WO2012096126A1 - 燃料電池、燃料電池の製造方法、電子機器、酵素固定化電極、バイオセンサー、エネルギー変換素子、細胞、細胞小器官および細菌 - Google Patents

燃料電池、燃料電池の製造方法、電子機器、酵素固定化電極、バイオセンサー、エネルギー変換素子、細胞、細胞小器官および細菌 Download PDF

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liposome
enzyme
electrode
glucose
immobilized
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隆平 松本
修二 藤田
酒井　秀樹
戸木田　裕一
渡辺　陽子
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ソニー株式会社
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    • H01M8/16—Biochemical fuel cells, i.e. cells in which microorganisms function as catalysts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
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    • Y02P70/00—Climate change mitigation technologies in the production process for final industrial or consumer products
    • Y02P70/50—Manufacturing or production processes characterised by the final manufactured product

Definitions

  • the present invention relates to a fuel cell, a fuel cell manufacturing method, an electronic device, an enzyme-immobilized electrode, a biosensor, an energy conversion element, a cell, a cell organelle, and a bacterium. More specifically, the present invention is suitable for application to, for example, a biofuel cell using glucose as a fuel or a substrate, a biosensor and an energy conversion element, and various electronic devices using the biofuel cell as a power source. .
  • the immobilization method using the polyion complex described above relies heavily on the physicochemical properties of the enzyme, especially the charge, and the immobilization state constantly changes due to changes in the external solution and environmental changes during use.
  • the immobilized enzyme is likely to elute.
  • enzymes have low heat resistance.
  • the physicochemical properties of the enzymes themselves change each time. It is necessary to aim for optimization, and is complicated.
  • more enzymes are required.
  • these enzymes are immobilized, a great deal of effort is required to optimize the immobilization conditions.
  • the present inventors have proposed that an enzyme or a coenzyme is encapsulated in a liposome and an enzyme reaction is performed using this space as a reaction field to efficiently extract electrons from fuel and generate electric energy ( (See Patent Document 13).
  • an enzyme or a coenzyme is encapsulated in a liposome and an enzyme reaction is performed using this space as a reaction field to efficiently extract electrons from fuel and generate electric energy (See Patent Document 13).
  • the problem to be solved by the present invention is that one or more kinds of enzymes or further coenzymes are confined in a minute space inside the liposome, and fuel such as glucose and organic acid is easily permeated into the liposome. It is possible to control the permeation rate of this fuel, and it is possible to efficiently extract electrons from the fuel and generate electric energy by performing an enzyme reaction using the internal space of the liposome as a reaction field, It is an object of the present invention to provide a fuel cell capable of easily immobilizing these enzymes or further coenzymes on electrodes, and a method for producing the same.
  • Another problem to be solved by the present invention is to provide a high-performance electronic device using the above-described excellent fuel cell.
  • Still another problem to be solved by the present invention is to provide an enzyme-immobilized electrode, a high-efficiency biosensor, and an energy conversion element that are suitable for application to the fuel cell.
  • Still another problem to be solved by the present invention is that a substrate such as glucose or an organic acid can be easily permeated into the interior, and the permeation rate of the substrate can be controlled. It is to provide cells, organelles, and bacteria that can efficiently extract electrons from a substrate and generate electric energy by performing an enzymatic reaction.
  • the present inventors have conducted intensive research to solve the above problems.
  • a biofuel cell when an enzyme required for an enzymatic reaction or further coenzyme is encapsulated in a liposome, which is an artificial cell, compared to the case where the same amount of enzyme or further coenzyme is not encapsulated in the liposome. It was found that the enzyme reaction can be carried out much more efficiently to obtain a very high catalyst current or to be easily immobilized on the electrode.
  • the present invention has been devised by examining the range in which the above method can be applied from various viewpoints based on the above-mentioned knowledge obtained independently by the present inventors.
  • the positive electrode and the negative electrode have a structure facing each other through a proton conductor, and are configured to extract electrons from the fuel using an enzyme, At least one of the above enzymes is encapsulated in the liposome,
  • This is a fuel cell in which an antibiotic having a hole capable of permeating glucose and a sterol are bound to the lipid bimolecular membrane constituting the liposome.
  • this invention When manufacturing a fuel cell having a structure in which a positive electrode and a negative electrode are opposed to each other through a proton conductor and taking out electrons from fuel using an enzyme, after encapsulating at least one kind of the enzyme in the liposome, It is a method for producing a fuel cell, comprising a step of binding an antibiotic having a hole capable of permeating glucose and a sterol to a lipid bimolecular membrane constituting the same.
  • the fuel cell is configured to extract electrons from the fuel using an enzyme and a coenzyme, and at least one enzyme and at least one coenzyme are encapsulated in the liposome.
  • Liposomes are closed vesicles formed by lipid bilayer membranes such as phospholipids, and the inside is an aqueous phase.
  • lipid bilayer membranes such as phospholipids
  • GUV giant unilamellar liposomes
  • SV small unilamellar liposomes
  • GUV giant unilamellar liposomes
  • GUV giant unilamellar liposomes
  • GUV giant unilamellar liposomes
  • GUV giant unilamellar liposomes
  • GUI large liposomes
  • MUVs nested multilamellar liposomes
  • Liposomes can be prepared, for example, from those having a diameter of about 100 nm to a large one having a diameter of 10 ⁇ m, and the diameter is selected according to need, but a specific example is 2 to 7 ⁇ m.
  • any phospholipid may be used, and either glycerophospholipid or sphingophospholipid may be used.
  • the glycerophospholipid include, but are not limited to, phosphatidic acid, phosphatidylcholine (lecithin), phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, and diphosphatidylglycerol (cardiolipin).
  • Sphingophospholipids include, but are not limited to, sphingomyelin.
  • a representative example of phosphatidylcholine is dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC).
  • DMPC dimyristoyl phosphatidylcholine
  • Conventionally known methods can be used to form liposomes and encapsulate enzymes and coenzymes inside the liposomes, and are selected as necessary.
  • a hole penetrating the lipid bilayer is formed in a form bordered by the antibiotic.
  • Various conventionally known antibiotics can be used as the antibiotic, and are selected as necessary. This hole has a size that prevents an enzyme or even a coenzyme enclosed inside the liposome from penetrating at least easily.
  • Antibiotics typically consist of multiple molecules in which a plurality of molecules are arranged in a ring.
  • sterol to be bound to the lipid bilayer membrane constituting the liposome various conventionally known sterols can be used and selected as necessary.
  • Representative examples of sterols include animal sterols such as cholesterol and coprostanol, sitosterol and stigmasterol in plants, and ergosterol produced by yeasts and ergots.
  • the weight ratio of sterol to the lipid bilayer membrane constituting the liposome is preferably 1 ⁇ 4 or more and 3 or less, but is not limited thereto.
  • the liposome encapsulates at least one enzyme or at least one coenzyme among enzymes or further coenzymes necessary for the enzyme reaction, but encapsulates all the enzymes necessary for the enzyme reaction or further coenzymes in the liposome.
  • a part of the enzyme or coenzyme may not be encapsulated in the liposome, but may be incorporated into the lipid bilayer membrane constituting the liposome, immobilized, or present outside the liposome.
  • an anchor such as a polyethylene glycol chain can be used.
  • the liposome is preferably immobilized on the negative electrode, but it is not always necessary to immobilize the liposome.
  • the liposome is included in the buffer solution. It may be.
  • various conventionally known immobilization methods used for cell immobilization for example, can be used.
  • an intermediate layer may be formed between the negative electrode and the liposome in order to stabilize the fixation of the liposome to the negative electrode.
  • this intermediate layer not only biopolymers such as proteins and DNA, but also polymer electrolytes having both hydrophilic and hydrophobic properties, and structures such as micelles, reverse micelles, and lamellae can be formed.
  • a compound having a nanometer structure, a compound having one or more properties, and high biocompatibility can be used.
  • the protein for example, in addition to acidic proteins such as alcohol dehydrogenase, lactate dehydrogenase, ovalbumin, and myokinase typified by albumin, lysozyme, cytochrome c, myoglobin, trypsinogen, etc. having an isoelectric point on the alkali side may be used. It can. It is possible to stably immobilize the liposome with respect to the negative electrode by physically adsorbing such an intermediate layer made of protein or the like on the electrode surface and immobilizing the liposome on the intermediate layer.
  • the first substance is fixed to the negative electrode
  • the second substance is bonded to the liposome
  • the first substance fixed to the negative electrode and the second substance bonded to the liposome are bonded to each other.
  • the liposome can be stably immobilized on the negative electrode.
  • a binding pair that specifically binds is preferably used, but is not necessarily limited thereto.
  • a specific example of such a combination of the first substance and the second substance is as follows.
  • Avidin and biotin Avidin is a glycoprotein that specifically binds to biotin.
  • Biotin may be immobilized on the negative electrode, and avidin may be bound to the liposome.
  • avidin various things, such as streptavidin (StreptAvidin) and neutroavidin (NeutroAvidin), can be used, Furthermore, these variants can also be used.
  • Antibodies are immunoglobulins that specifically bind to antigens. For example, while preparing a liposome using an antigen-modified lipid, the antibody can be immobilized on the negative electrode, and the liposome immobilized on the negative electrode can be immobilized by binding the antibody immobilized on the negative electrode and the antigen bound to the liposome. An antigen may be immobilized on the negative electrode, and an antibody may be bound to the liposome.
  • Protein A or protein G is a protein having a strong affinity for immunoglobulin IgG.
  • immunoglobulin IgG is immobilized on the negative electrode, and protein A or protein G is bound to the liposome. Then, the liposome can be immobilized on the negative electrode by binding immunoglobulin IgG immobilized on the negative electrode and protein A or protein G bound to the liposome. Protein A or protein G may be immobilized on the negative electrode, and immunoglobulin IgG may be bound to the liposome.
  • -Sugar molecule or sugar chain-containing compound
  • lectin is a general term for sugar-binding proteins.
  • a transmembrane lectin is mixed to produce a liposome, and a sugar molecule (or a sugar chain-containing compound) is immobilized on the negative electrode.
  • the liposome can be immobilized on the negative electrode by binding the sugar chain of the sugar molecule (or sugar chain-containing compound) immobilized on the negative electrode and the lectin bound to the liposome.
  • Lectins may be immobilized on the negative electrode, and sugar molecules (or sugar chain-containing compounds) may be bound to the liposomes.
  • ⁇ DNA and complementary DNA For example, a liposome is prepared using water-soluble lipid bound with DNA, and complementary strand DNA is immobilized on the negative electrode. Then, the liposome can be immobilized on the negative electrode by bonding the complementary strand DNA immobilized on the negative electrode and the DNA bonded to the liposome by hybridization.
  • Glutathione and glutathione S-transferase For example, a GST fusion transmembrane protein is mixed to produce a liposome, and glutathione is immobilized on the negative electrode. Then, the liposome can be immobilized on the negative electrode by combining glutathione immobilized on the negative electrode and GST bonded to the liposome.
  • the lipid bilayer membrane constituting the liposome is modified with heparin binding molecule, and the negative electrode is modified with heparin.
  • the liposome can be immobilized on the negative electrode by binding the heparin of the heparin-modified negative electrode and the heparin-binding molecule bound to the liposome.
  • Hormones and hormone receptors Hormone receptors are protein molecules or molecular complexes that specifically accept hormone molecules. For example, it is possible to immobilize the hormone receptor on the negative electrode, bind the hormone to the liposome, and immobilize the liposome to the negative electrode by binding the hormone receptor immobilized on the negative electrode and the hormone bound to the liposome. .
  • Carboxylic acid and imide For example, carboxylic acid is bonded to the negative electrode and amine is bonded to the liposome. Then, the carboxylic acid bonded to the negative electrode and the amine bonded to the liposome are bonded by amide coupling using an imide such as carbodiimide or N-hydroxysuccinimide, whereby the liposome can be immobilized on the negative electrode.
  • An amine may be bonded to the negative electrode, and a carboxylic acid may be bonded to the liposome.
  • the electrode material of the negative electrode is carbon (carbon)
  • a diazonium salt is refluxed in a solution containing nitric acid, sulfuric acid, hydrogen peroxide, or the like.
  • a method of performing local oxidation can be used.
  • various fuels such as glucose can be used, and are selected as necessary.
  • fuels other than glucose include various organic acids involved in the citric acid cycle, sugars and organic acids involved in the pentose phosphate cycle and glycolysis.
  • Various organic acids involved in the citric acid cycle are lactic acid, pyruvic acid, acetyl CoA, citric acid, isocitric acid, ⁇ -ketoglutaric acid, succinyl CoA, succinic acid, fumaric acid, malic acid, oxaloacetic acid and the like.
  • Sugars and organic acids involved in the pentose phosphate cycle and glycolysis are glucose 6-phosphate, 6-phosphogluconolactone, 6-phosphogluconoic acid, ribulose 5-phosphate, glyceraldehyde 3-phosphate, fructose 6-phosphate, xylulose 5-phosphate, sedheptulose 7-phosphate, erythrose 4-phosphate, phosphoenolpyruvate, 1,3-bisphosphoglycerate, ribose 5-phosphate and the like. Any of these fuels can permeate through a hole that is capable of permeating glucose, which is possessed by an antibiotic bonded to a lipid bilayer membrane constituting a liposome.
  • These fuels are typically used in the form of a fuel solution obtained by dissolving these fuels in a conventionally known buffer solution such as a phosphate buffer solution or a Tris buffer solution.
  • the enzyme encapsulated in the liposome typically contains an oxidase that promotes and decomposes the oxidation of fuel such as glucose, and further returns the coenzyme that has been reduced along with the oxidation of the fuel to the oxidant and an electron mediator. Including a coenzyme oxidase that passes electrons to the negative electrode.
  • the enzyme encapsulated in the liposome is preferably an oxidase that promotes and decomposes oxidation of fuel such as glucose, and a coenzyme oxidase that returns a coenzyme reduced by the oxidase to an oxidant. including.
  • the coenzyme oxidase By the action of the coenzyme oxidase, electrons are generated when the coenzyme returns to the oxidized form, and the electrons are transferred from the coenzyme oxidase to the negative electrode via the electron mediator.
  • glucose used as a fuel
  • glucose dehydrogenase (GDH) particularly NAD-dependent glucose dehydrogenase
  • NAD + or NADP + is used as a coenzyme
  • diaphorase eg, a coenzyme oxidase is used. DI
  • any electron mediator may be used, but a compound having a quinone skeleton is preferably used.
  • a compound having a quinone skeleton is preferably used.
  • 2,3-dimethoxy-5-methyl-1 is used.
  • ANQ 2-amino-1,4-naphthoquinone
  • ACNQ 2-amino-3-carboxy-1,4-naphthoquinone
  • vitamin K1 2-methyl-1,4-naphthoquinone
  • VK3 2-amino-3-carboxy-1,4-naphthoquinone
  • ACNQ 2-amino-3-carboxy-1,4-nap
  • the electron mediator may contain one or two or more other compounds that function as an electron mediator, if necessary. This electron mediator may be immobilized on the negative electrode together with the liposome in which the enzyme and coenzyme are encapsulated, encapsulated inside the liposome, immobilized on the liposome, or contained in the fuel solution. You may make it let.
  • this enzyme When an enzyme is immobilized on the positive electrode, this enzyme typically includes an enzyme that reduces oxygen.
  • the enzyme that reduces oxygen include bilirubin oxidase, laccase, and ascorbate oxidase.
  • an electron mediator is preferably immobilized on the positive electrode in addition to the enzyme.
  • the electron mediator for example, potassium hexacyanoferrate or potassium octacyanotungstate is used.
  • the electron mediator is preferably immobilized at a sufficiently high concentration, for example, 0.64 ⁇ 10 ⁇ 6 mol / mm 2 or more on average.
  • Various proton conductors can be used and are selected as necessary.
  • cellophane, perfluorocarbon sulfonic acid (PFS) -based resin film, and trifluorostyrene derivative can be used together.
  • an ion exchange resin having a fluorine-containing carbon sulfonic acid group Nafion (trade name, DuPont, USA), etc.
  • the concentration of the buffer substance contained in the electrolyte is 0.2 M or more and 2.5 M or less, preferably 0.2 M or more and 2 M or less, more preferably 0.4 M or more and 2 M or less, More preferably, it is 0.8M or more and 1.2M or less.
  • Buffer substances in general, as long as a pK a of 6 to 9, may it be used What Specific examples and, dihydrogen phosphate ion (H 2 PO 4 - ), 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (abbreviated Tris), 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES), cacodylic acid, carbonic acid (H 2 CO 3 ), hydrogen citrate Ions, N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA), piperazine-N, N′-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid ( ACES), 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS), N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid (HEPES), N-2-hydroxyethylpiperazine- '-3-prop
  • Examples of the substance that generates dihydrogen phosphate ions include sodium dihydrogen phosphate (NaH 2 PO 4 ) and potassium dihydrogen phosphate (KH 2 PO 4 ).
  • As the buffer substance a compound containing an imidazole ring is also preferable.
  • compounds containing an imidazole ring include imidazole, triazole, pyridine derivatives, bipyridine derivatives, imidazole derivatives (histidine, 1-methylimidazole, 2-methylimidazole, 4-methylimidazole, 2-ethylimidazole, imidazole-2 -Ethyl carboxylate, imidazole-2-carboxaldehyde, imidazole-4-carboxylic acid, imidazole-4,5-dicarboxylic acid, imidazol-1-yl-acetic acid, 2-acetylbenzimidazole, 1-acetylimidazole, N-acetyl Imidazole, 2-aminobenzimidazole, N- (3-aminopropyl) imidazole, 5-amino-2- (trifluoromethyl) benzimidazole, 4-azabenzimidazole, 4-aza-2-mercapto Lens imidazole, benzimidazole, 1-benzyl
  • buffer substances for example, selected from the group consisting of hydrochloric acid (HCl), acetic acid (CH 3 COOH), phosphoric acid (H 3 PO 4 ) and sulfuric acid (H 2 SO 4 )
  • HCl hydrochloric acid
  • CH 3 COOH acetic acid
  • H 3 PO 4 phosphoric acid
  • SO 4 sulfuric acid
  • At least one acid may be added as a neutralizing agent. By doing so, the activity of the enzyme can be maintained higher.
  • the pH of the electrolyte containing the buffer substance is preferably around 7, but may be any of 1 to 14 in general.
  • the electrode material for the positive electrode and the negative electrode various materials can be used.
  • carbon-based materials such as porous carbon, carbon pellets, carbon felt, and carbon paper are used.
  • a porous conductive material including a skeleton made of a porous material and a material mainly composed of a carbon-based material covering at least a part of the surface of the skeleton can be used (Patent Document). 12).
  • This fuel cell can be used for almost anything that requires electric power, and can be of any size.
  • electronic devices mobile objects (automobiles, motorcycles, aircraft, rockets, spacecrafts, etc.), power units, construction machinery, It can be used for machine tools, power generation systems, cogeneration systems, etc.
  • the output, size, shape, type of fuel, etc. are determined depending on the application.
  • At least one of the fuel cells is The positive electrode and the negative electrode have a structure facing each other through a proton conductor, and are configured to extract electrons from the fuel using an enzyme, At least one of the above enzymes is encapsulated in the liposome, It is an electronic device in which an antibiotic having a hole capable of permeating glucose and a sterol are bound to the lipid bimolecular membrane constituting the liposome.
  • This electronic device may basically be any type, and includes both portable and stationary devices. Specific examples include cell phones, mobile devices (portable information terminals). Machine (PDA), etc.), robot, personal computer (including both desktop type and notebook type), game machine, camera-integrated VTR (video tape recorder), in-vehicle device, home appliance, industrial product and the like.
  • PDA portable information terminals
  • PDA portable information terminals
  • robot personal computer
  • personal computer including both desktop type and notebook type
  • game machine including both desktop type and notebook type
  • camera-integrated VTR video tape recorder
  • in-vehicle device home appliance, industrial product and the like.
  • a liposome encapsulating at least one enzyme is immobilized, It is an enzyme-immobilized electrode in which an antibiotic having a hole capable of permeating glucose and a sterol are bound to a lipid bimolecular membrane constituting the liposome.
  • this invention Using enzymes, At least one of the above enzymes is encapsulated in the liposome, It is a biosensor in which an antibiotic having a hole capable of permeating glucose and a sterol are bound to a lipid bimolecular membrane constituting the liposome.
  • this invention It is an energy conversion element using a liposome in which at least one enzyme is encapsulated, and an antibiotic having a hole capable of permeating glucose and a sterol bonded to the lipid bimolecular membrane constituting the liposome.
  • this energy conversion element is an element that converts chemical energy of a fuel or a substrate into electric energy by an enzyme reaction, and the above-described fuel cell, that is, a biofuel cell, is a kind of this energy conversion element.
  • this invention It is a cell in which an antibiotic having a hole capable of permeating glucose and a sterol are bound to a lipid bimolecular membrane constituting the cell membrane.
  • this invention It is an organelle in which an antibiotic having a hole that allows glucose to permeate and a sterol are bound to a lipid bimolecular membrane constituting the cell membrane.
  • this invention It is a bacterium in which an antibiotic and a sterol having a hole capable of permeating glucose are bound to a lipid bimolecular membrane constituting a cell membrane.
  • the cells, organelles and bacteria are not particularly limited as long as they have a fuel or substrate metabolic system such as glucose, and include various conventionally known ones. If necessary, these cells, organelles, and bacteria may be encapsulated with an enzyme or further a coenzyme necessary for decomposing a fuel such as glucose or a substrate or the like, similar to the fuel cell described above.
  • At least one enzyme involved in an enzymatic reaction or at least one coenzyme can be encapsulated in a liposome while maintaining high activity.
  • the liposome can be easily permeated with a fuel or a substrate such as glucose or organic acid from the hole of the antibiotic bound to the lipid bimolecular membrane constituting the liposome, and the lipid two molecules constituting the liposome.
  • This fuel permeation rate can be controlled by the sterols attached to the membrane.
  • an enzymatic reaction is efficiently performed using the minute space inside the liposome as a reaction field, and electrons can be efficiently extracted from a fuel or a substrate such as glucose.
  • the concentration of the enzyme and the coenzyme encapsulated inside the liposome is extremely high, and therefore the distance between the enzyme and the coenzyme is extremely small, so that the catalytic cycle of these enzymes and coenzyme proceeds very fast.
  • the enzyme reaction proceeds at high speed.
  • the enzyme or further coenzyme enclosed in the liposome can be easily immobilized on the negative electrode or electrode via the liposome.
  • the electrons extracted from the fuel or substrate such as glucose can be reliably transferred to the negative electrode or the electrode.
  • the liposome can be fixed more easily than when the enzyme or coenzyme is immobilized by a polyion complex or the like.
  • an enzymatic reaction is efficiently carried out using a minute space inside these cells, organelles and bacteria as a reaction field, and fuel such as glucose and organic acids or Electrons can be efficiently extracted from the substrate.
  • the enzymatic reaction is carried out by the metabolic system of these cells, organelles, and bacteria.
  • the enzymes or enzymes necessary for decomposing fuel or substrates in these cells, organelles, and bacteria are not used.
  • these enzymes and coenzymes can be used.
  • an enzyme or further a coenzyme can be confined in a minute space inside the liposome, and fuel such as glucose and organic acid can be easily permeated into the liposome, and the permeation rate of this fuel can be increased. Electrons can be efficiently extracted from the fuel by generating an enzymatic reaction using the internal space of the liposome as a reaction field, and electric energy can be generated.
  • a highly efficient fuel cell that can be easily fixed can be realized. By using such a highly efficient fuel cell, a high-performance electronic device can be realized. Similarly, a highly efficient biosensor and energy conversion element can be realized.
  • cells, organelles, and bacteria that can efficiently extract electrons from a fuel or substrate such as glucose or an organic acid to generate electric energy can be realized.
  • 1 is a drawing-substituting photograph showing a fluorescence microscopic image of a liposome encapsulating fluorescently labeled alcohol dehydrogenase, fluorescently labeled diaphorase and NADH.
  • 1 is a drawing-substituting photograph showing a fluorescence microscopic image of a liposome encapsulating fluorescently labeled alcohol dehydrogenase, fluorescently labeled diaphorase and NADH.
  • 1 is a drawing-substituting photograph showing a fluorescence microscopic image of a liposome encapsulating fluorescently labeled alcohol dehydrogenase, fluorescently labeled diaphorase and NADH.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a state where alcohol dehydrogenase, diaphorase and NADH are simply dispersed in a buffer solution.
  • It is a drawing substitute photograph which shows the scanning electron microscope image which image
  • It is a drawing substitute photograph which shows the scanning electron microscope image which image
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the results of chronoamperometry performed for comparison with Example 1.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the results of chronoamperometry performed for comparison with Example 1.
  • FIG. 1 shows an enzyme-immobilized electrode according to a first embodiment of the present invention.
  • glucose, organic acid, or the like is used as a substrate.
  • liposomes 12 made of a lipid bimolecular film such as phospholipid are immobilized on the surface of an electrode 11 made of porous carbon or the like by physical adsorption or the like. At least one type of enzyme and at least one type of coenzyme involved in the target enzyme reaction are encapsulated in the aqueous phase inside the liposome 12.
  • FIG. 2 shows the details of the structure of the liposome 12.
  • two types of enzymes 13 and 14 and one type of coenzyme 15 are enclosed in the aqueous phase 12 a inside the liposome 12.
  • an electron mediator may be enclosed in the aqueous phase 12 a inside the liposome 12. This electron mediator may be immobilized on the electrode 11 together with the liposome 12.
  • the enzyme 13 is an oxidase that promotes and decomposes the oxidation of glucose used as a substrate, and the enzyme 14 returns the coenzyme 15 that has been reduced along with the oxidation of glucose to an oxidant, and an electron via an electron mediator.
  • 11 is a coenzyme oxidase to be passed to
  • one or a plurality of antibiotics 16 are bonded to the lipid bilayer membrane constituting the liposome 12, and a hole 17 penetrating the lipid bilayer membrane in a form bordered by the antibiotic 16. Is formed. Although only one hole 17 is shown in FIG. 2, the number and arrangement of the holes 17 are arbitrary. The size of the hole 17 is selected so that glucose can be permeated but the permeation of the enzymes 13 and 14 and the coenzyme 15 enclosed in the liposome 12 is impossible or difficult.
  • amphotericin B which is a polyene antibiotic, ionophore, and the like can be used, but are not limited thereto.
  • the ionophore include valinomycin, ionomycin, nigericin, gramicidin A, monensin, carbonyl cyanide-m-chlorophenylhydrazone, carbonylcyanide-p-fluoromethoxyphenylhydrazone, and the like.
  • one or more sterols 18 are bound to the lipid bimolecular membrane constituting the liposome 12. Although five sterols 18 are shown in FIG. 2, the number and arrangement of the sterols 18 are arbitrary and are selected as necessary. Preferably, the weight ratio of the sterol 18 to the lipid bilayer membrane constituting the liposome 12 is selected in the range from 1/4 to 1/3.
  • sterol 18 examples include cholesterol Or ergosterol Etc.
  • This enzyme-immobilized electrode can be produced, for example, as follows. First, the liposome 12 in which the enzymes 13 and 14 and the coenzyme 15 are encapsulated is prepared. Next, an antibiotic 16 is bound to the lipid bilayer membrane constituting the liposome 12 to form a hole 17, and a sterol 18 is bound to the lipid bilayer membrane. Next, the liposome 12 to which the antibiotic 16 and the sterol 18 are bound in this way is immobilized on the electrode 11. As a result, an enzyme-immobilized electrode is produced. Antibiotic 16 and sterol 18 may be bound to the lipid bilayer membrane constituting liposome 12 before encapsulating enzymes 13 and 14 and coenzyme 15. Alternatively, after the liposome 12 is immobilized on the electrode 11, the antibiotic 16 and the sterol 18 may be bound to the lipid bilayer membrane constituting the liposome 12.
  • the enzyme-immobilized electrode is produced, for example, as follows. First, a buffer solution containing the enzyme 13, a buffer solution containing the enzyme 14, a buffer solution containing the coenzyme 15 and the liposome 12 to which the sterol 18 is bound (in which the enzymes 13, 14 and the coenzyme 15 are not enclosed) ) Are prepared. Next, after mixing these buffers, the enzymes 13 and 14 and the coenzyme 15 outside the liposome 12 are removed by, for example, passing the mixed solution through a gel filtration column.
  • the liposome 12 in which the enzymes 13 and 14 and the coenzyme 15 are encapsulated in this way is placed in a buffer solution, and an antibiotic 16 is added to the buffer solution so that the lipid bilayer membrane constituting the liposome 12 has antibiotics.
  • the substance 16 is bonded to form the hole 17.
  • FIG. 3 schematically shows an example of an electron transfer reaction by an enzyme, a coenzyme, and an electron mediator in the enzyme-immobilized electrode.
  • the enzyme involved in glucose degradation is glucose dehydrogenase (GDH).
  • NAD + is a coenzyme that produces a reductant with an oxidation reaction in the glucose decomposition process.
  • a coenzyme oxidase that oxidizes NADH, which is a reduced form of the coenzyme, is diaphorase (DI).
  • DI diaphorase
  • An electron mediator receives electrons generated from the coenzyme oxidase accompanying the oxidation of the coenzyme and passes them to the electrode 11.
  • glucose permeates through the holes 17 formed in the lipid bilayer membrane constituting the liposome 12 and enters the inside of the liposome 12, and gluconolactone is produced by the decomposition of the glucose by glucose dehydrogenase.
  • the lactone passes through the hole 17 and comes out of the liposome 12.
  • the electron mediator enters and exits the lipid bilayer membrane constituting the liposome 12 and performs electron transfer.
  • FIG. 4 schematically shows an example of an electron transfer reaction by an enzyme, a coenzyme, and an electron mediator in the enzyme-immobilized electrode.
  • the enzyme involved in the decomposition of ethyl alcohol (EtOH) is alcohol dehydrogenase (ADH).
  • NAD + is a coenzyme that generates a reductant with an oxidation reaction in the decomposition process of ethyl alcohol.
  • a coenzyme oxidase that oxidizes NADH, which is a reduced form of the coenzyme, is diaphorase (DI). Then, the electron mediator receives electrons generated from the coenzyme oxidase accompanying the oxidation of the coenzyme and passes them to the electrode 19.
  • ethyl alcohol permeates the lipid bimolecular membrane constituting the liposome 20 and enters the inside of the liposome 20, and acetaldehyde (CH 3 CHO) is generated by the decomposition of the ethyl alcohol by alcohol dehydrogenase.
  • acetaldehyde CH 3 CHO
  • the electron mediator enters and exits the lipid bilayer membrane constituting the liposome 20 and performs electron transfer.
  • the enzyme-immobilized electrode shown in FIG. 4 was actually produced and tested.
  • an enzyme-immobilized electrode was produced as follows. 5 mg of diaphorase (DI) (EC 1.8.1.4, manufactured by Amano Enzyme) was weighed and dissolved in 1 mL of a buffer solution (10 mM phosphate buffer, pH 7) to obtain a DI enzyme buffer solution (1).
  • DI diaphorase
  • ADH alcohol dehydrogenase
  • the buffer solution for dissolving the enzyme is preferably refrigerated until just before, and the enzyme buffer solution is preferably stored as refrigerated as much as possible.
  • NADH buffer solution (3) 35 mg of NADH (manufactured by Sigma Aldrich, N-8129) was weighed and dissolved in 1 mL of buffer solution (10 mM phosphate buffer, pH 7) to obtain NADH buffer solution (3).
  • a liposome buffer solution (5) 100 mg of egg yolk lecithin (manufactured by Wako) was weighed and dissolved in 10 mL of a buffer solution (10 mM phosphate buffer, pH 7) and homogenized with a homogenizer to obtain a liposome buffer solution (5).
  • DI enzyme buffer solution (1) 50 ⁇ L ADH enzyme buffer solution (2): 50 ⁇ L NADH buffer solution (3): 50 ⁇ L Liposome buffer solution (5): 50 ⁇ L
  • the above mixed solution is passed through a gel filtration column to remove enzymes and NADH outside the liposome.
  • the liposome solution obtained here was used as an ADH, DI, NADH-encapsulated liposome solution (6).
  • 5, 6 and 7 are fluorescence micrographs of liposomes encapsulating ADH fluorescently labeled with cyanine dye Cy2 and DI and NADH fluorescently labeled with cyanine dye Cy3.
  • Ex indicates excitation light, has a wavelength described on the right of Ex
  • DM Dichroic mirror
  • BA Barrierfilter
  • BA Barrierfilter
  • FIG. 5 shows the distribution of ADH in which fluorescence is generated by exciting Cy2 with excitation light having a wavelength of 450 to 490 nm.
  • FIG. 6 shows the distribution of DI in which fluorescence is generated by exciting Cy3 with excitation light having a wavelength of 510 to 560 nm.
  • FIG. 7 shows NADH distribution in which NADH is excited by excitation light having a wavelength of 380 to 420 nm to generate fluorescence.
  • the average diameter of the liposomes was 4.6 ⁇ m, and the standard deviation was 2.0 ⁇ m. However, the average diameter of the liposome was determined by measuring the diameters of 30 liposomes in FIGS. 5, 6 and 7 and taking the average of them.
  • FIGS. 8 and 10 are graphs showing the results of fluorescence monitoring of liposomes encapsulating ADH fluorescently labeled with Cy2 and DI and NADH fluorescently labeled with Cy3.
  • FIG. 8 shows the fluorescence intensity from ADH fluorescently labeled with Cy2
  • FIG. 9 shows the fluorescence intensity from DI fluorescently labeled with Cy3
  • FIG. 10 shows the fluorescence intensity from NADH.
  • 8, 9, and 10, Em indicates the light emitted when the dye is excited by the excitation light Ex, and has the wavelength described on the right side of Em. The numerical value in the parenthesis on the right side of the wavelength is the half width. As can be seen from FIGS.
  • the fluorescence intensity did not change up to an ethyl alcohol concentration of 100 mM. That is, it was found that the liposome was stable at least up to an ethyl alcohol concentration of 100 mM, and ADH, DI, and NADH were reliably encapsulated inside the liposome. Further, when 0.3% Triton X as a surfactant was added, the fluorescence intensity increased. This means that the liposome was destroyed by 0.3% Triton X, and internal ADH, DI, and NADH were released outside the liposome, and the fluorescence intensity increased. The state at this time is shown in FIG. 11 taking NADH as an example. As shown in FIG.
  • the fluorescence intensity due to NADH is low when NADH is encapsulated inside the liposome, but when NADH is destroyed and the NADH encapsulated inside is released to the outside of the liposome, it is caused by NADH.
  • the fluorescence intensity increases.
  • the ADH, DI and NADH encapsulated liposome solution (6) thus obtained and the Q0 buffer solution (4) were mixed to prepare a measurement solution having a total volume of 100 ⁇ L.
  • the carbon felt was used as the working electrode, and the reference electrode Ag
  • 0.3 V was set to a potential sufficiently higher than the oxidation-reduction potential of the electron mediator, and chronoamperometry was performed while stirring the solution. During chronoamperometry, ethyl alcohol was added to the measurement solution in such a way that final concentrations of 1, 10, and 100 mM were added.
  • the curve (a) of FIG. 12 shows the results of chronoamperometry when ethyl alcohol was added to the above measurement solution containing ADH, DI, and NADH-encapsulated liposomes as described above.
  • a catalyst current derived from ethyl alcohol is observed, and the catalyst current increases as the concentration of ethyl alcohol increases. That is, the electrochemical catalytic activity by the artificial cells ADH, DI and NADH encapsulated liposomes was observed.
  • the catalyst current obtained when ADH, DI and NADH are not encapsulated in liposomes but simply dispersed in the Q0 buffer solution (4) is ADH, DI and This is only about 1 / 30th of the catalyst current obtained when NADH is encapsulated in liposomes. From this, it is clear that when ADH, DI, and NADH are encapsulated in liposomes, a much higher catalyst current can be obtained than when they are not encapsulated.
  • the liposome 20 encapsulates ADH (indicated by a circle with a horizontal line), DI (indicated by a vertical line with a circle), and NADH (indicated by a blank circle).
  • ADH indicated by a circle with a horizontal line
  • DI indicated by a vertical line with a circle
  • NADH indicated by a blank circle.
  • the volume of the buffer S is, for example, 100 ⁇ L, and the internal volume of the liposome 20 is, for example, about 0.17 ⁇ L.
  • 5.5 ⁇ 10 ⁇ 3 ⁇ mol of phospholipid constituting the lipid bilayer membrane of liposome 20 is present in buffer S, and the total volume inside liposome 20 is 30 ⁇ L / ⁇ mol when converted per 1 ⁇ mol of liposome. is there.
  • concentrations of ADH, DI, and NADH when ADH, DI, and NADH are simply dispersed in buffer S as shown in FIG.
  • ADH, DI, and NADH are present in liposome 20 as shown in FIG.
  • These local concentrations of ADH, DI, and NADH when encapsulated are about 600 times higher. That is, by encapsulating ADH, DI, and NADH in the liposome 20, the concentration of these ADH, DI, and NADH can be remarkably increased, and the distance between these ADH, DI, and NADH can be made extremely small. Can do. For this reason, in the liposome 20, the catalytic cycle by ADH, DI, and NADH advances very rapidly, and a result as shown in FIG. 12 is obtained.
  • the enzyme reaction can be efficiently performed using the minute space inside the liposome 12 as a reaction field. It can be seen that electrons can be efficiently extracted from the substrate.
  • An enzyme-immobilized electrode was produced as follows. 1 to 10 mg of diaphorase (DI) (EC 1.8.1.4, manufactured by Amano Enzyme) was weighed and dissolved in 1 mL of a buffer solution (10 mM phosphate buffer, pH 7) to obtain a DI enzyme buffer solution (11). .
  • DI diaphorase
  • GDH Glucose dehydrogenase
  • the buffer solution for dissolving the enzyme is preferably refrigerated until just before, and the enzyme buffer solution is preferably stored as refrigerated as much as possible.
  • NADH buffer solution 10 to 50 mg of NADH (manufactured by Sigma Aldrich, N-8129) was weighed and dissolved in 1 mL of buffer solution (10 mM phosphate buffer, pH 7) to obtain NADH buffer solution (13).
  • Q0 2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-benzoquinone
  • Egg yolk lecithin (manufactured by Wako) was weighed in an amount of 10 to 100 mg, dissolved in 10 mL of a buffer solution (10 mM phosphate buffer, pH 7), and homogenized with a homogenizer to obtain a liposome buffer solution (15).
  • DI enzyme buffer solution (11) 50 ⁇ L GDH enzyme buffer solution (12): 50 ⁇ L NADH buffer solution (13): 50 ⁇ L Liposome buffer solution (15): 50 ⁇ L
  • the above mixed solution is passed through a gel filtration column to remove enzymes and NADH outside the liposome.
  • the liposome solution obtained here was used as a GDH, DI, NADH-encapsulated liposome solution (16).
  • the GDH, DI and NADH encapsulated liposome solution (16) thus obtained and the Q0 buffer solution (14) were mixed to prepare a measurement solution having a total volume of 100 ⁇ L. Then, carbon felt is used as the working electrode, Ag
  • amphotericin B (AmB) as antibiotic 16 was added to the measurement solution so as to have a final concentration of 100 ⁇ M. Then, a catalytic current derived from glucose was observed. That is, it was found that glucose permeated through the lipid bilayer membrane constituting the liposome and a series of enzyme reactions proceeded inside the liposome. As far as the present inventors know, this is the first time that a catalytic current derived from glucose incorporated into the liposome is observed.
  • FIG. 16 shows the results of performing chronoamperometry while changing the final concentration of amphotericin B added to a measurement solution containing 100 mM glucose as described above to 1, 10, and 100 ⁇ M.
  • the catalyst current increases as the final concentration of amphotericin B added increases.
  • the final concentration of amphotericin B is 100 ⁇ M, the increase in the catalyst current peaked out. Show the trend.
  • FIG. 17 shows the structural formula of amphotericin B.
  • FIG. 18 is a cross-sectional view showing a state where amphotericin B is bound to the lipid bimolecular membrane constituting the liposome 12.
  • FIG. 19 is a plan view showing a state in which amphotericin B is bound to a lipid bilayer membrane (not shown). As shown in FIG. 19, a plurality of amphotericin B cyclically bonded to the lipid bilayer membrane form a hole penetrating the lipid bilayer membrane in a form bordered by these amphotericin B. It has been reported that amphotericin B can form holes in liposomes (see, for example, Non-Patent Document 1). This hole is permeable to glucose, and has a size that prevents the enzymes GDH and DI and the coenzyme NADH from permeating.
  • FIG. 20 is a scanning electron microscope (SEM) photograph of a liposome in which amphotericin B is bound to the lipid bilayer membrane constituting the liposome.
  • FIG. 21 is an SEM photograph of liposomes to which amphotericin B is not bound. However, photographing was performed in a state where a container in which the liposome was immersed in an ionic liquid was placed in a sample chamber of a scanning electron microscope and the sample chamber was evacuated to a high vacuum of 1 Pa or less.
  • the ionic liquid BMIBF 4 : 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate was used.
  • a sample solution was prepared by mixing 10 ⁇ L of liposome suspension and 10 ⁇ L of BMIBF 4 .
  • the method of immersing a sample in an ionic liquid and photographing with an electron microscope has not been used at all so far, and is the first method used by the present inventors.
  • liposomes to which amphotericin B is not bound have a spherical shape.
  • the liposome to which amphotericin B is bonded has a spherical shape with a small protrusion around it. This protrusion corresponds to the portion where amphotericin B is bound.
  • Example 1 Next, the results of a detailed study of the effectiveness of binding sterol 18 to the lipid bilayer membrane constituting liposome 12 will be described. Cholesterol was used as sterol 18. Antibiotic 16 is also used for this verification.
  • An enzyme-immobilized electrode was produced as follows. 1 to 10 mg of diaphorase (DI) (EC 1.8.1.4, manufactured by Amano Enzyme) was weighed and dissolved in 1 mL of a buffer solution (10 mM phosphate buffer, pH 7) to obtain a DI enzyme buffer solution (17). .
  • DI diaphorase
  • GDH Glucose dehydrogenase
  • the buffer solution for dissolving the enzyme is preferably refrigerated until just before, and the enzyme buffer solution is preferably stored as refrigerated as much as possible.
  • NADH buffer solution 10-50 mg of NADH (manufactured by Sigma Aldrich, N-8129) was weighed and dissolved in 1 mL of buffer solution (10 mM phosphate buffer, pH 7) to obtain NADH buffer solution (19).
  • Q0 2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-benzoquinone
  • the above mixed solution is passed through a gel filtration column to remove enzymes and NADH outside the liposome.
  • the liposome solution obtained here was used as a GDH, DI, and NADH encapsulated liposome solution (22).
  • FIGS. 23 and 24 show the results of chronoamperometry of two examples performed under the same conditions except that cholesterol is not bound. As shown in FIGS. 23 and 24, a decrease in current is observed in liposomes not bound with cholesterol, whereas liposomes bound with cholesterol show a steady current as shown in FIG. From this, it was confirmed that by binding sterol, the amphotericin B-bound liposome was structurally stabilized, glucose permeation was improved, and a more stable catalytic current was exhibited. That is, it can be seen that binding of sterol is a very useful substance for using liposome as an electrochemical catalyst.
  • the electrochemical analysis was performed using, instead of liposomes, amphotericin B and cholesterol or ergosterol bound as sterols to a flat lipid bilayer.
  • FIG. 25 shows an electrochemical measuring apparatus used for electrochemical analysis.
  • this electrochemical measuring apparatus two containers W1 and W2 are connected so that a hole H1 and a hole H2 formed in their walls coincide with each other.
  • a lipid bimolecular membrane BLM is provided between the hole H1 and the hole H2 so as to partition the inside of the container W1 and the inside of the container W2.
  • Amphotericin B and cholesterol were bound to the lipid bilayer membrane BLM.
  • As the lipid bilayer membrane BLM one made of phosphatidylcholine was used.
  • a supporting electrolyte SE made of a buffer solution is placed in each of the containers W1 and W2.
  • the counter electrode CE and the reference electrode RE are immersed in the supporting electrolyte SE in the container W1, the working electrode WE is immersed in the supporting electrolyte SE in the container W2, and the potentiostat P is placed in the counter electrode CE, the reference electrode RE, and the working electrode WE.
  • Platinum (Pt) was used as the counter electrode CE
  • AgCl was used as the reference electrode RE and the working electrode WE.
  • the buffer solution used as the supporting electrolyte SE in the containers W1 and W2 is 10 ⁇ 2 M BisTris-HEPES (pH 7.4).
  • the amount of amphotericin B is 5 ⁇ 10 ⁇ 7 M.
  • 0.01M sodium lactate was added to the supporting electrolyte SE in the container W1, and c times, that is, 0.01 ⁇ cM sodium lactate was added to the supporting electrolyte SE in the container W2.
  • FIG. 27 shows the results of electrochemical measurement. As shown in FIG. 27, as c increases, the current j becomes a large negative value, and the potential at which the current becomes zero (zero current potential) shifts positively.
  • FIG. 28 schematically shows the distribution of lactate ions and Na + in the supporting electrolyte SE in the containers W1 and W2. As shown in FIG. 28, in order to make the movement of lactate ions and Na + due to the concentration gradient zero, a positive voltage E must be applied. This shows that amphotericin B has anion selectivity.
  • FIG. 29 schematically shows the distribution of Na + and lactate ions (Org ⁇ ) in the supporting electrolyte SE in the containers W1 and W2.
  • the concentration of Na + in the supporting electrolyte SE in the container W1 is [Na + ] W1
  • the concentration of lactate ion (Org ⁇ ) is [Org ⁇ ] W1
  • the concentration of Na + in the supporting electrolyte SE in the container W2 is [
  • the concentration of Na + ] W2 and lactate ions (Org ⁇ ) is expressed as [Org ⁇ ] W2 .
  • the concentration of Na + in the portion of the lipid bilayer membrane BLM in contact with the supporting electrolyte SE in the container W1 is expressed as [Na + ] M1
  • the concentration of lactate ion (Org ⁇ ) is expressed as [Org ⁇ ] M1
  • the Na + concentration in the supporting electrolyte SE in the container W2 is represented as [Na + ] M2
  • the lactate ion (Org ⁇ ) concentration is represented as [Org ⁇ ] M2 .
  • the diffusion coefficient of Na + and Org ⁇ is expressed as D Na + and D Org ⁇ , respectively, and the diffusion coefficient ratio Then, It can be expressed as.
  • R is a gas constant
  • F is a Faraday constant
  • T is an absolute temperature.
  • FIG. 32 shows ⁇ values of various organic acid ions with respect to the molecular weight of the organic acid.
  • FIGS. 33 and 34 show the results of electrochemical measurements when cholesterol and ergosterol were used as sterols, respectively.
  • amphotericin B was affected and the permeation of sodium lactate was controlled by binding sterol in addition to amphotericin B to the lipid bilayer membrane constituting the liposome.
  • anion selectivity of amphotericin B is increased by binding sterol to the lipid bilayer membrane BLM in addition to amphotericin B, and sodium lactate is easily permeated. That is, by using sterols, the permeation of organic acids and anion selectivity can be controlled.
  • FIG. 35 shows the diffusion coefficient ratio ⁇ of various organic acids with respect to the molecular weight of the organic acid when cholesterol or ergosterol is used.
  • the diffusion coefficient ratio ⁇ is greater when cholesterol is used than when ergosterol is used. This is considered to be due to the reduced permeability of all organic acid ions to Na + when ergosterol is used compared to when cholesterol is used.
  • FIG. 36 shows the electrochemical measurement system used. As shown in FIG. 36, a biosensor in which glucose oxidase (GOD), peroxidase (POD) and ferrocene were immobilized on a carbon paste electrode CP was produced. And glucose was enclosed in a liposome and the elution of glucose by addition of amphotericin B was measured.
  • GOD glucose oxidase
  • POD peroxidase
  • ferrocene ferrocene
  • Fig. 37 shows the measurement results.
  • the vertical axis represents glucose concentration c
  • the horizontal axis represents time t.
  • the glucose elution rate is theoretically determined as follows.
  • V the initial glucose concentration as c in
  • c out the glucose concentration outside the liposome
  • k is a constant indicating the permeability of the amphotericin B hole.
  • k can be calculated by fitting the expression of c out with the experimental result shown in FIG. As a result, k when using cholesterol was 6.1 ⁇ 1.8 ⁇ 10 ⁇ 5 s ⁇ 1 and k when using ergosterol was 6.3 ⁇ 0.3 ⁇ 10 ⁇ 5 s ⁇ 1. It was almost the same. This shows that the diameter of the hole of amphotericin B does not change for both cholesterol and ergosterol.
  • FIG. 38 the advantage when ergosterol is bound to the liposome will be described.
  • a neutral substance such as glucose
  • an anion such as an organic acid
  • the substrate uptake from the amphotericin B hole is reduced. Without any problem, leakage of the intermediate to the outside of the liposome can be suppressed by reducing the anion selectivity of amphotericin B by ergosterol.
  • FIG. 39A shows the time change of glucose concentration when using a monolayer liposome having a diameter of 50 nm combined with cholesterol
  • FIG. 39B shows the time change of glucose concentration when using a monolayer liposome having a diameter of 100 nm combined with cholesterol.
  • FIG. 40 shows the change in glucose concentration over time when multilamellar liposomes bound with cholesterol are used. From FIGS. 39A and B and FIG. 40, no elution of glucose is observed until amphotericin B is added in both unilamellar liposomes and multilamellar liposomes.
  • FIG. 41A shows the time change of the glucose concentration when using a monolayer liposome having a diameter of 100 nm combined with ergosterol
  • FIG. 41B shows the time change of the glucose concentration when using a multilayer liposome combined with ergosterol.
  • the antibiotic 16 is bonded to the lipid bilayer membrane to form the hole 17, and the sterol 18 is further bonded to the inside of the liposome 12, for example, a substrate such as glucose.
  • Enzymes 13 and 14 and coenzyme 15 necessary for an enzymatic reaction for decomposing organic acids and organic acids are enclosed.
  • the liposome 12 is immobilized on the electrode 11. For this reason, the enzyme reaction can be efficiently performed using the minute space inside the liposome 12 as a reaction field, and electrons can be efficiently extracted from glucose as a substrate and transferred to the electrode 11. Further, the immobilization can be easily performed as compared with the conventional case in which an enzyme or the like is directly immobilized on the electrode 11 by a polyion complex or the like.
  • Second Embodiment> [Bio fuel cell] Next explained is the second embodiment of the invention.
  • the enzyme-immobilized electrode according to the first embodiment is used as the negative electrode of the biofuel cell.
  • FIG. 42 schematically shows this biofuel cell.
  • glucose is used as a fuel.
  • FIG. 43 schematically shows details of the configuration of the negative electrode of this biofuel cell, an example of an enzyme group and a coenzyme enclosed in the liposome 12 immobilized on the negative electrode, and an electron transfer reaction by the enzyme group and the coenzyme. Shown in
  • this biofuel cell has a structure in which the negative electrode 21 and the positive electrode 22 face each other with the electrolyte layer 23 therebetween.
  • the negative electrode 21 decomposes glucose supplied as fuel with an enzyme to extract electrons and generate protons (H + ).
  • the positive electrode 22 generates water by protons transported from the negative electrode 21 through the electrolyte layer 23, electrons sent from the negative electrode 21 through an external circuit, and oxygen in the air, for example.
  • the enzyme-immobilized electrode As the negative electrode 21, the enzyme-immobilized electrode according to the first embodiment is used. Specifically, the enzyme-immobilized electrode is obtained by immobilizing an antibiotic 11 having a hole 17 capable of permeating glucose and a sterol 18 bound to a lipid bimolecular membrane on the electrode 11. It is. Encapsulated in the liposome 12 are enzymes involved in the degradation of glucose, a coenzyme that produces a reductant during the oxidation process in the glucose degradation process, and a coenzyme oxidase that oxidizes the reductant of the coenzyme. ing. On the electrode 11, if necessary, in addition to the liposome 12, an electron mediator that receives electrons generated from the coenzyme oxidase accompanying the oxidation of the coenzyme and passes it to the electrode 11 is also immobilized.
  • glucose dehydrogenase preferably NAD-dependent glucose dehydrogenase
  • NAD-dependent glucose dehydrogenase preferably NAD-dependent glucose dehydrogenase
  • ⁇ -D-glucose can be oxidized to D-glucono- ⁇ -lactone.
  • this D-glucono- ⁇ -lactone can be decomposed into 2-keto-6-phospho-D-gluconate in the presence of two enzymes, gluconokinase and phosphogluconate dehydrogenase (PhGDH).
  • D-glucono- ⁇ -lactone is converted to D-gluconate by hydrolysis, and D-gluconate is converted to adenosine triphosphate (ATP) and adenosine diphosphate (ADP) in the presence of gluconokinase. And then phosphorylated to 6-phospho-D-gluconate.
  • This 6-phospho-D-gluconate is oxidized to 2-keto-6-phospho-D-gluconate by the action of the oxidase PhGDH.
  • glucose can be decomposed to CO2 using sugar metabolism.
  • the decomposition process utilizing sugar metabolism is roughly divided into glucose decomposition and pyruvic acid generation by a glycolysis system and a TCA cycle, which are widely known reaction systems.
  • the oxidation reaction in the monosaccharide decomposition process is accompanied by a coenzyme reduction reaction.
  • This coenzyme is almost determined by the acting enzyme.
  • NAD + is used as the coenzyme. That is, when ⁇ -D-glucose is oxidized to D-glucono- ⁇ -lactone by the action of GDH, NAD + is reduced to NADH to generate H + .
  • NADH is immediately oxidized to NAD + in the presence of diaphorase (DI), generating two electrons and H + . Therefore, two electrons and two H + are generated by one-step oxidation reaction per glucose molecule. In the two-stage oxidation reaction, a total of four electrons and four H + are generated.
  • DI diaphorase
  • the electrons generated in the above process are transferred from diaphorase to the electrode 11 via the electron mediator, and H + is transported to the positive electrode 22 through the electrolyte layer 23.
  • the liposome 12 encapsulating the enzyme and coenzyme and the electron mediator are provided with a buffer such as a phosphate buffer or a Tris buffer contained in the electrolyte layer 23 so that the electrode reaction can be performed efficiently and constantly.
  • the solution is preferably maintained at an optimum pH for the enzyme, for example, around pH 7.
  • a phosphate buffer for example, NaH 2 PO 4 or KH 2 PO 4 is used.
  • the ionic strength (IS) is too large or too small to adversely affect the enzyme activity, but considering the electrochemical response, it should be an appropriate ionic strength, for example, about 0.3. Is preferred.
  • pH and ionic strength have optimum values for each enzyme used, and are not limited to the values described above.
  • glucose dehydrogenase is an enzyme involved in the degradation of glucose
  • NAD + is a coenzyme that produces a reductant in the oxidation reaction in the glucose degradation process, and a reductant of coenzyme.
  • DI diaphorase
  • ACNQ the electron mediator that receives electrons from the coenzyme oxidase accompanying the oxidation of the coenzyme and passes it to the electrode 11 is ACNQ is shown.
  • the positive electrode 22 is obtained by immobilizing an enzyme that decomposes oxygen, such as bilirubin oxidase, laccase, and ascorbate oxidase, on an electrode made of an electrode material such as porous carbon.
  • the outer part of the positive electrode 22 (the part opposite to the electrolyte layer 23) is usually formed by a gas diffusion layer made of porous carbon, but is not limited thereto.
  • an electron mediator that transfers electrons to and from the positive electrode 22 is also immobilized on the positive electrode 22.
  • the electrolyte layer 23 is for transporting H + generated in the negative electrode 21 to the positive electrode 22, and is made of a material that does not have electron conductivity and can transport H + .
  • Specific examples of the electrolyte layer 23 include those already mentioned, such as cellophane.
  • the glucose when glucose is supplied to the negative electrode 21 side, the glucose is decomposed by a decomposing enzyme including an oxidase. Since the oxidase is involved in the monosaccharide decomposition process, electrons and H + can be generated on the negative electrode 21 side, and a current can be generated between the negative electrode 21 and the positive electrode 22.
  • a decomposing enzyme including an oxidase. Since the oxidase is involved in the monosaccharide decomposition process, electrons and H + can be generated on the negative electrode 21 side, and a current can be generated between the negative electrode 21 and the positive electrode 22.
  • this biofuel cell has a configuration in which the negative electrode 21 and the positive electrode 22 face each other with the electrolyte layer 23 therebetween.
  • Ti current collectors 41 and 42 are placed under the positive electrode 22 and the negative electrode 21, respectively, so that current collection can be performed easily.
  • Reference numerals 43 and 44 denote fixed plates. The fixing plates 43 and 44 are fastened to each other by screws 45, and the positive electrode 22, the negative electrode 21, the electrolyte layer 23, and the Ti current collectors 41 and 42 are sandwiched between them.
  • One surface (outer surface) of the fixing plate 43 is provided with a circular recess 43a for taking in air, and a plurality of holes 43b penetrating to the other surface are provided in the bottom surface of the recess 43a. These holes 43 b serve as air supply paths to the positive electrode 22.
  • a circular recess 44a for fuel loading is provided on one surface (outer surface) of the fixing plate 44, and a number of holes 44b penetrating to the other surface are provided on the bottom surface of the recess 44a. These holes 44 b serve as a fuel supply path to the negative electrode 21.
  • a spacer 46 is provided on the periphery of the other surface of the fixing plate 44, and when the fixing plates 43 and 44 are fastened to each other with screws 45, the interval between them becomes a predetermined interval. .
  • a load 47 is connected between the Ti current collectors 41 and 42, and a glucose solution in which glucose is dissolved in, for example, a phosphate buffer solution is put into the recess 44a of the fixed plate 44 to generate power. .
  • the liposomes 12 on which the antibiotics 16 having the holes 17 and the sterols 18 are bound to the lipid bimolecular membrane are encapsulated on the electrode 11.
  • the enzyme-immobilized electrode immobilized on is used as the negative electrode 21.
  • the enzyme reaction can be efficiently performed using the minute space inside the liposome 12 as a reaction field, and electrons can be efficiently extracted from the fuel glucose and transferred to the electrode 11, as well as enzymes, etc. Can be immobilized more easily than the case of directly immobilizing on the electrode 11 with a polyion complex or the like.
  • the enzyme-immobilized electrode used as the negative electrode 21 is highly efficient, a highly efficient biofuel cell can be realized.
  • the biofuel cell according to the third embodiment is the same as the biofuel cell according to the second embodiment except that a porous conductive material as shown in FIGS. 45A and 45B is used for the electrode material of the negative electrode 21. It has a configuration.
  • FIG. 45A schematically shows the structure of the porous conductive material
  • FIG. 45B is a cross-sectional view of the skeleton of the porous conductive material.
  • this porous conductive material includes a skeleton 79a made of a porous material having a three-dimensional network structure and a carbon-based material 79b covering the surface of the skeleton 79a. Liposomes 12 similar to those of the second embodiment are immobilized on the surface of the material 79b.
  • This porous conductive material has a three-dimensional network structure in which a large number of holes 80 surrounded by the carbon-based material 79b correspond to a network. In this case, these holes 80 communicate with each other.
  • the form of the carbon-based material 79b is not limited and may be any of fibrous (needle-like) or granular.
  • the skeleton 79a made of the porous material foam metal or foam alloy, for example, foam nickel is used.
  • the porosity of the skeleton 79a is generally 85% or more, or 90% or more, and the pore diameter is generally, for example, 10 nm to 1 mm, alternatively 10 nm to 600 ⁇ m, alternatively 1 to 600 ⁇ m, typically 50 ⁇ 300 ⁇ m, more typically 100 to 250 ⁇ m.
  • the carbon-based material 79b is preferably a highly conductive material such as ketjen black, but a functional carbon material such as carbon nanotube or fullerene may be used.
  • the porosity of the porous conductive material is generally 80% or more, or 90% or more, and the diameter of the hole 80 is typically 9 nm to 1 mm, alternatively 9 nm to 600 ⁇ m, alternatively 1 to 600 ⁇ m, typically Typically 30 to 400 ⁇ m, more typically 80 to 230 ⁇ m.
  • a method for producing this porous conductive material will be described.
  • a skeleton 79a made of a foam metal or a foam alloy (for example, foam nickel) is prepared.
  • a carbon-based material 79b is coated on the surface of the skeleton 79a made of this foam metal or foam alloy.
  • this coating method a conventionally known method can be used.
  • the carbon-based material 79b is coated by spraying an emulsion containing carbon powder, a suitable binder, or the like onto the surface of the skeleton 79a by spraying.
  • the coating thickness of the carbon-based material 79b is determined in accordance with the porosity and pore size required for the porous conductive material in consideration of the porosity and pore size of the skeleton 79a made of foam metal or foam alloy. In this coating, a large number of holes 80 surrounded by the carbon-based material 79b communicate with each other.
  • the target porous conductive material is manufactured. Thereafter, the liposome 12 is immobilized on the surface of the carbon-based material 79b of the porous conductive material.
  • the other than the above is the same as that of the second embodiment.
  • the porous conductive material in which the surface of the skeleton 79a made of a foam metal or a foam alloy is coated with the carbon-based material 79b has a sufficiently large hole 80 diameter and a rough three-dimensional network structure, while having a high strength. In addition, it has high conductivity and can provide a necessary and sufficient surface area.
  • the negative electrode 21 composed of an enzyme / coenzyme / electron mediator immobilized electrode obtained by immobilizing an enzyme, a coenzyme and an electron mediator on the porous conductive material is used as an electrode material.
  • the enzyme metabolic reaction can be performed with high efficiency, or the enzyme reaction phenomenon occurring in the vicinity of the electrode can be efficiently captured as an electrical signal, and is stable regardless of the use environment, It is possible to realize a high-performance biofuel cell.
  • an antibiotic having a hole capable of permeating glucose in a lipid bimolecular film constituting a cell membrane of a cell obtained by culturing a cell collected from a living organism or a cell collected from an organism. And binds sterols.
  • FIG. 47 shows a part of a cell membrane 81 composed of a lipid bimolecular membrane on the outer periphery of the cell.
  • this cell is an animal cell is considered, it may be a plant cell.
  • These cells mainly include the nucleus, organelles such as mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, lysosome, and water in which various ions, nutrients, enzymes, and the like are dissolved.
  • various proteins 82, 83, 84, etc. are embedded in the cell membrane 81 of this cell.
  • the protein 82 is a pump protein that transports ions and the like from the outside to the inside of the cell
  • the protein 83 is an intramembrane protein
  • the protein 84 is a channel protein that has a function of transporting a specific molecule into and out of the cell.
  • the antibiotic 16 is bound to the cell membrane 81, and one or a plurality of holes 17 capable of permeating glucose are formed, and further sterol 18 is bound. is doing.
  • the cells configured as described above are immobilized on an electrode made of porous carbon or the like by a conventionally known method.
  • glucose when the above cells are placed in a buffer solution containing glucose or the like, for example, glucose can be taken in through the hole 17 of the cell membrane 81.
  • the glucose thus taken into the cell is decomposed by a metabolic system such as a citrate circuit, a glycolysis system, and a pentose phosphate circuit of the cell, and electrons are taken out.
  • the electrons taken out in this way are finally delivered to the electrode on which the cells are immobilized via the electron mediator or directly without the electron mediator and taken out to the outside.
  • electric energy can be extracted from glucose.
  • FIG. 48 shows mitochondria. As shown in FIG. 48, the mitochondria have an outer membrane 85 and an inner membrane 86. These outer membrane 85 and inner membrane 86 are cell membranes composed of lipid bimolecular membranes. The inner membrane 86 forms a pleated crystal. Various enzymes are concentrated in the matrix cavity 87 inside the inner membrane 86. The final stage of molecular oxidation occurs at the inner membrane 86. Antibiotics 16 are bound to the cell membranes constituting the mitochondrial outer membrane 85 and inner membrane 86, one or more holes 17 capable of permeating glucose are formed, and sterols 18 are further bound. .
  • the mitochondria configured as described above are immobilized on an electrode made of porous carbon or the like by a conventionally known method.
  • glucose when the mitochondria are placed in a buffer solution containing glucose or the like, glucose can be taken in through the holes 17 of the outer membrane 85 and the inner membrane 86.
  • the glucose thus taken into the mitochondria is decomposed by the oxidation system of the molecules of the mitochondria, that is, the citrate circuit, glycolysis system, pentose phosphate circuit, etc., and electrons are taken out.
  • the electrons taken out in this way are finally transferred to the electrode on which the mitochondria are immobilized via the electron mediator or directly without the electron mediator and taken out to the outside.
  • electric energy can be extracted from glucose.
  • Fig. 49 shows bacteria.
  • this bacterium is an eubacteria.
  • this bacterium is surrounded by a capsule 88, a cell wall 89, and a cell membrane 90 in order from the outside, and contains a cytoplasm 91 therein.
  • Flagella 92 and cilia 93 are bound to the outside of this bacterium.
  • some bacteria lack the capsule 88, flagella 92, and cilia 93.
  • E. coli does not have these capsules 88, flagella 92, and cilia 93.
  • nucleoids, ribosomes and the like are present.
  • Proteins such as an electron transport system and various transporters are distributed in the cell membrane 90.
  • Antibiotic 16 is bound to cell membrane 90 made of this bacterial lipid bilayer, one or a plurality of holes 17 capable of permeating glucose are formed, and sterol 18 is further bound.
  • Bacteria configured as described above are immobilized on an electrode made of porous carbon or the like by a conventionally known method.
  • glucose when this bacterium is placed in a buffer solution or the like containing glucose, glucose can be taken in through the hole 17 of the cell membrane 90 of this bacterium.
  • the glucose thus taken into the inside of the bacterium is decomposed by a metabolic system such as a citrate circuit, a glycolysis system, and a pentose phosphate circuit of the bacterium, and an electron is taken out.
  • the electrons thus extracted are finally transferred to the electrode on which the bacteria are immobilized via the electron mediator or directly without the electron mediator, and taken out to the outside.
  • electric energy can be extracted from glucose.
  • the biofuel cell according to the seventh embodiment is the same as the biofuel cell according to the second embodiment except that a porous electrode as shown in FIGS. 50A and B is used as the electrode 11 of the negative electrode 21. It has a configuration.
  • FIG. 50A shows the overall configuration of the electrode 11 made of this porous electrode
  • FIG. 50B schematically shows the cross-sectional structure of the electrode 11.
  • the electrode 11 made of this porous electrode has a large number of pores 11a.
  • the same liposome 12 as in the second embodiment (enzymes and coenzymes enclosed in the internal aqueous phase, antibiotics bound to the lipid bilayer, holes bordered by the antibiotics, etc.) Is omitted).
  • these holes 11a communicate with each other.
  • a carbon-based material is preferably used, but the material is not limited to this.
  • This porous electrode is typically a carbon paste electrode.
  • the liposome 12 can be fixed to the inner surface of the hole 11a of the electrode 11 made of this porous electrode by allowing a solution containing the liposome 12 to penetrate into the electrode 11.
  • the other than the above is the same as that of the second embodiment. According to the seventh embodiment, the same advantages as those of the third embodiment can be obtained.
  • FIG. 51 shows an enzyme-immobilized electrode according to the eighth embodiment.
  • glucose is used as a substrate.
  • avidin 101 is immobilized on the surface of electrode 11 made of porous carbon or the like (including the inner surface of the hole inside electrode 11).
  • biotin 102 is bound to the same liposome 12 as in the first embodiment.
  • avidin 101 immobilized on the surface of electrode 11 and biotin 102 bound to liposome 12 are irreversibly specifically bound.
  • FIG. 51 a case where one biotin 102 is bound to one liposome 12 is shown, but a plurality of biotins 102 may be bound to one liposome 12.
  • Enzymes 13 and 14 and coenzyme 15 involved in the target enzyme reaction are encapsulated in the aqueous phase 12a inside the liposome 12.
  • an electron mediator may be enclosed in the aqueous phase 12 a inside the liposome 12. This electron mediator may be immobilized on the electrode 11 together with the liposome 12.
  • Enzyme 13 is an oxidase that promotes and decomposes the oxidation of glucose used as a substrate, and enzyme 14 returns coenzyme 15 that has been reduced due to the oxidation of glucose to an oxidant and also sends electrons to electrode 11 via an electron mediator. It is a coenzyme oxidase that passes.
  • one or a plurality of antibiotics and sterols are bound to the lipid bilayer membrane constituting the liposome 12, and this antibiotic is surrounded by this antibiotic. A hole penetrating the lipid bilayer membrane is formed.
  • This enzyme-immobilized electrode can be produced, for example, as follows. First, the liposomes 12 in which the enzymes 13 and 14 and the coenzyme 15 are encapsulated and the biotin 102 is bound to the outer peripheral surface are prepared. In order to bind the biotin 102 to the liposome 12, for example, biotin 102 modified with NHS ester is used for dehydration condensation with a phospholipid such as phosphatidylethanolamine to form an amide bond. Next, an antibiotic is bound to the lipid bilayer membrane constituting the liposome 12 to form a hole, and sterol is bound to the lipid bilayer membrane.
  • avidin 101 is immobilized on the surface of the electrode 11.
  • a carbon paste electrode mixed with agarose beads to which the avidin 101 is bonded is used as the electrode 11, or the avidin 101 is poly-L-lysine on the surface of the electrode 11. Or embedded in a polymer such as (PLL).
  • the liposome 12 is immobilized on the electrode 11 by binding the avidin 101 thus immobilized on the surface of the electrode 11 and the biotin 102 bound to the liposome 12 having the holes 17 formed therein. As a result, an enzyme-immobilized electrode is produced.
  • Antibiotics may be bound to the lipid bimolecular membrane constituting the liposome 12 before encapsulating the enzymes 13 and 14 and the coenzyme 15 to form holes, and sterols may be bound. Further, after immobilizing the liposome 12 on the electrode 11, an antibiotic may be bound to the lipid bimolecular membrane constituting the liposome 12 to form a hole, and a sterol may be bound.
  • Example 2 An enzyme-immobilized electrode was produced as follows. Here, however, sterol is not bound to the liposome in order to exclude the effect of sterol.
  • Diaphorase (DI) (EC 1.8.1.4, manufactured by Amano Enzyme) was weighed in 5 mg and dissolved in 1 mL of a buffer solution (10 mM phosphate buffer, pH 7) to prepare a 5 mg / mL DI enzyme buffer solution. .
  • GDH Glucose dehydrogenase
  • the buffer solution for dissolving the enzyme is preferably refrigerated until just before, and the enzyme buffer solution is preferably stored as refrigerated as much as possible.
  • NADH (manufactured by Sigma) was dissolved in a buffer solution (10 mM phosphate buffer, pH 7) to prepare a 50 mM NADH buffer solution.
  • Egg yolk lecithin manufactured by Wako
  • biotin-modified phosphatidylethanolamine (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (capbiotinyl)
  • Wako Wako
  • biotin-modified phosphatidylethanolamine (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (capbiotinyl)
  • the liposome solution obtained as described above is transferred to a 1.5 mL tube, and the remaining liposome solution is also collected with 50 ⁇ L of 100 mM phosphate buffer, and 1500 g using 1 mL of 100 mM phosphate buffer, Wash twice by centrifugation at 4 min.
  • the GDH, DI and NADH encapsulated biotin-modified liposomes thus obtained are suspended in 600 ⁇ L of 0.1 M phosphate buffer, amphotericin B is added to a final concentration of 1 mM, and mixed by vortexing.
  • biotin-modified liposomes in which GDH, DI, and NADH are encapsulated and amphotericin B is bound are prepared.
  • An avidin modified electrode was produced as follows. Add 100 ⁇ L of avidin agarose bead suspension to 200 mg of carbon paste (manufactured by BAS Co., Ltd.) mixed with graphite powder of uniform particle size and paraffin oil used as an adhesive, and knead with light force on an agate mortar. Include. Next, the avidin-containing carbon paste thus obtained is dried in a desiccator for 1 hour or more, and then kneaded into a pocket portion of an electrode having a pocket portion (concave portion) on the upper surface. Thereafter, the upper surface side of the electrode was pressed in a circle on a copy paper to flatten the surface. An avidin modified electrode is produced as described above.
  • biotin-modified liposomes encapsulating GDH, DI, and NADH and bound with amphotericin B were immobilized on an avidin-modified electrode as follows.
  • the avidin-modified electrode prepared as described above is immersed in 300 ⁇ L of the biotin-modified liposome prepared as described above. Then, after incubation at room temperature for 1 hour, the cells are washed twice with 500 ⁇ L of 0.1 M phosphate buffer.
  • FIG. 52 shows a biotin-modified liposome in which GDH, DI, and NADH are encapsulated and amphotericin B is bound to an avidin-modified electrode.
  • a carbon paste electrode 104 is embedded in a pocket portion 103 a provided on the upper surface of the electrode 103, and the avidin 101 is fixed to the carbon paste electrode 104.
  • the avidin 101 and the biotin 102 of the liposome 12 are bonded to each other, so that the liposome 12 is bonded to the carbon paste electrode 104 and immobilized.
  • Enzymes 13 and 14 and coenzyme 15 enclosed in aqueous phase 12a inside liposome 12 are GDH, DI and NADH, respectively.
  • the electrochemical response of the liposome-immobilized electrode prepared as described above was measured.
  • a liposome-immobilized electrode similar to the above except that the avidin 101 is not immobilized on the carbon paste electrode 104 (hereinafter referred to as CPE-BioLipo as necessary).
  • CPE-BioLipo carbon paste electrode 104
  • FIG. 54 a liposome-immobilized electrode similar to the above except that biotin 102 is not bound to the liposome 12 (hereinafter abbreviated as AviCPE-Lipo as necessary). Produced.
  • a fixed electrode hereinafter abbreviated as CPE-Lipo as required
  • FIG. 56 Each current (I) -time curve in FIG. 56 is shown with an offset of 0.03 ⁇ A added, but the base current values are comparable.
  • ViCPE-BioLipo a liposome-immobilized electrode
  • avidin 101 is immobilized on the carbon paste electrode 104 and biotin 102 is bound to the liposome 12
  • 0.015 ⁇ A It can be seen that 0.023 ⁇ A and a relatively high current value response can be seen compared with other liposome-immobilized electrodes (CPE-BioLipo, AviCPE-Lipo, CPE-Lipo).
  • the antibiotic 16 is bonded to the lipid bilayer membrane to form the hole 17, and glucose is decomposed inside the liposome 12 to which the sterol 18 is bonded.
  • Enzymes 13 and 14 and a coenzyme 15 necessary for the enzyme reaction to enclose are encapsulated.
  • the avidin 101 is immobilized on the electrode 11, the biotin 102 is bound to the liposome 12, and the avidin 101 immobilized on the electrode 11 and the biotin 102 bound to the liposome 12 are bound, whereby the liposome 12 is bound to the electrode 11. Is fixed.
  • the liposome 12 can be fixed to the electrode 11 easily and reliably and firmly can be acquired.
  • This liposome-immobilized electrode is suitable for use as, for example, a negative electrode of a biofuel cell.
  • FIG. 57 shows an enzyme-immobilized electrode according to the ninth embodiment.
  • glucose is used as a substrate.
  • the multilayer liposome 12 is immobilized on the surface of the electrode 11 by utilizing the fact that avidin 101 has four biotin binding pockets. That is, as in the eighth embodiment, the avidin 101 immobilized on the surface of the electrode 11 and the biotin 102 bound to the liposome 12 are irreversibly and specifically bound to each other, thereby causing the liposome on the surface of the electrode 11. 12 is fixed. In addition, in this case, a plurality of (two in the example shown in FIG. 57) biotins 102 are bound to the liposome 12 immobilized on the surface of the electrode 11.
  • Biotin 102 that is not used for immobilizing liposome 12 immobilized on the surface of electrode 11 on the surface of electrode 11 is bonded to avidin 101 that is not immobilized on the surface of electrode 11. And this avidin 101 and the one or two or more biotin 102 couple
  • the multilayer liposome 12 is immobilized on the surface of the electrode 11.
  • Others are the same as in the eighth embodiment.
  • the method of immobilizing the liposomes on the electrode according to the present invention using specific binding between avidin and biotin, etc. is also used when the lipid bilayer membrane constituting the liposome does not have a hole through which glucose can permeate. It is an effective method.
  • the fuel is not limited to glucose, and various fuels including alcohol can be used.

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Abstract

　一種または複数種の酵素あるいはさらに補酵素を微小な空間に閉じ込め、この空間を反応場として酵素反応を行うことによりグルコースなどから効率的に電子を取り出して電気エネルギーを発生させることができ、これらの酵素あるいはさらに補酵素の電極への固定も容易に行うことができる燃料電池およびその製造方法を提供する。酵素反応に必要な酵素１３、１４および補酵素１５をリポソーム１２に封入し、リポソーム１２を構成する脂質２分子膜に抗生物質１６を結合させることによりグルコースの透過が可能な一つまたは複数の穴１７を形成し、かつ脂質２分子膜にステロール１８を結合させる。このリポソーム１２を多孔質カーボンなどからなる電極の表面に固定化して酵素固定化電極を形成する。この酵素固定化電極を例えばバイオ燃料電池の負極として用いる。

Description

燃料電池、燃料電池の製造方法、電子機器、酵素固定化電極、バイオセンサー、エネルギー変換素子、細胞、細胞小器官および細菌
　この発明は、燃料電池、燃料電池の製造方法、電子機器、酵素固定化電極、バイオセンサー、エネルギー変換素子、細胞、細胞小器官および細菌に関する。より詳細には、この発明は、例えば、燃料または基質としてグルコースを用いるバイオ燃料電池、バイオセンサーおよびエネルギー変換素子ならびにバイオ燃料電池を電源に用いた各種の電子機器に適用して好適なものである。
　近年、酵素を用いた燃料電池（バイオ燃料電池）が注目されている（例えば、特許文献１～１２参照。）。このバイオ燃料電池は、燃料を酵素により分解してプロトン（Ｈ+）と電子とに分離するもので、燃料としてメタノールやエタノールなどのアルコール類あるいはグルコースなどの単糖類あるいはデンプンなどの多糖類を用いたものが開発されている。
　このバイオ燃料電池においては、電極に対する酵素の固定化・配列が非常に重要であることが分かっている。また、電子を伝達する役目を果たす電子メディエーターが酵素とともに有効に存在する必要性もあることが分かっている。従来の酵素の固定化方法は様々なものがあるが、その中でも本発明者らは、プラスに電荷を帯びたポリマーとマイナスに電荷を帯びたポリマーとを酵素と適当な割合で混合して多孔質カーボンなどからなる電極上に塗布することにより、電極との接着性を保ちつつ固定化膜を安定化させるポリイオンコンプレックス法やグルタルアルデヒド法を主体に開発してきた。
　しかしながら、上述のポリイオンコンプレックスを用いる固定化方法は、酵素の物理化学的性質、特に電荷に大きく依存しており、外部溶液の変化、使用中の環境変化などにより固定化の状態が絶えず変化することが懸念され、固定化した酵素などが溶出しやすい。また、一般的に酵素は熱に対する耐性が低いが、バイオ燃料電池の実用化に向けて酵素を改変してゆく際に、酵素そのものの物理化学的性質が変わり、その都度、固定化膜作製方法の最適化を図る必要があり、煩雑である。さらに、燃料からより多くの電子を取り出したいときには、より多くの酵素が必要となるが、これらの酵素を固定化する場合、その固定化条件の最適化に多大な労力を費やすことになる。
　こうした中、本発明者らは、酵素や補酵素をリポソームに封入し、この空間を反応場として酵素反応を行うことにより燃料から効率的に電子を取り出して電気エネルギーを発生させることを提案した（特許文献１３参照。）。こうして酵素や補酵素を封入したリポソームを電極に固定化することにより、酵素や補酵素の電極への固定化を容易に行うことができる。
特開２０００－１３３２９７号公報 特開２００３－２８２１２４号公報 特開２００４－７１５５９号公報 特開２００５－１３２１０号公報 特開２００５－３１０６１３号公報 特開２００６－２４５５５号公報 特開２００６－４９２１５号公報 特開２００６－９３０９０号公報 特開２００６－１２７９５７号公報 特開２００６－１５６３５４号公報 特開２００７－１２２８１号公報 特開２００７－３５４３７号公報 特開２００９－１５８４５８号公報
Biophys.J.,71,pp.2984-2995(1996)
　ところが、リポソームの内部に酵素や補酵素を閉じ込める特許文献１３の方法では、燃料としてグルコースを用いる場合には、リポソームを構成する脂質２分子膜がグルコースを透過しないため、グルコースを透過するトランスポーターを脂質２分子膜に組み込まなければならない。また、乳酸などの有機酸もリポソームを構成する脂質２分子膜を透過しないため、リポソームをそのまま用いた場合にはこれらの有機酸を燃料として用いることはできない。
　そこで、この発明が解決しようとする課題は、一種または複数種の酵素あるいはさらに補酵素をリポソームの内部の微小な空間に閉じ込め、このリポソームの内部にグルコースや有機酸などの燃料を容易に透過させることができ、しかもこの燃料の透過速度を制御することができ、リポソームの内部の空間を反応場として酵素反応を行うことにより燃料から効率的に電子を取り出して電気エネルギーを発生させることができ、これらの酵素あるいはさらに補酵素の電極への固定化も容易に行うことができる燃料電池およびその製造方法を提供することである。
　この発明が解決しようとする他の課題は、上記の優れた燃料電池を用いた高性能の電子機器を提供することである。
　この発明が解決しようとするさらに他の課題は、上記の燃料電池に適用して好適な酵素固定化電極ならびに高効率のバイオセンサーおよびエネルギー変換素子を提供することである。
　この発明が解決しようとするさらに他の課題は、グルコースや有機酸などの基質を内部に容易に透過させることができ、しかもこの基質の透過速度を制御することができ、内部の空間を反応場として酵素反応を行うことにより基質から効率的に電子を取り出して電気エネルギーを発生させることができる細胞、細胞小器官および細菌を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。その結果、バイオ燃料電池において、酵素反応に必要な酵素あるいはさらに補酵素を人工細胞であるリポソームに封入した場合には、同量の酵素あるいはさらに補酵素をリポソームに封入しないで用いる場合に比べて、酵素反応をはるかに効率的に行って極めて高い触媒電流を得たり、電極への固定化を容易にしたりすることができることを見出した。
　一方、バイオ燃料電池においてグルコースを燃料に用いる場合、周知のようにグルコースはリポソームを構成する脂質２分子膜に対する透過性が著しく低いため、グルコースを含む燃料溶液中にリポソームを置いても、リポソームの内部に燃料溶液からグルコースを取り込むことは極めて困難である（図５８参照。）。本発明者らは、この点に関し鋭意研究を行った結果、リポソームを構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴（チャネル）を有する抗生物質を結合させることにより、この問題を解消することができることを見出した。このグルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質では有機酸の透過も可能である。さらに、リポソームを構成する脂質２分子膜に、抗生物質に加えてステロールを結合させることにより、抗生物質の穴を通しての有機酸やグルコースなどの透過速度の制御が可能となることを見出した。
　この発明は、本発明者らが独自に得た上記の知見に基づいて、上記の手法の適用が可能な範囲について様々な観点から検討を行い、案出されたものである。
　上記課題を解決するために、この発明は、
　正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、酵素を用いて燃料から電子を取り出すように構成され、
　少なくとも一種の上記酵素がリポソームに封入されており、
　上記リポソームを構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質およびステロールが結合している燃料電池である。
　また、この発明は、
　正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、酵素を用いて燃料から電子を取り出す燃料電池を製造する場合に、少なくとも一種の上記酵素をリポソームに封入した後、上記リポソームを構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質およびステロールを結合させる工程を有する燃料電池の製造方法である。
　上記の各発明においては、典型的には、燃料電池は、酵素および補酵素を用いて燃料から電子を取り出すように構成され、少なくとも一種の酵素および少なくとも一種の補酵素がリポソームに封入される。
　リポソームは、リン脂質などからなる脂質２分子膜により形成された閉鎖小胞であり、内部が水相となっている。このリポソームには、一層の脂質２分子膜からなる単層リポソーム（ＳＵＶ：小さな一枚膜リポソーム、ＧＵＶ：巨大一枚膜リポソーム）だけでなく、小さなリポソーム（ＳＵＶ）が大きいリポソーム（ＧＵＶ）に取り込まれて入れ子になった多重層リポソーム（ＭＵＶ）も含まれる。リポソームは、例えば、直径１００ｎｍ程度のものから１０μｍに及ぶ大きなものまで作製することができ、直径は必要に応じて選ばれるが、具体例を挙げると２～７μｍである。リン脂質としては基本的にはどのようなものを用いてもよく、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質のいずれを用いてもよい。グリセロリン脂質としては、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール（カルジオリピン）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。スフィンゴリン脂質としては、スフィンゴミエリンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。ホスファチジルコリンの代表例はジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）である。リポソームの形成およびリポソーム内部への酵素および補酵素の封入には従来公知の方法を用いることができ、必要に応じて選ばれる。
　リポソームを構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質を結合させることで、抗生物質により縁取られる形で脂質２分子膜を貫通する穴が形成される。この抗生物質としては従来公知の各種のものを用いることができ、必要に応じて選ばれる。この穴は、リポソームの内部に封入される酵素あるいはさらに補酵素が少なくとも容易に透過しない大きさを有する。抗生物質は典型的には、複数の分子が環状に配列した多分子からなる。
　リポソームを構成する脂質２分子膜に結合させるステロールとしては従来公知の各種のものを用いることができ、必要に応じて選ばれる。ステロールの代表例としては、コレステロールやコプロスタノールなどの動物ステロールや、植物中のシトステロールやスチグマステロール、酵母や麦角菌が産出するエルゴステロールなどが挙げられる。リポソームを構成する脂質２分子膜に対するステロールの重量比は、好適には、１／４以上１／３以下であるが、これに限定されるものではない。
　このリポソームには、酵素反応に必要な酵素あるいはさらに補酵素のうち、少なくとも一種の酵素あるいはさらに少なくとも一種の補酵素を封入するが、酵素反応に必要な全ての酵素あるいはさらに補酵素をリポソームに封入してもよいし、一部の酵素または補酵素をリポソームに封入せず、このリポソームを構成する脂質２分子膜に組み込んだり、固定化したり、リポソームの外部に存在させるようにしてもよい。酵素または補酵素をリポソームを構成する脂質２分子膜に固定化する場合には、例えばポリエチレングリコール鎖などのアンカーを用いることができる。
　このリポソームは、好適には負極に固定化されるが、必ずしも固定化する必要はなく、プロトン伝導体に緩衝液（緩衝物質）を含む電解質を用いるような場合にはその緩衝液に含ませるようにしてもよい。リポソームの固定には、例えば細胞の固定に用いられる従来公知の各種の固定化方法を用いることができる。また、この場合、負極に対するリポソームの固定を安定化するために、負極とリポソームとの間に中間層を形成してもよい。この中間層としては、タンパク質やＤＮＡなどの生体高分子のみならず、親水、疎水の両方の性質を持つような高分子電解質や、ミセル、逆ミセル、ラメラなどの構造体を形成することができるものや、ナノメートル構造を持ち、一つまたは複数の性質を持つ化合物であって生体親和性の高い化合物を用いることができる。タンパク質としては、例えば、アルブミンを代表とした、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、オボアルブミン、ミオキナーゼなどの酸性タンパク質のほか、等電点をアルカリ側に持つリゾチウム、チトクロームｃ、ミオグロビン、トリプシノーゲンなどを用いることができる。このようなタンパク質などからなる中間層を電極表面に物理的に吸着させ、この中間層にリポソームを固定化することにより、負極に対してリポソームを安定に固定化することが可能である。
　負極に対してリポソームを安定に固定化する方法としては、次のような方法を用いることが有効である。すなわち、負極には第１の物質を固定化し、リポソームには第２の物質を結合し、負極に固定化された第１の物質とリポソームに結合した第２の物質とが互いに結合することにより、負極に対してリポソームを安定に固定化することができる。このような第１の物質と第２の物質との組み合わせとしては、好適には、特異的に結合する結合対が用いられるが、必ずしもこれに限定されるものではない。このような第１の物質と第２の物質との組み合わせの具体例を挙げると次の通りである。
・アビジン（avidin)とビオチン（biotin）
　アビジンはビオチンと特異的に結合する糖タンパク質である。例えば、負極にアビジンを固定化するとともに、ビオチンをリポソームに結合し、負極に固定化したアビジンとリポソームに結合したビオチンとを結合させることにより負極にリポソームを固定化することができる。負極にビオチンを固定化し、リポソームにアビジンを結合させてもよい。アビジンとしては、ストレプトアビジン（StreptAvidin)、ニュートロアビジン（NeutroAvidin）などの各種のものを用いることができ、さらにはこれらの変異体を用いることもできる。
・抗原と抗体
 　抗体は抗原と特異的に結合する免疫グロブリンである。例えば、抗原修飾脂質を用いてリポソームを作製するとともに、負極に抗体を固定化し、負極に固定化した抗体とリポソームに結合した抗原とを結合させることにより負極にリポソームを固定化することができる。負極に抗原を固定化し、リポソームに抗体を結合させてもよい。
・プロテインＡまたはプロテインＧと免疫グロブリンＩgＧ
　プロテインＡまたはプロテインＧは免疫グロブリンＩgＧに強い親和性を有するタンパク質である。例えば、負極に免疫グロブリンＩg Ｇを固定化するとともに、プロテインＡまたはプロテインＧをリポソームに結合する。そして、負極に固定化した免疫グロブリンＩgＧとリポソームに結合したプロテインＡまたはプロテインＧとを結合させることにより負極にリポソームを固定化することができる。負極にプロテインＡまたはプロテインＧを固定化し、リポソームに免疫グロブリンＩgＧを結合させてもよい。
・糖分子（あるいは糖鎖含有化合物）とレクチン
　レクチンは糖結合性タンパク質の総称である。例えば、膜貫通型レクチンを混ぜてリポソームを作製するとともに、負極に糖分子（あるいは糖鎖含有化合物）を固定化する。そして、負極に固定化した糖分子（あるいは糖鎖含有化合物）の糖鎖とリポソームに結合したレクチンとを結合させることにより負極にリポソームを固定化することができる。負極にレクチンを固定化し、リポソームに糖分子（あるいは糖鎖含有化合物）を結合させてもよい。
・ＤＮＡと相補鎖ＤＮＡ
　例えば、ＤＮＡを結合した水溶性脂質を利用してリポソームを作製するとともに、負極に相補鎖ＤＮＡを固定化する。そして、負極に固定化した相補鎖ＤＮＡとリポソームに結合したＤＮＡとをハイブリダイゼーションにより結合させることにより負極にリポソームを固定化することができる。
・グルタチオンとグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）
　例えば、ＧＳＴ融合膜貫通タンパク質を混ぜてリポソームを作製するとともに、負極にグルタチオンを固定化する。そして、負極に固定化したグルタチオンとリポソームに結合したＧＳＴとを結合させることにより負極にリポソームを固定化することができる。
・ヘパリンとヘパリン結合性分子
　例えば、リポソームを構成する脂質２分子膜をヘパリン結合性分子で修飾するとともに、負極をヘパリンで修飾する。そして、ヘパリン修飾負極のヘパリンとリポソームに結合したヘパリン結合性分子とを結合させることにより負極にリポソームを固定化することができる。
・ホルモンとホルモン受容体
　ホルモン受容体はホルモン分子を特異的に受容するタンパク質分子または分子複合体である。例えば、負極にホルモン受容体を固定化するとともに、リポソームにホルモンを結合し、負極に固定化したホルモン受容体とリポソームに結合したホルモンとを結合させることにより負極にリポソームを固定化することができる。
・カルボン酸とイミド
　例えば、負極にカルボン酸を結合するとともに、リポソームにアミンを結合する。そして、負極に結合したカルボン酸とリポソームに結合したアミンとをカルボジイミドやＮ－ヒドロキシスクシンイミドなどのイミドを用いてアミドカップリングにより結合することにより負極にリポソームを固定化することができる。負極にアミンを結合するとともに、リポソームにカルボン酸を結合してもよい。
　なお、負極の電極材料が炭素（カーボン）である場合、負極にカルボン酸を結合する方法としては、例えば、ジアゾニウム塩を硝酸、硫酸、過酸化水素などを含む溶液中でリフラックス、もしくは電気化学的酸化を行う方法を用いることができる。
　燃料としては、グルコースなどの種々のものを用いることができ、必要に応じて選ばれる。グルコース以外の燃料としては、例えば、クエン酸回路に関与する各種の有機酸や、ペントースリン酸回路および解糖系に関与する糖および有機酸などが挙げられる。クエン酸回路に関与する各種の有機酸は、乳酸、ピルビン酸、アセチルＣｏＡ、クエン酸、イソクエン酸、αケトグルタル酸、スクシニルＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸などである。ペントースリン酸回路および解糖系に関与する糖および有機酸は、グルコース６リン酸、６ホスホグルコノラクトン、６ホスホグルコン酸、リブロース５リン酸、グリセルアルデヒド３リン酸、フルクトース６リン酸、キシルロース５リン酸、セドヘプツロース７リン酸、エリトロース４リン酸、ホスホエノールピルビン酸、１，３ビスホスホグリセリン酸、リボース５リン酸などである。これらの燃料は、いずれも、リポソームを構成する脂質２分子膜に結合した抗生物質が有する、グルコースの透過が可能な穴の透過が可能である。
　これらの燃料は、典型的には、これらの燃料をリン酸緩衝液やトリス緩衝液などの従来公知の緩衝液に溶かした燃料溶液の形で用いる。
　リポソームに封入する酵素は、典型的には、グルコースなどの燃料の酸化を促進し分解する酸化酵素を含み、さらに、燃料の酸化に伴って還元された補酵素を酸化体に戻すとともに電子メディエーターを介して電子を負極に渡す補酵素酸化酵素を含む。具体的には、好適には、リポソームに封入する酵素は、グルコースなどの燃料の酸化を促進し分解する酸化酵素と、この酸化酵素によって還元される補酵素を酸化体に戻す補酵素酸化酵素とを含む。この補酵素酸化酵素の作用により、補酵素が酸化体に戻るときに電子が生成され、補酵素酸化酵素から電子メディエーターを介して負極に電子が渡される。例えば燃料としてグルコースを用いる場合、酸化酵素としては例えばグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（特に、ＮＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ）が、補酵素としては例えばＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+ が、補酵素酸化酵素としては例えばジアホラーゼ（ＤＩ）が用いられる。
　電子メディエーターとしては基本的にはどのようなものを用いてもよいが、好適には、キノン骨格を有する化合物が用いられ、具体的には、例えば、２，３－ジメトキシ－５－メチル－１，４－ベンゾキノン（Ｑ０）や、ナフトキノン骨格を有する化合物、例えば、２－アミノ－１，４－ナフトキノン（ＡＮＱ）、２－アミノ－３－メチル－１，４－ナフトキノン（ＡＭＮＱ）、２－メチル－１，４－ナフトキノン（ＶＫ３）、２－アミノ－３－カルボキシ－１，４－ナフトキノン（ＡＣＮＱ）、ビタミンＫ１などの各種のナフトキノン誘導体が用いられる。キノン骨格を有する化合物としては、例えば、アントラキノンやその誘導体を用いることもできる。電子メディエーターには、必要に応じて、キノン骨格を有する化合物以外に、電子メディエーターとして働く一種または二種以上の他の化合物を含ませてもよい。この電子メディエーターは、酵素および補酵素が封入されたリポソームとともに負極に固定化してもよいし、このリポソームの内部に封入してもよいし、このリポソームに固定してもよいし、燃料溶液に含ませるようにしてもよい。
　正極に酵素が固定化される場合、この酵素は、典型的には酸素を還元する酵素を含む。この酸素を還元する酵素としては、例えば、ビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどを用いることができる。この場合、正極には、好適には、酵素に加えて電子メディエーターも固定化される。電子メディエーターとしては、例えば、ヘキサシアノ鉄酸カリウム、オクタシアノタングステン酸カリウムなどを用いる。電子メディエーターは、好適には、十分に高濃度、例えば、平均値で０．６４×１０-6ｍｏｌ／ｍｍ2以上固定化する。
　プロトン伝導体としては種々のものを用いることができ、必要に応じて選択されるが、具体的には、例えば、セロハン、パーフルオロカーボンスルホン酸（ＰＦＳ）系の樹脂膜、トリフルオロスチレン誘導体の共重合膜、リン酸を含浸させたポリベンズイミダゾール膜、芳香族ポリエーテルケトンスルホン酸膜、ＰＳＳＡ－ＰＶＡ（ポリスチレンスルホン酸ポリビニルアルコール共重合体）や、ＰＳＳＡ－ＥＶＯＨ（ポリスチレンスルホン酸エチレンビニルアルコール共重合体）、含フッ素カーボンスルホン酸基を有するイオン交換樹脂（ナフィオン（商品名、米国デュポン社）など）などからなるものが挙げられる。
　プロトン伝導体として緩衝液（緩衝物質）を含む電解質を用いる場合には、高出力動作時に十分な緩衝能を得ることができ、酵素が本来持っている能力を十分に発揮することができるようにするのが望ましい。このために、電解質に含まれる緩衝物質の濃度を０．２Ｍ以上２．５Ｍ以下にすることが有効であり、好適には０．２Ｍ以上２Ｍ以下、より好適には０．４Ｍ以上２Ｍ以下、さらに好適には０．８Ｍ以上１．２Ｍ以下とする。緩衝物質は、一般的には、ｐＫaが６以上９以下のものであれば、どのようなものを用いてもよいが、具体例を挙げると、リン酸二水素イオン（Ｈ2 ＰＯ4 -）、２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－１，３－プロパンジオール（略称トリス）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、カコジル酸、炭酸（Ｈ2ＣＯ3 ）、クエン酸水素イオン、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－３－プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（略称トリシン）、グリシルグリシン、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（略称ビシン）などである。リン酸二水素イオン（Ｈ2ＰＯ4 -  ）を生成する物質は、例えば、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2ＰＯ4 ）やリン酸二水素カリウム（ＫＨ2 ＰＯ4 ）などである。緩衝物質としてはイミダゾール環を含む化合物も好ましい。イミダゾール環を含む化合物は、具体的には、イミダゾール、トリアゾール、ピリジン誘導体、ビピリジン誘導体、イミダゾール誘導体（ヒスチジン、１－メチルイミダゾール、２－メチルイミダゾール、４－メチルイミダゾール、２－エチルイミダゾール、イミダゾール－２－カルボン酸エチル、イミダゾール－２－カルボキシアルデヒド、イミダゾール－４－カルボン酸、イミダゾール－４，５－ジカルボン酸、イミダゾール－１－イル－酢酸、２－アセチルベンズイミダゾール、１－アセチルイミダゾール、Ｎ－アセチルイミダゾール、２－アミノベンズイミダゾール、Ｎ－（３－アミノプロピル)イミダゾール、５－アミノ－２－（トリフルオロメチル) ベンズイミダゾール、４－アザベンズイミダゾール、４－アザ－２－メルカプトベンズイミダゾール、ベンズイミダゾール、１－ベンジルイミダゾール、１－ブチルイミダゾール）などである。必要に応じて、これらの緩衝物質に加えて、例えば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ3ＣＯＯＨ）、リン酸（Ｈ3 ＰＯ4 ）および硫酸（Ｈ2 ＳＯ4）からなる群より選ばれた少なくとも一種の酸を中和剤として加えてもよい。こうすることで、酵素の活性をより高く維持することができる。緩衝物質を含む電解質のｐＨは、好適には７付近であるが、一般的には１～１４のいずれであってもよい。
　正極および負極の電極材料としては各種のものを用いることができるが、例えば、多孔質カーボン、カーボンペレット、カーボンフェルト、カーボンペーパーなどのカーボン系材料が用いられる。電極の材料としては、多孔体材料からなる骨格と、この骨格の少なくとも一部の表面を被覆する、カーボン系材料を主成分とする材料とを含む多孔体導電材料を用いることもできる（特許文献１２参照。）。
　この燃料電池はおよそ電力が必要なものすべてに用いることができ、大きさも問わないが、例えば、電子機器、移動体（自動車、二輪車、航空機、ロケット、宇宙船など）、動力装置、建設機械、工作機械、発電システム、コージェネレーションシステムなどに用いることができ、用途などによって出力、大きさ、形状、燃料の種類などが決められる。
　また、この発明は、
　一つまたは複数の燃料電池を用い、
　少なくとも一つの上記燃料電池が、
　正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、酵素を用いて燃料から電子を取り出すように構成され、
　少なくとも一種の上記酵素がリポソームに封入されており、
　上記リポソームを構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質およびステロールが結合しているものである電子機器である。
　この電子機器は、基本的にはどのようなものであってもよく、携帯型のものと据え置き型のものとの双方を含むが、具体例を挙げると、携帯電話、モバイル機器（携帯情報端末機（ＰＤＡ）など）、ロボット、パーソナルコンピュータ（デスクトップ型、ノート型の双方を含む）、ゲーム機器、カメラ一体型ＶＴＲ（ビデオテープレコーダ）、車載機器、家庭電気製品、工業製品などである。
　この電子機器の発明においては、その性質に反しない限り、上記の燃料電池および燃料電池の製造方法の発明に関連して説明したことが成立する。
　また、この発明は、
　少なくとも一種の酵素が封入されたリポソームが固定化されており、
　上記リポソームを構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質およびステロールが結合している酵素固定化電極である。
　この酵素固定化電極の発明においては、その性質に反しない限り、上記の燃料電池および燃料電池の製造方法の発明に関連して説明したことが成立する。
　また、この発明は、
　酵素を用い、
　少なくとも一種の上記酵素がリポソームに封入されており、
　上記リポソームを構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質およびステロールが結合しているバイオセンサーである。
　このバイオセンサーの発明においては、その性質に反しない限り、上記の燃料電池および燃料電池の製造方法の発明に関連して説明したことが成立する。
　また、この発明は、
　少なくとも一種の酵素が封入されたリポソームを用い、上記リポソームを構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質およびステロールが結合しているエネルギー変換素子である。
　ここで、このエネルギー変換素子は、燃料または基質が持つ化学エネルギーを酵素反応により電気エネルギーに変換する素子であり、上記の燃料電池、すなわちバイオ燃料電池はこのエネルギー変換素子の一種である。
　このエネルギー変換素子の発明においては、その性質に反しない限り、上記の燃料電池および燃料電池の製造方法の発明に関連して説明したことが成立する。
　また、この発明は、
　細胞膜を構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質およびステロールが結合している細胞である。
　また、この発明は、
　細胞膜を構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質およびステロールが結合している細胞小器官である。
　また、この発明は、
　細胞膜を構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質およびステロールが結合している細菌である。
　上記の細胞、細胞小器官および細菌は、グルコースなどの燃料または基質の代謝系を有するものである限り、特に限定されるものではなく、従来公知の各種のものを含む。必要に応じて、これらの細胞、細胞小器官および細菌の内部に、上記の燃料電池と同様に、グルコースなどの燃料または基質の分解などに必要な酵素あるいはさらに補酵素を封入してもよい。
　上述のように構成されたこの発明においては、酵素反応に関与する少なくとも一種の酵素あるいはさらに少なくとも一種の補酵素を、高活性を保ったままリポソームに封入することができる。このリポソームを構成する脂質２分子膜に結合した抗生物質の穴からこのリポソームの内部にグルコースや有機酸などの燃料または基質を容易に透過させることができ、しかも、このリポソームを構成する脂質２分子膜に結合したステロールによりこの燃料の透過速度を制御することができる。そして、このリポソームの内部の微小な空間を反応場として効率的に酵素反応が行われ、グルコースなどの燃料または基質から効率的に電子を取り出すことができる。この場合、このリポソームの内部に封入された酵素および補酵素の濃度は極めて高く、従って酵素および補酵素の相互の間隔は極めて小さいため、これらの酵素および補酵素による触媒サイクルは極めて高速に進行し、酵素反応が高速に進行する。そして、このリポソームを負極または電極に固定化することにより、このリポソームの内部に封入された酵素あるいはさらに補酵素をこのリポソームを介して負極または電極に容易に固定化することができる。このため、グルコースなどの燃料または基質から取り出された電子を確実に負極または電極に受け渡すことができる。この場合、リポソームの固定は、酵素や補酵素をポリイオンコンプレックスなどにより固定化する場合に比べて簡単に行うことができる。
　また、上記の細胞、細胞小器官および細菌においては、これらの細胞、細胞小器官および細菌の内部の微小な空間を反応場として効率的に酵素反応が行われ、グルコースや有機酸などの燃料または基質から効率的に電子を取り出すことができる。この場合、酵素反応は、これらの細胞、細胞小器官および細菌に備わっている代謝系により行われるが、これらの細胞、細胞小器官および細菌の内部に燃料または基質の分解などに必要な酵素あるいはさらに補酵素を封入する場合はこれらの酵素および補酵素により行うことができる。
　この発明によれば、酵素あるいはさらに補酵素をリポソームの内部の微小な空間に閉じ込め、このリポソームの内部にグルコースや有機酸などの燃料を容易に透過させることができ、しかもこの燃料の透過速度を制御することができ、リポソームの内部の空間を反応場として酵素反応を行うことにより燃料から効率的に電子を取り出して電気エネルギーを発生させることができ、これらの酵素あるいはさらに補酵素の電極への固定化も容易な高効率の燃料電池を実現することができる。そして、このように高効率の燃料電池を用いることにより、高性能の電子機器などを実現することができる。また、同様に、高効率のバイオセンサーおよびエネルギー変換素子を実現することができる。
　また、グルコースや有機酸などの燃料または基質から効率的に電子を取り出して電気エネルギーを発生させることができる細胞、細胞小器官および細菌を実現することができる。
この発明の第１の実施の形態による酵素固定化電極を示す略線図である。 この発明の第１の実施の形態による酵素固定化電極において用いられる酵素および補酵素が封入されたリポソームを示す略線図である。 この発明の第１の実施の形態による酵素固定化電極においてリポソームに封入された酵素群および補酵素による電子の受け渡し反応を模式的に示す略線図である。 リポソームに酵素群および補酵素を封入して酵素反応を行うことによる利点を説明するための略線図である。 蛍光ラベル化したアルコールデヒドロゲナーゼ、蛍光ラベル化したジアホラーゼおよびＮＡＤＨを封入したリポソームの蛍光顕微鏡像を示す図面代用写真である。 蛍光ラベル化したアルコールデヒドロゲナーゼ、蛍光ラベル化したジアホラーゼおよびＮＡＤＨを封入したリポソームの蛍光顕微鏡像を示す図面代用写真である。 蛍光ラベル化したアルコールデヒドロゲナーゼ、蛍光ラベル化したジアホラーゼおよびＮＡＤＨを封入したリポソームの蛍光顕微鏡像を示す図面代用写真である。 蛍光ラベル化したアルコールデヒドロゲナーゼ、蛍光ラベル化したジアホラーゼおよびＮＡＤＨを封入したリポソームを蛍光モニタリングした結果を示す略線図である。 蛍光ラベル化したアルコールデヒドロゲナーゼ、蛍光ラベル化したジアホラーゼおよびＮＡＤＨを封入したリポソームを蛍光モニタリングした結果を示す略線図である。 蛍光ラベル化したアルコールデヒドロゲナーゼ、蛍光ラベル化したジアホラーゼおよびＮＡＤＨを封入したリポソームを蛍光モニタリングした結果を示す略線図である。 リポソームの安定性を説明するための略線図である。 アルコールデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼおよびＮＡＤＨを封入したリポソームを所定の溶液中に分散させた場合ならびにアルコールデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼおよびＮＡＤＨを単に所定の溶液中に分散させた場合に行ったクロノアンペロメトリーの結果を示す略線図である。 アルコールデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼおよびＮＡＤＨを封入したリポソームを緩衝液中に分散させた状態を示す略線図である。 アルコールデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼおよびＮＡＤＨを単に緩衝液中に分散させた状態を示す略線図である。 グルコースデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼおよびＮＡＤＨを封入したリポソームを測定溶液中に分散させた場合に行ったクロノアンペロメトリーの結果を示す略線図である。 グルコースデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼおよびＮＡＤＨを封入したリポソームを測定溶液中に分散させた場合に行ったクロノアンペロメトリーの結果を示す略線図である。 この発明の実施例１において抗生物質として用いるアムホテリシンＢの構造式を示す略線図である。 この発明の実施例１においてリポソームを構成する脂質２分子膜にアムホテリシンＢが結合して穴が形成されている状態を示す断面図である。 この発明の実施例１においてリポソームを構成する脂質２分子膜にアムホテリシンＢが結合して穴が形成されている状態を示す平面図である。 脂質２分子膜にアムホテリシンＢを結合させたリポソームをイオン液体に浸漬して撮影した走査型電子顕微鏡像を示す図面代用写真である。 脂質２分子膜にアムホテリシンＢを結合させていないリポソームをイオン液体に浸漬して撮影した走査型電子顕微鏡像を示す図面代用写真である。 この発明の実施例１においてグルコースデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼおよびＮＡＤＨを封入したリポソームを測定溶液中に分散させた場合に行ったクロノアンペロメトリーの結果を示す略線図である。 実施例１との比較のために行ったクロノアンペロメトリーの結果を示す略線図である。 実施例１との比較のために行ったクロノアンペロメトリーの結果を示す略線図である。 電気化学分析に用いた電気化学測定装置を示す略線図である。 電気化学分析の測定条件を示す略線図である。 電気化学分析の測定結果を示す略線図である。 脂質２分子膜の両側のイオン分布を示す略線図である。 脂質２分子膜の内外のイオン濃度を示す略線図である。 脂質２分子膜の内外のイオン濃度を示す略線図である。 電気化学分析の測定結果を示す略線図である。 各種の有機酸の拡散係数比と有機酸の分子量との関係を示す略線図である。 コレステロールを用いた場合の電気化学分析の測定結果を示す略線図である。 エルゴステロールを用いた場合の電気化学分析の測定結果を示す略線図である。 コレステロールまたはエルゴステロールを用いた場合の各種の有機酸の拡散係数比と有機酸の分子量との関係を示す略線図である。 電気化学測定系を示す略線図である。 電気化学分析の測定結果を示す略線図である。 エルゴステロールを用いた場合の利点を説明するための略線図である。 電気化学分析の測定結果を示す略線図である。 電気化学分析の測定結果を示す略線図である。 電気化学分析の測定結果を示す略線図である。 この発明の第２の実施の形態によるバイオ燃料電池を示す略線図である。 この発明の第２の実施の形態によるバイオ燃料電池の負極の構成の詳細ならびにこの負極に固定化されたリポソームに封入された酵素群および補酵素の一例およびこの酵素群および補酵素による電子の受け渡し反応を模式的に示す略線図である。 この発明の第２の実施の形態によるバイオ燃料電池の具体的な構成例を示す略線図である。 この発明の第３の実施の形態によるバイオ燃料電池において負極の電極材料に用いる多孔体導電材料の構造を説明するための略線図および断面図である。 この発明の第３の実施の形態によるバイオ燃料電池において負極の電極材料に用いる多孔体導電材料の製造方法を説明するための略線図である。 この発明の第４の実施の形態による細胞の要部を示す略線図である。 この発明の第５の実施の形態によるミトコンドリアを示す略線図である。 この発明の第６の実施の形態による細菌を示す略線図である。 この発明の第７の実施の形態によるバイオ燃料電池において負極の電極に用いる多孔質電極を示す斜視図および断面図である。 この発明の第８の実施の形態による酵素固定化電極を示す略線図である。 この発明の実施例２においてクロノアンペロメトリー測定を行うために作製した試料を示す略線図である。 この発明の実施例２との比較のために作製した第１の試料を示す略線図である。 この発明の実施例２との比較のために作製した第２の試料を示す略線図である。 この発明の実施例２との比較のために作製した第３の試料を示す略線図である。 この発明の実施例２において行ったクロノアンペロメトリーの結果を比較例の結果とともに示す略線図である。 この発明の第９の実施の形態による酵素固定化電極を示す略線図である。 脂質２分子膜に対する種々の分子の透過性を示す略線図である。
　以下、発明を実施するための形態（以下「実施の形態」とする）について説明する。なお、説明は以下の順序で行う。
１．第１の実施の形態（酵素固定化電極およびその製造方法）
２．第２の実施の形態（バイオ燃料電池）
３．第３の実施の形態（バイオ燃料電池）
４．第４の実施の形態（細胞）
５．第５の実施の形態（ミトコンドリア）
６．第６の実施の形態（細菌）
７．第７の実施の形態（バイオ燃料電池）
８．第８の実施の形態（酵素固定化電極およびその製造方法）
９．第９の実施の形態（酵素固定化電極およびその製造方法）
〈１．第１の実施の形態〉
［酵素固定化電極］
　図１はこの発明の第１の実施の形態による酵素固定化電極を示す。この酵素固定化電極においては、基質としてグルコースや有機酸などを用いる。
　図１に示すように、この酵素固定化電極においては、多孔質カーボンなどからなる電極１１の表面にリン脂質などの脂質２分子膜からなるリポソーム１２が物理吸着などにより固定化されている。このリポソーム１２の内部の水相に、目的とする酵素反応に関与する少なくとも一種の酵素および少なくとも一種の補酵素が封入される。
　図２にこのリポソーム１２の構造の詳細を示す。図２においては、リポソーム１２の内部の水相１２ａに二種類の酵素１３、１４および一種類の補酵素１５が封入されている。このリポソーム１２の内部の水相１２ａには、これらの酵素１３、１４および補酵素１５以外に、例えば電子メディエーターを封入してもよい。この電子メディエーターは、リポソーム１２とともに電極１１上に固定化してもよい。例えば、酵素１３は基質として用いられるグルコースの酸化を促進し分解する酸化酵素、酵素１４はこのグルコースの酸化に伴って還元された補酵素１５を酸化体に戻すとともに電子メディエーターを介して電子を電極１１に渡す補酵素酸化酵素である。
　図２に示すように、リポソーム１２を構成する脂質２分子膜に一つまたは複数の抗生物質１６が結合しており、この抗生物質１６により縁取られる形でこの脂質２分子膜を貫通する穴１７が形成されている。図２においては一つの穴１７だけが示されているが、この穴１７の数および配置は任意である。この穴１７の大きさは、グルコースの透過は可能であるが、リポソーム１２の内部に封入された酵素１３、１４および補酵素１５の透過は不可能あるいは困難な大きさに選ばれる。
　抗生物質１６としては、例えば、ポリエン系抗生物質であるアムホテリシン（Amphotericin）Ｂのほか、イオノホア（ionophore)などを用いることができるが、これに限定されるものではない。イオノホアは、例えば、バリノマイシン、イオノマイシン、ナイジェリシン、グラミシジンＡ、モネンシン、カルボニルシアニド－ｍ－クロロフェニルヒドラゾン、カルボニルシアニド－ｐ－フルオロメトキシフェニルヒドラゾンなどである。
　リポソーム１２を構成する脂質２分子膜には、抗生物質１６に加えて、一つまたは複数のステロール１８が結合している。図２においては五つのステロール１８が示されているが、このステロール１８の数および配置は任意であり、必要に応じて選ばれる。好適には、リポソーム１２を構成する脂質２分子膜に対するステロール１８の重量比は１／４以上１／３以下の範囲に選ばれる。
　ステロール１８の具体例を挙げると、コレステロール
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 やエルゴステロール
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 などである。
［酵素固定化電極の製造方法］
　この酵素固定化電極は、例えば、次のようにして製造することができる。まず、酵素１３、１４および補酵素１５が封入されたリポソーム１２を作製する。次に、このリポソーム１２を構成する脂質２分子膜に抗生物質１６を結合させて穴１７を形成するとともに、この脂質２分子膜にステロール１８を結合させる。次に、こうして抗生物質１６およびステロール１８を結合させたリポソーム１２を電極１１上に固定化する。これによって、酵素固定化電極が製造される。酵素１３、１４および補酵素１５を封入する前のリポソーム１２を構成する脂質２分子膜に抗生物質１６およびステロール１８を結合させるようにしてもよい。また、リポソーム１２を電極１１上に固定化してからこのリポソーム１２を構成する脂質２分子膜に抗生物質１６およびステロール１８を結合させてもよい。
　より具体的には、酵素固定化電極は、例えば、次のようにして製造される。まず、酵素１３を含む緩衝液、酵素１４を含む緩衝液、補酵素１５を含む緩衝液およびステロール１８が結合しているリポソーム１２（内部に酵素１３、１４および補酵素１５が封入されていないもの）を含む緩衝液をそれぞれ作製する。次に、これらの緩衝液を混合した後、この混合溶液をゲルろ過カラムに通したりすることなどによりリポソーム１２外の酵素１３、１４および補酵素１５を除去する。次に、こうして内部に酵素１３、１４および補酵素１５が封入されたリポソーム１２を緩衝液中に置き、この緩衝液中に抗生物質１６を添加してリポソーム１２を構成する脂質２分子膜に抗生物質１６を結合させて穴１７を形成する。
　図３にこの酵素固定化電極における酵素、補酵素および電子メディエーターによる電子の受け渡し反応の一例を模式的に示す。この例では、グルコースの分解に関与する酵素がグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）である。また、グルコースの分解プロセスにおける酸化反応に伴って還元体が生成される補酵素がＮＡＤ+である。また、補酵素の還元体であるＮＡＤＨを酸化する補酵素酸化酵素がジアホラーゼ（ＤＩ）である。そして、補酵素酸化酵素から補酵素の酸化に伴って生じる電子を電子メディエーターが受け取って電極１１に渡すようになっている。この場合、グルコースは、リポソーム１２を構成する脂質２分子膜に形成された穴１７を透過してリポソーム１２の内部に入り、グルコースデヒドロゲナーゼによるこのグルコースの分解によりグルコノラクトンが生成され、このグルコノラクトンが穴１７を透過してリポソーム１２の外部に出る。電子メディエーターは、リポソーム１２を構成する脂質２分子膜を出入りして電子伝達を行う。
　実施例について説明する前に、酵素反応の反応場として酵素および補酵素を封入したリポソームを用いることの有効性について詳細に検討を行った結果について説明する（特許文献１３参照。）。ただし、ここでは、リポソームとして脂質２分子膜にグルコースの透過が可能な穴が形成されていないものを用い、酵素反応の基質としてエチルアルコールを用いる場合を考える。
　図４に示すように、電極１９に、脂質２分子膜にグルコースの透過が可能な穴が形成されていないリポソーム２０の内部にエチルアルコール（ＥｔＯＨ）の分解に関与する酵素および補酵素が封入されたものを固定化した酵素固定化電極を作製した。電極１９としては電極１１と同様なものを用いた。図４にこの酵素固定化電極における酵素、補酵素および電子メディエーターによる電子の受け渡し反応の一例を模式的に示す。この例では、エチルアルコール（ＥｔＯＨ）の分解に関与する酵素がアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）である。また、エチルアルコールの分解プロセスにおける酸化反応に伴って還元体が生成される補酵素がＮＡＤ+である。また、補酵素の還元体であるＮＡＤＨを酸化する補酵素酸化酵素がジアホラーゼ（ＤＩ）である。そして、補酵素酸化酵素から補酵素の酸化に伴って生じる電子を電子メディエーターが受け取って電極１９に渡す。この場合、エチルアルコールは、リポソーム２０を構成する脂質２分子膜を透過してリポソーム２０の内部に入り、アルコールデヒドロゲナーゼによるこのエチルアルコールの分解によりアセトアルデヒド（ＣＨ3ＣＨＯ）が生成され、このアセトアルデヒドがリポソーム２０の外部に出る。電子メディエーターは、リポソーム２０を構成する脂質２分子膜を出入りして電子伝達を行う。
　この図４に示す酵素固定化電極を実際に作製して実験を行った。
まず、次のようにして酵素固定化電極を作製した。
　ジアホラーゼ（ＤＩ）（ＥＣ　１．８．１．４、天野エンザイム製）を５ｍｇ秤量し、緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）１ｍＬに溶解させ、ＤＩ酵素緩衝溶液（１）とした。
　アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＮＡＤ依存型、ＥＣ　１．１．１．１、天野エンザイム製）を５ｍｇ秤量し、緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）１ｍＬに溶解させ、ＡＤＨ酵素緩衝溶液（２）とした。
　上記の酵素を溶解させる緩衝溶液は直前まで冷蔵されていたものが好ましく、酵素緩衝溶液もできるだけ冷蔵保存しておくことが好ましい。
　ＮＡＤＨ（シグマアルドリッチ製、Ｎ－８１２９）を３５ｍｇ秤量し、緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）１ｍＬに溶解させ、ＮＡＤＨ緩衝溶液（３）とした。
　２，３－ジメトキシ－５－メチル－１，４－ベンゾキノン（Ｑ０）を１５～３００ｍｇ秤量し、緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）１ｍＬに溶解させ、Ｑ０緩衝溶液（４）とした。
　卵黄レシチン（Ｗａｋｏ製）を１００ｍｇ秤量し、緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）１０ｍＬに溶解させてホモジナイザーで均一化し、リポソーム緩衝溶液（５）とした。
　上記のようにして作製した各種の溶液を、下記に示す量ずつ採取して混合し、凍結融解を３度繰り返した。
　ＤＩ酵素緩衝溶液（１）：５０μＬ
　ＡＤＨ酵素緩衝溶液（２）：５０μＬ
　ＮＡＤＨ緩衝溶液（３）：５０μＬ
　リポソーム緩衝溶液（５）：５０μＬ
　上記の混合溶液をゲルろ過カラムに通し、リポソーム外の酵素およびＮＡＤＨを除去する。ここで得たリポソーム溶液をＡＤＨ、ＤＩ、ＮＡＤＨ封入リポソーム溶液（６）とした。
　図５、図６および図７は、シアニン色素Ｃｙ２で蛍光ラベル化したＡＤＨ、シアニン色素Ｃｙ３で蛍光ラベル化したＤＩおよびＮＡＤＨを封入したリポソームの蛍光顕微鏡写真である。図５、図６および図７において、Ｅｘ（Excitation)は励起光を示し、Ｅｘの右に記載されている波長を有し、ＤＭ（Dichroic mirror)は励起光と蛍光を分離するミラーを示し、ＤＭの右に記載されている波長以上の光のみを透過し、ＢＡ（Barrierfilter)は蛍光と散乱光を分離するフィルターを示し、ＢＡの右に記載されている波長以上の光を透過する。この蛍光顕微鏡では、励起光により色素を励起し、それによって得られる光をＤＭおよびＢＡに順次通して不要な光を除去し、色素からの蛍光のみを検出する。図５は波長４５０～４９０ｎｍの励起光でＣｙ２を励起して蛍光を発生させたものでＡＤＨの分布を示す。図６は波長５１０～５６０ｎｍの励起光でＣｙ３を励起して蛍光を発生させたものでＤＩの分布を示す。図７は波長３８０～４２０ｎｍの励起光でＮＡＤＨを励起して蛍光を発生させたものでＮＡＤＨの分布を示す。
　図５、図６および図７より、リポソームの直径は平均４．６μｍ、標準偏差は２．０μｍであった。ただし、リポソームの平均直径は、図５、図６および図７中の３０個のリポソームの直径を測定し、それらの平均を取ることにより求めた。
　図８、図９および図１０は、Ｃｙ２で蛍光ラベル化したＡＤＨ、Ｃｙ３で蛍光ラベル化したＤＩおよびＮＡＤＨを封入したリポソームを蛍光モニタリングした結果を示すグラフである。図８はＣｙ２で蛍光ラベル化したＡＤＨからの蛍光強度、図９はＣｙ３で蛍光ラベル化したＤＩからの蛍光強度、図１０はＮＡＤＨからの蛍光強度を示す。図８、図９および図１０において、Ｅｍ（Emission）は励起光Ｅｘにより色素を励起した時に放出される光を示し、Ｅｍの右に記載されている波長を有し、Ｅｘの波長およびＥｍの波長の右の括弧内の数値は半値幅である。図８、図９および図１０から分かるように、いずれの場合も、エチルアルコール濃度１００ｍＭまで蛍光強度は変化しなかった。つまり、少なくともエチルアルコール濃度１００ｍＭまではリポソームは安定で、リポソーム内部にＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨが確実に封入されていることが分かった。また、界面活性剤である０．３％ＴｒｉｔｏｎＸを添加したところ、蛍光強度が増加した。これは、０．３％ＴｒｉｔｏｎＸによりリポソームが破壊され、内部のＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨがリポソーム外に放出され、蛍光強度が増加したことを意味する。この時の様子をＮＡＤＨを例に取って図１１に示す。図１１に示すように、リポソームの内部にＮＡＤＨが封入されていた状態ではＮＡＤＨによる蛍光強度は低いが、リポソームが破壊され、内部に封入されていたＮＡＤＨがリポソームの外部に放出されるとＮＡＤＨによる蛍光強度が増加する。
　こうして得たＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨ封入リポソーム溶液（６）とＱ０緩衝溶液（４）とを混合して総体積１００μＬの測定溶液を作製し、カーボンフェルトを作用電極とし、参照電極Ａｇ｜ＡｇＣｌに対して、０．３Ｖと電子メディエーターの酸化還元電位より十分高い電位に設定し、溶液攪拌下においてクロノアンペロメトリーを行った。クロノアンペロメトリー中に測定溶液に、エチルアルコールが終濃度１、１０、１００ｍＭとなるよう添加したものを順次添加した。
　ＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨ封入リポソームを含む上記測定溶液に上述のようにしてエチルアルコールを添加した際のクロノアンペロメトリーの結果を図１２の曲線（ａ）に示す。この曲線（ａ）から明らかなように、ＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨをリポソームに封入した場合にはエチルアルコール由来の触媒電流が観察され、エチルアルコールの濃度が高くなるに従って触媒電流は増加する。すなわち、人工細胞であるＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨ封入リポソームによる電気化学的触媒活性が観察された。一方、ＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨをリポソームに封入した場合と同量のＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨをリポソームに封入せず、単にＱ０緩衝溶液（４）中に分散させた場合について、上記と同様にしてクロノアンペロメトリーを行った。その結果を図１２の曲線（ｂ）に示す。この曲線（ｂ）から明らかなように、ＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨをリポソームに封入せず、単にＱ０緩衝溶液（４）中に分散させた場合にはエチルアルコール由来の触媒電流はほとんど観測されない。例えば、エチルアルコールの濃度が１００ｍＭの場合で比較すると、ＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨをリポソームに封入せず、単にＱ０緩衝溶液（４）中に分散させた場合に得られる触媒電流は、ＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨをリポソームに封入した場合に得られる触媒電流の約３０分の１程度に過ぎない。このことから、ＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨをリポソームに封入した場合には、封入しない場合に比べてはるかに高い触媒電流を得ることができることが明らかである。
　このように、ＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨをリポソームに封入した場合には、封入しない場合に比べてはるかに高い触媒電流が得られる理由について説明する。図１３に示すように、リポソーム２０内にＡＤＨ（横線を施した○で示す）、ＤＩ（縦線を施した○で示す）およびＮＡＤＨ（空白の○で示す）を封入したものが緩衝液Ｓ中に正方格子状に配列している場合を考える。一方、図１４に示すように、図１３に示すものと同じ体積の緩衝液Ｓ中に、図１３に示すものと同じ量のＡＤＨ（横線を施した○で示す）、ＤＩ（縦線を施した○で示す）およびＮＡＤＨ（空白の○で示す）が六方格子状に配列している場合を考える。緩衝液Ｓの体積は例えば１００μＬ、リポソーム２０の内部の体積は例えば約０．１７μＬである。ただし、リポソーム２０の脂質２分子膜を構成するリン脂質は緩衝液Ｓ中に５．５×１０-3μｍｏｌ存在し、リポソーム２０の内部の体積の合計はリポソーム１μｍｏｌ当たりに換算すると３０μＬ／μｍｏｌである。図１４に示すようにＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨが緩衝液Ｓ中に単に分散されている場合におけるＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨの濃度に比べて、図１３に示すようにリポソーム２０内にＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨが封入されている場合におけるこれらのＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨの局所的な濃度は約６００倍も高い。すなわち、リポソーム２０内にＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨを封入することにより、これらのＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨの濃度を著しく高くすることができ、これらのＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨの相互の間隔を極めて小さくすることができる。このため、リポソーム２０内では、ＡＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨによる触媒サイクルが極めて高速に進行し、図１２に示すような結果が得られる。
　以上のことから、リポソーム１２の内部に酵素反応に必要な酵素１３、１４および補酵素１５を封入することにより、酵素反応をリポソーム１２の内部の微小な空間を反応場として効率的に行うことができ、基質から効率的に電子を取り出すことができることが分かる。
　次に、リポソーム１２を構成する脂質２分子膜に抗生物質１６を結合させることの有効性について詳細に検討を行った結果について説明する。抗生物質１６としてはアムホテリシンＢを用いた。
　次のようにして酵素固定化電極を作製した。
　ジアホラーゼ（ＤＩ）（ＥＣ　１．８．１．４、天野エンザイム製）を１～１０ｍｇ秤量し、緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）１ｍＬに溶解させ、ＤＩ酵素緩衝溶液（１１）とした。
　グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（ＮＡＤ依存型、ＥＣ　１．１．１．４７、天野エンザイム製）を１０～５０ｍｇ秤量し、緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）
１ｍＬに溶解させ、ＧＤＨ酵素緩衝溶液（１２）とした。
　上記の酵素を溶解させる緩衝溶液は直前まで冷蔵されていたものが好ましく、酵素緩衝溶液もできるだけ冷蔵保存しておくことが好ましい。
　ＮＡＤＨ（シグマアルドリッチ製、Ｎ－８１２９）を１０～５０ｍｇ秤量し、緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）１ｍＬに溶解させ、ＮＡＤＨ緩衝溶液（１３）とした。
　２，３－ジメトキシ－５－メチル－１，４－ベンゾキノン（Ｑ０）を１００～２００ｍｇ秤量し、緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）１ｍＬに溶解させ、Ｑ０緩衝溶液（１４）とした。
　卵黄レシチン（Ｗａｋｏ製）を１０～１００ｍｇ秤量し、緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）１０ｍＬに溶解させてホモジナイザーで均一化し、リポソーム緩衝溶液（１５）とした。
　上記のようにして作製した各種の溶液を、下記に示す量ずつ採取して混合し、凍結融解を３度繰り返した。
　ＤＩ酵素緩衝溶液（１１）：５０μＬ
　ＧＤＨ酵素緩衝溶液（１２）：５０μＬ
　ＮＡＤＨ緩衝溶液（１３）：５０μＬ
　リポソーム緩衝溶液（１５）：５０μＬ
　上記の混合溶液をゲルろ過カラムに通し、リポソーム外の酵素およびＮＡＤＨを除去する。ここで得たリポソーム溶液をＧＤＨ、ＤＩ、ＮＡＤＨ封入リポソーム溶液（１６）とした。
　こうして得たＧＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨ封入リポソーム溶液（１６）とＱ０緩衝溶液（１４）とを混合して総体積１００μＬの測定溶液を作製した。そして、作用電極としてカーボンフェルト、参照電極としてＡｇ｜ＡｇＣｌ、対極として白金ワイヤーを用い、電位をＡｇ｜ＡｇＣｌに対して＋０．１Ｖに設定し、グルコースを燃料として、溶液攪拌下においてクロノアンペロメトリーを行った。クロノアンペロメトリーの結果を図１５に示す。
　図１５に示すように、まず、クロノアンペロメトリー中に測定溶液に、終濃度１００ｍＭとなるようにグルコースを添加した時には、反応はほとんど起こらず、得られる電流値はほとんど変化しなかった。これは、リポソームを構成する脂質２分子膜をグルコースが透過する速度が著しく小さく、実質的に透過しないことに起因するものである。
　次に、測定溶液に、終濃度１００μＭとなるように抗生物質１６としてアムホテリシンＢ（ＡｍＢ）を添加した。すると、グルコース由来の触媒電流が観察された。すなわち、リポソームを構成する脂質２分子膜をグルコースが透過し、リポソームの内部で一連の酵素反応が進行したことが判明した。本発明者らが知る限り、このようにリポソームの内部に取り込まれたグルコースに由来する触媒電流を観測したのは初めてである。
　次に、測定溶液に、リポソームを破壊しうる界面活性剤である０．３％ＴｒｉｔｏｎＸを添加したところ、触媒電流は著しく低下した。これは、０．３％ＴｒｉｔｏｎＸによりリポソームが破壊され、内部のＧＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨがリポソーム外に放出されたことを意味する。
　図１６に、上記と同様な１００ｍＭのグルコースを含む測定溶液に添加するアムホテリシンＢの終濃度を１、１０、１００μＭと変化させてクロノアンペロメトリーを行った結果を示す。図１６に示すように、この１～１００μＭの濃度範囲内では、添加するアムホテリシンＢの終濃度が高くなるに従って触媒電流は増加するが、アムホテリシンＢの終濃度が１００μＭでは触媒電流の増加は頭打ちの傾向を示す。
　図１７にアムホテリシンＢの構造式を示す。また、図１８に、リポソーム１２を構成する脂質２分子膜にアムホテリシンＢが結合した状態を示す断面図を示す。また、図１９に、脂質２分子膜（図示せず）にアムホテリシンＢが結合した状態を示す平面図を示す。図１９に示すように、脂質２分子膜に環状に複数結合したアムホテリシンＢにより、これらのアムホテリシンＢで縁取られる形で穴が脂質２分子膜を貫通して形成されている。アムホテリシンＢによりリポソームに穴を形成することができることは報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。この穴は、グルコースの透過が可能であり、しかも酵素であるＧＤＨおよびＤＩと補酵素であるＮＡＤＨとが透過しない大きさを有する。
　図２０は、リポソームを構成する脂質２分子膜にアムホテリシンＢが結合したリポソームの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。図２１は、アムホテリシンＢが結合していないリポソームのＳＥＭ写真である。ただし、撮影は、走査型電子顕微鏡の試料室内に、このリポソームをイオン液体に浸漬した容器を置き、試料室内を１Ｐａ以下の高真空に真空排気した状態で行った。イオン液体としては、ＢＭＩＢＦ4 ：１－ブチル－３－メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート（1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 を用いた。試料溶液は、リポソーム懸濁液１０μＬとＢＭＩＢＦ4１０μＬとを混合することにより調製した。このように試料をイオン液体中に浸漬して電子顕微鏡により撮影する手法は、本発明者らが知る限り、これまで全く用いられておらず、本発明者らが初めて用いたものである。
　図２１に示すように、アムホテリシンＢが結合していないリポソームは球状の形状を有する。これに対し、図２０に示すように、アムホテリシンＢが結合したリポソームは、全体として球状で周囲に小さな突起がある形状を有する。この突起はアムホテリシンＢが結合している部分に対応する。このように、イオン液体中にリポソームを浸漬した状態で観察することにより、リポソームを極めて鮮明に撮影することができ、リポソームの形状を正確に知ることができる。
〈実施例１〉
　次に、リポソーム１２を構成する脂質２分子膜にステロール１８を結合させることの有効性について詳細に検討を行った結果について説明する。ステロール１８としてはコレステロールを用いた。なお、この検証に関しても抗生物質１６を用いている。
　次のようにして酵素固定化電極を作製した。
　ジアホラーゼ（ＤＩ）（ＥＣ　１．８．１．４、天野エンザイム製）を１～１０ｍｇ秤量し、緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）１ｍＬに溶解させ、ＤＩ酵素緩衝溶液（１７）とした。
　グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（ＮＡＤ依存型、ＥＣ　１．１．１．４７、天野エンザイム製）を１０～５０ｍｇ秤量し、緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）１ｍＬに溶解させ、ＧＤＨ酵素緩衝溶液（１８）とした。
　上記の酵素を溶解させる緩衝溶液は直前まで冷蔵されていたものが好ましく、酵素緩衝溶液もできるだけ冷蔵保存しておくことが好ましい。
　ＮＡＤＨ（シグマアルドリッチ製、Ｎ－８１２９）を１０～５０ｍｇ秤量し、緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）１ｍＬに溶解させ、ＮＡＤＨ緩衝溶液（１９）とした。
　２，３－ジメトキシ－５－メチル－１，４－ベンゾキノン（Ｑ０）を１００～２００ｍｇ秤量し、緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）１ｍＬに溶解させ、Ｑ０緩衝溶液（２０）とした。
　卵黄レシチン（Ｗａｋｏ製）を１０～１００ｍｇ、コレステロールを１～５０ｍｇ秤量し、エタノール１０ｍＬに溶解させ、ロータリーエバポレーターによりエタノールを揮発させ、レシチンとコレステロールとが均一に混合したフィルムを形成する。そのフィルムを緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）１０ｍＬで懸濁させてホモジナイザーで均一化し、リポソーム緩衝溶液（２１）とした。
　上記のようにして作製した各種の溶液を、下記に示す量ずつ採取して混合し、凍結融解を３度繰り返した。
　ＤＩ酵素緩衝溶液（１７）：５０μＬ
　ＧＤＨ酵素緩衝溶液（１８）：５０μＬ
　ＮＡＤＨ緩衝溶液（１９）：５０μＬ
　リポソーム緩衝溶液（２１）：５０μＬ
　上記の混合溶液をゲルろ過カラムに通し、リポソーム外の酵素およびＮＡＤＨを除去する。ここで得たリポソーム溶液をＧＤＨ、ＤＩ、ＮＡＤＨ封入リポソーム溶液（２２）とした。
　こうして得たＧＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨ封入リポソーム溶液（２２）とＱ０緩衝溶液（２０）とを混合して総体積１００μＬの測定溶液を作製した。そして、作用電極としてカーボンフェルト、参照電極としてＡｇ｜ＡｇＣｌ、対極として白金ワイヤーを用い、電位をＡｇ｜ＡｇＣｌに対して＋０．１Ｖに設定し、グルコースを燃料として、溶液攪拌下においてクロノアンペロメトリーを行った。クロノアンペロメトリー中に測定溶液に、終濃度が１００ｍＭとなるようにグルコースを添加し、さらに終濃度が１００μＭとなるようにアムホテリシンＢを添加した。クロノアンペロメトリーの結果を図２２に示す。比較のために、コレステロールが結合していないことを除いて同様な条件で行った二つの例のクロノアンペロメトリーの結果を図２３および図２４に示す。図２３および図２４に示すように、コレステロールが結合していないリポソームでは電流の下降が観測されるのに対し、図２２に示すように、コレステロールが結合したリポソームは定常電流を示す。これより、ステロールを結合させることにより、アムホテリシンＢが結合したリポソームは構造的に安定化し、グルコースの透過が改善され、より安定した触媒電流を示すことが確認できた。すなわち、ステロールを結合させることは、リポソームを電気化学触媒として用いる上で非常に有用な物質であるということが分かる。
　これまでの検証により、ステロールが脂質２分子膜に対する有機酸の透過の改善に有用であることを確認したが、次にステロールの種類によって透過が変化するかを検討した。リポソームを構成する脂質２分子膜にアムホテリシンＢおよびステロールとしてコレステロールまたはエルゴステロールが結合した状態において、アムホテリシンＢに対する有機酸の透過性を調べた。有機酸は水溶液中で電離し、電荷を持つ。そこで、有機酸イオンの移動を電気化学的に分析した。
　ただし、電気化学分析は、リポソームの代わりに、平坦な脂質２分子膜にアムホテリシンＢおよびステロールとしてコレステロールまたはエルゴステロールが結合したものを用いて行った。
　図２５は電気化学分析に用いた電気化学測定装置を示す。図２５に示すように、この電気化学測定装置においては、二つの容器Ｗ１、Ｗ２が、それらの壁に形成された穴Ｈ１と穴Ｈ２とが互いに一致するように連結されている。穴Ｈ１と穴Ｈ２との間には脂質２分子膜ＢＬＭが容器Ｗ１の内部と容器Ｗ２の内部とを仕切るように設けられている。脂質２分子膜ＢＬＭにアムホテリシンＢおよびコレステロールを結合させた。脂質２分子膜ＢＬＭとしては、ホスファチジルコリンからなるものを用いた。容器Ｗ１、Ｗ２内にはそれぞれ緩衝液からなる支持電解質ＳＥが入れられている。容器Ｗ１内の支持電解質ＳＥに対極ＣＥおよび参照電極ＲＥを浸漬し、容器Ｗ２内の支持電解質ＳＥに作用極ＷＥを浸漬し、これらの対極ＣＥ、参照電極ＲＥおよび作用極ＷＥにポテンショスタットＰを接続した。対極ＣＥとしては白金（Ｐｔ）を用い、参照電極ＲＥおよび作用極ＷＥとしてはＡｇ｜ＡｇＣｌを用いた。容器Ｗ１内の支持電解質ＳＥを基準とし、容器Ｗ２内の支持電解質ＳＥに電圧ΔＥを印加して、脂質２分子膜ＢＬＭに対する有機酸の透過を作用極ＷＥと対極ＣＥとの間に流れる電流値（電流密度ｊ）を求めた。
　有機酸として乳酸ナトリウムを用い、乳酸ナトリウムの電離により発生する乳酸イオンおよびナトリウムイオン（Ｎａ+）のアムホテリシンＢに対する透過を観察した。図２６に示すように、容器Ｗ１、Ｗ２内の支持電解質ＳＥとして用いた緩衝液は１０-2ＭのＢｉｓＴｒｉｓ－ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）である。アムホテリシンＢの量は５×１０-7Ｍである。容器Ｗ１内の支持電解質ＳＥに０．０１Ｍの乳酸ナトリウムを添加し、容器Ｗ２内の支持電解質ＳＥにそのｃ倍、すなわち０．０１×ｃＭの乳酸ナトリウムを添加した。
　図２７に電気化学測定の結果を示す。図２７に示すように、ｃが大きくなるにつれて電流ｊは大きな負の値になり、電流がゼロとなる電位（ゼロ電流電位）が正にシフトする。図２８に、容器Ｗ１、Ｗ２内の支持電解質ＳＥ中の乳酸イオンおよびＮａ+の分布を模式的に示す。図２８に示すように、濃度勾配による乳酸イオンおよびＮａ+の移動をゼロにするには、正の電圧Ｅを印加しなければならない。このことから、アムホテリシンＢはアニオン選択性を有することが分かる。
　ここで、脂質２分子膜ＢＬＭの内外でのイオン分布の評価を行う。
　図２９は容器Ｗ１、Ｗ２内の支持電解質ＳＥ中のＮａ+および乳酸イオン（Ｏｒｇ-）の分布を模式的に示す。容器Ｗ１内の支持電解質ＳＥ中のＮａ+の濃度を［Ｎａ+］W1、乳酸イオン（Ｏｒｇ-）の濃度を［Ｏｒｇ- ］W1、容器Ｗ２内の支持電解質ＳＥ中のＮａ+の濃度を［Ｎａ+］W2、乳酸イオン（Ｏｒｇ-）の濃度を［Ｏｒｇ- ］W2と表す。また、脂質２分子膜ＢＬＭのうちの容器Ｗ１内の支持電解質ＳＥと接する部分のＮａ+の濃度を［Ｎａ+］M1、乳酸イオン（Ｏｒｇ-）の濃度を［Ｏｒｇ- ］M1と表す。また、脂質２分子膜ＢＬＭのうちの容器Ｗ２内の支持電解質ＳＥ中のＮａ+の濃度を［Ｎａ+］M2、乳酸イオン（Ｏｒｇ-）の濃度を［Ｏｒｇ- ］M2と表す。
　脂質２分子膜ＢＬＭの内外でのイオンの分配平衡は
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
 と表される。
　実験条件は
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
 である。また、電気的中性則より
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
 となる。
　以上より、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
 が成立する。
　次に、理論式によりゼロ電流電位の評価を行う。
　図２９における［Ｎａ+］W2および［Ｏｒｇ-］W2をそれぞれ［Ｎａ+］W1および［Ｏｒｇ- ］W1で表し、［Ｎａ+］M2および［Ｏｒｇ-］M2をそれぞれＮａ+］M1および［Ｏｒｇ- ］M1で表したものを図３０に示す。容器Ｗ１内の支持電解質ＳＥと脂質２分子膜ＢＬＭとの界面電位をＥS:W1/BLM、容器Ｗ２内の支持電解質ＳＥと脂質２分子膜ＢＬＭとの界面電位をＥS:BLM/W2、脂質２分子膜ＢＬＭの電位をＥMと表す。
　Ｇｏｌｄｍａｎ式およびＮｅｒｎｓｔ式より
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
 が成立する。
　Ｎａ+およびＯｒｇ-の拡散係数をそれぞれＤＮａ+およびＤOrg-と表し、拡散係数比
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
 とすると、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
 と表すことができる。ただし、Ｒは気体定数、Ｆはファラデー定数、Ｔは絶対温度である。
　次に、拡散係数比αの算出方法について説明する。
　図３１はｃratioの実測値に対してゼロ電流電位Ｅobsをプロットした図である。図３１に示すように、Ｅobs の式から、実測値に対するフィッティングによりα＝２．０と求められる。
　図３２に各種の有機酸イオンのα値を有機酸の分子量に対して示す。
　図３３および図３４はそれぞれステロールとしてコレステロールおよびエルゴステロールを用いた場合の電気化学測定の結果を示す。測定条件は図２６においてｃ＝１としたものである。図３３および図３４より、コレステロールを用いた場合には、乳酸０．０１Ｍでの電流密度ｊは、乳酸なしと比較して約２００倍増加する。これに対し、エルゴステロールを用いた場合には、乳酸０．０１Ｍでの電流密度ｊは、乳酸なしと比較して約３０倍増加する。このように、エルゴステロールを用いた場合にはコレステロールを用いた場合に比べて、電流密度ｊの増加は少ない。これは、リポソームを構成する脂質２分子膜にアムホテリシンＢに加えてステロールを結合させたことにより、アムホテリシンＢの穴の径が影響を受け、乳酸ナトリウムの透過が制御されたことを意味する。あるいは、脂質２分子膜ＢＬＭにアムホテリシンＢに加えてステロールを結合させたことにより、アムホテリシンＢのアニオン選択性が増加し、乳酸ナトリウムが透過しやすくなったことによるものとも考えられる。つまり、ステロールを利用することにより、有機酸の透過やアニオン選択性を制御することができるということである。
　図３５は、コレステロールまたはエルゴステロールを用いた場合において、種々の有機酸の拡散係数比αを有機酸の分子量に対して示したものである。
　図３５に示すように、いずれの有機酸でも、コレステロールを用いた場合の方が、エルゴステロールを用いた場合に比べて、拡散係数比αは大きい。これは、エルゴステロールを用いた場合には、コレステロールを用いた場合に比べて、Ｎａ+に対し、全ての有機酸イオンの透過性が低下することによるものと考えられる。
　次に、アムホテリシンＢの穴をグルコースが透過することを確認した結果について説明する。グルコースは電荷を持たないため、直接、電気化学測定を行うことができない。そこで、グルコースを酵素で酸化し、電極で電子移動を観測するものとする。
　図３６は使用した電気化学測定系を示す。図３６に示すように、カーボンペースト電極ＣＰ上にグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）およびフェロセンを固定化したバイオセンサーを作製した。そして、リポソーム内にグルコースを封入し、アムホテリシンＢの添加によるグルコースの溶出を測定した。
　図３７に測定結果を示す。図３７の縦軸はグルコース濃度ｃ、横軸は時間ｔを示す。図３７に示すように、アムホテリシンＢの添加と同時に、グルコース濃度が立ち上がり、グルコースが溶出したことが分かる。
　グルコース溶出速度は理論的に次のように求められる。
　グルコース溶出速度をＶ、グルコースの初期濃度をｃin、リポソームの外部のグルコース濃度をｃoutと表すと、グルコース溶出速度Ｖは次式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
 ただし、ｋはアムホテリシンＢの穴の透過性を示す定数である。
　この微分方程式を解くと、リポソームの外部のグルコース濃度ｃoutは
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
 と求められる。ただし、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000013
 である。
　ｃoutの式を図３７に示す実験結果とフィッティングすることによりｋを算出することができる。その結果、コレステロール使用時のｋは６．１±１．８×１０-5ｓ-1、エルゴステロール使用時のｋは６．３±０．３×１０-5ｓ-1であり、両者はほぼ同じであった。このことから、コレステロールもエルゴステロールも、アムホテリシンＢの穴の径は変わらないことが分かる。
　図３８を参照して、リポソームにエルゴステロールを結合させた場合の利点について説明する。図３８に示すように、この場合には、基質としてグルコースのような中性物質を用い、中間体に有機酸などのアニオンが生じる場合には、アムホテリシンＢの穴からの基質の取り込みを低下させることなく、エルゴステロールによるアムホテリシンＢのアニオン選択性の低下により、リポソームの外部への中間体の漏出を抑制することができる。
　次に、リポソームを構成する脂質２分子膜が単層の場合と多層の場合とでリポソームからのグルコースの流出を確認した結果について説明する。
　図３９Ａはコレステロールを結合させた直径５０ｎｍの単層リポソームを用いた場合のグルコース濃度の時間変化、図３９Ｂはコレステロールを結合させた直径１００ｎｍの単層リポソームを用いた場合のグルコース濃度の時間変化を示す。図４０はコレステロールを結合させた多重層リポソームを用いた場合のグルコース濃度の時間変化を示す。図３９ＡおよびＢならびに図４０より、単層リポソームでも多重層リポソームでも、アムホテリシンＢの添加まではグルコースの溶出は観測されない。
　図４１Ａはエルゴステロールを結合させた直径１００ｎｍの単層リポソームを用いた場合のグルコース濃度の時間変化、図４１Ｂはエルゴステロールを結合させた多層リポソームを用いた場合のグルコース濃度の時間変化を示す。
　以上のように、この第１の実施の形態によれば、脂質２分子膜に抗生物質１６が結合して穴１７が形成され、さらにステロール１８が結合したリポソーム１２の内部に、基質、例えばグルコースや有機酸などを分解するための酵素反応に必要な酵素１３、１４および補酵素１５を封入している。そして、このリポソーム１２を電極１１に固定化している。このため、酵素反応をこのリポソーム１２の内部の微小な空間を反応場として効率的に行うことができ、基質であるグルコースから効率的に電子を取り出し、電極１１に受け渡すことができる。また、従来のように酵素などをポリイオンコンプレックスなどにより電極１１上に直接固定化する場合に比べて固定化を簡単に行うことができる。
〈２．第２の実施の形態〉
［バイオ燃料電池］
　次に、この発明の第２の実施の形態について説明する。この第２の実施の形態においては、バイオ燃料電池の負極として、第１の実施の形態による酵素固定化電極を用いる。
　図４２はこのバイオ燃料電池を模式的に示す。このバイオ燃料電池では、燃料としてグルコースを用いる。図４３は、このバイオ燃料電池の負極の構成の詳細ならびにこの負極に固定化されたリポソーム１２に封入された酵素群および補酵素の一例およびこの酵素群および補酵素による電子の受け渡し反応を模式的に示す。
　図４２および図４３に示すように、このバイオ燃料電池は、負極２１と正極２２とが電解質層２３を介して対向した構造を有する。負極２１は、燃料として供給されたグルコースを酵素により分解し電子を取り出すとともにプロトン（Ｈ+ ）を発生する。正極２２は、負極２１から電解質層２３を通って輸送されたプロトンと負極２１から外部回路を通って送られた電子と例えば空気中の酸素とにより水を生成する。
　負極２１としては、第１の実施の形態による酵素固定化電極が用いられる。この酵素固定化電極は、具体的には、電極１１上に、脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴１７を有する抗生物質１６およびステロール１８が結合したリポソーム１２が固定化されたものである。このリポソーム１２の内部には、グルコースの分解に関与する酵素、グルコースの分解プロセスにおける酸化反応に伴って還元体が生成される補酵素および補酵素の還元体を酸化する補酵素酸化酵素が封入されている。電極１１上には、必要に応じて、リポソーム１２に加えて、補酵素酸化酵素から補酵素の酸化に伴って生じる電子を受け取って電極１１に渡す電子メディエーターも固定化される。
　グルコースの分解に関与する酵素としては、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、好適にはＮＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼを用いることができる。この酸化酵素を存在させることにより、例えば、β－Ｄ－グルコースをＤ－グルコノ－δ－ラクトンに酸化することができる。
　さらに、このＤ－グルコノ－δ－ラクトンは、グルコノキナーゼとフォスフォグルコネートデヒドロゲナーゼ（ＰｈＧＤＨ）との二つの酵素を存在させることにより、２－ケト－６－フォスフォ－Ｄ－グルコネートに分解することができる。すなわち、Ｄ－グルコノ－δ－ラクトンは、加水分解によりＤ－グルコネートになり、Ｄ－グルコネートは、グルコノキナーゼの存在下、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）とリン酸とに加水分解することでリン酸化されて、６－フォスフォ－Ｄ－グルコネートになる。この６－フォスフォ－Ｄ－グルコネートは、酸化酵素ＰｈＧＤＨの作用により、２－ケト－６－フォスフォ－Ｄ－グルコネートに酸化される。
　また、グルコースは上記分解プロセスのほかに、糖代謝を利用してＣＯ2まで分解することもできる。この糖代謝を利用した分解プロセスは、解糖系によるグルコースの分解およびピルビン酸の生成ならびにＴＣＡ回路に大別されるが、これらは広く知られた反応系である。
　単糖類の分解プロセスにおける酸化反応は、補酵素の還元反応を伴って行われる。この補酵素は作用する酵素によってほぼ定まっており、ＧＤＨの場合、補酵素にはＮＡＤ+が用いられる。すなわち、ＧＤＨの作用によりβ－Ｄ－グルコースがＤ－グルコノ－δ－ラクトンに酸化されると、ＮＡＤ+がＮＡＤＨに還元され、Ｈ+を発生する。
　生成されたＮＡＤＨは、ジアホラーゼ（ＤＩ）の存在下で直ちにＮＡＤ+に酸化され、二つの電子とＨ+ とを発生する。したがって、グルコース１分子につき１段階の酸化反応で二つの電子と二つのＨ+とが生成されることになる。２段階の酸化反応では、合計四つの電子と四つのＨ+ とが生成される。
　上記プロセスで生成された電子はジアホラーゼから電子メディエーターを介して電極１１に渡され、Ｈ+は電解質層２３を通って正極２２へ輸送される。
　上記の酵素および補酵素が封入されたリポソーム１２および電子メディエーターは、電極反応が効率よく定常的に行われるようにするために、電解質層２３に含まれるリン酸緩衝液やトリス緩衝液などの緩衝液によって、酵素にとって最適なｐＨ、例えばｐＨ７付近に維持されていることが好ましい。リン酸緩衝液としては、例えばＮａＨ2ＰＯ4 やＫＨ2 ＰＯ4 が用いられる。さらに、イオン強度（Ｉ．Ｓ．）は、あまり大きすぎても小さすぎても酵素活性に悪影響を与えるが、電気化学応答性も考慮すると、適度なイオン強度、例えば０．３程度であることが好ましい。ただし、ｐＨおよびイオン強度は、用いる酵素それぞれに最適値が存在し、上述した値に限定されない。
　図４３には、一例として、グルコースの分解に関与する酵素がグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、グルコースの分解プロセスにおける酸化反応に伴って還元体が生成される補酵素がＮＡＤ+、補酵素の還元体であるＮＡＤＨを酸化する補酵素酸化酵素がジアホラーゼ（ＤＩ）、補酵素酸化酵素から補酵素の酸化に伴って生じる電子を受け取って電極１１に渡す電子メディエーターがＡＣＮＱである場合が図示されている。
　正極２２は、例えば多孔質カーボンなどの電極材料からなる電極に、例えばビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどの酸素を分解する酵素を固定化したものである。この正極２２の外側の部分（電解質層２３と反対側の部分）は通常、多孔質カーボンよりなるガス拡散層により形成されるが、これに限定されるものではない。正極２２には、好適には、酵素に加えて、この正極２２との間で電子の受け渡しを行う電子メディエーターも固定化される。
　この正極２２においては、上記の酸素を分解する酵素の存在下で、電解質層２３からのＨ+と負極２１からの電子とにより空気中の酸素を還元し水を生成する。
　電解質層２３は負極２１において発生したＨ+を正極２２に輸送するためのもので、電子伝導性を持たず、Ｈ+ を輸送することが可能な材料により構成されている。電解質層２３としては、具体的には、例えば、セロハンなどの既に挙げたものが用いられる。
　以上のように構成されたバイオ燃料電池において、負極２１側にグルコースが供給されると、このグルコースが酸化酵素を含む分解酵素により分解される。この単糖類の分解プロセスで酸化酵素が関与することで、負極２１側で電子とＨ+とを生成することができ、負極２１と正極２２との間で電流を発生させることができる。
　次に、バイオ燃料電池の具体的な構造例について説明する。
　図４４ＡおよびＢに示すように、このバイオ燃料電池は、負極２１と正極２２とが電解質層２３を介して対向した構成を有している。この場合、正極２２の下および負極２１の下にそれぞれＴｉ集電体４１、４２が置かれ、集電を容易に行うことができるようになっている。符号４３、４４は固定板を示す。これらの固定板４３、４４はねじ４５により相互に締結され、それらの間に、正極２２、負極２１、電解質層２３およびＴｉ集電体４１、４２の全体が挟み込まれている。固定板４３の一方の面（外側の面）には空気取り込み用の円形の凹部４３ａが設けられ、この凹部４３ａの底面に他方の面まで貫通した多数の穴４３ｂが設けられている。これらの穴４３ｂは正極２２への空気の供給路となる。一方、固定板４４の一方の面（外側の面）には燃料装填用の円形の凹部４４ａが設けられ、この凹部４４ａの底面に他方の面まで貫通した多数の穴４４ｂが設けられている。これらの穴４４ｂは負極２１への燃料の供給路となる。この固定板４４の他方の面の周辺部にはスペーサー４６が設けられており、固定板４３、４４をねじ４５により相互に締結したときにそれらの間隔が所定の間隔になるようになっている。
　図４４Ｂに示すように、Ｔｉ集電体４１、４２の間に負荷４７を接続し、固定板４４の凹部４４ａに燃料として例えばリン酸緩衝液にグルコースを溶かしたグルコース溶液を入れて発電を行う。
　この第２の実施形態によれば、酵素反応に必要な酵素群および補酵素が封入され、かつ脂質２分子膜に、穴１７を有する抗生物質１６およびステロール１８が結合したリポソーム１２を電極１１上に固定化した酵素固定化電極を負極２１として用いている。このため、酵素反応をリポソーム１２の内部の微小な空間を反応場として効率的に行うことができ、燃料であるグルコースから効率的に電子を取り出し、電極１１に受け渡すことができるとともに、酵素などをポリイオンコンプレックスなどにより電極１１上に直接固定化する場合に比べて固定化を簡単に行うことができる。このように負極２１として用いられる酵素固定化電極が高効率であることにより、高効率のバイオ燃料電池を実現することができる。また、バイオ燃料電池の高出力化のためには燃料であるグルコースから２電子よりも多くの電子を取り出す必要があり、このためには三種類以上の酵素が適切な位置に固定化された酵素固定化電極を負極２１に用いる必要があるが、リポソーム１２の内部に三種類以上の酵素を封入することによりこのような要求も満たすことができる。また、互いに異なる三種類以上の酵素が封入された多種類のリポソームを混在させることにより多種類の燃料への対応が容易になる。さらには、負極リポソームと正極リポソームとを配列させたマイクロバイオ燃料電池の実現も可能である。
 〈３．第３の実施の形態〉
［バイオ燃料電池］
　この第３の実施の形態によるバイオ燃料電池は、負極２１の電極材に図４５ＡおよびＢに示すような多孔体導電材料を用いることを除いて、第２の実施の形態によるバイオ燃料電池と同様な構成を有する。
　図４５Ａはこの多孔体導電材料の構造を模式的に示し、図４５Ｂはこの多孔体導電材料の骨格部の断面図である。図４５ＡおよびＢに示すように、この多孔体導電材料は、三次元網目状構造の多孔体材料からなる骨格７９ａと、この骨格７９ａの表面を被覆するカーボン系材料７９ｂとからなり、このカーボン系材料７９ｂの表面に、第２の実施形態と同様なリポソーム１２が固定化されている。この多孔体導電材料は、カーボン系材料７９ｂに囲まれた多数の孔８０が網目に相当する三次元網目状構造を有する。この場合、これらの孔８０同士は互いに連通している。カーボン系材料７９ｂの形態は問わず、繊維状（針状）、粒状などのいずれであってもよい。
　多孔体材料からなる骨格７９ａとしては、発泡金属あるいは発泡合金、例えば発泡ニッケルが用いられる。この骨格７９ａの多孔率は一般的には８５％以上、あるいは９０％以上であり、その孔径は、一般的には例えば１０ｎｍ～１ｍｍ、あるいは１０ｎｍ～６００μｍ、あるいは１～６００μｍ、典型的には５０～３００μｍ、より典型的には１００～２５０μｍである。カーボン系材料７９ｂとしては、例えばケッチェンブラックなどの高導電性のものが好ましいが、カーボンナノチューブやフラーレンなどの機能性カーボン材料を用いてもよい。
　この多孔体導電材料の多孔率は一般的には８０％以上、あるいは９０％以上であり、孔８０の径は、一般的には例えば９ｎｍ～１ｍｍ、あるいは９ｎｍ～６００μｍ、あるいは１～６００μｍ、典型的には３０～４００μｍ、より典型的には８０～２３０μｍである。
　次に、この多孔体導電材料の製造方法について説明する。
　図４６Ａに示すように、まず、発泡金属あるいは発泡合金（例えば、発泡ニッケル）からなる骨格７９ａを用意する。
　次に、図４６Ｂに示すように、この発泡金属あるいは発泡合金からなる骨格７９ａの表面にカーボン系材料７９ｂをコーティングする。このコーティング方法としては従来公知の方法を用いることができる。一例を挙げると、カーボン粉末や適当な結着剤などを含むエマルションをスプレーにより骨格７９ａの表面に噴射することによりカーボン系材料７９ｂをコーティングする。このカーボン系材料７９ｂのコーティング厚さは、発泡金属あるいは発泡合金からなる骨格７９ａの多孔率および孔径との兼ね合いで、多孔体導電材料に要求される多孔率および孔径に応じて決められる。このコーティングの際には、カーボン系材料７９ｂに囲まれた多数の孔８０同士が互いに連通するようにする。
　こうして、目的とする多孔体導電材料が製造される。この後、この多孔体導電材料のカーボン系材料７９ｂの表面にリポソーム１２を固定化する。
　上記以外のことは第２の実施の形態と同様である。
　この第３の実施の形態によれば、第２の実施の形態と同様な利点に加えて次のような利点を得ることができる。すなわち、発泡金属あるいは発泡合金からなる骨格７９ａの表面をカーボン系材料７９ｂにより被覆した多孔体導電材料は、孔８０の径が十分に大きく、粗な三次元網目状構造を有しながら、高強度でしかも高い導電性を有し、必要十分な表面積を得ることもできる。このため、この多孔体導電材料を電極材に用い、これに酵素、補酵素および電子メディエーターを固定化することで得られる酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極からなる負極２１は、その上での酵素代謝反応を高効率に行わせることができ、あるいは、電極の近傍で起こっている酵素反応現象を効率よく電気信号として捉えることが可能であり、しかも使用環境によらずに安定であり、高性能のバイオ燃料電池を実現することが可能である。
〈４．第４の実施の形態〉
［細胞］
　この第４の実施の形態においては、生物から採取した細胞あるいは生物から採取した細胞の培養などにより得られる細胞の細胞膜を構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質およびステロールを結合させる。
　図４７に、細胞の外周の脂質２分子膜からなる細胞膜８１の一部分を示す。ここでは、この細胞が動物細胞である場合を考えるが、植物細胞であってもよい。この細胞は、主として、核とミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、リソゾームなどの細胞小器官と種々のイオン、養分、酵素などが溶けた水とを含む。図４７に示すように、この細胞の細胞膜８１には種々のタンパク質８２、８３、８４などが埋め込まれている。例えば、タンパク質８２はイオンなどを細胞の外部から内部に輸送するポンプタンパク質、タンパク質８３は膜内タンパク質、タンパク質８４は特定の分子を細胞の内外へ輸送する機能を有するチャネルタンパク質である。この細胞膜８１には、上述の種々のタンパク質８２、８３、８４に加えて抗生物質１６が結合しており、グルコースの透過が可能な一つまたは複数の穴１７が形成され、さらにステロール１８が結合している。
　上記のように構成された細胞は、従来公知の方法により、多孔質カーボンなどからなる電極に固定化される。
　この第４の実施の形態によれば、上記の細胞がグルコースを含む緩衝液などに置かれた場合、細胞膜８１の穴１７を透過して内部に例えばグルコースを取り込むことができる。こうして細胞の内部に取り込まれたグルコースは、この細胞が有するクエン酸回路、解糖系、ペントースリン酸回路などの代謝系により分解され、電子が取り出される。こうして取り出された電子は最終的には電子メディエーターを介して、もしくは電子メディエーターなしで直接、この細胞が固定化された電極に受け渡されて外部に取り出される。こうして、グルコースから電気エネルギーを取り出すことができる。
〈５．第５の実施の形態〉
［ミトコンドリア］
　この第５の実施の形態においては、生物から採取した細胞あるいは生物から採取した細胞の培養などにより得られる細胞に含まれる細胞小器官であるミトコンドリアを構成する脂質２分子膜にグルコースの透過が可能な一つまたは複数の穴を形成する。ミトコンドリアは真核細胞のエネルギー生産の場であり、食物の分子の酸化反応に際して得られるエネルギーでＡＴＰを作る。
　図４８にミトコンドリアを示す。図４８に示すように、ミトコンドリアは、外膜８５および内膜８６を有する。これらの外膜８５および内膜８６は脂質２分子膜からなる細胞膜である。内膜８６はひだ状のクリステを形成している。内膜８６の内部のマトリックス腔８７には多種の酵素が濃縮されている。分子の酸化の最終段階は内膜８６で起こる。このミトコンドリアの外膜８５および内膜８６を構成する細胞膜には抗生物質１６が結合しており、グルコースの透過が可能な一つまたは複数の穴１７が形成され、さらにステロール１８が結合している。
　上記のように構成されたミトコンドリアは、従来公知の方法により、多孔質カーボンなどからなる電極に固定化される。
　この第５の実施の形態によれば、上記のミトコンドリアがグルコースを含む緩衝液などに置かれた場合、外膜８５および内膜８６の穴１７を透過して内部にグルコースを取り込むことができる。こうしてミトコンドリアの内部に取り込まれたグルコースは、このミトコンドリアが有する分子の酸化系、すなわちクエン酸回路、解糖系、ペントースリン酸回路などにより分解され、電子が取り出される。こうして取り出された電子は最終的には電子メディエーターを介して、もしくは電子メディエーターなしで直接、このミトコンドリアが固定化された電極に受け渡されて外部に取り出される。こうして、グルコースから電気エネルギーを取り出すことができる。
〈６．第６の実施の形態〉
［細菌］
　この第６の実施の形態においては、細菌の細胞膜を構成する脂質２分子膜にグルコースの透過が可能な一つまたは複数の穴を形成する。
　図４９に細菌を示す。ここでは、この細菌が真正細菌である場合を考える。図４９に示すように、この細菌は外部から順に莢膜８８、細胞壁８９および細胞膜９０により取り囲まれており、その内部に細胞質９１が入っている。この細菌の外部には鞭毛９２および繊毛９３が結合している。ただし、細菌によっては莢膜８８、鞭毛９２および繊毛９３がないものもある。例えば、大腸菌にはこれらの莢膜８８、鞭毛９２および繊毛９３がない。細胞質９１には、図示は省略するが、核様体、リボソームなどが存在している。細胞膜９０には電子伝達系や各種の輸送体などのタンパク質が分布している。この細菌の脂質２分子膜からなる細胞膜９０には抗生物質１６が結合しており、グルコースの透過が可能な一つまたは複数の穴１７が形成され、さらにステロール１８が結合している。
　上記のように構成された細菌は、従来公知の方法により、多孔質カーボンなどからなる電極に固定化される。
　この第６の実施の形態によれば、この細菌がグルコースを含む緩衝液などに置かれた場合、この細菌の細胞膜９０の穴１７を透過して内部にグルコースを取り込むことができる。こうして細菌の内部に取り込まれたグルコースは、この細菌が有するクエン酸回路、解糖系、ペントースリン酸回路などの代謝系により分解され、電子が取り出される。こうして取り出された電子は最終的には電子メディエーターを介して、もしくは電子メディエーターなしで直接、この細菌が固定化された電極に受け渡されて外部に取り出される。こうして、グルコースから電気エネルギーを取り出すことができる。
〈７．第７の実施の形態〉
［バイオ燃料電池］
　この第７の実施の形態によるバイオ燃料電池は、負極２１の電極１１として図５０ＡおよびＢに示すような多孔質電極を用いることを除いて、第２の実施の形態によるバイオ燃料電池と同様な構成を有する。
　図５０Ａはこの多孔質電極からなる電極１１の全体構成を示し、図５０Ｂはこの電極１１の断面構造を模式的に示す。図５０Ｂに示すように、この多孔質電極からなる電極１１は多数の孔（ポア）１１ａを有する。この孔１１ａの内面に、第２の実施形態と同様なリポソーム１２（内部の水相に封入されている酵素および補酵素や脂質２分子膜に結合した抗生物質およびこの抗生物質に縁取られる穴などの図示は省略）が固定化されている。この場合、これらの孔１１ａ同士は互いに連通している。この多孔質電極の材料としては、好適にはカーボン系材料が用いられるが、これに限定されるものではない。この多孔質電極は、典型的にはカーボンペースト電極である。
　この多孔質電極からなる電極１１の孔１１ａの内面へのリポソーム１２の固定化は、リポソーム１２を含む溶液を電極１１中に浸透させることにより行うことができる。
　上記以外のことは第２の実施の形態と同様である。
　この第７の実施の形態によれば、第３の実施の形態と同様な利点を得ることができる。
〈８．第８の実施の形態〉
［酵素固定化電極］
　図５１はこの第８の実施の形態による酵素固定化電極を示す。この酵素固定化電極においては、基質としてグルコースを用いる。
　図５１に示すように、この酵素固定化電極においては、多孔質カーボンなどからなる電極１１の表面（電極１１の内部の孔の内面も含む）にアビジン１０１が固定化されている。一方、第１の実施の形態と同様なリポソーム１２にビオチン１０２が結合している。そして、電極１１の表面に固定化されたアビジン１０１とリポソーム１２に結合したビオチン１０２とが不可逆的に特異的に結合している。図５１においては、一つのリポソーム１２に一つのビオチン１０２が結合している場合が示されているが、一つのリポソーム１２に複数のビオチン１０２を結合させてもよい。
　リポソーム１２の内部の水相１２ａには、目的とする酵素反応に関与する酵素１３、１４および補酵素１５が封入されている。このリポソーム１２の内部の水相１２ａには、これらの酵素１３、１４および補酵素１５以外に、例えば電子メディエーターを封入してもよい。この電子メディエーターは、リポソーム１２とともに電極１１上に固定化してもよい。酵素１３は基質として用いられるグルコースの酸化を促進し分解する酸化酵素、酵素１４はこのグルコースの酸化に伴って還元された補酵素１５を酸化体に戻すとともに電子メディエーターを介して電子を電極１１に渡す補酵素酸化酵素である。
　図示は省略するが、図２に示すリポソーム１２と同様に、リポソーム１２を構成する脂質２分子膜に一つまたは複数の抗生物質およびステロールが結合しており、この抗生物質により縁取られる形でこの脂質２分子膜を貫通する穴が形成されている。
［酵素固定化電極の製造方法］
　この酵素固定化電極は、例えば、次のようにして製造することができる。まず、酵素１３、１４および補酵素１５が封入され、外周面にビオチン１０２が結合したリポソーム１２を作製する。リポソーム１２にビオチン１０２を結合するためには、例えば、ＮＨＳエステルによって修飾されたビオチン１０２を用いてリン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミンと脱水縮合させてアミド結合させる。次に、このリポソーム１２を構成する脂質２分子膜に抗生物質を結合させて穴を形成するとともに、この脂質２分子膜にステロールを結合させる。一方、電極１１の表面にアビジン１０１を固定化する。アビジン１０１を電極１１に固定化するためには、例えば、アビジン１０１が結合したアガロースビーズが混合されたカーボンペースト電極を電極１１として用いたり、アビジン１０１を電極１１の表面上でポリ－Ｌ－リシン（ＰＬＬ）などのポリマーに埋め込ませたりする。次に、こうして電極１１の表面に固定化したアビジン１０１と、穴１７を形成したリポソーム１２に結合したビオチン１０２とを結合させることにより、リポソーム１２を電極１１上に固定化する。これによって、酵素固定化電極が製造される。酵素１３、１４および補酵素１５を封入する前のリポソーム１２を構成する脂質２分子膜に抗生物質を結合させて穴を形成するとともに、ステロールを結合させるようにしてもよい。また、リポソーム１２を電極１１上に固定化してからこのリポソーム１２を構成する脂質２分子膜に抗生物質を結合させて穴を形成するとともに、ステロールを結合させるようにしてもよい。
〈実施例２〉
　次のようにして酵素固定化電極を作製した。ただし、ここでは、ステロールの効果を除外するために、リポソームにはステロールを結合させない。
　ジアホラーゼ（ＤＩ）（ＥＣ　１．８．１．４、天野エンザイム製）を５ｍｇ秤量し、緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）１ｍＬに溶解させ、５ｍｇ／ｍＬのＤＩ酵素緩衝溶液を調製した。
　グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（ＮＡＤ依存型、ＥＣ　１．１．１．４７、天野エンザイム製）を２５ｍｇ秤量し、緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）１ｍＬに溶解させ、２５ｍｇ／ｍＬのＧＤＨ酵素緩衝溶液を調製した。
　上記の酵素を溶解させる緩衝溶液は直前まで冷蔵されていたものが好ましく、酵素緩衝溶液もできるだけ冷蔵保存しておくことが好ましい。
　ＮＡＤＨ（シグマ社製）を緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）に溶解させ、５０ｍＭのＮＡＤＨ緩衝溶液を調製した。
　２，３－ジメトキシ－５－メチル－１，４－ベンゾキノン（Ｑ０）を緩衝溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）に溶解させ、１０ｍＭのＱ０緩衝溶液を調製した。
　リン脂質として卵黄レシチン（Ｗａｋｏ製）およびビオチン修飾ホスファチジルエタノールアミン（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(capbiotinyl）を用いた。
　次のようにしてビオチン修飾リポソームを作製した。
　レシチンをエタノールに溶解し、１００ｍｇ／ｍＬレシチン溶液を調製する。また、ＣＨＣｌ3、メタノールおよび水の混合溶液（ＣＨＣｌ3 ：メタノール：水＝６５：３５：８）にビオチン修飾ホスファチジルエタノールアミンを溶解し、１０ｍｇ／ｍＬビオチン修飾ホスファチジルエタノールアミン溶液を調製する。
　エタノール２０ｍＬに上記のレシチン溶液を１ｍＬ、上記のビオチン修飾ホスファチジルエタノールアミン溶液を５０μＬ加え、良く混合する。こうして得られた混合溶液をロータリーエバポレーターにより４０℃バス、真空下で１時間以上処理して溶媒を減圧除去する。
　次に、得られた生成物に、２５ｍｇ／ｍＬのＧＤＨ酵素緩衝溶液５０μＬ、５ｍｇ／ｍＬのＤＩ酵素緩衝溶液５０μＬ、５０ｍＭのＮＡＤＨ緩衝溶液５０μＬを混合してから加え、３０～６０秒、超音波バスにつける。その際、ポリテトラフルオロエチレン製スクレーパーによりリン脂質フィルムをかきとるように混ぜる。
　次に、上記のようにして得られたリポソーム溶液を１．５ｍＬのチューブに移し、５０μＬの１００ｍＭリン酸緩衝液で残りのリポソーム溶液も回収し、１ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液を用いて１５００ｇ、４ｍｉｎの条件での遠心分離により２回、洗浄する。
　こうして得たＧＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨ封入ビオチン修飾リポソームを６００μＬの０．１Ｍリン酸緩衝液に懸濁させて、終濃度１ｍＭになるようにアムホテリシンＢを添加し、ボルテックスで混合する。
　以上のようにして、ＧＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨが封入され、アムホテリシンＢが結合したビオチン修飾リポソームが作製される。
　次のようにしてアビジン修飾電極を作製した。
　均一な粒子径のグラファイトパウダーと接着剤として用いるパラフィンオイルとを混合したカーボンペースト（ビー・エー・エス株式会社製）２００ｍｇにアビジンアガロースビーズ懸濁液１００μＬを加え、めのう乳鉢上で軽い力で練り込む。次に、こうして得られたアビジン含有カーボンペーストをデシケーター内で１時間以上乾燥させた後、上面にポケット部（凹部）を有する電極のポケット部に練り込む。この後、この電極の上面側をコピー紙に円を描くように押し付け、表面を平らにした。
　以上のようにしてアビジン修飾電極が作製される。
　次に、次のようにして、ＧＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨが封入され、アムホテリシンＢが結合したビオチン修飾リポソームをアビジン修飾電極に固定化した。
　まず、上記のようにして作製されたビオチン修飾リポソーム３００μＬに、上記のようにして作製されたアビジン修飾電極を浸漬する。そして、１時間、室温でインキュベーションを行った後、０．１Ｍリン酸緩衝液５００μＬで２回洗浄する。
　図５２に、ＧＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨが封入され、アムホテリシンＢが結合したビオチン修飾リポソームをアビジン修飾電極に固定化したものを示す。図５２に示すように、電極１０３の上面に設けたポケット部１０３ａにカーボンペースト電極１０４が埋め込まれ、このカーボンペースト電極１０４にアビジン１０１が固定化されている。そして、このアビジン１０１とリポソーム１２のビオチン１０２とが結合することにより、カーボンペースト電極１０４にリポソーム１２が結合し、固定化されている。リポソーム１２の内部の水相１２ａに封入された酵素１３、１４および補酵素１５はそれぞれＧＤＨ、ＤＩおよびＮＡＤＨである。
　上記のようにして作製されたリポソーム固定化電極（以下、必要に応じてＡｖｉＣＰＥ－ＢｉｏＬｉｐｏと略称）の電気化学応答を測定した。第１の比較例として、図５３に示すように、カーボンペースト電極１０４にアビジン１０１が固定化されていないことを除いて上記と同様なリポソーム固定化電極（以下、必要に応じてＣＰＥ－ＢｉｏＬｉｐｏと略称）を作製した。第２の比較例として、図５４に示すように、リポソーム１２にビオチン１０２が結合していないことを除いて上記と同様なリポソーム固定化電極（以下、必要に応じてＡｖｉＣＰＥ－Ｌｉｐｏと略称）を作製した。第３の比較例として、図５５に示すように、カーボンペースト電極１０４にアビジン１０１が固定化されていないこと、および、リポソーム１２にビオチン１０２が結合していないことを除いて上記と同様なリポソーム固定化電極（以下、必要に応じてＣＰＥ－Ｌｉｐｏと略称）を作製した。
　２ｍＬのチューブに０．１Ｍリン酸緩衝液１８０μＬ、終濃度１ｍＭになるように１０ｍＭのＱ０緩衝溶液２０μＬを加え、これに対極として白金ワイヤー、参照電極としてＡｇ｜ＡｇＣｌ、作用電極として上記の四種類のリポソーム固定化電極（ＡｖｉＣＰＥ－ＢｉｏＬｉｐｏ、ＣＰＥ－ＢｉｏＬｉｐｏ、ＡｖｉＣＰＥ－Ｌｉｐｏ、ＣＰＥ－Ｌｉｐｏ）を浸漬させ、電位をＡｇ｜ＡｇＣｌに対して＋０．３Ｖに設定し、クロノアンペロメトリーを行った。測定開始後、終濃度１００ｍＭになるように２０μＬの１Ｍグルコース溶液を加えた。クロノアンペロメトリーの結果を図５６に示す。図５６の各電流（Ｉ）－時間曲線は０．０３μＡのオフセットが加算されて示されているが、ベース電流値は同程度である。図５６から、カーボンペースト電極１０４にアビジン１０１が固定化され、かつリポソーム１２にビオチン１０２が結合しているリポソーム固定化電極（ＡｖｉＣＰＥ－ＢｉｏＬｉｐｏ）を用いた場合だけ、グルコースの添加時に０．０１５μＡ→０．０２３μＡと他のリポソーム固定化電極（ＣＰＥ－ＢｉｏＬｉｐｏ、ＡｖｉＣＰＥ－Ｌｉｐｏ、ＣＰＥ－Ｌｉｐｏ）に比べて比較的高い電流値応答が見られることが分かる。
　以上のように、この第８の実施の形態によれば、脂質２分子膜に抗生物質１６が結合して穴１７が形成されるとともに、ステロール１８が結合したリポソーム１２の内部に、グルコースを分解するための酵素反応に必要な酵素１３、１４および補酵素１５を封入している。そして、電極１１にアビジン１０１を固定化するとともに、リポソーム１２にビオチン１０２を結合し、電極１１に固定化したアビジン１０１とリポソーム１２に結合したビオチン１０２とを結合させることにより、電極１１にリポソーム１２を固定化している。このため、第１の実施の形態と同様な利点に加えて、電極１１にリポソーム１２を容易かつ確実にしかも強固に固定化することができるという利点を得ることができる。このリポソーム固定化電極は、例えば、バイオ燃料電池の負極として用いて好適なものである。
〈９．第９の実施の形態〉
［酵素固定化電極］
　図５７はこの第９の実施の形態による酵素固定化電極を示す。この酵素固定化電極においては、基質としてグルコースを用いる。
　図５７に示すように、この酵素固定化電極においては、アビジン１０１が４個のビオチン結合ポケットを有することを利用して、電極１１の表面に多層のリポソーム１２が固定化されている。すなわち、第８の実施の形態と同様に、電極１１の表面に固定化されたアビジン１０１とリポソーム１２に結合したビオチン１０２とが不可逆的に特異的に結合することにより、電極１１の表面にリポソーム１２が固定化されている。これに加えて、この場合、この電極１１の表面に固定化されたリポソーム１２には複数（図５７に示す例では二つ）のビオチン１０２が結合している。この電極１１の表面に固定化されたリポソーム１２の、電極１１の表面への固定化に用いられていないビオチン１０２は、電極１１の表面に固定化されていないアビジン１０１と結合している。そして、このアビジン１０１と他のリポソーム１２に結合した一つまたは二つ以上のビオチン１０２とが結合することにより、リポソーム１２同士が互いに結合している。こうして、電極１１の表面に多層のリポソーム１２が固定化されている。その他のことは第８の実施の形態と同様である。
［酵素固定化電極の製造方法］
　この酵素固定化電極を製造するためには、第８の実施の形態による酵素固定化電極と同様にしてリポソーム１２を電極１１上に固定化した後、例えば、アビジン１０１またはアビジンアガロースビーズを加えることで、リポソーム１２を積層させる。この場合、加えるアビジンの量やリポソーム１２を構成する脂質２分子膜中のビオチン修飾脂質の比を調整することにより、積層するリポソーム１２の層の厚さやリポソーム１２の密度などを制御することができる。
　この第９の実施の形態によれば、第８の実施の形態と同様な利点を得ることができる。
　以上、この発明の実施の形態および実施例について具体的に説明したが、この発明は、上述の実施の形態および実施例に限定されるものではなく、この発明の技術的思想に基づく各種の変形が可能である。
　例えば、上述の実施の形態および実施例において挙げた数値、構造、構成、形状、材料などはあくまでも例に過ぎず、必要に応じてこれらと異なる数値、構造、構成、形状、材料などを用いてもよい。
　なお、アビジンとビオチンとの特異的な結合などを用いたこの発明によるリポソームの電極への固定化方法は、リポソームを構成する脂質２分子膜がグルコースの透過が可能な穴を有しない場合にも有効な方法である。例えば、この電極を燃料電池の負極に用いる場合、燃料はグルコースに限定されず、アルコールを始めとした各種の燃料を用いることができる。

Claims (20)

  1. 　正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、酵素を用いて燃料から電子を取り出すように構成され、
    　少なくとも一種の上記酵素がリポソームに封入されており、
    　上記リポソームを構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質およびステロールが結合している燃料電池。
  2. 　上記酵素および補酵素を用いて上記燃料から電子を取り出すように構成され、少なくとも一種の上記酵素および少なくとも一種の補酵素が上記リポソームに封入されている請求項１記載の燃料電池。
  3. 　上記リポソームを構成する脂質２分子膜に対する上記ステロールの重量比が１／４以上１／３以下である請求項２記載の燃料電池。
  4. 　上記抗生物質はアムホテリシンＢまたはイオノホアである請求項３記載の燃料電池。
  5. 　上記ステロールはコレステロール、エルゴステロール、コプロスタノール、シトステロールおよびスチグマステロールからなる群より選ばれた少なくとも一つである請求項４記載の燃料電池。
  6. 　上記リポソームが上記負極に固定化されている請求項５記載の燃料電池。
  7. 　上記負極に固定化された第１の物質と上記リポソームに結合した第２の物質とが互いに結合している請求項６記載の燃料電池。
  8. 　上記第１の物質と上記第２の物質との組み合わせが、アビジンとビオチン、抗原と抗体、プロテインＡと免疫グロブリンＩgＧ、プロテインＧと免疫グロブリンＩg Ｇ、糖分子とレクチン、ＤＮＡと相補鎖ＤＮＡ、グルタチオンとグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、ヘパリンとヘパリン結合性分子、ホルモンとホルモン受容体またはカルボン酸とイミドである請求項７記載の燃料電池。
  9. 　少なくとも二つの上記リポソーム間が互いに結合している請求項７記載の燃料電池。
  10. 　正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、酵素を用いて燃料から電子を取り出す燃料電池を製造する場合に、少なくとも一種の上記酵素をリポソームに封入した後、上記リポソームを構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質およびステロールを結合させる工程を有する燃料電池の製造方法。
  11. 　上記燃料電池は上記酵素および補酵素を用いて上記燃料から電子を取り出し、少なくとも一種の上記酵素および少なくとも一種の補酵素を上記リポソームに封入する請求項１０記載の燃料電池の製造方法。
  12. 　一つまたは複数の燃料電池を用い、
    　少なくとも一つの上記燃料電池が、
    　正極と負極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、酵素を用いて燃料から電子を取り出すように構成され、
    　少なくとも一種の上記酵素がリポソームに封入されており、
    　上記リポソームを構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質およびステロールが結合している燃料電池である電子機器。
  13. 　上記酵素および補酵素を用いて上記燃料から電子を取り出すように構成され、少なくとも一種の上記酵素および少なくとも一種の補酵素が上記リポソームに封入されている請求項１２記載の電子機器。
  14. 　少なくとも一種の酵素が封入されたリポソームが固定化されており、
    　上記リポソームを構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質およびステロールが結合している酵素固定化電極。
  15. 　少なくとも一種の上記酵素および少なくとも一種の補酵素が上記リポソームに封入されている請求項１４記載の酵素固定化電極。
  16. 　酵素を用い、
    　少なくとも一種の上記酵素がリポソームに封入されており、
    　上記リポソームを構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質およびステロールが結合しているバイオセンサー。
  17. 　少なくとも一種の酵素が封入されたリポソームを用い、上記リポソームを構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質およびステロールが結合しているエネルギー変換素子。
  18. 　細胞膜を構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質およびステロールが結合している細胞。
  19. 　細胞膜を構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質およびステロールが結合している細胞小器官。
  20. 　細胞膜を構成する脂質２分子膜に、グルコースの透過が可能な穴を有する抗生物質およびステロールが結合している細菌。
     
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