WO2012113733A1 - Nanopartikel als mrt-kontrastmittel zur diagnostik des hepatozellulären karzinoms - Google Patents

Nanopartikel als mrt-kontrastmittel zur diagnostik des hepatozellulären karzinoms Download PDF

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WO2012113733A1
WO2012113733A1 PCT/EP2012/052811 EP2012052811W WO2012113733A1 WO 2012113733 A1 WO2012113733 A1 WO 2012113733A1 EP 2012052811 W EP2012052811 W EP 2012052811W WO 2012113733 A1 WO2012113733 A1 WO 2012113733A1
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WO
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nanoparticles
nanoparticle
dtpa
contrast agent
hcc
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PCT/EP2012/052811
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English (en)
French (fr)
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Jörg KREUTER
Karsten ULBRICH
Klaus Langer
Thomas Knobloch
Albrecht Piiper
Verena KÖBERLE
Hüdayi KORKUSUZ
Thomas J. VOGEL
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Johann Wolfgang Goethe-Universität, Frankfurt Am Main
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Publication date
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/18—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes
    • A61K49/1818—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles
    • A61K49/1821—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles
    • A61K49/1824—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised nanoparticles
    • A61K49/1878—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised nanoparticles the nanoparticle having a magnetically inert core and a (super)(para)magnetic coating
    • A61K49/1881—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised nanoparticles the nanoparticle having a magnetically inert core and a (super)(para)magnetic coating wherein the coating consists of chelates, i.e. chelating group complexing a (super)(para)magnetic ion, bound to the surface

Definitions

  • the present invention relates to nanoparticles comprising a gadolinium compound and / or incorporated perfluorooctylbromide for use as contrast agents in a magnetic resonance imaging (MRI) based diagnosis of liver diseases, in particular hepatocellular carcinoma (HCC).
  • MRI magnetic resonance imaging
  • HCC hepatocellular carcinoma
  • the PLGA and HSA nanoparticles according to the invention were loaded with a gadolinium compound (Gd-DTPA) and could be used successfully for improved contrasting in the MRI of HCC.
  • the invention describes novel contrast agents comprising the nanoparticles according to the invention, in particular for use in the diagnosis, monitoring and / or early detection of HCC.
  • a method for diagnosis, monitoring and / or early detection of HCC is provided.
  • HCC hepatocellular carcinoma
  • HCC liver transplantation or resection. While the transplantation can be performed in BCLC stages 0, A and possibly B, tumor resection only makes sense in stage 0. The remaining, higher grade tumor stages can only be treated by local ablation procedures (LITT, TACE) or systemic therapy palliatively (chemoradiation with sorafenib). The early diagnosis is therefore crucial for a successful therapy.
  • HCC Surveillance the semi-annual ultrasound examination and the determination of the tumor marker ⁇ -fetoprotein has been established (Greten and Manns, 2008) .This usually results but only from a tumor diameter of about 1.5 cm to the diagnosis. Serum levels of ⁇ -fetoprotein, however, are inappropriate for diagnosis because of their low sensitivity and specificity (Daniele et al, 2004).
  • HCC High-risk patients for the development of HCC
  • HCC Patients with liver cirrhosis, as well as the diagnosis of suspicious nodules are central to a significant improvement in the prognosis of HCC patients.
  • the most reliable HCC diagnostic imaging enables dynamic Contrast Magnetic Resonance Imaging (MRI) and Contrast Computed Tomography.
  • MRI Magnetic Resonance Imaging
  • Contrast Computed Tomography In these studies, HCCs show a characteristic arterial venous and venous flow behavior due to the supply via the A. hepatica, which is utilized by the low-molecular contrast media (Magnevist®, Primovist®).
  • Tumor vessels have an increased permeability, which extends in particular to macromolecules such as nanoparticles. Since lymphatic drainage in the tumor tissue is also reduced, macromolecular substances injected into the blood circulation, such as nanoparticles but not low molecular weight substances, can deposit selectively in the tumor tissue.
  • Magnetic resonance imaging is an imaging technique that is used primarily in medical diagnostics to represent the structure and function of tissues and organs in the body. Magnetic resonance imaging is based on very strong magnetic Fields and electromagnetic alternating fields in the radio frequency range, with which certain nuclei (usually the hydrogen nuclei / protons) are excited resonantly in the body, which then induce electrical signals in the receiver circuit. Contrast agents serve to improve the representation of structures and functions of tissues / organs in MRI. In magnetic resonance imaging, gadolinium chelates are primarily used as contrast agents, which due to the paramagnetic property of the gadolinium atom lead to a shortening of the relaxation times in the vicinity of the contrast agent and thus to a brighter (more signal rich) representation of structures.
  • Nanoparticles made from the polymers human serum albumin (HSA) or poly (D, L-lactic-co-glycolic) acid (PLGA) are well tolerated. There is no unwanted long-term accumulation of these carrier systems in the body, since the nanoparticles are broken down by the body.
  • the functional groups present on the particle surface allow conjugation with different ligands for specific targeting.
  • HSA Human serum albumin
  • PLGA-based microparticles As a contrast substance, Gd-DTPA was included in the PLGA microparticles with a diameter of 900-1800 nm. To test the thus obtained contrast agent, a suspension of agarose and the microparticles were analyzed. No analyzes were performed on living tissue or even mouse models (Doiron AL et al., 2009).
  • nanoparticles based on an iron oxide core containing a specific tumor binding substance (chlorotoxin), a fluorophore and a biopolymer has been found to be advantageous.
  • chlorotoxin chlorotoxin
  • fluorophore a fluorophore
  • biopolymer a specific tumor binding substance
  • the object of the invention to provide new possibilities for the diagnosis, prognosis and in particular for the early detection of hepatocellular carcinoma (HCC) as well as for the monitoring of a therapy of such a disease.
  • the technique of magnetic resonance imaging in the diagnosis of HCC should be improved.
  • the present invention is intended to offer a novel MRI contrast agent, which exceeds the contrast agent currently available for imaging HCC in MRI in terms of specificity and sensitivity. This allows early detection of even small HCCs and also allows the differentiation of HCC and cirrhotic regenerate nodules and other benign changes.
  • nanoparticles which are composed of a matrix of human serum albumin (HSA) or PLGA are preferred.
  • paramagnetic species such as free radicals (eg, stable nitrooxides), as well as elements of the transition metals, lanthanides, and actinides, which, if desired, are covalently or noncovalently attached to complexing agents (chelators) or amino acids containing macromolecules can be bound.
  • elements selected from the group consisting of Gd (III), Mn (II), Cu (II), Cr (III), Fe (II), Fe (III), Co (II), Er (II), Ni (II), Eu (III) and Dy (III).
  • Particularly preferred elements are Gd (III), Mn (II), Cu (II), Fe (II), Fe (III), Eu (III) and Dy (III), especially Mn (II) and Gd (III).
  • the nanoparticle according to the invention comprises a paramagnetic substance as compound of an element selected from the group of lanthanides. It is particularly preferred that the lanthanoid compound is a gadolinium compound.
  • Preferred chelators of the present invention include: acetylacetone (acac), ethylenediamine (s), 2- (2-aminoethylamino) ethanol (AEEA), diethylenetriamine (diene), imino-diacetate (ida), triethylenetetramine (triene), triaminotriethylamine, nitrilotriacetate ( nta), ethylenediaminotriacetate (ted), ethylenediaminetetraacetate (edta), diethylenetriamine pentaacetate (DTPA) 1,4,7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4,7, 10-tetraacetate (DOTA), oxalate (ox), tartrate (tart ), Citrate (cit), dimethylglyoxime (dmg), 8-hydroxyquinoline, 2,2'-bipyridine (bpy) and
  • the present invention relates to a nanoparticle wherein the gadolinium compound is a complex of gadolinium and a chelator, in particular wherein the chelator is selected from the group consisting of diethylenetriamine pentaacetic acid (DTPA) and 1,4,7,10-tetraazacyclododecane - 1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA).
  • the gadolinium compound is Gd-DTPA, or derivatives of this compound, such as Gd-EOB-DTPA (Primovist®).
  • a "chelator” in the context of the present invention is to be understood as meaning a ligand having more than one free electron pair which can occupy at least two coordination sites (binding sites) of a central atom, in particular a gadolinium atom , the binding electron pair is provided solely by the ligand.
  • the entire complex of central atom and ligand is called a "chelate complex”.
  • the paramagnetic substance ie in particular the gadolinium compound
  • the paramagnetic substance can be incorporated both in the nanoparticle and / or bound to the surface of the nanoparticle covalently or noncovalently, for example adsorptively.
  • the binding of the gadolinium compound to an HSA particle matrix is accomplished, for example, by the use of n- (3-dimethylaminopropyl) -N-ethylcarbodiimide (EDC).
  • EDC n- (3-dimethylaminopropyl) -N-ethylcarbodiimide
  • the underlying idea is the introduction of a linker that "mediates" a covalent bond between the particle and the gadolinium compound, in which both molecules must react with the linker, and the gadolinium compound (eg, Gd-DTPA) binds to the surface of the PLGA
  • Gd-DTPA gadolinium compound
  • the nanoparticles of the invention further contain incorporated perfluorooctyl bromide and / or Gd-DTPA.
  • nanoparticle of the invention described herein may be further modified, preferably.
  • the nanoparticle is coated with surfactants, or conjugated to a tumor-specific ligand.
  • nanoparticles Modifications of nanoparticles have been shown to be beneficial, particularly in connection with the transport of drugs across the blood / brain barrier. In the context of the invention, it is therefore desirable that the nanoparticles and / or contrast agents according to the invention can be modified according to the disease to be diagnosed.
  • nanoparticles This can be achieved, on the one hand, by coating the nanoparticles with specific surfactants (polysorbate 80, or poloxamer 188, Gelperina et al., 2002), or by attaching specific ligands, such as apolipoprotein A1 and E (Zensi et al., 2009), Transferrin, insulin or antibodies to the corresponding receptors (Ulbrich et al., 2009, Ulbrich et al., 2010), but not by PEGylation.
  • pegylation of the nanoparticles may be beneficial in prolonging the circulation time of the nanoparticles in the blood. Modifications to allow targeted delivery of the nanoparticles to the tumor are known.
  • a preferred embodiment of the invention is directed to a nanoparticle which is coupled to a tumor-specific ligand, wherein the tumor-specific ligand is selected from the group comprising transferrin, an antibody against the transferrin receptor, insulin, an antibody against the insulin receptor and folic acid.
  • the tumor-specific ligand is selected from the group comprising transferrin, an antibody against the transferrin receptor, insulin, an antibody against the insulin receptor and folic acid.
  • all such substances are preferred as ligands which allow targeted taring of the nanoparticles to the tumor, in particular ligands which bind the nanoparticles to HCC in a targeted manner.
  • the nanoparticles of the invention should preferably be used as contrast agents in a magnetic resonance imaging method.
  • a magnetic resonance tomography for the diagnosis, prognosis and / or monitoring of a disease.
  • the nanoparticles described herein have a particularly good contrast of HCC in contrast to the surrounding liver parenchyma and non-malignant liver tissue readings. Since tumor vessels have an increased permeability and furthermore the lymphatic outflow in the tumor tissue is reduced, macromolecular substances injected into the blood circulation, but not low-molecular substances, can deposit selectively in the tumor tissue - this is the EPR effect.
  • the nanoparticles of the present invention have particularly surprisingly advantageous properties, which favor a contrasting of the HCC caused by the EPR effect.
  • nanoparticles have reduced penetration in malignancies (Jain and Stylianopoulos, Delivering nanomedicine to solid tumors, Nat Rev Clin Oncol 2010; doi: 10.1038 / nrclinonc.2010.139).
  • the nanoparticle-based contrasting of the tumors could also be due to a decreased accumulation of the nanoparticle-based contrast agent in the tumor. Since the accumulation of nanoparticles takes several hours, it is to be expected that the contrasting of the tumors by the nanoparticles will initially be based on a reduced accumulation of nanoparticles in the tumor, which compensates or reverses under the influence of the EPR effect. This should be a characteristic of malignancies like HCCs.
  • the nanoparticles and / or contrast agents of the present invention in conjunction with a 3-tesla scanner in the MRI.
  • the nanoparticles of the invention can be used for contrasting, and thus for diagnosing, a variety of diseases. Diseases which are associated with a disturbance of the barrier function of the vessels and reduced lymphatic drainage in the pathologically altered region are preferred. This is the case for most solid malignancies, in particular mammary carcinoma, colon carcinoma, pancreatic carcinoma, gastric carcinoma, ovarian carcinoma, bile duct carcinoma, prostate carcinoma, vicinal carcinoma, glioblastoma or tumor metastases.
  • the disease to be diagnosed is a liver disease, in particular cirrhosis and / or hepatocellular carcinoma (HCC).
  • HCC hepatocellular carcinoma
  • the structure of the nanoparticles according to the invention and / or contrast agents makes it possible to use them in the early detection of a hepatocellular carcinoma, in particular for the detection of a hepatocellular carcinoma of a size smaller than 1.5 cm.
  • a representation of such small HCC has not been possible via the known MRI methods. Therefore, the nanoparticles of the invention can be used especially for the diagnosis of HCC at an early stage. Therapy is characterized by a significantly improved prognosis for a patient diagnosed with HCC at an early stage, and therefore particularly advantageous.
  • the nanoparticles according to the invention are smaller than 500 nm, preferably smaller than 300 nm and most preferably have a size of 100-300 nm.
  • a contrast agent for use in magnetic resonance imaging comprising a nanoparticle of the invention described above.
  • the formulation and composition of pharmaceutically acceptable contrast media, in particular with regard to possible allergic reactions, are known to the person skilled in the art and can be found in the relevant prior art.
  • the contrast agent according to the invention also contains a tumor homing peptide, in particular iRGD.
  • the iRGD can be administered in parallel with the nanoparticles, or else coupled to the nanoparticles and / or incorporated in the nanoparticles.
  • iRGD consists of an RGD motif which binds to integrin a v , an integrin preferentially expressed in the endothelium of tumor vasculature (Ruoslahti, 2002) and a CendR motif which binds to neuropilin-1.
  • the binding of CendR and neuropilin is required for the enhanced tumor-selective penetration effect. Remarkably, this increased penetrability persists for several days after iRGD administration (Sugahara et al, 2010).
  • Cirrhotic liver tissue has elevated levels of neuropilin-1 compared to the normal liver (Cao et al, 2010); furthermore, the carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in the mouse is enhanced by neuropilin-1 (Cao et al, 2010). Since iRGD improves the penetration of the tumor stroma into the HCC, increased extravasation of the nanoparticles and an increase in the EPR effect are to be expected, resulting in an improvement in the specificity and / or the sensitivity of the contrast enhancement in malignant HCC tissue.
  • the contrast agent according to the invention may additionally contain agents which cause an increase in the blood pressure of the subject to be diagnosed-a patient.
  • agents which cause an increase in blood pressure leads to an enhancement of the EPR effect.
  • the contrast agent of the invention contains angiotensin II.
  • Another possibility is the ac- Allowing cumulation of nanoparticles is that preferably nitric oxide (NO) donors, such as glyceryl trinitrate (GNT) is contained in the contrast agent of the invention.
  • NO nitric oxide
  • GNT glyceryl trinitrate
  • the contrast agent may contain a physiologically acceptable aqueous medium.
  • the contrast agent of the present invention is preferably provided in the form of an injection solution.
  • a third aspect of the invention provides a nanoparticle according to the invention and / or a contrast agent according to the invention which is suitable for enabling a differentiation between hepatocellular carcinoma and cirrhotic regenerate nodules in a magnetic resonance tomography method. Furthermore, a nanoparticle according to the invention and / or a contrast agent according to the invention can be used for the differentiation between HCC and liver cirrhosis.
  • the object of the present invention is achieved by a method for the diagnosis, monitoring and / or early detection of hepatocellular carcinoma, comprising administering a contrast agent according to the invention to a subject and a subsequent MRI examination of the subject.
  • the MRI examination is preferably carried out by means of a 3-Tesla tomograph.
  • a subject in the context of the invention is preferably a human (a patient), in particular a patient in whom cirrhosis and / or HCC is suspected, or in whom a preventive or follow-up examination for HCC is to be made.
  • the present invention may be used generally for imaging by means of an MRI in a patient.
  • the image recording process is carried out as follows: first, a sufficient amount of the contrast agent according to the invention is administered to a patient, in order then to perform a scan of the patient by means of magnetic resonance tomography. Thus, images of the internal structures of the patient of interest, particularly the diseased tissues, are taken.
  • the contrast agent according to the invention is particularly helpful for the visualization of liver tissues, but other regions can also be used to record images.
  • Administration of the contrast agent can be accomplished in any manner well known to those skilled in the art. This includes in particular intravenous, intracardiac (heart injection), oral, rectal, etc. administration of different formulations of the contrast agent.
  • the necessary dose of the contrast agent is varied according to the age, size and weight of the patient, as well as the area of the body to be examined.
  • contrast agents of the invention can be used both alone and in combination with other diagnostic, therapeutic or other substances.
  • other substances is meant in particular pharmaceutical excipients, flavorings or colorants, for example sucrose or a natural citrus flavor may be added to an orally administered formulation
  • the contrast agent of the invention be included in liposomes or other pharmaceutical carriers.
  • the use of the above-described nanoparticles and / or contrast agents in an MRI method is also provided.
  • a use of the nanoparticles according to the invention and / or contrast agents for the diagnosis, prognosis and / or early detection of an HCC, and / or the monitoring of a therapy of such a disease based on an MRI is preferred.
  • Figure 1 Physicochemical properties (particle size and polydispersity) of
  • PLGA 502H nanoparticles as a function of their loading with gadolinium.
  • PLGA 504H nanoparticles as a function of their loading with gadolinium.
  • Figure 3 MRI scan at a repetition time of 100 ms.
  • Figure 4 Application of contrast agents in the HCC mouse model. In all applications the same amount of Gd-DTPA was used. Red circles highlight the HCCs.
  • Mouse 1 MRI of the liver of a TGFalpha / c-myc mouse directly after injection with Primovist® (Oh), and after 24 h. Primovist® can penetrate into normal liver cells and tumor cells through transport proteins, thus first contrasting the vessels and then both the tumor and the surrounding liver parenchyma.
  • Mouse 2 MRI of the liver of a TGFalpha / c-myc mouse directly after injection with Magnevist® (Oh), and after 24 h.
  • Mouse 3 This mouse was treated with Primovist® and analyzed directly. Thereafter, the mouse received Gd-DTPA-PLGA nanoparticles 48 hours later and was measured immediately after injection, as well as 24 h and 64 h later.
  • Figure 7 Incorporation of fluorescently labeled nanoparticles in the liver.
  • A PLGA-NP rhodamine-labeled nanoparticles.
  • B HSA-NP-rhodamine-labeled nanoparticles.
  • Figure 8 MRI image natively and with NP-HSA-Gd-Rhodamine: HCC in the native image of the same tumor, which can not be detected without contrast medium.
  • Example 1 Gadolinium-DTPA PLGA Nanoparticles 1. Synthesis of the Gd-DTPA-PLGA nanoparticles
  • PLGA nanoparticles with covalently coupled gadolinium DTPA uncharged PLGA-NP prepared by emulsion diffusion evaporation, amino groups introduced by EDC and 1,4-diaminobutane, Gd-DTPA bound by EDC:
  • Unplated PLGA nanoparticles were prepared by emulsion diffusion evaporation.
  • the organic phase was washed with 10 ml of an aqueous, 1% stabilized polyvinyl alcohol (PVA, Mr 30,000-70,000 Da, degree of hydrolysis 96.8-97.6%, ester number 30-40, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) solution by means of an Ultra - Turrax (Ultra Turrax® T25, IKA Laboratory, Staufen, Germany) emulsified at 17,000 rpm for 5 minutes.
  • PVA stabilized polyvinyl alcohol
  • the emulsion was added to a stirring PVA solution (550 rpm) in a 100 ml wide-bore condenser flask. As a result, the ethyl acetate diffuses into the aqueous phase and the polymer precipitates. By stirring overnight (-12 h), the ethyl acetate was removed by evaporation from the solution.
  • the resulting nanoparticles were purified by centrifugation (16,100 g 8 min, centrifuge 5804R, Eppendorf, Hamburg, Germany), exchange of the supernatant with MilliQ water and resuspension by means of ultrasound (ultrasonic bath Transsonic Digital, Elina, Singen, Germany). The purification cycle was repeated three times. At the last purification cycle, the nanoparticles were concentrated by resuspending in half of the original suspension volume. The exact nanoparticle content was determined gravimetrically (see below). 15 mg / ml of PLGA nanoparticles were brought to a suitable pH of 5.5 to 6.5 with the MES buffer.
  • the nanoparticles were subsequently purified. This was done as described above by centrifugation, exchange of the supernatant with MilliQ water. After 2 purification cycles, the nanoparticle content was determined gravimetrically.
  • PLGA nanoparticles with incorporated perflourooctyl bromide was carried out by means of emulsion-diffusion evaporation.
  • the organic phase was washed with 10 ml of an aqueous, 2% stabilized polyvinyl alcohol (PVA, Mr 30,000-70,000 Da, degree of hydrolysis 96.8-97.6%, ester number 30-40, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) solution by means of an Ultra - Turrax (Ultra Turrax® T25, IKA Laboratory, Staufen, Germany) emulsified at 17,000 rpm for 5 minutes.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • Ultra Turrax® T25 IKA Laboratory, Staufen, Germany
  • the emulsion was added to a stirring PVA solution (550 rpm) in a 100 ml wide-bore condenser flask. As a result, the ethyl acetate diffuses into the aqueous phase and the polymer precipitates. By stirring overnight (-12 h), the ethyl acetate was removed by evaporation from the solution.
  • the resulting nanoparticles were purified by centrifugation (16,100 g 12 min, centrifuge 5804R, Eppendorf, Hamburg, Germany) Exchange of the supernatant with MilliQ water and resuspension by means of ultrasound (Ultrasonic Bath Transsonic Digital, Elina, Singen, Germany). The purification cycle was repeated three times.
  • the concentration of nanoparticles was determined gravimetrically by the loss of drying (see above).
  • the size of the nanoparticles was determined by the PCS Photon Correlation Spectroscopy (Malvern Zetasizer 3000 HSA, Malvern, UK) using PCS cuvettes (PCS cuvettes (10x10x48), Sarstedt, Numbrecht, Germany).
  • the size measurements of two nanoparticle preparations show that particles have formed in the lower nanometer range (100-300 nm) ( Figures 1 and 2).
  • a satisfactory polydispersity of less than 0.3 (502H) or 0, 1 (504H) results ( Figures 1 and 2).
  • Particles with incorporated perfluorooctyl bromide have a size of about 260 nm and a polydispersity of less than 0.1.
  • the concentration of the nanoparticles was determined gravimetrically (analytical balance Supermicro S4, Sartorius, Göttingen, Germany) on the loss of drying. For this purpose, 50 ⁇ l of the nanoparticle suspension were weighed into a weighing boat (aluminum weighing boat, VWR, Darmstadt, Germany) and dried to constant weight at 80 ° C. in a drying cabinet (Ehret, Emmendingen, Germany).
  • the determination of the Gd-DTPA concentrations in the suspended nanoparticles was carried out by means of MRT in the 3 Tesla nuclear spin tomograph.
  • Figure 3 shows an MRI scan with a repetition time of 100 ms.
  • the numbers represent the theoretical Gd-DTPA concentration in the unit mg / ml.
  • PLGA means PLGA nanoparticles
  • HSA means HSA nanoparticles
  • the "+" plus sign means covalently coupled with e.g. Gd-DTPA.
  • the first column in Figure 3 shows a dilution series of the pure Gd-DTPA solution.
  • the concentration range extends from 3 mg / ml to 0.5 mg / ml of Gd.
  • mice Male TGF ⁇ / c-myc bi-transgenic mice were obtained by cross-breeding with homozygous MT / TGF ⁇ (Jhappan et al, 1990) and ALB / C-myc (Murakami et al, 1993) single transgenic mice in a CD13B6CBA background (as described in Murakami et al, 1993). After the weaning phase, the mice were induced with ZnCl 2 to induce expression of TGF ⁇ and thus accelerated hepatocarcinogenesis. 18 to 22 weeks after the start of the zinc treatment, the animals were subjected to a contrast-enhanced MRI examination. After the MRI examination, the livers of the animals were prepared and examined microscopically for HCC. The presence of HCC was histopathologically detected by tissue sections.
  • mice were anesthetized after zinc induction by intraperitoneal injection of ketamine (60 mg / kg body weight) and xylazine (12 mg / kg body weight). Thereafter, Primovist® (Schering) was injected intravenously and a mouse MRI was performed immediately. Each mouse was scanned both before and after administration of the contrast agent. A 3-tesla tomograph was used (Siemens Magnetom Trio, Siemens Medical Solutions, Er Weg, Germany).
  • the quantitative MRI analysis of the present invention is based on the measurement of signal intensities (SI).
  • SI signal intensities
  • circular geometrical regions, so-called operator-defined regions of interest (ROI) were drawn into the MRI images.
  • the SI values of the ROIs were presented as averages with one standard deviation.
  • hepatocarcinogenesis is induced by zinc in drinking water. After induction of hepatocarcinogenesis for 20 to 22 weeks, the animals were first examined for the presence of HCC by Primovist® / Magnevist® enhanced MRI. It showed that Primovist® enabled a more sensitive representation of HCC than Magnevist®.
  • the HCCs in the TGFalpha / c-myc mouse model could be contrasted with Primovist® and correspond to the 10% human HCCs.
  • mice were subjected to another MRI scan one day later. Here it was shown that the contrast of the HCC by Primovist® was largely lost.
  • Nanoparticle-based contrast agents of the present invention therefore offer the option of additionally using the EPR effect, a characteristic of malignancies, in differential diagnosis.
  • Gd-EOB-DTPA (Primovist®) is a gadolinium-containing, water-soluble contrast agent. It differs from the MRI contrast agent Magnevist® described above by a lipophilic ethyl-oxy-benzyl group, so that the substance is specifically taken up by the hepatocytes and excreted biliary. For uptake into the cell, the albumin-binding organic anion transporter, which has only a low specificity, is responsible, whereas biliary excretion occurs in an ATP-dependent process with the help of glutathione S-transferase.
  • FIGS. 5 and 6 show that the nanoparticles according to the invention have a SIR ("signal / intensity ratio” signal / intensity ratio) as well as CNR ("contrast / noise ratio” / background ratio).
  • SIR signal / intensity ratio
  • CNR contrast / noise ratio
  • Figure 7 shows the distribution of fluorescently labeled PLGA and HSA nanoparticles.
  • 200 ⁇ of the PLGA nanoparticle rhodamines or HSA nanoparticle rhodamines were intravenously injected into the HCC mice. Thirty minutes later, the animals were sacrificed and cuts made by the liver. Fluorescence-labeled nanoparticles are seen to a lesser extent in HCCs compared to adjacent normal liver tissue. Accordingly, nanoparticles of the invention allow a clear contrast between tumor tissue and the surrounding liver tissue.
  • Figure 8 shows In order to investigate the contrasting effect of HSA-based nanoparticles in HCCs in TGFa / c-myc mice, an MRI sequence was first performed prior to injection of the nanoparticles. Subsequently, the animals were injected with Gd-DTPA-loaded HSA nanoparticles (with about 10 ⁇ Gd-DTPA / kg body weight) and MRI sequences were carried out immediately after the injection. One recognizes the demarcation of a HCC, which was not visible in the Nativfact.
  • Example 2 Gadolinium-DTPA HSA nanoparticles
  • the embedding of Gd-DTPA in an HSA particle matrix is carried out by ethanolic desolvation.
  • the polymer and the drug are first dissolved in a solvent.
  • the non-solvent is added to ethanol.
  • the addition of this substance results in an "ultrafine coacervation", which leads to the inclusion of the drug molecules in the polymer.
  • a part of the drug can be dissolved in the polymer.
  • a cross-linking substance such as glutaraldehyde is added its two free aldehyde functions with the terminal amino groups in the protein and thus leads to a cross-linking of the amino acid strands in the protein and thus to a stabilization or curing of the nanoparticles.
  • the addition of the non-solvent takes place slowly and uniformly Desolvation of the HSA nanoparticles is then performed in the final purification step and the nanoparticles are redispersed in MES buffer pH 4.7.
  • Binding of Gd-DTPA to the HSA particle matrix occurs by transient binding of n- (3-dimethylaminopropyl) -N-ethylcarbodiimide (EDC).
  • EDC n- (3-dimethylaminopropyl) -N-ethylcarbodiimide
  • the underlying idea is the introduction of a linker that "mediates" a covalent bond between the particle and the drug, in which both molecules (particles and drug) must react with the linker
  • the Gd-DTPA complex is expressed in dissolved in the above-mentioned ethanol / water mixture and 0.6 ml of it with 0.2 ml of a freshly prepared EDC solution (10 mg / ml) .
  • This solution becomes the particles which in 1 ml of MES buffer pH 4 , Dispersed and shaken for two hours on an Eppendorf mixer at 600 rpm with exclusion of light.
  • the preparations contain an effective concentration of 6 mg /
  • Example 3 Further manufacturing methods of the nanoparticles of the invention
  • HSA nanoparticles were prepared by a desolvation process (Weber et al, 2000). 200 mg HSA was dissolved in 2 ml 10 mM NaCl 2 solution, adjusted to pH 8.4 and filtered through a 0.22 ⁇ filter. In this solution, the nanoparticles were formed under constant stirring at room temperature with the continuous addition of 8 ml of the desolvation agent ethanol (addition rate 1 ml / min). To the protein desolvation, 115 ⁇ of an 8% aqueous glutaraldehyde solution was added to achieve crosslinking of the particles. The resulting nanoparticles were purified by three centrifugation steps (16100xg, 8 min) and redispersion in the original volume with water.
  • DTPAa 5 mg was added to 1 ml of HSA solution adjusted to pH 9.0-9.5 and incubated for 3 h at room temperature with constant shaking at 600 rpm.
  • the DTPA-conjugated HSA nanoparticles were purified by four washings by centrifugation (16100xg, 10 min) and redispersed in 1 ml of water.
  • EDC l-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • a freshly prepared EDC solution (100 ⁇ , 10 mg / ml) was added to an HSA suspension and incubated for 30 min with constant shaking at 600 rpm.
  • the Gd-DTPA complex was subsequently synthesized by the addition of DTPAa and complexation with GdCl 3 to the HSA nanoparticles.
  • the Solution was quenched with 1 ⁇ M of hydroxylamine (500 mg / ml) for 20 min to stop the reaction. Subsequently, for the purification of the nanoparticles, three centrifugation cycles (16100 ⁇ g, 8 min) with redispersion in the original volume of water were carried out.
  • the particle size and polydispersivity index (PDI) were determined by dynamic light scattering (DLS). DLS and zeta potential analyzes were performed using the Zetasic Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK). An aliquot (15 ⁇ ) of the samples was diluted in 2 ml ultrapure water and the light scattering measured at 25 ° C at a 90 degree angle. The nanoparticle content of the suspension was determined gravimetrically, the concentration of Gd by atomic absorption spectroscopy. The surface morphology of the nanoparticles was determined by means of the scanning electron microscope (Hitachi, S 4500 SEM), the Gd loading of the nanoparticles by MRI.
  • DLS and zeta potential analyzes were performed using the Zetasic Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK). An aliquot (15 ⁇ ) of the samples was diluted in 2 ml ultrapure water and the light scattering measured at 25 ° C at a 90 degree angle
  • PLGA nanoparticles were prepared by the double-emulsion method by evaporation of the solvent. 500 mg of PLGA (50:50) was dissolved in 5 ml of ethyl acetate to form a polymer phase. Subsequently, this was mixed with 10 ml of 1% polyvinyl alcohol solution (PVA) and homogenized using an Ultra-Turrax (17000 rpm, 5 min). It resulted in a water-in-oil (w / o) emulsion. This primary emulsion was added with 40 ml of a 1% PVA solution and stirred for 18 h (550 rpm) to evaporate the ethyl acetate. In the last step, the nanoparticles were washed three times by centrifugation (16100xg, 8 min) and lyophilized for long-term storage.
  • PVA polyvinyl alcohol solution
  • Gd-DTPA-loaded PLGA nanoparticles were prepared by a modified double-emulsion solvent evaporation method. 5 mg of diethylenetriaminepentaacetic acid anhydride (DTPAa) was added to 1 ml of PLGA nanoparticles in a concentration of 10-50 mg / ml, homogenized using an Ultra-Turrax (17000 rpm, 1 min) and stirred at 600 rpm for 3 h , Subsequently, the DTPA-conjugated PLGA nanoparticles were washed three times by centrifugation (16100xg, 8 min) and redispersion in 1 ml of water.
  • DTPAa diethylenetriaminepentaacetic acid anhydride
  • Rhodamine B / Rhodamine 123 was dissolved in 1 ml of ethyl acetate (0.5 mg / ml), added to 2.5 ml of a PLGA solution (in 100 mg / ml ethyl acetate) and 5 ml of a 1% PVA solution mixed. The homogenization was then carried out with the help of the Ultra-Turraxes (17000 rpm, 5 min). This primary emulsion was placed in 20 ml of a 1% PVA solution and stirred for 18 h (550 rpm) to allow the solvent to evaporate. Subsequently, the nanoparticles were washed three times by centrifugation (16100xg, 8 min) with ultrapure water and freeze-dried for long-term storage.
  • Particle size and polydispersity index (PDI) were determined by dynamic light scattering (DLS). DLS and zeta potential analyzes were performed using a Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK). An aliquot (15 ⁇ ) of the samples was mixed with 2 ml ultrapure water and the light scattering at 25 ° C and a scattering angle of 90 degrees determined. The nanoparticle content of the suspension was determined gravimetrically. The concentration of Gd was measured by atomic absorption spectroscopy. The morphology of the nanoparticle surface was determined by scanning electron microscopy (Hitachi, S 4500 SEM). The loading of nanoparticles with Gd was determined by MRI.
  • DLS and zeta potential analyzes were performed using a Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK). An aliquot (15 ⁇ ) of the samples was mixed with 2 ml ultrapure water and the light scattering at 25 ° C and

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Nanopartikel, umfassend einer Gadoliniumverbindung und/oder inkorporiertes Perfluorooctylbromid, zur Verwendung als Kontrastmittel in einer Magnetresonanztomographie (MRT) gestützten Diagnose von Lebererkrankungen, insbesondere von Hepatozellulärem Karzinom (HCC). Die erfindungsgemäßen PLGA und HSA Nanopartikel wurden mit einer Gadoliniumverbindung (Gd-DTPA) beladen und konnten erfolgreich zur verbesserten Kontrastierung in der MRT von HCC eingesetzt werden. Weiterhin beschreibt die Erfindung neuartige Kontrastmittel beinhaltend die erfindungsgemäßen Nanopartikel, insbesondere zur Verwendung in der Diagnose, Überwachung und/oder Früherkennung von HCC. Weiterhin wird ein Verfahren zur Diagnose, Überwachung und/oder Früherkennung von HCC bereitgestellt.

Description

Nanopartikel als MRT-Kontrastmittel zur Diagnostik des Hepatozellulären Karzinoms
Die vorliegende Erfindung betrifft Nanopartikel, umfassend einer Gadoliniumverbindung und/oder inkorporiertes Perfluorooctylbromid, zur Verwendung als Kontrastmittel in einer Magnetresonanztomographie (MRT) gestützten Diagnose von Lebererkrankungen, insbesondere von Hepatozellulärem Karzinom (HCC). Die erfindungsgemäßen PLGA und HSA Nanopartikel wurden mit einer Gadoliniumverbindung (Gd-DTPA) beladen und konnten erfolgreich zur verbesserten Kontrastierung in der MRT von HCC eingesetzt werden. Weiterhin beschreibt die Erfindung neuartige Kontrastmittel beinhaltend die erfindungsgemäßen Nanopartikel, insbesondere zur Verwendung in der Diagnose, Überwachung und/oder Früherkennung von HCC. Weiterhin wird ein Verfahren zur Diagnose, Überwachung und/oder Früherkennung von HCC bereitgestellt.
Beschreibung
Trotz der Fortschritte in den letzten Jahren ist die Therapie solider Tumore, zu denen auch das hepatozelluläre Karzinom (HCC) gehört, in fortgeschrittenen Stadien bisher noch immer unbefriedigend. Das HCC ist weltweit das fünfhäufigste Malignom und, aufgrund der erst späten Diagnose und dann fehlender erfolgversprechender Therapieoptionen, die dritthäufigste Ursache krebsbedingter Mortalität; mit steigender Inzidenz (El-Serag et al 2007). Das HCC entwickelt sich in der Regel auf dem Boden einer Leberzirrhose, die durch eine chronische Hepatitis entsteht. Wichtige Ursachen für eine Leberzirrhose sind Hepatitis B- und Hepatitis C- Virusinfektionen, Aflatoxin und Alkoholabusus.
Kurative Therapieansätze des HCC sind die Lebertransplantation oder Resektion. Während die Transplantation in den BCLC-Stadien 0, A und ggf. B durchgeführt werden kann, ist die Tumorresektion nur im Stadium 0 sinnvoll. Die verbleibenden, höher gradigen Tumorstadien können nur durch lokalablative Verfahren (LITT, TACE) oder systemische Therapie palliativ (Chemotherapie mit Sorafenib) behandelt werden. Die frühe Diagnosestellung ist daher für eine erfolgreiche Therapie ausschlaggebend. Als System der Standardfrüherkennung („HCC- Surveillance") hat sich die halbjährliche Ultraschalluntersuchung und die Bestimmung des Tumormarkers α-Fetoprotein etabliert (Greten und Manns, 2008). Dieses führt in der Regel jedoch erst ab einem Tumordurchmesser von ca. 1,5 cm zur Diagnosestellung. Serum-Spiegel von α-Fetoprotein sind allerdings für die Diagnosestellung aufgrund zu geringer Sensitivität und Spezifität ungeeignet (Daniele et al, 2004).
Eine Verbesserung der Überwachung von Patienten mit hohem Risiko für die Entwicklung eines HCCs, d. h. Patienten mit Leberzirrhose, sowie der Diagnostik verdächtiger Knoten sind von zentraler Bedeutung für eine deutliche Verbesserung der Prognose von HCC Patienten. Di e zuverlässigste bildgebende HCC-Diagnostik ermöglicht die dynamische Kontrast- Kernspin-Tomographie (Kontrast-MRT) sowie die Kontrast-Computertomographie. HCCs zeigen bei diesen Untersuchungen aufgrund der Versorgung über die A. hepatica ein charakteristisches arterielles An- und venöses Ab stromverhalten, welches durch die niedermolekularen Kontrastmittel genutzt wird (Magnevist®, Primovist®). Kleine HCCs weisen jedoch selten die typischen radiologischen Kriterien auf und sind eher hypovaskulär aufgrund der bereits reduzierten Versorgung über die Portalvene und der noch nicht ausgebildeten arteriellen Hypervaskularisierung (Nakashima et al, 2007). Somit bleibt die klinisch äußerst bedeutsame Unterscheidung zwischen kleinen HCCs sowie Regenerat- und dysplastischen Knoten in der zirrhotischen Leber weiterhin schwierig.
Tumorgefäße weisen eine erhöhte Permeabilität auf, welche sich insbesondere auf Makromoleküle wie Nanopartikel erstreckt. Da weiterhin der lymphatische Abstrom im Tumorgewebe reduziert ist, können sich in die Blutzirkulation injizierte makromolekulare Substanzen wie Nanopartikel, nicht jedoch niedermolekulare Substanzen, selektiv im Tumorgewebe ablagern. Dieser Effekt wird EPR-Effekt (EPR=„Enhanced Permeability and Retention") genannt (Maeda et al 2001). Bisher ist es jedoch nicht gelungen, allein aufgrund des passiven EPR- Effekts mit Nanopartikel-basierten Kontrastmitteln eine sensitive Darstellung von Malignomen zu erzielen. Hingegen gelang eine sensitive Tumordarstellung in bestimmten Tumormodellen im MRT mit Nanopartikeln, welche an der Oberfläche mit Tumor-spezifischen Liganden modifiziert waren (Veiseh et al, 2009). Die für diesen Ansatz unabdingbare Identifizierung von Tumor-spezifischen Antigenen und deren effektive Nutzung für effektive Liganden sind intensiv, jedoch bisher wenig erfolgreich, beforscht worden.
Die Magnetresonanztomographie (MRT) ist ein bildgebendes Verfahren, das vor allem in der medizinischen Diagnostik zur Darstellung von Struktur und Funktion der Gewebe und Organe im Körper eingesetzt wird. Die Magnetresonanztomographie basiert auf sehr starken Magnet- feldern sowie elektromagnetischen Wechselfeldern im Radiofrequenzbereich, mit denen bestimmte Atomkerne (meistens die Wasserstoffkerne/Protonen) im Körper resonant angeregt werden, die dann im Empfängerstromkreis elektrische Signale induzieren. Kontrastmittel dienen dabei zur Verbesserung der Darstellung von Strukturen und Funktionen von Geweben/Organen im MRT. Bei der Magnetresonanztomografie kommen als Kontrastmittel vorrangig Gadolinium-Chelate zum Einsatz, die wegen der paramagnetischen Eigenschaft des Gadoliniumatoms zu einer Verkürzung der Relaxationszeiten in der Nähe des Kontrastmittels und damit zu einer helleren (signalreicheren) Darstellung von Strukturen führen.
Biodegradation und Biokompatibilität sind essentielle Eigenschaften von humankompatiblen Nanopartikeln. Nanopartikel aus den Polymeren Human-Serum-Albumin (HSA) oder Po- ly(D,L-lactic-co-glycolic)acid (PLGA) werden gut toleriert. Es kommt zu keiner unerwünschten langfristigen Akkumulation dieser Trägersysteme im Körper, da die Nanopartikel vom Körper abgebaut werden. Die vorhandenen funktionellen Gruppen auf der Partikeloberfläche erlauben die Konjugation mit verschiedenen Liganden für ein spezifisches Targeting.
Human-Serum-Albumin (HSA) Nanopartikel basierte Kontrastmittel sind aus dem Stand der Technik bekannt. So zeigen Stollenwerk und Kollegen die Synthese von Albumin- Polylactatsäure Nanopartikeln als Träger von Gadolinium. Diese Partikel sollen als Magnetresonanzkontrastmittel verwendet werden. Obgleich keine klinische Anwendung der hergestellten Partikel nahegelegt wurde, konnte jedoch nachgewiesen werden, daß die Albumin basierten Nanopartikel nicht toxisch, nicht thrombogen und nicht immunogen reagieren (Stollenwerk MM et al. 2010).
Doiron und Kollegen beschreiben die Verwendung von, unter anderen, PLGA-basierten Mik- ropartikeln als Kontrastmittel für MRT Anwendungen. Als Kontrastsubstanz wurde Gd- DTPA in die PLGA-Mikropartikel mit einem Durchmesser von 900-1800 nm eingeschlossen. Zur Testung des so gewonnenen Kontrastmittels wurden eine Suspension von Agarose und den Mikropartikeln analysiert. Es wurden keine Analysen an lebendem Gewebe oder gar Mausmodellen durchgeführt (Doiron AL et al. 2009).
In der Diagnostik der Arteriosklerose ist zudem die Verwendung von PLGA und Poly lactic acid-polyethylen glycol (PLA-PEG) basierten Nanopartikeln bekannt. Doiron und Kollegen beschreiben die Herstellung solcher Nanopartikel sowie deren Beladung mit Gd-DTPA. Das nanopartikuläre Kontrastmittel wurde zudem in-vitro auf Zytotoxizität und Stabilität der Partikel überprüft. In-vivo Daten zu diagnostischen Verfahren sind in diesem Dokument nicht enthalten (Doiron AL et al. 2008).
Zur Visualisierung oder Behandlung von Gehirntumoren konnte die Verwendung von Nanopartikeln basierend auf einem Eisenoxidkern als vorteilhaft nachgewiesen werden, die eine spezifisch tumorbindende Substanz (Chlorotoxin), ein Fluorophor und ein Biopolymer enthalten. Die beschriebenen Partikel passieren die Blut/Gehirn- Schranke in einem Maustumormodell und akkumulierten im Tumorgewebe (Veiseh O et al. 2009).
Chen et al. beschreiben die Herstellung und Verwendung von Gd-DTPA beschichteten PLA- PEG Nanopartikeln als Kontrastmittel in der MRT. Insbesondere schlagen die Autoren die Verwendung dieser Nanopartikel zur Visualisierung von Leberkarzinomen (HCC) vor. Eine Kontrastierung von Tumorgewebe mittels der Nanopartikel wird in dieser Studie jedoch nicht gezeigt (Chen Z et al. 2009).
Ausgehend vom Stand der Technik war es deshalb die Aufgabe der Erfindung, neue Möglichkeiten zur Diagnose, Prognose und insbesondere zur Früherkennung des hepatozellulären Karzinoms (HCC) sowie zur Überwachung einer Therapie einer solchen Erkrankung zur Verfügung zu stellen. Dabei soll vor allem die Technik der Magnetresonanztomographie in der Diagnose des HCC verbessert werden. Des Weiteren soll die vorliegende Erfindung ein neuartiges MRT -Kontrastmittel anbieten, welches den derzeit für die Darstellung des HCC im MRT zur Verfügung stehenden Kontrastmittel an Spezifität und Sensitivität übertrifft. Damit ist eine frühere Erkennung auch kleiner HCC möglich und zudem die Differenzierung von HCC und zirrhotischen Regeneratknötchen und anderen gutartigen Veränderungen erlaubt.
Gelöst wird die oben gestellte Aufgabe in einem ersten Aspekt durch einen Nanopartikel zur Verwendung als Kontrastmittel in einem Verfahren zur Diagnose, Prognose und Früherkennung einer Erkrankung sowie zur Überwachung einer Therapie einer Erkrankung, umfassend ein paramagnetischer Stoff.
Bevorzugt sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Nanopartikel, die aus einer Matrix von Human-Serum- Albumin (HSA) oder PLGA aufgebaut sind. Nutzbar im Kontext der vorliegenden Erfindung sind paramagnetische Stoffe, wie beispielsweise freie Radikale (zum Beispiel stabile Nitrooxide), wie auch Elemente aus den Übergangsmetallen, Lanthanoide und den Aktiniden, die, soweit gewünscht, kovalent oder nicht- kovalent an Komplexbildner (Chelatoren) oder Aminosäure-haltigen Makromoleküle gebunden sein können. Insbesondere bevorzugt werden Elemente ausgesucht aus der Gruppe beinhaltend Gd(III), Mn(II), Cu(II), Cr(III), Fe(II), Fe(III), Co(II), Er(II), Ni(II), Eu(III) and Dy(III). Besonders bevorzugte Elemente sind Gd(III), Mn(II), Cu(II), Fe(II), Fe(III), Eu(III) and Dy(III), insbesondere Mn(II) und Gd(III).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße Nanopartikel einen paramagnetischen Stoff als Verbindung eines Elements ausgesucht aus der Gruppe der Lanthanoide. Besonders bevorzugt ist dabei, daß die Lanthanoidverbindung eine Gadoliniumverbindung ist.
Vorzugsweise ist der paramagnetische Stoff der erfindungsgemäßen Nanopartikel komple- xiert. Bevorzugte Chelatoren der vorliegenden Erfindung umfassen: Acetylaceton (acac), Ethylendiamin (en), 2-(2-Aminoethylamino)ethanol (AEEA), Diethylentriamin (dien), Imino- diacetat (ida), Triethylentetramin (trien), Triaminotriethylamin, Nitrilotriacetat (nta), Ethylen- diaminotriacetat (ted), Ethylendiamintetraacetat (edta), Diethylentriaminpentaacetat (DTPA) 1,4,7, 10-Tetraazacyclododecan-1, 4,7, 10-tetraacetat (DOTA), Oxalat (ox), Tartrat (tart), Citrat (cit), Dimethylglyoxim (dmg), 8-Hydroxychinolin, 2,2'-Bipyridin (bpy) and 1, 10- Phenanthrolin (phen).
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung in einer nächsten bevorzugten Ausführungsform einen Nanopartikel, wobei die Gadoliniumverbindung ein Komplex aus Gadolinium und einem Chelator ist, insbesondere wobei der Chelator ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und 1,4,7, 10-Tetraazacyclododecan- 1,4,7, 10- tetraessigsäure (DOTA). Vorzugsweise ist die Gadoliniumverbindung Gd-DTPA, oder Derivate dieser Verbindung, wie beispielsweise Gd-EOB-DTPA (Primovist®)
Als„Chelator" im Kontext der vorliegenden Erfindung soll ein Ligand mit mehr als einem freien Elektronenpaar verstanden werden, der mindestens zwei Koordinationsstellen (Bindungsstellen) eines Zentralatoms, hier insbesondere eines Gadoliniumatoms, einnehmen kann. Liganden und Zentralatom sind über koordinative Bindungen verknüpft. Das bedeutet, das bindende Elektronenpaar wird allein vom Liganden bereitgestellt. Der Gesamtkomplex von Zentralatom und Ligand wird als„Chelatkomplex" bezeichnet.
Bevorzugt ist im Rahmen der hier beschriebenen Erfindung, daß der paramagnetische Stoff, also insbesondere die Gadoliniumverbindung, sowohl im Nanopartikel inkorporiert vorliegen kann und/oder auch an die Oberfläche des Nanopartikel kovalent oder nicht-kovalent, zum Beispiel adsorptiv, gebunden sein kann.
Die Bindung der Gadoliniumverbindung an eine HSA-Partikelmatrix erfolgt beispielsweise durch die Verwendung von n-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC). Die hierbei zugrunde liegende Idee liegt in der Einführung eines Linkers, der eine kovalente Bindung zwischen dem Partikel und der Gadoliniumverbindung„vermittelt". Hierbei müssen beide Moleküle mit dem Linker reagieren. Die Bindung der Gadoliniumverbindung (z.B. Gd- DTPA) an die Oberfläche der PLGA-Nanopartikel erfolgt nach Einführung von Aminogrup- pen im gleichen Verfahren, wie unter der Bindung an HSA Nanopartikeln mittels EDC beschrieben.
Darüber hinaus ist es bevorzugt, daß die erfindungsgemäßen Nanopartikel weiterhin inkorporiertes Perfluorooctylbromid und/oder Gd-DTPA enthalten.
Der Nanopartikel der hier beschriebenen Erfindung kann bevorzugterweise weiter modifiziert werden. Beispielsweise wird bei einer bevorzugten Modifikation der Erfindung der Nanopartikel mit Tensiden überzogen, oder mit einem tumorspezifischen Liganden konjugiert.
Modifikationen von Nanopartikeln konnten insbesondere in Verbindung mit dem Transport von Arzneistoffen über die Blut/Gehirn-Schranke als vorteilhaft nachgewiesen werden. Im Kontext der Erfindung ist es daher erwünscht, daß die erfindungsgemäßen Nanopartikel und/oder Kontrastmittel gemäß der zu diagnostizierenden Erkrankung modifiziert werden können. Dies kann einerseits durch einen Überzug der Nanopartikel mit speziellen Tensiden (Polysorbat 80, bzw. Poloxamer 188; Gelperina et al. 2002) erreicht werden, oder durch An- bindung von speziellen Liganden wie Apolipoprotein A-l und E (Zensi et al. 2009), Transfer- rin, Insulin oder Antikörpern gegen die entsprechenden Rezeptoren (Ulbrich et al. 2009, Ul- brich et al. 2010), nicht hingegen durch PEGylierung. PEGylierung der Nanopartikel kann jedoch zur Verlängerung der Zirkulationszeit der Nanopartikel im Blut vorteilhaft sein. Modifikationen, um einen gezielten Transport der Nanopartikel an den Tumor zu ermöglichen, sind bekannt. Nach Bindung von Doxorubicin an derartige Nanopartikel konnte in Ratten, denen das äußerst aggressiven Glioblastoms 101/8 transplantiert wurde, welches in hohem Maße menschlichen Grade 4-Glioblastomen entspricht, nach intravenöser Injektion der Partikel eine wesentliche Lebenszeitverlängerung, bzw. ein vollständiges Verschwinden des Tumors erreicht werden (Steiniger et al. 2004).
Somit richtet sich eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung auf einen Nanopartikel, der mit einem tumorspezifischen Liganden gekoppelt wird, wobei der tumorspezifische Li- gand ausgewählt ist aus der Gruppe beinhaltend Transferrin, ein Antikörper gegen den Trans- ferrinrezeptor, Insulin, ein Antikörper gegen den Insulinrezeptor und Folsäure. Im Rahmen der Erfindung sind alle solchen Substanzen als Liganden bevorzugt, die eine gezieltes„targe- ting" der Nanopartikel an den Tumor ermöglichen, insbesondere Liganden, die den Nanopartikel gezielt an HCC binden.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel sollen bevorzugt als Kontrastmittel in einem Magnetre- sonanztomografieverfahren eingesetzt werden. Insbesondere in einer Magnetresonanztomographie zur Diagnose, Prognose und/oder Überwachung einer Erkrankung.
Die Erfinder haben überraschenderweise entdeckt, daß die hier beschriebenen Nanopartikel eine besonders gute Kontrastierung des HCC im Gegensatz zu dem umgebenden Leberparen- chym und nicht-malignen Lebergewebslesionen aufweisen. Da Tumorgefäße eine erhöhte Permeabilität aufweisen und weiterhin der lymphatische Abstrom im Tumorgewebe reduziert ist, können sich in die Blutzirkulation injizierte makromolekulare Substanzen nicht jedoch niedermolekulare Substanzen, selektiv im Tumorgewebe ablagern - dies ist der EPR Effekt. Die Nanopartikel der vorliegenden Erfindung weisen besonders überraschend vorteilhafte Eigenschaften auf, die eine durch den EPR Effekt verursachte Kontrastierung des HCC begünstigen.
Häufig weisen niedermolekulare Substanzen sowie Makromoleküle wie Nanopartikel in Malignomen eine erniedrigte Penetration auf (Jain und Stylianopoulos, Delivering nanomedicine to solid tumors. Nat Rev Clin Oncol 2010;doi: 10.1038/nrclinonc.2010.139). Somit könnte die Nanopartikel-basierte Kontrastierung der Tumore auch auf einer verminderten Akkumulation der Nanopartikel-basierten Kontrastmittel im Tumor beruhen. Da die Akkumulation der Nanopartikel einige Stunden in Anspruch nimmt, ist zu erwarten, dass die Kontrastierung der Tumore durch die Nanopartikel zunächst auf einer verminderten Akkumulation der Nanopartikel im Tumor beruht, welche sich unter dem Einfluss des EPR-Effekts ausgleicht bzw. umkehrt. Dies sollte ein Charakteristikum von Malignomen wie HCCs sein.
Um eine gute Diagnose von HCC, sowie insbesondere eine hohe Auflösung der Bilder in der MRT zu ermöglichen, ist es bevorzugt, die Nanopartikel und/oder Kontrastmittel der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit einem 3-Tesla-Tomographen in der MRT einzusetzen.
Die Nanopartikel der Erfindung können zur Kontrastierung, und damit zur Diagnose, einer Vielzahl von Erkrankungen herangezogen werden. Dabei sind Erkrankungen bevorzugt, die mit einer Störung der Barrierefunktion der Gefäße und vermindertem lymphatischen Abfluss in der pathologisch veränderten Region in Zusammenhang stehen. Dies trifft auf die meisten soliden Malignome zu, insbesondere das Mamma-Karzinom, Kolon-Karzinom, Pankreaskarziom, Magenkarzinom, Ovarial-Karzinom, Gallenwegs-Karzinom, Prostata-Karzinom, Zer- vic-Karzinom, Glioblastom oder auch Tumormetastasen.
Aufgrund der vorteilhaften Effekte ist es aber besonders bevorzugt, daß die zu diagnostizierende Erkrankung eine Lebererkrankung ist, insbesondere eine Zirrhose und/oder ein hepato- zelluläres Karzinom (HCC). Dabei ermöglicht es der Aufbau der erfindungsgemäßen Nanopartikel und/oder Kontrastmittel, dass diese in der Früherkennung eines hepatozellulären Karzinoms verwendet werden können, insbesondere zur Erkennung eines hepatozellulärem Karzinoms einer Größe kleiner als 1,5 cm. Eine Darstellung solch kleiner HCC ist bisher nicht über die bekannten MRT Verfahren möglich gewesen. Daher können die Nanopartikel der Erfindung besonders zur Diagnose von HCC in einem frühen Stadium herangezogen werden. Eine Therapie ist für einen Patienten, der in einem frühen Stadium mit HCC diagnostiziert wurde, durch eine signifikant verbesserte Prognose gekennzeichnet, und daher besonders vorteilhaft.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist es bevorzugt, daß die erfindungsgemäßen Nanopartikel kleiner als 500 nm sind, vorzugsweise kleiner als 300 nm sind und besonders bevorzugt eine Größe von 100 - 300 nm aufweisen. In einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die oben gestellte Aufgabe durch ein Kontrastmittel zur Verwendung in der Magnetresonanztomographie gelöst, das einen Nanopartikel der oben beschriebenen Erfindung umfaßt. Die Formulierung und Zusammensetzung pharmazeutisch verträglicher Kontrastmittel, insbesondere mit Hinblick auf eventuelle allergische Reaktionen sind dem Fachmann bekannt und dem einschlägigen Stand der Technik zu entnehmen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Kontrastmittel weiterhin ein Tumorhoming-Peptid, insbesondere iRGD. Dabei kann das iRGD parallel mit den Nanopartikeln verabreicht werden, oder auch an die Nanopartikel gekoppelt und/oder in den Nanopartikeln inkorporiert vorliegen. Kürzlich ist in unterschiedlichen Tumormodellen gezeigt worden, dass ein intravenös appliziertes Tumor-Homing Peptid (CRGDK/RGPD/EC, iRGD) die Penetration von nieder- und hochmolekularen Substanzen selektiv im Tumorstroma in verschiedenen Tumormodellen verbessert (Sugahara et al, 2009; 2010). iRGD besteht aus einem RGD-Motiv, welches an Integrin av, einem bevorzugt im Endothel von Tumorgefäßen exprimierten Integrin (Ruoslahti, 2002) und einem CendR-Motiv, welches an Neuropilin- 1 bindet. Die Bindung von CendR und Neuropilin ist für den erhöhten tumorselektiven Penetrationseffekt erforderlich. Bemerkenswerterweise hält diese erhöhte Penetrierbarkeit für mehrere Tage nach iRGD- Applikation an (Sugahara et al, 2010).
Zirrhotisches Lebergewebe weist im Vergleich zur normalen Leber erhöhte Spiegel von Neuropilin- 1 auf (Cao et al, 2010); ferner wird die Tetrachlorkohlenstoff-induzierte Leberfibrose in der Maus durch Neuropilin- 1 verstärkt (Cao et al, 2010). Da iRGD die Penetration des Tumorstromas im HCC verbessert, ist eine verstärkte Extravasaten der Nanopartikel sowie eine Verstärkung des EPR-Effekts zu erwarten, was eine Verbesserung der Spezifität und/oder der Sensitivität der Kontrastmittelanreicherung in malignem HCC-Gewebe zur Folge hat.
In einer weiteren Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Kontrastmittel zudem Mittel enthalten, die eine Erhöhung des Blutdrucks des zu diagnostizierenden Subjekts - eines Patienten - bewirken. So konnte nachgewiesen werden, daß eine Steigerung des Blutdrucks zur einer Verstärkung des EPR Effekts führt. Dies ermöglicht eine verbesserte Kontrastierung und somit eine spezifischere und sensitivere Diagnose. Mithin ist es besonders bevorzugt, daß das erfindungsgemäße Kontrastmittel Angiotensin II enthält. Eine weitere Möglichkeit die Ak- kumulation der Nanopartikel zu ermöglichen besteht darin, dass bevorzugt Stickoxid (NO) Donatoren, wie beispielsweise Glyceryltrinitrat (GNT) im erfindungsgemäßen Kontrastmittel enthalten ist.
In einer weiteren Ausführung der Erfindung kann das Kontrastmittel ein physiologisch verträgliches wäßriges Medium enthalten.
Das Kontrastmittel der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt in Form einer Injektionslösung bereitgestellt.
In einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein erfindungsgemäßer Nanopartikel und/oder ein erfindungsgemäßes Kontrastmittel bereitgestellt, das geeignet ist, eine Differenzierung zwischen hepatozellulärem Karzinom und zirrhotischen Regeneratknötchen in einem Magnetresonanztomographieverfahren zu ermöglichen. Des Weiteren kann ein erfindungsgemäßer Nanopartikel und/oder ein erfindungsgemäßes Kontrastmittel zur Differenzierung zwischen HCC und Leberzirrhose verwendet werden.
In einem vierten Aspekt wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren zur Diagnose, Überwachung und/oder Früherkennung von hepatozellulärem Karzinom gelöst, umfassend, Verabreichen eines erfindungsgemäßen Kontrastmittels an ein Subjekt und eine anschließende MRT Untersuchung des Subjekts. Dabei wird die MRT Untersuchung bevorzugt mittels eines 3-Tesla Tomographen vorgenommen. Ein Subjekt im Kontext der Erfindung ist dabei bevorzugtermaßen ein Mensch (ein Patient), insbesondere ein Patient bei dem eine Zirrhose und/oder HCC vermutet wird, oder bei dem eine Vorsorge- oder Nachsorgeuntersuchung für HCC vorgenommen werden soll.
Die vorliegende Erfindung kann allgemein zur Bildaufnahme mittels eines MRT bei einem Patienten verwendet werden. Der Bildaufnahme Vorgang wird dabei folgendermaßen durchgeführt: zunächst wird einem Patienten eine ausreichende Menge des erfindungsgemäßen Kontrastmittels verabreicht, um dann einen Scan des Patienten mittels Magnetresonanztomographie vorzunehmen. Somit werden Bilder der inneren Strukturen des Patienten die von Interesse sind, insbesondere der erkrankten Gewebe, aufgenommen. Das erfindungsgemäße Kontrastmittel ist zur Visualisierung von Lebergeweben besonders hilfreich, kann aber auch zur Aufnahme von Bildern andere Regionen verwendet werden. Die Verabreichung des Kontrastmittels kann in jeder dem Fachmann bestens bekannter Art und Weise vorgenommen werden. Dies beinhaltet insbesondere die intravenöse, intrakardiale (Herzinjektion), orale, rektale usw. Verabreichung von verschiedenen Formulierungen des Kontrastmittels. Die notwendige Dosis des Kontrastmittels wird entsprechend dem Alter, der Größe und des Gewichts des Patienten, sowie der zu Untersuchenden Körperregion variiert.
Die Kontrastmittel der Erfindung können dabei sowohl alleine als auch in Kombination mit anderen diagnostischen, therapeutischen oder anderen Substanzen verwendet werden. Unter „anderen Substanzen" werden dabei insbesondere pharmazeutische Hilfsstoffe, Geschmacksstoffe oder Färbemittel verstanden. So können beispielsweise einer oral verabreichten Formulierung Saccharose oder ein natürliches Zitrusaroma beigemischt werden. Weiterhin ist es bevorzugt, daß das erfindungsgemäße Kontrastmittel in Liposomen oder anderen pharmazeutischen Trägern eingeschlossen werden kann.
In einem fünften Aspekt wird außerdem die Verwendung der oben beschriebenen Nanoparti- kel und/oder Kontrastmittel in einem MRT Verfahren bereitgestellt. Insbesondere ist eine Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel und/oder Kontrastmittel zur Diagnose, Prognose und/oder Früherkennung eines HCC, und/oder die Überwachung einer Therapie einer solchen Erkrankung gestützt auf eine MRT bevorzugt.
Die vorliegende Erfindung soll im Folgenden anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Abbildungen näher erläutert werden, ohne daß die Erfindung dadurch eingeschränkt wird.
Abbildung 1 : Physiko-chemische Eigenschaften (Partikelgröße und Polydispersität) von
PLGA 502H Nanopartikeln in Abhängigkeit von deren Beladung mit Gadolinium.
Abbildung 2: Physiko-chemische Eigenschaften (Partikelgröße und Polydispersität) von
PLGA 504H Nanopartikeln in Abhängigkeit von deren Beladung mit Gadolinium.
Abbildung 3 : MRT- Aufnahme bei einer Wiederholungszeit von 100 ms. Abbildung 4: Applikation von Kontrastmitteln im HCC Mausmodel. In allen Anwendungen wurde die gleiche Menge von Gd-DTPA verwendet. Rote Kreise heben die HCCs hervor. Maus 1 : MRT der Leber einer TGFalpha/c-myc Maus direkt nach Injektion mit Primovist® (Oh), sowie nach 24h. Primovist® kann durch Transportproteine in normale Leberzellen und Tumorzellen eindringen und kontrastiert so zuerst die Gefäße und dann sowohl den Tumor als auch das umliegende Leberparenchym. Maus 2: MRT der Leber einer TGFalpha/c-myc Maus direkt nach Injektion mit Magnevist® (Oh), sowie nach 24h. Zwei Tage später erhielt diese Maus eine Injektion mit Primovist® und anschließende MRT, die zeigt, daß Primovist® sensitiver ist als Magnevist®. Maus 3 : Diese Maus wurde mit Primovist® behandelt und direkt analysiert. Danach erhielt die Maus 48h später Gd-DTPA-PLGA Nanopartikel und wurde direkt nach Injektion, sowie 24h und 64h später vermessen.
Abbildung 5: Signal Inten sitäts- Verhältnis (SIR) von Tumorgewebe zu Leberparenchym von Gd-EOB-DTPA im Vergleich zu Gd-DTPA-PLGA Nanopartikel
Abbildung 6: Kontrast zu Hintergrund Verhältnis (CNR) von Tumorgewebe zu Leberparenchym von Gd-EOB-DTPA im Vergleich zu Gd-DTPA-PLGA Nanopartikel
Abbildung 7: Aufnahme Fluoreszenz-markierter Nanopartikel in der Leber. (A) PLGA- NP -Rhodamine-markierte Nanopartikel. (B) HSA-NP-Rhodamine-markierte nanopartikel.
Abbildung 8: MRT Aufnahme nativ und mit NP-HSA-Gd-Rhodamine: HCC in der nativ- Aufnahme des selben Tumors, welcher ohne Kontrastmittel nicht zu erkennen ist. Beispiele
Beispiel 1 : Gadolinium-DTPA PLGA Nanopartikel 1. Synthese der Gd-DTPA-PLGA-Nanopartikel
PLGA-Nanopartikel mit kovalent gekoppeltem Gadolinium-DTPA
Folgend werden PLGA-Nanopartikel mit kovalent gekoppeltem Gadolinium-DTPA (unbela- dene PLGA-NP hergestellt mittels Emulsions-Diffusions-Evaporation, Aminogruppen eingeführt mittels EDC und 1,4-Diaminobutan, Gd-DTPA gebunden mittels EDC) beschrieben:
Die Herstellung von unbeladenen PLGA-Nanopartikeln erfolgte mittels Emulsions- Diffusions-Evaporation. Hierzu wurden 500 mg Resomer® RG 502H (Intrinsische Viskosität i.v. = 0, 16-0,24 dl/g, Boehringer Ingelheim, Biberach, Deutschland) oder Resomer® RG 504H (i.v. = 0,45-0,60 dl/g, Boehringer Ingelheim, Biberach, Deutschland) in 5 ml Ethylacetat gelöst.
Die organische Phase wurde mit 10 ml einer wässrigen, 1% stabilisierten Polyvinylalkohol (PVA, Mr 30.000-70.000 Da, Hydrolysegrad 96,8-97,6%, Esterzahl 30-40, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) Lösung mittels eines Ultra- Turrax (Ultra Turrax® T25, IKA- Labortechnik, Staufen, Deutschland) bei 17.000 U/min 5 min emulgiert.
Die Emulsion wurde zu einer rührenden PVA-Lösung (550 U/min) in einem 100 ml Weithal- serlenmeyerkolben gegeben. Hierdurch diffundiert das Ethylacetat in die wässrige Phase und das Polymer fällt aus. Durch offenes Rühren über Nacht (-12 h) wurde das Ethylacetat durch Verdampfung aus der Lösung entfernt.
Die entstandenen Nanopartikel wurden durch Zentrifugation (16.100 g 8 min; Zentrifuge 5804R, Eppendorf, Hamburg, Deutschland), Austausch des Überstandes mit MilliQ-Wasser und Resuspendierung mittels Ultraschall aufgereinigt (Ultraschallbad Transsonic Digital, Elina, Singen, Deutschland). Der Aufreinigungszyklus wurde dreimal wiederholt. Beim letzten Aufreinigungszyklus wurden die Nanopartikel aufkonzentriert, indem eine Resuspendierung in der Hälfte des ursprünglichen Suspensionsvolumens getätigt wurde. Der genaue Nanopar- tikelgehalt wurde gravimetrisch bestimmt (s.u.). 15 mg/ml PLGA-Nanopartikel wurden mit dem MES-Puffer auf einen geeigneten pH- Wert von 5,5 bis 6,5 gebracht. Zu 1 ml der PLGA-Nanopartikellösung wurden 50 μΐ (24 mg/ml) einer EDC-Lösung (l-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)Carbodiimid-Hydrochlorid; Fluka, Buchs, Schweiz) und 50 μΐ (36 mg/ml) einer N-Hydroxysuccinimid (Fluka, Buchs, Schweiz) hinzugefügt. Nach einer Reaktionszeit von 30 min bei 20°C und 650 U/min im Thermomixer (Thermomixer 5437, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) wurde der pH- Wert mittels 700 μΐ eines Phosphatpuffers pH 8 ins leicht alkalische gebracht und 100 μΐ (75 mg/ml) einer 1,4- Diaminobutan-Hydrochlorid-Lösung (Fluka, Buchs, Schweiz) dazugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2 h bei 20°C und 650 rpm im Thermomixer geschüttelt und anschließend das überschüssige und noch nicht reagierte EDC mit 100 μΐ (50 mg/ml) Hydroxylamin- Hydrochlorid abgestoppt.
Die Nanopartikel wurden anschließend aufgereinigt. Dies erfolgte wie oben beschrieben durch Zentrifugation, Austausch des Überstandes mit MilliQ-Wasser. Nach 2 Aufreinigungszyklen wurde der Nanopartikelgehalt gravimetrisch bestimmt.
1 ml (10 mg/ml) Gadolinium-DTPA-Lösung wurde mit 50 μΐ (24 mg/ml) einer EDC-Lösung (l-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)Carbodiimid-Hydrochlorid; Fluka, Buchs, Schweiz) und 50 μΐ (36 mg/ml) einer N-Hydroxysuccinimd (Fluka, Buchs, Schweiz) versetzt. Diese Mischung wurde unter Li chtausschluss 15 min bei 20°C im Thermomixer (Thermomixer 5437, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bei 650 U/min geschüttelt. Im Anschluss wurde zu der Lösung 750 μΐ der Aminogruppen eingeführten PLGA-Nanopartikel (20 mg/ml) hinzugefügt. Diese waren vorab abzentrifugiert und in Phosphatpuffer pH 8 resuspendiert worden, um den pH- Wert des späteren Reaktionsgemisches ins neutrale bis leicht alkalische zu bringen. Es folgte eine Reaktion unter Lichtausschluss im Thermomixer bei den oben genannten Bedingungen. Nach 4 h wurde die Reaktion mit 100 μΐ (50 mg/ml) Hydroxylamin-Hydrochlorid abgestoppt.
Es folgte eine Aufreinigung wie oben beschrieben. Beim dritten Aufreinigungszyklus wurden die Partikel aufkonzentriert.
PLGA-Nanopartikel mit inkorporiertem Perfluorooctylbromid
Nachfolgend werden PLGA-Nanopartikel mit inkorporiertem Perfluorooctylbromid (mittels Emulsions-Diffusions-Evaporation hergestellt) und kovalent gebundenem Gd-DTPA be- schrieben.
Die Herstellung von PLGA-Nanopartikeln mit inkorporiertem Perflourooctylbromid erfolgte mittels Emulsions-Diffusions-Evaporation. Hierzu wurden 500 mg Resomer® RG 502H (Intrinsische Viskosität i.v. = 0, 16-0,24 dl/g, Boehringer Ingelheim, Biberach, Deutschland) oder Resomer® RG 504H (i.v. = 0,45-0,60 dl/g, Boehringer Ingelheim, Biberach, Deutschland) bzw. Resomer® PEG sample (Boehringer Ingelheim, Biberach, Deutschland) in 5 ml Ethylacetat gelöst. Nach Lösung des PLGAs wurde 100 μΐ Perfluorooctylbromid in diesem Ethylacetat gelöst. Um eine gute Einbettung in die PLGA-Matrix zu erhalten wurde die Lösung 1 h bei Raumtemperatur bei 550 U/min in einem geschlossenem System (Falcon-Tube 50 ml, Becton Dickinson, Heidelberg) auf einer Rührplatte (Rührplatte Komet Variomag Poly, Vari- omag, Florida, USA) gerührt.
Die organische Phase wurde mit 10 ml einer wässrigen, 2% stabilisierten Polyvinylalkohol (PVA, Mr 30.000-70.000 Da, Hydrolysegrad 96,8-97,6%, Esterzahl 30-40, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) Lösung mittels eines Ultra- Turrax (Ultra Turrax® T25, IKA- Labortechnik, Staufen, Deutschland) bei 17.000 U/min 5 min emulgiert.
Die Emulsion wurde zu einer rührenden PVA-Lösung (550 U/min) in einem 100 ml Weithal- serlenmeyerkolben gegeben. Hierdurch diffundiert das Ethylacetat in die wässrige Phase und das Polymer fällt aus. Durch offenes Rühren über Nacht (-12 h) wurde das Ethylacetat durch Verdampfung aus der Lösung entfernt.
Die entstandenen Nanopartikel wurden durch Zentrifugation (16.100 g 12 min; Zentrifuge 5804R, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) Austausch des Überstandes mit MilliQ-Wasser und Resuspendierung mittels Ultraschall aufgereinigt (Ultraschallbad Transsonic Digital, Elina, Singen, Deutschland). Der Aufreinigungszyklus wurde dreimal wiederholt.
Die Konzentration der Nanopartikel wurde gravimetrisch über den Trocknungsverlust bestimmt (s.u.).
Mit den Nanopartikeln wurde die Kopplung von Gadolinium-DTPA wie unter 1. beschrieben durchgeführt. Als Ersatz für EDC wurden mit dem Carbodiimid CMC (l-Cyclohexyl-3-(2- Morpholinoethyl)-Carbodiimid) Versuche durchgeführt. Die Reaktionszeiten wurde hierbei auf bis zu 8 h verlängert.
Es wurde als Ersatz für 1,4-Diaminobutan auch mit Cystein-Hydrochlorid gearbeitet. Bei den Versuchen mit DCC wurde Ehylendiamin verwendet.
2. Bestimmung der physiko-chemischen Nanopartikel-Eigenschaften
Die Größe der Nanopartikel wurde über die Photonenkorrelationsspektroskopie PCS (Malvern Zetasizer 3000 HSA, Malvern, Großbritannien) mittels PCS-Küvetten (PCS-Küvetten (10x10x48), Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) bestimmt. Die Größenmessung von zwei Nanopartikel-Herstellungen (PLGA 502H und PLGA 504H) zeigen, dass Partikel im unteren Nanometerbereich entstanden sind (100-300 nm) (Abb. 1 und 2). Für die gemessenen Partikel hergestellt nach der Doppel-Emulsions-Methode ergibt sich eine zufrieden stellende Polydispersität kleiner 0,3 (502H) bzw. 0, 1 (504H) (Abb. 1 und 2). Partikel mit inkorporierten Perflurooctylbromid haben Größe von ungefähr 260 nm und eine Polydispersität von kleiner 0, 1.
Die Konzentration der Nanopartikel wurde gravimetrisch (Analysenwaage Supermicro S4, Sartorius, Göttingen, Deutschland) über den Trocknungsverlust bestimmt. Hierzu wurden 50 μΐ der Nanopartikelsuspension in ein Wägeschiffchen (Aluminium- Wägeschiffchen, VWR, Darmstadt, Deutschland) eingewogen und bis zur Gewichtskonstanz bei 80°C in einem Trockenschrank (Ehret, Emmendingen, Deutschland) getrocknet.
Die Bestimmung der Gd-DTPA-Konzentrationen in den suspendierten Nanopartikeln erfolgte mittels MRT im 3 Tesla-Kernspin-Tomographen.
3. MRT-Aufnahme
Es wurden Aufnahmen bei unterschiedlichen Repetitionszeiten gemacht (50 ms, 100 ms und 200 ms). In Abbildung 3 ist eine MRT-Aufnahme mit einer Repetitionszeit von 100 ms zu sehen.
In einer vorhergehenden Untersuchung wurden Leerpartikel vermessen. Sie waren auf den Aufnahmen nicht zu sehen. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass sie keinen Ein- fluß auf die Messung haben.
Die Belegung des Rasters der MRT Untersuchung entspricht der folgenden Tabelle:
Tabelle 1: Schlüssel der MRT-Aufnahme zu Abbildung 3.
Figure imgf000018_0001
Die Zahlen bedeuten die theoretische Gd-DTPA-Konzentration in der Einheit mg/ml. PLGA bedeutet PLGA-Nanopartikel, HSA bedeutet HSA-Nanopartikel, das "+" Pluszeichen bedeutet kovalent gekoppelt mit z.B. Gd-DTPA.
Die erste Spalte in Abbildung 3 zeigt eine Verdünnungsreihe der reinen Gd-DTPA-Lösung. Die Konzentrationsspanne erstreckt sich von 3 mg/ml bis 0,5 mg/ml Gd.
Man erkennt, dass sowohl die HSA-Nanopartikel als auch die PLGA-Nanopartikel effektiv mit Gd-DTPA beladen sind. Die Gd-DTPA-Konzentration der verwendeten Nanopartikel- Emulsionen betrugen 1,3-1,4 mg/ml.
4. Mäuse
Männliche TGFa/c-myc bitransgene Mäuse wurden durch Kreuzung mit homozygoten MT/TGFa - (Jhappan et al, 1990) und ALB/C-myc (Murakami et al, 1993) einzeltransgenen Mäuse in einem CD13B6CBA Hintergrund erhalten (wie beschrieben in Murakami et al, 1993). Nach der Entwöhnungsphase wurden die Mäuse mit ZnCl2 induziert, um die Expression von TGFa und somit eine beschleunigte Hepatokarzinogenese zur induzieren. 18 bis 22 Wochen nach Start der Zinkbehandlung wurden die Tiere einer Kontrasterhöhten MRT Untersuchung unterzogen. Nach der MRT Untersuchung wurden die Lebern der Tiere präpariert und mikroskopisch nach HCC untersucht. Das Vorhandensein eines HCC wurde durch Gewebeschnitte histopathologisch nachgewiesen.
5. In vivo MRT
Mäuse wurden nach Zinkinduktion durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (60 mg/kg- Körpergewicht) und Xylazin (12 mg/kg-Köpergewicht) anästhesiert. Danach wurde Primo- vist® (Schering) intravenös injiziert und sofort eine MRT der Maus durchgeführt. Jede Maus wurde sowohl vor als auch nach Gabe des Kontrastmittels gescannt. Es wurde ein 3-Tesla Tomograph verwendet (Siemens Magnetom Trio, Siemens Medical Solutions, Erlangen, Deutschland).
Es wurden 200 μΐ des Gd-DTPA-PLGA Kontrastmittels intravenös injiziert (8,5 μιηοΐ Gd- DTPA/kg Körpergewicht) und 200 μΐ von Gd-DPTA (57 μιηοΐ/kg Körpergewicht). Die Mäuse wurden 10 Minuten, 24 Stunden, 44 Stunden und 64 Stunden nach Injektion gescannt.
6. Bildanalyse
Zur Bildanalyse wurde das kommerziell erhältliche Centricity RIS 4. Ii Plus, Version 4.1 (General Electric Company) verwendet.
7. Quantitative Analyse
Die quantitative MRT Analyse der vorliegenden Erfindung basiert auf der Vermessung von Signalintensitäten (SI). Um die Signalintensitäten der Organe darzustellen, wurden zirkuläre geometrische Bereiche, sogenannte operatordefinierte Regionen von Interesse (ROI) in die MRT Bilder eingezogen. Die SI Werte der ROIs wurden als Durchschnittswerte mit einer Standardabweichung dargestellt.
8. Statistische Analyse
Die Daten wurden als Werte der S R (signal-noise-ratio) und der Standardabweichung dargestellt. Die grafische Darstellung folgte über Box Plots, Diagramme und Tabellen. Die aufgenommen Daten wurden mittels eines Kruskal-Wallis-Tests auf Signifikanz untersucht. Bei einem p-Wert von < 0.05 (5%) wurde der Unterschied als signifikant gewertet. Alle statistischen Berechnungen wurden mittels der Software BiAS für Microsoft Windows, Version 09.05 durchgeführt. 9. Darstellung der HCCs im doppelt-transgenen HCC-Mausmodell
Die Durchblutung- und Diffusionsverhältnisse endogener Tumormodelle scheinen eher denen von Karzinomen im Menschen zu entsprechen als diejenige in transplantierten Tumormodellen (Olive et al ., 2009). Dies trifft auch auf das TGFa/c-myc-doppelt-transgene HCC- Mausmodell zu, welches makroskopisch und histologisch das menschliche HCC sehr viel besser widerspiegelt als transplantierte Tumormodelle. Um diese Tumormodelle für diagnostische und therapeutische Zwecke effektiv nutzen zu können, ist die Visualisierung der endogenen Tumore von großer Bedeutung.
In männlichen TGFa/c-myc-doppelt-transgenen Mäusen wird die Hepatokarzinogenese durch Zink im Trinkwasser induziert. Nach Induktion der Hepatokarzinogenese für 20 bis 22 Wochen wurden die Tiere zunächst auf Vorhandensein eines HCC mittels einer Primo- vist®/Magnevist® verstärkten MRT untersucht. Dabei zeigte sich, daß Primovist® eine sensitivere Darstellung des HCC gegenüber Magnevist® ermöglichte. Die HCCs im TGFalpha/c- myc Mausmodel konnten mittels Primovist® kontrastiert werden und korrespondieren zu den 10% humanen HCCs.
Die gleichen Mäuse wurden einen Tag später einer weiteren MRT -Untersuchung unterzogen. Hier zeigte sich, daß die Kontrastierung der HCC durch Primovist® weitgehend verlorengegangen war.
Die Untersuchungen mit den Nanopartikel-basierten Kontrastmitteln erfolgen an TGFa/c- myc-Mäusen im direkten Anschluß an den Nachweis der HCCs mit Primo vi st®- verstärktem MRT. Ungefähr zwei Tage nach den Primo vi st®-kontrastierten MRT- Aufnahmen werden den Tieren Gd-DTPA-PLGA-Nanopartikel intravenös appliziert und eine identische MRT- Sequenz wie zuvor mit Primovist® durchgeführt. Die Aufnahmen wurden densitometrisch ausgewertet. Da die Tumoren in diesem HCC-Modell langsam wachsen, ist die Zunahme der Größe der HCCs in diesen Zeitraum vernachlässigbar.
Überraschenderweise konnte nachgewiesen werden, daß die Kontrastierung der HCC mit den erfindungsgemäßen Gd-DTPA beladenen PLGA-Nanopartikeln signifikant bessere Ergebnisse lieferte (Abbildung 4). Dies ist insbesondere von Vorteil, da die mit den Nanopartikeln injizierte Gd-DTPA-Menge nur ein Achtel der Menge des injizierten Magnevists® oder Pri- movists® betrug. Injektion von 8,5 μπιοΐ/kg Magnevist® oder Primovist® führte zu keiner signifikanten Kontrastierung der HCCs. Weder die Kontrollapplikation mit PLGA- Nanopartikeln ohne Gd-DTPA, noch die MRT von nicht-induzierten Tieren lieferte eine Kontrastierung.
Im Anschluß an die MRT -Untersuchungen wurden die Tiere getötet, die Lebern entnommen, makroskopisch der Tumorstatus dokumentiert, mit Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und die Schnitte mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Die Schnitte wurden durch einem Pathologen beurteilt und eine Korrelation der MRT -Bilder mit der pathologischen Aufarbeitung durchgeführt.
Diese Daten zeigen, daß die erfindungsgemäßen Gd-DTPA beladenen PLGA Nanopartikel als Kontrastmittel dem herkömmlich verwendeten Primovist® überlegen sind.
10. Darstellung des EPR Effekts im doppelt-transgenen HCC-Mausmodell
Bisher stellt eine charakteristische Sequenz einer zunächst arteriellen Anreicherung von Kontrastmittel im HCC, gefolgt von einem venösen Abstrom des Kontrastmittels aus dem HCC, und Anreicherung des Kontrastmittels im umgebenden Lebergewebe ein Hauptkriterium für die Diagnose von HCC dar. Benigne Veränderungen in der zirrhotischen Leber können zum Teil jedoch ähnliche MRT -Bilder wie HCCs liefern. Nanopartikel-basierte Kontrastmittel der vorliegenden Erfindung bieten daher die Option, zusätzlich noch den EPR-Effekt, ein Charakteristikum von Malignomen, differentialdiagnostisch heranzuziehen.
Zur Untersuchung des EPR Effekts in den HCC der TGFa/c-myc-Mäusen, wurde den Tieren Gd-DTPA beladene PLGA Nanopartikel injiziert und MRT-Sequenzen zusätzlich zu den unmittelbar nach der Injektion erfolgenden Aufnahmen auch 24h, 48h und 64h durchgeführt. Wie Abbildung 4 zeigt, blieb die Kontrastierung so gut wie unverändert bis 24h nach der Applikation und war selbst nach 64h immer noch detektierbar.
Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen, konnte keine Kontrastierung der HCCs mit Magnevist® nach bereits 24h festgestellt werden. Dies beweist, daß die erfindungsgemäßen Gd-DTPA beladenen PLGA-Nanopartikel, und nicht Magnevist®, einen starken Kontrast verursachen.
11. Quantifizierung der Signal-Intensitäts Verhältnisse (SIR) und Kontrast-Hintergrund Verhältnisse (CNR) von Gd-DTPA PLGA Nanopartikel im Vergleich zu Gd-EOB-DTPA. Um die vorteilhaften Eigenschaften der erfindungsgemäßen Gd-DTPA PLGA-Nanopartikel gegenüber herkömmlichen Kontrastmitteln zu quantifizieren, wurden die erfindungsgemäßen Gd-DTPA PLGA-Nanopartikel mit Gd-EOB-DTPA als Kontrastmittel im oben beschriebenen HCC Tumormodell verglichen.
Gd-EOB-DTPA (Primovist®) ist ein gadoliniumhaltiges, gut wasserlösliches Kontrastmittel. Es unterscheidet sich von oben beschriebenen MRT Kontrastmittel Magnevist® durch eine lipophile Ethyl-Oxy-Benzylgruppe, so dass die Substanz spezifisch von den Hepatozyten aufgenommen und biliär ausgeschieden wird. Für die Aufnahme in die Zelle ist der Albuminbindende organische-Anionen-Transporter, der nur eine niedrige Spezifität aufweist, verantwortlich, wohingegen die biliäre Ausscheidung in einem ATP-abhängigen Prozess unter Mitwirkung der Gluthation-S-Transferase erfolgt.
Abbildungen 5 und 6 zeigen, daß die erfindungsgemäßen Nanopartikel sowohl mit Hinblick auf SIR („Signal/Intensity Ratio" - Signal/Intensitäts- Verhältnis) als auch auf CNR („Con- trast/Noise-Ratio" - Kontrast/Hintergrund- Verhältnis) signifikante Verbesserungen zu dem herkömmlichen, in der Diagnose von HCC verwendeten Kontrastmitteln (hier Gd-EOB- DTPA) aufweist. Dies zeigt eindrucksvoll, daß die mit dieser Erfindung bereitgestellten neuartigen Kontrastmittel insbesondere zur Diagnose der HCC besonders gut geeignet sind.
Abbildung 7 zeigt die Verteilung von Fluoreszenz-markierten PLGA- und HSA Nanoparti- keln. 200 μΐ der PLGA-Nanopartikel-Rhodamine bzw. HSA-Nanopartikel-Rhodamine wurden den HCC-Mäusen intravenös injiziert. 30 Minuten später wurden die Tiere getötet und Schnitte von der Leber angefertigt. Fluoreszenz-markierte Nanopartikel sind in geringerem Masse in den HCCs im Vergleich zum angrenzenden normalen Lebergewebe zu sehen. Entsprechend ermöglichen die erfindungsgemäßen Nanopartikel eine deutliche Kontrastierung zwischen Tumorgewebe und dem umliegenden Lebergewebe.
Abbildung 8 zeigt Zur Untersuchung des kontrastierenden Effekts der HSA-basierten Nanopartikel in den HCCs in TGFa/c-myc-Mäusen wurde zunächst eine MRT-Sequenz vor der Injektion der Nanopartikel durchgeführt. Anschließend wurden den Tieren Gd-DTPA bela- dene HSA-Nanopartikel (mit etwa 10 μπιοΐ Gd-DTPA/kg Körpergewicht) injiziert und MRT- Sequenzen unmittelbar nach der Injektion durchgeführt. Man erkennt die Demarkierung eines HCC, welches in der Nativaufnahme nicht sichtbar war. Beispiel 2: Gadolinium-DTPA HSA-Nanopartikel
Synthese der Gadolinium-DTPA HSA-Nanopartikel
Die Einbettung von Gd-DTPA in eine HSA-Partikelmatrix erfolgt durch ethanolische Desol- vatation. Bei diesem Verfahren werden das Polymer und der Arzneistoff zunächst in einem Lösemittel gelöst. Anschließend wird das Nicht-Lösungsmittel Ethanol hinzu gegeben. Durch dessen Zugabe erfolgt eine„ultrafeine Koazervation", die zum Einschluss der Arzneistoffmoleküle in das Polymer führt. Ein Teil des Arzneistoffs kann durchaus gelöst im Polymer vorliegen. Zur Stabilisierung bzw. Aushärtung der Nanopartikel wird ein quervernetzender Stoff wie Glutaraldehyd zugegeben. Das Glutaraldehyd reagiert mit seinen beiden freien Aldehydfunktionen mit den terminalen Aminogruppen im Protein und führt so zu einer Vernetzung der Aminosäurestränge im Protein und somit zu einer Stabilisierung bzw. Aushärtung der Nanopartikel. Um eine geringe Polydispersität zu erreichen, erfolgt die Zugabe des NichtLösungsmittels langsam und gleichmäßig. Die durch ethanolische Desolvatation hergestellten HSA-Nanopartikel werden anschließend aufgereinigt. Im letzten Aufreinigungsschritt wurden die Nanopartikel in MES-Puffer pH 4,7 redispergiert.
Die Bindung von Gd-DTPA an die HSA-Partikelmatrix erfolgt durch eine vorübergehende Bindung von n-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide) (EDC). Die hierbei zugrunde liegende Idee liegt in der Einführung eines Linkers, der eine kovalente Bindung zwischen dem Partikel und dem Arznei Stoff„vermittelt". Hierbei müssen beide Moleküle (Partikel und Arznei Stoff) mit dem Linker reagieren. Der Gd-DTPA-Komplex wird in der oben erwähnten Ethanol/Wasser-Mischung gelöst und 0,6 ml davon mit 0,2 ml einer frisch hergestellten EDC- Lösung (10 mg/ml) vereinigt. Diese Lösung wird zu den Partikeln, die in 1 ml MES-Puffer pH 4,7 dispergiert vorliegen, hinzu gegeben und für zwei Stunden auf einem Eppendorfmixer bei 600 rpm unter Lichtausschluss geschüttelt. Die Ansätze beinhalten eine effektive Konzentration von 6 mg/ml Arzneistoff. Die Kopplungsreaktion wird durch Zugabe von 100 μΐ Hydroxylamin (500 mg/ml) gestoppt.
Zur Untersuchung des kontrastierenden Effekts der HSA-basierten Nanopartikel in den HCCs in TGFa/c-myc-Mäusen wurde den Tieren Gd-DTPA beladene HSA-Nanopartikel (8,5 μιηοΐ Gd-DTPA/kg Körpergewicht) injiziert und MRT-Sequenzen unmittelbar nach der Injektion durchgeführt. Gd-DTPA-beladene HSA-Nanopartikel bewirkten eine Kontrastierung der HCCs, welche bezogen auf die Menge an Gd-DTPA der von Primovist® überlegen war. In der üblichen Dosierung (57 μηιοΐ/kg) war jedoch die Kontrastierung der HCCs mit Primovist® derjenigen mit Gd-DTPA-HSA überlegen.
Beispiel 3 : Weitere Herstellungsverfahren der Nanopartikel der Erfindung
1. Präparation der HSA-Nanopartikel
HSA-Nanopartikel wurden mittels eines Desolvationprozesses hergestellt (Weber et al, 2000). 200 mg HSA wurde in 2 ml 10 mM NaCl2-Lösung gelöst, auf pH 8,4 eingestellt und durch einen 0,22 μπι Filter filtriert. In dieser Lösung bildeten sich unter konstantem Rühren bei Raumtemperatur die Nanopartikel unter kontinuierlicher Zugabe von 8 ml des Desolvati- onsmittels Ethanol (Zugaberate 1 ml/min). Der Proteindesolvation wurden 115 μΐ einer 8%- igen wässrigen Glutaraldehydlösung zugesetzt, um das Crosslinken der Partikel zu erreichen. Die resultierenden Nanopartikel wurden durch drei Zentrifugationsschritte (16100xg, 8 min) und Redispersion im ursprünglichen Volumen mit Wasser aufgereinigt.
2. Einbau von Gd-DTPA in die HSA-Nanopartikel
5 mg DTPAa wurde zu 1 ml HSA-Lösung, welche auf pH 9.0-9.5 justiert war, zugegeben und für 3 h bei Raumtemperatur unter konstantem Schütteln bei 600 rpm inkubiert. Um ungebundenes DTPAa von der Proteinfraktion zu trennen, wurden die DTPA-konjugierten HSA- Nanopartikel durch vier Waschschritte durch Zentrifugation (16100xg, 10 min) aufgereinigt und in 1 ml Wasser redispersiert. Anschließend wurden 20 μΐ 94,8 mM GdCl3 zu den HSA- DTPA-Nanopartikeln zugefügt und bei 21°C für 30 min unter konstantem Schütteln bei 600 rpm inkubiert, gefolgt von vier Zentrifugationszyklen (16100xg, 10 min) mit Redispersion der Nanopartikel in 1 ml Wasser. Mit Hilfe des Arsenazotests wurde im Überstand die Abwesenheit von freiem Gd nachgeprüft.
3. Optimierung der Beladung der Nanopartikel mit Gd-DTPA
Um die Beladung der Nanopartikel mit Gd-DTPA zu optimieren, wurden HSA-Nanopartikel auf der Oberfläche mit Gd-DTPA mittels EDC (l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodii- mid) als Crosslinker kovalent modifiziert. Eine frisch zubereitete EDC-Lösung (100 μΐ, 10 mg/ml) wurde zu einer HSA-Suspension zugegeben und für 30 min unter konstantem Schütteln bei 600 rpm inkubiert. Der Gd-DTPA-Komplex wurde anschließend an die HSA- Nanopartikel durch die Zugabe von DTPAa und Komplexierung mit GdCl3 hergestellt. Die Lösung wurden mit 1 μΐ Hydroxylamin (500 mg/ml) für 20 min gequenscht, um die Reaktion zu stoppen. Anschließend erfolgte zur Aufreinigung der Nanopartikel drei Zentrifugations- zyklen (16100xg, 8 min) mit Redispersion im ursprünglichen Volumen an Wasser.
4. Characterisierung der Nanopartikel
Die Partikelgröße und der Polydispersivitätsindex (PDI) wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) bestimmt. DLS- und die Zeta-Potentialanalysen wurden mit Hilfe des Zetasi- zer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) durchgeführt. Ein Aliquot (15 μΐ) der Proben wurde in 2 ml Reinstwasser verdünnt und die Lichtstreuung bei 25 °C in einem Winkel von 90 Grad gemessen. Der Nanopartikelgehalt der Suspension wurde gravimetrisch bestimmt, die Konzentration von Gd durch Atomabsorptionsspektroskopie. Die Oberflächenmorphologie der Nanopartikel wurden mit Hilfe des Rasterelektronenmikroskp ermittelt (Hitachi, S 4500 SEM), die Gd-Beladung der Nanopartikel mittels MRT.
5. Präparation von PLGA-Nanopartikeln
PLGA-Nanopartikel wurden mit Hilfe der Doppel-Emulsionsmethode durch Evaporation des Lösungsmittels hergestellt. 500 mg PLGA (50:50) wurde in 5 ml Ethylazetat gelöst und bildete dabei eine Polymerphase. Anschließend wurde diese mit 10 ml einer l%igen Polyvinylal- kohol-Lösung (PVA) gemischt und mit Hilfe eines Ultra- Turrax (17000 rpm, 5 min) homogenisiert. Es resulte einer Wasser-in-Öl (w/o) Emulsion. Diese primäre Emulsion wurden mit 40 ml einer 1%-igen PVA-Lösung versetzt und für 18 h gerührt (550 rpm), um das Ethylazetat evaporieren zu lassen. Im letzten Schritt wurden die Nanopartikel dreimal durch Zentrifugati- on (16100xg, 8 min) gewaschen und für die Langzeit-Lagerung gefriergetrocknet.
6. Herstellung Gd-DTPA-beladener PLGA-Nanopartikel
Gd-DTPA-beladene PLGA-Nanopartikel wurden mittels einer modifizierten Doppelemulsi- ons-Lösungsmittel-Evaporationsmethode hergestellt. 5 mg Diethylenetriamiepentaessigsäure- Anhydrid (DTPAa) wurde zu 1 ml PLGA-Nanopartikeln in einer Konzentration von 10-50 mg/ml zugegeben, mit Hilfe eines Ultra- Turraxes homogenisiert (17000 rpm, 1 min), und bei 600 rpm für 3 h gerührt. Anschließend wurden die DTPA-konjugierten PLGA-Nanopartikel dreimal mittels Zentrifugation (16100xg, 8 min) und Redispersion in 1 ml Wasser gewaschen. Anschließend wurden 20 μΐ 94,8 mM GdCl3 in die Lösung gegeben, für 30 min bei 21°C unter konstantem Schütteln (600 rpm) geschüttelt und dreimal mittels Zentrifugation (16, 100xg, 8 min) mit Wasser gewaschen. Die Arsenazo-Methode wurde benutzt, um die Entfernung des freien Gadoliniums aus dem Überstand zu überprüfen.
7. Fluoreszenzmarkierung der PLGA-Nanopartikel
Rhodamine B/ Rhodamine 123 wurde in 1 ml Ethylazetat (0,5 mg/ml) gelöst, zu 2,5 ml einer PLGA-Lösing (in 100 mg/ml Ethylazetat) zugegeben und mit 5 ml einer 1%-igen PVA- Lösung gemischt. Anschließend erfolgte mit Hilfes des Ultra- Turraxes (17000 rpm, 5 min) die Homogenisation. Diese primäre Emulsion wurde in 20 ml einer 1%-igen PVA-Lösung gegeben und für 18 h gerührt (550 rpm), um das Lösungsmittel abdampfen zu lassen. Anschließend wurden die Nanopartikel dreimal mittels Zentrifugation (16100xg, 8 min) mit Reinstwasser gewaschen und für die Langzeitlagerung gefriergetrocknet.
8. Charakterisierung der Nanopartikel
Die Partikelgröße und der Polydispersitätsindex (PDI) wurden mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) bestimmt. DLS und Zetapotentialanalysen wurden mit Hilfe eines Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) durchgeführt. Ein Aliquot (15 μΐ) der Proben wurden mit 2 ml Reinstwasser versetzt und die Lichtstreuung bei 25 °C und einem Streuwinkel von 90 Grad bestimmt. Der Nanopartikelgehalt der Suspension wurde gravimetrisch bestimmt. Die Konzentration von Gd wurde mittels Atomabsorptionsspectroskopie gemessen. Die Morphologie der Nanopartikeloberfläche wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie ermittelt (Hitachi, S 4500 SEM). Die Beladung der Nanopartikel mit Gd wurde durch MRT ermitelt.

Claims

Patentansprüche
1. Nanopartikel zur Verwendung als Kontrastmittel in einem Verfahren zur Diagnose, Prognose und/oder Früherkennung einer Erkrankung und/oder Überwachung einer Therapie einer Erkrankung, umfassend ein paramagnetischer Stoff.
2. Nanopartikel nach Anspruch 1, wobei der paramagnetische Stoff eine Lanthanoidverbin- dung ist.
3. Nanopartikel nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Lanthanoidverbindung eine Gadolinium Verbindung ist.
4. Nanopartikel nach Anspruch 1 bis 3, wobei die Gadoliniumverbindung ein Komplex aus Gadolinum und einem Chelator ist, insbesondere wobei der Chelator ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und 1,4,7, 10- Tetraazacyclododecan- 1,4,7, 10-tetraessigsäure (DOTA).
5. Nanopartikel nach Anspruch 4, wobei die Gadoliniumverbindung entweder im Nanopartikel inkorporiert vorliegt und/oder kovalent und/oder nicht-kovalent an den Nanopartikel gebunden ist.
6. Nanopartikel nach Anspruch 1 bis 5, weiter umfassend inkorporiertes Gadolinium-DTPA und/oder inkorporiertes Perfluorooctylbromid.
7. Nanopartikel nach Anspruch 1 bis 6, wobei der Nanopartikel ein humanes Serumalbumin (HSA) - Nanopartikel oder ein PLGA - Nanopartikel ist.
8. Nanopartikel nach Anspruch 1 bis 7, wobei der Nanopartikel weiter modifiziert ist.
9. Nanopartikel nach Anspruch 8, wobei die Modifikation ein Überzug mit Tensiden ist oder eine Konjugation mit einem tumorspezifischen Liganden ist, insbesondere ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Transferrin, ein Antikörper gegen den Transferrinrezeptor, Insulin, ein Antikörper gegen den Insulinrezeptor und Folsäure.
10. Nanopartikel nach Anspruch 1 bis 9, wobei der Nanopartikel als Kontrastmittel in einer Magnetresonanztomographie zur Diagnose, Prognose und/oder Überwachung einer Erkrankung verwendet wird.
11. Nanopartikel nach Anspruch 1 bis 10, wobei die Erkrankung eine Lebererkrankung ist, insbesondere eine Zirrhose und/oder ein hepatozelluläres Karzinom.
12. Nanopartikel nach Anspruch 1 bis 1 1, wobei der Nanopartikel kleiner als 500 nm ist, vorzugsweise kleiner als 300 nm ist und besonders bevorzugt eine Größe von 100 - 300 nm aufweist.
13. Kontrastmittel zur Verwendung in der Magnetresonanztomographie, umfassend ein Nanopartikel nach einem Anspruch 1 bis 12.
14. Kontrastmittel nach Anspruch 13, weiterhin enthaltend ein Tumorhoming-Peptid, insbesondere iRGD.
15. Kontrastmittel nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Kontrastmittel weiterhin Substanzen zur Erhöhung des Blutdrucks enthält, wie Angiotensin(II); und/oder einem NO-Donator enthält, wie beispielsweise Glyceryltrinitrat (GNT).
16. Ein Nanopartikel nach Anspruch 1 bis 12, oder ein Kontrastmittel nach Anspruch 13 bis 15, geeignet zur Differenzierung zwischen hepatozellulärem Karzinom und zirrhotischen Regeneratknötchen in einem Magnetresonanztomographieverfahren.
17. Verfahren zur Diagnose, Überwachung und/oder Früherkennung von hepatozellulärem Karzinom umfassend, Verabreichen eines Kontrastmittels gemäß der Ansprüche 13 bis 15 an ein Subjekt und anschließende MRT -Untersuchung des Subjekts mittels eines 3-Tesla Tomographen.
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2708244A1 (de) * 2012-09-14 2014-03-19 Stichting Katholieke Universiteit Kontrastmittel und Verwendung für die Abbildung
CN105051016A (zh) * 2012-11-12 2015-11-11 易格尼塔公司 苯达莫司汀衍生物及其使用方法
WO2016097963A1 (en) * 2014-12-16 2016-06-23 Fondazione Istituto Italiano Di Tecnologia Albumin nanoparticles encapsulating gadolinium and method of synthesis thereof
EP3124052A1 (de) 2015-07-30 2017-02-01 Albrecht Piiper Verfahren zur diagnose von karzinomen mittels irgd und magnetresonanztomographie (mrt)
EP3216464A1 (de) 2016-03-11 2017-09-13 Stichting Katholieke Universiteit Nijmegen Verfahren zur herstellung von teilchen zur abbildung
CN109486827A (zh) * 2018-12-04 2019-03-19 南京林业大学 一种肿瘤归巢穿膜肽tLyP-1修饰的去铁蛋白纳米笼及其制备方法
CN112587677A (zh) * 2020-12-23 2021-04-02 广东省第二人民医院（广东省卫生应急医院） 一种iRGD磁性靶向微泡造影剂及其应用
CN114767885A (zh) * 2022-03-15 2022-07-22 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种新型高效白蛋白钆基对比剂用于活体多功能磁共振成像
CN115317628A (zh) * 2022-03-15 2022-11-11 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种具有高弛豫率长循环时间的钆基磁共振对比剂合成方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030147811A1 (en) * 2001-05-23 2003-08-07 New York University Detection of Alzheimer's amyloid by magnetic resonance imaging
US20060251580A1 (en) * 2003-06-06 2006-11-09 Faustus Forschungs Cie.Translational Cancer Research Gmbh Lectin conjugates

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030147811A1 (en) * 2001-05-23 2003-08-07 New York University Detection of Alzheimer's amyloid by magnetic resonance imaging
US20060251580A1 (en) * 2003-06-06 2006-11-09 Faustus Forschungs Cie.Translational Cancer Research Gmbh Lectin conjugates

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABDELMOEZ A A ET AL: "Albumin-based nanoparticles as magnetic resonance contrast agents: II. Physicochemical characterisation of purified and standardised nanoparticles", HISTOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 134, no. 2, 14 July 2010 (2010-07-14), pages 171 - 196, XP019848095, ISSN: 1432-119X *
CHEN Z ET AL: "Gadolinium-conjugated PLA-PEG nanoparticles as liver targeted molecular MRI contrast agent", JOURNAL OF DRUG TARGETING 2011 INFORMA HEALTHCARE GBR LNKD- DOI:10.3109/1061186X.2010.531727, vol. 19, no. 8, September 2011 (2011-09-01), pages 657 - 665, XP009157975, ISSN: 1061-186X *
JAIN; STYLIANOPOULOS: "Delivering nanomedicine to solid tumors", NAT REV CLIN ONCOL, 2010
WALLNOFER E A ET AL: "MRI molecular imaging with nanoparticles: A technical platform for early diagnosis of cancer", INTERNATIONAL JOURNAL OF CLINICAL PHARMACOLOGY AND THERAPEUTICS 2011 DUSTRI-VERLAG DR. KARL FEISTLE DEU LNKD- DOI:10.5414/CPP49073, vol. 49, no. 1, January 2011 (2011-01-01), pages 73 - 74, XP009157981, ISSN: 0946-1965 *
YUNPENG YE ET AL: "Synthesis and evaluation of new iRGD peptide analogs for tumor optical imaging", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, PERGAMON, ELSEVIER SCIENCE, GB, vol. 21, no. 4, 21 December 2010 (2010-12-21), pages 1146 - 1150, XP028138658, ISSN: 0960-894X, [retrieved on 20101228], DOI: 10.1016/J.BMCL.2010.12.112 *

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2708244A1 (de) * 2012-09-14 2014-03-19 Stichting Katholieke Universiteit Kontrastmittel und Verwendung für die Abbildung
WO2014041150A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 Stichting Katholieke Universiteit Contrast agent and its use for imaging
JP2015534549A (ja) * 2012-09-14 2015-12-03 スティヒティング カトリーケ ユニフェルシテイトＳｔｉｃｈｔｉｎｇ Ｋａｔｈｏｌｉｅｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ 造影剤およびイメージングのためのその使用
US11185600B2 (en) 2012-09-14 2021-11-30 Stichting Radboud Universitair Medisch Centrum Contrast agent and its use for imaging
CN105051016A (zh) * 2012-11-12 2015-11-11 易格尼塔公司 苯达莫司汀衍生物及其使用方法
WO2016097963A1 (en) * 2014-12-16 2016-06-23 Fondazione Istituto Italiano Di Tecnologia Albumin nanoparticles encapsulating gadolinium and method of synthesis thereof
CN107847614A (zh) * 2015-07-30 2018-03-27 阿尔布雷希特·皮佩尔 借助于iRGD和磁共振成像（MRT）用于诊断癌症的方法
WO2017017285A1 (de) 2015-07-30 2017-02-02 Albrecht Piiper Verfahren zur diagnose von karzinomen mittels irgd und magnetresonanztomographie (mrt)
EP3124052A1 (de) 2015-07-30 2017-02-01 Albrecht Piiper Verfahren zur diagnose von karzinomen mittels irgd und magnetresonanztomographie (mrt)
EP3216464A1 (de) 2016-03-11 2017-09-13 Stichting Katholieke Universiteit Nijmegen Verfahren zur herstellung von teilchen zur abbildung
US11286352B2 (en) 2016-03-11 2022-03-29 Stichting Radboud Universitair Medisch Centrum Process for preparation of beads for imaging
CN109486827A (zh) * 2018-12-04 2019-03-19 南京林业大学 一种肿瘤归巢穿膜肽tLyP-1修饰的去铁蛋白纳米笼及其制备方法
CN112587677A (zh) * 2020-12-23 2021-04-02 广东省第二人民医院（广东省卫生应急医院） 一种iRGD磁性靶向微泡造影剂及其应用
CN112587677B (zh) * 2020-12-23 2022-11-11 广东省第二人民医院（广东省卫生应急医院） 一种iRGD磁性靶向微泡造影剂及其应用
CN114767885A (zh) * 2022-03-15 2022-07-22 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种新型高效白蛋白钆基对比剂用于活体多功能磁共振成像
CN115317628A (zh) * 2022-03-15 2022-11-11 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种具有高弛豫率长循环时间的钆基磁共振对比剂合成方法及应用
CN115317628B (zh) * 2022-03-15 2023-10-17 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种具有高弛豫率长循环时间的钆基磁共振对比剂合成方法及应用

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