WO2012081657A1 - 抗原特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製方法及び抗原特異的モノクローナル抗体の製造方法 - Google Patents

抗原特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製方法及び抗原特異的モノクローナル抗体の製造方法 Download PDF

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WO2012081657A1
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antigen
cells
human animal
lymphoid tissue
antibody
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服部　雅一
浄 井上
悠子 赤澤
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学校法人北里研究所
東レ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an antigen-specific monoclonal antibody-producing hybridoma and a method for producing an antigen-specific monoclonal antibody.
  • Monoclonal antibodies specifically recognize antigens. Due to its characteristics, monoclonal antibodies are used not only for research and diagnostics but also as pharmaceuticals. Antibodies are classified into several classes (isotypes) depending on the structure of the constant region. In mammals, there are five classes of immunoglobulins (antibodies): IgG, IgA, IgM, IgD, and IgE.
  • Japan's antibody drug market is steadily increasing as the overall growth of the drug market is slowing down, and it is estimated that the market scale from approximately 80 billion yen in 2007 will exceed 170 billion yen in 10 years Furthermore, it is predicted that it will grow to 700 to 800 billion yen in 17 years, seven years later, and will occupy 10% of the prescription drug market estimated to be 7 trillion to 8 trillion yen.
  • the antibody drugs currently on the market include Rituxan (registered trademark), Herceptin (registered trademark), Avastin (registered trademark) for cancer treatment, Remicade (registered trademark) for rheumatoid arthritis, and Humira ( Registered trademark) (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • ADCC activity is an activity in which leukocytes such as natural killer cells, monocytes and neutrophils kill target cells such as cancer cells via antibodies, and CDC activity kills target cells via complements. Active.
  • the class of antibody drugs marketed so far is all IgG.
  • IgG has high ADCC activity, and it can be said that an IgG class antibody is suitable for an antibody drug particularly targeting cancer (Non-patent Document 2).
  • IgG class antibodies do not have ADCC activity via neutrophils.
  • IgA class antibodies were found to have neutrophil-mediated ADCC activity.
  • IgG class antibodies have monocyte-mediated ADCC activity, whereas IgA class antibodies do not have monocyte-mediated ADCC activity.
  • the proportion of neutrophils in human blood is 50-60%, the proportion of monocytes is 5%, and furthermore, neutrophils in blood can be increased by administration of G-CSF. Since the combined effect of G-CSF and an IgA class antibody can be expected, the IgA class antibody is considered to be a drug having characteristics not found in IgG class antibodies.
  • IgA is produced in exocrine tissues such as the intestinal tract, airway epithelium, lactating mammary gland, and salivary gland.
  • IgA functions as a defense mechanism against various pathogens by preventing bacteria and toxins from binding to epithelial cells and adsorbing foreign substances.
  • Newborns are particularly susceptible to infection because they are exposed to pathogens that they have never been exposed to immediately after birth. Therefore, IgA antibodies secreted from breast milk are carried to the intestinal tract of the newborn baby until they can make antibodies themselves, and are protected from bacteria and the like by IgA from the mother. This shows that IgA acts orally. Therefore, IgA can be expected as an orally available antibody drug for preventing infection.
  • Non-Patent Document 4 As methods for obtaining IgA monoclonal antibody-producing hybridomas, Peyer's patches, pulmonary lymphocytes, submandibular glands or nasal mucosa-associated lymphoid tissues (NALT) containing IgA-producing B cells are obtained from a plurality of antigen-immunized mice. A method using cells recovered from tissue) has been reported (Non-Patent Document 4).
  • a method for producing an antigen-specific monoclonal antibody-producing hybridoma characterized in that an artificial lymph node is formed in a non-human animal immunized with an antigen, the artificial lymph node is removed and transplanted to an immunodeficient non-human animal.
  • this method has room for improvement in that it takes time to construct an artificial lymph node, and a method for selectively and efficiently obtaining a hybridoma that produces IgA is not disclosed (Patent Literature). 1).
  • IgA is not easily induced by ordinary immunization methods and there are few IgA-producing B cells, it is very difficult to obtain IgA monoclonal antibody-producing hybridomas compared to IgG monoclonal antibody-producing hybridomas.
  • IgA monoclonal antibody hybridomas In order to obtain IgA monoclonal antibody hybridomas, conventional methods for producing hybridomas using cells such as Peyer's patches, pulmonary lymphocytes, submandibular gland, or nasal mucosa-associated lymphoid tissue, which have relatively high IgA production, Since the number of cells obtained from the tissue is small and the number of cells finally required for hybridoma production is recovered using several mice, the possibility of obtaining an IgA monoclonal antibody hybridoma is low or not necessarily obtained, It can be said that efficiency is bad. In addition, there is a problem that only antigenic pathogens that can be used as antigens in this method are limited.
  • An object of the present invention is to provide a method for selectively and efficiently producing an antigen-specific monoclonal antibody-producing hybridoma and a method for efficiently producing an antigen-specific monoclonal antibody.
  • the present inventors transplanted secondary lymphoid tissue or cells thereof derived from an antigen-immunized non-human animal into an immunodeficient non-human animal, and the animal was treated with the antigen.
  • the inventors have found that antigen-specific monoclonal antibodies can be selectively and strongly induced by boosting (boost), and have completed the present invention, and include the following.
  • a non-human animal immunization step for immunizing a non-immune deficient non-human animal by administering an antigen
  • the secondary lymphoid tissue collected from the non-human animal immunized in the step (a) in the transplantation step (step (b)) is transplanted into the immunodeficient non-human animal.
  • the secondary lymphoid tissue or secondary lymphoid tissue cell transplanted into an immunodeficient non-human animal is also preferably a mucosa-associated lymphoid tissue or a mucosa-associated lymphoid tissue cell, respectively.
  • this method can be a method for producing an antigen-specific IgA antibody-producing hybridoma.
  • the secondary lymphoid tissue or secondary lymphoid tissue cell transplanted into the immunodeficient non-human animal is a spleen or a spleen cell, respectively.
  • the secondary lymphoid tissue or secondary lymphoid tissue cell transplanted into an immunodeficient non-human animal is preferably a lymph node or a lymph node cell, respectively.
  • the animal used in this method may be a rodent.
  • [2] A method for producing an antigen-specific monoclonal antibody, comprising producing an antigen-specific antibody-producing hybridoma using the method of [1] above and collecting an antigen-specific monoclonal antibody from the culture supernatant.
  • suitable antigens include viral proteins, such as hepatitis C virus E2 protein or influenza virus hemagglutinin protein.
  • the production efficiency of an antigen-specific monoclonal antibody-producing hybridoma can be significantly improved.
  • the amount of antigen-specific antibody in blood in SCID mice transfected or transplanted with lymphoid tissue cells derived from BALB / c mice immunized with hepatitis C virus TH strain envelope protein E2 (TH strain E2 protein) as an antigen It is a figure which shows a measurement result. It is a figure which shows the measurement of the OVA specific antibody titer in the blood of the SCID mouse
  • NALT nasal mucosa lymph tissue
  • Lymphoid tissue is classified into primary lymphoid tissue and secondary lymphoid tissue.
  • Primary lymphoid tissue is the place for lymphocyte production and includes the bone marrow and thymus.
  • Secondary lymphoid tissue is where adaptive immunity is initiated and includes spleen, lymph nodes and mucosa-associated lymphoid tissue.
  • lymphocytes are divided into a T cell region and a B cell region.
  • the B cell region is also called a follicle, and antigen-stimulated B cells migrate to the follicle where they proliferate and form a germinal center at the center of the follicle.
  • the spleen is composed of white pulp and red pulp, and the white pulp is a lymph sheath having a T cell region and a B cell region around an arterial branch, and has a structure very similar to that of a lymph node.
  • the ratio of IgA out of all antibodies is only about 20%, but it is known that the ratio of IgA to the total antibody content is as high as 80% in the mucosa-associated lymphoid tissue.
  • the mucosa-associated lymphoid tissue is a lymphoid tissue mass that does not have a membrane, and is found in the lamina intestinal and submucosa of the digestive tract, respiratory tract, urogenital organs.
  • the present invention is a two-step process in which an animal is immunized with a target antigen, then the secondary lymphoid tissue of the immunized animal or its cells (secondary lymphoid tissue cells) are transplanted into an immunodeficient animal and immunized by antigen administration.
  • a method for producing an antigen-specific monoclonal antibody-producing hybridoma using the immunization step is provided.
  • the present invention relates to a non-human animal immunization step (step (a)) in which an antigen is administered to a non-immune deficient non-human animal for immunization.
  • a non-human animal is immunized with an antigen (target antigen) that is a target of an antibody produced by a hybridoma.
  • the antigen used here may be any immunogenic substance, and may be a polypeptide or peptide including protein, protein fragment, fusion protein and the like.
  • a substance having relatively low immunogenicity may be used as an antigen.
  • useful antigens include, but are not limited to, viral proteins (structural proteins or nonstructural proteins).
  • the viral protein may be derived from a virus hosted on a human or non-human mammal, but may be derived from a virus hosted on another biological species.
  • a virus envelope protein or spike protein is particularly preferable.
  • antigens used in the present invention include hepatitis C virus (HCV) proteins such as structural proteins Core, E1, E2, and p7, and nonstructural proteins NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A. And NS5B.
  • HCV hepatitis C virus
  • the hepatitis C virus from which the antigen used herein can be a genotype 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 3a, 3b, 4, 5a, or 6a virus strain.
  • the hepatitis C virus from which the antigen used in the present invention is derived is not limited, and may be strains such as HCV-TH, JFH-1, JCH-1, J6CF, and H77.
  • antigens include influenza virus proteins such as hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), RNA polymerase ⁇ subunit (PA), RNA polymerase ⁇ 1 subunit (PB1), RNA polymerase ⁇ 2 subunit (PB2). ), Matrix proteins M1 and M2, nucleoprotein NP, and nonstructural proteins NS1 and NS2, but the envelope proteins hemagglutinin or neuraminidase are particularly preferred.
  • Hemagglutinin can use any subtype (typically H1 to H16), and subtype H1 is a preferred example.
  • Neuraminidase can be of any subtype (typically N1 to N9), but subtype N1 is a preferred example.
  • influenza virus from which the antigen used in the present invention is derived may be type A or type B influenza virus, for example, H1N1 (A USSR type), H3N2, H1N2, and H2N2 (A Hong Kong type), H9N1, and There may be various subtypes such as H5N1.
  • H1”, “H3” and the like represent hemagglutinin subtypes
  • N1”, “N2” and the like represent neuraminidase subtypes.
  • the influenza virus from which the antigen used in the present invention is derived may be any biological species as a host, and is not limited to, for example, human influenza virus, avian influenza virus, swine influenza virus, or the like.
  • the non-human animal to which the antigen is administered in the non-human animal immunization step (step (a)) is a non-immune-deficient non-human animal (hereinafter, abbreviated as “non-human animal”), that is, includes an antibody producing ability. It is a non-human animal having immunity and possessing T cells and B cells. This non-human animal is preferably a normal non-human animal. Non-human animals may be, but are not limited to, mammals, rodents, birds and the like. The non-human animal may be, for example, a domestic animal such as a monkey, dog, guinea pig, mouse, rat sheep, goat, or chicken, a pet animal or a laboratory animal.
  • non-human animals are rodents, and examples include mice and rats, and more preferred are mice.
  • the non-human animal may be of any strain or type, and includes genetically engineered non-human animals such as humanized animals and human antibody-producing animals. If a human antibody-producing animal is used as the non-human animal, human antibodies can be obtained.
  • any method capable of inducing humoral immunity against a target antigen can be used.
  • an antigen is administered to immunize a non-human animal.
  • the antigen may be administered alone or with an adjuvant, carrier or diluent.
  • an adjuvant any adjuvant such as complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, or aluminum hydroxide can be used.
  • Antigen administration routes include parenteral routes such as intraperitoneal administration, intravenous administration, subcutaneous administration, intradermal administration, nasal administration (such as nasal administration), pulmonary administration, and rectal administration. Any route may be mentioned. It is preferable to use a route of administration capable of causing induction of antibodies of the desired isotype.
  • immune pathways that induce the induction of IgA class antibodies can be selected, and examples include transmucosal administration including nasal administration.
  • the number of times of immunization (antigen administration) to a non-human animal may be single time or multiple times (for example, 2, 3, 4, or 5 times or more), but it is more preferable to perform multiple times. In the case of multiple immunizations, it is preferable to repeat administration once every 1-6 weeks.
  • the administration route may be the same, or two or more administration routes may be combined.
  • the non-human animal immunized with the antigen may be a disease model animal such as an allergy model animal.
  • a non-human animal immunized with an antigen is transplanted with a stromal cell (cytokine-producing stromal cell or the like) and / or a dendritic cell or a polymer biomaterial containing them to form an artificial lymph node ( Patent Document 1) is not included.
  • the term “artificial lymph node” refers to a lymph node (ectopic lymph node) that is acquired in a different site from a lymph node inherent in a non-human animal by artificial manipulation.
  • Artificial lymph nodes can include polymeric biomaterials, exogenous stromal cells and / or immunocompetent cells (such as dendritic cells activated by cytokines and the like).
  • a secondary lymphoid tissue or a cell thereof is collected and transplanted to an immunodeficient non-human animal.
  • the secondary lymph tissue is, but not limited to, spleen, lymph node, or mucosa-related lymph tissue.
  • the lymph node may be any lymph node, such as a primary lymph node, a secondary lymph node, or a tertiary lymph node, such as the front neck, upper arm, armpit, buttocks, and popliteal lymph node.
  • “secondary lymphoid tissue” means a natural (natural) secondary lymphoid tissue, and thus does not include an artificial lymph node.
  • mucosa-associated lymphoid tissue examples include nasal-associated lymphoid tissue (NALT), bronchial-associated lymphoid tissue (BALT), pharyngeal mucosal lymph tissue, upper respiratory tract mucosal lymph tissue (tonsil) Intestinal mucosal tissue (GLT; Gut-associated lymphoid tissue), appendiceal mucosal tissue, Peyer's patch, mesenteric lymph node, mediastinal lymph node, and the like.
  • the secondary lymphoid tissue is collected from the whole organ / organ such as pancreas and lymph node, or is collected as a tissue piece retaining the tissue structure and transplanted to an immunodeficient non-human animal. Can do.
  • the secondary lymphoid tissue cell refers to a lymphoid cell population constituting the secondary lymphoid tissue.
  • the cell population contained in the secondary lymphoid tissue is prepared as a cell suspension suspended in PBS or the like. Can do.
  • the secondary lymphoid tissue piece to be transplanted contains at least part of the germinal center.
  • the secondary lymphoid tissue piece or secondary lymphoid tissue cell used for transplantation preferably also contains lymphoid cells such as antibody-producing cells, dendritic cells, B cells and T cells.
  • Secondary lymphoid tissue cells may be a mixture of cells from multiple sites of secondary lymphoid tissue.
  • an immunodeficient non-human animal transplanted with a secondary lymphoid tissue or a secondary lymphoid tissue cell collected from an antigen-immunized non-human animal may be innate or acquired.
  • the immunodeficient non-human animal preferably has at least humoral immunity deficiency or markedly reduced function (more preferably deficiency), and both humoral immunity and cellular immunity are deficient or significantly functional. It is still more preferable that it is reduced (more preferably deficient).
  • the immunodeficient non-human animal preferably has at least one of T cells and B cells deficient or reduced, and more preferably exhibits a combined immunodeficiency in which both T cells and B cells are deficient or reduced.
  • the immunodeficient non-human animal may be, but is not limited to, mammals, rodents, birds and the like.
  • the immunodeficient non-human animal may be, for example, livestock animals such as monkeys, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats or chickens, pets or experimental animals.
  • the immunodeficient non-human animal may be a rodent such as a mouse or a rat, but is more preferably a mouse.
  • the immunodeficient non-human animal may be of any strain and type, and includes genetically engineered non-human animals such as humanized animals and human antibody-producing animals.
  • the immunodeficient non-human animal transplanted with the secondary lymphoid tissue or secondary lymphoid tissue cells is the same species as the non-human animal from which the secondary lymphoid tissue or secondary lymphoid tissue cells were collected.
  • a severe combined immunodeficient mouse (Severe Combined Immunodeficient mouse; SCID mouse) may be used.
  • SCID mouse severe combined Immunodeficient mouse
  • specific examples thereof include nude mice, Rag1 knockout mice, Rag2 knockout mice, etc., as well as SCID mice such as CB.17-SCID, NOD SCID, NOG SCID.
  • immunodeficient rats specific examples thereof include X-SCID rats (Mashimo et al., PLoS ONE 5: e8870 (2010)).
  • Transplantation of secondary lymphoid tissue or secondary lymphoid tissue cells into an immunodeficient non-human animal can be performed by a conventional method.
  • “transplantation” means introducing an entire tissue (organ, organ, etc.), a tissue fragment thereof, or cells into the body of an immunodeficient non-human animal.
  • Cell transplantation is sometimes referred to as “transfer”.
  • the site where the secondary lymphoid tissue or secondary lymphoid tissue cells are transplanted may be any place suitable for tissue engraftment, but preferred examples include transplantation under the renal capsule and subcutaneous implantation. It is more preferable to transplant under the renal capsule. Specifically, transplantation under the renal capsule can be performed by inserting a tissue or a piece of tissue between the renal capsule and the kidney.
  • the number of tissue pieces to be transplanted is not limited, but it is also preferable to transplant 2 or more, for example, 3 or 4 or 5 or more.
  • Transplantation (transfer) of secondary lymphoid tissue cells may be performed by a parenteral route, and examples include intraperitoneal administration and intravenous administration, and intraperitoneal administration is more preferable.
  • the number of cells to be transferred can be appropriately determined by those skilled in the art, but is preferably 1 ⁇ 10 6 or more, for example, 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 8 .
  • An immunodeficient non-human animal transplanted with secondary lymphoid tissue or secondary lymphoid tissue cells is also referred to as a reconstituted animal.
  • the antigen-specific IgA monoclonal antibody-producing hybridoma can also be produced by the method of the present invention.
  • mucosa-associated lymphoid tissue or mucosa-associated lymphoid tissue cells as a secondary lymphoid tissue or secondary lymphoid tissue cell into an immunodeficient non-human animal.
  • the mucosa-associated lymphoid tissue may be any mucosa-associated lymphoid tissue such as the specific examples described above, but preferred examples include nasal-associated mucosal lymphoid tissue (NALT; Nasal-associated lymphoid tissue) and mediastinal lymph nodes. It is done.
  • a secondary lymphoid tissue eg, mucosa-associated lymphoid tissue
  • Secondary lymphoid tissue for example, mucosa-associated lymphoid tissue
  • Similar immunodeficient non-human animals can also be produced by transplanting cells into immunodeficient non-human animals.
  • a similar immunodeficient non-human animal can also be produced by transplanting a mucosa-associated lymphoid tissue or cells thereof extracted from a cancer-bearing model animal into which cancer cells have been transferred to the non-human animal to the immunodeficient non-human animal. it can.
  • the efficiency of formation of a target antigen-specific monoclonal antibody-producing hybridoma can be remarkably increased by transplanting a secondary lymphoid tissue into an immunodeficient non-human animal. Therefore, in the method of the present invention for transplanting secondary lymphoid tissue, the target hybridoma can be produced with high efficiency.
  • immunodeficient non-human animal After transplanting secondary lymphoid tissue or secondary lymphoid tissue cells into an immunodeficient non-human animal, the immunodeficient non-human animal is further immunized with the target antigen used for immunization of the non-human animal.
  • “immunity” of an immunodeficient non-human animal in the present invention means that an antibody specific for a target antigen is produced in the body of the immunodeficient non-human animal, and the lymph system of the immunodeficient non-human animal itself. It is not limited to antibody production by cells, but rather intends production of antigen-specific antibodies by lymphoid cells transplanted into immunodeficient non-human animals.
  • the immunization of this immunodeficient non-human animal resulting in the production of antigen-specific antibodies by the transplanted lymphoid cells represents a boost (boost) to the transplanted antigen-sensitized lymphoid cells.
  • Immunization of an immunodeficient non-human animal with a target antigen can be performed by one or more administrations of the target antigen. More preferably, this administration of the target antigen is performed twice or more than three times. The interval between administrations of the target antigen is preferably about 7-14 days.
  • the administration route of the antigen is not particularly limited as long as it is used for boosting (boost), and examples thereof include intraperitoneal administration, intravenous administration, subcutaneous administration, and intradermal administration. In the case of mice, the dose of antigen is 1 ⁇ g-1000 ⁇ g, preferably 5 ⁇ g-200 ⁇ g.
  • the antibody titer in the blood against the target antigen is increased by administration of the target antigen (boost immunization).
  • Spleen cells or lymph node cells are obtained from the immunodeficient non-human animal after the booster immunization (eg, 3-10 days after administration).
  • This spleen cell or lymph node cell can be obtained by removing the spleen or lymph node from an immunodeficient non-human animal and collecting the cell therefrom. If the collected spleen cells or lymph node cells are fused with immortalized cells such as myeloma cells of the same or different species, hybridoma cells having autonomous proliferation ability can be prepared.
  • Cell fusion between spleen cells or lymph node cells and immortalized cells such as myeloma cells can be performed by a known method (Kehler et al., Nature (1975) vol. 256, p.495-497). For example, after washing both cells, spleen cells or lymph node cells are mixed in a ratio of 1-10 to immortalized cells 1 such as myeloma cells, and a polyethylene glycol or poly (ethylene glycol) having an average molecular weight of 1000-6000 is used as a fusion accelerator Cell fusion can be induced by adding vinyl alcohol and applying electrical stimulation (for example, electroporation) using a cell fusion device or the like.
  • electrical stimulation for example, electroporation
  • myeloma cells that can be used for cell fusion include, for example, mouse-derived cell lines P3-X63Ag8-U1 (P3-U1), SP2 / 0-Ag14 (SP2 / 0), P3-X63-Ag8653 (653), P3-X63-Ag8 (X63), P3 / NS1 / 1-Ag4-1 (NS1), and rat-derived cell lines YB2 / O, Y3-Ag1.2.3, and the like. It is done. These cell lines are available from RIKEN BioResource Center, ATCC (American Type Collection Culture) or ECACC (European Collection of Cell Cultures).
  • the hybridoma formed by cell fusion can be selected by culturing in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution.
  • a normal selective culture solution for example, a HAT culture solution.
  • the culture with the HAT culture solution may be performed for a sufficient time (several days to several weeks) for the non-fused cells to die.
  • the obtained hybridoma clone group contains a hybridoma producing a target antigen-specific monoclonal antibody very frequently. Therefore, a hybridoma producing a target antigen-specific monoclonal antibody can be screened with high efficiency from the group of hybridoma clones formed by the method of the present invention.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be screened by a known method such as ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), Western blot, flow cytometry.
  • a method of detecting a monoclonal antibody bound to a microplate by adding a hybridoma culture supernatant to a microplate adsorbed with a target antigen and further adding an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme, or Examples include a method in which a hybridoma culture supernatant is added to a microplate to which an anti-immunoglobulin antibody is adsorbed, a protein labeled with a radioactive substance or an enzyme is added, and a monoclonal antibody bound to the microplate is detected.
  • an IgA-recognizing antibody may be used as an antibody of a specific isotype.
  • a large amount of target antigen-specific monoclonal antibodies can be prepared by culturing cells of the target antigen-specific monoclonal antibody-producing hybridoma thus obtained.
  • the monoclonal antibody can be prepared from the culture supernatant obtained by acclimating the hybridoma cells obtained by the above screening in a serum-free medium, for example, Hybridoma-SFM (Invitrogen) and culturing in the serum-free medium.
  • a serum-free medium for example, Hybridoma-SFM (Invitrogen) and culturing in the serum-free medium.
  • a flask, a petri dish, a spinner culture bottle, a roller bottle, or a high-density culture flask CELLine Becton Dickinson
  • pristane 2,6,10,14-tetramethylpentadecane
  • SCID mouse a nude mouse or SCID mouse
  • the target antigen-specific monoclonal antibody was prepared from the ascites obtained by administering 5 ⁇ 10 6 to 2 ⁇ 10 7 cells / mouse of hybridoma cells intraperitoneally and then rearing for 10-21 days. You can also
  • RNA is prepared from spleen cells or lymph node cells of non-human animals immunized with the target antigen, a cDNA library of antibody genes is prepared, and the cDNA is expressed in Escherichia coli or animal cells, etc.
  • the target monoclonal antibody for example, IgA monoclonal antibody
  • the present invention also provides a method for producing a target antigen-specific monoclonal antibody, comprising culturing the target antigen-specific monoclonal antibody-producing hybridoma produced as described above.
  • a non-human animal is immunized with a target antigen, a mucosa-associated lymphoid tissue is removed from the animal, and the mucosa-associated lymphoid tissue or cells thereof (mucosal-associated lymphoid tissue cells) are immunodeficient non-human animal.
  • a target antigen-specific antibody-producing hybridoma is produced by fusing it with immortalized cells such as myeloma cells, and the antibody-producing hybridoma is cultured to produce a target antigen-specific IgA monoclonal antibody.
  • a method for producing a target antigen-specific IgA monoclonal antibody by isolating the antigen-specific IgA monoclonal antibody is also provided.
  • Example 1 Transplantation of antigen-immunized BALB / c mouse-derived lymph nodes or lymph node cells and spleen or spleen cells into SCID mice
  • BALB / c normal mouse
  • SCID mouse severe combined immunodeficient mouse
  • CB-17 / Icr-scid / scidJcl purchased from CLEA Japan
  • HCV hepatitis C virus
  • TH strain E2 protein The replacement HCV envelope protein E2 (hereinafter also referred to as TH strain E2 protein) was isolated and purified.
  • 1 ⁇ 10 7 cells per mouse were suspended in 200 ⁇ L of PBS (phosphate buffered saline) and administered intravenously to 8-week-old female SCID mice. Node cells were transferred (transplanted).
  • PBS phosphate buffered saline
  • a part is used for transplantation, the cells are isolated from the part, and 1 ⁇ 10 7 cells per mouse are suspended in 200 ⁇ L of PBS (phosphate buffered saline), which is stored for 8 weeks.
  • Spleen cells were transferred to mice by intravenous administration to aged female SCID mice.
  • first booster 2, 16, and 30 days after tissue transplantation or cell transfer
  • second booster 2, 16, and 30 days after tissue transplantation or cell transfer
  • third booster the TH strain E2 protein solution prepared above was used with an antigen amount of 10 ⁇ g / head.
  • mice were administered into the abdominal cavity of each of the above SCID mice, and blood was collected using a heparinized capillary (Terumo) 4 days after each booster immunization.
  • the antigen specific antibody in the blood was quantified by ELISA (FIG. 1A).
  • ELISA a recombinant TH strain E2 protein to which a tag different from that of the antigen used for immunization is added is immobilized on an immunoplate, and this is used to specifically target an antigen (TH strain envelope protein E2) in a blood sample.
  • the amount of antibody was measured.
  • the vertical axis shows the absorbance at 450 nm. Circles indicate individual values, and bars indicate average values. In FIG.
  • LN is an experimental group transplanted with a lymph node derived from a BALB / c mouse immunized with a target antigen
  • Splen is an experimental group transplanted with a spleen derived from a BALB / c mouse immunized with a target antigen.
  • LN cell is an experimental group in which lymph node cells derived from BALB / c mice immunized with the target antigen are transferred (intravenous administration)
  • Splen cell is transferred from spleen cells derived from BALB / c mice immunized with the target antigen. This is an experimental group (intravenous administration).
  • “1st”, “2nd”, and “3rd” indicate blood samples collected after the first to third boosts in SCID mice, respectively.
  • the tagged protein One-StrEP-tag-THE2 containing TH strain E2 protein was used for the preparation of the antigen solution.
  • Example 2 Transplantation of antigen-immunized BALB / c mouse-derived lymphoid tissue (lymph node or spleen) into SCID mice
  • lymphoid tissue lymph node or spleen
  • transplantation into the SCID mice under the renal capsule induced the production of antigen-specific antibodies against the antigen TH strain E2 protein.
  • lymph nodes front neck, upper arm, axilla, 2 weeks after the second immunization from BALB / c mice immunized with an antigen solution containing TH strain E2 protein in the same manner as in Example 1 were used. The spleen was collected and placed in ice-cold PBS.
  • BALB / c mice that were combined with the antigen-immunized group and the age of the untreated mice were used, and lymph nodes (front neck, upper arm, armpit, buttocks) and spleen were collected and placed in ice-cold PBS.
  • Example 1 A total of 4 pieces of tissue (either lymph node or spleen) were transplanted, 2 per single kidney. 2, 16, and 30 days after tissue transplantation, the TH strain E2 protein solution prepared in Example 1 was administered into the abdominal cavity of the SCID mouse at an antigen amount of 10 ⁇ g / head, and 4 days after each additional immunization. Blood was collected later.
  • antigen-specific antibodies in blood were quantified by ELISA in the same manner as in Example 1 (FIG. 1B).
  • Recombinant envelope protein E2 to which a tag different from that of the antigen used for immunization was added was immobilized on an immunoplate, and the amount of antigen (TH strain envelope protein E2) -binding antibody in the blood sample was measured using this.
  • the vertical axis shows the absorbance at 450 nm. Circles indicate individual values, and bars indicate average values. In FIG.
  • untreated LN is a control group transplanted with lymph nodes derived from naive BALB / c mice
  • untreated Spleen is a control group transplanted with spleens derived from naive BALB / c mice.
  • Pre immunity LN is an experimental group transplanted with lymph nodes derived from BALB / c mice immunized with the target antigen in Example 2
  • pre immunity Spleen is BALB / c mice immunized with the target antigen in Example 2 It is the experimental group which transplanted the spleen of origin.
  • “1st”, “2nd”, and “3rd” indicate blood samples collected after the first to third boosts in SCID mice, respectively.
  • the tagged protein One-StrEP-tag-THE2 containing TH strain E2 protein was used for the preparation of the antigen solution.
  • Example 3 Transplantation of antigen-immunomucosal lymphoid tissue into SCID mice (1) Preparation of OVA (ovalbumin) -induced allergy model mice OVA solution (SIGMA) and ImageAlum (PIERCE) are mixed in equal amounts and prepared. The obtained solution was intraperitoneally administered twice a week to female BALB / c mice (Japan Clare) aged 8 weeks in an amount of 10 ⁇ g / head. Subsequently, the mouse was administered nasally with an OVA solution in an amount of 100 ⁇ g / head for 3 consecutive days. Thus, an OVA (ovalbumin) -induced allergy model mouse was produced.
  • OVA solution SIGMA
  • ImageAlum PIERCE
  • NALT Nasal-associated lymphoid tissue
  • the renal capsule was broken about 2-3 mm using microtweezers, and the piece of lymph tissue (nasal mucosa lymph tissue) collected above was inserted between the kidney capsule and the kidney.
  • the kidney was returned to the body and the muscle layer and skin were sutured.
  • a total of 4 pieces of lymph tissue (nasal mucosa lymph tissue) were transplanted, 2 per single kidney.
  • the OVA specific antibody titer in blood was measured according to isotype by ELISA.
  • the antibody titer for each isotype was measured by ELISA using OVA as a solid phase.
  • 5 ⁇ g / well of OVA was added to an immunoplate (Nunc) and allowed to stand overnight at 4 ° C. for immobilization. After blocking with Blocking One (Nacalai Tesque), a serum dilution was added to each well and allowed to react at room temperature for 1-2 hours.
  • an HRP-labeled anti-mouse antibody (anti-IgG1, anti-IgG2a, anti-IgA, anti-total IgG) was added and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • TMB substrate (3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine) was added, and when the color development became appropriate, 2N sulfuric acid was added to stop the reaction, Absorbance at 450 nm was measured.
  • FIG. 2 shows the measurement results regarding blood samples collected after boosting 16 days after tissue transplantation. While no increase in the antigen-specific antibody titers of IgG2a, IgG2b and IgM types was observed, the induction of antigen-specific antibodies was confirmed in the IgA type.
  • the black circles in FIG. 2 show the measured values of SCID mice transplanted with NALT, and the white circles show the measured values of SCID mice transplanted with non-immunized BALB / c mouse-derived axillary lymph nodes.
  • 2A shows IgG1
  • FIG. 2B shows IgG2a
  • FIG. 2C shows IgM
  • FIG. 2D shows IgA results.
  • the vertical axis represents absorbance (450 nm), and the horizontal axis represents serum dilution.
  • the serum was evaluated according to the protocol of the kit. Absorbance measurement was performed for each isotype in serum using secondary antibodies against IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, and IgA, and the total value of the obtained absorbances was defined as 100, and the ratio ( %) was calculated (FIG. 3).
  • the serum IgA antibody ratio was 3 in comparison with the control mouse (A in the figure) to which normal immunization was performed. It was shown to be more than twice as high (FIG. 3).
  • a in the figure shows the result of a blood sample (control group) collected after the OVA antigen was administered four times to BALB / c mice together with Alum adjuvant (primary immunization + 3 additional immunizations) (normal immunization).
  • B in the figure is a blood sample (experimental group) from a SCID mouse transplanted with NALT derived from an OVA immune allergy model mouse and boosted.
  • IgA can be selectively and strongly induced by the method of the present invention by transplanting antigen-immunized NALT (nasal mucosal lymphoid tissue) into SCID mice.
  • Example 4 Preparation of hybridoma from lymphocytes derived from NALT-transplanted SCID mice Spleen cells prepared from the spleen of SCID mice transplanted with NALT derived from OVA-induced allergic model mice and mouse myeloma cell line SP2 / 0 were prepared by a conventional method. The fused cell suspension was seeded at 100 ⁇ L / well in each well of a 96-well plate and cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
  • Example 5 Analysis of cells in peripheral lymphoid tissue of SCID mouse transplanted with antigen-immune lymphoid tissue
  • Antigen-immunized BALB / c mouse-derived lymphoid tissue (lymphoid) prepared in the same manner as in Example 2 using NP-OVA as an antigen
  • the attributes of cells present in lymphoid tissues (lymph nodes or spleen) in SCID mice transplanted with (node) were analyzed using flow cytometry.
  • Antigen-immune lymph node transplanted SCID mice were boosted 3 times with antigen in the same manner as in Example 2. Lymph nodes (upper arm, axilla) and spleen were removed from SCID mice after the third boost.
  • Cells (lymph node cells, splenocytes) were isolated from the lymph nodes and spleen, and after removing erythrocytes by treatment with tris-ammonium chloride isotonic buffer (ACT solution), Fc blocking solution (anti-CD16 antibody and Anti-CD32 antibody; Mouse BD Fc Block TM, BD Pharmingen)) and incubated at 4 ° C for 20 minutes.
  • ACT solution tris-ammonium chloride isotonic buffer
  • Fc blocking solution anti-CD16 antibody and Anti-CD32 antibody
  • Mouse BD Fc Block TM Mouse BD Fc Block TM, BD Pharmingen
  • the CD4 + , CD62L low and CD44 high fraction cells were 30.75% in the spleen and 17.24% in the lymph nodes. Met.
  • Example 6 Preparation of hybridoma from splenocytes derived from SCID mice transplanted with antigen-immune lymph nodes Mouse myeloma (myeloma) cell line SP2 / 0 was washed twice with RPMI 1640 medium without serum.
  • spleen cells were collected and prepared from SCID mice transplanted with lymph nodes of BALB / c mice immunized with the antigen TH strain E2 protein prepared in Example 2, and washed 3 times with RPMI 1640 medium without serum. .
  • the cells in the diluted solution were collected by centrifugation at 1200 rpm for 3 minutes, and RPMI 1640 medium (containing 15% FBS, 10% BM Condimed H1 (Roche)) so that the number of splenocytes was 1 ⁇ 10 7 cells / mL. It was suspended in. This cell suspension was seeded in each well of a 96-well plate at 100 ⁇ L / well and cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. On the next day, 100 ⁇ L of RPMI 1640 containing 2 times concentration of HAT (Invitrogen) was added to each well, followed by incubation in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. After culturing for 5-10 days, the culture supernatant of each well was collected.
  • RPMI 1640 medium containing 15% FBS, 10% BM Condimed H1 (Roche)
  • an antigen TH strain E2 protein
  • ELISA ELISA as follows. First, 50 ng / well of the antigen was added to an immunoplate (Nunc) and allowed to stand at 4 ° C. overnight to immobilize. After blocking with Blocking One (Nacalai Tesque), the hybridoma culture supernatant was added to each well and allowed to react at room temperature for 1-2 hours. After washing with 0.05% Tween20 / PBS, an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • an antigen TH strain E2 protein
  • TMB substrate (3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine) was added, and when the color development became appropriate, 2N sulfuric acid was added to stop the reaction, Absorbance at 450 nm was measured. The result is shown in FIG.
  • FIG. 5A shows the absorbance measurement value of each clone by the ELISA method. This result showed that a hybridoma producing a monoclonal antibody against a target antigen can be produced very efficiently by the method of the present invention.
  • FIG. 5A shows the detection results for a hybridoma prepared from splenocytes derived from the spleen of SCID mice transplanted with lymph nodes of BALB / c mice immunized with hepatitis C virus envelope protein (TH strain E2 protein) as an antigen.
  • FIG. 5B shows the detection results for hybridomas prepared from splenocytes derived from the spleen of BALB / c mice immunized by the usual immunization method.
  • the positive reaction was determined to have an absorbance of 0.3 or higher, and 0.5 or higher was determined to be a stronger positive reaction.
  • the frame of positive reaction clones is shown with a shadow.
  • Example 7 Evaluation of inhibition of HCV infection by hybridoma culture supernatant containing monoclonal antibody against antigen TH strain E2 protein Produced by hybridoma prepared from spleen cells derived from antigen-immune lymphoid tissue transplanted SCID mice prepared in the same manner as in Example 6 The obtained antigen-specific monoclonal antibody was evaluated whether it had an activity to inhibit cell infection of HCV particles having the antigen TH strain E2 protein on its surface.
  • HCVpp infectious HCV-like particles
  • HCVpp infectious HCV-like particles
  • HCVpp infectious HCV-like particles
  • three types of vectors a vector that expresses the retroviral fusion protein Gag-pol, a vector that expresses the HCV envelope protein, and a retroviral packaging vector that expresses the reporter gene, are co-expressed in an animal cell, thereby producing a reporter.
  • Pseudovirus particles that have the gene packaged and express the HCV envelope protein on the surface of the virus can be made.
  • HCVpp having an envelope protein of genotype 1b
  • a recombinant plasmid pcDNA THdC-E2 was used as an HCV structural protein expression vector.
  • This recombinant plasmid is derived from the N-terminus of the polyprotein (Wakita, T. et al., J. Biol. Chem., 269, p.14205-14210 (1994)), a HCV strain of genotype 1b.
  • This is an expression vector obtained by cloning a nucleic acid encoding from amino acid residue No. 132 to amino acid residue No. 747 (part of core, E1, E2 protein) into pcDNA3.1.
  • Gag-pol expression vector an expression vector Gag-Pol 5349 in which a gene encoding murine leukemia virus (MLV) gag and pol was cloned was used.
  • a reporter gene expression vector a retrovirus packaging vector Luc126 in which a luciferase gene was cloned was used.
  • HEK293T cells were subcultured in 10% FCS-DMEM medium (hereinafter referred to as DMEM-10F).
  • HEK293T cells were seeded in a collagen-coated 10 cm dish (IWAKI) at 2.5 ⁇ 10 6 cells / dish and cultured overnight.
  • IWAKI collagen-coated 10 cm dish
  • Opti-MEM Opti-MEM
  • Lipofectamine 2000 Dibco
  • pcDNA THdC-E2 Gag-Pol 5349 and Luc126 were mixed and incubated at room temperature for 20 minutes.
  • the medium of HEK293T cells was replaced with 9 mL of Opti-MEM, and a complex consisting of Lipofectamine 2000 prepared above and three types of DNA (expression vectors) was added thereto, and incubated at 37 ° C., 5% CO 2 for 6 hours. After completion of the reaction, the plate was washed once with PBS, 8 mL of DMEM-10F was added, and the mixture was incubated at 37 ° C., 5% CO 2 for 48 hours. After completion of the culture, the supernatant was collected and filtered through a 0.22 ⁇ m filter to obtain an HCVpp solution. The HCVpp solution was dispensed in 1 mL portions and stored at ⁇ 80 ° C.
  • TH HCVpp pseudo-HCV particles having the structural protein of the TH strain of genotype 1b are referred to as TH HCVpp.
  • the cell lysis solution CCLR Promega
  • the cell mass was removed by centrifugation, and the supernatant was used as a sample.
  • 20 ⁇ l of sample and 50 ⁇ l of luciferin substrate solution were mixed, and the luminescence intensity was measured immediately.
  • the luciferase gene introduced into HCVpp particles is expressed in the cells, and the fluorescence is detected by the activity.
  • medium RPMI 1640 was mixed with TH HCVpp instead of the hybridoma culture supernatant, and the luminescence intensity was measured in the same manner.
  • control The measurement value of the control experiment (control) was defined as 100% infection rate, and the measurement value when the hybridoma culture supernatant and TH HCVpp were mixed was expressed as a relative infection rate (%). That is, the lower the infection rate, the higher the HCV infection inhibitory activity of the monoclonal antibody contained in the hybridoma culture supernatant used.
  • the hybridoma culture supernatant may have an activity of inhibiting HCVpp infection. Indicated.
  • “sup.” Is a culture supernatant sample of each hybridoma clone.
  • “No env.” Is a retroviral particle having no HCV envelope protein.
  • a monoclonal antibody capable of recognizing an antigen and having an activity inhibiting activity against the antigen can be efficiently produced by the method of the present invention.
  • Example 8 Production of IgA antibody against influenza virus protein (1) Immunization with inactivated influenza virus 8-week-old female BALB / c mice (Claire Japan) were divided into "normal immunization group” and "secondary lymphoid tissue transplantation group”. 100 ⁇ g of inactivated PR8 strain (H1N1 subtype) influenza virus particles (the virus distributed from the Hokkaido University Research Center for Zoonosis Control was propagated in chicken eggs) Nasal administration (immunization). Inactivated influenza virus particles (PR8 strain) were diluted with PBS and used as 100 ⁇ g / 10 ⁇ L. Nasal administration was carried out by administering 10 ⁇ L from the nose of BALB / c mice using Pipetman.
  • PR8 strain H1N1 subtype influenza virus particles
  • spleen and mediastinal lymph nodes were collected from immunized BALB / c mice in the “secondary lymph tissue transplant group”.
  • the spleen was cut into 3 mm squares (thickness was about 2 to 3 mm), and the mediastinal lymph nodes were cut with scissors and used for transplantation.
  • the collected spleen or mediastinal lymph node was transplanted under the renal capsule of an 8 week old female SCID mouse (Claire Japan) (two tissue fragments were transplanted for one kidney). That is, 4 spleen fragments or 4 mediastinal lymph nodes were transplanted per SCID mouse.
  • inactivated influenza virus particles PR8 strain
  • heart blood was collected from BALB / c mice 4 days after the final booster immunization. Blood was collected by and serum was prepared.
  • the immunization schedules of the “normal immunity group” and the “secondary lymph tissue transplantation group” are shown in FIG.
  • inactivated influenza virus particles PR8 strain
  • the inactivated influenza virus particles PR8 strain
  • SCID mice secondary lymphoid tissue transplantation group
  • a virus disruption solution of influenza virus particles (PR8 strain) was prepared by diluting with PBS, 50 ⁇ L / well was dispensed onto an immunoplate (Nunc; MaxSorp), and solidified at 4 ° C. overnight. The immobilized plate was washed 3 times with PBS containing 0.05% Tween-20, and then blocked with 1% BSA-containing PBS for 1 hour at room temperature. After removing the blocking solution and washing the plate three times in the same manner, serum from each mouse diluted with PBS containing 1% BSA was added and allowed to react at room temperature for 1 hour. When measuring IgG, serum was used 24,300 times, and when measuring IgA, serum was diluted 10,000 times.
  • an antibody for detection diluted with PBS containing 1% BSA was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • HRP-goat anti-mouse IgG or HRP-goat anti-mouse IgA both Zymed was used.
  • the detection antibody was removed from the plate, and after washing 8 times in the same manner, 100 ⁇ L of Sure Blue / TMB (KPL) was added, and after 5 to 15 minutes, 50 ⁇ L of 2N sulfuric acid was added to stop the reaction.
  • Absorbance (450 nm) was measured using a plate reader (iMark; BIORAD).
  • FIG. 8A shows the results of PR8-specific IgG
  • FIG. 8B shows the results of PR8-specific IgA.
  • the vertical axis represents absorbance (450 nm).
  • IgG the serum of each mouse was measured 24,300 times
  • IgA the serum of each mouse was diluted 10,000 times.
  • Lane 1 untreated mice (naive)
  • lane 2 normal immunization group
  • lane 3 secondary lymphoid tissue transplantation group (spleen transplantation)
  • lane 4 secondary lymphoid tissue transplantation group (mediastinal lymph node transplantation).
  • HEK293T cells were seeded at 6 ⁇ 10 5 cells per 6 cm dish and cultured for 18 hours.
  • These expression vectors are vectors that express the HA gene under the control of the CAG promoter, and were obtained from the Hokkaido University Research Center for Zoonosis Control.
  • a cell lysate was prepared (pCAG-PR8 (HA1) -introduced HEK293T cells and pCAG-Aichi (HA3) -introduced HEK293T cells).
  • a cell lysate of HEK293T cells was prepared. The amount of protein in the cell lysate was measured, and 20 ⁇ g of each was electrophoresed by SDS-PAGE. The electrophoresis product was transferred to a nitrocellulose membrane, and Western blotting was performed according to a conventional method.
  • mice sera normal immunization group, secondary lymphoid tissue transplantation group (spleen transplantation)) and secondary lymphoid tissue transplantation group (mediastinal lymphatics) diluted 2000-fold each to nitrocellulose membrane to which HA protein of influenza virus was transferred Node transplantation)
  • serum was removed, and the nitrocellulose membrane was washed.
  • HRP-goat anti-mouse IgG or HRP-goat anti-mouse IgA was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • the antibody for detection was removed, the nitrocellulose membrane was washed, and detected with Western blotting detection reagent ECL (GE Healthcare Japan) (FIG. 9).
  • FIG. 9A shows a normal immunization group
  • FIG. 9B shows a secondary lymphoid tissue transplantation group (spleen transplantation)
  • FIG. 9C shows a secondary lymphoid tissue transplantation group (mediastinal lymph node transplantation).
  • Lane 1 shows HEK293T cells
  • Lane 2 shows pCAG-PR8 (HA1) -introduced HEK293T cells
  • Lane 3 shows pCAG-Aichi (HA3) -introduced HEK293T cells.
  • FIG. 9 shows electrophoresis of cell lysates of HEK293T cells (pCAG-PR8 (HA1) -introduced HEK293T cells and pCAG-Aichi (HA3) -introduced HEK293T cells) expressing influenza virus HA protein, and the influenza virus HA protein was converted into a nitrocellulose membrane.
  • 2 shows the result of detecting whether the antibody bound to the influenza virus HA antigen is IgG or IgA by the ECL method by reacting each mouse serum diluted 2,000 times after transcription.
  • an antigen-specific monoclonal antibody in particular, an IgA monoclonal antibody that has been difficult to obtain by conventional techniques, can be obtained efficiently.
  • antigen-sensitized lymphoid cells contained in lymphoid tissues transplanted to immunodeficient non-human animals can be selectively amplified.
  • Antigen-specific monoclonal antibodies obtained from antibody-producing hybridomas can be advantageously used as antibody drugs, diagnostic antibodies, research antibodies, and the like.

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Abstract

本発明は、選択的かつ効率的に抗原特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製する方法、及び抗原特異的モノクローナル抗体を効率よく製造する方法を提供することを目的としている。本発明は、非免疫不全の非ヒト動物に抗原を投与して免疫する非ヒト動物免疫工程と、免疫工程で免疫した上記非ヒト動物から二次リンパ組織又は二次リンパ組織細胞を採取し、該二次リンパ組織又は該二次リンパ組織細胞を免疫不全非ヒト動物に移植する移植工程と、移植工程で移植を行った免疫不全非ヒト動物に、上記抗原を投与して免疫する免疫不全非ヒト動物免疫工程と、免疫不全非ヒト動物免疫工程で免疫した免疫不全非ヒト動物から、脾細胞又はリンパ節細胞を取得する取得工程と、取得工程で取得した脾細胞又はリンパ節細胞をミエローマ細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを作製するハイブリドーマ作製工程とを含む、抗原特異的抗体産生ハイブリドーマを作製する方法を提供する。

Description

抗原特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製方法及び抗原特異的モノクローナル抗体の製造方法
　本発明は、抗原特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製方法及び抗原特異的モノクローナル抗体の製造方法に関する。
　モノクローナル抗体は、抗原を特異的に認識する。その特徴から、モノクローナル抗体は、研究や診断薬のみならず医薬品としても使用されている。抗体は、定常領域の構造の違いにより、いくつかのクラス (アイソタイプ）に分類されている。哺乳類では、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥの５種類のクラスの免疫グロブリン（抗体）に分類される。
　日本の抗体医薬市場は、医薬品市場全体の成長が鈍化している中で、着実に増大しており、２００７年に約８００億円であった市場規模は１０年に１７００億円を超えると推計され、さらに、７年後の１７年には７０００億～８０００億円規模に成長し、７兆～８兆円とみられる医療用医薬品市場の１０％を占めるようになると予測されている。
　現在上市されている抗体医薬には、がんを治療対象とするリツキサン（登録商標）、ハーセプチン（登録商標）、アバスチン（登録商標）、及び関節リウマチを対象とするレミケード（登録商標）、ヒュミラ（登録商標）がある（非特許文献１、２）。
　抗体が、がん細胞を殺傷する機構には主に２つ知られており、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ： antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）活性と補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ： complement-dependent cytotoxicity）活性である。ＡＤＣＣ活性は、ナチュラルキラー細胞、単球、好中球などの白血球が抗体を介してがん細胞などの標的細胞を殺傷する活性であり、ＣＤＣ活性は、補体を介して標的細胞を殺傷する活性である。
　これまでに上市されている抗体医薬のクラスは、すべてＩｇＧである。ＩｇＧは、ＡＤＣＣ活性が高く、特にがんを標的とした抗体医薬にはＩｇＧクラスの抗体が適しているといえる（非特許文献２）。
　しかし、近年、ＥＧＦ受容体に対するＩｇＧクラスの抗体とＩｇＡクラスの抗体を用いたＡＤＣＣ活性の研究から（非特許文献３）、ＩｇＧクラスの抗体には好中球を介したＡＤＣＣ活性はないのに対して、ＩｇＡクラスの抗体には好中球を介したＡＤＣＣ活性があることが明らかになった。逆に、ＩｇＧクラスの抗体には単球を介したＡＤＣＣ活性があるのに対し、ＩｇＡクラスの抗体には単球を介したＡＤＣＣ活性がない。しかし、ヒト血液中の好中球の割合は５０－６０％であり単球の割合は５％であること、さらに、血中の好中球はＧ－ＣＳＦの投与で増加させることができるため、Ｇ－ＣＳＦとＩｇＡクラスの抗体との併用効果も期待できることから、ＩｇＡクラスの抗体はＩｇＧクラスの抗体にはない特性をもった医薬となる可能性が考えられる。
　ＩｇＡは腸管、気道上皮、授乳期乳腺、唾液腺などの外分泌組織で産生される。ＩｇＡの作用の一つとして、上皮表面を感染から防御することが挙げられる。ＩｇＡは、上皮細胞に細菌や毒素が結合したり、異物が吸着したりするのを防ぎ、種々の病原体に対する防御機構として働いている。新生児は生後直ちに、かつてさらされたことのない病原体に暴露されることになるため、特に感染が起こりやすい。したがって、自身で抗体を作れるようになるまでの間、母乳より分泌されたＩｇＡ抗体が新生児の腸管に運ばれて、母親からのＩｇＡにより細菌等から防御される。このことから、ＩｇＡは経口で作用することが分かる。したがって、ＩｇＡは感染予防用の経口可能な抗体医薬としても期待できる。
　それ故、疾患の治療・予防の観点から、ＡＤＣＣ活性の高い抗体、経口投与可能な抗体であるＩｇＡモノクローナル抗体を取得する効果的な方法の開発も求められている。
　ＩｇＡモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得する方法としては、抗原免疫した複数のマウスから、ＩｇＡ産生Ｂ細胞が存在するパイエル板、肺リンパ球、顎下腺又は鼻粘膜関連リンパ組織（ＮＡＬＴ：nasal-associated lymphoid tissue）から回収した細胞を用いる方法が報告されている（非特許文献４）。
　また、抗原で免疫した非ヒト動物において人工リンパ節を形成させ、その人工リンパ節を摘出し、免疫不全非ヒト動物に移植することを特徴とする抗原特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製方法が開示されているが、この方法は人工リンパ節の構築に手間がかかる点に改良の余地があり、またＩｇＡを産生するハイブリドーマを選択的かつ効率的に取得する方法は開示されてはいない（特許文献１）。
　ＩｇＡは通常の免疫方法では誘導されにくいこと、及びＩｇＡ産生Ｂ細胞が少ないことから、ＩｇＧモノクローナル抗体産生ハイブリドーマと比べると、ＩｇＡモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの取得は非常に困難であるのが現状である。
　ＩｇＡモノクローナル抗体ハイブリドーマを取得する目的で、比較的ＩｇＡ産生の多い、パイエル板、肺リンパ球、顎下腺又は鼻粘膜関連リンパ組織等の細胞を用いてハイブリドーマを作製する従来の方法では、これらの組織から得られる細胞数は少なく、何匹ものマウスを使ってようやくハイブリドーマ作製に必要な細胞数を回収するため、ＩｇＡモノクローナル抗体ハイブリドーマを取得できる可能性は低いか又はかならずしも取得できるとはいえず、効率が悪いといえる。また、この方法で抗原として使用し得るのは、抗原性の強い病原体に限られているという問題点もある。
国際公開第０７／０６９７５５号
Ｈｕｄｓｏｎら、ＮＡＴＵＲＥ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ、２００３年、９巻、ｐ．１２９－１４３ Ａｄａｍｓら、ＮＡＴＵＲＥ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、２００５年、２３巻、ｐ.１１４７－１１５７ Ｄｅｃｈａｎｔら、Ｊ.　Ｉｍｍｕｎｏｌ.、２００７年、１７９巻、ｐ.２９３６-２９４３ Ｉｍａｉら、Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００５年、３０２巻、ｐ．１２５－１３５
　本発明は、選択的かつ効率的に抗原特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製する方法、及び、抗原特異的モノクローナル抗体を効率よく製造する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、抗原免疫した非ヒト動物由来の二次リンパ組織又はその細胞を、免疫不全非ヒト動物に移植し、該動物を抗原で追加免疫（ブースト）することによって、抗原特異的モノクローナル抗体を選択的に強く誘導することができることを見出し、本発明を完成させるに至ったものであり、以下を包含する。
[1] 非免疫不全の非ヒト動物に抗原を投与して免疫する非ヒト動物免疫工程（工程（ａ））と、
　前記免疫工程で免疫した前記非ヒト動物から二次リンパ組織又は二次リンパ組織細胞を採取し、該二次リンパ組織又は該二次リンパ組織細胞を免疫不全非ヒト動物に移植する移植工程（工程（ｂ））と、
　前記移植工程で移植を行った免疫不全非ヒト動物に、前記抗原を投与して免疫する免疫不全非ヒト動物免疫工程（工程（ｃ））と、
　前記免疫不全非ヒト動物免疫工程で免疫した免疫不全非ヒト動物から、脾細胞又はリンパ節細胞を取得する取得工程（工程（ｄ））と、
　前記取得工程で取得した脾細胞又はリンパ節細胞をミエローマ細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを作製するハイブリドーマ作製工程（工程（ｅ））と、
を備える、抗原特異的抗体産生ハイブリドーマを作製する方法。
　この方法では、移植工程（工程（ｂ））において前記工程（ａ）で免疫した非ヒト動物から採取した二次リンパ組織を、免疫不全非ヒト動物に移植することがより好ましい。
　本方法の別の一態様では、免疫不全非ヒト動物に移植する二次リンパ組織又は二次リンパ組織細胞は、それぞれ粘膜関連リンパ組織又は粘膜関連リンパ組織細胞であることも好ましい。粘膜関連リンパ組織又は粘膜関連リンパ組織細胞を移植する場合、この方法は抗原特異的ＩｇＡ抗体産生ハイブリドーマを作製するための方法であり得る。
　本方法の別の一態様では、免疫不全非ヒト動物に移植する二次リンパ組織又は二次リンパ組織細胞は、それぞれ脾臓又は脾細胞であることも好ましい。
　本方法の一態様では、免疫不全非ヒト動物に移植する二次リンパ組織又は二次リンパ組織細胞は、それぞれリンパ節又はリンパ節細胞であることが好ましい。
　本方法に使用する動物は、げっ歯動物であってもよい。
[2] 上記[1]の方法を用いて抗原特異的抗体産生ハイブリドーマを作製し、その培養上清から抗原特異的モノクローナル抗体を採取することを含む、抗原特異的モノクローナル抗体の製造方法。
　上記[1]及び[2]の方法では、好適な抗原としてはウイルスタンパク質が挙げられ、例えば、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質又はインフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質が挙げられる。
　本発明の方法によれば、抗原特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製効率を顕著に向上させることができる。
Ｃ型肝炎ウイルスＴＨ株エンベロープタンパク質Ｅ２（ＴＨ株Ｅ２タンパク質）を抗原として免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するリンパ組織細胞を移入又はリンパ組織を移植したＳＣＩＤマウスにおける血中の抗原特異的抗体量の測定結果を示す図である。 ＯＶＡ免疫アレルギーモデルマウス由来の鼻粘膜リンパ組織（ＮＡＬＴ；Nasal-associated lymphoid tissue）を移植したＳＣＩＤマウスの血中のＯＶＡ特異的抗体価の測定を示す図である。 ＯＶＡ免疫鼻アレルギーモデルマウス由来の鼻粘膜リンパ組織（ＮＡＬＴ）を移植したＳＣＩＤマウスの血清の抗体アイソタイピングの結果を示す図である。 ＮＰ－ＯＶＡ（４－ヒドロキシ－３－ニトロフェニルアセチル－卵白アルブミン）を抗原として用いて免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスのリンパ組織（リンパ節）を移植し追加免疫を行ったＳＣＩＤマウスの脾臓及びリンパ節中に含まれるリンパ球のフローサイトメトリー解析の結果を示すドットプロット図である。 脾細胞から作製したハイブリドーマの各クローンについての培養上清中の抗原結合性抗体の検出結果を示す図である。 Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質（ＴＨ株Ｅ２タンパク質）を抗原として免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス由来リンパ組織を移植したＳＣＩＤマウスの脾細胞から作製したハイブリドーマの培養上清について、Ｃ型肝炎ウイルス擬粒子（ＨＣＶｐｐ）感染阻害活性を評価した結果を示す図である。 インフルエンザウイルスＰＲ８株をマウスに免疫するスケジュールを示す図である。 図７に示したスケジュールにて免疫した各マウス（図中のレーン２～４）及びインフルエンザウイルス非免疫マウス（図中のレーン１）の血清中のインフルエンザウイルスＰＲ８株タンパク質特異的抗体価の測定を示す図である。 図７に示したスケジュールにて免疫した各マウスの血清中の、インフルエンザウイルスＨＡ抗原に対する抗体を、ウエスタンブロット法にて解析した結果を示す図である。
　リンパ組織は、一次リンパ組織と二次リンパ組織に分類される。一次リンパ組織はリンパ球産生のための場所であり、骨髄と胸腺が含まれる。二次リンパ組織は適応免疫が開始される場所であり、脾臓、リンパ節及び粘膜関連リンパ組織が含まれる。二次リンパ組織では、リンパ球がＴ細胞領域とＢ細胞領域とに分かれて存在している。Ｂ細胞領域は濾胞とも呼ばれ、抗原刺激を受けたＢ細胞は濾胞へと移動し、そこで増殖し、濾胞の中心に胚中心を形成する。脾臓は白脾髄と赤脾髄とで構成され、白脾髄は動脈枝の周りにＴ細胞領域とＢ細胞領域のあるリンパ鞘で、リンパ節と非常によく似た構造をしている。リンパ節では全ての抗体のうちのＩｇＡの割合は２０％程度に過ぎないが、粘膜関連リンパ組織では抗体総含量に対するＩｇＡの割合が８０％にも及ぶことが知られている。
　粘膜関連リンパ組織（mucosa-associated lymphoid tissue；ＭＡＬＴ）は皮膜を持たないリンパ組織塊で、消化管、気道、泌尿生殖器の粘膜固有層と粘膜下組織に認められる。
　本発明は、標的抗原を用いて動物を免疫した後、その免疫した動物の二次リンパ組織又はその細胞（二次リンパ組織細胞）を免疫不全動物に移植して抗原投与により免疫するという二段階の免疫工程を用いて、抗原特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製する方法を提供する。
　より具体的には、本発明は、非免疫不全の非ヒト動物に抗原を投与して免疫する非ヒト動物免疫工程（工程（ａ））と、
　前記免疫工程で免疫した前記非ヒト動物から二次リンパ組織又は二次リンパ組織細胞を採取し、該二次リンパ組織又は該二次リンパ組織細胞を免疫不全非ヒト動物に移植する移植工程（工程（ｂ））と、
　前記移植工程で移植を行った免疫不全非ヒト動物に、前記抗原を投与して免疫する免疫不全非ヒト動物免疫工程（工程（ｃ））と、
　前記免疫不全非ヒト動物免疫工程で免疫した免疫不全非ヒト動物から、脾細胞又はリンパ節細胞を取得する取得工程（工程（ｄ））と、
　前記取得工程で取得した脾細胞又はリンパ節細胞をミエローマ細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを作製するハイブリドーマ作製工程（工程（ｅ））と、
を含む、抗原特異的抗体産生ハイブリドーマを作製する方法を提供する。
　本発明の典型的な実施形態では、
（ａ）抗原で非ヒト動物を免疫し；
（ｂ）免疫した非ヒト動物から採取した二次リンパ組織又は二次リンパ組織細胞を免疫不全非ヒト動物に移植し；
（ｃ）二次リンパ組織又は二次リンパ組織細胞を移植した免疫不全非ヒト動物を、前記抗原で免疫し；
（ｄ）前記（ｃ）で免疫した免疫不全非ヒト動物から、脾細胞又はリンパ節細胞を取得し；そして
（ｅ）前記（ｄ）で取得した脾細胞又はリンパ節細胞を不死化細胞（ミエローマ細胞など）と融合させて抗体産生ハイブリドーマを形成させることにより、
抗原特異的抗体産生ハイブリドーマを作製することができる。
　本発明の方法では、まず、ハイブリドーマに産生させる抗体の標的となる抗原（標的抗原）を用いて、非ヒト動物を免疫する。ここで用いる抗原は任意の免疫原性物質であってよく、タンパク質、タンパク質断片、融合タンパク質等を始めとするポリペプチド又はペプチドであってもよい。本発明の方法では比較的免疫原性が低い物質を抗原として用いてもよい。有用な抗原の例は、限定するものではないが、ウイルスタンパク質（構造タンパク質又は非構造タンパク質）が含まれる。ウイルスタンパク質は、ヒト又は非ヒト哺乳動物を宿主とするウイルス由来のものであってよいが、他の生物種を宿主とするウイルス由来のものであってもよい。本発明に用いる抗原としては例えば、ウイルスのエンベロープタンパク質又はスパイクタンパク質と呼ばれる、ウイルス表面のエンベロープに存在しウイルス感染能に関与する糖タンパク質が特に好ましい。
　本発明に用いる抗原の具体例としては、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）タンパク質、例えば、構造タンパク質であるＣｏｒｅ、Ｅ１、Ｅ２、及びｐ７、並びに非構造タンパク質であるＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂ等が挙げられる。なおＥ１及びＥ２はエンベロープタンパク質である。ここで使用する抗原が由来するＣ型肝炎ウイルスは、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、３ｂ、４、５ａ、又は６ａのウイルス株であり得る。本発明に用いる抗原が由来するＣ型肝炎ウイルスは、限定するものではないが、例えば、ＨＣＶ－ＴＨ、ＪＦＨ－１、ＪＣＨ－１、Ｊ６ＣＦ、Ｈ７７等の株であってもよい。
　抗原の別の好ましい例としては、インフルエンザウイルスタンパク質、例えば、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ＲＮＡポリメラーゼαサブユニット（ＰＡ）、ＲＮＡポリメラーゼβ１サブユニット（ＰＢ１）、ＲＮＡポリメラーゼβ２サブユニット（ＰＢ２）、マトリクスタンパク質Ｍ１及びＭ２、核タンパク質ＮＰ、並びに非構造タンパク質ＮＳ１及びＮＳ２が挙げられるが、エンベロープタンパク質であるヘマグルチニン又はノイラミニダーゼは特に好ましい。ヘマグルチニンは任意のサブタイプ（典型的にはＨ１～Ｈ１６）を使用できるが、サブタイプＨ１が好適例として挙げられる。ノイラミニダーゼも任意のサブタイプ（典型的にはＮ１～Ｎ９）を使用できるが、サブタイプＮ１が好適例として挙げられる。また、本発明に用いる抗原が由来するインフルエンザウイルスは、Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルスであってよく、例えば、Ｈ１Ｎ１（Ａソ連型）、Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ２、及びＨ２Ｎ２（Ａ香港型）、Ｈ９Ｎ１、並びにＨ５Ｎ１等の様々な亜型であってよい。なおこれらの亜型名の「Ｈ１」、「Ｈ３」等はヘマグルチニンのサブタイプを表し、「Ｎ１」、「Ｎ２」等はノイラミニダーゼのサブタイプを表す。本発明に用いる抗原が由来するインフルエンザウイルスは、任意の生物種を宿主とするものであってよく、限定するものではないが、例えばヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス等、又はそれらの変異体であってもよい。　非ヒト動物免疫工程（工程（ａ））において抗原を投与する非ヒト動物は、非免疫不全の非ヒト動物（以下、「非ヒト動物」と略す。）であり、すなわち、抗体産生能を含む免疫能を有し、Ｔ細胞及びＢ細胞を保有している、ヒト以外の動物である。この非ヒト動物は、好ましくは正常非ヒト動物である。非ヒト動物は、限定するものではないが、哺乳動物、げっ歯動物、鳥類等であってよい。非ヒト動物は、例えば、サル、イヌ、モルモット、マウス、ラットヒツジ、ヤギ、若しくはニワトリ等の家畜動物、愛玩動物又は実験動物であってもよい。より好ましい非ヒト動物は、げっ歯動物であり、マウスやラット等が挙げられるが、より好ましくは、マウスである。非ヒト動物は、任意の系統や種類であってよく、ヒト化動物やヒト抗体産生動物等の遺伝子操作した非ヒト動物も包含する。非ヒト動物としてヒト抗体産生動物を用いれば、ヒト抗体の取得も可能になる。
　抗原で非ヒト動物を免疫する方法として、標的抗原に対する液性免疫を誘導できる任意の方法を用いることができるが、通常は、抗原を投与して非ヒト動物を免疫すればよい。抗原は単独で投与してもよいし、アジュバント、担体又は希釈剤とともに投与しても構わない。アジュバントとしては、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、又は水酸化アルミニウム等の任意のアジュバントを使用することができる。抗原の投与経路（免疫経路）としては、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、経鼻投与（点鼻投与など）、経肺投与、直腸内投与などの非経口経路を始めとする任意の経路が挙げられる。目的のアイソタイプの抗体の誘導を引き起こすことが可能な投与経路を用いることが好ましい。例えばＩｇＡクラスの抗体の誘導を引き起こす免疫経路を選択することができ、そのような例としては経鼻投与を含む経粘膜投与が挙げられる。
　非ヒト動物に対する免疫（抗原投与）の回数は、単回でも複数回（例えば、２回、３回、４回又は５回以上）でもよいが、複数回行うことがより好ましい。複数回免疫する場合は、１－６週間に１回の頻度で繰り返し投与することが好ましい。複数回免疫を行う場合、投与経路は同一であってもよいが、２種以上の投与経路を組み合わせてもよい。
　抗原での免疫後、非ヒト動物における抗原特異的抗体価が上昇していることが望ましいが、その上昇レベルは高くなくてもよく、二次リンパ組織に抗原特異的抗体産生細胞が存在していればよい。抗原で免疫した非ヒト動物は、例えばアレルギーモデル動物等の疾患モデル動物であってもよい。
　本発明の方法では、抗原で免疫した非ヒト動物に、ストローマ細胞（サイトカイン産生ストローマ細胞等）及び／又は樹状細胞又はそれらを含む高分子生体材料を移植して人工リンパ節を形成させる工程（特許文献１）を含まない。本発明において人工リンパ節とは、人工的操作により非ヒト動物が生来有するリンパ節とは異なる部位に後天的に形成されたリンパ節（異所性リンパ節）をいう。人工リンパ節は高分子生体材料、外来性ストローマ細胞及び／又は免疫担当細胞（サイトカイン等で活性化された樹状細胞等）を含みうる。
　抗原で免疫した非ヒト動物からは、二次リンパ組織又はその細胞（二次リンパ組織細胞）を採取して、免疫不全非ヒト動物に移植する。ここで二次リンパ組織は、限定するものではないが、脾臓、リンパ節又は粘膜関連リンパ組織である。リンパ節は任意のリンパ節、例えば一次リンパ節、二次リンパ節又は三次リンパ節であってよく、具体的には表頸、上腕、腋窩、鼠蹊部、及び膝窩リンパ節等であってもよい。本発明において「二次リンパ組織」は、生来備わっている（生来の）二次リンパ組織を意味し、したがって人工リンパ節を含まない。粘膜関連リンパ組織としては、例えば、鼻粘膜リンパ組織（ＮＡＬＴ；Nasal-associated lymphoid tissue）、気管支関連リンパ組織（ＢＡＬＴ；Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ）、咽頭粘膜リンパ組織、上気道粘膜リンパ組織（扁桃）、腸管粘膜組織(ＧＡＬＴ；Ｇｕｔ-ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ)、虫垂粘膜組織、パイエル板（Ｐａｙｅｒ’s ｐａｔｃｈ）、腸間膜リンパ節、縦隔リンパ節（Ｍｅｄｉａｓｔｉｎａｌ　ｌｙｍｐｈ　ｎｏｄｅ）等が挙げられる。本発明の方法において二次リンパ組織は、膵臓やリンパ節等の臓器・器官全体を採取するか、又は組織構造を保持した組織片として採取して、それを免疫不全非ヒト動物に移植することができる。本発明において二次リンパ組織細胞とは、二次リンパ組織を構成するリンパ系細胞集団をいい、例えば二次リンパ組織に含まれる細胞集団をPBS等に懸濁した細胞懸濁液として調製することができる。移植する二次リンパ組織片は胚中心の少なくとも一部を含む。移植に用いる二次リンパ組織片又は二次リンパ組織細胞はまた、抗体産生細胞、樹状細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞等のリンパ系細胞を含むことも好ましい。二次リンパ組織細胞は、複数部位の二次リンパ組織からの細胞の混合物であってもよい。
　本発明において、抗原免疫した非ヒト動物から採取した二次リンパ組織又は二次リンパ組織細胞を移植する免疫不全非ヒト動物は、先天性免疫不全であっても、後天性免疫不全であってもよい。この免疫不全非ヒト動物は、少なくとも液性免疫能が欠損又は顕著に機能低下（より好ましくは欠損）していることが好ましく、液性免疫能と細胞性免疫能の両方が欠損又は顕著に機能低下（より好ましくは欠損）していることがさらに好ましい。免疫不全非ヒト動物は、Ｔ細胞及びＢ細胞の少なくとも一方が欠損又は減少していることが好ましく、Ｔ細胞及びＢ細胞の両方が欠損又は減少している複合免疫不全を示すことがより好ましい。免疫不全非ヒト動物は、哺乳動物、げっ歯動物、鳥類等であってよいが、これらに限定されるものではない。免疫不全非ヒト動物は、例えば、サル、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、若しくはニワトリ等の家畜動物、愛玩動物又は実験動物であってよい。免疫不全非ヒト動物は、マウスやラット等のげっ歯動物であってよいが、より好ましくは、マウスである。免疫不全非ヒト動物は、任意の系統や種類であってよく、ヒト化動物やヒト抗体産生動物等の、遺伝子操作したヒト以外の動物も包含する。二次リンパ組織又は二次リンパ組織細胞を移植する免疫不全非ヒト動物は、その二次リンパ組織又は二次リンパ組織細胞を採取した非ヒト動物と同一生物種であることがより好ましい。例えば免疫不全マウスとしては、重度複合免疫不全マウス（Severe Combined Immunodeficient mouse；ＳＣＩＤマウス）を用いてもよい。免疫不全マウスを用いる場合、その具体例としては、Ｃ.Ｂ.１７-ＳＣＩＤ、ＮＯＤ ＳＣＩＤ、ＮＯＧ ＳＣＩＤ等のＳＣＩＤマウスの他、ヌードマウス、Ｒａｇ１ノックアウトマウス、Ｒａｇ２ノックアウトマウス等も挙げられる。免疫不全ラットを用いる場合、その具体例としては、Ｘ－ＳＣＩＤラット（Mashimoら、PLoS ONE 5:e8870 (2010)）を挙げることができる。
　二次リンパ組織又は二次リンパ組織細胞の免疫不全非ヒト動物への移植は、常法により行うことができる。ここで「移植」とは、組織全体（臓器・器官等）若しくはその組織片、又は細胞を、免疫不全非ヒト動物の体内に導入することを意味する。なお細胞の移植は「移入」ということがある。二次リンパ組織又は二次リンパ組織細胞を移植する部位は、組織生着に適した任意の場であってよいが、好ましい例として、腎皮膜下への移植や皮下への移植などが挙げられ、腎皮膜下に移植することがより好ましい。腎皮膜下への移植は、具体的には腎皮膜と腎臓との間に組織又は組織片を挿入することによって行うことができる。移植する組織片の数は限定されないが、２個以上、例えば３個若しくは４個又は５個以上を移植することも好ましい。二次リンパ組織細胞の移植（移入）は、非経口経路で行えばよく、例えば腹腔内投与又は静脈内投与等が挙げられるが、腹腔内投与がより好ましい。移入する細胞数は、当業者が適宜定めることができるが、１ｘ１０６個以上、例えば１ｘ１０７～１ｘ１０８個であることが好ましい。二次リンパ組織又は二次リンパ組織細胞を移植した免疫不全非ヒト動物は再構成動物とも称される。
　本発明の方法により、抗原特異的ＩｇＡモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することもできる。抗原特異的ＩｇＡモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製する場合、二次リンパ組織又は二次リンパ組織細胞として、粘膜関連リンパ組織又は粘膜関連リンパ組織細胞を、免疫不全非ヒト動物に移植することが好ましい。粘膜関連リンパ組織は、上述した具体例のような任意の粘膜関連リンパ組織であってよいが、好ましい例としては、鼻粘膜リンパ組織（ＮＡＬＴ；Ｎａｓａｌ-ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ）、縦隔リンパ節が挙げられる。
　本発明の一態様では、非ヒト動物を所定の標的抗原（アレルゲン物質など）で免疫して得られる疾患モデル動物から摘出した二次リンパ組織（例えば、粘膜関連リンパ組織）又はその細胞を、免疫不全非ヒト動物に移植してもよい。なお、免疫疾患を発症している疾患モデル動物や、免疫異常が認められ目的の抗体が高産生されているような非ヒト動物から摘出した二次リンパ組織（例えば、粘膜関連リンパ組織）又はその細胞を、免疫不全非ヒト動物に移植することにより、同様の免疫不全非ヒト動物を作製することもできる。あるいは、非ヒト動物に癌細胞を移入した担癌モデル動物から摘出した粘膜関連リンパ組織又はその細胞を、免疫不全非ヒト動物に移植することによっても同様の免疫不全非ヒト動物を作製することができる。
　本発明の方法では、免疫不全非ヒト動物に二次リンパ組織を移植することにより、標的抗原特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの形成効率を、顕著に増加させることができる。したがって二次リンパ組織の移植を行う本発明の方法では、目的のハイブリドーマを高効率に作製することができる。
　二次リンパ組織又は二次リンパ組織細胞を免疫不全非ヒト動物に移植した後、非ヒト動物の免疫に用いた標的抗原で、その免疫不全非ヒト動物をさらに免疫する。ここで、本発明における免疫不全非ヒト動物の「免疫」とは、免疫不全非ヒト動物の体内で標的抗原に特異的な抗体が産生されることをいい、免疫不全非ヒト動物自身のリンパ系細胞による抗体産生に限定されず、むしろ、免疫不全非ヒト動物に移植されたリンパ系細胞による抗原特異的抗体の産生を意図する。移植されたリンパ系細胞による抗原特異的抗体の産生をもたらすこの免疫不全非ヒト動物の免疫は、移植された抗原感作リンパ系細胞に対する追加免疫（ブースト）に相当する。
　標的抗原による免疫不全非ヒト動物の免疫は、標的抗原の１回以上の投与によって行うことができる。標的抗原のこの投与は、２回又は３回以上行うことがより好ましい。標的抗原の投与の間隔は、７－１４日程度とすることが好ましい。抗原の投与経路は、追加免疫（ブースト）に用いられるものであれば特に限定されないが、例えば、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、皮内投与などが挙げられる。抗原投与量は、マウスの場合、１μｇ－１０００μｇ、好ましくは５μｇ－２００μｇである。
　標的抗原の投与（追加免疫）により、上記免疫不全非ヒト動物（再構成動物）では標的抗原に対する血中抗体価が上昇する。追加免疫を行った後（例えば、投与後３－１０日目）に免疫不全非ヒト動物から脾細胞又はリンパ節細胞を取得する。この脾細胞又はリンパ節細胞の取得は、免疫不全非ヒト動物から脾臓又はリンパ節を摘出し、そこから細胞を採取することにより行うことができる。採取した脾細胞又はリンパ節細胞を、同種又は異種動物のミエローマ細胞等の不死化細胞と細胞融合させれば、自律増殖能を持ったハイブリドーマ細胞を作製することができる。
　脾細胞又はリンパ節細胞とミエローマ細胞等の不死化細胞との細胞融合は、公知の方法（ケーラーら、Nature (1975) vol. 256、p.495-497）によって実施できる。例えば、両細胞を洗浄した後、ミエローマ細胞等の不死化細胞１に対し脾細胞又はリンパ節細胞を１－１０の割合で混合し、融合促進剤として、平均分子量１０００－６０００のポリエチレングリコール又はポリビニールアルコールを加え、細胞融合装置等を用いて電気刺激（例えば、エレクトロポレーション）を負荷することにより、細胞融合を誘導することができる。
　細胞融合に使用可能なミエローマ細胞の例としては、例えば、マウス由来の株化細胞であるＰ３－Ｘ６３Ａｇ８－Ｕ１（Ｐ３－Ｕ１）、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３（６５３）、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）、Ｐ３／ＮＳ１／１－Ａｇ４－１（ＮＳ１）等、さらにラット由来の株化細胞であるＹＢ２／Ｏ、Ｙ３－Ａｇ１.２．３等が挙げられる。これらの細胞株は、理化学研究所バイオリソースセンター、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）又はＥＣＡＣＣ（European Collection of Cell Cultures）等から入手可能である。
　このようにして細胞融合により形成されたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液で培養することにより選択することができる。ＨＡＴ培養液での培養は、非融合細胞が死滅するのに十分な時間（数日から数週間）行えばよい。
　得られたハイブリドーマクローン群には、標的抗原特異的モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが非常に高頻度で含まれる。したがって本発明の方法で形成されるハイブリドーマクローン群からは、標的抗原特異的モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを高効率でスクリーニングすることができる。
　モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングは、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）、ウエスタンブロット、フローサイトメトリーなど公知の方法で行うことができる。例えば、標的抗原を吸着させたマイクロプレートにハイブリドーマ培養上清を添加し、さらに放射性物質や酵素等で標識した抗イムノグロブリン抗体を加えて、マイクロプレートに結合したモノクローナル抗体を検出する方法、又は、抗イムノグロブリン抗体を吸着させたマイクロプレートにハイブリドーマ培養上清を添加し、さらに放射性物質や酵素等で標識したタンパク質を加え、マイクロプレートに結合したモノクローナル抗体を検出する方法等が挙げられる。特定のアイソタイプの抗体、例えば、抗原特異的ＩｇＡモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングするためには、イムノグロブリンを検出する抗体にＩｇＡ認識抗体を使用すればよい。
　このようにして得られる標的抗原特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを細胞培養することにより、標的抗原特異的モノクローナル抗体を、大量に調製することができる。例えば、上記スクリーニングで得られたハイブリドーマ細胞を、無血清培地、例えば、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ（インビトロジェン社）に馴化させ、無血清培地にて培養して得た培養上清からモノクローナル抗体を調製できる。培養には、例えば、フラスコ、シャーレ、スピナーカルチャーボトル、ローラーボトル又は高密度培養フラスコＣＥＬＬｉｎｅ（ベクトンデッキンソン社）を使用することができる。
　あるいは、大量にモノクローナル抗体を調製する場合には、例えば、６－８週齢のヌードマウス又はＳＣＩＤマウスの腹腔内に、０．５ｍＬのプリスタン（2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン）を投与し、２週間飼育した後に５×１０６～２×１０７細胞／匹のハイブリドーマ細胞を腹腔内に投与し、１０－２１日間飼育することによって得られる腹水から標的抗原特異的モノクローナル抗体を調製することもできる。
　なお、ハイブリドーマ細胞を作製せず、標的抗原で免疫した非ヒト動物の脾細胞又はリンパ節細胞からＲＮＡを調製し、抗体遺伝子のｃＤＮＡライブラリーを作製し、該ｃＤＮＡを大腸菌又は動物細胞等で発現させて目的のモノクローナル抗体（例えば、ＩｇＡモノクローナル抗体）を産生するクローンをスクリーニングすることによって、目的のモノクローナル抗体（例えば、ＩｇＡモノクローナル抗体）を大量に調製することもできる。
　したがって本発明はまた、上記のようにして作製した標的抗原特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを培養することを含む、標的抗原特異的モノクローナル抗体の製造方法も提供する。
　本発明は、一態様として、非ヒト動物を標的抗原で免疫し、該動物から粘膜関連リンパ組織を摘出し、その粘膜関連リンパ組織又はその細胞（粘膜関連リンパ組織細胞）を免疫不全非ヒト動物に移植し、得られた再構成動物に抗原を投与して追加免疫し、該標的抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞又はそれを含む脾細胞又はリンパ節細胞を該再構成動物から採取し、それをミエローマ細胞等の不死化細胞と融合させて標的抗原特異的抗体産生ハイブリドーマを作製し、該抗体産生ハイブリドーマを培養して標的抗原特異的ＩｇＡモノクローナル抗体を産生させて、培養上清からその標的抗原特異的ＩｇＡモノクローナル抗体を単離することによる、標的抗原特異的ＩｇＡモノクローナル抗体の製造方法も提供する。
　以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
［実施例１］抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃマウス由来リンパ節又はリンパ節細胞および脾臓又は脾細胞のＳＣＩＤマウスへの移植
　本実施例では、抗原刺激したリンパ球をｉｎ　ｖｉｖｏで増幅させるべく、Ｔ細胞及びＢ細胞を持たない免疫不全マウスであるＳＣＩＤマウス（重症複合免疫不全マウス）（Ｃ．Ｂ－１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄＪｃｌ、日本クレア社より購入）に、抗原で免疫した正常マウス（ＢＡＬＢ／ｃ系統）の二次リンパ節又は脾臓の組織片を移植した。また比較実験として、二次リンパ節又は脾臓から単離した細胞を同様のＳＣＩＤマウスの静脈内に移入し、その効果を比較した。
　まず、抗原として用いるため、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＴＨ株（Wakita et al., J.Biol.Chem., 269：14205-14210, (1994)及びMoradpour et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 246： 920-924 (1998)）由来の組換えエンベロープタンパク質を調製した。具体的にはＨＣＶ　ＴＨ株のゲノム（Wakita, T. et al., J. Biol. Chem., 269, p.14205-14210 (1994)）の３２８位～７１７位の配列に相当する、Ｅ２タンパク質をコードするＤＮＡを、動物細胞用タグ化タンパク質発現ベクター（タグ：Ｏｎｅ－ＳＴｒＥＰ－ｔａｇ）中に組み込み、これをＣＯＳ１細胞（アフリカミドリザル腎臓由来）に導入し、タンパク質を発現させ、得られた組換えＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ２（以下、ＴＨ株Ｅ２タンパク質とも称する）を単離精製した。
　このＴＨ株Ｅ２タンパク質溶液とアジュバントＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍ（商標）（PIERCE社）とを等量ずつ混和して調製した抗原溶液を、８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）の腹腔内に抗原量１０μｇ／ｈｅａｄとなる量で２週間おきに２回投与した。２回目の免疫の２週間後にリンパ節（表頸、上腕、腋窩、鼠蹊部、及び膝窩）及び脾臓を採取し、氷上に置いた。得られた各リンパ節を混合し、一部は移植に使用し、一部から細胞を単離した。
　単離した細胞について、１匹あたり細胞数１ｘ１０７個を、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）２００μＬに懸濁し、それを８週齢の雌性ＳＣＩＤマウスの静脈内に投与することによりマウスにリンパ節細胞を移入（移植）した。脾臓に関しても同様に、一部を移植に使用し、一部から細胞を単離し、１匹あたり細胞数１ｘ１０７個を、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）２００μＬに懸濁し、それを８週齢の雌性ＳＣＩＤマウスの静脈内に投与することによりマウスに脾細胞を移入した。
　組織移植については、８週齢の雌性ＳＣＩＤマウスをイソフルランによって麻酔し、背部をバリカンで毛剃りした。マウスを７０％エタノールで消毒後、片側臥位にし、左季肋部の皮を約１ｃｍ切開し、その真下の筋層も約１ｃｍ切開した。腎周辺の脂肪をピンセットで摘んで腎臓を体外に引き出した。マイクロピンセットを用いて腎皮膜を２－３ｍｍ程度破り、腎皮膜と腎臓との間に、上記で採取及び調製したリンパ組織片（リンパ節又は脾臓）を挿入した。腎臓を体内に戻し、筋層及び皮膚を縫合した。片腎につき２個、計４個の組織片（リンパ節又は脾臓のいずれか）を移植した。
　組織移植あるいは細胞移入の２、１６、及び３０日後（それぞれ、第１追加免疫、第２追加免疫、第３追加免疫と称する）に、上記で調製したＴＨ株Ｅ２タンパク質溶液を抗原量１０μｇ／ｈｅａｄとなる量で、上記の各ＳＣＩＤマウスの腹腔内に投与し、各追加免疫の４日後にヘパリナイズキャピラリー（テルモ社）を用いて採血を行った。
　得られた血液サンプルについて、ＥＬＩＳＡによって血中の抗原特異的抗体を定量した（図１Ａ）。このＥＬＩＳＡでは、免疫に用いた抗原のものとは異なるタグを付加した組換えＴＨ株Ｅ２タンパク質をイムノプレートに固相化し、これを用いて血液サンプル中の抗原（ＴＨ株エンベロープタンパク質Ｅ２）特異的抗体量を測定した。縦軸は４５０ｎｍでの吸光度を示す。丸印は個体値、棒印は平均値を示す。なお図１Ａ中、「ＬＮ」は標的抗原で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス由来のリンパ節を移植した実験群、「Ｓｐｌｅｅｎ」は標的抗原で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓を移植した実験群である。「ＬＮ　ｃｅｌｌ」は標的抗原で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス由来のリンパ節細胞を移入（静脈内投与）した実験群、「Ｓｐｌｅｅｎ　ｃｅｌｌ」は標的抗原で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾細胞を移入（静脈内投与）した実験群である。「1st」「2nd」「3rd」は、ＳＣＩＤマウスでの第１～第３追加免疫の後にそれぞれ採取した血液サンプルを示す。ここでは、ＴＨ株Ｅ２タンパク質を含むタグ化タンパク質One-StrEP-tag-THE2を抗原溶液の調製に用いた。
　図１Ａの「ＬＮ」及び「Ｓｐｌｅｅｎ」の結果に示すように、抗原免疫マウス由来組織片を移植したＳＣＩＤマウスでは、２度目の抗原投与（第２追加免疫）により血中抗体価の上昇が認められ、３度目の抗原投与（第３追加免疫）を行うことによって、さらに大きな抗体価の上昇が観察された。
　一方、「ＬＮ　ｃｅｌｌ」及び「Ｓｐｌｅｅｎ　ｃｅｌｌ」の結果に示すように、抗原免疫細胞を移入したＳＣＩＤマウスにおいても、２度目の抗原投与（第２追加免疫）により血中抗体価の上昇が認められ、３度目の抗原投与（第３追加免疫）を行うことによって、さらに大きな抗体価の上昇が観察された。しかし、組織片移植の場合と比較するとその程度は低く、組織片の腎皮膜下移植が有効であることが示された。
　以上より、抗原感作されたリンパ系細胞をＳＣＩＤマウスに移入して追加免疫を行うことにより、その抗原に対する血中抗体価を大幅に上昇させることができることが示された。このことは、標的抗原に対する抗原特異的抗体の産生をＳＣＩＤマウス中で効果的に誘導できたことを示している。
［実施例２］抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃマウス由来リンパ組織（リンパ節又は脾臓）片のＳＣＩＤマウスへの移植
　本実施例では、無処置マウスあるいは抗原免疫マウス由来のリンパ組織（リンパ節又は脾臓）を、ＳＣＩＤマウスに腎皮膜下（組織生着に適した場である）に移植することにより、抗原ＴＨ株Ｅ２タンパク質に対する抗原特異的抗体の産生を誘導した。
　具体的には、実施例１と同様の方法で、ＴＨ株Ｅ２タンパク質を含む抗原溶液を用いて免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから２回目の免疫の２週間後にリンパ節（表頸、上腕、腋窩、鼠蹊部）及び脾臓を採取し、それぞれ氷冷ＰＢＳ中に置いた。一方、無処置マウスは抗原免疫群と週齢を合わせたＢＡＬＢ／ｃマウスを用い、リンパ節（表頸、上腕、腋窩、鼠蹊部）及び脾臓を採取し、それぞれ氷冷ＰＢＳ中に置いた。
　８週齢の雌性ＳＣＩＤマウスをイソフルランによって麻酔し、背部をバリカンで毛剃りした。マウスを７０％エタノールで消毒後、片側臥位にし、左季肋部の皮を約１ｃｍ切開し、その真下の筋層も約１ｃｍ切開した。腎周辺の脂肪をピンセットで摘んで腎臓を体外に引き出した。マイクロピンセットを用いて腎皮膜を２－３ｍｍ程度破り、腎皮膜と腎臓との間に、上記で採取及び調製したリンパ組織片（リンパ節又は脾臓）を挿入した。腎臓を体内に戻し、筋層及び皮膚を縫合した。片腎につき２個、計４個の組織片（リンパ節又は脾臓のいずれか）を移植した。組織移植の２、１６、３０日後に、実施例１で調製したＴＨ株Ｅ２タンパク質溶液を、抗原量１０μｇ／ｈｅａｄとなる量でそのＳＣＩＤマウスの腹腔内に投与し、その各追加免疫の４日後に採血を行った。
　得られた血液サンプルについて、実施例１と同様に、ＥＬＩＳＡによって血中の抗原特異的抗体を定量した（図１Ｂ）。免疫に用いた抗原のものとは異なるタグを付加した組換えエンベロープタンパク質Ｅ２をイムノプレートに固相化し、これを用いて血液サンプル中の抗原（ＴＨ株エンベロープタンパク質Ｅ２）結合性抗体量を測定した。縦軸は４５０ｎｍでの吸光度を示す。丸印は個体値、棒印は平均値を示す。なお図１Ｂ中、「無処置ＬＮ」はナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス由来のリンパ節を移植した対照群、「無処置Ｓｐｌｅｅｎ」はナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓を移植した対照群である。「ｐｒｅ免疫ＬＮ」は、実施例２において標的抗原で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス由来のリンパ節を移植した実験群、「ｐｒｅ免疫Ｓｐｌｅｅｎ」は、実施例２において標的抗原で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓を移植した実験群である。「1st」「2nd」「3rd」は、ＳＣＩＤマウスでの第１～第３追加免疫の後にそれぞれ採取した血液サンプルを示す。ここでは、ＴＨ株Ｅ２タンパク質を含むタグ化タンパク質One-StrEP-tag-THE2を抗原溶液の調製に用いた。
　図１Ｂの「ｐｒｅ免疫ＬＮ」及び「ｐｒｅ免疫Ｓｐｌｅｅｎ」の結果に示すように、抗原免疫リンパ組織を移植したＳＣＩＤマウスでは、２度目の抗原投与（第２追加免疫）により抗原に対する血中抗体価の大幅な上昇が認められ、３度目の抗原投与（第３追加免疫）を行うことによって、さらに顕著に大きな抗体価上昇が観察された。一方、「無処置ＬＮ」及び「無処置Ｓｐｌｅｅｎ」の結果に示すように、抗原免疫を行っていないマウス由来のリンパ組織を移植した場合の抗体価の上昇は３度目の抗原投与（第３追加免疫）においても弱く、あらかじめ抗原免疫を行ったマウス由来のリンパ組織を移植することが効果的であることが示された。
［実施例３］抗原免疫粘膜リンパ組織のＳＣＩＤマウスへの移植
（１）　ＯＶＡ（卵白アルブミン）誘発アレルギーモデルマウスの作製
　ＯＶＡ溶液（ＳＩＧＭＡ社）とＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍ（ＰＩＥＲＣＥ社）を等量ずつ混和し、調製した溶液を１０μｇ／ｈｅａｄとなる量で８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）に１週おきに２回腹腔内投与した。続いてそのマウスに、ＯＶＡ溶液を１００μｇ／ｈｅａｄの量で３日連続、点鼻投与した。これにより、ＯＶＡ（オボアルブミン）誘発アレルギーモデルマウスが作製された。
（２）　ＯＶＡ誘発アレルギーモデルマウス由来ＮＡＬＴのＳＣＩＤマウスへの移植
　上記のとおり作製したＯＶＡ誘発アレルギーモデルマウスから、鼻粘膜リンパ組織（ＮＡＬＴ；Ｎａｓａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ）を採取し、氷冷ＰＢＳ中に置いた。８週齢の雌性ＳＣＩＤマウス（日本クレア）をイソフルランによって麻酔し、背部をバリカンで毛剃りした。７０％エタノールでマウスを消毒後、片側臥位にし、左季肋部の皮を約１ｃｍ切開し、その真下の筋層も約１ｃｍ切開した。腎周辺の脂肪をピンセットで摘んで腎臓を体外に引き出した。マイクロピンセットを用いて腎皮膜を２－３ｍｍ程度破り、腎皮膜と腎臓との間に、上記で採取したリンパ組織片（鼻粘膜リンパ組織）を挿入した。腎臓を体内に戻し、筋層及び皮膚を縫合した。片腎につき２個、計４個のリンパ組織片（鼻粘膜リンパ組織）を移植した。
　組織移植の２日後及び１６日後に、ＯＶＡ １００μｇ／ｈｅａｄを静脈内に投与し、その２度目の追加免疫の４日後に採血を行った。
　得られた血液サンプルについて、ＥＬＩＳＡによって血中のＯＶＡ特異的抗体価をアイソタイプ別に測定した。アイソタイプ別の抗体価測定はＯＶＡを固相化したＥＬＩＳＡによって行った。まず、イムノプレート（Ｎｕｎｃ社）にＯＶＡを５μｇ／ｗｅｌｌずつ添加し、４℃で一晩静置することによって固相化した。ブロッキング・ワン（ナカライテスク社）でブロッキングを行った後、血清希釈液を各ウェルに添加し、室温で１－２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／　ＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウス抗体（抗ＩｇＧ１，抗ＩｇＧ２ａ，抗ＩｇＡ，抗ｔｏｔａｌ　ＩｇＧ）を添加し、室温で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄後、ＴＭＢ基質（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン）を添加し、発色が適当になったところで２Ｎ硫酸を添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　また比較のため、免疫を行っていないＢＡＬＢ／ｃマウス（ナイーブ（ｎａｉｖｅ）マウス）の腋窩リンパ節を移植したＳＣＩＤマウスにおける血中のＯＶＡ特異的抗体価の測定も行った。
　組織移植の１６日後の追加免疫の後に採取した血液サンプルに関する測定結果を図２に示す。ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＭタイプの抗原特異的抗体価の上昇は観察されなかったのに対し、ＩｇＡタイプでは抗原特異的抗体の誘導が確認された。図２中の黒丸はＮＡＬＴを移植したＳＣＩＤマウス、白丸は免疫を行っていないＢＡＬＢ／ｃマウス由来腋窩リンパ節を移植したＳＣＩＤマウスの測定値を示している。図２ＡはＩｇＧ１、図２ＢはＩｇＧ２ａ、図２ＣはＩｇＭ、図２ＤはＩｇＡの結果を示す。縦軸は吸光度（４５０ｎｍ）、横軸は血清の希釈倍率を示す。
　さらに、アイソタイピングキット（ＰＩＥＲＣＥ社）を用い、キットのプロトコールに従って血清の評価を行った。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡのそれぞれに対する二次抗体を用いて血清中の各アイソタイプに対し吸光度測定し、得られた吸光度の合計値を１００として、各アイソタイプの吸光度からその割合（％）を算出した（図３）。その結果、ＯＶＡ誘発アレルギーモデルマウス由来ＮＡＬＴを移植したＳＣＩＤマウス（図中のＢ）では、血清中ＩｇＡ抗体の割合が、通常免疫を施した対照マウス（図中のＡ）と比較して、３倍以上高いことが示された（図３）。なお、図中のＡは、ＯＶＡ抗原をＡｌｕｍアジュバントと共にＢＡＬＢ／ｃマウスに４度投与（初回免疫＋３回の追加免疫）（通常免疫）した後に採取された血液サンプル（対照群）の結果を示す。図中のＢは、ＯＶＡ免疫アレルギーモデルマウス由来ＮＡＬＴを移植し追加免疫を行ったＳＣＩＤマウスからの血液サンプル（実験群）である。
　以上から、抗原免疫したＮＡＬＴ（鼻粘膜リンパ組織）をＳＣＩＤマウスに移植することによる本発明の方法で、ＩｇＡを選択的に強く誘導できることが示された。
［実施例４］ＮＡＬＴ移植ＳＣＩＤマウス由来リンパ細胞からのハイブリドーマの作製
　ＯＶＡ誘発アレルギーモデルマウス由来ＮＡＬＴを移植したＳＣＩＤマウスの脾臓から調製した脾細胞と、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０とを、常法により融合させ、融合細胞懸濁液を１００μＬ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。翌日、２倍濃度のＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン；インビトロジェン社）を含む培地ＲＰＭＩ　１６４０を各ウェルに１００μＬ加え、引き続き３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。５－１０日間培養し、各ウェルの培養上清に含まれる抗原（ＯＶＡ）結合性抗体をスクリーニングした。その結果、培養上清中にＩｇＡタイプのＯＶＡ結合性抗体（モノクローナル抗体）が検出された。
　このように、本発明の方法により、従来法では取得が困難であった抗原特異的ＩｇＡモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを容易に取得できることが示された。
［実施例５］抗原免疫リンパ組織移植ＳＣＩＤマウスの末梢リンパ組織中の細胞の解析
　ＮＰ－ＯＶＡを抗原として用いて、実施例２と同様にして作製した抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃマウス由来リンパ組織（リンパ節）を移植したＳＣＩＤマウスにおけるリンパ組織（リンパ節又は脾臓）中に存在する細胞の属性を、フローサイトメトリーを用いて解析した。
　抗原免疫リンパ節移植ＳＣＩＤマウスに、実施例２と同様にして、抗原を用いた３回の追加免疫を行った。３度目の追加免疫後にＳＣＩＤマウスからリンパ節（上腕、腋窩）及び脾臓を摘出した。そのリンパ節及び脾臓から細胞（リンパ節細胞、脾細胞）を単離し、トリス－塩化アンモニウム等張緩衝液（ＡＣＴ溶液）で処理することによって赤血球を除去した後、Ｆｃブロック液（抗ＣＤ１６抗体及び抗ＣＤ３２抗体；Mouse BD Fc Block（商標）、BD Pharmingen社））に懸濁し、４℃で２０分間インキュベートした。１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で細胞を洗浄後、蛍光標識した各種抗体（抗ＣＤ３抗体／抗Ｂ２２０抗体、抗ＣＤ４抗体／抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４抗体／抗ＣＤ４４抗体／抗ＣＤ６２Ｌ抗体；ＢＤ社）を添加して４℃で３０分間反応させた。１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄後、フローサイトメトリーにて解析を行った。フローサイトメトリーを用いて測定した各細胞群のドットプロットを図４に示す。
　抗原免疫リンパ節移植ＳＣＩＤマウスのリンパ節及び脾臓から調製した細胞群では、抗ＣＤ３抗体で検出されるＴ細胞、及び抗Ｂ２２０抗体で検出されるＢ細胞の存在が確認された。さらに詳しく解析した結果、リンパ節及び脾臓のいずれにおいても、ＣＤ４＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ、ＣＤ４４ｈｉｇｈ画分に分類されるメモリーＴ細胞が、高率で存在していることが示された（図４のＩ、Ｌ）。ＳＣＩＤマウスの脾臓からの細胞群ではＣＤ４＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ、ＣＤ４４ｈｉｇｈ画分の細胞が９０．０９％、ＳＣＩＤマウスのリンパ節からの細胞群では同画分の細胞が６０．５３％であった。
　一方、抗原ＮＰ－ＯＶＡで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓及びリンパ節の細胞群では、ＣＤ４＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ、ＣＤ４４ｈｉｇｈ画分の細胞は脾臓で３０．７５％、リンパ節で１７．２４％であった。
　この結果から、抗原免疫リンパ組織をＳＣＩＤマウスに移植することにより、ＳＣＩＤマウスの脾臓及びリンパ節中のメモリーＴ細胞が顕著に増加したことが示された。メモリーＴ細胞は、再び同じ抗原に出会った際の速やかな免疫反応の誘導に関与していることが知られている。したがって、抗原免疫リンパ組織移植ＳＣＩＤマウスで追加免疫（ブースト）により強い抗体誘導が起こった理由の１つとして、ＳＣＩＤマウスのリンパ組織でメモリーＴ細胞が大幅に増加したことが考えられた。
［実施例６］抗原免疫リンパ節移植ＳＣＩＤマウス由来脾細胞からのハイブリドーマ作製
　マウス骨髄腫（ミエローマ）細胞株ＳＰ２／０を、血清を含まないＲＰＭＩ　１６４０培地にて２回洗浄した。
　次に実施例２で作製した抗原ＴＨ株Ｅ２タンパク質で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスのリンパ節を移植したＳＣＩＤマウスより脾細胞を採取及び調製し、血清を含まないＲＰＭＩ　１６４０培地にて３回洗浄した。
　上記のＳＰ２／０細胞とマウス脾細胞とを１：５の比率になるように混和し、１２００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を完全に吸引して除去した後、チューブをタッピングしてペレットをほぐした。細胞融合のため、細胞に３７℃にて温めておいたＰＥＧ１５００（ロシュ社）１ｍＬを添加し、続いて９ｍＬの血清不含ＲＰＭＩ　１６４０培地を加えて希釈した。希釈液中の細胞を１２００ｒｐｍで３分間遠心して回収し、脾細胞が１ｘ１０７個／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ　１６４０培地（１５％ＦＢＳ、１０％ＢＭコンディムド（Ｃｏｎｄｉｍｅｄ）Ｈ１（ロシュ社）を含む）に懸濁した。この細胞懸濁液を１００μＬ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。翌日、２倍濃度のＨＡＴ（インビトロジェン社）を含むＲＰＭＩ　１６４０を各ウェルに１００μＬ加え、引き続き３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。５－１０日間培養し、各ウェルの培養上清を回収した。
　ハイブリドーマ培養上清中に含まれる抗原（ＴＨ株Ｅ２タンパク質）結合性抗体の有無は、ＥＬＩＳＡ法により以下のようにしてスクリーニングした。まず、イムノプレート（Ｎｕｎｃ社）に抗原を５０ｎｇ／ｗｅｌｌずつ添加し、４℃で一晩静置することによって固相化した。ブロッキング・ワン（ナカライテスク社）でブロッキングを行った後、ハイブリドーマの培養上清を各ウェルに添加し、室温で１－２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を添加し、室温で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄後、ＴＭＢ基質（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン）を添加し、発色が適当になったところで２Ｎ硫酸を添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図５に示す。
　抗原免疫リンパ節移植ＳＣＩＤマウス由来脾細胞からのハイブリドーマ作製では、ほぼ全てのクローンが、その培養上清について強い陽性反応（吸光度０．５以上）を示した（図５Ａ）。通常免疫法により免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞からのハイブリドーマ作製（対照群）の結果（図５Ｂ）と比較すると、その違いは顕著であった。図５中の各枠は、ＥＬＩＳＡ法による各クローンの吸光度測定値を示す。この結果は、本発明の方法により、標的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを非常に効率良く作製できることを示した。図５Ａは、Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質（ＴＨ株Ｅ２タンパク質）を抗原として免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスのリンパ節を移植したＳＣＩＤマウスの脾臓由来の脾細胞より作製したハイブリドーマに関する検出結果である。図５Ｂは、通常免疫法により免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓由来の脾細胞より作製したハイブリドーマに関する検出結果である。陽性反応を吸光度０．３以上とし、０．５以上をより強い陽性反応とした。陽性反応クローンの枠には影をつけて示した。
［実施例７］抗原ＴＨ株Ｅ２タンパク質に対するモノクローナル抗体を含むハイブリドーマ培養上清によるＨＣＶ感染阻害評価
　実施例６と同様にして作製した抗原免疫リンパ組織移植ＳＣＩＤマウス由来脾細胞から作製されたハイブリドーマにより産生された抗原特異的モノクローナル抗体について、その抗原ＴＨ株Ｅ２タンパク質を表面に有するＨＣＶ粒子の細胞感染を阻害する活性を有するかどうかを評価した。
（１）　感染性ＨＣＶ様粒子（ＨＣＶｐｐ）の作製
　ＨＣＶ感染を引き起こすために用いる感染性ＨＣＶ様粒子（ＨＣＶｐｐ）の作製は、Bartoschらの方法に準じて行った（文献：Ｂａｒｔｏｓｃｈ，　Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．（２００３）　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．，　１９７，　６３３－６４２）。この方法では、レトロウイルス融合タンパク質Ｇａｇ－ｐｏｌを発現するベクター、ＨＣＶエンベロープタンパク質を発現するベクター、レポーター遺伝子を発現するレトロウイルスパッケージングベクターの３種類のベクターを動物細胞で共発現させることにより、レポーター遺伝子がパッケージングされており、ＨＣＶエンベロープタンパク質をそのウイルスの表面に発現するシュード（偽）ウイルス粒子を作製することができる。
　遺伝子型１ｂのエンベロープタンパク質をもつＨＣＶｐｐを作製するために、ＨＣＶ構造タンパク質発現ベクターとして組換えプラスミドｐｃＤＮＡ　ＴＨｄＣ－Ｅ２を使用した。この組換えプラスミドは、遺伝子型１ｂのＨＣＶ株であるＴＨ株のポリプロテイン（Wakita, T. et al., J. Biol. Chem., 269, p.14205-14210 (1994)）のＮ末端から１３２番のアミノ酸残基から７４７番のアミノ酸残基まで（コアの一部、Ｅ１、Ｅ２タンパク質）をコードする核酸を、ｐｃＤＮＡ３．１にクローン化した発現ベクターである。
　Ｇａｇ－ｐｏｌ発現ベクターとしては、マウス白血病ウイルス（Murine leukemia virus；MLV）のｇａｇとｐｏｌをコードする遺伝子をクローン化した発現ベクターＧａｇ－Ｐｏｌ　５３４９を使用した。レポーター遺伝子発現ベクターとしては、ルシフェラーゼ遺伝子をクローン化したレトロウイルスパッケージングベクターＬｕｃ１２６を用いた。
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％　ＦＣＳ－ＤＭＥＭ培地（以下、ＤＭＥＭ－１０Ｆと記載）にて継代培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２．５×１０６細胞／ディッシュとなるように、コラーゲンコートした１０ｃｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ社）に播種し、一晩培養した。所定量のＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｄｉｂｃｏ社）及び３種類の上記発現ベクター（ｐｃＤＮＡ　ＴＨｄＣ－Ｅ２、Ｇａｇ－Ｐｏｌ　５３４９及びＬｕｃ１２６）を混合し、室温で２０分インキュベートした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培地をＯｐｔｉ－ＭＥＭ　９ｍＬに交換し、ここに上記で調製したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と３種類のＤＮＡ（発現ベクター）からなる複合体を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。反応終了後、ＰＢＳで一回洗浄し、ＤＭＥＭ－１０Ｆ　８ｍＬを添加して３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。培養終了後、上清を回収し、０．２２μｍフィルターで濾過したものをＨＣＶｐｐ溶液とした。ＨＣＶｐｐ溶液は１ｍＬずつ分注し、－８０℃にて保存した。
　このようにして得られた、遺伝子型１ｂのＴＨ株の構造タンパク質をもつシュードＨＣＶ粒子（ＨＣＶｐｐ）をＴＨ　ＨＣＶｐｐと呼称する。
（２）感染阻害活性の測定
　（１）で作製したＴＨ　ＨＣＶｐｐを用いた細胞感染系で、実施例６と同様にして抗原免疫リンパ組織移植ＳＣＩＤマウス由来脾細胞から作製されたハイブリドーマの培養上清中に含まれる抗体のＨＣＶ感染阻害活性を測定した。
　具体的には、上記（１）で得たＴＨ　ＨＣＶｐｐ溶液に、採取したハイブリドーマ培養上清を等量加え、３７℃で３０分インキュベーションした。このようにして処理したウイルス液を、前日に４８穴プレート中で２ｘ１０４細胞／ウェルで培養しておいたＨｕｈ７細胞（培養培地は廃棄）に、１００μｌ／ウェルで加えて、３７℃で３時間インキュベーションした。次いで、加えたウイルス液を捨てた後、Ｈｕｈ７細胞をＰＢＳで１回洗浄し、５００μｌ／ウェルの培養培地を加えて３７℃で７２時間インキュベーションした。培地を捨て、ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞溶解液ＣＣＬＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を加えて細胞を溶解し、遠心分離により細胞塊を除去し、その上清をサンプルとした。サンプル２０μｌとルシフェリン基質溶液５０μｌを混和し、直ちに発光強度を測定した。ＨＣＶ粒子が細胞に感染した場合、ＨＣＶｐｐ粒子に導入したルシフェラーゼ遺伝子が細胞内で発現し、その活性により蛍光が検出されることになる。一方、対照実験として、ハイブリドーマ培養上清に代えて培地ＲＰＭＩ　１６４０を、ＴＨ　ＨＣＶｐｐと混合して同様に発光強度の測定を行った。対照実験の測定値（対照）を１００％感染率として、ハイブリドーマ培養上清とＴＨ　ＨＣＶｐｐを混合した場合の測定値を、相対的な感染率（％）で表した。すなわち、感染率が低いほど、用いたハイブリドーマ培養上清に含まれるモノクローナル抗体のＨＣＶ感染阻害活性が高いことを示す。
　その結果、図６に示すように、試験したハイブリドーマ培養上清の感染率は、培地と比較して50%であることから、ハイブリドーマ培養上清にはHCVppの感染を阻害する活性があることが示された。なお図６中、「sup.」は各ハイブリドーマクローンの培養上清サンプルである。「no env.」はＨＣＶのエンベロープタンパク質を持たないレトロウイルス粒子である。
　以上の結果から、本発明の方法により、抗原を認識でき抗原に対する活性阻害能を有するモノクローナル抗体（いわゆる中和抗体）を効率良く作製できることが示された。
［実施例８］インフルエンザウイルスタンパク質に対するＩｇＡ抗体の作製
（１）不活化インフルエンザウイルスによる免疫
　８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）を「通常免疫群」と「二次リンパ組織移植群」の２群に分けて、不活化したＰＲ８株（Ｈ１Ｎ１亜型）のインフルエンザウイルス粒子（北海道大学人獣共通感染症リサーチセンターより分与されたウイルスをニワトリ卵にて増殖させ不活化した）を１００μｇ経鼻投与（免疫）した。不活化インフルエンザウイルス粒子（ＰＲ８株）は、ＰＢＳで希釈し、１００μｇ／１０μＬとして使用した。経鼻投与は、ピペットマンを用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻より１０μＬを投与することにより行った。
　２か月後、「二次リンパ組織移植群」の免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓及び縦隔リンパ節を採取した。脾臓は３ｍｍ四方程度（厚みは２～３ｍｍ程度）に切り、縦隔リンパ節はハサミで切りこみを入れ、移植に使用した。麻酔下で８週齢の雌性ＳＣＩＤマウス（日本クレア）の腎皮膜下に、採取した脾臓又は縦隔リンパ節を移植した（腎臓１つに対し、２つの組織断片を移植）。すなわちＳＣＩＤマウス１匹あたり、脾臓断片４つ又は縦隔リンパ節４つを移植した。移植から４日後、ＳＣＩＤマウスに不活化インフルエンザウイルス粒子（ＰＲ８株）１００μｇを尾静脈より投与した（追加免疫）。２週間後及びさらにその２週間後に不活化インフルエンザウイルス粒子（ＰＲ８株）１００μｇをＳＣＩＤマウスに尾静脈より投与した（追加免疫）。最終追加免疫から４日後に、ＳＣＩＤマウスから心採血によって血液を採取し、血清を調製した。
　「通常免疫群」も同じスケジュールで不活化インフルエンザウイルス粒子（ＰＲ８株）１００μｇをＢＡＬＢ／ｃマウスに尾静脈より投与（追加免疫）し、最終追加免疫から４日後に、ＢＡＬＢ／ｃマウスから心採血によって血液を採取し、血清を調製した。「通常免疫群」と「二次リンパ組織移植群」の免疫スケジュールを図７に示した。図７Ａの「通常免疫群」では、不活化インフルエンザウイルス粒子（ＰＲ８株）をＢＡＬＢ／ｃマウスに経鼻投与後、同ウイルスを３回静脈内投与にて追加免疫するスケジュールで免疫した。図７Ｂの「２次リンパ組織移植群」では、不活化インフルエンザウイルス粒子（ＰＲ８株）をＢＡＬＢ／ｃマウスに経鼻投与後、ＢＡＬＢ／ｃマウスから二次リンパ組織を採取し、ＳＣＩＤマウスの腎皮膜下に該組織を移植後、同ウイルスをＳＣＩＤマウスに３回静脈内投与にて追加免疫するスケジュールで免疫した。
　（２）ＥＬＩＳＡによる血清中の抗体価の評価
　図７に示したスケジュールにより不活化インフルエンザウイルス粒子（ＰＲ８株）で免疫したマウス及び、対照として無処置マウス（免疫を行っていないＢＡＬＢ／ｃマウス（ナイーブ））の血清中の抗体価の測定を行った。
　インフルエンザウイルス粒子（ＰＲ８株）のウイルス破砕液をＰＢＳで希釈調製し、イムノプレート（Ｎｕｎｃ社；ＭａｘＳｏｒｐ）に５０μＬ／ウェルを分注し、４℃で一晩、固相化した。固相化プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで、室温にて１時間ブロッキングした。ブロッキング液を除き、同様にプレートを３回洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈した各マウスの血清を加え、室温にて１時間反応させた。なお、ＩｇＧを測定する場合は血清を２４，３００倍、ＩｇＡを測定する場合は血清を１０，０００倍に希釈したものを用いた。その後、プレートから血清を除去し、同様に５回洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈した検出用抗体を加え、室温にて１時間反応させた。検出用抗体には、ＨＲＰ－ヤギ抗マウスＩｇＧ又はＨＲＰ－ヤギ抗マウスＩｇＡ（いずれもＺｙｍｅｄ社）を用いた。反応後、プレートから検出用抗体を除去し、同様に８回洗浄後、Ｓｕｒｅ　Ｂｌｕｅ／ＴＭＢ（ＫＰＬ社）を１００μＬ加え、５～１５分後に、２Ｎ硫酸を５０μＬ加え、反応を停止させた。プレートリーダー（ｉＭａｒｋ；ＢＩＯＲＡＤ社）を用いて吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。
　その結果を図８に示す。通常免疫群（レーン２）、二次リンパ組織移植群（脾臓移植）（レーン３）及び二次リンパ組織移植群（縦隔リンパ節移植）（レーン４）のいずれの免疫方法でも、インフルエンザウイルス（ＰＲ８株）タンパク質に対する特異的なＩｇＧの誘導が確認された（図８Ａ）。一方、インフルエンザウイルス（ＰＲ８株）タンパク質に対する特異的なＩｇＡの誘導は、縦隔リンパ節移植の場合（レーン４）に著しく高値であった（図８Ｂ）。
　なお図８ＡはＰＲ８特異的ＩｇＧ、図８ＢはＰＲ８特異的ＩｇＡの結果を示す。縦軸は吸光度（４５０ｎｍ）を示す。ＩｇＧを測定するときは各マウスの血清を２４，３００倍に、ＩｇＡを測定するときは各マウスの血清を１０，０００倍に希釈して測定した。レーン１：無処置マウス（ナイーブ）、レーン２：通常免疫群、レーン３：二次リンパ組織移植群（脾臓移植）、レーン４：二次リンパ組織移植群（縦隔リンパ節移植）。
　（３）ウエスタンブロットによるインフルエンザウイルスＨＡ抗原に対する抗体の検出
　次に各免疫マウスの血清中のインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）抗原に対する抗体を検出するために、ウエスタンブロットを行った。
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ｃｍディッシュあたり６×１０５個で播種し、１８時間培養した。インフルエンザウイルス（ＰＲ８株）のＨＡ遺伝子をクローン化した動物細胞発現ベクターｐＣＡＧ－ＰＲ８（ＨＡ１）、又はＨ３Ｎ２亜型Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子をクローン化した動物細胞発現ベクターｐＣＡＧ－Ａｉｃｈｉ（ＨＡ３）を、それぞれ２μｇ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、添付書に従って、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にそれぞれ導入した。なお、これらの発現ベクターは、ＣＡＧプロモーターの制御下にＨＡ遺伝子を発現するベクターであり、北海道大学人獣共通感染症リサーチセンターより入手した。　
　遺伝子導入２日後に各細胞を回収し、細胞溶解液を調製した（ｐＣＡＧ－ＰＲ８（ＨＡ１）導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びｐＣＡＧ－Ａｉｃｈｉ（ＨＡ３）導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）。同様に、対照として、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞溶解液を調製した。細胞溶解液のタンパク質量を測定し、各２０μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥにて電気泳動した。その電気泳動産物をニトロセルロース膜に転写し、定法に従って、ウエスタンブロットを行った。
　インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質が転写されたニトロセルロース膜にそれぞれ２０００倍に希釈した３種類のマウス血清（通常免疫群、二次リンパ組織移植群（脾臓移植）及び二次リンパ組織移植群（縦隔リンパ節移植））を加え、室温にて反応させた。１時間後、血清を除去し、ニトロセルロース膜を洗浄後、ＨＲＰ－ヤギ抗マウスＩｇＧ又はＨＲＰ－ヤギ抗マウスＩｇＡを加え、室温にて１時間反応させた。検出用抗体を除去、ニトロセルロース膜を洗浄し、ウェスタンブロッティング検出試薬ＥＣＬ（ＧＥヘルスケア・ジャパン）にて検出した（図９）。
　なお図９Ａは通常免疫群、図９Ｂは二次リンパ組織移植群（脾臓移植）、図９Ｃは二次リンパ組織移植群（縦隔リンパ節移植）を示す。レーン１はＨＥＫ２９３Ｔ細胞、レーン２はｐＣＡＧ－ＰＲ８（ＨＡ１）導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、レーン３はｐＣＡＧ－Ａｉｃｈｉ（ＨＡ３）導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示す。図９はインフルエンザウイルスＨＡタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ｐＣＡＧ－ＰＲ８（ＨＡ１）導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びｐＣＡＧ－Ａｉｃｈｉ（ＨＡ３）導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）の細胞溶解液を電気泳動し、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質をニトロセルロース膜に転写後、２，０００倍に希釈した各マウス血清を反応させ、インフルエンザウイルスＨＡ抗原に結合した抗体がＩｇＧであるかＩｇＡであるかをＥＣＬ法にて検出した結果を示している。
　その結果、通常免疫群及び二次リンパ組織移植群（脾臓移植）では、インフルエンザウイルス（ＰＲ８株）のＨＡタンパク質を認識するＩｇＧのみが検出されたのに対し、二次リンパ組織移植群（縦隔リンパ節移植）では、インフルエンザウイルス（ＰＲ８株）のＨＡタンパク質を認識するＩｇＧ及びＩｇＡが検出された。
　以上から、縦隔リンパ節を移植したＳＣＩＤマウスでＩｇＡが有意に誘導されることが示され、本発明の方法は抗原特異的ＩｇＡ抗体を効果的に誘導する方法であることが確認された。
　本発明の方法は、抗原特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを高効率に作製することができることから、抗原特異的モノクローナル抗体、特に、従来技術では取得困難であったＩｇＡモノクローナル抗体を効率的に取得するために有利に利用することができる。本発明の方法を用いれば、免疫不全非ヒト動物に移植した、リンパ組織に含まれる抗原感作リンパ系細胞を、選択的に増幅させることができる。また、従来の方法では特に取得が困難であった、免疫原性が低い抗原に対する抗原特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ、特に、ＩｇＡモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの取得も本発明によれば容易となる。抗体産生ハイブリドーマから得られる抗原特異的モノクローナル抗体は、抗体医薬、診断用抗体、及び研究用抗体等として有利に使用できる。

Claims (10)

  1. 　非免疫不全の非ヒト動物に抗原を投与して免疫する非ヒト動物免疫工程と、
    　前記免疫工程で免疫した前記非ヒト動物から二次リンパ組織又は二次リンパ組織細胞を採取し、該二次リンパ組織又は該二次リンパ組織細胞を免疫不全非ヒト動物に移植する移植工程と、
    　前記移植工程で移植を行った免疫不全非ヒト動物に、前記抗原を投与して免疫する免疫不全非ヒト動物免疫工程と、
    　前記免疫不全非ヒト動物免疫工程で免疫した免疫不全非ヒト動物から、脾細胞又はリンパ節細胞を取得する取得工程と、
    　前記取得工程で取得した脾細胞又はリンパ節細胞をミエローマ細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを作製するハイブリドーマ作製工程と、
    を備える、抗原特異的抗体産生ハイブリドーマを作製する方法。
  2. 　前記移植工程において二次リンパ組織を免疫不全非ヒト動物に移植する、請求項１記載の方法。
  3. 　前記二次リンパ組織又は前記二次リンパ組織細胞は、粘膜関連リンパ組織又は粘膜関連リンパ組織細胞である、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　前記二次リンパ組織又は前記二次リンパ組織細胞は、脾臓又は脾細胞である、請求項１又は２記載の方法。
  5. 　前記二次リンパ組織又は前記二次リンパ組織細胞は、リンパ節又はリンパ節細胞である請求項１又は２記載の方法。
  6. 　抗原特異的ＩｇＡ抗体産生ハイブリドーマを作製するための、請求項３記載の方法。
  7. 　前記非ヒト動物及び／又は免疫不全非ヒト動物は、げっ歯動物である、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
  8. 　請求項１～７のいずれか一項記載の方法を用いて抗原特異的抗体産生ハイブリドーマを作製し、該抗原特異的抗体産生ハイブリドーマの培養上清から抗原特異的モノクローナル抗体を採取する工程を含む、抗原特異的モノクローナル抗体の製造方法。
  9. 　前記抗原は、ウイルスタンパク質である、請求項１～８のいずれか一項記載の方法。
  10. 　前記ウイルスタンパク質は、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質又はインフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質である、請求項９記載の方法。
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