present invention also provides a novel enzyme substrate that can be used in a highly sensitive assay method and kit for the above protein and nucleic acid.
  • the radioimmunoassay (RIA) method has been technically established as a high-sensitivity measurement method for proteins and nucleic acids. In addition to increasing the sensitivity of detection devices, at present, higher sensitivity of about 10 -16 mole or higher is technically required. Impossible. Moreover, in the RIA method, the field of measurement is not limited to the isotope experimental facility, but if a short-lived nuclide is used, the expiration date of the reagent is extremely shortened and the measurement sensitivity is drastically lowered. In addition, there is a problem of radioactive waste unique to radioactivity measurement methods. The problem of disposal is particularly great when long-lived nuclides are used. Therefore, in recent years, research on the development of high-sensitivity measurement methods for proteins and nucleic acids has been developed with the keyword “non-radioactive”. Therefore, there is almost no research and development or technical improvement on the RIA method.
  • ELISA method enzyme immunoassay
  • PCR method nucleic acid measurement
  • Enzyme immunoassays have been developed with higher sensitivity (10 -15 mole) from the original colorimetric method (10 -13 mole) to the fluorescence method and luminescence method, and the development and improvement of dedicated measuring devices are also progressing.
  • the sensitivity has reached its limit just by making the measurement operation simple.
  • Patent Document 1 describes an enzyme measurement method using an antibody-enzyme complex using a thio-NAD cycling method and a nucleic acid probe measurement method using an enzyme-labeled nucleic acid probe.
  • Patent Document 1 combines an enzyme immunoassay with an enzyme cycling method using a product of a labeled enzyme used in the enzyme immunoassay as a substrate, and thioNAD (P) H as a signal substance in a geometric series.
  • thioNAD P
  • P thioNAD
  • an object of the present invention is to solve the problem of the substrate for the labeled enzyme in the method described in Patent Document 1 in which the enzyme cycling method using the enzyme-linked immunosorbent assay as a substrate is the product of the labeled enzyme. It is an object to provide a measurement method that uses a colorimetric method, which is the simplest colorimetric detection method by colorimetric measurement of protein or nucleic acid, and which has a sensitivity enhanced geometrically. Specifically, it is to provide a measurement method with sensitivity increased to 10 -18 moles or more.
  • the present inventors have found a compound that can be a substrate for a labeling enzyme that has solved the above-mentioned problems or provided a new compound, and found that the above-described problems can be solved by using these substrates. Was completed.
  • the present invention is as follows.
  • An enzyme activity measurement method using an antibody-enzyme complex wherein alkaline phosphatase, glucosidase, galactosidase, fructosidase, mannosidase or peroxidase is used as an enzyme of the antibody-enzyme complex,
  • an androsterone derivative represented by the following general formula (1) as a substrate of the enzyme,
  • X is a phosphoric acid group
  • Y 1 and Y 2 are jointly a methylene group
  • Y 1 is hydrogen
  • Y 2 is hydrogen, a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or An alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • the androsterone derivative represented by the general formula (1) is used as a substrate for glucosidase, galactosi
  • a nucleic acid probe measurement method using an enzyme-labeled nucleic acid probe Using alkaline phosphatase, glucosidase, galactosidase, fructosidase, mannosidase or peroxidase as the enzyme of the enzyme-labeled nucleic acid probe, and an androsterone derivative represented by the following general formula (1) as a substrate of the enzyme, (i) When the androsterone derivative represented by the general formula (1) is used as a substrate for alkaline phosphatase, In the formula, X is a phosphoric acid group, Y 1 and Y 2 are jointly a methylene group, or Y 1 is hydrogen, Y 2 is hydrogen, a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 6
  • the method is carried out by measuring the amount of thio-NADH and / or thio-NADPH produced, or measuring the color change caused by the produced thio-NADH and / or thio-NADPH.
  • the enzyme is alkaline phosphatase;
  • the androsterone derivative represented by the general formula (1) is In the formula, X is a phosphoric acid group, Y 1 and Y 2 are jointly a methylene group, or Y 1 is hydrogen, Y 2 is hydrogen, a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or The method according to [1] or [2], which is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the enzyme is glucosidase, galactosidase, fructosidase or mannosidase, and androsterone derivative represented by the general formula (1),
  • X is a sugar residue
  • the sugar residue is one selected from the group consisting of glucose, galactose, fructose and mannose
  • Y 1 and Y 2 are a methylene group or an oxygen atom together
  • Y 1 is hydrogen
  • Y 2 is hydrogen, a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, [1] or [2].
  • the enzyme is peroxidase, and androsterone derivative represented by the general formula (1),
  • X is —O—CO—R (wherein R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a phenyl group), and Y 1 and Y 2 together are a methylene group or an oxygen atom,
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a phenyl group
  • Y 1 and Y 2 together are a methylene group or an oxygen atom
  • Y 1 is hydrogen
  • Y 2 is hydrogen, a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, [1] or [2].
  • An enzyme immunoassay kit comprising the following reagents (1) to (5): (1) Alkaline phosphatase labeled with an antibody specific for the target protein antigen (2) an androsterone derivative represented by the general formula (1) which is a substrate of the enzyme (Wherein X is a phosphate group, Y 1 and Y 2 are jointly methylene groups, or Y 1 is hydrogen, Y 2 is hydrogen, a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, Or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms), (3) Hydroxysteroid dehydrogenase (HSD) (4) NADH and / or NADPH, (5) Thio NAD and / or Thio NADP [7] An enzyme immunoassay kit comprising the following reagents (1) to (5): (1) Glucosidase, galactosidase, fructosidase or mannosidase labeled with an antibody specific to the target protein antigen (2) an androsterone derivative
  • Y 1 is hydrogen, and Y 2 is hydrogen, a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms), (3) Hydroxysteroid dehydrogenase (HSD) (4) NADH and / or NADPH, (5) Thio NAD and / or Thio NADP [8]
  • An enzyme immunoassay kit comprising the following reagents (1) to (5): (1) peroxidase labeled with an antibody specific for a target protein antigen, (2) an androsterone derivative represented by the general formula (1) which is a substrate of the enzyme (Wherein X is —O—CO—R (wherein R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a phenyl group), and Y 1 and Y 2 together are a methylene group or an oxygen atom) Or Y 1 is hydrogen, and Y 2 is hydrogen, a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms
  • Y 1 is hydrogen, and Y 2 is hydrogen, a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms), (3) hydroxysteroid dehydrogenase (HSD), (4) NADH and / or NADPH, (5) Thio NAD and / or Thio NADP [11]
  • a kit for measuring a nucleic acid probe comprising the following reagents (1) to (5): (1) peroxidase labeled with a nucleic acid probe that specifically binds to a target nucleic acid, (2) an androsterone derivative represented by the general formula (1) which is a substrate of the enzyme (Wherein X is —O—CO—R (wherein R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a phenyl group), and Y 1 and Y 2 together are a methylene group or an oxygen atom) Or Y 1 is hydrogen, and Y 2 is hydrogen, a hydroxyl group
  • X is a phosphoric acid group
  • Y 1 and Y 2 are jointly a methylene group
  • Y 1 is hydrogen
  • Y 2 is a hydroxyl group
  • B X is one sugar residue selected from the group consisting of glucose, galactose, fructose and mannose
  • Y 1 and Y 2 are jointly methylene groups
  • Y 1 is hydrogen
  • Y 2 is hydrogen, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • C X is -O-CO-R, R is an alkyl group or phenyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • Y 1 and Y 2 are a methylene group or an oxygen atom, or
  • X, Y 1 and Y 2 are defined as follows: (A) X is a phosphate group, Y 1 and Y 2 are jointly methylene groups, or Y 1 is hydrogen, Y 2 is a hydroxyl group, The androsterone derivative according to [12], which is an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. [14] The definitions of X, Y 1 and Y 2 are as follows: (B) X is one sugar residue selected from the group consisting of glucose, galactose, fructose and mannose, and Y 1 and Y 2 are methylene groups together.
  • Y 1 is hydrogen and Y 2 is hydrogen, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • X, Y 1 and Y 2 are defined as follows: (C) X is —O—CO—R, R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a phenyl group, and Y 1 and Y 2 together represent methylene.
  • the enzyme immunoassay which improved the measurement sensitivity to 10 ⁇ -18 > mols or more can be provided, and the highly sensitive measurement of target protein or target nucleic acid is possible.
  • the present invention relates to an androsterone derivative represented by the following general formula (1).
  • the definition of X, Y 1 and Y 2 is one of the following (A), (B) and (C).
  • A) X is a phosphoric acid group, Y 1 and Y 2 are jointly a methylene group, or Y 1 is hydrogen, Y 2 is a hydroxyl group, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or a carbon number 1 to 6 alkyl groups
  • (B) X is one sugar residue selected from the group consisting of glucose, galactose, fructose and mannose, Y 1 and Y 2 are jointly methylene groups, or Y 1 is hydrogen, Y 2 is hydrogen, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • C) X is -O-CO-R, R is an alkyl group or phenyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • Examples of Y 2 may be an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms such as a methoxy group, an ethoxy group, or a propoxy group, and an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms may be, for example, a methyl group or an ethyl group. , Iso-propyl group, n-propyl group, tert-butyl group, n-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group and the like.
  • the sugar of the sugar residue can be glucose, galactose, fructose or mannose, and can be appropriately selected depending on the labeling enzyme used.
  • the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms in R is, for example, a methyl group, an ethyl group, an iso-propyl group, n- It may be a propyl group, tert-butyl group, n-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group, and the like.
  • R may be a phenyl group or may have a functional group.
  • X is a sugar residue or -O-CO-R, specifically a sugar derivative of 5 ⁇ -androsterone or 5 ⁇ -androsterone, such as a glucoside , Galactoside, fructoside or mannoside.
  • glucoside, galactoside, fructoside and mannoside are formally called glucopyranoside, galactopyranoside, fructopyranoside and mannopyranoside, respectively.
  • Table 1 Specific examples of the compound of the present invention are shown in Table 1 described later. However, Table 1 includes compounds that can be used in the methods and kits of the present invention in addition to specific examples of the compounds of the present invention.
  • the compounds of the present invention can be synthesized based on the methods described in Examples or with reference to the methods described in Examples.
  • the present invention is an enzyme measurement method using an antibody-enzyme complex, Enzymatic reaction product quantification of antibody-enzyme complex uses NADH and / or NADPH, thioNAD and / or thioNADP, and dehydrogenase (DH) to produce thioNADH and / or thioNADPH by enzyme cycling reaction And measuring the amount of thio-NADH and / or thio-NADPH produced, or measuring the color change caused by thio-NADH and / or thio-NADPH.
  • the antibody-enzyme complex comprises an antibody specific for the target protein antigen and an enzyme labeled with this antibody, and is used for measuring the target protein.
  • the present invention relates to a method for measuring a nucleic acid probe using an enzyme-labeled nucleic acid probe, wherein the enzyme-labeled nucleic acid probe quantifies the reaction product by NADH and / or NADPH, thio-NAD and / or thio-NADP, and dehydrogenase ( DH) is used to generate thio-NADH and / or thio-NADPH by an enzyme cycling reaction and measure the amount of thio-NADH and / or thio-NADPH generated, or the color of thio-NADH and / or thio-NADPH generated It is related with the said method performed by measuring a change.
  • the enzyme-labeled nucleic acid probe quantifies the reaction product by NADH and / or NADPH, thio-NAD and / or thio-NADP, and dehydrogenase ( DH) is used to generate thio-NADH and / or thio-NADPH by an
  • the enzyme-labeled nucleic acid probe comprises a nucleic acid probe that specifically binds to a target nucleic acid and an enzyme labeled with the nucleic acid probe, and is used for measuring the target nucleic acid.
  • the enzyme (labeled enzyme) of the antibody-enzyme complex or enzyme-labeled nucleic acid probe used in the method of the present invention is alkaline phosphatase (ALP), galactosidase, glucosidase, fructosidase, mannosidase or peroxidase.
  • ALP alkaline phosphatase
  • galactosidase galactosidase
  • glucosidase glucosidase
  • fructosidase fructosidase
  • mannosidase mannosidase
  • peroxidase peroxidase
  • An androsterone derivative represented by the following general formula (1) is used as the enzyme substrate.
  • the androsterone derivative included in (ii) includes the above novel compound of the present invention, and further includes a compound in which Y 1 and Y 2 are oxygen atoms together.
  • Y 1 and Y 2 are oxygen atoms together
  • compounds in which X is glucose are described in Carbohydrate Research, 1971, Vol. 17, No. 1, p. 199-207. The entire description of this document is hereby specifically incorporated by reference.
  • compounds in which Y 2 is a hydroxyl group compounds in which X is glucose are described in Phytochemistry, 1974, Vol. 13, No. 10, p.2135-2142. The entire description of this document is hereby specifically incorporated by reference.
  • X is —O—CO—R (where R is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or Y 1 and Y 2 are jointly a methylene group or an oxygen atom, or Y 1 is hydrogen, Y 2 is hydrogen, a hydroxyl group, and an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms. Or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or Y 1 and Y 2 are jointly a methylene group or an oxygen atom, or Y 1 is hydrogen, Y 2 is hydrogen, a hydroxyl group, and an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms. Or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or Y 1 and Y 2 are jointly a methylene group or an oxygen atom, or Y 1 is hydrogen, Y 2 is hydrogen, a hydroxyl group, and an alkoxy group having
  • the ultrasensitive measurement method of the present invention can be carried out in the same manner as the usual enzyme immunoassay method and nucleic acid probe method.
  • a solid phase carrier used for normal measurement such as a solid phase carrier to which an antibody or nucleic acid probe that specifically binds to the analyte is fixed, such as a microplate, plastic tube, or magnetic bead. Can do.
  • Antibody and nucleic acid probe-enzyme complexes can be prepared by conventional methods.
  • the antibody constituting the antibody-enzyme complex can be appropriately selected from antibodies that specifically bind to the analyte to be measured by the enzyme immunoassay method of the present invention.
  • the enzyme immunoassay method of the present invention is used for protein analysis.
  • the antibody of the antibody-enzyme complex is an antibody that specifically binds to the protein as the analyte.
  • a substrate on which an antibody that specifically binds to the protein as the analyte is fixed to the surface is used.
  • the antibody constituting the antibody-enzyme complex and the antibody to be fixed to the substrate may be antibody fragments.
  • the analyte in the enzyme immunoassay method of the present invention is not limited to a protein, and can be any substance other than the protein to be measured by a normal enzyme immunoassay method.
  • a probe complementary to the nucleic acid to be measured can be selected as appropriate for the nucleic acid probe enzyme complex.
  • the quantification of the reaction product by the enzyme of the antibody-enzyme complex or the enzyme-labeled nucleic acid probe is performed using NADH and / or NADPH, thioNAD and / or thioNADP, and dehydrogenase (DH).
  • NADH and / or NADPH NADH and / or NADPH
  • thioNAD and / or thioNADP a dehydrogenase
  • DH dehydrogenase
  • the concentration of each component can be in the following range.
  • Concentration range of antibody-enzyme complex or enzyme-labeled nucleic acid probe 0.01 ⁇ g / ml to 1 mg / ml
  • Concentration range of the label enzyme substrate 1 ⁇ M to 500 mM
  • NADH and / or NADPH concentration range 0.01 mM to 50 mM
  • Thio NAD and / or Thio NADP concentration range 0.01 mM to 100 mM
  • Dehydrogenase (DH) concentration 0.01 u / ml to 5000 u / ml
  • the reaction conditions can be appropriately determined in consideration of the optimum temperature range of the labeling enzyme and dehydrogenase (DH).
  • the reaction temperature is preferably room temperature since the operation is simple. However, it can be carried out at a temperature higher or lower than room temperature in consideration of the optimum temperature range of the labeling enzyme and dehydrogenase (DH).
  • the reaction time accumulates thio-NADH and / or thio-NADPH to such an extent that the amount of thio-NADH and / or thio-NADPH produced can be measured or the color change due to the produced thio-NADH and / or thio-NADPH can be measured Enough time.
  • the accumulation amount of thio-NADH and / or thio-NADPH necessary for measurement or measurement varies depending on the measurement or measurement conditions, and can be appropriately determined according to the conditions.
  • Cycle cycling using thio NAD (P) is a unique cycling system that appeared relatively recently.
  • dehydrogenase (DH) using NAD (P) / NAD (P) H as a coenzyme is used.
  • the measurement principle of the thio NAD (P) cycling method is as follows.
  • Cycling systems that use thio-NAD (P) can measure dehydrogenase activity based on increased absorption of NADH, taking advantage of the fact that it can be measured using popular absorption photometers and microplate readers for colorimetry.
  • Some of the conventional methods such as a method for quantifying the substrate have been improved to a method using thio NAD.
  • this cycling system as a detection system such as an enzyme immunoassay for high sensitivity.
  • an amplification reaction can be made a geometrical reaction for the first time, and sufficient sensitivity can be increased.
  • the product produced by the enzyme complex and the substrate combined therewith is used as a substrate for the next enzyme cycling reaction, and the thiol produced by the enzyme cycling reaction is used. Colorimetric determination of NAD (P) H absorption.
  • the substrate for the enzyme cycling reaction may be a reduced substrate or an oxidized substrate.
  • the labeled enzyme used as the enzyme complex used in the present invention, its substrate, and the dehydrogenase used in the subsequent cycling reaction have the following properties.
  • Labeled enzyme product is androsterone or its derivatives
  • Commercially available and widely used labeled enzymes can be used
  • Enzymatic cycling turnover number is large
  • Dehydrogenation used for enzymatic cycling reaction Enzyme does not have the same activity as labeling enzyme contamination or labeling enzyme
  • DH dehydrogenase
  • Examples of dehydrogenase (DH) include 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase.
  • usable substrate candidates include androsterone, 11 ⁇ -hydroxyandrosterone, 11-oxoandrosterone, 11 ⁇ -hydroxyandrosterone. Is mentioned.
  • a substrate having a high enzyme reaction rate (high activity against the substrate) and reacting even at a low concentration (small Km value) is preferable.
  • a preferable property as a dehydrogenase is a reaction rate when thioNAD (P) is used as a coenzyme.
  • the reaction rate when thio-NAD is used as a coenzyme is within several percent of that when NAD is used, whereas in the dehydrogenation reaction of androsterone with 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase, The reaction rate with NAD is about 59% of the reaction rate with NAD, and it has favorable properties as the cycling enzyme of the present invention.
  • alkaline phosphatase ALP
  • the 3-position phosphate ester of an androsterone derivative which is a substrate for alkaline phosphatase is easily synthesized. It is.
  • glucosidase and an androsterone derivative glucoside which are widely used as labeling enzymes
  • galactosidase and an androsterone derivative galactoside are also easily combined and preferred combinations.
  • peroxides of peroxidase and androsterone derivatives that are widely used as labeling enzymes such as tert-butyl peroxide, are also a combination that is easy to synthesize and is preferable.
  • Alkaline phosphatase is an enzyme that is widely used as a labeling enzyme.
  • this enzyme immunoassay method using ALP if a new androsterone derivative is used as a substrate for ALP, androsterone is produced as a product. .
  • 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase (3 ⁇ -HSD) which is a dehydrogenase using the reaction product of ALP as a substrate, is used for the enzyme cycling reaction.
  • ThioNAD cycling allows amplification and quantification of dehydrogenase substrates with an efficiency of several hundred cycles per minute if an appropriate dehydrogenase reaction is selected. Therefore, the activity of an enzyme that gives such a substrate as a reaction product can be measured with extremely high sensitivity by thio-NAD cycling.
  • the present invention includes an enzyme cycling method kit comprising an enzyme labeled on a reactive carrier, its substrate, an enzyme for cycling reaction, and its coenzymes thio NAD and NADH.
  • the reactive carrier represents an antibody, a nucleic acid probe, a lectin or the like having an activity to bind to a measurement object.
  • the reactive carrier is not particularly limited as long as it is suitable for the measurement target, and the labeling enzyme and its substrate are also suitable.
  • the present invention includes a kit for an enzyme cycling method comprising a labeling enzyme, its substrate, an enzyme for cycling reaction, and its coenzymes thio NAD and NADH.
  • the kit of the present invention is an enzyme immunoassay kit containing the following reagents (1) to (5).
  • Alkaline phosphatase which is an enzyme labeled with an antibody specific for the target protein antigen, or glucosidase or galactosidase or fructosidase or mannosidase or peroxidase, (2) an androsterone derivative represented by the general formula (1) which is a substrate of the enzyme, (3) dehydrogenase (DH), (4) NADH and / or NADPH, (5) Thio NAD and / or Thio NADP
  • the present invention is a kit for measuring a nucleic acid probe comprising the following reagents (1) to (5).
  • Alkaline phosphatase which is an enzyme labeled with a nucleic acid probe that specifically binds to a target nucleic acid, or glucosidase or galactosidase or fructosidase or mannosidase or peroxidase, (2) an androsterone derivative represented by the general formula (1) which is a substrate of the enzyme, (3) dehydrogenase (DH), (4) NADH and / or NADPH, (5) Thio NAD and / or Thio NADP
  • dehydrogenase (DH) and general formula (1) those described in the method of the present invention can be used as they are.
  • kit of the present invention a commercially available enzyme-labeled antibody or the like can be used in combination with the constituent reagents of this kit.
  • This kit can be used for an enzyme immunoassay method using an enzyme cycling method.
  • Alkaline phosphatase and Pumilio using thio-NAD cycling of the Alkaline phosphatase (ALP) and Androsterone 3-phosphate (A3P) system as a detection system.
  • ALP Alkaline phosphatase
  • A3P Androsterone 3-phosphate
  • Reference example 2 Preparation of insoluble carrier-immobilized antibody 1
  • BSA bovine serum albumin
  • Measurement Method A 0.1% BSA-containing TBS (pH) containing purified Pumilio (standard substance) in a range of 0 to 200 ng / ml on a microplate on which the anti-Pumilio guinea pig polyclonal antibody prepared by the method of Reference Example 2 is immobilized. 7.5) 50 ⁇ l of the solution was added and shaken at room temperature for 1 hour. Next, the solution in the well is removed by suction, washed with 0.05% Tween 20-containing TBS (pH 7.5), and contains the ALP-labeled anti-Pumilio mouse monoclonal antibody prepared by the method of Reference Example 1 at a concentration of 2.5 ⁇ g / ml.
  • FIG. 2 shows a straight line having a good concentration dependency obtained by plotting the amount of change in absorbance for 30 minutes against the concentration of the standard substance.
  • Reaction reagent B 0.2 M glycine buffer (pH 9.6) containing 0.2 M disodium hydrogen phosphate 3 mM thio-NAD 1 mM NADH 40 U / ml 3 ⁇ -Hydroxysteroid dehydrogenase
  • Measurement Method A 0.1% BSA-containing TBS (pH) containing purified Pumilio (standard substance) in the range of 0 to 100 ng / ml in a microplate on which the anti-Pumilio guinea pig polyclonal antibody prepared by the method of Reference Example 3 is immobilized. 7.5) 50 ⁇ l of the solution was added and shaken at room temperature for 1 hour. Next, the solution in the well is removed by suction, washed with 0.05% Tween 20-containing TBS (pH 7.5), and contains the ALP-labeled anti-Pumilio mouse monoclonal antibody prepared by the method of Reference Example 1 at a concentration of 2.5 ⁇ g / ml.
  • FIG. 3 shows a straight line having good concentration dependency obtained by plotting the amount of change in absorbance for 30 minutes against the standard substance concentration.
  • Reaction reagent 0.1 M Tris buffer (pH 8.6) 0.5 mM MgCl 2 1.5 mM thio-NAD 0.5 mM NADH 0.5 mM 5 ⁇ -Androsterone 3-phosphate 20 U / ml 3 ⁇ -Hydroxysteroid dehydrogenase
  • Measurement Method A 0.1% BSA-containing TBS (pH) containing purified Pumilio (standard substance) in the range of 0 to 50 ng / ml in a microplate on which the anti-Pumilio guinea pig polyclonal antibody prepared by the method of Reference Example 3 is immobilized. 7.5) 50 ⁇ l of the solution was added and shaken at room temperature for 1 hour. Next, the solution in the well is removed by suction, washed with 0.05% Tween 20-containing TBS (pH 7.5), and contains the ALP-labeled anti-Pumilio mouse monoclonal antibody prepared by the method of Reference Example 1 at a concentration of 2.5 ⁇ g / ml.
  • FIG. 4 shows a straight line having good concentration dependency obtained by plotting the amount of change in absorbance for 30 minutes against the standard substance concentration.
  • Reaction reagent A 0.1 M Tris buffer (pH 8.3) 1 mM MgCl 2 0.1 mM 5 ⁇ -Androsterone 3-phosphate
  • Reaction reagent B 0.2 M glycine buffer (pH 9.6) containing 0.2 M disodium hydrogen phosphate 3 mM thio-NAD 1 mM NADH 40 U / ml 3 ⁇ -Hydroxysteroid dehydrogenase
  • Measurement Method A 0.1% BSA-containing TBS (pH) containing purified Pumilio (standard substance) in the range of 0 to 50 ng / ml in a microplate on which the anti-Pumilio guinea pig polyclonal antibody prepared by the method of Reference Example 3 is immobilized. 7.5) 50 ⁇ l of the solution was added and shaken at room temperature for 1 hour. Next, the solution in the well is removed by suction, washed with 0.05% Tween 20-containing TBS (pH 7.5), and contains the ALP-labeled anti-Pumilio mouse monoclonal antibody prepared by the method of Reference Example 1 at a concentration of 2.5 ⁇ g / ml.
  • FIG. 5 shows a straight line having good concentration dependency obtained by plotting the amount of change in absorbance for 10 minutes against the standard substance concentration.
  • Reaction reagent 0.1 M Tris buffer (pH 9.5) 0.2 mM MgCl 2 0.6 mM thio-NAD 4 mM NADH 0.5 mM 3 ⁇ -Hydroxy-17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -Androstane 3-phosphate 20 U / ml 3 ⁇ -Hydoroxysteroid dehydrogenase
  • Measurement method 50 ⁇ l of Tris buffer solution (pH 9.5) containing standard substance (Alkaline phosphatase) in the range of 0 to 2 mU / ml is added to a flat-bottomed microplate well, and then 50 ⁇ l each of reaction reagent B is added to the well.
  • the absorbance was measured for 60 minutes using a 405 nm filter with a microplate reader (Corona MTP-500) while heating at 37 ° C.
  • FIG. 7 shows a straight line having good concentration dependency obtained by plotting the amount of change in absorbance for 60 minutes against the standard substance concentration.
  • Reaction reagent A 0.1 M Tris buffer (pH 9.5) 0.2 mM MgCl 2 1 mM 3 ⁇ -Hydroxy-17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -Androstane 3-phosphate
  • Reaction reagent B 0.15 M pyrophosphate buffer (pH 9.5) 3 mM thio-NAD 1 mM NADH 40 U / ml 3 ⁇ -Hydoroxysteroid dehydrogenase
  • the ALP The labeled antibody solution is present a complex of different molecular weights of ALP and Fab, since activity has variation, ALP-labeled antibody solution 1 mM Mgl 2 produced, 0.1 mM ZnCl 2, the 0.01% BSA Gel filtration using a column (Amersham Biosciences) packed with superdex 200 using Tris buffer (pH 7.0) as an eluent, and comparing the activity of each fraction, ALP-labeled antibody with a large S / N ratio Only recovered.
  • Example 3 Measurement reaction reagent 0.1 M Tris buffer 3 ⁇ -Hydroxy-17 ⁇ -methoxy- 5 ⁇ -Androstane 3-phosphate Pumilio by 1 step method using (Pumirio) (pH 9.5) 1.5 mM thio-NAD 2.5 mM NADH 0.1 mM 3 ⁇ -Hydroxy-17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -Androstane 3-phosphate 20 U / ml 3 ⁇ -Hydoroxysteroid dehydrogenase
  • Measurement Method A 0.1% BSA-containing TBS (pH) containing purified Pumilio (standard substance) in a range of 0 to 25 ng / ml in a microplate on which the anti-Pumilio guinea pig polyclonal antibody prepared by the method of Reference Example 5 is immobilized. 7.5) 50 ⁇ l of the solution was added and shaken at room temperature for 2 hours. Next, the solution in the well was removed by suction, washed with 0.5% Triton X-100-containing TBS (pH 7.5), and ALP-labeled anti-Pumilio mouse monoclonal antibody prepared by the method of Reference Example 4 at a concentration of about 0.8 ⁇ g / ml.
  • FIG. 9 shows a straight line having good concentration dependency obtained by plotting the amount of change in absorbance for 60 minutes against the standard substance concentration.
  • Measurement Method A 0.1% BSA-containing TBS (pH) containing purified Pumilio (standard substance) in the range of 0 to 0.5 ng / ml in a microplate on which the anti-Pumilio guinea pig polyclonal antibody prepared by the method of Reference Example 5 is immobilized. 7.5) 50 ⁇ l of the solution was added and shaken at room temperature for 2 hours.
  • the solution in the well was removed by suction, washed with 0.5% Triton X-100-containing TBS (pH 7.5), and about 0.2 ⁇ g / ml of ALP-labeled anti-Pumilio mouse monoclonal antibody prepared by the method of Reference Example 4, rabbit 50 ⁇ l of 0.1% BSA-containing TBS (pH 7.5) solution containing F (ab ′) 2 at a concentration of 1 mg / ml was added and shaken at 4 ° C. for 2 hours.
  • the solution in the well was removed by suction, washed with 0.5% Triton X-100-containing TBS (pH 7.5), and further washed with TBS.
  • reaction reagent A 50 ⁇ l of reaction reagent A was added to each well and incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
  • 50 ⁇ l of reaction reagent B was added to the well, and the absorbance was measured for 30 minutes using a 405 nm filter with a microplate reader (MTP-500 manufactured by Corona) while heating at 37 ° C.
  • FIG. 10 shows a straight line having good concentration dependency obtained by plotting the amount of change in absorbance for 30 minutes against the standard substance concentration.
  • ⁇ -Galactosidase was used as the labeling enzyme for ELISA, and Androsterone ⁇ -D-Galactoside was synthesized as a substrate for further investigation.
  • Reaction reagent A 0.1 M phosphate buffer (pH 7.3) 0.2 mM MgCl 2 0.1 mM 5 ⁇ -Androsterone ⁇ -D-Galactoside
  • Reaction reagent B 0.1 M pyrophosphate buffer (pH 9.0) 1.2 mM thio-NAD 3.6 mM NADH 40 U / ml 3 ⁇ -Hydoroxysteroid dehydrogenase
  • Measurement method 25 ⁇ l of phosphate buffer solution (pH 7.3) containing standard substance ( ⁇ -Galactosidase) in the range of 0 to 200 pg / ml is added to a flat-bottomed microplate well, and then 25 ⁇ l of reaction reagent A is added to the well. They were added and mixed, and incubated at 37 ° C for 60 minutes. Next, 50 ⁇ l of the reaction sample solution B was added to each well, and the absorbance was measured for 30 minutes using a 405 nm filter with a microplate reader (Corona MTP-500) while heating at 37 ° C.
  • FIG. 11 shows a straight line having good concentration dependency obtained by plotting the amount of change in absorbance for 30 minutes against the standard substance concentration.
  • Reaction reagent 0.1 M phosphate buffer (pH 7.7) 10 mM MgCl 2 6 mM thio-NAD 1 mM NADH 0.1 mM 5 ⁇ -Androsterone ⁇ -D-Galactoside 40 U / ml 3 ⁇ -Hydoroxysteroid dehydrogenase
  • FIG. 12 shows a straight line having good concentration dependency obtained by plotting the change in absorbance for 120 minutes against the concentration of the standard substance.
  • Reaction reagent A 0.1 M phosphate buffer (pH 7.5) 10 mM MgCl 2 0.1 mM 5 ⁇ -Androsterone ⁇ -D-Galactoside
  • Reaction reagent B 0.1 M pyrophosphate buffer (pH 9.0) 4.8 mM thio-NAD 0.4 mM NADH 40 U / ml 3 ⁇ -Hydoroxysteroid dehydrogenase
  • Measurement method 25 ⁇ l of phosphate buffer solution (pH 7.5) containing standard substance ( ⁇ -Galactosidase) in the range of 0 to 200 pg / ml is added to a flat-bottomed microplate well, and then 25 ⁇ l of reaction reagent A is added to the well. They were added and mixed, and incubated at 37 ° C for 60 minutes. Next, 50 ⁇ l of the reaction sample solution B was added to each well, and the absorbance was measured for 30 minutes using a 405 nm filter with a microplate reader (Corona MTP-500) while heating at 37 ° C.
  • FIG. 13 shows a straight line having good concentration dependency obtained by plotting the amount of change in absorbance for 30 minutes against the concentration of the standard substance.
  • N-iodosuccinimide (435 mg) and trifluoromethanesulfonic acid (15 mg) were added, and the mixture was stirred at ⁇ 20 ° C. for 2 hours, and further reacted at room temperature for 2 hours.
  • the reaction was stopped by adding 250 ⁇ L of triethylamine, and the reaction was washed successively with a 3: 1 mixture of saturated sodium carbonate and sodium thiosulfate, and saturated brine. After drying the organic layer with anhydrous sodium sulfate, the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in methanol (15 mL), 28% sodium methoxide (500 ⁇ L) was added, and the mixture was stirred for 2 hr.
  • Reaction reagent 0.1 M phosphate buffer (pH 8.5) 10 mM MgCl 2 6 mM thio-NAD 1 mM NADH 0.2 mM 3 ⁇ -Hydroxy-17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -Androstane ⁇ -D-Galactoside 20 U / ml 3 ⁇ -Hydoroxysteroid dehydrogenase
  • FIG. 14 shows a straight line having good concentration dependency obtained by plotting the amount of change in absorbance for 120 minutes against the concentration of the standard substance.
  • Reaction reagent A 0.1 M phosphate buffer (pH 7.5) 4 mM MgCl 2 0.1 mM 3 ⁇ -Hydroxy-17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -Androstane ⁇ -D-Galactoside
  • Reaction reagent B 0.1 M pyrophosphate buffer (pH 9.8) 1.2 mM thio-NAD 1 mM NADH 40 U / ml 3 ⁇ -Hydoroxysteroid dehydrogenase
  • Measurement method 25 ⁇ l of phosphate buffer solution (pH 7.5) containing standard substance ( ⁇ -Galactosidase) in the range of 0 to 200 pg / ml is added to a flat-bottomed microplate well, and then 25 ⁇ l of reaction reagent A is added to the well. They were added and mixed, and incubated at 37 ° C for 60 minutes. Next, 50 ⁇ l of the reaction sample solution B was added to each well, and the absorbance was measured for 30 minutes using a 405 nm filter with a microplate reader (Corona MTP-500) while heating at 37 ° C.
  • FIG. 15 shows a straight line having good concentration dependency obtained by plotting the amount of change in absorbance for 30 minutes against the concentration of the standard substance.
  • Reaction reagent 0.1 M phosphate buffer (pH 7.7) 5 mM MgCl 2 1.2 mM thio-NAD 0.8 mM NADH 0.05 mM 5 ⁇ -Androstane ⁇ -D-Galactoside 20 U / ml 3 ⁇ -Hydoroxysteroid dehydrogenase
  • Measurement Method A 0.1% BSA-containing TBS (pH) containing purified Pumilio (standard substance) in the range of 0 to 2.5 ng / ml on a microplate immobilized with the anti-Pumilio guinea pig polyclonal antibody prepared by the method of Reference Example 5.
  • 7.5 50 ⁇ l of the solution was added and shaken at room temperature for 2 hours. Next, the solution in the well was removed by suction, washed with 0.5% Triton X-100-containing TBS (pH 7.5), and the biotin-labeled anti-Pumilio mouse monoclonal antibody prepared by the method of Reference Example 6 was added at a concentration of approximately 0.1 ⁇ g / ml.
  • FIG. 16 shows a straight line having good concentration dependency obtained by plotting the amount of change in absorbance for 60 minutes against the standard substance concentration.
  • Reaction reagent A 0.1 M phosphate buffer (pH 7.5) 0.1 mM MgCl 2 0.05 mM 5 ⁇ -Androsterone ⁇ -D-Galactoside
  • Reaction reagent B 0.1 M pyrophosphate buffer (pH 9.0) 3 mM thio-NAD 2 mM NADH 40 U / ml 3 ⁇ -Hydoroxysteroid dehydrogenase
  • Measurement Method A 0.1% BSA-containing TBS (pH) containing purified Pumilio (standard substance) in a range of 0 to 5 ng / ml on a microplate immobilized with the anti-Pumilio guinea pig polyclonal antibody prepared by the method of Reference Example 5.
  • 7.5 50 ⁇ l of the solution was added and shaken at room temperature for 2 hours. Next, the solution in the well was removed by suction, washed with 0.5% Triton X-100-containing TBS (pH 7.5), and the biotin-labeled anti-Pumilio mouse monoclonal antibody prepared by the method of Reference Example 6 was added at a concentration of approximately 0.1 ⁇ g / ml.
  • reaction reagent A 50 ⁇ l of reaction reagent A was added to each well and incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
  • 50 ⁇ l of reaction reagent B was added to the well, and the absorbance was measured for 30 minutes using a 405 nm filter with a microplate reader (MTP-500 manufactured by Corona) while heating at 37 ° C.
  • FIG. 17 shows a straight line having good concentration dependency obtained by plotting the amount of change in absorbance over 30 minutes against the standard substance concentration.
  • Reaction reagent 0.1 M phosphate buffer (pH 8.5) 1.2 mM thio-NAD 0.8 mM NADH 0.05 mM 3 ⁇ -Hydroxy-17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -Androstane ⁇ -D-Galactoside 20 U / ml 3 ⁇ -Hydoroxysteroid dehydrogenase
  • Measurement Method A 0.1% BSA-containing TBS (pH) containing purified Pumilio (standard substance) in the range of 0 to 10 ng / ml in a microplate on which the anti-Pumilio guinea pig polyclonal antibody prepared by the method of Reference Example 5 is immobilized. 7.5) 50 ⁇ l of the solution was added and shaken at room temperature for 2 hours. Next, the solution in the well was removed by suction, washed with 0.5% Triton X-100-containing TBS (pH 7.5), and the biotin-labeled anti-Pumilio mouse monoclonal antibody prepared by the method of Reference Example 6 was added at a concentration of approximately 0.1 ⁇ g / ml.
  • FIG. 18 shows a straight line having good concentration dependency obtained by plotting the amount of change in absorbance for 60 minutes against the standard substance concentration.
  • Reaction reagent A 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) 0.05 mM 3 ⁇ -Hydroxy-17 ⁇ -methoxy-5 ⁇ -Androstane ⁇ -D-Galactoside
  • Reaction reagent B 0.1 M pyrophosphate buffer (pH 9.0) 2.4 mM thio-NAD 2 mM NADH 40 U / ml 3 ⁇ -Hydoroxysteroid dehydrogenase
  • Measurement Method A 0.1% BSA-containing TBS (pH) containing purified Pumilio (standard substance) in the range of 0 to 10 ng / ml in a microplate on which the anti-Pumilio guinea pig polyclonal antibody prepared by the method of Reference Example 5 is immobilized. 7.5) 50 ⁇ l of the solution was added and shaken at room temperature for 2 hours. Next, the solution in the well was removed by suction, washed with 0.5% Triton X-100-containing TBS (pH 7.5), and the biotin-labeled anti-Pumilio mouse monoclonal antibody prepared by the method of Reference Example 6 was added at a concentration of approximately 0.3 ⁇ g / ml.
  • reaction reagent A 50 ⁇ l of reaction reagent A was added to each well and incubated at 37 ° C. for 60 minutes.
  • 50 ⁇ l of reaction reagent B was added to the wells, and the absorbance was measured for 30 minutes using a 405 nm filter with a microplate reader (Corona MTP-500) while heating at 37 ° C.
  • FIG. 19 shows a straight line having a good concentration dependency obtained by plotting the amount of change in absorbance for 30 minutes against the standard substance concentration.
  • Reaction reagent 0.1 M glycine buffer (pH 10.3) 1 mM MgCl 2 1 mM ZnCl 2 1 mg / ml p-NPP
  • Measurement Method A 0.1% BSA-containing TBS (pH) containing purified Pumilio (standard substance) in a range of 0 to 25 ng / ml on a microplate immobilized with the anti-Pumilio guinea pig polyclonal antibody prepared by the method of Reference Example 3. 7.5) 50 ⁇ l of the solution was added and shaken at room temperature for 1 hour. Next, after removing the solution in the well by suction, it was washed with TBS (pH 7.5) containing 0.05% Tween 20, and the ALP-labeled anti-Pumilio mouse monoclonal antibody prepared by the method of Reference Example 1 was contained at a concentration of 1 ⁇ g / ml.
  • FIG. 20 shows a straight line having a good concentration dependency obtained by plotting the amount of change in absorbance for 30 minutes against the concentration of the standard substance.
  • Reaction reagent 0.1 M phosphate buffer (pH 7.3) 0.2 mM 2-mercaptoethanol 1 mM MgCl 2 10 mM ONPG
  • FIG. 21 shows a straight line having a good concentration dependency obtained by plotting the amount of change in absorbance for 60 minutes against the standard substance concentration.
  • FIG. 22 shows a straight line having good concentration dependency obtained by plotting the amount of change in absorbance for 120 minutes against the concentration of the standard substance.
  • Example 15 Measurement of Pumilio by 1-step method using 3 ⁇ -tert-butyl-peroxy-5 ⁇ -Androsterone Reaction reagent 0.1M phosphate buffer (pH 7.0) 10 mM MgCl 2 6 mM thio-NAD 1mM NADH 0.1 mM 3 ⁇ -tert-butyl-peroxy-5 ⁇ -Androsterone 40U / ml 3 ⁇ -Hydroxysteroid dehydrogenase Sample 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5 ng / ml Pumilio
  • Measurement Method A 0.1% BSA-containing TBS (pH 7) containing purified Pumilio (standard substance) in a range of 0 to 2.5 ng / ml on a microplate on which an anti-Pumilio guinea pig polyclonal antibody prepared by the method of Reference Example 5 is immobilized. .5) 50 ⁇ l of the solution was added and shaken at room temperature for 2 hours. Next, after removing the solution in the well by suction, it was washed with TBS (pH 7.5) containing 0.5% Triton X-100, and 0.1% BSA containing HRP-labeled anti-Pumilio mouse monoclonal antibody at a concentration of approximately 0.1 ⁇ g / ml.
  • FIG. 23 shows a straight line having good concentration dependency obtained by plotting the amount of change in absorbance for 60 minutes against the standard substance concentration.
  • ⁇ Reference Example 9 Synthesis method of 3 ⁇ -benzoyl-peroxy-5 ⁇ -Androsterone and 3 ⁇ -acetyl-peroxy-5 ⁇ -Androsterone
  • tert-butyl-hydroperoxide was synthesized.
  • the title compound was obtained in the same manner except that benzoyl-hydroperoxide or acetyl-hydroperoxide was used.
  • the present invention can be suitably used in clinical inspection fields and food inspection fields where high sensitivity and simple measurement are required.

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Abstract

吸光光度計やプレートリーダー等の汎用測定機器や目視で測定可能な超高感度測定法を提供する。チオNAD(P)を補酵素とする酵素サイクリング法と標識酵素およびその基質の最適な組合わせにより、シグナル物質であるチオNAD(P)Hを幾何級数的に増幅し、そのチオNAD(P)Hを比色定量することにより、汎用測定機器や目視で測定可能な高感度測定法を提供することができる。

Description

タンパク質および核酸の超高感度測定法およびキット、並びに新規な酵素基質 関連出願の相互参照
　本出願は、２０１１年３月２３日出願の日本特願２０１１－６３５５９号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
　本発明は、酵素免疫測定法および核酸プローブ測定法を利用するタンパク質と核酸の高感度測定法およびキットに関する。特に本発明は、抗体または核酸プローブに標識する酵素に対して特定の酵素基質を用いることで、これらの酵素の活性測定に用いるチオNADサイクリング法における阻害を回避して、標的タンパク質および核酸の超高感度測定を可能にする方法に関する。さらに本発明は、上記タンパク質と核酸の高感度測定法およびキットに用いることができる新規な酵素基質も提供する。
　タンパク質や核酸の高感度測定法としてラジオイムノアッセイ（RIA）法が技術的に確立されているが、検出装置の感度を上げる以外に、現状では10-16mole程度以上の高感度化は技術的に不可能である。しかも、RIA法では測定の場がアイソトープ実験施設に限定されるだけではなく、短寿命の核種を使用すれば試薬の使用期限が極端に短くなる上に、測定感度も急激に低下する。さらに、放射能測定法に特有の放射性廃棄物の問題も抱えている。特に長寿命の核種を使用する場合の廃棄の問題は大きい。したがって、近年、タンパク質や核酸の高感度測定法の開発研究は「非放射性」をキーワードとして展開されてきた。それゆえ、RIA法に関する研究開発や技術的改良はほとんど行われていない現状である。
　RIA法に代わる高感度測定法として、タンパク質の測定には酵素免疫測定法(ELISA法)[図１]が、核酸の測定にはPCR法がある。酵素免疫測定法は開発当初の比色法(10-13mole)から蛍光法、発光法へと高感度化(10-15mole)が進められ、専用測定装置の開発・改良も進んでいる。しかし、測定操作が簡便になっただけで感度的には限界に達している。
　また、核酸の高感度測定法としてのPCR法では、ターゲット特異的なシグナル検出の問題、増幅効率の問題、PCR産物がプラトーに達する条件等を考え合わせると、核酸の定量は厳密には難しい。
　WO2008/117816（特許文献1）には、チオNADサイクリング法を利用する抗体酵素複合体を用いる酵素測定方法及び酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法が記載されている。
　特許文献1に記載の方法は、酵素免疫測定法を、酵素免疫測定法で用いる標識酵素の生成物を基質とする酵素サイクリング法を組み合わせ、シグナル物質としてチオNAD(P)Hを幾何級数的に増幅することで、比色法によって、高感度にタンパク質または核酸の定量や目視による検出が可能である。しかしながら、標識酵素と基質との反応性が必ずしも高くないことや、標識酵素に対する基質が酵素サイクリング法における酵素反応を部分的に阻害することが明らかになった。
　そこで本発明の目的は、酵素免疫測定法を酵素免疫測定法で用いる標識酵素の生成物を基質とする酵素サイクリング法を組み合わせた特許文献1に記載の方法において、上記標識酵素に対する基質の問題点を解決した、タンパク質または核酸の比色測定による高感度測定法検出方法が最も簡便な比色法を用い、感度を幾何級数的に高めた測定法を提供することである。具体的には感度を10-18moles 以上に高めた測定法を提供することである。
　そこで、本発明者らは、上記課題を解決した標識酵素に対する基質となり得る化合物を見出しまたは新たな化合物を提供し、さらにこれらの基質を用いることで、上記課題を解決できることを見いだして、本発明を完成させた。
　本発明は以下の通りである。
[1]
抗体酵素複合体を用いる酵素活性測定方法であって、抗体酵素複合体の酵素としてアルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼまたはペルオキシダーゼを用い、
上記酵素の基質として下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体を用い、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 (i)一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、アルカリホスファターゼの基質として用いる場合には、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基であり、
(ii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基であり、
(iii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ペルオキシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1～6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基であり、
前記酵素反応の生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法。
[2]
酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法であって、
酵素標識核酸プローブの酵素としてアルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼまたはペルオキシダーゼを用い、上記酵素の基質として下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体を用い、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 (i)一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、アルカリホスファターゼの基質として用いる場合には、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基であり、
(ii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基であり、
(iii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ペルオキシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1～6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基であり、
前記酵素反応の反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法。
[3]
前記酵素がアルカリホスファターゼであり、
一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である、[1]または[2]に記載の方法。
[4]
前記酵素がグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼであり、一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である、[1]または[2]に記載の方法。
[5]
前記酵素がペルオキシダーゼであり、一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1～6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である、[1]または[2]に記載の方法。
[6]
以下の(1)～(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したアルカリホスファターゼ
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 (式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である)、
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[7]
以下の(1)～(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼ
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 (式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である)、
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[8]
以下の(1)～(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したペルオキシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 (式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1～6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である)、
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[9]
以下の(1)～(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したアルカリホスファターゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 (式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である)
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[10]
以下の(1)～(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 (式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である)、
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[11]
以下の(1)～(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したペルオキシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 (式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1～6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である)、
(3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
[12]
下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 (式中、X、Y1およびY2の定義は、以下の(A)、(B)および(C)のいずれかである。
(A)Xはリン酸基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基または炭素数1～6のアルキル基である、
(B)Xはグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種の糖残基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である、
(C)Xは-O-CO-Rであり、R は炭素数1～6のアルキル基またはフェニル基であり、Y1及びY2が共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である。)
[13]
X、Y1およびY2の定義は、(A)Xはリン酸基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基または炭素数1～6のアルキル基である、[12]に記載のアンドロステロン誘導体。
[14]
X、Y1およびY2の定義は、 (B)Xはグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種の糖残基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である、[12]に記載のアンドロステロン誘導体。
[15]
X、Y1およびY2の定義は、(C)Xは-O-CO-Rであり、R は炭素数1～6のアルキル基またはフェニル基であり、Y1及びY2が共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である、[12]に記載のアンドロステロン誘導体。
　本発明によれば、測定感度を10-18moles 以上に高めた酵素免疫測定法を提供することができ、標的タンパク質や標的核酸の高感度測定が可能である。
酵素免疫測定法（ELISA法）の測定原理。 比較例1で得られたPumilio検量線。 比較例2で得られたPumilio検量線。 比較例3で得られたPumilio検量線。 比較例4で得られたPumilio検量線。 3α-ヒドロキシアンドロスタン類の例示。 実施例1で得られたAlkaline phosphatase検量線。 実施例2で得られたAlkaline phosphatase検量線。 実施例3で得られたPumilio検量線。 実施例4で得られたPumilio検量線。 実施例5で得られたβ-Galactosidase検量線。 実施例6で得られたβ-Galactosidase検量線。 実施例7で得られたβ-Galactosidase検量線。 実施例8で得られたβ-Galactosidase検量線。 実施例9で得られたβ-Galactosidase検量線。 実施例10で得られたPumilio検量線。 実施例11で得られたPumilio検量線。 実施例12で得られたPumilio検量線。 実施例13で得られたPumilio検量線。 参考例7で得られたPumilio検量線。 参考例8で得られたβ-Galactosidase検量線。 実施例14で得られたHorseradish peroxidase検量線。 実施例15で得られたPumilio検量線。
〔新規基質〕
　本発明は下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体に関する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 (式中、X、Y1およびY2の定義は、以下の(A)、(B)および(C)のいずれかである。
(A)Xはリン酸基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基または炭素数1～6のアルキル基である、
(B)Xはグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種の糖残基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である、
(C)Xは-O-CO-Rであり、R は炭素数1～6のアルキル基またはフェニル基であり、Y1及びY2が共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である。)
　Y2の例である炭素数1～6のアルコキシ基は、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基などであることができ、炭素数1～6のアルキル基は、例えば、メチル基、エチル基、iso-プロピル基、n-プロピル基、tert-ブチル基、n-ブチル基、n-ぺンチル基、n-ヘキシル基などであることができる。
　糖残基の糖は、グルコース、ガラクトース、フルクトースまたはマンノースであることができ、使用する標識酵素により適宜選択することができる。
　-O-CO-Rにおける-CO-は、-(C=O)-を意味し、Rにおける炭素数1～6のアルキル基は、例えば、メチル基、エチル基、iso-プロピル基、n-プロピル基、tert-ブチル基、n-ブチル基、n-ぺンチル基、n-ヘキシル基などであることができる。またRはフェニル基であってもよく、官能基を有していても良い。
　Y1及びY2が共同で酸素原子である場合は、Xは糖残基または-O-CO-Rであり、具体的には5α-アンドロステロンまたは5β-アンドロステロンの糖誘導体、例えば、グルコシド、ガラクトシド、フルクトシドまたはマンノシドである。尚、グルコシド、ガラクトシド、フルクトシド及びマンノシドは、正式にはそれぞれグルコピラノシド、ガラクトピラノシド、フルクトピラノシド及びマンノピラノシドと呼称される。
　上記本発明の化合物の具体例は、後述の表1に示す。但し、表1には、本発明の化合物の具体例以外に、本発明の方法およびキットで使用できる化合物も含まれている。
　上記本発明の化合物は、実施例に記載の方法に基づいてまたは実施例に記載の方法を参照して合成できる。
〔酵素サイクリング法〕
　本発明は、抗体酵素複合体を用いる酵素測定方法であって、
抗体酵素複合体の酵素による反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法に関する。
　上記抗体酵素複合体は、標的タンパク質抗原に特異的な抗体とこの抗体で標識した酵素とからなり、前記標的タンパク質の測定に用いられる。
　さらに本発明は、酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法であって、酵素標識核酸プローブの酵素による反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法に関する。
　上記酵素標識核酸プローブは、標的核酸に特異的に結合する核酸プローブとこの核酸プローブで標識した酵素とからなり、前記標的核酸の測定に用いられる。
　上記本発明の方法で用いられている抗体酵素複合体または酵素標識核酸プローブの酵素（標識酵素）は、アルカリホスファターゼ(ALP)、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼまたはペルオキシダーゼである。上記酵素の基質として下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体を用いる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 (i)一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、アルカリホスファターゼの基質として用いる場合には、式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である。(i)に含まれるアンドロステロン誘導体は、上記本発明の新規化合物を含むと共に、さらにY2が、水素である化合物も含む。Y2が、水素である化合物はTetrahedron, 1999, Vol.55, No.17, p.5465-5482に記載されている。この文献の全記載は、ここに特に開示として援用される。
 (ii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼの基質として用いる場合は、式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である。(ii)に含まれるアンドロステロン誘導体は、上記本発明の新規化合物を含むと共に、さらにY1及びY2は共同で酸素原子である化合物も含む。Y1及びY2は共同で酸素原子である化合物の内、Xがグルコースである化合物はCarbohydrate Research, 1971,  Vol.17, No.1，p.199-207に記載されている。この文献の全記載は、ここに特に開示として援用される。Y2が水酸基である、化合物の内、Xがグルコースである化合物はPhytochemistry，1974, Vol.13, No.10，p.2135-2142に記載されている。この文献の全記載は、ここに特に開示として援用される。
 (iii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ペルオキシダーゼの基質として用いる場合は、式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1～6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である。(iii)に含まれるアンドロステロン誘導体は、上記本発明の新規化合物である。
　本発明の超高感度測定法は、通常の酵素免疫測定法や核酸プローブ法と同様に実施することができる。例えば、被検体に特異的に結合する抗体や核酸プローブを表面に固着させた固相担体、例えば、マイクロプレートやプラスチックチューブ、磁気ビーズ等、通常の測定に用いられている固相担体を用いることができる。
　抗体および核酸プローブ－酵素複合体は、常法により調製できる。
　抗体酵素複合体を構成する抗体は、本発明の酵素免疫測定方法により測定されるべき被検体に特異的に結合する抗体から適宜選択することができる。例えば、本発明の酵素免疫測定方法は、タンパク質の分析に用いられるが、その場合、抗体酵素複合体の抗体は、被検体であるタンパク質に特異的に結合する抗体である。また、この場合、被検体であるタンパク質に特異的に結合する抗体を表面に固着させた基板を用いる。また、抗体酵素複合体を構成する抗体および基板に固着させる抗体は、抗体の断片であっても良い。本発明の酵素免疫測定方法における、被検体は、タンパク質に限定されず、通常の酵素免疫測定方
法が測定対象とするタンパク質以外のすべての物質であることができる。
　核酸プローブ酵素複合体も同様に測定対象となる核酸に相補的なプローブを適宜選択することができる。
　本発明の方法において、抗体酵素複合体の酵素または酵素標識核酸プローブの酵素による反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにデヒドロゲナーゼ(DH)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う。
　本発明の方法において、各成分の濃度は以下の範囲にすることができる。
　（１）抗体酵素複合体または酵素標識核酸プローブの濃度範囲
　0.01μg/ml ～ 1 mg/ml
　（２）標識酵素の基質の濃度範囲
　1μM ～ 500 mM
　（３）NADHおよび／またはNADPHの濃度範囲
　0.01 mM ～ 50 mM
　（４）チオNADおよび／またはチオNADPの濃度範囲
　0.01 mM ～ 100 mM
　（５）デヒドロゲナーゼ(DH)の濃度範囲
　0.01 u/ml ～ 5000 u/ml
　反応条件は、標識酵素およびデヒドロゲナーゼ(DH)の最適温度範囲を考慮して適宜決定できる。例えば、反応温度は、操作が簡便であることから、室温で実施することが好ましい。但し、標識酵素およびデヒドロゲナーゼ(DH)の最適温度範囲を考慮して室温より高い温度または低い温度で実施することもできる。
　反応時間は、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量の測定、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化の計測が可能な程度まで、チオNADHおよび／またはチオNADPHが蓄積するに十分な時間とすることができる。但し、測定または計測に必要なチオNADHおよび／またはチオNADPHの蓄積量は、測定または計測条件により変化するで、条件に応じて適宜決定できる。
　酵素サイクリング系の中でチオNAD(P)を利用するサイクリング系は比較的最近になって登場したユニークなサイクリング系である。この系ではNAD(P)/NAD(P)Hを補酵素として利用する脱水素酵素（Dehydrogenase;DH）を用い、NAD(P)/NAD(P)HとそのアナログであるチオNAD(P)/チオNAD(P)Hが共存する条件下でサイクリングを行い、脱水素酵素の基質をチオNAD(P)H（極大吸収波長：400 nm、モル吸光係数=11,900）として増幅定量する。チオNAD(P)サイクリング法の測定原理は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　NADHの極大吸収が340 nm（モル吸光係数=6,200）であるのに対し、チオNAD(P)Hは可視域に吸収を示すため（極大吸収波長：400 nm、モル吸光係数=11,900）、普及型の吸光光度計や比色測定用マイクロプレートリーダーを用いて測定できることをその長所としている。
　チオNAD(P)を利用するサイクリング系は、普及型の吸光光度計や比色測定用マイクロプレートリーダーを用いて測定できるという長所を利用して、NADHの吸収増加に基づく脱水素酵素活性測定やその基質の定量法などの従来法のいくつかがチオNADを用いる方法に改良されている。しかしながら、このサイクリング系を酵素免疫測定法等の検出系として高感度化に利用した報告は未だない。
　本発明では、標識酵素とサイクリング系を組み合わせることにより、初めて増幅反応を幾何級数的な反応とすることが可能となり、十分な高感度化を行うことが可能となった。
　本発明の測定法では、酵素免疫測定法の例で示したとおり、酵素複合体とそれに組み合わせた基質で産生された生成物を次の酵素サイクリング反応の基質として用い、酵素サイクリング反応により生成したチオNAD(P)Hの吸収を比色定量するものである。この反応では１種の脱水素酵素で酵素サイクリングを行うため、酵素サイクリング反応の基質としては、還元型基質でも酸化型基質でもよい。
　本発明で用いる上記酵素複合体として用いる標識酵素とその基質およびそれに続くサイクリング反応に用いる脱水素酵素は以下のような性質を持っている。
　（１）標識酵素の生成物がアンドロステロンまたはその誘導体
　（２）市販および汎用されている標識酵素が使用できる
　（３）酵素サイクリングのターンオーバー数が大きい
　（４）酵素サイクリング反応に使用する脱水素酵素に標識酵素のコンタミや標識酵素と同様の活性がない
　デヒドロゲナーゼ(DH)としては、例えば、3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを上げることができる。
　本発明に使用可能な代表的な標識酵素、基質及び酵素サイクリング用の脱水素酵素の組合わせの一例として以下のものがあげられるが、もちろんこの組み合わせに限られるわけではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
　例えば、上記記載の組合せの中でサイクリング酵素として3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いる場合、使用可能な基質の候補としては、アンドロステロン、11β-ヒドロキシアンドロステロン、11-オキソアンドロステロン、11α-ヒドロキシアンドロステロンが挙げられる。
　サイクリング用の基質としては、酵素の反応速度が速く(基質に対する活性が高い)、低濃度でも反応する(Km値が小さい)ものが好ましい。また、脱水素酵素として好ましい性質は、補酵素としてチオNAD(P)を用いた場合の反応速度である。多くの脱水素酵素では、補酵素としてチオNADを用いた場合の反応速度がNADを用いた場合の数％以内であるのに対し、3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによるアンドロステロンの脱水素反応では、チオNADでの反応速度がNADでの反応速度の約59％もあり、本発明のサイクリング酵素として、好ましい性質を有している。しかも組合わせる標識酵素として、汎用されているアルカリホスファターゼ（ALP）を用いることが可能であり、アルカリホスファターゼの基質となるアンドロステロン誘導体の3位リン酸エステルの合成が容易であることも好ましい組合わせである。
　また、同じように標識酵素として汎用されているグルコシダーゼとアンドロステロン誘導体のグルコシド、ガラクトシダーゼとアンドロステロン誘導体のガラクトシドも合成が容易で好ましい組み合わせである。
　また、同じように標識酵素として汎用されているペルオキシダーゼとアンドロステロン誘導体のペルオキシド、例えば、tert-ブチルペルオキシドも合成が容易で好ましい組み合わせである。
　アンドロステロン 3-β-Dガラクトシドを基質とした反応例を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　抗体酵素複合体の酵素としてアルカリホスファターゼ(ALP)を用いる酵素免疫測定方法を例にして、以下に説明する。アルカリホスファターゼ(ALP)は、標識酵素として広く用いられている酵素であり、このALPを用いる酵素免疫測定方法では、新規化合物のアンドロステロン誘導体をALPの基質とすると、生成物としてアンドロステロンが生成する。そして、ALPの反応生成物を基質とするデヒドロゲナーゼである、3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3α-HSD)を酵素サイクリング反応に使用する。
　チオNADサイクリングは適切な脱水素酵素反応を選択すれば1分当たり数百サイクルという効率で脱水素酵素基質を増幅定量することができる。したがって、このような基質を反応生成物として与える酵素の活性はチオNADサイクリングによって超高感度に測定できることになる。
[酵素サイクリング用キット]
　本発明は、反応性担体に標識化された酵素およびその基質とサイクリング反応用の酵素とその補酵素のチオNADとNADHを含む酵素サイクリング法用キットを包含する。
　反応性担体とは測定対象物と結合する活性を持った抗体・核酸プローブ・レクチン等を表す。
　反応性担体は測定対象物に適した物を用いればよく、標識酵素およびその基質も適した物を用いればよく特に限定はされない。
　より具体的には、本発明は、標識酵素及びその基質とサイクリング反応用の酵素とその補酵素のチオNADとNADHを含む酵素サイクリング法用キットを包含する。
　本発明のキットは、以下の(1)～(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キットである。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識した酵素であるアルカリホスファターゼ(ALP)またはグルコシダーゼまたはガラクトシダーゼまたはフルクトシダーゼまたはマンノシダーゼまたはペルオキシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体、
(3)デヒドロゲナーゼ(DH)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
　さらに本発明は、以下の(1)～(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キットである。
(1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識した酵素であるアルカリホスファターゼ(ALP)またはグルコシダーゼまたはガラクトシダーゼまたはフルクトシダーゼまたはマンノシダーゼまたはペルオキシダーゼ、
(2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体、
(3)デヒドロゲナーゼ(DH)、
(4)NADHおよび／またはNADPH、
(5)チオNADおよび／またはチオNADP
　標識酵素、デヒドロゲナーゼ(DH)および 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体については、上記本発明の方法で説明したものをそのまま利用できる。
　本発明のキットは、市販の酵素標識抗体等をこのキットの構成試薬と組合わせて使用することも可能である。このキットは、酵素サイクリング法を用いる酵素免疫測定方法に利用できる。
　以下、実施例に基づきこの発明を説明するが、斯界の技術水準においては、斯かる実施例は多種多様に改変可能である。斯かる技術水準に鑑み、この発明がこれら実施例のみに限定されるべきでないことは云うまでもない。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
　Alkaline phosphatase（ALP）とAndrosterone 3-phosphate（A3P）の系のチオNADサイクリングを検出系とする、Alkaline phosphataseとPumilio（プミリオ）の測定。
参考例1
ALP標識抗体の作製
　抗原に特異的反応性を有するマウス由来のモノクローナル抗体を0.1 Mクエン酸緩衝液（pH 3.5）で30分間の透析を3回行った。その抗体溶液に抗体量に対し0.5 %になるようにペプシンを添加し、37℃で1時間静置した後、1.5 Mトリス緩衝液（pH 8.8）で中性に調整した。この混合反応液をsuperdex 200を充填したカラム（Amersham Biosciences社）を用いてゲルろ過し、F(ab’)2を得た。
　このF(ab’)2を100 μg用いて、ALP-labeling kit（同仁化学社）によりALPを標識した。
参考例2
不溶性担体固定化抗体の調製1
　抗原に特異的反応性を有するモルモット由来のポリクローナル抗体を50 mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.6）に100μg/mlの濃度で溶解した溶液を、平底マイクロプレート（Nunc社）の各ウェルに50μlずつ添加し、室温で1時間静置した後抗体溶液を回収し、2%ウシ血清アルブミン（BSA）含有TBSを300μl添加して室温で2時間静置してブロッキング処理を行い、ポリクローナル抗体固定化マイクロプレートを得た。
参考例3
不溶性担体固定化抗体の調製2
　抗原に特異的反応性を有するモルモット由来のポリクローナル抗体を50 mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.6）に10μg/mlの濃度で溶解した溶液を、平底マイクロプレート（Nunc社）の各ウェルに50μlずつ添加し、室温で1時間静置した後ウェル内の溶液を吸引除去し、0.1 %ウシ血清アルブミン（BSA）含有TBSを300μl添加して室温で2時間静置してブロッキング処理を行い、0.05 % Tween 20含有TBSで洗浄し、ポリクローナル抗体固定化マイクロプレートを得た。
＜比較例1＞ 5α-Androsterone 3-phosphateを用いた1ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
　反応試液
　　　0.2 M グリシン緩衝液（pH 8.8）
　　　1.5 mM thio-NAD
　　　1 mM NADH
　　　0.5 mM 5α-Androsterone 3-phosphate
　　　20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
　測定試料
　　　0.1、0.5、1、2、5、10、50、100、200 ng/ml Pumilio
　測定方法
　参考例2の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0～200 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例1の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を2.5μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液を100μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図2に示す。
　ここで、酵素（Alkaline phosphatase）と基質（Androsterone 3-phosphate）の反応性が悪いこと、基質がサイクリング反応を阻害することが問題点として浮上したため、酵素反応とサイクリング反応を分ける2ステップ法を試した。また、サイクリング反応の酵素である3α-Hydroxysteroid dehydrogenase中にphosphatase活性があり、ブランクの原因となることがわかったため、2ステップ法のサイクリング反応時にはリン酸を含有する緩衝液を使用することにした。
＜比較例2＞ 5α-Androsterone 3-phosphateを用いた2ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
　反応試液A
　　　0.1 M トリス緩衝液（pH 8.3）
　　　1 mM MgCl2
　　　0.1 mM 5α-Androsterone 3-phosphate
　反応試液B
　　　0.2 M リン酸水素二ナトリウム含有0.2 M グリシン緩衝液（pH 9.6）
　　　3 mM thio-NAD
　　　1 mM NADH
　　　40 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
　測定試料
　　　0.5、0.75、1、2.5、5、7.5、10、12.5、20、50、75、100 ng/ml Pumilio
　測定方法
　参考例3の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0～100 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例1の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を2.5μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液Aを50μlずつ添加し、37℃で30分間インキュベートした。続いてそのウェルに反応試液Bを50μl添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図3に示す。
　2ステップ法を試したが、期待するほど感度が上がらないので、Alkaline phosphataseとの反応性を向上させるため、ここまで用いていた、5α-Androsterone 3-phosphateとは立体構造の異なる、5β-Androsterone 3-phosphateを使用することにした。
＜比較例3＞ 5β-Androsterone 3-phosphateを用いた1ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
　反応試液
　　　0.1 M トリス緩衝液（pH 8.6）
　　　0.5 mM MgCl2
　　　1.5 mM thio-NAD
　　　0.5 mM NADH
　　　0.5 mM 5β-Androsterone 3-phosphate
　　　20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
　試料
　　　0.1、0.5、1、2、5、8、10、20、50 ng/ml Pumilio
　測定方法
　参考例3の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0～50 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例1の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を2.5μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl加え、1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液を50μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図4に示す。
＜比較例4＞ 5β-Androsterone 3-phosphateを用いた2ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
　反応試液A
　　　0.1 M トリス緩衝液（pH 8.3）
　　　1 mM MgCl2
　　　0.1 mM 5β-Androsterone 3-phosphate
　反応試液B
　　　0.2 M リン酸水素二ナトリウム含有0.2 M グリシン緩衝液（pH 9.6）
　　　3 mM thio-NAD
　　　1 mM NADH
　　　40 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
　試料
　　　0.005、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2.5、5、10、25、50 ng/ml Pumilio
　測定方法
　参考例3の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0～50 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例1の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を2.5μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液Aを50μlずつ添加し、37℃で30分間インキュベートした。続いてそのウェルに反応試液Bを50μl添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して10分間吸光度を測定した。10分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図5に示す。
　ここまでで、Androsterone 3-phosphateがサイクリング反応の基質になっていることがわかり、また、この現象によるブランク上昇も問題点となった。その原因が17位のケトンにあることが判明したので、17位のケトンを除去もしくは置換した基質を使用することにした。合成した3α-ヒドロキシアンドロスタン類は図6に示す。また、これらを基質としたサイクリング反応の回転数を比較すると、表2のようになった。この中では5α-Androsteroneの回転数が最大で、それに近い基質は3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane、5α-Dihydrotestosteroneであったので、まずは前者のリン酸エステル、3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate合成してチオNADサイクリングへ応用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
＜実施例1＞ 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphateを用いた1ステップ法によるAlkaline phosphataseの測定
3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphateの合成方法
　オキシ塩化リン(0.26mL)の無水ピリジン溶液(4 mL)に、氷冷下で3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-androstane (200mg)の無水ピリジン溶液 (4mL)を滴下し、氷冷下でさらに1時間攪拌した。反応液を氷水に注ぎ、溶液を強アルカリ性 (pH 約11)とした後、エーテルで洗浄した。次いで、水層に濃塩酸を加えpHを約2に調整した後、エーテルで抽出した。エーテル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒を留去した。残渣をテトラヒドロフラン－ヘキサンで再結晶し無色結晶（210 mg）を得た。
1H-NMR (400 MHz, Methanol-d4 ) δ= 0.73 (s, 3H, 18-CH3), 0.95 (s, 3H, 19-CH3), 3.19 (1H, t, J=8.6 Hz, 17α-H), 3.32 (s, 3H, -OCH3), 4.18 (m, 1H, 3β-H)
ESI-HR-MS Calculated for C20H35O5P-H: m/z 385.2149 [M-H]－. Found m/z 385.2157
m.p. 187-188℃
　反応試液
　　　0.1 Mトリス緩衝液（pH 9.5）
　　　0.2 mM MgCl2
　　　0.6 mM thio-NAD
　　　4 mM NADH
　　　0.5 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
　　　20 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
　試料
　　　0.1、0.2、0.5、1、2 mU/ml Alkaline phosphatase（最終濃度　0.05、0.1、0.25、0.5、1 mU/ml）
　測定方法
　平底のマイクロプレートウェルに標準物質（Alkaline phosphatase）を0～2 mU/mlの範囲で含有するトリス緩衝溶液（pH 9.5）を50μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して60分間吸光度を測定した。60分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図7に示す。
　続いて2ステップ法の検討について、サイクリング反応の酵素である3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase中のphosphatase活性の阻害のため、サイクリング反応時にはリン酸を含有する緩衝液で反応を行うことはすでに述べたが、リン酸緩衝液よりも、よりこのphosphatase活性を阻害するものとして、ピロリン酸緩衝液を採用することにした。
＜実施例2＞ 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphateを用いた2ステップ法によるAlkaline phosphataseの測定
　反応試液A
　　　0.1 M トリス緩衝液（pH 9.5）
　　　0.2 mM MgCl2
　　　1 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
　反応試液B
　　　0.15 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.5）
　　　3 mM thio-NAD
　　　1 mM NADH
　　　40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
　試料
　　　1、5、10、15、20 μU/ml Alkaline phosphatase（最終濃度　0.5、2.5、5、7.5、10 μU/ml）
　測定方法
　平底のマイクロプレートウェルに標準物質（Alkaline phosphatase）を0～20μU/mlの範囲で含有するトリス緩衝溶液（pH 9.5）を25μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Aを25μlずつ添加して混合し、37℃のインキュベーターで1時間静置する。次に反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して20分間吸光度を測定した。20分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図8に示す。
参考例4 
Alkaline phosphatase（ALP）標識抗体の精製
　参考例1のように得たF(ab’)2を150μμg用いてALP-labeling-kit（同仁化学）によりALP標識抗体を作製した。このALP標識抗体液中にはALPとFabの様々な分子量の複合体が存在し、活性にバラつきがあるので、作製したALP標識抗体液を1 mM Mgl2、0.1 mM ZnCl2、0.01 % BSAを含有するトリス緩衝液（pH 7.0）を溶出液としてsuperdex 200を充填したカラム（Amersham Biosciences社）を用いてゲルろ過し、各フラクションの活性を比較した上で、S/N比の大きいALP標識抗体のみを回収した。
参考例5
不溶性担体固定化抗体の調製
　抗原に特異的反応性を有するモルモット由来のポリクローナル抗体を50 mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.6）に10μg/mlの濃度で溶解した溶液を、平底マイクロプレート（Nunc社）の各ウェルに50μlずつ添加し、室温で1時間静置した後ウェル内の溶液を吸引除去し、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄を行った。次に5 %ウシ血清アルブミン（BSA）含有TBSを200μl添加して4℃で2時間から一晩静置してブロッキング処理を行い、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、ポリクローナル抗体固定化マイクロプレートを得た。
＜実施例 3＞ 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphateを用いた1ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
　反応試液
　　　0.1 Mトリス緩衝液（pH 9.5）
　　　1.5 mM thio-NAD
　　　2.5 mM NADH
　　　0.1 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
　　　20 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
　試料
　　　0.1、0.5、2、5、10、25 ng/ml Pumilio
　測定方法
　参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0～25 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例4の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.8μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、4℃で2時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液を50μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して60分間吸光度を測定した。60分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図9に示す。
＜実施例4＞ 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane3-phosphateを用いた2ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
　反応試液A
　　　0.1 M トリス緩衝液（pH 9.5）
　　　0.1mM MgCl2
　　　0.2 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
　反応試液B
　　　0.15 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.5）
　　　3 mM thio-NAD
　　　1 mM NADH
　　　40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
　試料
　　　0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5 ng/ml Pumilio
　測定方法
　参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0～0.5 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例4の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.2μg/ml、ウサギF(ab’)2を1 mg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl加え、4℃で2時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液Aを50μlずつ添加し、37℃で30分間インキュベートした。続いてそのウェルに反応試液Bを50μl添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図10に示す。
　このように17位を修飾した基質を使用してもブランク反応は完全には除去できなかった。そこで、ELISAの標識酵素にβ-Galactosidaseを用い、その基質として、Androsterone β-D-Galactosideを合成し、検討を進めた。
　β-GalactosidaseとAndrosterone 3-β-D-Galactosideの系のチオNADサイクリングを検出とする、β-GalactosidaseとPumilio（プミリオ）の測定。
＜実施例5＞ 5β-Androsterone β-D-Galactosideを用いた2ステップ法によるβ-Galactosidaseの測定
5β-Androsterone 3-β-D-Galactoside(正式名：5β-Androsterone 3-β-D-galactopyranoside)の合成方法
　5β-Androsterone (290mg)のジクロロメタン溶液(15 mL)に、MS4A (1.25 g)、Phenyl 2,3,4,6-O-tetrabenzoyl-1-thio-β-D-garactopyranoside (1.03g)を加えて－20℃で15分間攪拌した。次いで、N-ヨードスクシンイミド (435mg), トリフルオロメタンスルホン酸 (15mg)を加え－20℃で2時間攪拌した後、室温にてさらに2時間反応した。反応液にトリエチルアミン250μLを添加し反応を停止し、反応液を飽和炭酸ナトリウムとチオ硫酸ナトリウムの3：1の混液、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下溶媒を留去した。残渣をメタノール(15 mL)に溶解し、28 % ナトリムメトキシド(500 μL)加え2時間攪拌した。反応液に酢酸を加えて中和した後、減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (24×240 mm, 10 % メタノール－クロロホルム)にて精製後、メタノールで再結晶し無色結晶(360mg)を得た。
1H-NMR (400 MHz, Methanol-d4 ) δ= 0.85 (s, 3H, 18-CH3), 0.97 (s, 3H, 19-CH3), 3.44-3.49 (bm, 3H, H-2’, H-3’, H-5’), 3.70 (d, 1H, H-6’a), 3.72 (d, 1H, H-6’b), 3.73 (m, 1H, 3β-H), 3.81 (d, 1H, H-4’), 4.33 (d, 1H, H-1’, J1’, 2’= 6.2 Hz)
ESI-HR-MS Calculated for C25H40O7-H: m/z 451.2701 [M-H]－. Found m/z 451.2711
m.p. 130-135℃
　反応試液A
　　　0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.3）
　　　0.2 mM MgCl2
　　　0.1 mM 5β-Androsterone β-D-Galactoside
　反応試液B
　　　0.1 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.0）
　　　1.2 mM thio-NAD
　　　3.6 mM NADH
　　　40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
　試料
　　　1、4、10、40、100、200 pg/ml β-Galactosidase（最終濃度　0.5、2、5、20、50、100 pg/ml）
　測定方法
　平底のマイクロプレートウェルに標準物質（β-Galactosidase）を0～200 pg/mlの範囲で含有するリン酸緩衝溶液（pH 7.3）を25μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Aを25μlずつ添加して混合し、37℃で60分間インキュベートした。次に反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図11に示す。
＜実施例6＞ 5β-Androsterone β-D-Galactosideを用いた1ステップ法によるβ-Galactosidaseの測定
　反応試液
　　　0.1 Mリン酸緩衝液（pH 7.7）
　　　10 mM MgCl2
　　　6 mM thio-NAD
　　　1 mM NADH
　　　0.1 mM 5β-Androsterone β-D-Galactoside
　　　40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
　試料
　　　5、10、25、50、100、250 pg/ml β-Galactosidase（最終濃度　2.5、5、12.5、25、50、125 pg/ml）
　測定方法
　平底のマイクロプレートウェルに標準物質（β-Galactosidase）を0～250 pg/mlの範囲で含有するリン酸緩衝溶液（pH 7.7）を50μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して120分間吸光度を測定した。120分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図12に示す。
＜実施例7＞ 5β-Androsterone β-D-Galactosideを用いた2ステップ法によるβ-Galactosidaseの測定
　反応試液A
　　　0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.5）
　　　10 mM MgCl2
　　　0.1 mM 5β-Androsterone β-D-Galactoside
　反応試液B
　　　0.1 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.0）
　　　4.8 mM thio-NAD
　　　0.4 mM NADH
　　　40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
　試料
　　　1、4、10、40、100、200 pg/ml β-Galactosidase（最終濃度　0.5、2、5、20、50、100 pg/ml）
　測定方法
　平底のマイクロプレートウェルに標準物質（β-Galactosidase）を0～200 pg/mlの範囲で含有するリン酸緩衝溶液（pH 7.5）を25μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Aを25μlずつ添加して混合し、37℃で60分間インキュベートした。次に反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図13に示す。
＜実施例8＞ 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane β-D-Galactosideを用いた1ステップ法によるβ-Galactosidaseの測定
3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane β-D-Galactoside(正式名：3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-β-D-galactopyranoside)の合成方法
　3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane (306mg)のジクロロメタン溶液(15 mL)に、MS4A (1.25 g)、Phenyl 2,3,4,6-O-tetrabenzoyl-1-thio-β-D-garactopyranoside (1.03g)を加えて－20℃で15分間攪拌した。次いで、N-ヨードスクシンイミド(435mg), トリフルオロメタンスルホン酸 (15mg)を加え－20℃で2時間攪拌した後、室温にてさらに2時間反応した。反応液にトリエチルアミン250μLを添加し反応を停止し、反応液を飽和炭酸ナトリウムとチオ硫酸ナトリウムの3：1の混液、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下溶媒を留去した。残渣をメタノール(15 mL)に溶解し、28 % ナトリムメトキシド(500 μL)加え2時間攪拌した。反応液に酢酸を加えて中和した後、減圧乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (24×240 mm, 10 % メタノール－クロロホルム)にて精製後、アセトン－ヘキサンで再結晶し無色結晶(383mg)を得た。
1H-NMR (400 MHz, Methanol-d4 ) δ= 0.73 (s, 3H, 18-CH3), 0.95 (s, 3H, 19-CH3),  3.26 (t, 1H, J=8.6 Hz, 17α-H), 3.32 (s, 3H, -OCH3), 3.45-3.51 (bm, 3H, H-2’, H-3’, H-5’), 3.71 (s, 1H, H-6’a), 3.73 (d, 1H, H-6’b), 3.74 (m, 1H, 3β-H), 3.81 (d, 1H, H-4’), 4.33 (d, 1H, H-1’, J 1’, 2’= 7.5 Hz)
ESI-HR-MS Calculated for C26H44O7-H: m/z 467.3014 [M-H]－. Found m/z 451.3026
m.p. 197-199℃
　反応試液
　　　0.1 Mリン酸緩衝液（pH 8.5）
　　　10 mM MgCl2
　　　6 mM thio-NAD
　　　1 mM NADH
　　　0.2 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane β-D-Galactoside
　　　20 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
　試料
　　　5、10、25、50、100、250 pg/ml β-Galactosidase（最終濃度　2.5、5、12.5、25、50、125 pg/ml）
　測定方法
　平底のマイクロプレートウェルに標準物質（β-Galactosidase）を0～250 pg/mlの範囲で含有するリン酸緩衝溶液（pH 8.5）を50μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して120分間吸光度を測定した。120分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図14に示す。
＜実施例9＞ 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane β-D-Galactosideを用いた2ステップ法によるβ-Galactosidaseの測定
　反応試液A
　　　0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.5）
　　　4 mM MgCl2
　　　0.1 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane β-D-Galactoside
　反応試液B
　　　0.1 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.8）
　　　1.2 mM thio-NAD
　　　1 mM NADH
　　　40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
　試料
　　　1、4、10、40、100、200 pg/ml β-Galactosidase（最終濃度　0.5、2、5、20、50、100 pg/ml）
　測定方法
　平底のマイクロプレートウェルに標準物質（β-Galactosidase）を0～200 pg/mlの範囲で含有するリン酸緩衝溶液（pH 7.5）を25μl添加し、続いてそのウェルに反応試液Aを25μlずつ添加して混合し、37℃で60分間インキュベートした。次に反応試液Bを50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図15に示す。
　Androsterone β-D-Galactosideを用いたPumilioの測定の実施例を以下に示す。但し、抗原に特異的反応性をもつ抗体に直接β-Galactosidaseを標識したものがないため、Labeled StreptAvidin-Biotin（LSAB）法を試している。
参考例6
ビオチン標識抗体の作製
　参考例1のように得たF(ab’)2を50μg用いてbiotin-labeling-kit（同仁化学）によりビオチン標識抗体を作製した。
＜実施例 10＞5β-Androsterone β-D-Galactosideを用いた1ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
　反応試液
　　　0.1 Mリン酸緩衝液（pH 7.7）
　　　5 mM MgCl2
　　　1.2 mM thio-NAD
　　　0.8 mM NADH
　　　0.05 mM 5β-Androstaneβ-D-Galactoside
　　　20 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
　試料
　　　0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5 ng/ml Pumilio
　測定方法
　参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0～2.5 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例6の方法で作製したビオチン標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.1μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、室温で1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、β-Galactosidase標識ストレプトアビジン（Roche社）を0.1 U conjugate/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl添加し、室温で30分間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液を50μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して60分間吸光度を測定した。60分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図16に示す。
＜実施例11＞ 5β-Androsterone β-D-Galactosideを用いた2ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
　反応試液A
　　　0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.5）
　　　0.1mM MgCl2
　　　0.05 mM 5β-Androsterone β-D-Galactoside
　反応試液B
　　　0.1 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.0）
　　　3 mM thio-NAD
　　　2 mM NADH
　　　40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
　試料
　　　0.05、0. 1、0.5、1、2.5、5 ng/ml Pumilio
　測定方法
　参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0～5 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例6の方法で作製したビオチン標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.1μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、室温で1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、β-Galactosidase標識ストレプトアビジン（Roche社）を0.1 U conjugate/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl添加し、室温で30分間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液Aを50 μlずつ添加し、37℃で30分間インキュベートした。続いてそのウェルに反応試液Bを50μl添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図17に示す。
＜実施例 12＞ 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane β-D-Galactosideを用いた1ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
　反応試液
　　　0.1 Mリン酸緩衝液（pH 8.5）
　　　1.2 mM thio-NAD
　　　0.8 mM NADH
　　　0.05 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstaneβ-D-Galactoside
　　　20 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
　試料
　　　0.1、0.5、1、2.5、5、10 ng/ml Pumilio
　測定方法
　参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0～10 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例6の方法で作製したビオチン標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.1μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、室温で1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、β-Galactosidase標識ストレプトアビジン（Roche社）を0.1 U conjugate/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl添加し、室温で30分間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液を50μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して60分間吸光度を測定した。60分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図18に示す。
＜実施例13＞ 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstaneβ-D-Galactosideを用いた2ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
　反応試液A
　　　0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.0）
　　　0.05 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstaneβ-D-Galactoside
　反応試液B
　　　0.1 M ピロリン酸緩衝液（pH 9.0）
　　　2.4 mM thio-NAD
　　　2 mM NADH
　　　40 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
　試料
　　　0.25、0.5、1、2.5、5、10 ng/ml Pumilio
　測定方法
　参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0～10 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例6の方法で作製したビオチン標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.3μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl加え、室温で1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、β-Galactosidase標識ストレプトアビジン（Roche社）を0.1 U conjugate/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で30分間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液Aを50μlずつ添加し、37℃で60分間インキュベートした。続いてそのウェルに反応試液Bを50 μl添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図19に示す。
＜参考例7＞ p-Nitrophenyl phosphate（p-NPP）を用いたPumilio（プミリオ）の測定
　反応試液
　　　0.1 M グリシン緩衝液（pH 10.3）
　　　1 mM MgCl2
　　　1 mM ZnCl2
　　　1 mg/ml p-NPP
　測定試料
　　　0、1、2.5、5、10、25 ng/ml Pumilio
　測定方法
　参考例3の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0～25 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、参考例1の方法で作製したALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を1μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、各ウェルに反応試液を100μl添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して30分間吸光度を測定した。30分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図20に示す。
＜参考例8＞ o-Nitrophenyl β-D-Galactopyranoside（ONPG）を用いたβ-Galactosidaseの測定
　反応試液
　　　0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.3）
　　　0.2 mM 2-mercaptoethanol
　　　1 mM MgCl2
　　　10 mM ONPG
　測定試料
　　　2、10、20、50 ng/ml β-Galactosidase（最終濃度　1、5、10、25 ng/ml）
　測定方法
　平底のマイクロプレートウェルに標準物質（β-Galactosidase）を0～25 ng/mlの範囲で含有するリン酸緩衝溶液（pH 7.3）を50μl添加し、続いてそのウェルに反応試液を50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で415 nmのフィルターを使用して60分間吸光度を測定した。60分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性のよい直線を図21に示す。
検出限界および定量限界の算出方法
　各測定結果の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットし、直線上に並ぶ濃度のみを抽出して近似曲線を作成する。次にブランク（標準物質を含まない；n≧3）の標準偏差を算出し、その3倍値および10倍値を近似曲線の傾きで割り、得られる数値をそれぞれ検出限界および定量限界とする。
　各実験結果より算出した検出限界および定量限界を表3、4、5にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
＜実施例14＞
3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsteroneを用いた1ステップ法によるHorseradish peroxidaseの測定
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsteroneの合成方法
　3α-chloro-5β-Androsterone（100mg）をジクロロメタン溶液（15mL）に溶解させ、反応試液を調製した。本溶液に対し、20%の水酸化ナトリウム水溶液（15mL）にtert-butyl-hydroperoxide（30mg）を溶解した溶液を加え、室温にて2時間撹拌させて反応させた。反応液から有機層を回収し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（24×240 mm，10%メタノール－クロロホルム）にて精製後、本化合物88mgを得た。本化合物の同定は、1H-NMR、ESI-HR-MS およびm.p.(融点)により行った。
反応試液
　0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）
　10mM MgCl2
　6mM thio-NAD
　1mM NADH
　0.1mM 3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsterone
　40U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
 
試料
　5、10、25、50、100、250 pg/ml Horseradish peroxidase（最終濃度 2.5、5、12.5、25、50、125pg/ml）
測定方法
　平底のマイクロプレートウェルに標準物質（Horseradish peroxidase）（以下HRPと称する。）を0～250pg/mlの範囲で含有するリン酸緩衝液（pH7.0）を50μl添加し、続いてそのウェルに反応試液を50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405nmのフィルターを使用して120分間吸光度を測定した。120分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性の良い直線を図22に示す。
 
＜実施例15＞
3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsteroneを用いた1ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定
反応試液
　0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）
　10mM MgCl2
　6mM thio-NAD
　1mM NADH
　0.1mM 3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsterone
　40U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
試料
　0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5 ng/ml Pumilio
測定方法
　参考例5の方法で調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0～2.5ng/mlの範囲で含有する、0.1%BSA含有TBS（pH7.5）溶液を50μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5% Triton X-100含有TBS（pH7.5）で洗浄し、HRP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.1μg/mlの濃度で含有する、0.1% BSA含有TBS（pH7.5）溶液を50μl加え、室温で1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5% Triton X-100含有TBS（pH7.5）で洗浄した。次に各ウェルに反応試液を50μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405nmのフィルターを使用して60分間吸光度を測定した。60分間の吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた、濃度依存性の良い直線を図23に示す。
<参考例9>
3α-benzoyl-peroxy-5β-Androsteroneおよび3α-acetyl-peroxy-5β- Androsteroneの合成方法
　実施例14に示した3α-tert-butyl-peroxy-5β-Androsterone の合成方法において、tert-butyl-hydroperoxideをbenzoyl-hydroperoxide またはacetyl-hydroperoxideに替えた以外は同様にして表題化合物を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　本発明は、高感度かつ簡便な測定が要求される臨床検査分野や食品検査分野において好適に利用可能である。

Claims (15)

  1. 抗体酵素複合体を用いる酵素活性測定方法であって、抗体酵素複合体の酵素としてアルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼまたはペルオキシダーゼを用い、
    上記酵素の基質として下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体を用い、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     (i)一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、アルカリホスファターゼの基質として用いる場合には、
    式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基であり、
    (ii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼの基質として用いる場合は、
    式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基であり、
    (iii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ペルオキシダーゼの基質として用いる場合は、
    式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1～6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基であり、
    前記酵素反応の生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法。
  2. 酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法であって、
    酵素標識核酸プローブの酵素としてアルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼまたはペルオキシダーゼを用い、上記酵素の基質として下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体を用い、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     (i)一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、アルカリホスファターゼの基質として用いる場合には、
    式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基であり、
    (ii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼの基質として用いる場合は、
    式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基であり、
    (iii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ペルオキシダーゼの基質として用いる場合は、
    式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1～6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基であり、
    前記酵素反応の反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う、前記方法。
  3. 前記酵素がアルカリホスファターゼであり、
    一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、
    式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である、請求項1または2に記載の方法。
  4. 前記酵素がグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼであり、一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、
    式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である、請求項1または2に記載の方法。
  5. 前記酵素がペルオキシダーゼであり、一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、
    式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1～6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である、請求項1または2に記載の方法。
  6. 以下の(1)～(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
    (1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したアルカリホスファターゼ
    (2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     (式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である)、
    (3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
    (4)NADHおよび／またはNADPH、
    (5)チオNADおよび／またはチオNADP
  7. 以下の(1)～(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
    (1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼ
    (2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     (式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である)、
    (3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
    (4)NADHおよび／またはNADPH、
    (5)チオNADおよび／またはチオNADP
  8. 以下の(1)～(5)の試薬を含む酵素免疫測定用キット。
    (1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したペルオキシダーゼ、
    (2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     (式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1～6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である)、
    (3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)
    (4)NADHおよび／またはNADPH、
    (5)チオNADおよび／またはチオNADP
  9. 以下の(1)～(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
    (1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したアルカリホスファターゼ、
    (2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     (式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である)
    (3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
    (4)NADHおよび／またはNADPH、
    (5)チオNADおよび／またはチオNADP
  10. 以下の(1)～(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
    (1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼ、
    (2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     (式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である)、
    (3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
    (4)NADHおよび／またはNADPH、
    (5)チオNADおよび／またはチオNADP
  11. 以下の(1)～(5)の試薬を含む核酸プローブ測定用キット。
    (1)標的核酸に特異的に結合する核酸プローブで標識したペルオキシダーゼ、
    (2)上記酵素の基質である一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     (式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1～6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である)、
    (3)ヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)、
    (4)NADHおよび／またはNADPH、
    (5)チオNADおよび／またはチオNADP
  12. 下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     (式中、X、Y1およびY2の定義は、以下の(A)、(B)および(C)のいずれかである。
    (A)Xはリン酸基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基または炭素数1～6のアルキル基である、
    (B)Xはグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種の糖残基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である、
    (C)Xは-O-CO-Rであり、R は炭素数1～6のアルキル基またはフェニル基であり、Y1及びY2が共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である。)
  13. X、Y1およびY2の定義は、(A)Xはリン酸基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基または炭素数1～6のアルキル基である、請求項12に記載のアンドロステロン誘導体。
  14. X、Y1およびY2の定義は、 (B)Xはグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種の糖残基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である、請求項12に記載のアンドロステロン誘導体。
  15. X、Y1およびY2の定義は、(C)Xは-O-CO-Rであり、R は炭素数1～6のアルキル基またはフェニル基であり、Y1及びY2が共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は水素、水酸基、炭素数1～6のアルコキシ基、または炭素数1～6のアルキル基である、請求項12に記載のアンドロステロン誘導体。
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