WO2012057591A2 - 콩 불마름병 저항성 유전자 - Google Patents

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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention is a marker composition for diagnosing resistance to soybean fire blight, a composition for diagnosing resistance to soybean fire blight comprising a primer specifically binding to the marker gene as an active ingredient, soybean fire blight comprising the composition Resistant diagnostic kits and methods for diagnosing resistance to soybean blight.
  • Soybeans are an important food crop in the world and a very important crop in terms of the cropping system for maintaining and enhancing the intelligence.
  • Soybean fire blight is Xanthomonas axonopodis pv. Caused by glycines, it has been reported to reduce seed count and granule weight, leading to a decrease in yield (Arun et al. 1993, Weber et al. 1966, Lee 1999), or to lower the protein content of the key nutrients (Hartwig). & Johnson 1953).
  • the causative agent of soybean fire blight overwinters in the tissues of seeds and pathogens and occurs primarily in the seedlings' leaflets, spreading upward along the leaves. In particular, it develops at high temperature and high humidity conditions, and has a high temperature characteristic that does not stop the disease progression even when the weather gets hot. Soybean fire blight is widely distributed around the world due to its strong pathogenicity, and has been spreading nationwide since it was reported in the 1970s in Korea. Ninety percent of the total 106 field surveys conducted during 1997-19988 confirmed soybean burning (Lee 1999).
  • the present inventors have completed the present invention by identifying marker genes for diagnosing resistance to soybean fire dryness as a result of trying to develop soybean fire dryness resistant sarcoma.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing resistance to soybean burning disease comprising a substance for measuring the expression level of the marker.
  • Still another object of the present invention is to provide a diagnostic kit for resistance to soybean fire dryness and a method for diagnosing resistance to soybean fire dryness comprising the composition.
  • the present invention is AB052784 (SEQ ID NO: 1), AF022780 (SEQ ID NO: 2), BI944059 (SEQ ID NO: 3), U13987 (SEQ ID NO: 4), D86929 (SEQ ID NO: 5), BE823110 (SEQ ID NO: 6 ), FG999662 (SEQ ID NO: 7), CX710871 (SEQ ID NO: 8 or 18), AF055369 (SEQ ID NO: 9), CS226295 (SEQ ID NO: 10), BU550410 (SEQ ID NO: 11), EV281281 (SEQ ID NO: 12), EV276436 (SEQ ID NO: 13), EF551167 (SEQ ID NO: 14), EH258681 (SEQ ID NO: 15), CX709057 (SEQ ID NO: 16), and CX702069 (SEQ ID NO: 17) to diagnose resistance to soybean fire blight containing any one gene selected from the group consisting of It provides
  • the present invention provides a composition for diagnosing resistance to soybean fire blight comprising any one or more primers selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 19 to 52.
  • the present invention also provides a diagnostic kit for resistance to soybean fire disease and a method for diagnosing resistance to soybean fire dryness comprising the composition.
  • Figure 1 shows the microarray data and real-time PCR results of soybean fire blight gene AB052784 according to the present invention.
  • Figure 2 shows the microarray data and real-time PCR results of soybean fire blight gene AF022780 according to the present invention.
  • Figure 3 shows the microarray data and real-time PCR results of the soybean fire blight gene BI944059 according to the present invention.
  • Figure 4 shows the microarray data and real-time PCR results of soybean fire blight gene U13987 according to the present invention.
  • Figure 5 shows the microarray data and real-time PCR results of soybean fire blight gene D86929 according to the present invention.
  • Figure 6 shows the microarray data and real-time PCR results of soybean fire blight gene BE823110 according to the present invention.
  • Figure 7 shows the microarray data and real-time PCR results of the soybean fire blight gene FG999662 according to the present invention.
  • Figure 8 shows the microarray data and real-time PCR results of soybean fire blight gene CX710871 according to the present invention.
  • Figure 9 shows the microarray data and real-time PCR results of soybean fire blight gene AF055369 according to the present invention.
  • Figure 10 shows the microarray data and real-time PCR results of soybean fire blight gene CS226295 according to the present invention.
  • Figure 11 shows the microarray data and real-time PCR results of the soybean fire blight gene BU550410 according to the present invention.
  • Figure 12 shows the microarray data and Real-time PCR results of soybean fire blight gene EV281281 according to the present invention.
  • Figure 13 shows the microarray data and real-time PCR results of the soy fire blight gene EV276436 according to the present invention.
  • Figure 14 shows the microarray data and real-time PCR results of soybean fire blight gene EF551167 according to the present invention.
  • Figure 15 shows the microarray data and real-time PCR results of soybean fire blight gene EH258681 according to the present invention.
  • Figure 16 shows the microarray data and real-time PCR results of soybean fire blight gene CX709057 according to the present invention.
  • Figure 17 shows the microarray data and real-time PCR results of soybean fire blight gene CX702069 according to the present invention.
  • FIG. 18 is a diagram analyzing the degree of resistance to soybean blight depending on the treatment concentration of sucrose.
  • the present invention is directed to AB052784 (Glycine max mRNA for nitrate transporter NRT1-1, SEQ ID NO: 1), AF022780 (Glycine max nitrate reductase (BCNR-A), SEQ ID NO: 2), BI944059 (sq64f11.y1 Gm-c1048 Glycine max) cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1048-262 5- similar to TR: O82161 O82161 PHI-1 PROTEIN, SEQ ID NO: 3), U13987 (Glycine max inducible nitrate reductase 2 (INR2), SEQ ID NO: 4), D86929 (Glycine max mRNA for uricase, SEQ ID NO: 5), BE823110 (GM700020A10D10 Gm-r1070 Glycine max cDNA clone Gm-r1070-7843 3-, SEQ ID NO: 6),
  • the gene is derived from soybean and includes both genomic DNA and cDNA. Variants of the above base sequences are also included within the scope of the present invention. Specifically, the gene includes a nucleotide sequence having at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 17, respectively. can do.
  • the present invention provides a composition for diagnosing resistance to soybean burning, comprising a substance measuring the gene expression level.
  • the diagnostic composition for resistance to soybean burning disease of the present invention provides any one or more primers selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 19 to 52.
  • a "primer” is a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group, which can form complementary templates and base pairs and serves as a starting point for template strand copying. Means a short nucleic acid sequence. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different deoxynucleoside triphospates (dNTPs) and reagents for polymerisation (DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffers and temperatures.
  • dNTPs deoxynucleoside triphospates
  • DNA polymerase or reverse transcriptase reverse transcriptase
  • the primer according to the present invention refers to a primer that can be hybridized complementarily to a marker gene for diagnosing resistance to soybean burning, preferably AB052784 (SEQ ID NO: 1), AF022780 (SEQ ID NO: 2), BI944059 ( SEQ ID NO: 3), U13987 (SEQ ID NO: 4), D86929 (SEQ ID NO: 5), BE823110 (SEQ ID NO: 6), FG999662 (SEQ ID NO: 7), CX710871 (SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 18), AF055369 (SEQ ID NO: 9) , CS226295 (SEQ ID NO: 10), BU550410 (SEQ ID NO: 11), EV281281 (SEQ ID NO: 12), EV276436 (SEQ ID NO: 13), EF551167 (SEQ ID NO: 14), EH258681 (SEQ ID NO: 15), CX709057 (SEQ ID NO: 16), and Primers or primer pairs
  • primer nucleic acid sequences of the present invention may, if necessary, include a label that can be detected directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means.
  • labels include enzymes (eg horseradish peroxidase, alkaline phosphatase), radioisotopes (eg 32P), fluorescent molecules, chemical groups (eg biotin), and the like.
  • Primer pairs in the present invention include primer pairs of all combinations of forward and reverse primers that recognize the target gene sequence, but are preferably primer pairs that provide assay results with specificity and sensitivity.
  • the diagnostic composition for resistance to soybean fire dryness of the present invention may include a probe that specifically binds to the gene.
  • probe refers to nucleic acid fragments such as RNA or DNA corresponding to short bases of several hundred bases and hundreds of bases capable of specific binding with mRNA, and are labeled to confirm the presence or absence of a specific mRNA.
  • Probes may be prepared in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes, and the like.
  • Primers or probes of the invention can be synthesized chemically using phosphoramidite solid support methods, or other well known methods. Such nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, substitution with one or more homologs of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, eg, uncharged linkages such as methyl phosphonate, phosphoester, phosphoroami Date, carbamate, etc.) or charged linkages such as phosphorothioate, phosphorodithioate and the like.
  • the diagnostic composition for resistance to soybean fire dryness of the present invention may include a material capable of measuring the protein level encoded by the gene.
  • a material capable of measuring the protein level encoded by the gene may include "antibodies” such as polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies. Generating antibodies can be readily prepared by those skilled in the art using known techniques. Polyclonal antibodies can be produced by methods well known in the art for injecting a protein antigen encoded by the gene into an animal and collecting blood from the animal to obtain a serum comprising the antibody. Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal species host, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, cattle, dogs, and the like.
  • Monoclonal antibodies are well known in the art by the hybridoma method (see Kohler and Milstein (1976) European Journal of Immunology 6: 511-519), or phage antibody libraries (Clackson et al, Nature, 352). : 624-628, 1991; Markset al, J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597, 1991) .
  • Antibodies of the invention can also be prepared using two full length light chains and As well as complete forms having two full-length heavy chains, as well as functional fragments of the antibody molecule, which refers to fragments having at least antigen binding function, Fab, F (ab '), F (ab ') 2 and Fv.
  • the present invention provides a diagnostic kit for resistance to soybean fire comprising the composition for diagnosing resistance to soybean fire.
  • the diagnostic kit of the present invention may further comprise one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method.
  • the diagnostic kit relates to a kit for detecting a diagnostic marker including the necessary elements necessary to perform RT-PCR.
  • the RT-PCR kit includes a test tube or other suitable container, reaction buffers (pH and magnesium concentrations vary), deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerases and reverse transcriptases, in addition to each primer pair specific for the marker gene.
  • dNTPs deoxynucleotides
  • Taq-polymerases Taq-polymerases and reverse transcriptases
  • Such as enzymes, DNase, RNase inhibitors, DEPC-water (DEPC-water) may include sterile water and the like. It may also include primer pairs specific for the gene used as the quantitative control.
  • the diagnostic kit may be a DNA chip kit including essential elements necessary for performing the microarray method.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which
  • the diagnostic kit may be a diagnostic kit including the necessary elements necessary to perform the ELISA.
  • ELISA kits may include reagents capable of detecting bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromopores, enzymes (eg, conjugated with antibodies) and substrates thereof. It may also include antibodies specific for quantitative control proteins.
  • the protein measurement using the antibody in the present invention may include a diagnostic method using a protein chip.
  • the protein chip may include a substrate to which an antibody is attached.
  • protein measurement using antibodies includes a substrate for surface plasma detection (SPR).
  • microarray refers to a microarray in which a polynucleotide or polypeptide group is immobilized at a high density on a substrate, and each of the polynucleotide or polypeptide group is immobilized in a predetermined region, which is a DNA.
  • Chip or PNA (Peptide Nucleic Acid) chip or protein chip but is not limited thereto.
  • Such microarrays are well known in the art. Microarrays are disclosed, for example, in US Pat. Nos. 5,445,934 and 5,744,305, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • the present invention provides a method for diagnosing resistance to soybean burning.
  • Saturn // Lee / Seonheuk's F7 strain was screened as a material for microarray analysis by inoculation and morbidity of major soybean growing strains and RIL 160 strains.
  • the fire blight pathogen used in the present invention was cultured in PDA (potato dextrose agar) medium for 2 days in bacteria stored at ⁇ 70 ° C., and then it was primary passaged and secondary cultured in large quantities for inoculation.
  • PDA potato dextrose agar
  • PDA medium was prepared by the following method. First, 35 g of PDA powder was added to 1 L of distilled water and sterilized at 121 ° C. for 15 minutes. When the sterilized medium is cooled to approximately 50 ⁇ 55 °C about 15 ⁇ 20ml by Petri dish was hardened and refrigerated at 4 °C was used. Refrigerated PDA medium was placed in a 28 ° C. thermostat for 2 hours prior to use to reduce temperature shock. After that, the bacteria were streaking (Bloom et al., 1996) and incubated at 28 ° C. for 1.5-2 days. The colony of fire blight pathogens cultured at 28 ° C. for about 2 days was pale yellow on the medium.
  • Inoculation was carried out at the time of V3 with two main leaves.
  • the invasion path of soybean fire blight pathogens was inoculated during the day when the pores were open because the pores of the wound, hand and leaf.
  • sufficient moisture was supplied before the inoculation to supply adequate humidity, and the inoculation was inoculated around 4-5 pm.
  • Inoculation was sprayed with inoculum suspensions on the front and back of leaves until watersoaking appeared (Groth and Braun, 1986). Inoculation strain density was 8ra (106 ⁇ 107cfu).
  • Samples were collected (one grain per 5 ⁇ ) after 3 hours, 12 hours, 24 hours, 3 days and 10 days of soybean blight pathogen inoculation.
  • RNA for DNA chip analysis was extracted from TRIzol TM reagent (Invitrogen, USA) from one sample. Quantitative and qualitative analysis of the total RNA extracted using Agilent's Bioanalyzer 2100 RNA nano kit (Agilent Technologies, USA) was conducted to determine the suitability for DNA chip analysis.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • NH National Institutes of Health
  • Agilent's eArray software http://earray.chem.agilent.com/earray/
  • a probe for DNA microarray production was designed, and a 60-mer oligonucleotide microarray was produced using an eArray system (Agilent Technologies, USA).
  • the control sample was labeled with Cy3 (green color), and each experimental group was labeled with Cy5 (red color), and hybridization was performed on the prepared DNA chip in a 2-channel manner.
  • total RNA was amplified using Low RNA Input Linear Amplification kit PLUS (Agilent Technologies, USA), and chip analysis procedures (including chip scanning) were also performed using methods, kits, and equipment provided by Agilent. It was.
  • DNA chip data analysis was performed using the Feature Extraction program and GeneSpring 7.3.1 software (Agilent Technologies, USA) to calculate signal intensity values, normalization (Lowess), grouping, and statistical analysis (ANOVA tests). ) was performed.
  • microarray data analyzed in Examples 3 and 4 and the results of Real-time PCR were consistent with each other (FIGS. 1 to 17).
  • the 17 genes were confirmed to be soybean fire resistant gene.

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Abstract

본 발명은 콩 불마름병에 대한 저항성을 진단하기 위한 마커 조성물, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 프라이머를 유효성분으로 포함하는 콩 불마름병에 대한 저항성 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 콩 불마름병에 대한 저항성 진단 키트 및 콩 불마름병에 대한 저항성을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 마커를 이용하여, 콩 불마름병에 저항성이 있는 우량 품종 개발이 가능하다.

Description

콩 불마름병 저항성 유전자
본 발명은 콩 불마름병에 대한 저항성을 진단하기 위한 마커 조성물, 상기 마커 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 유효성분으로 포함하는 콩 불마름병에 대한 저항성 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 콩 불마름병에 대한 저항성 진단 키트 및 콩 불마름병에 대한 저항성을 진단하는 방법에 관한 것이다.
콩은 세계적으로 중요한 식량작물이며 지력유지 및 증진을 위한 작부체계 측면에서도 매우 중요한 작물이다.
콩 불마름병은 Xanthomonas axonopodis pv. glycines에 의해 발병하며 종자수, 백립중을 감소시켜 수확량의 감소를 일으키거나(Arun et al. 1993, Weber et al. 1966, Lee 1999), 종실 주요 영양성분인 단백질 함량을 낮추는 것으로 보고되었다(Hartwig & Johnson 1953). 콩 불마름병을 일으키는 병원균은 종자, 이병식물체의 조직에서 월동하며 유묘의 초생엽에서 1 차로 발생, 잎을 따라 위쪽으로 확산된다. 특히 고온 다습한 환경조건에서 최대로 발병되며 날씨가 더워져도 병의 진전이 정지되지 않는 고온성 특성을 가지고 있다. 콩 불마름병은 병원성이 강해 전 세계적으로 분포하고 있으며, 우리나라에서는 1970년대 보고된 이후 근래 전국적으로 확산되고 있는 추세이다. 1997~19988년 2년 동안 수행된 전국 106개 포장 조사에서 전체의 90%에서 콩 불마름병 발생이 확인되었다(Lee 1999).
현재까지 한국에서는 콩 불마름병 방제를 위한 약제나 저항성 품종이 개발되어 있지 못한 실정이며, 이를 방제하고자 농약 등의 화학약제의 과도한 사용으로 인하여 환경오염 및 인체에 악영향을 미치고 있다.
이에 본 발명자들은 콩 불마름병 저항성 육종을 개발하고자 노력한 결과, 콩 불마름병에 대한 저항성을 진단하기 위한 마커 유전자를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 콩 불마름병에 대한 저항성을 진단하기 위한 마커 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 마커의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 콩 불마름병에 대한 저항성 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 콩 불마름병에 대한 저항성 진단 키트 및 콩 불마름병에 대한 저항성을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 AB052784 (서열번호 1), AF022780 (서열번호 2), BI944059 (서열번호 3), U13987 (서열번호 4), D86929 (서열번호 5), BE823110 (서열번호 6), FG999662 (서열번호 7), CX710871 (서열번호 8 또는 18), AF055369 (서열번호 9), CS226295 (서열번호 10), BU550410 (서열번호 11), EV281281 (서열번호 12), EV276436 (서열번호 13), EF551167 (서열번호 14), EH258681 (서열번호 15), CX709057 (서열번호 16) 및 CX702069 (서열번호 17)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 유전자를 포함하는 콩 불마름병에 대한 저항성을 진단하기 위한 마커 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 19 내지 52로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머를 포함하는 콩 불마름병에 대한 저항성 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 콩 불마름병에 대한 저항성 진단 키트 및 콩 불마름병에 대한 저항성을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 콩 불마름병에 대한 저항성을 진단하기 위한 마커 유전자를 이용하여 콩 불마름병 저항성 품종을 육성함으로써 내재해성, 고품질의 우량 품종 육성이 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 콩 불마름병 유전자 AB052784의 Microarray data와 Real-time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 콩 불마름병 유전자 AF022780의 Microarray data와 Real-time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 콩 불마름병 유전자 BI944059의 Microarray data와 Real-time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 콩 불마름병 유전자 U13987의 Microarray data와 Real-time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 콩 불마름병 유전자 D86929의 Microarray data와 Real-time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 콩 불마름병 유전자 BE823110의 Microarray data와 Real-time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 콩 불마름병 유전자 FG999662의 Microarray data와 Real-time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 콩 불마름병 유전자 CX710871의 Microarray data와 Real-time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 콩 불마름병 유전자 AF055369의 Microarray data와 Real-time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에 따른 콩 불마름병 유전자 CS226295의 Microarray data와 Real-time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에 따른 콩 불마름병 유전자 BU550410의 Microarray data와 Real-time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명에 따른 콩 불마름병 유전자 EV281281의 Microarray data와 Real-time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명에 따른 콩 불마름병 유전자 EV276436의 Microarray data와 Real-time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명에 따른 콩 불마름병 유전자 EF551167의 Microarray data와 Real-time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명에 따른 콩 불마름병 유전자 EH258681의 Microarray data와 Real-time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명에 따른 콩 불마름병 유전자 CX709057의 Microarray data와 Real-time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명에 따른 콩 불마름병 유전자 CX702069의 Microarray data와 Real-time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 수크로스의 처리 농도에 따라 콩 불마름병 저항성의 정도를 분석한 그림이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
한 양태로써 본 발명은 AB052784 (Glycine max mRNA for nitrate transporter NRT1-1, 서열번호 1), AF022780 (Glycine max nitrate reductase (BCNR-A), 서열번호 2), BI944059 (sq64f11.y1 Gm-c1048 Glycine max cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1048-262 5- similar to TR:O82161 O82161 PHI-1 PROTEIN, 서열번호 3), U13987 (Glycine max inducible nitrate reductase 2 (INR2), 서열번호 4), D86929 (Glycine max mRNA for uricase, 서열번호 5), BE823110 (GM700020A10D10 Gm-r1070 Glycine max cDNA clone Gm-r1070-7843 3-, 서열번호 6), FG999662 (GLPAC22TF JCVI-SOY1 Glycine max cDNA 5-, 서열번호 7), CX710871 (gmrtDrNS01_24-D_M13R_D08_058.s3 Water stressed 48h segment 1 gmrtDrNS01 Glycine max cDNA 3-, 서열번호 8 (CX710871-Glyma15g08800.1) 또는 서열번호 18 (CX710871-Glyma15g08800.2)), AF055369 (Glycine max nitrate reductase (nr2) gene, 서열번호 9), CS226295 (Sequence 78 from Patent WO2005098015, 서열번호 10), BU550410 (GM880017B20A09 Gm-r1088 Glycine max cDNA clone Gm-r1088-6186 3-, 서열번호 11), EV281281 (GLNB304TF JCVI-SOY3 Glycine max cDNA 5-, 서열번호 12), EV276436 (GLMCT07TF JCVI-SOY2 Glycine max cDNA 5-, 서열번호 13), EF551167 (Glycine max dehydration-responsive element binding protein 7, 서열번호 14), EH258681 (JGI_ACBU2446.fwd ACBU Phakopsora pachyrhizi infected soybean leaf tissue 6-8 days post inoculation with TW72-1 urediniospores Glycine max cDNA clone ACBU2446 5-, 서열번호 15), CX709057 (gmrtDrNS01_03-D_M13R_B04_030.s4 Water stressed 48h segment 2 gmrtDrNS01 Glycine max cDNA 3-, 서열번호 16) 및 CX702069 (gmrtDrNS01_01-B_T3_D02_010.s0 Water stressed gmrtDrNS01 Glycine max cDNA 3-, 서열번호 17)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 유전자를 포함하는 콩 불마름병에 대한 저항성을 진단하기 위한 마커 조성물을 제공한다.
상기 유전자는 콩 유래이며, 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 또한 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로 상기 유전자는 서열 번호 1 내지 17의 염기서열과 각각 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 %이상, 가장 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 양태로써 본 발명은 상기 유전자 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 콩 불마름병에 대한 저항성 진단용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 콩 불마름병에 대한 저항성 진단용 조성물은 서열번호 19 내지 52로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머를 제공한다.
본 발명에서 "프라이머"란 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머는 콩 불마름병에 대한 저항성을 진단하기 위한 마커 유전자에 상보적으로 혼성화될 수 있는 프라이머를 말하며, 바람직하게는 상기 AB052784 (서열번호 1), AF022780 (서열번호 2), BI944059 (서열번호 3), U13987 (서열번호 4), D86929 (서열번호 5), BE823110 (서열번호 6), FG999662 (서열번호 7), CX710871 (서열번호 8 또는 서열번호 18), AF055369 (서열번호 9), CS226295 (서열번호 10), BU550410 (서열번호 11), EV281281 (서열번호 12), EV276436 (서열번호 13), EF551167 (서열번호 14), EH258681 (서열번호 15), CX709057 (서열번호 16) 및 CX702069 (서열번호 17)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 유전자를 증폭할 수 있는 7개 내지 50개의 뉴클레오티드 서열을 가진 프라이머 또는 프라이머 쌍 (센스(정방향) 및 안티센스(역방향) 핵산)일 수 있으며, 구체적인 서열은 표 1에 개시하였다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어,32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴)등이 있다. 본 발명에서 프라이머 쌍은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다.
또한 본 발명의 콩 불마름병에 대한 저항성 진단용 조성물은 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함할 수 있다.
본 발명에서 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
또한 본 발명의 콩 불마름병에 대한 저항성 진단용 조성물은 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질 수준을 측정할 수 있는 물질을 포함할 수 있다. 이는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 "항체"를 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법((hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Markset al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
또 다른 양태로써 본 발명은 상기 콩 불마름병에 대한 저항성 진단용 조성물을 포함하는 콩 불마름병에 대한 저항성 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 진단 키트는, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 진단키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단 마커 검출용 키트에 관한 것이다. RT-PCR 키트는, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한, 바람직하게, 상기 진단 키트는 마이크로어레이법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 DNA칩 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA나 올리고 염기가 부착되어 있는 기판을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 단백질 수준을 측정하는 제재가 바람직하게 항체인 경우, 상기 진단키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단 키트일 수 있다. 이러한 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소(예:항체와 접합) 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 또한 본 발명에서 항체를 이용한 단백질 측정에는 단백질칩을 이용한 진단방법이 포함될 수 있다. 단백질칩은 항체가 부착되어 있는 기판을 포함할 수 있다. 또한 항체를 이용한 단백질 측정에는 SPR (Surface Plasmon Resonance) 검출을 위한 기판이 포함된다.
본 발명의 명세서에서, "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미하며, 이는 DNA 칩 또는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 칩 또는 단백질 칩일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다.
또 다른 양태로써 본 발명은 콩 불마름병에 대한 저항성을 진단하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 일 예에 지나지 않으며, 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 콩 불마름병 병원균의 접종
주요 콩 육성 계통 및 RIL 160 계통의 불마름병 (8ra) 접종 및 이병도 조사를 하여 Saturn//Lee/Seonheuk 의 F7 계통을 Microarray 분석을 위한 재료로 선별하였다.
본 발명에 이용한 불마름병 병원균은 -70℃에 보관되어 있는 균을 PDA (potato dextrose agar) 배지에서 2일간 배양한 후, 이를 1차 계대배양하고 접종을 위해 대량으로 2차 배양하여 이용하였다.
PDA 배지는 하기와 같은 방법으로 제조되었다. 먼저 PDA powder 35g을 1ℓ 증류수에 첨가하여 121℃에서 15분간 멸균(autoclave)하였다. 멸균된 배지가 대략 50~55℃정도로 식으면 페트리디쉬에 약 15~20㎖씩 분주하여 굳힌 후 4℃에서 냉장보관하여 사용하였다. 냉장보관 상태의 PDA 배지는 temperature shock을 줄이기 위해 이용하기 전 2시간 동안 28℃ 항온기에 넣어두었다. 이 후 균을 streaking (Bloom et al., 1996)하여 28℃에서 1.5~2일간 배양하였다. 28℃에서 약 2일 동안 배양된 불마름병 병원균의 colony는 배지 상에서 연한 노란색을 띠었으며, 페트리디쉬당 약 2㎖의 증류수를 첨가하여 삼각유리봉을 이용하여 긁어서 모은 후 현탁하고, UV (visible spectrophotometer)를 이용하여 600㎚의 파장에서 흡광도 0.3~0.5 (108colony forming units (cfu) per milliliter)가 되도록 증류수로 희석하여 접종에 이용하였다.
접종은 본엽이 2매인 V3 시기에 하였다. 콩 불마름병 병원균의 침입경로는 상처, 수공 및 잎의 기공이므로 기공이 열려 있는 낮 동안 접종하였다. 온실접종으로 지나친 고온으로 세균의 활력이 낮아지는 것을 줄이고, 적당한 습도를 공급해주기 위해 접종 전에 수분을 충분히 공급해주었으며, 오후 4~5시경에 접종하였다. 습실처리를 위해 접종 후 망실에 넣고 비닐로 덮어 상대습도를 유지하였다. 접종은 분무기를 이용하여 watersoaking이 나타날 때까지 잎 앞ㆍ뒷면에 접종액(inoculum suspensions)을 분사하였다(Groth and Braun, 1986). 접종균주 밀도는 8ra (106~107cfu)로 하였다.
콩 불마름병 병원균 접종 3시간, 12시간, 24시간, 3일 및 10일 후 시료 채집 (개체당 1립× 5)을 하였다.
실시예 2. total RNA 추출
저항성 strains(R46, R47, R48), 민감성 strains (S50, S51, S52)을 이용하여, 불마름병 접종 전 대조군과, 불마름병 접종(실험군)후 3시간, 12시간, 1일, 3일, 10일의 시료(sample)로부터 TRIzolTM reagent(Invitrogen, USA)을 이용하여 DNA칩 분석을 위한 total RNA를 추출하였다. Agilent’s Bioanalyzer 2100 RNA nano kit (Agilent Technologies, USA)을 이용하여 추출한 total RNA의 정량 및 정성분석을 실시하고 DNA칩 분석을 위한 적합성 여부를 판단하였다.
실시예 3. DNA칩(DNA microarray) 제작 및 분석
미국립보건원 (NIH) 산하 NCBI (the National Center for Biotechnology Information), Glycine max 데이터베이스에서 추출한 33,574 unigenes 을 대상으로, Agilent 사에서 제공하는 eArray software (http://earray.chem.agilent.com/earray/)을 이용하여, DNA microarray 제작을 위한 탐침 (probe)을 디자인하고, eArray system 을 이용하여 60-mer oligonucleotide microarray을 제작하였다 (Agilent Technologies, USA).
대조군 시료는 Cy3 (green color), 그리고 각 실험군 시료는 Cy5 (red color)로 라벨(labeling)하여 2-channel 방식으로 상기 제작된 DNA칩에 혼성화반응 (hybridization)을 실시하였다. 이때 total RNA의 증폭은 Low RNA Input Linear Amplification kit PLUS (Agilent Technologies, USA)를 이용하였으며, 이후 칩 분석 절차 (칩 스캐닝 포함) 역시 Agilent 사에서 제공하는 방법, 시약(kit) 및 장비를 이용하여 진행하였다.
DNA칩 데이터 분석은 Feature Extraction program 및 GeneSpring 7.3.1 software (Agilent Technologies, USA)를 이용하여 각 유전자의 발현값 (signal intensity values) 산출, normalization(Lowess), 그룹화(clustering) 및 통계분석(ANOVA tests)을 수행하였다.
실시예 4. Real-Time PCR
실시예 3에서 확인한 AB052784 (서열번호 1), AF022780 (서열번호 2), BI944059 (서열번호 3), U13987 (서열번호 4), D86929 (서열번호 5), BE823110 (서열번호 6), FG999662 (서열번호 7), CX710871 (서열번호 8 또는 서열번호 18), AF055369 (서열번호 9), CS226295 (서열번호 10), BU550410 (서열번호 11), EV281281 (서열번호 12), EV276436 (서열번호 13), EF551167 (서열번호 14), EH258681 (서열번호 15), CX709057 (서열번호 16) 및 CX702069 (서열번호 17)의 17종의 콩 불마름병 저항성 유전자에 대한 Messenger RNA는 Bio-Rad iCycler system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 분석하였다. 총 RNA는 Omniscript RT kit (Qiagen)를 사용하였으며, Real-time PCR은 SYBR의 supermix 키트를 (Bio-Rad)를 수행하였다. 모든 샘플들은 45 cycles로 95°C에 20 초 , 60°C에 1분간 진행되었다. 이하 모든 데이터는 별도의 세 가지 실험 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표시되며, Real-time PCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다 (표 1).
표 1
프라이머 세트 서열 서열번호
AB052784-F ATCCGACAGACGCATTCTCA 19
AB052784-R AGAGGAACATGCCAAAGCCT 20
AF022780-F AGTCCAACCCAACCCTCAAG 21
AF022780-R GCGTTGATGAGGATGCTGTC 22
BI944059-F ACCACCCCAGATAATGAGGC 23
BI944059-R GGTTGACACCAGCCATTTTG 24
U13987-F AGTCCAACCCAACCCTCAAG 25
U13987-R GCGTTGATGAGGATGCTGTC 26
D86929-F TGAATCGCTGTATAGCCTCCC 27
D86929-R GGAAACCTGTTCAGTGTGGC 28
BE823110-F CAGCCACTTGAGGTGAAGGA 29
BE823110-R GATTGTGGAAATGCAAGCCA 30
FG999662-F GTGGAATGCTGATGACTGGG 31
FG999662-R GCCTGCAGAGTCCAGTTCCT 32
CX710871-F GCAGGTCTACCTCCAGCAACT 33
CX710871-R AGTGGCTGCAGTCATTGCC 34
AF055369-F AGTCCAACCCAACCCTCAAG 35
AF055369-R GCGTTGATGAGGATGCTGTC 36
CS226295-F AGCCTCAGCACCATCCTTTC 37
CS226295-R TATGATAACCGGTGGCTTGG 38
BU550410-F GGATCAAGACCGCGAGTACA 39
BU550410-R CAGCCTCTTGAGGTCTTCTGG 40
EV281281-F AGTGCCCTCAACCTGACCTC 41
EV281281-R GACGAATGCATTTGGGACAG 42
EV276436-F AGTCCATTGTCTTGGCCTCA 43
EV276436-R CTAGCGCGCACACTTAAAGC 44
EF551167-F AAGGATGATGATGCGGTGG 45
EF551167-R GCATCGTCAAATTCCACGTC 46
EH258681-F AGCAAATCCTCGTGACCCA 47
EH258681-R GGTGGAGCCAAGTTAAGATCG 48
CX709057-F AAATCATCAGCACCCAAACG 49
CX709057-R ACGATTTGGTAGCATCACCG 50
CX702069-F ATCATCAGGACTAGTTGCCTCAA 51
CX702069-R GGTGGGGTGAATGGCAGTA 52
실험 결과, 실시예 3 및 4에서 분석한 microarray data와 Real-time PCR의 결과가 일치하였다 (도 1 내지 17). 이를 통해 상기 17종의 유전자들은 콩 불마름병 저항성 유전자임이 확인되었다.
실시예 5. Sucrose와 콩 불마름병의 상관관계 확인
실시예 3 및 4에서 확인된 상기 17종의 유전자의 기능을 분석한 결과, Sugar metabolism에 연관된 유전자가 총 13개로 나타났다. 이를 바탕으로 Sucrose와 콩 불마름병의 상관관계를 분석하였다. 도 18에 나타낸 바와 같이, Sucrose를 처리하지 않은 대조군 (control)에서는 불마름병 병반이 뚜렷이 나타났으나, Sucrose를 0.5%, 1% 및 2% 로 처리한 실험군에서는 불마름병 병징이 확연히 줄어드는 것을 확인하였다.
본 발명의 콩 불마름병에 대한 저항성을 진단하기 위한 마커 유전자를 이용하여 콩 불마름병 저항성 품종을 육성함으로써 내재해성, 고품질의 우량 품종 육성이 가능하다.

Claims (5)

  1. AB052784 (서열번호 1), AF022780 (서열번호 2), BI944059 (서열번호 3), U13987 (서열번호 4), D86929 (서열번호 5), BE823110 (서열번호 6), FG999662 (서열번호 7), CX710871 (서열번호 8), AF055369 (서열번호 9), CS226295 (서열번호 10), BU550410 (서열번호 11), EV281281 (서열번호 12), EV276436 (서열번호 13), EF551167 (서열번호 14), EH258681 (서열번호 15), CX709057 (서열번호 16) 및 CX702069 (서열번호 17)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 유전자를 포함하는 콩 불마름병에 대한 저항성을 진단하기 위한 마커 조성물.
  2. 제1항의 유전자 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 콩 불마름병에 대한 저항성 진단용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 19 내지 52로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제2항의 조성물을 포함하는 콩 불마름병에 대한 저항성 진단 키트.
  5. 콩 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 19 내지 52로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 콩 불마름병에 대한 저항성을 진단하는 방법.
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