WO2012121430A1 - 카르복실기가 도입된 만난으로 코팅된 자기공명영상 조영제 및 그것의 제조 방법 - Google Patents

카르복실기가 도입된 만난으로 코팅된 자기공명영상 조영제 및 그것의 제조 방법 Download PDF

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contrast agent
carboxylic acid
mri contrast
coated
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전수연
권안성
강상현
정용연
박인규
조종수
김유경
김원종
남궁란
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주식회사 인트론바이오테크놀로지
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    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis

Definitions

  • the present invention relates to magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents, and particularly to tissues having antigen-presenting cells and antigen-presenting cells that are specifically introduced into antigen presenting cells.
  • the present invention relates to an MRI contrast agent that can be visualized through magnetic resonance imaging. More specifically, it relates to a superparamagnetic MRI contrast agent coated with a mannan introduced with a carboxyl group.
  • Magnetic resonance imaging which is a representative tomography imaging technique, is a non-invasive method of obtaining 3D images, and has been widely used for diagnosis of diseases because of its excellent contrast and spatial resolution.
  • MRI contrast agent detects the difference from changes in T1 and T2 relaxation time caused by strong external magnetic field and high frequency energy after in vivo injection and enhances contrast between normal and abnormal tissues.
  • Chemicals that allow imaging of the anatomical or functional area of MRIs are generally classified as paramagnetic and superparamagnetic (Eur. Radiol. 11: 2319, 2001).
  • Paramagnetic contrast agents are highly biotoxic, and because only mM levels of imaging are possible, there is a greater interest in superparamagnetic contrast agents capable of high sensitivity imaging at ⁇ M levels (Nano Lett. 6: 2427, 2006; Nat. Med. 13: 95, 2007).
  • Superparamagnetic contrast agents widely used in the clinic are prepared based on superparamagnetic nanoparticles represented by superparamagnetic iron oxide (SPIO), such as magnetite (Fe3O4) or maghemite (maghemite, Fe2O3). They are made into ferrofluid, a stable colloidal form of uniform particles with a size of several tens of nanometers or less, and introduced into the body.
  • SPIO superparamagnetic iron oxide
  • Fe3O4 magnetite
  • maghemite maghemite
  • Pure superparamagnetic iron oxide particles are 1 hydrophobic and have a high hydrophobic interaction between particles because of their large volume-to-surface ratio, which leads to agglomeration, forming clusters. Magnetic properties are easy to change, 3 exposed to the biological environment can cause rapid biodegradation, 4 pure iron oxide itself is toxic to harmful to the human body. Thus, surface modification of the particles is required to improve this problem and to improve the stability of the iron oxide solution comprising the superparamagnetic nanoparticles.
  • Coating of various polymers is used for surface modification, and those coated with dextran or dextran derivatives are commercially available.
  • Conventional coating polymers in addition to dextran-based polyacrylic acid (Polyacrylic acid (PAA), polyvinylpyrrolidone (Polyvinylpyrrolidone, PVP), polyvinyl alcohol (Polyvinylalcohol, PVA), polyethylene glycol (Polyethylene glycol, PEG), etc.
  • PAA polyacrylic acid
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • PVA polyvinyl alcohol
  • PVA polyvinylalcohol
  • Polyethylene glycol Polyethylene glycol
  • Polymers J. Mater. Chem. 12: 3654-3659, 2002; J. Colloid Interface Sci. 278: 353-360, 2004
  • natural polymers such as gelatin, chitosan, pullulan (J. Colloid Interface Sci. 283: 446-451, 2005; J. Magn. Magn. Mater. 293:
  • the clinical utility can be high if MRI can specifically enhance contrast of antigen-labeled cells or tissues with large amounts of antigen-labeled cells.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • a large amount of antigen-labeled cells are present at the site of infection such as cancer tissue or sepsis.
  • the presence of a large amount of antigen-labeled cells at a particular site indicates that abnormalities have occurred at that site. Therefore, the development of a diagnostic technique for diagnosing an ideal increase in such antigen-marking cells may be important in consideration of clinical utility.
  • an object of the present invention is to solve the problems of the prior art and the technical problem that has been requested from the past.
  • An object of the present invention is to provide an MRI contrast agent which is excellent in stability and safety in the body and has specific contrast enhancement performance of antigen-marking cells or tissues containing antigen-marking cells, and furthermore, a method of preparing the same.
  • Another object of the present invention is to provide an MRI contrast agent that can be used for diagnosis of cancer metastasis to lymph nodes.
  • Another object of the present invention is to provide an MRI contrast agent that can be used to diagnose sepsis.
  • the present inventors in order to overcome the disadvantages of the MRI contrast agent coated with the existing mannan, by introducing a carboxyl group to the mannan can be used as a coating material of the MRI contrast agent to lower the toxicity and increase the half-life in the body
  • a carboxyl group to the mannan can be used as a coating material of the MRI contrast agent to lower the toxicity and increase the half-life in the body
  • the present invention provides an MRI contrast agent which is a superparamagnetic nanoparticle coated with a carboxyl group introduced with a carboxyl group which has excellent stability and safety in the body and has specific contrast-enhancing performance of antigen-labeling cells or tissues containing antigen-marking cells, and preparation thereof.
  • an MRI contrast agent which is a superparamagnetic nanoparticle coated with a carboxyl group introduced with a carboxyl group which has excellent stability and safety in the body and has specific contrast-enhancing performance of antigen-labeling cells or tissues containing antigen-marking cells, and preparation thereof.
  • the magnetic material of the superparamagnetic nanoparticles is various, such as manganese oxide (MnO), manganese ferrite (MnFe2O4), iron-platinum alloy (Fe-Pt alloy), cobalt-platinum alloy (Co-Pt alloy) and cobalt (Co)
  • MnO manganese oxide
  • MnFe2O4 manganese ferrite
  • Fe-Pt alloy iron-platinum alloy
  • Co-Pt alloy cobalt-platinum alloy
  • Co cobalt
  • SPIO superparamagnetic iron oxide
  • magnetite magnetite
  • maghemite maghemite, Fe2O3
  • the antigen-labeling cells may be of various types such as dendritic cells, macrophages, and B-cells, but cells having a mannose receptor are preferred targets, particularly macrophages. desirable.
  • MRI contrast agent of the present invention may be utilized are cancer diagnosis, and diagnosis of cancer metastasis to lymph nodes is particularly preferred.
  • the MRI contrast agent of the present invention can be utilized in the diagnosis of inflammation, especially the diagnosis of sepsis is preferred.
  • the present invention also provides
  • Contrast-enhanced MRI contrast agent of a tissue containing a carboxyl group-introduced mannan or antigen-labeling cell comprising the step of coating the synthesized superparamagnetic nanoparticles with the prepared carboxylic acid-mannan It relates to a manufacturing method.
  • aldehyde-mannan refers to a mannan into which an aldehyde group is introduced
  • carboxylic acid-mannan refers to a mannan into which a carboxyl group is introduced
  • a feature of the present invention is to provide an MRI contrast agent coated with a mannyl introduced carboxyl group and the use of aldehyde-mannan as an intermediate in the preparation of the mannyl introduced carboxyl group.
  • a superparamagnetic MRI contrast agent coated with mannan introduced with a high degree of carboxyl group can provide excellent body stability and low biotoxicity and is specific for antigen-labeling cells. It can be introduced into the target can specifically visualize the tissue including antigen-labeled cells and antigen-labeled cells.
  • MRI contrast agents that can specifically visualize these antigen-labeling cells and tissues containing antigen-labeling cells and have excellent body stability can be used to effectively detect metastasis to early lymph nodes such as breast cancer, colon cancer, and gastric cancer. It can also be used for the early diagnosis of sepsis.
  • PET-CT Pulsitron Emission Tomography and Computed Tomography
  • Sepsis is currently diagnosed mainly through diagnostic tests such as ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), but it has a drawback in that it takes a long time. Since sepsis has a high mortality rate, early diagnosis is essential. When the present invention is used to diagnose sepsis, it can provide promptness and ease of diagnosis.
  • diagnostic tests such as ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
  • ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
  • 1 is a diagram showing the synthesis of aldehyde-mannan of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the synthesis of carboxylic acid-mannan of the present invention.
  • Mannan-CHO stands for aldehyde-mannan
  • Mannan-COOH stands for carboxylic acid-mannan
  • SPIONs iron oxide nanoparticles
  • Figure 7 shows the results of MR phantom imaging to investigate intracellular influx using peritoneal macrophages. Cells are present in the middle of the microcentrifuge tube.
  • the signal intensity ratio is the ratio of the relative signal strength of the lymph nodes to adjacent muscles.
  • Figure 11 shows the difference in the degree of influx of carboxylic acid-mannan coated SPIONs prepared according to the present invention between LPS treated cells and normal cells.
  • the present invention is to provide a superparamagnetic MRI contrast agent which is excellent in the stability of the body coated with a mannan introduced with a high degree of carboxyl group and significantly low toxicity.
  • the result was 351 mg of a white solid, carboxylic acid-mannan.
  • the carboxylic acid-mannan was introduced and about 13 mol% of the carboxyl group of mannose was introduced.
  • the whole process is shown in FIG. 2.
  • the introduction of the carboxyl group was analyzed using a conventional Fourier transform infrared spectrometer (Nicolet Magna 550 series II spectrometer, Midac, Atlanta, GA, USA) and the results are shown in FIG. 3. In the results of Figure 3 it can be seen that the characteristic peak (peak) according to the introduction of the carboxyl group.
  • the SPIONs were precipitated by reducing Fe2 + and Fe3 + ions with a basic solution (NH4OH). Specifically, 2 mol of iron (III) chloride (FeCl 3 ⁇ 6H 2 O) and 1 mol of iron (II) chloride (FeCl 2 ⁇ 4H 2 O) was added to 70 ml of distilled water to prepare a mixed aqueous solution. 7 ml of aqueous ammonia solution was added while vigorously stirring the mixed aqueous solution. At this time, a black precipitate was formed, which was washed several times with distilled water until the pH dropped from 10 to 7 while fixing the precipitate using a permanent magnet. In this way, only precipitates having reached pH 7 were collected.
  • a basic solution NH4OH
  • the SPIONs stock solution was diluted with distilled water to 6.25 mg / ml. The dilution thus prepared is stirred at 4 ° C. Meanwhile, 17.5 mg of carboxylic acid-mannan was dissolved in 200 ⁇ l of distilled water to prepare a carboxylic acid-mannan solution.
  • carboxylic acid-meet solution takes 800 ⁇ l from the dilution of the prepared SPIONs stock solution and slowly add dropwise the carboxylic acid-meet solution with stirring at 4 ° C.
  • the addition is complete, it is stirred at 4 ° C. overnight.
  • add a small amount of NH4OH to adjust the pH to 7.
  • NaCl is added to 0.9% to adjust the ionic strength.
  • the solution thus prepared was used as a solution of carboxylic acid-mannan coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (ie, MRI contrast medium).
  • Manganese-coated SPIONs, dextran-coated SPIONs, and polyvinyl alcohol (PVA) -coated SPIONs were also prepared, and all procedures were the same as the preparation of carboxylic acid-mannan-coated SPIONs.
  • an electrophoretic light scattering spectrophotometer (ELS 8000, Otsuka Electronics, Osaka, Japan) adjusted with a scattering angle of 90 degrees was used. Measured at 25 ° C.
  • the sample for analysis of the total light scatterometer was prepared by sonication after the carboxylic acid-mannan-coated SPIONs in distilled water. As can be seen from the analysis results of FIG. 5, it was found that evenly distributed particles were produced, and the average particle size was 34.1 nm.
  • Zeta potential (potential difference between shear boundary and bulk solution as an indicator of surface charge level of colloidal particles suspended in a liquid) of carboxylic acid-mannan-coated SPIONs was measured according to a conventional method. The result was -31.69 mV. Was measured. These zeta potential values confirm that the carboxylic acid-mannan-coated SPIONs remain stable on the usual colloidal basis.
  • the MRI contrast agent used In order to make MRI contrast targets of antigen-labeled cells or tissues containing a large amount of antigen-labeled cells, the MRI contrast agent used must be efficiently introduced into the antigen-labeled cells, and it is preferable that they are specific. To confirm this, the following experiments were conducted.
  • Peritoneal macrophage was selected as a model cell of antigen-labeled cells.
  • Peritoneal macrophages isolated from Balb / C mice were incubated for 3 hours in a medium containing SPIONs coated with carboxylic acid-mannan. After culture, normal Prussian blue staining was performed to observe the degree of inflow of SPIONs coated with carboxylic acid-mannan into the cells.
  • Prussian blue dyeing is a method in which iron ions react with a ferrocyan compound to produce an iron ferrocyan compound. The results are shown in FIG. It can be seen from the results of FIG.
  • Lymph node slices were stained with 10% potassium ferrocyanide and 20% HCl for 20 minutes, and the stained slices were observed under an optical microscope. Iron oxide particles appear as blue dots. The result is shown in FIG. 8.
  • SPIONs coated with carboxylic acid-mannan were well distributed in lymph nodes compared to other MRI contrast agents. From these results, SPIONs coated with carboxylic acid-mannan can be effectively introduced into antigen-labeled cells in tissues, and can be used as MRI contrast agents for tissues containing antigen-labeled cells.
  • the carboxylic acid-coated SPIONs were compared with the known MRI contrast agents Dextran-coated SPION and PVA-coated SPION on MRI scans for the diagnosis of cancer metastasis to lymph nodes. Lymph nodes were compared by MRI after administration of contrast medium to 1 mg of iron ion per experimental animal with lymph node cancer metastasis.
  • the magnetic resonance images of the SPIONs coated with carboxylic acid-mannan were darker with time than the magnetic resonance images of the control group.
  • the SPIONs coated with carboxylic acid-mannan can provide a contrast difference between tissues in a considerably fast time after administration, confirming that it is an effective MRI contrast agent for lymph node cancer metastasis.
  • the result of the signal intensity ratio of FIG. 10 shows the ratio of the relative signal intensity of the lymph nodes to adjacent muscles, whereby the SPIONs coated with carboxylic acid-mannan into the lymph nodes more effectively than the muscles and thereby the relative It can be seen that the signal strength ratio is excellent.
  • the carboxylic acid-mannan-coated SPIONs of the present invention can be used as an MRI contrast agent for the purpose of visualizing tissues having antigen-expressing cells, and as an MRI contrast agent for diagnosing cancer metastasis to lymph nodes. It can be confirmed that it can be effectively used. That is, the MRI contrast agent of the present invention was confirmed that can be used to effectively detect the metastasis to early lymph nodes, such as breast cancer, colon cancer, gastric cancer.
  • the MRI contrast agent of the present invention can also be used for the purpose of early diagnosis of sepsis.
  • Sepsis is a disease caused by bacterial infection. When infected, the infected site generates macrophages in response to the lipopolysaccharide (LPS) of the bacteria. If the macrophages generated in this way can be easily identified, the degree of sepsis can be conveniently confirmed.
  • LPS lipopolysaccharide
  • peritoneal macrophages were treated with LPS to produce cells in sepsis-like condition.
  • the LPS-treated peritoneal macrophages and no treated peritoneal macrophages were incubated for 3 hours in a medium containing SPOINs coated with carboxylic acid-mannan, respectively. After incubation, normal Prussian blue staining was performed on each cell to observe the degree of inflow of SPOINs coated with carboxylic acid-mannan into the cells.
  • FIG. 11 the influx of SPOINs coated with carboxylic acid-mannan was significantly increased in LPS-treated cells, which are septic cells, as compared to normal cells without any treatment. From this result, it can be confirmed that the MRI contrast agent of the present invention can also be used for the early diagnosis of sepsis.

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Abstract

본 발명은 카르복실기가 도입된 만난으로 코팅된 자기공명영상 조영제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 체내 안정성이 높으면서 항원표시세포에 특이적으로 도입될 수 있게 카르복실기가 도입된 만난으로 코팅된 초상자성 자기공명영상 조영제 및 그것의 제조법에 관한 것이다. 본 발명에서 제시하는 카르복실기가 도입된 만난으로 코팅된 자기공명영상 조영제는 높은 표면 음전하를 가져 높은 체내 안정성과 생체적합성을 제공할 수 있으며 만난의 만노우즈로 인하여 항원표시세포에 효과적으로 유입될 수 있어 항원표시세포 자체 및 항원표시세포를 포함하는 조직을 자기공명영상에서 특이적으로 가시화 할 수 있다.

Description

카르복실기가 도입된 만난으로 코팅된 자기공명영상 조영제 및 그것의 제조 방법
본 발명은 자기공명영상(magnetic resonance imaging; MRI) 조영제(contrast agent)에 관한 것으로, 특히 항원표시세포(antigen presenting cell)에 특이적으로 유입되어 항원표시세포 자체와 항원표시세포를 가진 조직을 특이적으로 자기공명영상을 통하여 가시화(visualization) 할 수 있는 MRI 조영제에 관한 것이다. 보다 상세하게는 카르복실기(carboxyl group)가 도입된 만난(mannan)으로 코팅(coating)된 초상자성(superparamagnetic) MRI 조영제에 관한 것이다.
대표적인 단층 촬영 영상 기술인 자기공명영상은 비침습적으로 3차원 영상을 얻을 수 있는 방법으로, 대조도(contrast)와 공간 해상도(spatial resolution)가 뛰어나 질병의 진단을 위해 널리 사용되고 있다.
MRI 조영제는 생체 내 주입(injection) 후 강력한 외부 자기장과 고주파 에너지에 의해 발생하는 T1, T2 완화시간(relaxation time)의 변화에서 오는 차이를 감지하여 정상 조직과 비정상 조직의 대조도를 증강시킴으로써 국소부위의 해부학적 혹은 기능적 영역에 대한 영상화를 가능케 하는 화학 물질로, 일반적으로 MRI 조영제는 상자성(paramagnetic) 조영제와 초상자성 조영제로 구분된다 (Eur. Radiol. 11: 2319, 2001).
상자성 조영제는 생체 독성이 심하며 mM 수준만의 영상이 가능하기 때문에 μM 수준의 고감도 영상이 가능한 초상자성 조영제에 대한 관심이 보다 높다 (Nano Lett. 6: 2427, 2006; Nat. Med. 13: 95, 2007).
임상에 널리 사용되는 초상자성 조영제는 마그네타이트(magnetite, Fe3O4) 또는 마그헤마이트(maghemite, Fe2O3)와 같은 산화철(superparamagnetic iron oxide, SPIO)로 대표되는 초상자성 나노입자(nanoparticle)를 기반으로 제조된다. 이들은 수십 나노미터 이하의 크기를 갖는 균일한 입자의 안정한 콜로이드 형태인 산화철 용액 (ferrofluid)으로 제조되어 체내로 투입된다.
순수한 초상자성 산화철 입자는, ① 소수성이면서 부피 대 표면적의 비가 크기 때문에 입자들 간에 소수성 인력(hydrophobic interaction)이 강하고 이로 인해 응집이 잘 일어나 클러스터(cluster)를 형성하고, ② 안정성이 낮아 본래 구조가 변해서 자기적인 특성이 변하기 쉽고, ③ 생체 환경에 노출되게 되면 빠르게 생분해가 일어날 수 있으며, ④ 순수한 산화철 자체만으로는 독성이 있어 인체에 유해하다. 따라서, 이러한 문제를 개선하고 상기 초상자성 나노입자를 포함하는 산화철 용액의 안정성을 개선시키기 위해서는 입자의 표면 개질이 요구된다.
표면 개질에는 다양한 고분자들의 코팅이 활용되고 있으며, 덱스트란(dextran)이나 덱스트란의 유도체로 표면코팅이 되어 있는 것들이 상용화 되어 있다. 종래 코팅하는 고분자로는 덱스트란 계통 외에도 폴리아크릴산(Polyacrylic acid, PAA), 폴리비닐피롤리돈(Polyvinylpyrrolidone, PVP), 폴리비닐알콜(Polyvinylalcohol, PVA), 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG) 등의 합성 고분자 (J. Mater. Chem. 12: 3654-3659, 2002; J. Colloid Interface Sci. 278: 353-360, 2004)나 젤라틴(Gelatin), 키토산(Chitosan), 플루란(Pullulan) 등의 천연 고분자 (J. Colloid Interface Sci. 283: 446-451, 2005; J. Magn. Magn. Mater. 293: 20-27, 2005)가 사용되기도 한다.
한편, 만난의 경우 흔히 사용되지는 않지만 표면개질(코팅)에 만난의 사용이 개시되어 있기도 하며 (미국등록특허 5,262,176 및 미국등록특허 5,462,053) 본 발명자들도 만난을 활용한 바가 있다 (한국등록특허 10-0949465). 미국등록특허 5,262,176에서 개시하고 있는 만난의 활용 목적은 통상의 고분자 코팅의 목적과 같이 산화철 콜로이드(colloid)의 체내 안정성의 제고이며, 미국등록특허 5,462,053에서의 목적도 통상의 고분자 코팅의 목적과 같이 조영제 용액(suspension)의 안정화를 제고하기 위해서이다. 한국등록특허 10-0949465에서는 고분자 코팅에서 기대할 수 있는 일반적인 효과에 더하여 만노우즈(mannose) 특이 수용체(receptor)에 의한 타겟팅의 목적도 갖고 있다. 그러나 이러한 만난의 사용은 만난에 의한 생체 독성의 위험성이 제기되기도 하며 생체 내 순환계(circulation system)에서의 소실(trap)이 문제가 되어 왔다. 따라서 보다 생체에 적합한 즉, 독성이 훨씬 낮고 생체내의 반감기가 긴 형태의 만난의 개발 및 이를 코팅한 MRI 조영제의 개발은 중요하다 할 수 있다.
다른 측면에서, MRI로 항원표시세포 또는 항원표시세포를 다량 가지는 조직을 특이적으로 조영증강 할 수 있다면 그 임상적 활용도는 높을 수 있다. 통상 암조직이나 패혈증(sepsis) 등 감염 부위에서는 항원표시세포가 다량 존재하게 된다. 특정 부위에서 항원표시세포의 다량 존재는 해당 부분에서 이상 증상이 발생했음을 나타내는 것이다. 따라서 이러한 항원표시세포의 이상적 증가를 진단할 수 있는 진단 기술의 개발은 임상적 활용성을 고려할 때 중요하다 할 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
따라서 본 발명은 이러한 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 체내 안정성 및 안전성이 우수하고 항원표시세포 또는 항원표시세포가 포함된 조직의 특이적 조영증강 성능을 갖는 MRI 조영제를 제공하고, 이에 더하여 그것의 제조방법을 제공하는 것이다.
또 다른 본 발명의 목적은 림프절로의 암전이 진단에 활용할 수 있는 MRI 조영제를 제공하는 것이다.
또 다른 본 발명의 목적은 패혈증 진단에 활용할 수 있는 MRI 조영제를 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 기존 만난으로 코팅된 MRI 조영제의 단점을 극복하기 위하여, 만난에 카르복실기를 도입하여 이를 MRI 조영제의 코팅 물질로 사용하면 독성도 낮출 수 있고 체내 반감기도 증가시킬 수 있을 것으로 예상하고 충분한 정도로 카르복실기를 만난에 도입할 수 있는 기술을 개발하고 이렇게 제조된 카르복실기가 도입된 만난으로 코팅된 MRI 조영제가 만난으로 코팅된 MRI 조영제에 비하여 그 사용이 안전함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 체내 안정성 및 안전성이 우수하고 항원표시세포 또는 항원표시세포가 포함된 조직의 특이적 조영증강 성능을 갖는 카르복실기가 도입된 만난으로 코팅된 초상자성 나노입자인 MRI 조영제 및 그것의 제조방법을 제공한다.
상기 초상자성 나노입자의 자성물질은 망간 산화물(MnO), 망간 페라이트(MnFe2O4), 철-백금 합금(Fe-Pt alloy), 코발트-백금 합금(Co-Pt alloy) 및 코발트(Co) 등 다양하게 선택되어 질 수 있으나, 마그네타이트(magnetite, Fe3O4) 또는 마그헤마이트(maghemite, Fe2O3)와 같은 산화철(superparamagnetic iron oxide, SPIO)이 가장 바람직하다.
상기 항원표시세포로는 수지상 세포(dendritic cell), 대식세포(macrophage), B-세포(B-cell) 등 다양한 종류가 될 수 있으나, 만노우즈 수용체를 가진 세포가 바람직한 대상이며, 특히 대식세포가 바람직하다.
본 발명의 MRI 조영제가 활용될 수 있는 대표적 예로는 암진단이며, 특히 림프절로의 암전이 진단이 바람직하다. 또한 본 발명의 MRI 조영제는 염증 관련 진단에도 활용될 수 있으며, 특히 패혈증의 진단이 바람직하다.
본 발명은 또한,
A) 초상자성 나노입자를 합성하는 단계;
B) 만난에 알데히드기를 도입하여 알데히드-만난을 합성하는 단계;
C) 상기 알데히드-만난을 이용하여 이를 산화시킴으로 카르복실기가 도입된 카르복실산-만난을 제조하는 단계; 및
D) 상기 제조된 카르복실산-만난으로 상기 합성된 초상자성 나노입자를 코팅하는 단계를 포함하는 카르복실기가 도입된 만난으로 코팅된 항원표시세포 또는 항원표시세포가 포함된 조직의 조영증강 MRI 조영제의 제조방법에 관한 것이다.
상기에서 알데히드-만난은 알데히드기가 도입된 만난을 지칭하고, 카르복실산-만난은 카르복실기가 도입된 만난을 지칭한다.
본 발명자들은 만난에 카르복실기를 도입하기 위하여 다양한 방법을 적용해 보았으나 다른 방법으로는 충분한 정도의 카르복실기의 도입이 어려웠고, 본 발명에서 개시한 알데히드-만난을 거치는 방법을 통하여 충분한 정도의 카르복실기의 도입이 가능하였다 (전체 만노우즈의 10 mol %가 카르복실화가 됨). 따라서 본 발명의 특징은 카르복실기가 도입된 만난으로 코팅된 MRI 조영제를 제공하는 점과 상기 카르복실기가 도입된 만난의 제조에 있어 알데히드-만난을 중간체로 사용한 점이다.
높은 정도로의 카르복실기(carboxyl group)가 도입된 만난(mannan)으로 코팅(coating)된 초상자성(superparamagnetic) MRI 조영제는 우수한 체내 안정성(stability) 및 낮은 생체 독성을 제공 할 수 있으며, 항원표시세포에 특이적으로 유입될 수 있어 항원표시세포 및 항원표시세포를 포함한 조직을 특이적으로 가시화 시킬 수 있다. 이러한 항원표시세포 및 항원표시세포를 포함한 조직을 특이적으로 가시화 시킬 수 있고 체내 안정성이 우수한 MRI 조영제는 유방암, 대장암, 위암 등의 초기 림프절로의 전이(metastasis)를 효과적으로 탐지하는 데에 사용될 수 있고, 또한 패혈증을 조기진단 하는 목적으로도 활용될 수 있다.
암의 림프절 전이 여부를 정확하게 진단하는 것은 암치료와 환자 예후를 결정하는데 있어 매우 중요하며 패혈증의 조기진단은 설명할 필요가 없이 중요하다 할 것이다. 림프절로의 암의 전이를 탐지하기 위해서는 현재 PET-CT(Positron Emission Tomography and Computed Tomography)를 많이 사용하고 있는데, MRI는 PET-CT에 비해서 방사능 피폭에 대한 위험이 없고 공간분해능이 우수하여 초기 미세전이를 판정하는 데에 있어 용이한 장점이 있다.
패혈증은 현재 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 같은 진단검사법을 통해서 주로 진단이 이루어지지만 진단시간이 많이 소요되는 단점이 있다. 패혈증은 사망률이 상당히 높기 때문에 조기 진단이 필수적이다. 본 발명을 패혈증 진단에 활용할 경우 진단의 신속성과 용이성을 제공해 줄 수 있다.
도 1은 본 발명의 알데히드-만난의 합성을 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 카르복실산-만난의 합성을 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 알데히드-만난 및 카르복실산-만난의 퓨리에 변환 적외선 분광기 분석 결과이다. 그림에서 “Mannan-CHO"는 알데히드-만난을 나타내고, “Mannan-COOH"는 카르복실산-만난을 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 산화철 나노입자(SPIONs)의 제조방법을 나타낸 순서도이다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 카르복실산-만난이 코팅된 SPIONs의 토탈 광산란 측정기 분석 결과이다.
도 6은 복막 대식세포를 이용한 세포내 유입을 조사한 프루시안 블루 염색 결과이다. 사진에서 푸른색 부분과 갈색 부분이 철이 도입된 부분을 나타내고 붉은 부분은 핵(nucleus)를 나타낸다. 1000배 확대 사진이다.
도 7은 복막 대식세포를 이용한 세포내 유입을 조사한 MR phantom imaging 결과이다. Microcentrifuge tube 중간 부분에 세포들이 존재하고 있다.
도 8은 림프절을 이용한 프루시안 블루 염색 결과이다. 사진에서 푸른색 부분이 철이 도입된 부분을 나타낸다.
도 9는 자기공명영상 비교 결과로 실제 촬영 사진이다.
도 10은 자기공명영상 비교 결과로 신호 강도 비이다. 신호 강도 비는 인접한 근육에 대한 림프절의 상대적 신호 강도의 비이다.
도 11은 LPS 처리한 세포 및 정상 세포 간에서 본 발명에 따라 제조된 카르복실산-만난이 코팅된 SPIONs의 유입 정도의 차이를 보여 주는 결과이다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 높은 정도로의 카르복실기가 도입된 만난으로 코팅된 체내 안정성이 우수하고 독성이 크게 낮아진 초상자성 MRI 조영제를 제공하는 것이다.
이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 카르복실산-만난의 제조
실시예 1-1: 알데히드-만난의 합성
400 mg의 만난을 16 ml의 증류수에 녹였다. 여기에 0.1 M NaIO4 수용액 9 ml (만노우즈에 대해 0.4 당량)을 천천히 첨가하고 4℃ 조건에서 빛을 차단한 채로 한 시간 동안 반응을 시켰다. 반응을 종결시키기 위해 글리세롤 (만노우즈에 대해 0.8 당량)을 첨가하고 30분 동안 저었다. 생성물을 투석막 (MWCO 1,000)에 옮겨서 증류수에 대하여 4℃ 조건에서 하루 동안 투석한 후 동결건조 해서 393 mg의 흰색 고체인 알데히드-만난을 얻었다. 전체 과정이 도 1에 제시되어 있다.
실시예 1-2: 카르복실산-만난의 합성
370 mg의 알데히드-만난을 20 ml의 증류수에 녹였다. 이 용액을 얼음이 채워진 수조에 담고 여기에 과산화수소(H2O2; 만노우즈에 대해 1.2 당량)를 첨가해 주었다. 여기에 3 ml의 0.5 M NaClO2 (만노우즈에 대해 1.2 당량)를 천천히 첨가하고 pH를 5로 맞추었다. 이후 얼음 수조를 제거하고 계속 저어주면서 NaOH를 이용하여 반응물의 pH를 5로 유지시켰다. pH가 더 이상 변하지 않을 때 생성물의 pH를 9로 맞춘 후 투석막 (MWCO 1,000)을 이용하여 증류수에 대해 4℃ 조건에서 하루 동안 투석하여 정제한 후 동결건조 시켰다. 그 결과 351 mg의 흰색 고체인 카르복실산-만난을 얻었다. 생성된 카르복실산-만난을 대상으로 1 M HCl을 이용하여 도입된 카르복실기의 양을 정량한 결과 만노우즈의 약 13 mol %의 카르복실기가 도입됨을 확인할 수 있었다. 전체 과정이 도 2에 제시되어 있다. 카르복실기의 도입은 통상의 방법인 퓨리에 변환 적외선 분광기(Fourier transform infrared spectrometer; Nicolet Magna 550 series II spectrometer, Midac, Atlanta, GA, USA)를 이용하여 분석되었는데 그 결과는 도 3과 같다. 도 3의 결과에서 카르복실기의 도입에 따른 특징적 피크 (peak)가 나타남을 확인할 수 있다.
실시예 2: 초상자성 산화철 나노입자의 제조
먼저 초상자성 산화철 나노입자(Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles; SPIONs)를 제조하기 위하여, 염기성 용액(NH4OH)으로 Fe2+와 Fe3+ 이온을 환원시켜 SPIONs를 침전시켰다. 구체적으로, 염화철(III)(FeCl3?6H2O) 2 mol과 염화철(II)(FeCl2?4H2O) 1 mol을 증류수 70 ml에 첨가하여 혼합 수용액을 제조하였다. 상기 혼합 수용액을 격렬히 교반시키면서 암모니아 수용액 7 ml을 첨가하였다. 이 때 검은 침전물이 형성되는데, 상기 침전물을 영구자석을 이용하여 고정시키면서 pH가 10에서 7로 떨어질 때까지 증류수로 여러 번 세척하였다. 이렇게 하여 pH 7이 된 침전물만을 수거하였다.
상기 침전물에 2 M의 질산(HNO3)용액 20 ml와 0.35 M의 질산 제2철(Fe(NO3)3?9H2O) 수용액 30 ml을 가하여 1시간 동안 환류(reflux)하여 산화시켰다. 산화로 인하여 형성된 갈색 현탁액을 2일 동안 0.01 M의 질산에 대하여 투석하여 SPIONs 저장 용액(stock solution)을 제조하였으며 이를 4℃에 보관하였다 (도 4 참조).
실시예 3: 카르복실산-만난으로 코팅된 초상자성 산화철 나노입자의 제조
상기 SPIONs 저장 용액을 6.25 mg/ml이 되게 증류수로 희석하였다. 이렇게 준비된 희석액은 4℃에서 저어준다. 한편, 이 동안 17.5 mg의 카르복실산-만난을 200 ㎕의 증류수에 녹여 카르복실산-만난 용액을 준비한다. 카르복실산-만난 용액의 준비가 완료되면 앞에 준비된 SPIONs 저장 용액의 희석액으로부터 800 ㎕를 취하여 여기에 카르복실산-만난 용액을 4℃에서 저어 주면서 천천히 한 방울씩 첨가한다. 첨가가 완료되면 이를 4℃에서 한밤 동안 교반하여 준다. 최종적으로 NH4OH를 소량 넣어 pH를 7로 맞추어 준다. 마지막으로 NaCl을 0.9%가 되게 첨가하여 이온 강도를 맞추어 준다. 이렇게 제조된 용액을 카르복실산-만난이 코팅된 초상자성 산화철 나노입자 (즉, MRI 조영제) 용액으로 사용하였다.
대조물질로 만난이 코팅된 SPIONs, 덱스트란이 코팅된 SPIONs 및 PVA(polyvinyl alcohol)가 코팅된 SPIONs도 제조하였는데, 모든 과정은 카르복실산-만난이 코팅된 SPIONs 제조 과정과 동일하였다.
실시예 4: 카르복실산-만난이 코팅된 SPIONs의 특성분석
실시예 4-1: 카르복실산-만난이 코팅된 SPIONs의 크기 분포도 측정
본 발명에 따라 제조된 카르복실산-만난이 코팅된 SPIONs의 크기와 분포를 측정하기 위해, 산란각 90도로 조절된 토탈 광산란 측정기(electrophoretic light scattering spectrophotometer, ELS 8000, Otsuka Electronics, Osaka, Japan)를 이용하여 25 ℃에서 측정하였다. 상기 토탈 광산란 측정기 분석을 위한 시료는 카르복실산-만난이 코팅된 SPIONs을 증류수에 넣은 후 초음파 처리를 하여 준비하였다. 도 5의 분석결과에서 알 수 있듯이 고른 분포의 입자가 생성되었음을 알 수 있었으며 평균 입자 크기는 34.1 nm였다.
실시예 4-2: Zeta potential 측정
카르복실산-만난이 코팅된 SPIONs의 Zeta potential(액체 속에 부유하는 콜로이드 입자들의 표면 대전량 정도를 나타내는 지표로서 shear boundary와 bulk solution과의 전위차)을 통상의 방법에 따라 측정하였으며 그 결과 -31.69 mV로 측정되었다. 이 zeta potential 수치로 카르복실산-만난이 코팅된 SPIONs이 통상적 콜로이드 기준에서 안정한 상태를 유지함을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 대조 물질들과의 비교
실시예 5-1: 만난이 코팅된 SPIONs와의 독성학적 비교
카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs과 만난으로 코팅된 SPIONs의 독성학적 비교를 실시하였다. 통상의 단회 정맥투여 시험을 통하여 비교하였다. 시험은 화학연구원 부설 안전성평가연구소에서 실시하였다. 구체적으로, 7주령 ICR 마우스(군당 암수 각 5마리 사용)에게 카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs과 만난으로 코팅된 SPIONs을 20, 40 및 80 mg Fe/kg 용량으로 단회 정맥 투여한 후 15일간 일반 증상 관찰, 사망동물의 관찰 및 체중 측정을 실시하였고, 15일째 부검을 실시하여 내부 장기의 이상 유무 등을 관찰하였다.
만난으로 코팅된 SPIONs을 투여한 경우, 20 mg Fe/kg 이상 용량에서 사망동물의 발생이 일부 발견되었고 활동성 저하, 불규칙 호흡, 복와위 및 하복부 오염의 일반 증상이 관찰되었다. 이를 근거로 만난으로 코팅된 SPIONs의 암수 마우스에서의 반수치사량은 대략 두 경우 모두 44 mg Fe/kg로 산출되었다. 한편, 카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs을 투여한 경우, 암수 모든 시험군에서 시험물질 투여와 관련된 사망이 관찰되지 않았으며 육안적인 부검소견도 특이사항이 없었다. 따라서 카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs의 마우스에서의 반수 치사량은 80 mg Fe/kg을 상회하는 것으로 나타났다.
이상의 결과로 카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs이 만난으로 코팅된 SPIONs에 비하여 훨씬 안전한 MRI 조영제임을 확인할 수 있었다.
실시예 5-2: 항원표시세포 내로의 유입 측정
항원표시세포 또는 항원표시세포가 다량 포함된 조직을 MRI 조영의 대상으로 하기 위해서는 사용한 MRI 조영제가 항원표시세포에 효과적으로 유입되어야 하고 또한 그것이 특이적이면 바람직하다. 이를 확인하기 위하여 다음의 실험들을 실시하였다.
먼저 카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs의 항원표시세포 내로의 유입 효율을 조사해 보았다. 항원표시세포의 모델 세포로는 복막 대식세포 (peritoneal macrophage)를 선정하였다. Balb/C mice로부터 분리한 복막 대식세포를 카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs이 첨가된 배지 상태에서 3시간 배양하였다. 배양 후 통상의 프루시안 블루 염색(Prussian blue staining)을 실시하여 카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs의 세포 내로의 유입 정도를 관찰하였다. 프루시안 블루 염색법은 철 이온이 페로시안 화합물과 반응하여 철 페로시안 화합물을 생성하는 원리를 응용한 염색법으로 이 염색법으로 철 이온의 분포를 확인할 수 있다. 그 결과가 도 6에 제시되어 있다. 도 6의 결과로부터 세포 내로 카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs이 효과적으로 유입되어 있음을 확인할 수 있으며 이 결과로부터 카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs이 항원표시세포 또는 항원표시세포가 다량 포함된 조직을 대상으로 활용될 수 있음을 알 수 있었다. 이러한 세포 내로의 유입은 내포작용(endocytosis)로 설명될 수 있다.
추가 실험으로 타 MRI 조영제들과 항원표시세포 내로의 유입 효율 측면에서 비교해 보았다. 이 실험에서는 앞서의 실험에서 독성이 확인된 만난이 코팅된 SPIONs은 배제하였다. 비교 대상 타 MRI 조영제로는 Dextran-coated SPION 및 PVA-coated SPION을 선정하였다. 이 실험에서도 항원표시세포의 모델 세포로는 복막 대식세포를 선정하였다. Balb/C mice로부터 분리한 복막 대식세포를 카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs, Dextran-coated SPION 및 PVA-coated SPION이 각각 첨가된 배지 상태에서 3시간 및 24 시간 배양하였다. 배양 후 2× 105 세포를 5% 젤라틴(gelatin)에 고정시킨 후 이를 microcentrifuge tube에 넣은 다음 원심분리를 실시하였다. 원심분리 후 MR phantom imaging을 통하여 세포 내로의 유입 정도를 분석하였다. 그 결과가 도 7에 제시되어 있다. 도 7의 결과에서 SPIONs이 유입되면 될수록 검게 나타나는데 카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs의 경우가 훨씬 빨리 세포 내로 유입됨을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터 카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs이 타 MRI 조영제들에 비하여 항원표시세포 또는 항원표시세포가 다량 포함된 조직을 대상으로 MRI 조영제로서 보다 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 5-3: 조직 내의 항원표시세포 내로의 유입 측정
카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs가 항원표시세포를 포함한 조직을 타겟으로 한 MRI 조영제로서 활용 가능성을 조사하기 위하여 실제 조직 내의 항원표시세포 내로의 유입 효율을 타 MRI 조영제들과 비교 조사하였다. 항원표시세포의 모델 세포로는 대식세포를 선정하였고 모델 조직으로 대식세포가 많은 림프절 조직을 선정하였다. 각 MRI 조영제를 주입 후 프루시안 블루 염색으로 유입 정도를 측정하였다. 구체적으로, 각 MRI 조영제를 주입 후 림프절 조직을 적출하고 적출된 림프절을 4% 포르말린(formalin) 용액 1 ml에 담가 둔 다음 이를 파라핀(paraffin) 안에 고정시키고 염색을 위하여 절개하였다. 림프절 slice를 10% potassium ferrocyanide 및 20% HCl로 20분간 염색하였고 염색된 slice는 광학현미경으로 관찰하였다. Iron oxide 입자는 푸른 점으로 나타난다. 그 결과는 도 8과 같다. 도 8의 결과에서 알 수 있듯이, 카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs은 림프절 내에 타 MRI 조영제들에 비하여 잘 분포되어 있었다. 이로부터 카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs을 조영제로 주입할 경우 조직 내의 항원표시세포에도 효과적으로 유입될 수 있음을 확인할 수 있었고 이로부터 항원표시세포가 포함된 조직을 대상으로 한 MRI 조영제로 활용 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 림프절로의 암전이 진단에의 활용
카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs을 기존에 알려진 MRI 조영제인 Dextran-coated SPION 및 PVA-coated SPION과 림프절로의 암전이 진단을 목적으로 한 MRI 촬영에서 그 성능을 비교하여 보았다. 림프절 암전이를 가진 실험동물 당 1 mg의 철이온이 되게 각 조영제들을 투여한 후 림프절을 MRI하여 비교하였다. 화순 전남대 병원의 동물용 코일(4 channel phased array rat head coil, Rapid Biomedical mdh, Rimpar, Germany)을 이용한 3 T MR 스캐너(Siemens Medical System, Elegan, Germany)를 사용하여 터보-스핀 에코(Turbo-spin echo; TSE) T2-weighted(repetition time ms/echo time ms of 3,200/86, flip angle 150°, echo train length of 18, 56mm field of view, 2 mm section thickness, 0.2-mm intersection gap, 320×320 matrix, 8 NEX) MRI를 수행하였다. 그 결과는 도 9 및 도 10에 제시되어 있다.
도 9의 결과에서 대조군 경우의 자기공명 영상보다 카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs가 주입된 경우의 자기공명 영상이 시간이 지남에 따라 보다 어두워짐을 확인할 수 있었다. 이를 통하여, 카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs는 투여 후 상당히 빠른 시간 안에 조직 간의 대조도 차이를 제공할 수 있어 효과적인 림프절 암전이 진단용 MRI 조영제임을 확인할 수 있었다. 도 10의 신호 강도 (signal intensity) 비의 결과는 인접한 근육에 대한 림프절의 상대적 신호 강도의 비를 보여주는 결과이며, 근육보다 림프절로 카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs이 보다 효과적으로 유입되고 이로 인하여 상대적 신호 강도 비가 우수함을 확인할 수 있다.
이상의 결과들은 본 발명의 카르복실산-만난으로 코팅된 SPIONs이 항원표시세포를 가지는 조직을 가시화하는 목적으로의 MRI 조영제로 활용될 수 있음은 물론, 림프절로의 암전이 진단 목적의 MRI 조영제로도 효과적으로 활용될 수 있음을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명의 MRI 조영제는 유방암, 대장암, 위암 등의 초기 림프절로의 전이를 효과적으로 탐지하는 데에 사용되어 질 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 패혈증 진단에의 활용
본 발명의 MRI 조영제가 패혈증을 조기진단 하는 목적으로도 활용될 수 있는가를 알아 보았다. 패혈증은 박테리아의 감염에 의해 유발되는 질환으로 박테리아에 감염될 경우 감염부위는 박테리아의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS)에 반응하여 대식세포를 다량 생성한다. 이렇게 생성된 대식세포를 용이하게 확인할 수 있다면 패혈증 정도를 편리하게 확인할 수 있다. 실험은 다음과 같이 실시되었다. 다음의 실험에서는 카르복실산-만난으로 코팅된 SPOINs이 LPS에 노출되어 활성화된 대식세포 내로 얼마나 효율적으로 유입되는가를 알아보고자 하였다.
복막 대식세포의 일부를 LPS로 처리하여 패혈증와 같은 상태의 세포로 만들었다. 이렇게 LPS 처리한 복막 대식세포와 아무 처리하지 않은 복막 대식세포를 각각 카르복실산-만난으로 코팅된 SPOINs이 포함된 배지에서 3시간 배양하였다. 배양 후 각 세포에 대하여 통상의 프루시안 블루 염색을 실시하여 카르복실산-만난으로 코팅된 SPOINs의 세포 내로의 유입 정도를 관찰하였다. 그 결과가 도 11에 제시되어 있다. 도 11의 결과에서 알 수 있듯이 패혈증 상태의 세포라 할 수 있는 LPS 처리된 세포에서 아무 처리하지 않은 정상 세포에 비하여 카르복실산-만난으로 코팅된 SPOINs의 유입이 현저히 증가하는 결과를 확인할 수 있었다. 이 결과로부터 본 발명의 MRI 조영제가 패혈증의 조기 진단 목적으로도 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

  1. 항원표시세포 자체 및 항원표시세포를 포함하는 조직을 자기공명영상에서 특이적으로 가시화 시킬 수 있는 카르복실산-만난으로 코팅된 초상자성 나노입자 MRI 조영제.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 항원표시세포는 수지상 세포, 대식세포, B-세포인 것을 특징으로 한, MRI 조영제.
  3. 제 1항에 있어서, 림프절로의 암전이 진단에 활용될 수 있는 것을 특징으로 한, MRI 조영제.
  4. 제 1항에 있어서, 패혈증 진단에 활용될 수 있는 것을 특징으로 한, MRI 조영제.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 카르복실산-만난은 알데히드-만난으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는, MRI 조영제.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 카르복실산-만난은 전체 구성하는 만노우즈의 10 mol % 이상이 카르복실화 되어 있는 것을 특징으로 하는, MRI 조영제.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 초상자성 나노입자가 산화철인 것을 특징으로 하는, MRI 조영제.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 산화철이 마그네타이트(magnetite,Fe3O4) 또는 마그헤마이트(maghemite, Fe2O3)인 것을 특징으로 하는, MRI 조영제.
  9. A) 초상자성 나노입자를 합성하는 단계;
    B) 만난에 알데히드기를 도입하여 알데히드-만난을 합성하는 단계;
    C) 상기 알데히드-만난을 이용하여 이를 산화시킴으로 카르복실기가 도입된 카르복실산-만난을 제조하는 단계; 및
    D) 상기 제조된 카르복실산-만난으로 상기 합성된 초상자성 나노입자를 코팅하는 단계를 포함하는, MRI 조영제 제조방법.
  10. 제9항에 의해 제조되는, 카르복실산-만난으로 코팅된 초상자성 나노입자 MRI 조영제.
  11. 제 10항에 있어서, 조영제는 림프절로의 암전이 진단에 활용될 수 있는 것을 특징으로 한, 카르복실산-만난으로 코팅된 초상자성 나노입자 MRI 조영제.
  12. 제 10항에 있어서, 조영제는 패혈증 진단에 활용될 수 있는 것을 특징으로 한, 카르복실산-만난으로 코팅된 초상자성 나노입자 MRI 조영제.
  13. 제 10항에 있어서, 상기 카르복실산-만난은 전체 구성하는 만노우즈의 10 mol % 이상이 카르복실화 되어 있는 것을 특징으로 하는, 카르복실산-만난으로 코팅된 초상자성 나노입자 MRI 조영제.
  14. 제 10항에 있어서, 상기 초상자성 나노입자가 산화철인 것을 특징으로 하는, 카르복실산-만난으로 코팅된 초상자성 나노입자 MRI 조영제.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 산화철이 마그네타이트(magnetite,Fe3O4) 또는 마그헤마이트(maghemite, Fe2O3)인 것을 특징으로 하는, 카르복실산-만난으로 코팅된 초상자성 나노입자 MRI 조영제.
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