WO2012059612A1 - Derivados de pequeños arn de interferencia y su uso - Google Patents

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WO2012059612A1
WO2012059612A1 PCT/ES2011/070740 ES2011070740W WO2012059612A1 WO 2012059612 A1 WO2012059612 A1 WO 2012059612A1 ES 2011070740 W ES2011070740 W ES 2011070740W WO 2012059612 A1 WO2012059612 A1 WO 2012059612A1
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prna
chain
atoms
tnf
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PCT/ES2011/070740
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Sandra Milena Ocampo
Ramón ERITJA CASADELLÁ
Carolina Romero Prada
Juan Francisco BURGUEÑO BANÚS
Ester Fernández Gimeno
José Carlos PERALES
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
Universidad Autónoma De Barcelona
Universidad De Barcelona
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    • C12N2310/34Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end

Definitions

  • the present invention belongs to the field of Biotechnology.
  • the present invention relates to new small chemically modified RNA interference (pRNA) at the ends of the accompanying chain and their use in the treatment of diseases.
  • pRNA small chemically modified RNA interference
  • RNA interference is a process of post-transcriptional and sequence-specific gene synergy, which employs double-stranded RNA. After the discovery of this phenomenon in plants in the early 1990s, Andy Fire and Craig Mello demonstrated that a double stranded RNA was able to inhibit gene expression specifically and selectively in Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1998 Nature , 391 (6669) 806-1 1).
  • the sequence of the accompanying chain coincides with the corresponding region of the target messenger RNA (mRNA).
  • mRNA target messenger RNA
  • the guide chain or leader is complementary to this mRNA.
  • the double strand of RNA is several orders of magnitude more efficient than the leader strand alone in silencing gene expression by inducing mRNA degradation.
  • RNA interference process begins when the DICER enzyme finds a double-stranded RNA and cuts it into the so-called small interfering RNAs (pRNA) from about 20 nucleotides.
  • pRNA small interfering RNAs
  • the cells have a machinery called RISC (from the English "RNA-induced silencing comple '), to which the guide chain is incorporated.
  • Patent effect WO2007051303 describes the effect of some chemical modifications on the pRNA molecules that decrease the immunological response.
  • the mentioned modifications are found in both chains and are the following: 2'-0-methyl, 2'-deoxy-2'-fluoro, 2'-deoxy and 2'-0- (2-methoxy ethyl).
  • Other more complex modifications are described in WO2006020768.
  • Van Aerschot et al Bull. Soc. Chim. Belg. 104, n s 12, pp 717-720, 1995 a solid carrier functionalized with propand ⁇ ol is used for DNA synthesis in order to increase resistance to degradation by 3'-exonucleases.
  • TNF- ⁇ has a central role in the inflammatory process due to its ability to increase its own expression while increasing the expression of other pro-inflammatory molecules.
  • Serums and intestinal mucous membranes of patients with inflamed bowel disease show high levels of TNF- ⁇ and high amounts of TNF- ⁇ have been detected in models of inflamed bowel disease such as animal models of colitis.
  • the inhibition of TNF-a through antibodies, soluble receptors or inhibitors of phosphodiester IV, such as rolipram has improved significantly or even prevented inflammation in these animal models.
  • side effects have been described, such as an increase in vulnerability to intracellular pathogens or autoimmune reactions. In order to reduce side effects, it is convenient to increase the selectivity of the organ to which the treatment is directed.
  • patent application WO2006097768 describes the use of pRNA capable of inhibiting the expression of IL-12 for the treatment of intestinal diseases and their administration by intrarectal route
  • application WO0020645 describes antisense oligonucleotides to inhibit TNF expression - ⁇ .
  • these requests do not refer to possible chemical modifications for the reduction of the nonspecific immune response.
  • Dr. Ramratnam's group uses unmodified pRNA (Zhang et al. Mol. Ther. 2006, 14: 336-42) and demonstrates that these pRNAs can decrease TNF- ⁇ mRNA levels and improve their histological profile but not the clinical development of the disease.
  • the present invention relates to compounds derived from small interfering RNA (pRNA) based on the chemical modifications 2'-0-methyl and on the binding of a small polar alkyl molecule, which confer surprisingly advantageous properties to silence the RNA duplex gene expression without causing inflammatory side effects.
  • pRNAs of the invention are capable of inhibiting the expression of tumor necrosis factor alpha (TNF- ⁇ ) without causing side effects of stimulating the immune response and improving clinical outcomes in a colitis model. That the chemical modifications 2'-0-methyl in a pRNA decrease the immune response and inflammation, is something already described in patent application WO2007051303.
  • the pRNA derivatives of the invention modified with a small polar alkyl molecule in addition to the 2'-0-methyl modifications, have a surprisingly much more beneficial effect in inhibiting gene expression without causing stimulation of the immune response.
  • These two modifications of the pRNA 2-O-methyl and union of a small alkyl molecule, when performed separately achieve much less effective effects.
  • the effect achieved by combining these two modifications is much greater than the sum of the individual effects, that is, it has a beneficial and unexpected synergistic effect.
  • the compounds of the present invention increase the inhibitory efficacy of TNF- ⁇ in cell cultures and in animals.
  • these modifications introduced in the pRNAs reduce non-specific immune stimulation in human PBMC cells, thereby improving the pharmacological profile.
  • the present invention also relates to a composition comprising said modified pRNAs, as well as to the use of pRNAs or said composition for the preparation of a medicament.
  • a first aspect of the present invention relates to a compound (hereinafter called the compound of the invention) of the formula pRNA-POR
  • pRNA is a small interference RNA comprising at least a 2'-0 modification -methyl
  • ii) -PO- represents a phosphodiester bond linking R to the 3 'terminal position of any of the pRNA chains
  • R is a radical selected from: a CiC 6 alkyl substituted with at least one -OH group; a C 4 -C-6 cycloalkyl substituted with at least one -OH group; a C 4 -Ce heterocycloalkyl; a heteroaquichemical chain of between 2 and 7 atoms, where at least one of the atoms in the chain is an oxygen atom or a sulfur atom, preferably the chain is substituted with at least one -OH group; and a heteroaryl in which the ring is formed between 3 and 6 atoms and at least one of
  • small interference RNA or pRNA in the present description is indistinct to the term siRNA (from the English "small interfering RNA").
  • a pRNA is a double stranded RNA that comprises two elements: (a) a guide chain, also known as a leader chain or antisense chain, that hybridizes with (b) an accompanying chain, also known as a sense chain.
  • the guide, leader or antisense chain is responsible for the ability of this molecule to interfere with the expression of the messenger RNA (mRNA) target of silencing. Said hybrid guide chain with said mRNA, finally causing its processing and thus reducing the translation of the mRNA into protein.
  • mRNA messenger RNA
  • a pRNA is composed of chained ribonucleotides, but may also have some deoxyribonucleotide.
  • a 2'-O-methyl modification in a nucleotide is the binding of an oxymethyl group at the 2 'position of the nucleotide, that is, in the second carbon of the pentose.
  • the 3 'position is obviously the 3' position of the terminal nucleotide, located at the 3 'end of either of the two pRNA chains, since in the other nucleotides, the 3 'position is occupied in the binding to the next nucleotide of the chain by means of a phosphodiester bond.
  • An -OH group is a free hydroxyl group.
  • the phosphodiester bond can be such a bond or any other that fulfills the same function, although preferably it is a phosphodiester bond.
  • the compound of the invention is anti-inflammatory.
  • the pRNA guide chain of the compound of the invention totally or partially inhibits or silences the expression of a pro-inflammatory molecule.
  • inhibitor or silence refers to the decrease in gene expression that occurs when the pRNA specifically hybridizes with the mRNA to which it is directed and induces its degradation. It is said that gene expression is inhibited or silenced when the amount of mRNA of a given gene decreases or disappears with respect to the original starting levels.
  • the amount or levels of mRNA can be determined by multiple techniques known to those skilled in the art, such as, but not limited to, polymerase chain reaction (PCR) or other hybridization techniques with specific probes.
  • proinflammatory molecules are understood as those molecules that participate in inflammation, promoting said process.
  • proinflammatory molecules include interleukin 1 (IL-1), interleukin 8 (IL-8), prostaglandins, nitric oxide, ⁇ interferon and tumor necrosis factor (TNF).
  • pro-inflammatory enzymes such as phospholipase type II or PLA 2 , the Cyclooxygenase 2 (COX-2) or inducible nitric oxide synthase ( ⁇ NOS), which activate the synthesis of platelet activating factor, leukotrienes, prostanoids or nitric oxide.
  • the pRNA guide chain inhibits or silences, in whole or in part, the expression of at least one of the genes on the list comprising: tumor necrosis factor alpha (TNF-a), IL -1 beta, IL-6 and IL-8.
  • TNF-a tumor necrosis factor alpha
  • IL-1 beta IL-1 beta
  • IL-6 IL-6
  • IL-8 tumor necrosis factor alpha
  • the pRNA guide chain of the compound of the invention totally or partially inhibits or silences the expression of the TNF- ⁇ gene or that of the IL-1 beta gene. More preferably, the pRNA guide chain of the compound of the invention totally or partially inhibits or silences the expression of the TNF-a gene.
  • Tumor necrosis factor or TNF- ⁇ ⁇ tumor necrosis factor alpha is the first member of the TNF superfamily, to which some cytokines involved in the acute phase of the inflammatory process belong.
  • the members of this superfamily have a common phylogenetic origin and most also have a common function: they promote apoptosis and the activation of the transcription factor NF-KB.
  • R is a d-C 6 alkyl substituted with at least one free hydroxyl group.
  • R is a C 2 -C 4 alkyl substituted with one or two free hydroxyl groups.
  • R is ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl or terbutyl.
  • the phosphodiester bond binds a molecule of 1,2-propanediol or 1,3-propanediol, preferably 1, 3-propanediol, to the 3 'position of any of the pRNA chains.
  • R is a C 4 -C 6 cycloalkyl substituted with at least one free hydroxyl group.
  • R is cyclobutyl, cyclopentyl or cyclohexyl where R is substituted with one or two free hydroxyl groups.
  • the phosphodiester bond binds a 4-cyclohexandiol molecule to the 3 'position of any of the pRNA chains.
  • R is a C4-C6 heterocycloalkyl, preferably substituted with at least one free hydroxyl group.
  • R is an oxetanyls (C 4 ), aziridinyls (C 3 ), azetidinyls (C), tetrahydrofuranyls (C 5 ), pyrrolidinyls (C5), morpholinyl (C 6 ), dithynyls (C 6 ), thiomorpholinyl (C 6 ) , piperidinyls (C 6 ), tetrahydropyranyls (C 6 ), piperazinyls (C 6 ) or trityanils (Ce).
  • R is 4-methylpiperazinyl, 3-methyl-4- methylpiperazine, 4-dimethylaminopiperidinyl, 4-methylaminopiperidinyl, 4- aminopiperidinyl, 3-dimethylaminopypiperidinyl, 3-methylaminopiperidinyl, 3- ainopiidi-3-hydroxy-2-dimethyl-3-hydroxy-3-nipropyl-3-yl-nipropyl-3-yl-Nipropyl-3-yl-nipropyl-3-yl-nipropyl-3-yl-nipropyl-3-yl-nipropyl-4-Methylpipethyl ester -hydroxypiperidinyl, 4-methylpiperidinyl, 3-methylpiperidinyl, 3-dimethylaminopyrrolidinyl, 3- methyl amino pyrrolidinyl, 3-aminopyrrolidinyl or methylmorpholinyl.
  • R is a heteroalkyl chain of between 2 and 7 atoms, where at least one of the atoms in the chain is an oxygen atom or a sulfur atom, preferably the chain is substituted with at less a free hydroxyl group.
  • R is a heteroalkyl chain of between 4 and 6 atoms where at least one of the atoms in the chain is an oxygen atom or a sulfur atom, preferably the chain is substituted with at least one free hydroxyl group.
  • the phosphodiester bond binds a diethylene glycol or diethylene glycol thioether molecule to the 3 'position of any of the pRNA chains.
  • R is a heteroaryl formed by between 3 and 6 atoms and at least one of those atoms is an atom of oxygen
  • R is thienyl, furanyl, pyrrolyl, oxazolyl, thiazolyl or imidazolyl.
  • R is substituted with two or three hydroxyl groups.
  • R is selected from the list comprising: 1,2-propanediol, 1,3-propanediol, 3-amino-1, 2-propanediol, 2,2-dimethyl-1,3-propanediol, glycerol, ethylene glycol, diethylene glycol , diethylene glycolthioether, 1,6-hexanediol, cyclohexandiol.
  • R is linked through a phosphodiester bond to the 3 'terminal position of the accompanying chain.
  • Modifications of the pRNA of the compound of the invention can be carried out according to any of the methods known to date, including those described in the examples herein, or as described in Vaishnaw, AK et al. 2010. S ⁇ lence. 1:14.
  • nucleotides that form the pRNA, preferably from the accompanying chain comprise a 2'-0-methyl modification.
  • nucleotides that form the pRNA preferably from the accompanying chain
  • nucleotides that form the pRNA preferably from the accompanying chain
  • nucleotides that form the pRNA preferably from the accompanying chain
  • nucleotides that form the pRNA preferably from the accompanying chain
  • nucleotides that form the pRNA preferably from the accompanying chain
  • nucleotides that form the pRNA preferably from the accompanying chain
  • a 2'-0-methyl modification More preferably, 2 nucleotides, preferably from the accompanying chain, comprise a 2'-0-methyl modification.
  • the nucleotides that form the pRNA that comprise the 2'-0-methyl modification are at the 5 'end.
  • the nucleotides that form the pRNA that comprise 2'-0-methyl modifications are in the accompanying chain, and preferably at the 5 'end of the accompanying chain.
  • at least one nucleotide that forms the pRNA, preferably from the accompanying chain is a deoxyribonucleotide.
  • at least one nucleotide of the 3 'end of the pRNA, preferably of the accompanying chain is a deoxyribonucleotide. More preferably, 2 nucleotides of the 3 'end of the pRNA, preferably of the accompanying chain, are deoxyribonucleotides.
  • the deoxyribonucleotides of the 3 'end of pRNA are thymidine deoxyribonucleotides (dT).
  • the deoxyribonucleotides are at the 3 'end of the pRNA accompanying chain.
  • each pRNA chain comprises between 15 and 40 nucleotides.
  • each chain comprises between 17 and 30 nucleotides. More preferably, each chain comprises between 18 and 25 nucleotides.
  • the sequence of the pRNA accompanying chain is SEQ ID NO: 1.
  • the pRNA guide chain sequence is SEQ ID NO: 2.
  • the pRNA accompanying chain sequence is SEQ ID NO: 1 and The sequence of the pRNA guide chain is SEQ ID NO: 2.
  • a second aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition characterized in that it comprises the compound of the invention, hereinafter referred to as the pharmaceutical composition of the invention.
  • the pharmaceutical composition comprises a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • the "vehicle” or carrier is preferably an inert substance.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of other compounds, allow a better dosage and administration or give consistency and form to the pharmaceutical composition. Therefore, the carrier is a substance that is used in the medicament to dilute any of the components of the pharmaceutical composition of the present invention to a certain volume or weight; or that even without diluting said components it is capable of allowing a better dosage and administration or giving consistency and form to the medicine.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is the diluent.
  • the carrier or diluent is a transfection agent.
  • the transfection agent is selected from the list comprising polyethylene glycol, cholesterol, polyethyleneimide (PEI), cell penetration peptides, oligoarginine, poly-lysine, rabies virus glycoprotein, gold nanoparticles, dendrimers, carbon nanotubes and lipids
  • a transfection agent is any system that allows or facilitates transfection, that is, the introduction of a nucleic acid into a cell.
  • a transfection agent is a molecule that facilitates or allows the entry of the pRNAs of the invention or of the composition comprising them, into a cell.
  • the transfection agent is a lipid. More preferably, the lipid is a cationic lipid. Even more preferably, the cationic lipid is a liposome.
  • the pharmaceutical composition further comprises another biologically active substance.
  • biologically active substance is any matter, whatever its human, animal, plant, chemical or other origin, to which an appropriate activity is attributed to constitute a medicament.
  • a third aspect of the present invention relates to the use of the compound or pharmaceutical composition of the invention for the preparation of a medicament.
  • the compound or pharmaceutical composition of the invention is used for the treatment of an inflammatory disease.
  • the inflammatory disease is selected from the list comprising: inflamed bowel disease, rheumatoid arthritis, osteoarthritis and chronic obstructive pulmonary disease. More preferably, the inflammatory disease is intestinal, preferably it is the disease of the inflamed intestine.
  • the compound or pharmaceutical composition of the invention can be used for the treatment of Crohn's disease, ulcerative colitis, irritable bowel syndrome, infectious bowel disease, pseudomembranous colitis, amebiasis, intestinal tuberculosis, chronic polyps , diverticular disease, constipation, intestinal obstruction, malabsorption syndrome, diarrhea or colorectal cancer.
  • the compound or pharmaceutical composition of the invention is used for the treatment of a disease that is selected from the list comprising: Crohn, ulcerative colitis, irritable bowel syndrome, infectious bowel disease, pseudomembranous colitis, amebiasis or intestinal tuberculosis, chronic polyps, diverticular disease and colorectal cancer.
  • the disease is Crohn's disease, ulcerative colitis or irritable bowel syndrome.
  • the compound or pharmaceutical composition containing it is administered intrarectally.
  • suppositories or enemas in the rectum can be used, but not limited to.
  • a therapeutically effective amount of the compound or pharmaceutical composition of the invention is administered.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to an amount that, administered in doses and for the necessary period of time, is effective in achieving the desired prophylactic or therapeutic result.
  • a “therapeutically effective amount” of the compound or of the pharmaceutical composition or composition of the invention may vary with the stage of the disease, the age, sex and weight of the individual, and refers to an amount that has no adverse effects. no toxicity and is able to achieve the desired prophylactic or therapeutic effect.
  • An embodiment of the invention can be a compound in which each pRNA chain has between 17 and 30 nucleotides, comprises between two and four 2'-0-methyl modifications in the nucleotides the 5 'end of the accompanying chain, a modification with a 1,2-propanediol at the 3 'end of the accompanying chain linked by a phosphodiester bond and those between two and four nucleotides of the 3' end of the accompanying chain are deoxyribonucleotides.
  • Another embodiment of the invention may be a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a compound that inhibits or silences the expression of IL- in which each pRNA chain has between 20 and 26 nucleotides, comprises between two and five 2'-0-methyl modifications in the nucleotides of the accompanying chain and a modification with a C2-C4 alkyl substituted with two hydroxyl groups, attached to the accompanying chain at its 3 'end by a phosphodiester bond and between two and four nucleotides of the 3' end of the accompanying chain are thymidine deoxyribonucleotides.
  • Another embodiment of the invention may be the use of a compound that inhibits the expression of a proinflammatory molecule comprising between two and four 2'-O-methyl modifications in between one and three nucleotides of the 3 'end of any of the chains and a modification with 1,3-propanediol, for the preparation of a medicament for the treatment of an inflammatory bowel disease, which is administered intrarectally in a therapeutically effective amount.
  • a proinflammatory molecule comprising between two and four 2'-O-methyl modifications in between one and three nucleotides of the 3 'end of any of the chains and a modification with 1,3-propanediol
  • (1) is 1,3-propanediol; (a) the reagent used in this reaction is dimethoxytrityl chloride (DMT) dissolved in pyridine; (2) is 1-O-Dimethoxytrityl-1,3-propanediol; (3) is the 1-O-Dimethyloxytrityl-1,3-propanediol hemisuccinate, (b) the reagents used in this reaction are succinic anhydride, and N, N-dimethylaminopyridine dissolved in dichloromethane; (4) is the solid glass support functionalized with 1,3-propanediol, (c) the reagents used in this reaction are glass balls functionalized with amino, N, N-dimethylaminopyridine, triphenylphosphine, and 2,2-dithiobis ( 5-nitropyridine) dissolved in a mixture of 1,2-dichloroethane and acetonitrile.
  • DMT dimethoxyt
  • Fig. 1 In vitro mouse TNF- ⁇ inhibitory activity of the compounds of the invention and their controls in cell lines and primary macrophages. Only compounds where the sequence of the pRNA guide chain is complementary to the TNF-oc mRNA (sm, OMe, Prop, OMe-Prop) are able to bind RISC and silence TNF- ⁇ , while the random sequence pRNA with 2'-O-methyl modifications it does not inhibit the production of TNF- ⁇ (Ser).
  • A. Amount of TNF- ⁇ produced by HeLa cells after 24 h of treatment with the plasmid expressing TNF- ⁇ and the compounds of the invention or its controls. B.
  • TNF- ⁇ produced by peritoneal macrophages transfected with the compounds of the invention and their controls.
  • C Amount of TNF- ⁇ produced by 4T1 cells after 24 h of treatment with the compounds of the invention and their controls. Error bars represent the standard deviation of the mean.
  • Statistical analysis was performed following the ANOVA method with the Bonferroni post-test. *** P ⁇ 0.001 * * P ⁇ 0.01 or * P ⁇ 0.05 compared to Ser, the random sequence pRNA, ## P ⁇ 0.01 compared to the unmodified pRNA (sm).
  • Fig. Stimulation of the immune response produced by the addition of the compounds of the invention and their controls.
  • PBMC Peripheral blood mononuclear adherent cells
  • OMe-Prop stimulates the immune response less than sm Error bars represent the standard deviation of the mean.
  • Statistical analysis was performed following the ANOVA method with the Bonferroni post-test. ** P ⁇ 0.01 or * P ⁇ 0.05 compared to sm
  • Fig. 3 Inhibition of TNF- ⁇ production in a chronic colitis model. It shows the levels of TNF- ⁇ messenger RNA (mRNA) in arbitrary units in the colon of healthy mice or mice with colitis treated with OMe-Prop or Ser. Animals with colitis were treated with OMe-Prop or Ser. the colon, mRNA was isolated and TNF- ⁇ levels were measured by quantitative PCR. The OMe-Prop compound is capable of decreasing the production of TNF- ⁇ with respect to Ser. Statistical analysis was performed following the ANOVA method with the Bonferroni post-test. ** P ⁇ 0.01. Fig. 4. Clinical outcome observed in a chronic colitis model as a result of the administration of the compounds of the invention and their controls.
  • mRNA messenger RNA
  • the compounds of the invention improve the clinical outcome in a chronic colitis model.
  • Animals with colitis were treated with OMe-Prop, sm, OMe or with Ser and were observed up to 8 days, during which several indicators of the disease were measured and the disease activity index (ADI) was evaluated. Mice were sacrificed 8 days after the start of the experiment and the colon was removed to evaluate the activity of myeloperoxidase (MPO) and perform histological observation. Control mice are healthy mice in which colitis was not induced.
  • D. Average length of the colon in cm of animals treated on day 8.
  • RNA sequences were assembled using the solid phase synthesis method.
  • 0.1 millimoles of 2,2-dithio-bis- (5-nitropyridine) (DTB) was dissolved in 0.4 ml of acetonitrile and the resulting solution was mixed with a solution containing 0.1 millimoles of hemisuccinate and N, N-dimethylaminopyridine (0.1 mmol) dissolved in 0.5 ml of acetonitrile (ACN).
  • ACN acetonitrile
  • TPP triphenylphosphine
  • the mixture was stirred with an orbital shaker for a few seconds and added to a syringe containing 0.5 g of controlled pore glass balls functionalized with amino groups.
  • the reaction was allowed to stir gently for 2 hours at room temperature.
  • the reaction was stopped by the addition of 0.5 ml of methanol and the solid support was separated from the solution.
  • the solid support was washed three times with methanol (10 ml per wash), three times with ACN (10 ml per wash) and then with ethyl ether (10 ml per wash).
  • the support was dried under vacuum and treated with the acetylation solution consisting of a mixture of two solutions: 1) 0.5 ml of an anhydride solution acetic: pyridine: tetrahydrofuran (1: 1: 8) and 2) 0.5 ml of a solution of 10% N-methylimidazole in tetrahydrofuran. After 30 minutes, the solid support was washed as above with methanol, acetonitrile and ethyl ether. The support was dried in air and then under vacuum and stored at 4 e C.
  • the degree of functionalization was determined by elimination of the dimethoxytrityl group (DMT) from an aliquot with an acid solution and subsequent reading of the absorption of the DMT cation released from the 500 nm support.
  • the degree of functionalization was 35 nanomoles / g.
  • the oligoribonucleotides were prepared using a synthesizer from the Applied Biosystems Model 3400 commercial house using 2- cyanoethyl phosphoramidites and terbutyl dimethylsilyl type protectors (TBDMS) for the protection of the 2 'position hydroxyl group.
  • TDMS terbutyl dimethylsilyl type protectors
  • RNA sequences 0.4 M 1 H-tetrazole in ACN (catalyst); 3% trichloroacetic acid in DCM (destritilation), acetic anhydride: pyridine: tetrahydrofuran (1: 1: 8) (acetylation solution A), 10% N-methylimidazole in tetrahydrofuran (acetylation solution B), 0.01 M iodine tetrahydrofuran: pyridine: water (7: 2: 1) (oxidation).
  • the last DMT was removed since the DMT group is not completely stable to fluoride treatment.
  • the average yield per stage of addition of a nucleotide was about 97-98% for RNA monomers.
  • the obtained polymer supports treated with a concentrated solution of ammonia-ethanol (3: 1) for 1 55 Q C.
  • the supports were washed with ethanol and the resulting solutions are combined and evaporated to dryness.
  • the resulting products were treated with 0.15 ml of triethylamine-tris (hydrofluoride): triethylamine: N-methylpyrrolidone (4: 3: 6) for 2.5 h at 65 [ deg.] C. in order to eliminate the TBDMS groups.
  • the reactions were stopped by the addition of 0.3 ml of isopropoxytrimethylsilane and 0.75 ml of ether.
  • the resulting mixtures were stirred and cooled to 4 e C.
  • MALDI-TOF spectra were performed on a Perseptive Voyager DETMRP mass spectrometer, equipped with a 337 nm nitrogen laser using a 3 ns pulse.
  • the matrix used contained 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP, 10 mg / ml in ACN: water 1: 1) and ammonium citrate (50 mg / ml in water).
  • RNA sequences were obtained from commercial sources (Sigma-Proligo, Dharmacon): accompanying chain negative control 5'- (mC) (mA) G UCG CGU UUG CGA CUG G-dT-dT-3 '(SEQ ID NO: 3), 5'-CCA GUC GCA AAC GCG ACU G-dT-dT-3 'negative control guide chain (SEQ ID NO: 4), anti-TNF- ⁇ guide chain: 5'-GAG GCU GAG ACA UAG GCA C -dT-dT-3 '(SEQ ID NO: 5), anti-TNF- ⁇ companion chain: 5'-GUG CCU AUG UCU CAG CCU C-dT-dT-3' (SEQ ID NO: 2) and accompanying chain anti-TNF-ct: 5'- (mG) (mU) G CCU AUG UCU CAG CCU C-dT-dT-3 '(SEQ ID NO: 1).
  • RNA monomers (ribonucleotides) are detailed in capital letters and the abbreviation dT corresponds to thymidine deoxyribonucleotide.
  • Type 2'-O-methyl-RNA monomers are detailed in brackets such as: (mG), (mU), (mC) and (mA).
  • the anti-TNF- ⁇ pRNA sequences are described in Sorensen et al. J Mol Biol. 2003, 327: 761-6. Table 2. Mass spectrometry characterization of modified RNA derivatives.
  • EXAMPLE 2 Inhibition of TNF- ⁇ in vitro.
  • the guide and companion chains were hybridized and the resulting double stranded RNA was used for inhibition of TNF- ⁇ gene expression.
  • the inhibitory properties of the compounds prepared in example 1 in HeLa cells were studied. These cells do not express the mouse TNF- ⁇ gene, so prior to the addition of the compounds the cells were transfected with a plasmid containing the mouse TNF- ⁇ gene.
  • HeLa cells were cultured under usual conditions: 37 s C, 5% CO 2 , in Eagle's modified Dulbecco medium, 10% fetal bovine serum (SFB), 2 mM L-glutamine supplemented with penicillin (100 U / ml) and streptomycin (100 mg / ml). All experiments were performed at a cell confluence of 40-60%. HeLa cells were transfected with 250 ng of the plasmid expressing the mouse TNF- ⁇ gene using lipofectin (Invitrogen) and following the manufacturer's instructions.
  • Peritoneal macrophages were isolated from untreated mice. Culture medium was injected into the peritoneum of the sacrificed animals and the resulting liquid was collected and isolated. The cells obtained in this liquid were counted and seeded. This peritoneal macrophage culture was transfected with the compounds using DOTAP (Roche) and following the manufacturer's instructions. After 20 hours of transfection, the cells were stimulated with 10 ng / ml lipopolysaccharide (LPS) for 10 hours and the amount of TNF-a produced was determined by the ELISA assay. 3. -The 4T1 mouse cells were cultured under the usual conditions. These cells express the mouse TNF-gene naturally.
  • PBMC peripheral blood mononuclear adherent cells
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • Monocyte enriched populations were isolated by their adhesion in plastic. After 3 hours incubation at 37 e C, the cells were transfected with the compounds and controls for 18 hours using DOTAP (Roche) and following the manufacturer 's instructions. Cell supernatants were collected and the amount of TNF- ⁇ produced under immunostimulation was determined by ELISA.
  • FIG. 2 shows the production of human TNF- ⁇ as a non-specific response of the addition of unmodified or modified pRNA.
  • This figure clearly shows that OMe-Prop, produces a 20 to 50% reduction in activity immunostimulatory, compared to sm, at a concentration of 10 nM.
  • EXAMPLE 3 Inhibition of TNF- ⁇ in vivo. The therapeutic impact was evaluated in a model of inflamed bowel disease in mice, administering the compounds and their controls directly in the distal colon of sick animals (rectal administration). First, the inhibitory efficacy in this animal model was evaluated by measuring TNF-ct messenger RNA (mRNA) by the method of reverse transcriptase and quantitative PCR, directly on colon messenger RNA extracts.
  • mRNA TNF-ct messenger RNA
  • mice of strain C57BI / 6 Har ⁇ an Ibérica
  • the animals were cared for under normal conditions at a temperature of 22 Q C and a relative humidity of 70-80%, in light / dark cycles of 12 hours.
  • the disease activity index (ADI) During the period of the experiment, the animals were examined daily for the status of the following variables: (i) general condition of the animal, (ii) appearance of the hair, (ii) appearance and appearance of blood in the stool ⁇ method of benzidine TMB), (iv) ingestion of food and drink (grams or mi per day).
  • the IAD parameter correlates well with the histopathological evaluation of inflammation in intestinal invaginations.
  • the ADI is obtained from the following weighting:% increase in weight with respect to day 1 (PC), from 0 to 4 points; stool consistency, from 0 to 4 points; aspect of the animal, from 0 to 3 points; blood in stool, 0 to 3 points.
  • the compounds and their controls were resuspended in RNAse free water and mixed with Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA).
  • the complex was administered in the rectum of anesthetized mice (4 nanomoles per mouse).
  • Ketamine and xylazine (Imalgene 1000, Merial labs, Rompun 2%, Bayer) was injected intraperitoneally at a dose of 55:15 mg / kg, diluted in saline buffer. The animals were sacrificed with a halothane overdose and blood was drawn via cardiac puncture. Next, different organs were removed, which were frozen for later analysis.
  • MPO Myeloperoxidase
  • the MPO is located in the intracellular granules of polymorphonuclear neutrophils (PMNN) and catalyzes the conversion of hydrogen peroxide into water and oxygen ion.
  • MPO activity is a quantitative indication of the degree of leukocyte infiltration in inflamed tissue.
  • O-dianisidine Sigma
  • One unit of MPO activity is the amount of enzyme that converts 1 micromol of hydrogen peroxide to water, in one minute.
  • Colon samples from animals treated for histology were washed with phosphate saline. To preserve the morphology and tissue composition, they were fixed with 4% paraformaldehyde and then dehydrated with a gradient of ethanol. The tissue was fixed in paraffin in the presence of toluol. The paraffin block was cut into sections 8 micrometers thick, which were stained with hematoxylin / eosin.
  • Figure 3 shows that the disease model induced by the administration of a 5% DSS solution produces an increase in TNF-ct levels after 3 days of administration. You can see the large increase in TNF- ⁇ in the colon of mice that have been treated with DSS and Ser, compared to those that have not been treated with DSS (healthy).
  • Figure 4 shows that the compounds of the invention are capable of stopping the development of the disease as a result of the decrease in the levels of TNF- ⁇ mRNA.
  • the clinical parameters of the disease were analyzed at 8 days after starting treatment with DSS. Mice were treated with the compounds and their controls on days 2 and 4, using 4 nanomoles in each of the treatments.
  • Figure 4 shows that OMe-Prop treatment produces a significant improvement both qualitative as quantitative in the clinical parameters of colitis in treated animals, compared to animals treated with sm or with Ser.
  • the length of the colon ( Figure 4D), the weight of the colon ( Figures 4A and 4E) and the relationship length / colon weight ( Figure 4F) are significantly better in animals treated with OMe-Prop.
  • the disease activity index (ADI) indicates an improvement in animals treated with OMe-Prop. Also, histological assessment shows a significant beneficial impact on animals treated with OMe-Prop.
  • the degree of inflammation determined by the MPO activity ( Figure 4G) in treated colon extracts also shows a significant reduction after treatment with OMe-Prop. But the most important parameter, which is the degree of survival, is also clearly better in the Animals treated with OMe-Prop, showing that the beneficial effects observed locally in the degree of inflammation of the colon translate into a significant improvement in the general physiological state of the animal.

Abstract

La presente invención se refiere a un pequeño ARN de interferencia (pARNi) específico frente al factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), con modificaciones 2'-0-metilo y que lleva unido mediante un enlace fosfodiéster un grupo R a la posición 3', donde R se selecciona entre: un C1-C6 alquilo sustituido con al menos un grupo -OH, en especial propanodiol; un C4-C6 cicloalquilo sustituido con al menos un grupo - OH; un C4-C6 heterocicloalquilo; una cadena heteroalquílica entre 2 y 7 átomos, donde al menos uno es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre, preferiblemente la cadena está sustituida con al menos un grupo - OH; y un heteroarilo cuyo anillo está formado entre 3 y 6 átomos y al menos uno de esos átomos es un átomo de oxígeno. La presente invención se refiere también al uso de dicho pARNi para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, preferiblemente la enfermedad del intestino inflamado.

Description

DERIVADOS DE PEQUEÑOS ARN DE INTERFERENCIA Y SU USO
La presente invención pertenece al campo de la Biotecnología. La presente invención se refiere a unos nuevos pequeños ARN de interferencia (pARNi) modificados químicamente en los extremos de la cadena acompañante y a su uso en el tratamiento de enfermedades.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR La interferencia de ARN es un proceso de sílencíamíento de genes post- transcripcional y específico de secuencia, que emplea ARN de doble cadena. Después del descubrimiento de este fenómeno en plantas a principio de los años 90, Andy Fire y Craig Mello demostraron que un ARN de doble cadena era capaz de inhibir la expresión génica de manera específica y selectiva en Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1998 Nature, 391 (6669) 806-1 1 ).
La secuencia de la cadena acompañante coincide con la región correspondiente del ARN mensajero (ARNm) diana. La cadena guía o líder es complementaria a este ARNm. La doble cadena de ARN es varios órdenes de magnitud más eficiente que la cadena líder sola a la hora de silenciar la expresión génica mediante la inducción de la degradación del ARNm.
El proceso de la interferencia de ARN comienza cuando la enzima DICER encuentra un ARN de doble cadena y lo trocea en los llamados pequeños ARN de interferencia (pARNi, del inglés "small interfering RNAs, o siRNA"), de unos 20 nucleótidos. Las células cuentan con una maquinaria denominada RISC (del inglés "RNA-induced silencing comple '), a la que se incorpora la cadena guía.
Se sabe que las moléculas de pARNi pueden unirse a los receptores de tipo "Toll" presentes tanto en la membrana celular como en el interior de la célula, y estimular la producción de los interferones alfa y beta que, a su vez, producen una respuesta inmunológíca. Esta respuesta inmunológíca es ínespecífíca y enmascara frecuentemente los efectos de los pARNi.
En la solicitud de patente WO2007051303 se describe el efecto de algunas modificaciones químicas en las moléculas de pARNi que disminuyen la respuesta inmunológíca. Las modificaciones mencionadas se encuentran en ambas cadenas y son las siguientes: 2'-0-metilo, 2'-deoxi-2'-fluoro, 2'-deoxi y 2'-0-(2-metoxíetilo). Otras modificaciones más complejas se describen en WO2006020768. En Van Aerschot et al, Bull. Soc. Chim. Belg. 104, ns 12, pp 717-720, 1995 se utiliza un soporte sólido funcionalizado con propandíol para la síntesis de ADN con el fin de incrementar la resistencia a la degradación por 3'- exonucleasas.
En cuanto a la enfermedad del intestino inflamado, algunas de la principales características de la enfermedad del intestino inflamado son la pérdida de la tolerancia a los microbios intestinales, la activación de las células responsables de la inmunidad y la producción de cantidades elevadas de varías citoquinas tales como el factor de necrosis tumoral alfa, TNF-α y la interleuquinas IL- 1 beta, IL-6 y IL-8 por parte de los immunocitos y también de las células de la mucosa intestinal. Estas citoquinas captan células immunocompetentes que amplifican la respuesta inflamatoria. TNF-α tiene un papel central en el proceso inflamatorio debido a su capacidad de incrementar su propia expresión al mismo tiempo que incrementa la expresión de otras moléculas proinflamatorias. Los sueros y las mucosas intestinales de pacientes de la enfermedad del intestino inflamado muestran niveles de TNF-α elevados y se han detectado cantidades elevadas de TNF-α en modelos de la enfermedad del intestino inflamado como son los modelos animales de colitis. La inhibición de TNF-a medíante anticuerpos, receptores solubles o inhibidores de la fosfodíesterasa IV, como el rolipram, ha mejorado sensiblemente o incluso ha prevenido la inflamación en estos modelos anímales. Sin embargo, se han descrito varios efectos secundarios como por ejemplo un incremento en la vulnerabilidad a patógenos intracelulares o reacciones autoinmunes. De cara a reducir los efectos secundarios, es conveniente incrementar la selectividad del órgano al que va dirigido el tratamiento. A este respecto, la solicitud de patente WO2006097768 describe el uso de pARNí capaces de inhibir la expresión de la IL-12 para el tratamiento de enfermedades intestinales y su administración por vía intrarectal, y la solicitud WO0020645 describe oligonucleótidos antisentido para inhibir la expresión de TNF-α. Sin embargo estas solicitudes no hacen referencia a posibles modificaciones químicas para la disminución de la respuesta inmune inespecífica. El grupo del Dr. Ramratnam utiliza pARNí sin modificar (Zhang et al. Mol. Ther. 2006, 14: 336-42) y demuestra que estos pARNi pueden disminuir los niveles de ARNm de TNF-α y mejorar su perfil histológico pero no el desarrollo clínico de la enfermedad. Por todo esto, es importante desarrollar nuevas estrategias que permitan, por un lado, disminuir los efectos secundarios asociados a los tratamientos con pARNí y, por otro lado, dirigir el tratamiento a las zonas que se deseen tratar, como es únicamente al intestino en la enfermedad del intestino inflamado. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a compuestos derivados de pequeños ARN de interferencia (pARNi) basados en las modificaciones químicas 2'-0-metilo y en la unión de una pequeña molécula alquílica polar, que confieren al dúplex de ARN unas propiedades sorprendentemente ventajosas para silenciar la expresión génica sin apenas provocar efectos secundarios inflamatorios. Por ejemplo, los pARNi de la invención son capaces de inhibir la expresión del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) sin provocar efectos secundarios de estimulación de la respuesta inmune y de mejorar los resultados clínicos en un modelo de colitis. Que las modificaciones químicas 2'-0-metilo en un pARNi disminuyen la respuesta inmunológica y la inflamación, es algo ya descrito en la solicitud de patente WO2007051303. Sin embargo, los derivados de pARNí de la invención, modificados con una pequeña molécula alquílíca polar además de las modificaciones 2'-0-metilo, tienen un efecto sorprendentemente mucho más beneficioso a la hora de inhibir la expresión génica sin provocar la estimulación de la respuesta inmune. Estas dos modificaciones de los pARNi: 2-O-metilo y unión de una pequeña molécula alquílica, cuando se realizan por separado consiguen unos efectos mucho menos efectivos. Además, el efecto que se consigue mediante la combinación de estas dos modificaciones es mucho mayor que la suma de los efectos individuales, es decir, presenta un efecto sinérgico beneficioso e inesperado.
Los compuestos de la presente invención incrementan la eficacia inhibitoria de TNF-α en cultivos celulares y en animales. Además, esas modificaciones introducidas en los pARNi reducen la estimulación inmunológica no específica en células PBMC humanas, mejorando por tanto el perfil farmacológico.
La presente invención se refiere también a una composición que comprende dichos pARNi modificados, así como al uso de los pARNi o de dicha composición para la preparación de un medicamento.
Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto (en adelante llamado compuesto de la invención) de fórmula pARNi-P-O-R donde: i) pARNi es un pequeño ARN de interferencia que comprende al menos una modificación 2'-0-metilo; ii) -P-O- representa un enlace fosfodiéster que une R a la posición terminal 3' de cualquiera de las cadenas del pARNi; iií) donde R es un radical que se selecciona entre: un C-i-C6 alquilo sustituido con al menos un grupo -OH; un C4-C-6 cicloalquilo sustituido con al menos un grupo -OH; un C4-Ce heterocicloalquilo; una cadena heteroaiquíiica de entre 2 y 7 átomos, donde ai menos uno de ios átomos de la cadena es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre, preferiblemente la cadena está sustituida con al menos un grupo -OH; y un heteroarilo en cual el anillo esta formado entre 3 y 6 átomos y ai menos uno de esos átomos es un átomo de oxígeno.
El término pequeño ARN de interferencia o pARNi en la presente descripción es indistinto al término siRNA (del inglés "small interfering RNA").
Un pARNi es un ARN de doble cadena que comprende dos elementos: (a) una cadena guía, también conocida como cadena líder o cadena antisentido, que hibrida con (b) una cadena acompañante, también conocida como cadena sentido. La cadena guía, líder o antisentido es la responsable de la capacidad de esta molécula para interferir en la expresión del ARN mensajero (ARNm) diana del silenciamiento. Dicha cadena guía híbrida con dicho ARNm, provocando finalmente su procesamiento y disminuyendo así la traducción del ARNm a proteína.
Un pARNi está compuesto por ribonucleótidos encadenados, pero puede presentar también algún desoxirribonucleótido.
Una modificación 2'-O-metílo en un nucleótido es a la unión de un grupo oxi- metilo en la posición 2' del nucleótido, es decir, en el segundo carbono de la pentosa. La posición 3' es obviamente la posición 3' del nucleótido terminal, situado en el extremo 3' de cualquiera de las dos cadenas del pARNi, ya que en los demás nucleótidos, la posición 3' está ocupada en la unión al siguiente nucleótido de la cadena mediante un enlace fosfodiéster.
Un grupo -OH es un grupo hidroxilo libre.
Para la unión de R al pARNi medíante un enlace fosfodiéster es necesario que el grupo que se va a incorporar presente al menos un grupo hidroxilo libre, cuyo átomo de oxígeno formará el enlace con el pARNi. El enlace fosfodiéster puede ser tal enlace o cualquier otro que cumpla la misma función, aunque preferiblemente es un enlace fosfodiéster.
En una realización preferida de la invención, el compuesto de la invención es antiinflamatorío. Preferiblemente, la cadena guía del pARNi del compuesto de la invención inhibe o silencia, total o parcialmente, la expresión de una molécula proinflamatoria.
El término "inhibir o silenciar", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a la disminución de la expresión génica que ocurre cuando el pARNi híbrida específicamente con el ARNm al que está dirigido e induce su degradación. Se dice que la expresión génica está inhibida o silenciada cuando la cantidad de ARNm de un determinado gen decrece o desaparece respecto a los niveles originales de partida. La cantidad o los niveles de ARNm pueden ser determinados por múltiples técnicas conocidas por el experto en la materia, como pueden ser, pero sin limitarse, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otras técnicas de hibridación con sondas específicas.
En la presente descripción, se entiende por moléculas proinflamatorias aquellas moléculas que participan en la inflamación, promoviendo dicho proceso. Existe una gran variedad de moléculas proinflamatorias, entre las que se encuentran la interleuquina 1 (IL-1 ), interleuquína 8 (IL-8), las prostaglandinas, el óxido nítrico, el interferón γ y el factor de necrosis tumoral (TNF). Además, existen algunas enzimas proinflamatorias, como la fosfolipasa de tipo II o PLA2, la cíclooxígenasa 2 (COX-2) o la síntasa de óxido nítrico inducible (¡NOS), que activan la síntesis de factor activador de plaquetas, leucotrienos, prostanoides u óxido nítrico. En una realización preferida del compuesto de la invención, la cadena guía del pARNi inhibe o silencia, total o parcialmente, la expresión de al menos uno de los genes de la lista que comprende: factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), IL-1 beta, IL-6 e IL-8. Preferiblemente, la cadena guía del pARNi del compuesto de la invención inhibe o silencia, total o parcialmente, la expresión del gen de TNF-α o la del gen de IL-1 beta. Más preferiblemente, la cadena guía del pARNi del compuesto de la invención inhibe o silencia, total o parcialmente, la expresión del gen de TNF-a.
El factor de necrosis tumoral o TNF-α {del inglés "tumor necrosis factor alpha") es el primer miembro de la superfamilia de TNF, a la que pertenecen algunas citoquinas implicadas en la fase aguda del proceso inflamatorio. Los miembros de esta superfamilia tienen un origen filogenético común y la mayoría tienen también una función común: promueven la apoptosis y la activación del factor de transcripción NF-KB.
En una realización preferida del compuesto de la invención, R es un alquilo d- C6 sustituido con al menos un grupo hidroxilo libre. Preferiblemente, R es un alquilo C2-C4 sustituido con uno o dos grupos hídroxilos libres. En una realización preferida del compuesto de la invención, R es etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo o terbutilo. Preferiblemente, el enlace fosfodiéster une una molécula de 1 ,2-propandiol o 1 ,3-propandiol, preferiblemente de 1 ,3- propandiol, a la posición 3' de cualquiera de las cadenas del pARNi. Dado que un grupo hidroxilo se utiliza para la formación del enlace, sólo quedaría un grupo hidroxilo libre. En una realización preferida del compuesto de la invención, R es un C4-C6 cicloalquilo sustituido con al menos un grupo hidroxilo libre. Preferiblemente, R es ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo donde R está sustituido con uno o dos grupos hídroxilos libres. Más preferiblemente, el enlace fosfodíéster une una molécula de 4-ciclohexandiol a la posición 3' de cualquiera de las cadenas del pARNi.
En otra realización preferida del compuesto de la invención, R es un C4-C6 heterocicloalquilo, preferiblemente sustituido con al menos un grupo hidroxilo libre. Preferiblemente, R es un oxetanílos (C4), aziridinilos (C3), azetidinilos (C ), tetrahidrofuranilos (C5), pirrolidinilos (C5), morfolinilos (C6), ditianilos (C6), tiomorfolinilos (C6), piperídinilos (C6), tetrahidropiranilos (C6), piperazinilos (C6) o trítianilos (Ce). Más preferiblemente, R es 4-metilpiperazinilo, 3-metil-4- metilpiperazine, 4-dimetilaminopiperidinilo, 4-metilaminopiperidinilo, 4- aminopiperídinilo, 3-dimetilamínopíperidinílo, 3-metilaminopiperidinilo, 3- aminopiperidinilo, 4-hídroxipiperidinilo, 3-hidroxipiperidinilo, 2-hidroxipiperidinilo, 4-metilpiperídínilo, 3-metílpiperidinilo, 3-dimetilamínopirrolidínílo, 3- metilaminopirrolidinilo, 3-aminopirrolidinilo o metilmorfolinilo. En otra realización preferida del compuesto de la invención, R es una cadena heteroalquílica de entre 2 y 7 átomos, donde al menos uno de los átomos de la cadena es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre, preferiblemente la cadena está sustituida con al menos un grupo hidroxilo libre. Preferiblemente, R es una cadena heteroalquílica de entre 4 y 6 átomos donde al menos uno de los átomos de la cadena es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre, preferiblemente la cadena está sustituida con al menos un grupo hidroxilo libre. Más preferiblemente, el enlace fosfodíéster une una molécula de dietilenglicol o dietílenglicoltioéter a la posición 3' de cualquiera de las cadenas del pARNi. En una realización preferida del compuesto de la invención, R es un heteroarilo formado por entre 3 y 6 átomos y al menos uno de esos átomos es un átomo de oxígeno. Preferiblemente, R es tíenilo, furanilo, pirrolilo, oxazolilo, tiazolilo o imidazolilo.
En una realización preferida del compuesto de la invención, R está sustituido con dos o tres grupos hidroxilo. Preferiblemente, R se selecciona de la lista que comprende: 1 ,2-propanodiol, 1 ,3-propanodíol, 3-amino-1 ,2-propanodiol, 2,2- dimetil-1 ,3-propanodiol, glicerol, etilenglicol, dietilenglicol, dietilenglicoltioéter, 1 ,6-hexandiol, ciclohexandiol. En una realización preferida del compuesto de la invención, R esta unido a través de un enlace fosfodiéster a la posición terminal 3' de la cadena acompañante.
Las modificaciones del pARNi del compuesto de la invención pueden llevarse a cabo según cualquiera de los métodos conocidos hasta la fecha, incluidos los descritos en los ejemplos de la presente memoria, o como se describe en Vaishnaw, AK et al. 2010. Sílence. 1 :14.
En una realización preferida del compuesto de la invención, entre 1 y 7 nucleótidos que forman el pARNi, preferiblemente de la cadena acompañante, comprenden una modificación 2'-0-metilo. Preferiblemente, entre 2 y 4 nucleótidos, preferiblemente de la cadena acompañante, comprenden una modificación 2'-0-metilo. Más preferiblemente, 2 nucleótidos, preferiblemente de la cadena acompañante, comprenden una modificación 2'-0-metilo.
En una realización preferida del compuesto de la invención, los nucleótidos que forman el pARNi que comprenden la modificación 2'-0-metilo están en el extremo 5'. Preferiblemente, los nucleótidos que forman el pARNi que comprenden modificaciones 2'-0-metilo están en la cadena acompañante, y preferiblemente en el extremo 5' de la cadena acompañante. En una realización preferida del compuesto de la invención, al menos un nucleótido que forma el pARNi, preferiblemente de la cadena acompañante, es un desoxirribonucleótido. Preferiblemente, al menos un nucleótido del extremo 3' del pARNi, preferiblemente de la cadena acompañante, es un desoxirribonucleótido. Más preferiblemente, 2 nucleótidos del extremo 3' del pARNi, preferiblemente de la cadena acompañante, son desoxírribonucleótidos.
En una realización preferida del compuesto de la invención, los desoxírribonucleótidos del extremo 3' del pARNi son desoxírribonucleótidos de timidína (dT). Preferiblemente, los desoxírribonucleótidos están en el extremo 3' de la cadena acompañante del pARNi
En una realización preferida del compuesto de la invención, cada cadena del pARNi comprende entre 15 y 40 nucleótidos. Preferiblemente, cada cadena comprende entre 17 y 30 nucleótidos. Más preferiblemente, cada cadena comprende entre 18 y 25 nucleótidos.
En una realización preferida del compuesto de la invención, la secuencia de la cadena acompañante del pARNi es SEQ ID NO: 1 . En una realización preferida del compuesto de la invención, la secuencia de la cadena guía del pARNi es SEQ ID NO: 2. En una realización preferida del compuesto de la invención, la secuencia de la cadena acompañante del pARNi es SEQ ID NO: 1 y la secuencia de la cadena guía del pARNi es SEQ ID NO: 2. La síntesis del compuesto de la invención puede llevarse a cabo según cualquiera de los métodos descritos en el estado de la técnica, o como se describe en Reese CB. Organic Biomolecular Chemistry. 2005, 3:3851 -68.
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el compuesto de la invención, en adelante llamada composición farmacéutica de la invención. En una realización preferida del segundo aspecto de la invención, la composición farmacéutica comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. El "vehículo" o portador, es preferiblemente una sustancia inerte. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Por tanto, el vehículo es una sustancia que se emplea en el medicamento para diluir cualquiera de los componentes de la composición farmacéutica de la presente invención hasta un volumen o peso determinado; o bien que aún sin diluir dichos componentes es capaz de permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma al medicamento. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente.
En una realización preferida del segundo aspecto de la invención, el vehículo o diluyente es un agente de transfeccion. Preferiblemente, el agente de transfeccion se selecciona de la lista que comprende polietilenglicol, colesterol, polietilenimida (PEI), péptidos de penetración celular, oligoargínina, poli-lisína, glicoproteína del virus de la rabia, nanopartículas de oro, dendrímeros, nanotubos de carbono y lípidos.
Un agente de transfeccion es cualquier sistema que permite o facilita la transfeccion, es decir, la introducción de un ácido nucleico en una célula. En la presente descripción, un agente de transfeccion es una molécula que facilita o permite la entrada de los pARNi de la invención o de la composición que los comprende, en una célula.
Preferiblemente, el agente de transfeccion es un lípido. Más preferiblemente, el lípido es un lípido catiónico. Aún más preferiblemente, el lípido catiónico es un liposoma. En otra realización aún más preferida, la composición farmacéutica además comprende otra sustancia biológicamente activa. Además del requerimiento de la eficacia terapéutica, que puede necesitar el uso de otros agentes terapéuticos, pueden existir razones fundamentales adicionales que obligan o recomiendan en gran medida el uso de una combinación de un compuesto de la invención y otro agente terapéutico. El término "sustancia biológicamente activa" es toda materia, cualquiera que sea su origen humano, animal, vegetal, químico o de otro tipo, a la que se atribuye una actividad apropiada para constituir un medicamento.
Un tercer aspecto de la presente invención se refiere al uso del compuesto o de la composición farmacéutica de la invención para la preparación de un medicamento. En una realización preferida del tercer aspecto de la invención, el compuesto o la composición farmacéutica de la invención se usan para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria. Preferiblemente, la enfermedad inflamatoria se selecciona de la lista que comprende: enfermedad del intestino inflamado, artritis reumatoide, osteoartritis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Más preferiblemente, la enfermedad inflamatoria es intestinal, preferiblemente es la enfermedad del intestino inflamado.
El compuesto o la composición farmacéutica de la invención pueden usarse para el tratamiento de la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, el síndrome del colon irritable, la enfermedad infecciosa del intestino, la colitis pseudomembranosa, la amebiasis, la tuberculosis intestinal, los pólipos crónicos, la enfermedad diverticular, el estreñimiento, la obstrucción intestinal, el síndrome de mala absorción, la diarrea o el cáncer colorrectal. En una realización preferida del tercer aspecto de la invención, el compuesto o la composición farmacéutica de la invención se usan para el tratamiento de una enfermedad que se selecciona de la lista que comprende: enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome del colon irritable, enfermedad infecciosa del intestino, colitis pseudomembranosa, amebiasis o tuberculosis intestinal, pólipos crónicos, enfermedad diverticular y cáncer colorrectal. Preferiblemente, la enfermedad es la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa o el síndrome del colon irritable.
En una realización preferida del tercer aspecto de la invención, el compuesto o la composición farmacéutica que lo contiene se administra por vía intrarrectal. Para dicha administración se pueden emplear, pero sin limitarse, supositorios o enemas en el recto.
En una realización preferida del tercer aspecto de la invención, se administra una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto o de la composición farmacéutica de la invención. La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad que, administrada en dosis y durante el período de tiempo necesario, es efectiva a la hora de conseguir el resultado profiláctico o terapéutico deseado. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" del compuesto o de la o de la composición farmacéutica de la invención puede variar con el estadio de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y se refiere a una cantidad que no presenta efectos adversos ni toxicidad y es capaz de alcanzar el efecto profiláctico o terapéutico deseado.
Un realización de la invención puede ser un compuesto en el que cada cadena del pARNi tiene entre 17 y 30 nucleótidos, comprende entre dos y cuatro modificaciones 2'-0-metilo en los nucleótidos el extremo 5' de la cadena acompañante, una modificación con un 1 ,2-propandíol en el extremo 3' de la cadena acompañante unida mediante un enlace fosfodiéster y los entre dos y cuatro nucleótidos del extremo 3' de la cadena acompañante son desoxirribonucleótidos.
Otra realización de la invención puede ser una composición farmacéutica que comprende un compuesto que inhibe o silencia la expresión de IL- en el que cada cadena del pARNi tiene entre 20 y 26 nucleotidos, comprende entre dos y cinco modificaciones 2'-0-metilo en los nucleotidos de la cadena acompañante y una modificación con un alquilo C2-C4 sustituido con dos grupos hidroxilo, unido a la cadena acompañante por su extremo 3' mediante un enlace fosfodiéster y entre dos y cuatro nucleotidos del extremo 3' de la cadena acompañante son desoxírribonucleótídos de timidina.
Otra realización de la invención puede ser el uso de un compuesto que inhibe la expresión de una molécula proinflamatoria que comprende entre dos y cuatro modificaciones 2'-O-metilo en entre uno y tres nucleotidos del extremo 3' de cualquiera de las cadenas y una modificación con 1 ,3-propandiol, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria intestinal, que se administra por vía intrarrectal en una cantidad terapéuticamente efectiva.
Los métodos de síntesis de los compuestos de la invención son conocidos y están disponibles en la técnica. (Reese CB. Organíc Biomolecular Chemistry. 2005, 3:3851 -68). Por ejemplo, en el siguiente esquema se resumen la síntesis del soporte de vidrio para la síntesis de derivados de ARN que contienen grupos propandiol en el extremo 3'.
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Esquema 1
(1 ) es 1 ,3-propandiol; (a) el reactivo utilizado en esta reacción es el cloruro de dimetoxitritilo (DMT) disuelto en piridina; (2) es 1 -O-Dimetoxitritil-1 ,3-propandiol; (3) es el hemísuccínato de 1 -O-Dimeíoxitrítil-1 ,3-propandiol, (b) los reactivos utilizados en esta reacción son el anhídrido succínico, y la N,N- dimetilaminopirídina disueltos en diclorometano; (4) es el soporte sólido de vidrio funcionalizado con 1 ,3-propandiol, (c) los reactivos utilizados en esta reacción son bolas de vidrio funcionalizadas con grupos amino, N,N- dimetilaminopiridina, trifenilfosfina, y 2,2-ditiobis (5-nitropiridina) disueltos en una mezcla de 1 ,2-dicloroetano y acetonitrilo.
Tabla 1 . Nomenclatura de una realización de la invención (OMe-Prop) y de los controles empleados (s.m.: sin modificar; Ser o Ser OMe: pARNí de secuencia aleatoria con modificaciones 2'-O-metilo; OMe: con modificaciones 2'-O-metilo en el extremo 5' de la cadena acompañante; Prop: con una molécula de 1 ,3- propandiol unida mediante un enlace fosfodiéster al extremo 3' de la cadena acompañante).
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*Scr también puede encontrarse en la memoria como Ser OMe.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Actividad inhibitoria de TNF-α de ratón in vitro de los compuestos de la invención y sus controles en líneas celulares y macrofagos primarios. Sólo los compuestos donde la secuencia de la cadena guía del pARNi es complementaría al ARNm de TNF-oc (s.m, OMe, Prop, OMe-Prop) son capaces de unirse a RISC y silenciar TNF-α, mientras que el pARNi de secuencia aleatoria con modificaciones 2'-O-metilo no inhibe la producción de TNF-α (Ser). A. Cantidad de TNF-α producida por células HeLa después de 24 h de tratamiento con el plásmido que expresa TNF-α y los compuestos de la invención o sus controles. B. Cantidad de TNF-α producida por macrófagos peritoneales transfectados con los compuestos de la invención y sus controles. C. Cantidad de TNF-α producida por células 4T1 después de 24 h de tratamiento con los compuestos de la invención y sus controles. Las barras de error representan la desviación estándar de la media. El análisis estadístico se realizó siguiendo el método ANOVA con el post-ensayo de Bonferroni. *** P<0,001 **P<0,01 o *P<0,05 comparado con Ser, el pARNi de secuencia aleatoria, ## P<0,01 comparado con el pARNi sin modificar (s.m.). Fig. 2. Estimulación de la respuesta inmune producida por la adición de los compuestos de la invención y sus controles. Las presencia de las modificaciones 2'-0-metilo y/o propandíol disminuye la respuesta inmune a los compuestos, independientemente de la secuencia del pARNi. Células adherentes mononucleares de sangre periférica (PBMC) se transfectaron a una concentración 10 nM de los diferentes compuestos de la invención y sus controles y se midió la cantidad de TNF-α humano producido en los sobrenadantes. OMe-Prop estimula menos la respuesta inmune que s.m. Las barras de error representan la desviación estándar de la media. El análisis estadístico se realizó siguiendo el método ANOVA con el post-ensayo de Bonferroni. **P<0,01 o *P<0,05 comparado con s.m.
Fig. 3. Inhibición de la producción de TNF-α en un modelo de colitis crónica. Muestra los niveles de ARN mensajero (ARNm) de TNF-α en unidades arbitrarias en el colon de ratones sanos o de ratones con colitis tratados con OMe-Prop o Ser. Los animales con colitis se trataron con OMe- Prop o Ser. Se extrajo el colon, se aisló el ARNm y se midieron los niveles TNF-α por PCR cuantitativa. El compuesto OMe-Prop es capaz de disminuir la producción de TNF-α con respecto a Ser. El análisis estadístico se realizó siguiendo el método ANOVA con el post-ensayo de Bonferroni. **P<0,01 . Fig. 4. Resultado clínico observado en un modelo de colitis crónica como resultado de la administración de ios compuestos de la invención y sus controles. Los compuestos de la invención mejoran el resultado clínico en un modelo de colitis crónica. Los animales con colitis se trataron con OMe-Prop, s.m., OMe o con Ser y se observaron hasta los 8 días, durante los cuales se midieron varios indicadores de la enfermedad y se evaluó el índice de actividad de la enfermedad (IAD). Los ratones se sacrificaron a los 8 días del inicio del experimento y se les extrajo el colon para evaluar la actividad de la mieloperoxidasa (MPO) y realizar la observación histológica. Los ratones control son ratones sanos en los que no se indujo la colitis. A. Cambios observados en el peso. B. Variación del índice de actividad de la enfermedad (IAD). C. Media de los índices de la actividad de la enfermedad (IAD) de los animales tratados a día 8. D. Media de la longitud del colon en cm de los animales tratados a día 8. E. Media del peso del colon en mg de los animales tratados a día 8. F. Medía de la relación entre el peso en mg y la longitud del colon en mm de los animales tratados a día 8. G. Media de los niveles de mieloperoxidasa (MPO) en unidades por mg de colon determinado en el colon de los animales tratados a día 8. El análisis estadístico se realizó siguiendo el método ANOVA con el post-ensayo de Bonferroni. *** P<0,001 **P<0,01 o *P<0,05 comparado con los controles sanos, ## P<0,01 comparando s.m. con Ser OMe, +++ P<0,001 comparando OMe-Prop con Ser OMe.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 : Síntesis de ios compuestos.
Las secuencias de ARN se ensamblaron utilizando el método de síntesis en fase sólida. Las cadenas acompañantes portadoras del grupo propandíol en el extremo 3' con o sin las unidades de 2'-O-metil-ARN en las dos posiciones finales cercanas al extremo 5': 5'-(mG)(mU)GCCUAUGUCUCAGCCUC-dT-dT- propandiol-3' (SEQ ID NO: 1 ) y 5'-GUGCCUAUGUCUCAGCCUC-dT-dT- propandiol-3' (SEQ ID NO: 2) se ensamblaron en un soporte sólido de vidrio siguiendo el esquema 1 .
Preparación del soporte sólido funcionalizado con 1 ,3-propandiol.
Como se muestra en el esquema 1 , 1 -0-dimetoxitritil-1 ,3-propandíol (0, 1 milimoles) preparado según se describe en Van Aerschot et al. Bull. Soc. Chim. Belg. 104, n9 12, pp 717-720, 1995; se disolvió en díclorometano (DCM) (1 mi) junto con N,N-dimetilaminopiridina (1 ,5 eq) y anhídrido succínico (1 ,5 eq). La reacción se mantuvo con agitación a temperatura ambiente durante 16 horas (h). La solución resultante se diluyó con 5 mi de DCM y la solución orgánica resultante se lavó 2 veces con una solución 0,1 M de Na2HP04. La capa orgánica resultante se secó con sulfato sódico anhidro, se filtró y se evaporó el disolvente. El residuo que contiene el hemisuccinato deseado se usó directamente en el siguiente paso sin más purificación.
Se disolvieron 0,1 milimoles de 2,2-ditío-bis-(5-nítropiridina) (DTB) en 0,4 mi de acetonitrilo y la solución resultante se mezcló con una solución que contiene 0,1 milimoles del hemisuccinato y N,N-dimetilaminopirídína (0,1 milimoles) disueltos en 0,5 mi de acetonitrilo (ACN). Una mezcla de 0,1 milimoles de trifenilfosfina (TPP) y 0,2 mi de ACN se añadieron a la solución anterior a temperatura ambiente.
La mezcla se agitó con un agitador orbital durante unos segundos y se añadió a una jeringa que contenía 0,5 g de bolas de vidrio de poro controlado funcionalizadas con grupos amino. Se dejó la reacción agitándose suavemente durante 2 horas a temperatura ambiente. La reacción se detuvo por adición de 0,5 mi de metanol y se separó el soporte sólido de la solución. El soporte sólido se lavó tres veces con metanol (10 mi por lavado), tres veces con ACN (10 mi por lavado) y tras veces con éter etílico (10 mi por lavado). El soporte se secó al vacío y se trató con la solución de acetilación que consta de una mezcla de dos soluciones: 1 ) 0,5 mi de una solución de anhídrido acético:p¡ridina:tetrahidrofurano (1 :1 :8) y 2) 0,5 mi de una solución de 10 % N- metilimidazol en tetrahidrofurano. Al cabo de 30 minutos, el soporte sólido se lavó igual que arriba con metanol, acetonitrilo y éter etílico. El soporte se secó al aire y después al vacío y se guardó a 4e C. El grado de funcionalización se determinó por eliminación del grupo dimetoxitritilo (DMT) de una alícuota con una solución ácida y posterior lectura de la absorción del catión DMT liberado del soporte a 500 nm. El grado de funcionalización fue de 35 nanomoles/g.
Síntesis de oliqonucleótidos
Los oligorribonucleótidos se prepararon utilizando un sintetizador de la casa comercial Applied Biosystems modelo 3400 utilizando fosforamidítos de 2- cianoetilo y los protectores de tipo terbutíldimetílsílil (TBDMS) para la protección del grupo hidroxilo en la posición 2'. Se utilizaron las siguientes soluciones: 0,4 M 1 H-tetrazol en ACN (catalizador); 3% ácido tricloroacétíco en DCM (destritilación), anhídrido acético:piridina:tetrahidrofurano (1 :1 :8) (solución de acetilación A), 10 % N-metilimídazol en tetrahidrofurano (solución de acetílación B), 0,01 M iodo en tetrahidrofurano:piridina:agua (7:2:1 ) (oxidación). En las secuencias de RNA, se eliminó el último DMT ya que el grupo DMT no es totalmente estable al tratamiento de fluoruro. El rendimiento medio por etapa de adición de un nucleótido fue alrededor del 97-98% para los monómeros de RNA. Los soportes polimérícos obtenidos se trataron con una solución concentrada de amoníaco-etanol (3:1 ) durante 1 h a 55Q C. Los soportes se lavaron con etanol y las soluciones resultantes se combinaron y se evaporaron a sequedad. Los productos resultantes se trataron con 0,15 mi de trietilamina- tris(hidrofluoruro):trietilamina:N-metilpírrolidona (4:3:6) durante 2,5 h a 65δ C con el fin de eliminar los grupos TBDMS. Las reacciones se detuvieron por adición de 0,3 mi de isopropoxitrimetilsilano y 0,75 mi de éter. Las mezclas resultantes se agitaron y se enfriaron a 4e C. Se formó un precipitado que fue centrifugado a 7.000 rpm durante 5 minutos a 49 C. Los precipitados se lavaron con éter y se centrifugaron de nuevo. Los residuos se disolvieron en agua y los conjugados se purificaron por HPLC. Para la HPLC se empleó la columna Nucleosil 120-10 C18 (250 x 4 mm). Se utilizó un gradiente lineal de 20 minutos desde 0% a 50%; con un flujo de 3 ml/minuto. La composición de las soluciones utilizadas en la HPLC fueron: solución A: 5% ACN en 100 mM acetato de trietilamonio (pH 6,5) y solución B: 70% ACN en 100 mM acetato de trietilamonio pH 6,5. Los productos purificados se analizaron por espectrometría de masas MALDI-TOF (del inglés " Matríx-Assisted Láser Desorption/lonization-Time oí Flighf).
Los espectros de MALDI-TOF se realizaron en un espectrómetro de masas Perseptive Voyager DETMRP, equipado con un láser de nitrógeno de 337 nm utilizando un pulso de 3 ns. La matriz utilizada contenía 2,4,6- trihidroxiacetofenona (THAP, 10 mg/ml en ACN:agua 1 :1 ) y citrato amónico (50 mg/ml en agua). Las siguientes secuencias de ARN se obtuvieron de fuentes comerciales (Sigma-Proligo, Dharmacon): cadena acompañante control negativo 5'- (mC)(mA)G UCG CGU UUG CGA CUG G-dT-dT-3' (SEQ ID NO: 3), cadena guía control negativo 5'-CCA GUC GCA AAC GCG ACU G-dT-dT-3' (SEQ ID NO: 4), cadena guía anti-TNF-α: 5'-GAG GCU GAG ACA UAG GCA C-dT-dT-3' (SEQ ID NO: 5), cadena acompañante anti-TNF-α: 5'-GUG CCU AUG UCU CAG CCU C-dT-dT-3' (SEQ ID NO: 2) y cadena acompañante anti-TNF-ct: 5'- (mG)(mU)G CCU AUG UCU CAG CCU C-dT-dT-3' (SEQ ID NO: 1 ). Los monómeros de tipo ARN (ribonucleótidos) se detallan en letras mayúsculas y la abreviación dT corresponde al desoxirribonucleótido timidina. Los monómeros de tipo 2'-O-metil-RNA se detallan entre paréntesis tal como: (mG), (mU), (mC) y (mA). Las secuencias de pARNi anti-TNF-α están descritas en Sorensen et al. J Mol Biol. 2003, 327: 761 -6. Tabla 2. Caracterización por espectrometría de masas de los derivados de ARN modificados.
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EJEMPLO 2: Inhibición de TNF-α in vitro.
Las cadenas guía y acompañante se hibridaron y el ARN de cadena doble resultante se utilizó para la inhibición de la expresión del gen TNF-α. Primero, se estudiaron las propiedades inhibitorias de los compuestos preparados en el ejemplo 1 en células HeLa. Estas células no expresan el gen de TNF-α de ratón por lo que previamente a la adición de los compuestos se transfectaron las células con un plásmido que contiene el gen de TNF-α de ratón.
En la Figura 1 se muestra el efecto biológico de OMe, OMe-Prop y Prop. La capacidad de silenciamiento de estos compuestos se evaluó tanto en líneas celulares (HeLa) como en cultivos primarios de macrofagos. Los resultados obtenidos con las células Hela utilizando oligofectamina demuestran que el compuesto de la invención OMe-Prop es capaz de unirse a RISC y silenciar TNF-α (Fig. 1 A) mientras que el pARNi de secuencia aleatoria (Ser) con modificaciones 2'-O-metilo no inhibe la producción de TNF-a. Cultivos celulares, transfección y ensayos celulares
Las células HeLa se cultivaron en condiciones habituales: 37s C, 5% CO2, en medio de Dulbecco modificado por Eagle, 10% suero fetal bovino (SFB), 2 mM L-glutamina suplementado con penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 mg/ml). Todos los experimentos se hicieron a una confluencia celular del 40- 60%. Las células HeLa se transfectaron con 250 ng del plásmido que expresa el gen de TNF-α de ratón utilizando lipofectina (Invitrogen) y siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se utilizaron tres protocolos diferentes de transfección según el tipo de células utilizado:
1 . - Una hora después de la transfección con el plásmido que expresa el gen de TNF-α de ratón, las células HeLa se transfectaron con 50nM de los compuestos diseñados para inhibir TNF-α, utilizando oligofectamina (Invitrogen). Al cabo de 48 h se determinó la concentración de TNF-α en los sobrenadantes del cultivo celular utilizando el ensayo de immunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) (Bender MedSystems) siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Se aislaron macrofagos peritoneales de ratones no tratados. En el peritoneo de los animales sacrificados se inyectó medio de cultivo y se recogió y aisló el líquido resultante. Las células obtenidas en este líquido se contaron y se sembraron. Este cultivo de macrofagos peritoneales se transfectó con los compuestos utilizando DOTAP (Roche) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Al cabo de 20 horas de la transfección, las células se estimularon con lipopolisacárido (LPS) 10 ng/ml durante 10 horas y la cantidad de TNF-a producida se determinó por el ensayo de ELISA. 3. -Las células de ratón 4T1 se cultivaron en las condiciones habituales. Estas células expresan el gen del TNF- de ratón de forma natural. Las soluciones que contienen 100 nM de cada uno de los compuestos y sus controles y un 10% de suero fetal bovino se incubaron unos minutos antes de su adición a las células. Al cabo de 24 h se determinó la cantidad de TNF-α producida por las células mediante un ensayo de tipo ELISA. Preparación de células adherentes mononucleares de sangre periférica (PBMC, del inglés "peripheral blood mononuclear cells")
Las PBMC se obtuvieron a partir de plasma humano utilizando la separación por gradientes de densidad utilizando Ficoll. Las poblaciones enriquecidas de monocitos se aislaron por su adherencia en plástico. Después de 3 horas de incubación a 37e C, las células se transfectaron con los compuestos y sus controles durante 18 horas utilizando DOTAP (Roche) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Los sobrenadantes de células se colectaron y la cantidad de TNF-α producida bajo immunoestimulación se determinó por ELISA.
Para evaluar los efectos secundarios de la transfección de los compuestos y sus controles, independientes del gen diana que se quiere silenciar, se realizó la transfección del cultivo primario de macrófagos con s.m, OMe, OMe-Prop y con Ser. Como puede observarse en la Figura 1 B, OMe-Prop muestra una mejora clara en la eficiencia inhibitoria, incrementado la resistencia a las nucleasas. Este efecto beneficioso se vuelve a reproducir cuando se utiliza OMe-Prop en células 4T1 (Figura 1 C). La capacidad inmunoestimuladora de los pARNi modificados se analizaron en PBMC procedentes de humanos sanos. Los pARNi diseñados para inhibir el TNF-α de ratón no pueden inhibir la expresión del TNF-α humano producido por las PBMC. Así, sí se produce una estimulación de la producción de TNF-a humano, esta estimulación es un efecto inespecífico. En la figura 2 se muestra la producción de TNF-α humano como respuesta no específica de la adición de pARNi sin modificar o modificados. En esta figura se muestra claramente que OMe-Prop, produce una reducción del 20 al 50% de la actividad inmunoestimuladora, comparado con s.m., a una concentración de 10 nM. Estos datos confirman que las modificaciones desarrolladas en esta invención provocan una respuesta inespecífica mucho menor que los pARNi sin modificar. Por lo tanto se demuestra que los efectos biológicos observados son específicos de la inhibición de TNF-α y no una respuesta inmunológica general inducida por los pARNi.
EJEMPLO 3: Inhibición de TNF-α in vivo. Se evaluó el impacto terapéutico en un modelo de la enfermedad del intestino inflamado en ratones, administrando los compuestos y sus controles directamente en el colon distal de los animales enfermos (administración rectal). En primer lugar, se evaluó la eficacia inhibidora en este modelo animal midiendo el ARN mensajero (ARNm) de TNF-ct por el método de la transcríptasa reversa y PCR cuantitativa, directamente sobre los extractos de ARN mensajero de colon.
Modelo de colitis inducido por 5% de dextrano sulfato sódico (DSS) en ratones C57BI/6
Los experimentos se realizaron con ratones hembras de la cepa C57BI/6 (Harían Ibérica). Los animales se cuidaron en condiciones habituales a una temperatura de 22Q C y una humedad relativa del 70-80%, en ciclos de luz/oscuridad de 12 horas.
Todos los protocolos usados con los animales se aprobaron por el comité ético de la Universidad Autónoma de Barcelona y los animales se trataron siguiendo las regulaciones europeas. La solución al 5% de DSS se añadió como agua de bebida a ratones de 10 semanas de vida. 6 animales fueron utilizados como controles sanos y no recibieron el tratamiento con DSS. 24 animales recibieron el tratamiento con DSS (MP Biomedicals; de peso molecular 36-50 kD) en el agua de bebida.
Durante el experimento, todos los animales dispusieron de agua y alimentos ad libitum (A04 chow, PanLab). Se controlaron el peso de los animales, la comida y el consumo de agua diariamente en cada jaula.
Evaluación del índice de actividad de la enfermedad (IAD) Durante el periodo del experimento, los animales se examinaron diariamente el estado de las siguientes variables: (i) estado general del animal, (ii) aspecto del pelo, (íii) aspecto y aparición de sangre en las heces {método de bencidina TMB), (iv) ingestión de comida y bebida (gramos o mi por día). El parámetro IAD se correlaciona bien con la evaluación histopatológica de la inflamación en las invaginaciones intestinales. El IAD se obtiene de la siguiente ponderación: % incremento de peso con respecto al día 1 (PC), de 0 a 4 puntos; consistencia de las heces, de 0 a 4 puntos; aspecto del animal, de 0 a 3 puntos; sangre en heces, de 0 a 3 puntos.
Protocolo de tratamiento con los compuestos y sus controles en el modelo de colitis
Los compuestos y sus controles se resuspendieron en agua libre de RNAsas y se mezclaron con Lipofectamina 2000 (Invitrogen, CA, USA). El complejo se administró en el recto de ratones anestesiados (4 nanomoles por ratón).
Anestesia y eutanasia Una mezcla de Ketamina y xilazina (Imalgene 1000, Merial labs, Rompun 2%, Bayer) se inyectó por vía intraperitoneal a una dosis de 55:15 mg/kg, diluida en tampón salino. Los animales se sacrificaron con una sobredosis de halotano y la sangre se extrajo vía punción cardiaca. A continuación, se extrajeron diferentes órganos, que fueron congelados para su análisis posterior.
Actividad de la enzima Mieloperoxidasa (MPO)
La MPO se localiza en los gránulos intracelulares de los neutrófílos polimorfonucleares (PMNN) y cataliza la conversión de peróxido de hidrógeno en agua y ión oxígeno. La actividad de MPO es una indicación cuantitativa del grado de infiltración de leucocitos en tejido inflamado. Para la medida de la actividad de MPO se utiliza O-díanisídina (Sigma) como cromógeno. Una unidad de actividad de MPO es la cantidad de enzima que convierte 1 micromol de peróxido de hidrógeno en agua, en un minuto.
Histología
Las muestras de colon de los animales tratados para histología se lavaron con solución salina de fosfato. Para preservar la morfología y la composición del tejido se fijaron con paraformaldehido al 4% y a continuación se deshidrataron con un gradiente de etanol. El tejido se fijó en parafina en presencia de toluol. El bloque de parafina se cortó en secciones de 8 micrometros de grosor, que se tiñeron con hematoxilina/eosina.
Estadística Todos los datos obtenidos se representaron y se analizaron estadísticamente con un paquete informático (GraphPad Prism versión 5.0 para Windows). Los grupos de tratamiento se analizaron con el método ANOVA de un factor y ensayo posterior no paramétrico (Newman-Koels). *<0,05%, **<0,01 % y ***<0,001 %.
Análisis de los niveles de producción del ARN mensajero de TNF-g en el colon de los ratones por PCR cuantitativa. Para la purificación del ARN total tanto de células como de tejidos, se ha utilizado el RNeasy Mini Kit (Qiagen), de acuerdo a las instrucciones del fabricante y para la obtención de ADN molde (ADN copia (ADNc) del ARNm) se realizó la retrotranscripción del ARNm, se utilizo el equipo comercial Redy-To- Go You-Príme First-Strand Beads (Amersham Biosciences) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc obtenido de las muestras a estudiar, se utiliza como molde para amplificarse mediante la PCR cuantitativa. Para detectar la modulación del mensajero de TNF-oc se ha utilizado el ensayo con sonda Taqman número Mm00443258__m1 (Assay on Demand Gene Expression) en el aparato ABI Prism 7700 Sequence Detection System de Applied Biosystems.
La Figura 3 muestra que el modelo de enfermedad inducido por la administración de una solución el 5% de DSS produce un aumento de los niveles de TNF-ct al cabo de 3 días de la administración. Se puede ver el gran incremento de TNF-α en el colon de los ratones que han sido tratados con DSS y Ser, en comparación con los que no han sido tratados con DSS (sanos).
En las condiciones experimentales escogidas (ratones C57BI/6, 5% de DSS de peso molecular 36-50 KDa durante 3 días), el tratamiento con el compuesto OMe-Prop administrado 56 horas después del inicio del tratamiento con una solución al 5% de DSS, redujo los niveles de ARN mensajero de TNF-α en un 40%, demostrando que el pARNi modificado es efectivo en el modelo de colitis por administración rectal.
La figura 4 muestra que los compuestos de la invención son capaces de detener el desarrollo de la enfermedad como consecuencia de la disminución de los niveles de de ARNm de TNF-α. Se analizaron los parámetros clínicos de la enfermedad a los 8 días después de iniciar el tratamiento con DSS. Los ratones se trataron con los compuestos y sus controles en los días 2 y 4, utilizando 4 nanomoles en cada uno de los tratamientos. La Figura 4 muestra que el tratamiento con OMe-Prop produce una mejora significativa tanto cualitativa como cuantitativa en los parámetros clínicos de la colitis en los animales tratados, en comparación con los animales tratados con s.m. o con Ser. La longitud del colon (Figura 4D), el peso del colon (Figuras 4A y 4E) y la relación longitud/peso del colon (Figura 4F) son significativamente mejores en los animales tratados con OMe-Prop. El índice de la actividad de la enfermedad (IAD) (figuras 4B y 4C) indica una mejoría en los animales tratados con OMe- Prop. También, la valoración histológica muestra un impacto beneficioso importante en los animales tratados con OMe-Prop. El grado de inflamación determinado por la actividad MPO (Figura 4G) en extractos de colon tratados también muestra una reducción significativa después del tratamiento con OMe- Prop. Pero el parámetro más importante, que es el grado de supervivencia, también es claramente mejor en los animales tratados con OMe-Prop, mostrando que los efectos beneficiosos observados localmente en el grado de inflamación del colon se traducen en una mejora significativa del estado fisiológico general del animal.

Claims

REIVINDICACIONES
1 .- Un compuesto de fórmula pARNi-P-O-R donde: i) pARNi es un pequeño ARN de interferencia que comprende al menos una modificación 2'-O-metilo; ii) -P-O- representa un enlace fosfodiéster que une R a la posición 3' de cualquiera de las cadenas guía y acompañante del pARNi; y iii) donde R es un radical que se selecciona entre: un d-C6 alquilo sustituido con al menos un grupo -OH; un C4-C6 cícloalquilo sustituido con al menos un grupo -OH; un C4-C6 heterocicloalquílo; una cadena heteroalquílica de entre 2 y 7 átomos, donde al menos uno de los átomos de la cadena es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre, preferiblemente la cadena está sustituida con al menos un grupo -OH; y un heteroarilo cuyo anillo esta formado entre 3 y 6 átomos y al menos uno de esos átomos es un átomo de oxígeno.
2.- El compuesto según la reivindicación anterior, donde la cadena guía del pARNi del compuesto de la invención inhibe o silencia, total o parcialmente, la expresión de una molécula proínflamatoria.
3. - El compuesto según la reivindicación anterior, donde la cadena guía inhibe o silencia la expresión de al menos uno de los genes de la lista que comprende: factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α); ínterleuquina 1 beta; interleuquina 6; e ínterleuquina 8.
4. - El compuesto según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde la cadena guía inhibe o silencia la expresión del gen de TNF-α o del de la interleuquina 1 beta.
5. - El compuesto según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, donde la cadena guía inhibe o silencia la expresión del gen de TNF-a.
6. - El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R es un alquilo CrC6 sustituido con al menos un grupo -OH.
7. - El compuesto según la reivindicación anterior, donde R es un alquilo C2-C4 sustituido con uno o dos grupos -OH.
8.- El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el enlace fosfodiéster une una molécula de 1 ,2-propandiol o 1 ,3-propandiol, preferiblemente de 1 ,3-propandíol, a la posición 3' de cualquiera de las cadenas del pARNi.
9.- El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde R es un C4-C6 cicloalquilo sustituido con al menos un grupo -OH.
10. - El compuesto según la reivindicación anterior, donde el enlace fosfodiéster une una molécula de 4-ciclohexandiol a la posición 3' de cualquiera de las cadenas del pARNi.
1 1 . - El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde R es un C4-C6 heterocicloalquilo, preferiblemente sustituido con al menos un grupo - OH.
12. - El compuesto según la reivindicación anterior, donde R es un oxetanílo, aziridinilo, azetidinilo, tetrahidrofuranilo, pirrolidinilo, morfolinilo, ditianilo, tiomorfolinilo, píperidinílo, tetrahidropiranílo, piperazinílo o tritianilo.
13.- El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde R es una cadena heteroalquílica de entre 2 y 7 átomos, donde al menos uno de los átomos de la cadena es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre.
14.- El compuesto según la reivindicación anterior, donde R es una cadena heteroalquílica de entre 4 y 6 átomos donde al menos uno de los átomos de la cadena es un átomo de oxígeno o un átomo de azufre.
15.- El compuesto según la reivindicación anterior, donde el enlace fosfodiéster une una molécula de dietilenglicol o dietilenglicoltíoéter a la posición 3' de cualquiera de las cadenas del pARNi.
16. - El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde R es un heteroarilo formado por entre 3 y 6 átomos y al menos uno de esos átomos es un átomo de oxígeno.
17. - El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R está unido a través de un enlace fosfodiéster a la posición 3' de la cadena acompañante.
18. - El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde entre 1 y 7 nucleótidos que forman el pARNi comprenden una modificación 2'- O-metilo.
19. - El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los nucleótidos que forman el pARNi que comprenden la modificación 2'-0- metilo están en el extremo 5'.
20.- El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los nucleótidos que forman el pARNi que comprenden modificaciones 2'-0- metilo están en la cadena acompañante.
21 .- El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde al menos un nucleótido que forma el pARNi es un desoxirribonucleótido.
22. - El compuesto según la reivindicación anterior, donde al menos un nucleótido del extremo 3' del pARNi es un desoxirribonucleótido.
23. - El compuesto según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde los desoxirribonucleótidos del extremo 3' del pARNi son desoxirribonucleótidos de timídina.
24. - El compuesto según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, donde los desoxirribonucleótidos están en el extremo 3' de la cadena acompañante del pARNi.
25. - El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde cada cadena del pARNi comprende entre 15 y 40 nucleótidos.
26.- El compuesto según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde la secuencia de la cadena acompañante del pARNi es SEQ ID NO: 1 .
27. - El compuesto según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, donde la secuencia de la cadena guía del pARNi es SEQ ID NO: 5.
28. - El compuesto según cualquiera de las cuatro reivindicaciones anteriores, donde la secuencia de la cadena acompañante del pARNi es SEQ ID NO: 1 y la secuencia de la cadena guía del pARNi es SEQ ID NO: 5.
29.- Una composición farmacéutica que comprende el compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
30. - La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, que además comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
31 . - La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, donde el vehículo o diluyente es un agente de transfección.
32. - La composición farmacéutica según ia reivindicación anterior, donde el agente de transfección se selecciona de la lista que comprende polietilenglicol, colesterol, polietilenimida (PEI), péptidos de penetración celular, oligoarginina, poli-lisina, glicoproteína del virus de la rabia, nanopartículas de oro, dendrímeros, nanotubos de carbono y lípidos.
33. - La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, donde el agente de transfección es un lípído.
34.- La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, donde el lípido es un lípido catiónico.
35. - La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, donde el lípido catiónico es un liposoma.
36. - La composición farmacéutica según cualquiera de las siete reivindicaciones anteriores, que además comprende otra sustancia biológicamente activa.
37.- Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 o de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 36 para la preparación de un medicamento.
38. - Uso según la reivindicación anterior para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.
39. - Uso según la reivindicación anterior para el tratamiento de una enfermedad que se selecciona de la lista que comprende: enfermedad del intestino inflamado, artritis reumatoide, osteoartritis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
40.- Uso según la reivindicación anterior donde la enfermedad inflamatoria es la enfermedad del intestino inflamado.
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