WO2012042072A1 - Formulaciones tópicas de anfotericina b y método de obtención - Google Patents

Formulaciones tópicas de anfotericina b y método de obtención Download PDF

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amphotericin
excipient
preparation
cyclodextrin
pharmaceutical formulation
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PCT/ES2011/000289
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Juan José TORRADO DURÁN
Helga Karina RUIZ SALDAÑA
Remedios SERRANO LÓPEZ
Gloria MOLERO MARTÍN-PORTUGUÉS
César NOMBELA CANO
Francisco BOLÁS FERNÁNDEZ
María Auxiliadora DEA AYUELA
Pablo Estanislao Bilbao Ramos
María del Carmen VEGAS SÁNCHEZ
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Universidad Complutense De Madrid
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention falls within the technical field of the manufacture of pharmaceutical preparations. More specifically, the invention relates to the preparation and obtaining of new amphotericin B compositions for topical administration, and their use in the treatment and prevention of superficial, cutaneous and mucocutaneous mycoses, as well as for the treatment of leishmaniasis.
  • Amphotericin B was discovered in the mid-50s of the last century by the company Squibb, which later marketed it in the form of an intravenous administration suspension under the trade name Fungizona ® (amphotericin B deoxycholate). This formulation is still on the market and although in some countries, for example Spain, it has been discontinued by replacing it with other less toxic formulations, such as liposomes and lipid complexes of amphotericin B, Fungizona ® is still the reference formulation of this antifungal .
  • Fungizona ® amphotericin B deoxycholate
  • Amphotericin B interacts directly with the ergosterol of the fungal cell membrane but does not interfere with membrane synthesis but destabilizes it, facilitating the formation of channels with the consequent loss of ions and cellular components thus producing cell death. In large part, this action is due to its peculiar chemical structure characterized by presenting a double hydrophilic and lipophilic nature. This property, together with the amphoteric behavior (has acid and base groups) that gives the molecule its name (amphotericin), facilitates its incorporation into cell membranes, inducing their destabilization.
  • amphotericin B is more toxic to the pathogen than to the host, despite which it turns out to be an antifungal of very high toxicity.
  • the peculiar chemical structure of this antifungal is also responsible for the important difficulties for its solubilization, thus conditioning the preparation of amphotericin B formulations. Only because of its poor solubility is the use of intravenous administration suspensions exceptional. Also, its low affinity for water is responsible for the tendency to form molecular aggregates when dispersed in an aqueous medium.
  • amphotericin B Since the discovery of amphotericin B there have been several formulations of it that have been marketed worldwide. The first formulation that was commercialized and the one that receives the name of conventional amphotericin B is:
  • Amphotericin B deoxycholate (briefly, AMB deoxycholate) (marketed under the name of Fungizona ® ): it is a colloidal complex of amphotericin B with sodium deoxycholate. Its pharmaceutical form is that of sterile lyophilized powder to be reconstituted and the route of administration is intravenous, although there is also a presentation for oral suspension. Due to the problems found in this formulation (mainly, nephrotoxicity), and since amphotericin B had demonstrated great efficacy, lipid formulations thereof were proposed as an alternative to the classic treatment.
  • the lipid formulations that have reached the market are:
  • Amphotericin B lipid complex (marketed under the name of Abelcet ® ): it is an amphotericin B complex with two phospholipids: Ladimiristoylphosphatidylcholine (abbreviated, DMPC), La-dimiristoylphosphatidylglycerol (in the form of sodium and ammonium salts) (abbreviated , DMPG). Its pharmaceutical form is that of a suspension concentrate and the route of administration is perfusion.
  • Liposomal amphotericin (marketed under the name of AmBisome ® ): it is a pharmaceutical formulation comprising amphotericin B encapsulated in the liposome bilayer.
  • the pharmaceutical form is that of a lyophilisate and the route of administration is by intravenous infusion.
  • Amphotericin B colloidal dispersion (marketed under the name of Amphotec ® or Amphocil ® ): it is a complex of amphotericin B with cholesteryl sodium sulfate.
  • the pharmaceutical form is lyophilisate for reconstitution and the route of administration is by intravenous infusion.
  • amphotericin B for the development of pharmaceutical formulations are its poor solubility in aqueous medium and its poor physical and chemical stability.
  • several studies have also been carried out to try to increase their solubility in aqueous media as well as improve their stability.
  • the use of cyclodextrins to increase the solubility and stability of amphotericin B (EP147851B1, US4883785A, WO8910739A1) has gained great interest.
  • cyclodextrins form a complex with amphotericin B that has a water solubility and stability that are substantially greater than those of known amphotericin B compounds or formulations. Furthermore, the complex has palatability, light stability and toxicity. improved compared to known amphotericin B formulations or compounds.
  • the use of y-cyclodextrin stands out due to the good results obtained.
  • y-cyclodextrin Various alternatives to the use of y-cyclodextrin have been described which provide, like it, good results.
  • a hydroxyalkyl cyclodextrin derivative is proposed in WO8910739A1 instead of the y-cyclodextrin base molecule.
  • WO2006089007A2 the use of a new polymerized cyclodextrin derivative to which amphotericin B is linked by covalent bonding (binding of a greater degree of force than that described in the previous patents) is described.
  • AMB-CD amphotericin B-cyclodextrin complexes
  • cyclodextrins Since the use of cyclodextrins was proposed to increase the solubility and stability of amphotericin B, several variants of the same method of synthesis of the amphotericin B-cyclodextrin complex have been used. This method is based on a change in pH and the use of solvents, such as ethanol, and subsequent drying and removal of debris by lyophilization or atomization. In contrast, a new method for making said complexes is described in JP8059483A. This new synthesis alternative proposes the use of the dimethylsulfoxide solvent (DMSO), a more toxic solvent than those conventionally used, which is then removed by dialysis.
  • DMSO dimethylsulfoxide solvent
  • Amphotericin B formulations marketed to date are intended to be administered primarily intravenously and the pharmaceutical form in which they are marketed is lyophilized powder.
  • lyophilisate In order to administer amphotericin B intravenously, lyophilisate must be dispersed in aqueous medium. The period of validity (or physical and chemical stability in use after dilution) of amphotericin B powder once dispersed in aqueous medium is very short (a few days and stored in a refrigerator), which makes commercial use difficult.
  • Cutaneous mycoses are usually associated with poor drying and contamination (worsening in immunodeficiency patients) in the feet and back. An excess of humidity can favor the appearance of these infections that are usually treated by drying the area (talcum powder) and applying creams, ointments or antifungal gels.
  • amphotericin B formulations for topical administration are described in which both the use as an excipient of y-cyclodextrin, which provides an increase in the solubility in aqueous medium of amphotericin B, and the new form of presentation of the medication to be administered (gel, cream, ointment or eye drops), which facilitates the contact of the same with the infecting agent, provide as a final result an increase in the pharmacological effect of amphotericin B. Thanks to this increase in its effect Pharmacological amphotericin manifests antiparasitic action (specifically, antileishmaniasis) in addition to the antifungal action (cutaneous, mucocutaneous and superficial) main indication for which amphotericin B is currently prescribed.
  • the formulations prepared in the present invention have a safety profile drastically improved with respect to any of the amphotericin B formulations known so far.
  • amphotericin B is forming a complex with cyclodextrin.
  • amphotericin B is forming a complex with ⁇ -cyclodextrin.
  • amphotericin B - / - cyclodextrin complex increases the solubility in aqueous medium of amphotericin B and this, in turn, causes a decrease in its affinity for the fatty components of pharmaceutical formulations.
  • the amphotericin B- ⁇ -cyclodextrin complex will be released from your vehicle more easily and to a greater extent than amphotericin B without complexing.
  • ⁇ -cyclodextrin also acts as a promoter of absorption and exerts an adhesive action, which will favor the penetration and activity of amphotericin B.
  • the presentation of the pharmaceutical formulations of the present invention in particular, gel, cream, ointment and eye drops, facilitates the contact of the antifungal with the infecting agent.
  • amphotericin B has a monomeric aggregation state, unlike the aggregation state that this usually presents in the pharmaceutical formulations marketed so far, which is the dimeric state.
  • the pharmaceutical formulations described in the present invention have superior physical and chemical stability than amphotericin B formulations marketed so far. This superior physical and chemical stability is explained, in part, by the state of monomeric aggregation presented by amphotericin B in the formulations of the invention, as well as by the fact that it is forming a complex with ⁇ -cyclodextrin.
  • amphotericin B results in a solubilizing effect of amphotericin B in aqueous media.
  • This effect is based on the formation of micelles in a molar ratio of amphotericin B: y-cyclodextrin between 1: 50 and 1: 200.
  • each amphotericin B molecule is influenced by the presence of between 50 and 200 y-cyclodextrin molecules around it.
  • the present invention relates, first of all, to new topical formulations of amphotericin B in different pharmaceutical forms: gel, cream, ointment and eye drops.
  • These formulations of the invention comprise a By-cyclodextrin amphotericin complex and a pharmaceutically acceptable topical excipient, and are further characterized in that the molar ratio between amphotericin B and y-cyclodextrin is in the range between 1: 50 and 1: 200 and because Amphotericin B has a monomeric aggregation status.
  • a topical excipient refers to any component, or components, other than the active substance, in this case amphotericin B, present in the pharmaceutical formulation or used in its manufacture and whose function is to serve as a support (vehicle or base) of the active substance and facilitate its manufacture and administration topically.
  • the topical excipient to be used is a suitable excipient for the preparation of gels.
  • Said excipient suitable for the preparation of gels is selected from cellulose derivatives, guar derivatives, vinyl polymers, carboxyvinyl polymers, acrylic polymers, natural polymers, and / or combinations thereof.
  • the excipient suitable for the preparation of gels is selected from methylcellulose, hydroxypropylcellulose and cross-linked copolymers of C 10-30 alkyl acrylate.
  • excipient suitable for the preparation of gels refers to any pharmaceutically acceptable topical excipient indicated for the manufacture of pharmaceutical formulations in gel form.
  • the topical excipient to be used is a suitable excipient for the preparation of creams.
  • Said excipient suitable for the preparation of creams is selected from silicones, silicone derivatives, emulsifying bases oil / water (abbreviated, O / A) of non-ionic type, and / or combinations thereof.
  • the excipient suitable for the preparation of creams is selected from cyclomethicone and dimethicone.
  • excipient suitable for the preparation of creams refers to any pharmaceutically acceptable topical excipient indicated for the manufacture of pharmaceutical formulations in the form of cream.
  • the topical excipient to be used is a suitable excipient for the preparation of ointments.
  • Said excipient suitable for the preparation of ointments is selected from an oral adhesive excipient, paraffin, paraffin derivatives, water / oil bases (abbreviated, A / O), water / oil creams (abbreviated, A / O), and / or combinations thereof.
  • the excipient suitable for the preparation of ointments is a mixture comprised of sodium carboxymethylcellulose, pectin and gelatin, in a base of polyethylene and mineral oil.
  • excipient suitable for the preparation of ointments refers to any pharmaceutically acceptable topical excipient indicated for the manufacture of pharmaceutical formulations in the form of ointment.
  • the pharmaceutical formulation in eye drops of the invention comprises the amphotericin B-and-cyclodextrin complex dissolved in saline or glucose.
  • the present invention also claims the use of the pharmaceutical formulations described for the treatment of fungal and / or parasitic infections in humans and / or animals. More specifically, the pharmaceutical formulations of the invention can be used for the treatment of superficial, cutaneous and mucocutaneous mycoses, as well as for the treatment of cutaneous leishmaniasis.
  • the present invention also relates to the method for the preparation of the pharmaceutical formulations described above.
  • This method comprises, first, the solubilization of amphotericin B by formation of a complex with -cyclodextrin and, secondly, the preparation of each of the pharmaceutical formulations of the invention (gel, cream, ointment and eye drops) by the addition of a pharmaceutically acceptable topical excipient to the By-cyclodextrin amphotericin complex solution.
  • the method for preparing the formulations of the present invention comprises the following steps: a) a solution in aqueous medium of ⁇ -cyclodextrin is prepared and the pH of said solution is adjusted to a value between 11.5 and 14 ,
  • step (b) the amphotericin B is then added to the solution of step (a) in a molar ratio antotericin B: ⁇ - cyclodextrin between 1: 50 and 1: 200 and constantly stirred until completely dissolved,
  • step (c) the pH of the mixture of step (b) is adjusted to a value between 4 and 8. d) a pharmaceutically acceptable topical excipient is added to the solution of the By-cyclodextrin amphotericin complex of step (c).
  • a suitable excipient for the preparation of gels must be added as a topical excipient in step (d) and, in addition, the following steps must be added after stage (d):
  • the excipient suitable for the preparation of gels is selected from cellulose derivatives, guar derivatives, vinyl polymers, carboxyvinyl polymers, acrylic polymers, natural polymers, and / or combinations thereof.
  • the excipient suitable for the preparation of gels is selected from methyl cellulose, hydroxypropyl cellulose and cross-linked C 10-3 alkyl acrylate copolymers, such as Carbopol ® Ultrez 20 and Carbopol ® ETD 2020.
  • a suitable excipient for the preparation of creams must be added as a topical excipient in step (d), and in addition, the following stage must be added after stage (d):
  • the excipient suitable for the preparation of creams is selected from silicones, silicone derivatives, emulsifying bases O / A of non-ionic type, and / or combinations thereof.
  • the excipient suitable for the preparation of creams is selected from cyclomethicone and dimethicone.
  • a suitable excipient should be added as a topical excipient in step (d) of the method for the preparation of ointments, and in addition, the following stages must be added after stage (c) and before stage (d):
  • Stage (el) the amphotericin B-y-cyclodextrin complex of stage (c) is lyophilized
  • Stage (c2) the lyophilisate from stage (el) is sprayed.
  • the excipient suitable for the preparation of ointments is selected from an oral adhesive excipient, paraffin, paraffin derivatives, A / O bases, A / O creams, and / or combinations thereof.
  • the excipient suitable for the preparation of ointments is Orábase ® (mixture comprised of sodium carboxymethylcellulose, pectin and gelatin, in a base of polyethylene and mineral oil).
  • the pharmaceutical formulations of the present invention have been shown to have greater activity against superficial, cutaneous and mucocutaneous mycoses (11 different yeast strains were tested) than the conventional amphotericin B (amphotericin B deoxycholate) formulation and the amphotericin B formulation dissolved in DMSO.
  • these formulations have proven in different studies in vivo to be effective for use against Leishmania (6 different Leishmania species were tested) showing, in addition, a safety profile much higher than the conventional amphotericin (amphotericin B deoxycholate) formulation and that the amphotericin B formulation dissolved in DMSO, presenting much less cytotoxicity than these formulations.
  • an aqueous solution of the amphotericin B: ⁇ - cyclodextrin complex was lyophilized in a 1: 70 molar ratio, and the solid obtained was analyzed by X-ray diffraction, infrared spectrophotometry (IR) and differential scanning calorimetry.
  • IR infrared spectrophotometry
  • differential scanning calorimetry The results obtained both by X-ray diffraction and by differential scanning calorimetry evidenced the existence of an amorphous solid that differed from the molecular structure of the starting material, amphotericin B, which is a crystalline solid.
  • a comparative study of the different formulations prepared was also carried out, using infrared spectrophotometry as a technique.
  • Figure 2 shows the result of the study.
  • a stretch of the peaks located in the region could also be seen around 1800 cm “1 , which corresponds to the groups - CH 3 and the rest --CO of the carboxylic acid group of the amphotericin B molecule, and in the region about 1400 cm “ 1 , which corresponds to the groups -OH (alcohol groups) thereof, which indicates the formation of hydrogen bonds.
  • IR spectra showed the interaction between amphotericin B and cyclodextrin.
  • amphotericin B-y-cyclodextrin complex was prepared. For this, 12.5 grams of y-cyclodextrin were dissolved in approximately 50 ml of deionized water. The solution obtained was brought to pH 12.0 by the addition of 2N sodium hydroxide, 125 mg of amphotericin B was added with constant stirring until completely dissolved and the solution obtained was brought to pH 5.5 using 2N phosphoric acid, for finally complete the volume at 100 ml with deionized water.
  • Gels were prepared with 3% by weight hydroxypropylcellulose (w / w) and with 2% w / w methylcellulose. For this, the gelling agent was added to the solution of the amphotericin B complex with y-cyclodextrin, gently stirring to avoid generating bubbles, and the mixture was allowed to stand for 24 hours for complete homogenization.
  • Gels were prepared using two different gelling agents, Carbopol ® ETD 2020 and Carbopol ® Ultrez 20.
  • the gelling agent was added in each case at a concentration of 1% p / p, was dispersed in the amphotericin B complex solution with y-cyclodextrin, and the pH was adjusted to a value of 5.5 with triethanolamine. 2.A.2.
  • amphotericin B-y-cyclodextrin complex was prepared.
  • the y-cyclodextrin was dissolved in approximately 40 ml of water and drops of a 2N sodium hydroxide solution were added until the pH of the solution was adjusted to 12.0. Keeping the stirring constant, amphotericin B was added and stirring was continued until completely dissolved. A few drops of a 2N phosphoric acid solution were added until pH 5.5. This solution was completed with water to a volume of 70 ml, previously dissolving in it 1 gram of sodium chloride.
  • the pharmaceutical formulation in cream was prepared.
  • 15 ml of cyclomethicone and 15 ml of Dow Corning 3225C were mixed in another beaker and stirred using an Ultra Turrax homogenizer.
  • the first prepared solution containing the amphotericin B-y-cyclodextrin complex was added little by little while maintaining stirring, and stirring was continued until the desired consistency was achieved.
  • 2.A.3. Preparation of pharmaceutical formulations of amphotericin B-and-cyclodextrin in the form of ointment:
  • An ointment formulation was prepared using the oral adhesive excipient Orábase ® .
  • This adhesive base is constituted by sodium carboxymethyl cellulose, pectin, gelatin and a mixture of liquid paraffin and polyethylene.
  • This excipient in particular was chosen for the preparation of the ointment of the invention due to its adherent properties and its protective effect on skin lesions.
  • the By-cyclodextrin amphotericin complex was prepared following the procedure for preparing it detailed in section 1 of this example.
  • the resulting By-cyclodextrin amphotericin complex was lyophilized in order to remove water from said complex.
  • the solution obtained was brought to pH 12.0 with 2N sodium hydroxide, 143.75 mg of amphotericin B was added with constant stirring until completely dissolved and the solution obtained was brought to pH 7.4 using 2N orthophosphoric acid to finally complete the volume up to 100 ml with either the sterile physiological saline solution, or the 5% w / v sterile dextrose solution, depending on the solution used at the beginning. Subsequently, a sterilizing filtration was carried out with a 0.22 ⁇ filter of Minisart NML ® Sartorius cellulose acetate.
  • a decrease in absorbances with respect to the gel formulation with methylcellulose was observed, which may be indicative of a deficient release of amphotericin B.
  • MHA Mueller Hinton agar
  • Solutions of amphotericin B in dimethylsulfoxide were prepared at concentrations of 600; 240; 96; 38.4 and 15.4 ⁇ g / ml.
  • the samples of the amphotericin B gel, cream and eye drops were dissolved / dispersed initially in water and then in 0.2 M phosphate buffer pH 10.5 at a concentration of 96 ⁇ g / ml.
  • test paper discs were impregnated with 20 ⁇ of each standard and sample solution, allowed to dry for 15 minutes at room temperature, then placed on the culture plates containing MHA and inoculated with the fungus suspension (C albicans 1394). After being kept in refrigeration at 5 ° C for 2 hours, the plates were incubated at 30 ° C for 48 hours, to subsequently measure the inhibition halos.
  • AMB-y-CD gel with Carbopol ® 18.7 + 0.1
  • AMB-y-CD cream with silicones 26.4 + 0.2
  • methylcellulose gels with concentrations of 1.5 were prepared; 2.0; 2.5; 3.0; 3.5 and 4.0% w / w and with increasing viscosities from 330 cps to 3500 cps.
  • concentrations of 1.5 were prepared; 2.0; 2.5; 3.0; 3.5 and 4.0% w / w and with increasing viscosities from 330 cps to 3500 cps.
  • the antimicrobial activity of all of them was similar, so a concentration of methylcellulose at 3% w / w was chosen as the most appropriate for its viscosity (1520-2470 cps).
  • amphotericin gel By-cyclodextrin selected as preferred in the previous example was prepared.
  • amphotericin B (0.125 g)
  • -cyclodextrin (12.5 g)
  • methylcellulose 3 g
  • small amounts of NaOH 1,3-bis(trimethoxy)
  • orthophosphoric acid to adjust the pH at a value in the range 5.5-5.7
  • water csp sufficient quantity for 100.
  • the antifungal activity of this formulation was analyzed under various conditions.
  • This molten agar at a temperature of 50 ° C was inoculated with 3 ml of a fungus suspension (several yeast strains were used, see Fig. 3), previously adjusted to an absorbance of 0.1 to 600 nm, in physiological saline solution (NaCl 0.9% w / v).
  • Said fungus suspension had been prepared from yeast cultures in Sabouraud dextrose agar incubated for 72 hours at 30 ° C.
  • Test discs were impregnated with 20 ⁇ of each of the control solutions and each of the solutions of the gel formulation of the invention, allowed to dry for 15 minutes at room temperature and finally deposited on the MHA plates which contained the suspension of the fungus.
  • the present invention refers to the formulation of the formulation as a formulation that does not contain the active substance (in this case, amphotericin B) but whose preparation and composition is equal to that of the formulation of the invention).
  • a pre-circle was prepared in 50 ml of YNB minimum medium (nitrogenous yeast base) with 50 mM galactose and incubated at 37 ° C overnight. The culture was centrifuged at 4500 rpm for 5 minutes and then washed twice with PBS (phosphate buffered saline). The cells were finally suspended in PBS to an absorbance of 0.2 to 600 nm.
  • YNB minimum medium nitrogenous yeast base
  • PBS phosphate buffered saline
  • Solutions of the gel formulation of the invention were prepared at the following concentrations: 25, 50, 75, 150, 300, 450 and 600 ⁇ g / ml. With these solutions, sterile cellulose membranes (Millipore) of 0.22 ⁇ pore diameter (6 membranes for each of the 1 1 strains) were impregnated for approximately 10 seconds. Subsequently these membranes were washed. A first group of them (3 of those 6 membranes, for each strain) were rinsed three consecutive times with a solution of PBS, while a second group (the other 3 remaining membranes) were immersed for 1 hour also in PBS. All membranes were allowed to dry for 20 minutes at 37 ° C before being inoculated.
  • (+) growth in the entire membrane
  • ( ⁇ ) growth in part of the membrane
  • (-) membrane without growth.
  • A membranes washed three times with PBS; B: membranes that were left submerged for one hour after applying the formulation.
  • amphotericin B YNB agar with 500 mM galactose was prepared, autoclaved and, before solidifying, it was divided into 6 portions, adding to the same amphotericin B, in two different ways, on the one hand, the formulation of amphotericin B dissolved in dimethylsulfoxide and, on the other, the gel formulation of the invention, to obtain plaques, in duplicate (i.e., for each of the two formulations), with the following concentrations in both cases: 150, 300 and 600 ⁇ g / ml YNB galactose agar plates to which amphotericin B has been incorporated constitute layer A of the test biofilm (see Fig. 4).
  • a new membrane is disposed that serves as a direct contact separation. On this occasion, it is a membrane of 0.22 ⁇ in pore diameter and 25 mm in diameter. This new membrane constitutes the C layer of the test biofilm (see Fig. 4).
  • the discs described above as layer D were deposited on Mueller Hinton agar plates inoculated with a suspension of Candida albicans as a reference microorganism, just as for Microbiological determination of sensitivity to amphotericin B (section 3.2.). Plates were incubated at 30 ° C for 48 hours and the inhibition halos obtained were measured (Samaranayake, YH, Ye, J., Yau, JYY, Cheung, BPK and Samaranayake, LP In vitro method to study antifungal perfusion in Candida biofilms Journal of Clinical Microbiology, Feb.
  • a set of sterile test tubes containing 5 ml of PBS each, three control tubes and three for each concentration to be evaluated were prepared.
  • the plates were used with the membranes that were evaluated in the biofilm penetration test (test 3.4) and their corresponding control.
  • sowing handle a fraction of colonies in an area of 2 mm was taken from each membrane and dispersed in one of the PBS tubes using a vortex shaker.
  • Trichosporon 61978 showed a greater susceptibility to the gel formulation of the invention than to the amphotericin formulation dissolved in DMSO.
  • the rest of the strains showed no significant differences between the viability of the biofilms exposed to the amphotericin formulation dissolved in DMSO with respect to the gel formulation of the invention.
  • Table 5 shows in detail the number of colonies obtained for each species per mm of biofilm exposed to the action of the antifungal.
  • clotrimazole cream formulation is currently the product of first choice in the treatment of cutaneous mycoses
  • a comparative sensitivity test was performed, using C. albicans as the reference microorganism, between clotrimazole cream and the gel formulation of the invention.
  • dilutions of amphotericin B in dimethylsulfoxide were prepared at concentrations of 600; 240; 96; 38.4 and 15.4 ⁇ g / ml, as in previous studies, while the gel formulation of the invention, for its part, was diluted to a concentration of 60 ⁇ g / ml.
  • test disks were inoculated with the prepared solutions and placed on the MHA plates containing the C. albicans suspension. Plates were incubated for 48 hours at 30 ° C and inhibition halos measured.
  • clotrimazole was extracted from the cream, using DMSO, test discs were impregnated and their activity compared to the standard disc of clotrimazole Neo Sensitabs which contains 10 ⁇ % of clotrimazole. The diameter of the halos observed was the same in both cases. Additionally, dilutions with the gel formulation of the invention were prepared at the same concentration of 10 ⁇ g and tested together with their respective amphotericin B Neo Sensitabs standard discs. The results obtained are shown in Table 7.
  • amphotericin B both the gel formulation of the
  • Sensitabs® was 10 i of antifungal per disc.
  • Example 4 Antileishmania activity, cytotoxicity and safety of use
  • the antiparasitic activity of the gel formulation of the invention amphotericin ⁇ -cyclodextrin gel in methylcellulose (3% w / w), in different Leishmania species was determined, and compared with that of a formulation that It contained only the amphotericin B - ⁇ - cyclodextrin complex but without a gelling agent and with that of amphotericin B deoxycholate.
  • Promastigotes from different strains were maintained by in vitro cultures in 20 ml of Schneider Drosophila culture medium (Sigma), in culture bottles with lids that allowed air exchange (tissue Culture Flask 25 cm 2 SARTED). The bottles were incubated horizontally in an incubator at 26 ° C.
  • the macrophages were grown in RPMI 1640 medium (Sigma) and used, in Logarithmic growth phase, in microtiter plates (SARSTED) at a concentration of 2.5x10 5 cells / ml and in a final volume of 200 ⁇ .
  • Serial dilutions of the different amphotericin B formulations were prepared in RPMI-1640 culture medium (5, 2.5, 0.625, 0.156, 0.078, 0.039 and 0.019 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ), which were added by tripled to microtiter plates.
  • the safety margin of use of a drug as the ratio between toxic and effective concentrations, in this particular case, the MS would be calculated as the ratio between CC 50 and IC 50 .
  • Table 10 The results of safety margins for the different formulations studied in the different Leishmania species are shown in table 10.
  • the gel formulation of the invention is compared with amphotericin formulations whose marketing has been approved by the relevant regulatory agencies (indicating, among other things, that said formulations have a sufficient safety profile for commercialization),
  • the results in Table 10 clearly show that the gel under study has safety characteristics not only very suitable for in vivo use but also quite better than those currently presented in the market. It is concluded, therefore, that the gel formulation of the invention is substantially safer for administration in humans and animals compared to the formulation currently prescribed for administration in humans and with the formulation constituted solely by the complex ⁇ - ⁇ -CD without gelling agent (table 9) as it is drastically less toxic than these two formulations.
  • the topical treatment was initiated with the ointment formulation of the invention, by means of a spatula application on the plantar pad of the left hind leg and immobilization for 2 hours. After this first application, the treatment was repeated every 24 hours for the next 4 days, completing a treatment of 5 days in total.
  • days 37 to 41 the leg that received the treatment remained bandaged and for that reason no data are available during that interval of days.
  • the inflammation size characteristic of L. amazonensis infection, was determined weekly by measuring the diameter of the infected left and uninfected left hind legs, with the help of a caliper (Vernier Caliper), until the end of the experiment in the day 58 pi (see table 11).
  • Left leg Right leg neither Left leg Right or infected leg not infected or infected and infected or
  • the formulation to be evaluated (gel formulation of the invention) was stored at room temperature and protected from light and, in addition to the determination of the Amphotericin B concentration by liquid chromatography, the pH was measured and a spectrophotometer was scanned to assess whether it maintained the monomeric aggregation status. In none of the three analyzes there were notable variations, that is, no significant changes were observed in the concentration of amphotericin, the formulation maintained its pH value between 5.0 and 5.5 and no changes were observed in the state of aggregation .
  • Table 13 Results obtained with the eye drops formulation of the invention with saline solution during the 30 days evaluated with samples at room temperature and in refrigeration.
  • the second eye drops formulation was prepared using a 5% w / v glucose solution as solvent.
  • the tests performed were the same as those carried out on the first formulation.
  • the results obtained are presented in Table 14. In it, the differences between the values obtained with the formulation preserved in refrigeration versus that conserved at room temperature can be observed.
  • amphotericin B deoxycholate in the form of eye drops was also prepared in order to make the comparative study with respect to the two formulations previous.
  • the dilution of amphotericin B in glucose serum was chosen to avoid the formation of precipitates (Martindale, Complete Guide to Pharmacotherapeutic Consultation, SC. Sweetman ( director) Pharma Editores SL 2003). The tests performed were the same as those carried out on the two previous formulations.
  • amphotericin B formulations claimed in the present invention have chemical stability characteristics superior to those of the reference commercial amphotericin B formulation (amphotericin B deoxycholate, Fungizona ® analogue).
  • Figure 1 shows the amphotericin B solubility diagram in the presence of y-cyclodextrin at 25 ° C.
  • Said diagram represents the concentration (mM) of amphotericin B versus the concentration (raM) of y-cyclodextrin at the solubility limit of amphotericin B at 25 ° C.
  • Figure 2 depicts the infrared (IR) absorption spectra of the amphotericin B molecule, the ⁇ -cyclodextrin molecule, the By-cyclodextrin amphotericin physical mixture (AMB-GCD) and the lyophilisate of a By-cyclodextrin amphotericin solution in a 1: 70 molar ratio and unfiltered.
  • IR infrared
  • AMB-GCD By-cyclodextrin amphotericin physical mixture
  • % T percentage of transmittance
  • Figure 3 shows a comparative bar diagram of the inhibition (represented by the diameters (measured in mm) of the inhibition halos obtained) to which the gel formulation of the invention (10 ⁇ g amphotericin B, left bar) results. ) on different strains of fungi (strains shown on the X-axis) compared to the inhibition produced by Neo-Sensitabs ® amphotericin B standard discs in MHA (discs with 10 ⁇ g of amphotericin B, right bar).
  • Neo-Sensitabs ® points out the following parameters to determine the sensitivity of a microorganism against amphotericin B (AMB): Resistant (R), if the inhibition halo is less than 10 mm. Intermediate (I), if the measurement is between 10 and 14 mm and Sensitive (S), if the measurement is greater than or equal to 15 mm.
  • FIG. 4 The device used to perform the amphotericin B penetration test in fungal biofilms is shown in Figure 4 (example 3.4).
  • Layer A corresponds to a plate with YNB-Galactose agar to which amphotericin B was added in both forms (amphotericin B dissolved in DMSO and the gel formulation of the invention).
  • Layer B represents a membrane of 0.22 ⁇ in pore diameter and 47 mm in diameter with or without Candida albicans biofilm.
  • Layer C symbolizes a membrane of 0.22 ⁇ in pore diameter and 25 mm in diameter that serves as a direct contact separation.
  • Layer D refers to 6 mm diameter test discs impregnated with 20 ⁇ of PBS.
  • the upper graph shows the evolution over time (measured in days) of the diameter (mm) of the plantar pad of the right and left hind legs of the infected cricets, before and after treatment with the ointment formulation of the invention .
  • the series represented by a double continuous thin line corresponds to the evolution of the left hind leg (infected but without treatment) of the cricets that did not receive treatment.
  • the series represented by a continuous thick line corresponds to the evolution of the left hind leg (infected and treated) of the cricets that received treatment.
  • the series represented by a dashed dashed line corresponds to the evolution of the right hind leg (not infected and without treatment) of the cricetos that did not receive treatment in their left hind leg.
  • the series represented by a dashed dotted line corresponds to the evolution of the right hind leg (uninfected and untreated) of the cricets that received treatment in their left hind leg with the ointment formulation of the invention.
  • the two lower photographs show the detail of the plantar pad of the left hind leg of an untreated control animal (left) and of an animal after treatment (right). The treatment was done from day 37 to 41.

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Abstract

La invención se refiere a la preparación de nuevas formulaciones de anfotericina B de administración por vía tópica. En dichas formulaciones, la anfotericina B se encuentra formando un complejo con ciclodextrina. La poca afinidad de la anfotericina B por la ciclodextrina provoca la liberación de la mayor parte del antifúngico tras la administración de la formulación, ocasionando un aumento del efecto farmacológico de la anfotericina B gracias al cual ésta manifiesta acción antiparasitaria (antileishmaniosis) además de la acción antimicótica (cutánea, mucocutánea y superficial), principal indicación para la que se prescribe actualmente la anfotericina B. Para la preparación de estas formulaciones se utiliza una combinación de excipientes (además de la ciclodextrina que actúa como solubilizante), tales como viscosizantes, emulsificantes y excipientes grasos. En la presente invención se describe la preparación de formulaciones tópicas de anfotericina B, presentando cada una de ellas una forma farmacéutica diferente: gel, crema, pomada y colirio.

Description

Título
FORMULACIONES TÓPICAS DE ANFOTERICINA B Y MÉTODO DE OBTENCIÓN
Sector de la Técnica
La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de la fabricación de preparaciones farmacéuticas. De forma más concreta, la invención se refiere a la preparación y obtención de nuevas composiciones de anfotericina B de administración por vía tópica, y su utilización en el tratamiento y prevención de micosis superficiales, cutáneas y mucocutáneas, así como para el tratamiento de leishmaniosis.
Estado de la Técnica
La anfotericina B fue descubierta a mediados de los años 50 del siglo pasado por la empresa Squibb, que posteriormente la comercializó en forma de suspensión de administración intravenosa con el nombre comercial Fungizona® (anfotericina B desoxicolato). Esta formulación todavía está en el mercado y aunque en algunos países, por ejemplo España, se ha dejado de comercializar sustituyéndola por otras formulaciones menos tóxicas, como liposomas y complejos lipidíeos de anfotericina B, Fungizona® sigue siendo todavía la formulación de referencia de este antifúngico.
La anfotericina B interactúa directamente con el ergosterol de la membrana celular fúngica pero no interfiere con la síntesis de la membrana sino que la desestabiliza, facilitando la formación de canales con la pérdida consecuente de iones y componentes celulares produciendo así la muerte celular. En gran parte, esta acción se debe a su peculiar estructura química caracterizada por presentar una doble naturaleza hidrófíla y lipófila. Esta propiedad, junto con el comportamiento anfótero (tiene grupos ácido y base) que da nombre a la molécula (anfotericina), facilita su incorporación a las membranas celulares induciendo la desestabilización de las mismas. Su mayor afinidad por los esteróles de la membrana celular fúngica, que por el colesterol de la célula animal, explica que la anfotericina B resulte más tóxica para el patógeno que para el hospedador, a pesar de lo cual resulta ser un antifúngico de toxicidad muy elevada. La peculiar estructura química de este antifúngico es asimismo responsable de las importantes dificultades para su solubilización, condicionando así la preparación de formulaciones de anfotericina B. Sólo por su deficiente solubilidad se justifica, con carácter excepcional, la utilización de suspensiones de administración intravenosa. Asimismo, su escasa afinidad por el agua es responsable de la tendencia a la formación de agregados moleculares cuando se dispersa en un medio acuoso. Se han descrito varios estados de agregación de anfotericina B con diferente actividad y toxicidad. De forma resumida éstos serían tres: monomérico, dimérico y poliagregado. La forma más utilizada en terapéutica es la dimérica, obtenida por mezcla de anfotericina B y desoxicolato sódico junto con un cambio de pH (Torrado JJ, Espada R, Ballesteros MP y Torrado-Santiago S. "Amphotericin B formulations and drug targeting", J. Pharm. Sci. 2008: 97, 2405-2425). A pesar de las limitaciones para su utilización a causa de la toxicidad, tras muchos años desde su lanzamiento al mercado la anfotericina B sigue siendo considerada como un antifúngico de primera elección en muchos casos, tanto por su amplio espectro como, sobre todo, porque su uso no ha generado resistencias clínicas relevantes.
Desde el descubrimiento de la anfotericina B han sido varias las formulaciones de la misma que se han comercializado en todo el mundo. La primera formulación que se comercializó y la que recibe el nombre de anfotericina B convencional es:
Anfotericina B desoxicolato (abreviadamente, AMB desoxicolato) (comercializado bajo el nombre de Fungizona®): se trata de un complejo coloidal de anfotericina B con desoxicolato sódico. Su forma farmacéutica es la de polvo liofilizado estéril para reconstituirse y la vía de administración es la intravenosa, aunque también existe presentación para suspensión oral. Debido a los problemas encontrados en esta formulación (principalmente, la nefrotoxicidad), y dado que la anfotericina B había demostrado una gran eficacia, se propusieron formulaciones lipídicas de la misma como alternativa al tratamiento clásico.
Estas formulaciones lipídicas han demostrado ser menos tóxicas que la anfotericina B desoxicolato en varios estudios experimentales manteniendo el mismo espectro antifúngico, lo que permite una dosificación más alta y, con ello, aumentar el índice terapéutico.
Las formulaciones lipídicas que han llegado al mercado son:
Anfotericina B complejo lipídico (comercializado bajo el nombre de Abelcet®): se trata de un complejo de anfotericina B con dos fosfolípidos: L-a- dimiristoilfosfatidilcolina (abreviadamente, DMPC), L-a-dimiristoilfosfatidilglicerol (en forma de sales de sodio y amonio) (abreviadamente, DMPG). Su forma farmacéutica es la de un concentrado para suspensión y la vía de administración es la perfusión. Anfotericina liposomal (comercializado bajo el nombre de AmBisome®): se trata de una formulación farmacéutica que comprende anfotericina B encapsulada en la bicapa de liposomas. La forma farmacéutica es la de un liofilizado y la vía de administración es por infusión intravenosa. Anfotericina B dispersión coloidal (comercializado bajo el nombre de Amphotec® o Amphocil®): se trata de un complejo de anfotericina B con sulfato sódico de colesterilo. La forma farmacéutica es la de liofilizado para reconstitución y la vía de administración es por infusión intravenosa. Otra formulación farmacéutica que se lanzó al mercado (aprobada en España en el año 1967) comprendía anfotericina B combinada con gramicidina, neomicina y triamcinolona y en esta ocasión la formulación se presentaba en forma de pomada (Catálogo de Especialidades Farmacéuticas del Consejo General de Colegios Oficiales de farmacéuticos, 1998) (comercializada bajo el nombre de Trigon®). Sin embargo, una combinación de cuatro componentes activos en una misma formulación (polifármaco) está actualmente desaconsejada ya que aumenta el riesgo de resistencias y efectos adversos. Esta formulación farmacéutica se dejó de comercializar en España a finales del siglo pasado.
Por otra parte, tal y como se ha comentado anteriormente en la presente invención, los principales inconvenientes que plantea la anfotericina B para el desarrollo de formulaciones farmacéuticas son su escasa solubilidad en medio acuoso y su deficiente estabilidad física y química. Por este motivo, paralelamente a la investigación llevada a cabo para lanzar al mercado nuevos medicamentos de este antifúngico cada vez más perfeccionados, se han realizado también diversos estudios para intentar aumentar su solubilidad en medio acuoso así como también mejorar su estabilidad. En los últimos años ha cobrado gran interés el uso de las ciclodextrinas para incrementar la solubilidad y estabilidad de la anfotericina B (EP147851B1, US4883785A, WO8910739A1). Se ha demostrado que las ciclodextrinas forman un complejo con anfotericina B que presenta una solubilidad en agua y una estabilidad que son sustancialmente mayores que las de los compuestos o formulaciones conocidas de anfotericina B. Además el complejo tiene una palatabilidad, estabilidad a la luz y toxicidad mejoradas respecto a las formulaciones o compuestos de anfotericina B conocidos. Entre las ciclodextrinas que se han usado a tal efecto destaca el uso de y-ciclodextrina (EP147851B1) por los buenos resultados que se obtienen.
Se han descrito también diversas alternativas a la utilización de la y-ciclodextrina que proporcionan, como ella, buenos resultados. Por ejemplo, en la patente WO8910739A1 se propone un derivado hidroxialquil ciclodextrina en lugar de la molécula base de y-ciclodextrina. Asimismo, en la patente WO2006089007A2 se expone la utilización de un nuevo derivado polimerizado de ciclodextrina al que la anfotericina B se une por enlace covalente (unión pues de mayor grado de fuerza que la descrita en las patentes anteriores). Adicionalmente, se han propuesto también alternativas respecto al método de síntesis de estos complejos anfotericina B-ciclodextrina (abreviadamente, AMB-CD). Desde que se propuso la utilización de las ciclodextrinas para aumentar la solubilidad y estabilidad de la anfotericina B se han estado usando diversas variantes de un mismo método de síntesis del complejo anfotericina B-ciclodextrina. Este método se basa en un cambio de pH y en el uso de disolventes, como el etanol, y posterior secado y eliminación de restos por liofilización o atomización. En contraposición, en la patente JP8059483A se describe un nuevo método para elaborar dichos complejos. Esta nueva alternativa de síntesis propone la utilización del disolvente dimetilsulfóxido (DMSO), disolvente más tóxico que los usados convencionalmente, que luego se retira por diálisis.
Las formulaciones de anfotericina B comercializadas hasta la fecha están destinadas a administrarse prioritariamente por vía intravenosa y la forma farmacéutica en la que se comercializan es la de polvo liofilizado. Para poder administrar la anfotericina B por vía intravenosa, se deberá dispersar previamente el liofilizado en medio acuoso. El periodo de validez (o estabilidad física y química en uso tras la dilución) del polvo de anfotericina B una vez dispersado en medio acuoso es muy corto (unos pocos días y conservado en nevera), lo que dificulta su uso comercial.
Además, en los últimos años se ha producido el agravamiento de varios problemas sanitarios que demandan el desarrollo de formulaciones tópicas de anfotericina B: - Prevención de infecciones nosocomiales: En enfermos hospitalizados se acentúa el peligro de infección fúngica provocada por los catéteres y sondas. Por esta razón, y de forma preventiva, se usan combinaciones de antifúngicos de amplio espectro (especialmente anfotericina B) con antibióticos preparados generalmente en los servicios de Farmacia del propio hospital. En estos casos es muy importante que el producto a administrar sea además lubricante y tenga un cierto efecto adhesivo sobre la sonda para que su acción perdure en el tiempo existiendo siempre un contacto estrecho entre el fármaco y la sonda. La forma farmacéutica idónea del medicamento a administrar para esta aplicación es la presentación en forma de gel.
Tratamiento y prevención de infecciones fúngicas en inmunodeprimidos: Tanto en inmunodepresiones patológicas (SIDA) como iatrogénicas (por antiinflamatorios corticoides, transplantes, etc.) pueden aparecer infecciones en mucosas (boca, vagina, ojos,...) debidas a la microbiota oportunista, especialmente del género Candida. Para esta aplicación resultan muy interesantes los geles (si son muy diluidos podrían ser colirios) y las cremas. El uso de estas formulaciones tópicas se hace especialmente idóneo en el caso de infecciones en la cavidad bucal para las que deben usarse compuestos especialmente adhesivos y resistentes al agua para que tengan efectos prolongados.
Tratamiento de micosis cutáneas: Las micosis cutáneas se suelen asociar a un deficiente secado y contaminación (agravándose en pacientes inmunodefícientes) en pies y espalda. Un exceso de humedad puede favorecer la aparición de estas infecciones que se suelen tratar secando la zona (talco) y aplicando cremas, pomadas o geles antifúngicos.
En la presente invención se describen formulaciones de anfotericina B para administración por vía tópica en las que tanto el uso en calidad de excipiente de la y- ciclodextrina, que proporciona un aumento en la solubilidad en medio acuoso de la anfotericina B, como la nueva forma de presentación del medicamento a administrar (gel, crema, pomada o colirio), que facilita el contacto de la misma con el agente infectante, proporcionan como resultado final un aumento en el efecto farmacológico de la anfotericina B. Gracias a este aumento en su efecto farmacológico la anfotericina manifiesta acción antiparasitaria (en concreto, antileishmaniosis) además de la acción antimicótica (cutánea, mucocutánea y superficial) principal indicación para la que se prescribe actualmente la anfotericina B. Además, las formulaciones preparadas en la presente invención presentan un perfil de seguridad drásticamente mejorado con respecto al de cualquiera de las formulaciones de anfotericina B conocidas hasta ahora. Explicación de la Invención
En primer lugar, se debe tener en cuenta que el uso en esta descripción y en las reivindicaciones de los artículos el/la, un/a/o incluye la referencia al plural a no ser que en el contexto se indique explícitamente lo contrario.
La invención se refiere a nuevas formulaciones farmacéuticas de anfotericina B de administración por vía tópica, así como a su método de preparación y a sus aplicaciones. En dichas formulaciones la anfotericina B se encuentra formando un complejo con ciclodextrina. En concreto, en las formulaciones farmacéuticas de la presente invención la anfotericina B se encuentra formando un complejo con γ- ciclodextrina.
La formación del complejo anfotericina B-/-ciclodextrina aumenta la solubilidad en medio acuoso de la anfotericina B y esto provoca, a su vez, una disminución de la afinidad de la misma por los componentes grasos de las formulaciones farmacéuticas. De esta forma, el complejo anfotericina B- ^-ciclodextrina se liberará de su vehículo con más facilidad y en mayor medida que la anfotericina B sin complejar. A su vez, la ^-ciclodextrina actúa también como promotora de absorción y ejerce una acción adhesiva por lo que favorecerá la penetración y la actividad de la anfotericina B.
Asimismo, la forma de presentación de las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, en concreto, gel, crema, pomada y colirio, facilita el contacto del antifúngico con el agente infectante.
La acción combinada de todas las características descritas contribuye al aumento del efecto farmacológico de la anfotericina B gracias al cual ésta manifiesta actividad antiparasitaria (en concreto, antileishmaniosis) además de la acción antimicótica (cutánea, mucocutánea y superficial), principal indicación para la que se prescribe actualmente la anfotericina B. Otro aspecto importante de las formulaciones farmacéuticas de la presente invención es que la anfotericina B presenta un estado de agregación monomérico, a diferencia del estado de agregación que suele presentar ésta en las formulaciones farmacéuticas comercializadas hasta el momento, que es el estado dimérico.
Además, las formulaciones farmacéuticas descritas en la presente invención presentan una estabilidad física y química superior que las formulaciones de anfotericina B comercializadas hasta el momento. Esta estabilidad física y química superior se explica, en parte, por el estado de agregación monomérico que presenta la anfotericina B en las formulaciones de la invención, así como por el hecho de encontrarse formando un complejo con la ^-ciclodextrina.
Tal y como ya se ha comentado, la interacción entre los dos componentes del complejo, anfotericina B y y-ciclodextrina, tiene como resultado un efecto solubilizante de la anfotericina B en medios acuosos. Dicho efecto se fundamenta en la formación de micelas en una relación molar de anfotericina B:y-ciclodextrina entre 1 :50 y 1 :200. Dicho de otra forma, cada molécula de anfotericina B está influenciada por la presencia de entre 50 y 200 moléculas de y-ciclodextrina a su alrededor.
La presente invención se refiere, en primer lugar, a nuevas formulaciones tópicas de anfotericina B en distintas formas farmacéuticas: gel, crema, pomada y colirio. Estas formulaciones de la invención comprenden un complejo anfotericina B-y-ciclodextrina y un excipiente tópico farmacéuticamente aceptable, y se caracterizan además porque la relación molar entre la anfotericina B y la y-ciclodextrina está dentro del intervalo entre 1 :50 y 1 :200 y porque la anfotericina B presenta un estado de agregación monomérico.
En la presente invención, la expresión "un excipiente tópico" se refiere a cualquier componente, o componentes, distinto del principio activo, en este caso anfotericina B, presente en la formulación farmacéutica o utilizado en su fabricación y cuya función es servir como soporte (vehículo o base) del principio activo y facilitar su fabricación y administración por vía tópica.
En la formulación farmacéutica en gel de la invención, el excipiente tópico a usar es un excipiente adecuado para la preparación de geles. Dicho excipiente adecuado para la preparación de geles se selecciona entre derivados de celulosa, derivados de guar, polímeros vinílicos, polímeros carboxivinílicos, polímeros acrílicos, polímeros naturales, y/o combinaciones de los mismos. De forma preferida, el excipiente adecuado para la preparación de geles se selecciona entre metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa y copolímeros reticulados de acrilato de alquilo C 10-30 .
En la presente invención, la expresión "excipiente adecuado para la preparación de geles" se refiere a cualquier excipiente tópico farmacéuticamente aceptable indicado para la fabricación de formulaciones farmacéuticas en forma de gel.
En la formulación farmacéutica en crema de la invención, el excipiente tópico a usar es un excipiente adecuado para la preparación de cremas. Dicho excipiente adecuado para la preparación de cremas se selecciona entre siliconas, derivados de siliconas, bases emulgentes aceite/agua (abreviadamente, O/A) de tipo no iónico, y/o combinaciones de los mismos. De forma preferida, el excipiente adecuado para la preparación de cremas se selecciona entre ciclometicona y dimeticona.
En la presente invención, la expresión "excipiente adecuado para la preparación de cremas" se refiere a cualquier excipiente tópico farmacéuticamente aceptable indicado para la fabricación de formulaciones farmacéuticas en forma de crema.
En la formulación farmacéutica en pomada de la invención, el excipiente tópico a usar es un excipiente adecuado para la preparación de pomadas. Dicho excipiente adecuado para la preparación de pomadas se selecciona entre un excipiente adhesivo oral, parafina, derivados de parafina, bases agua/aceite (abreviadamente, A/O), cremas agua/aceite (abreviadamente, A/O), y/o combinaciones de los mismos. De forma preferida, el excipiente adecuado para la preparación de pomadas es una mezcla comprendida por carboximetilcelulosa sódica, pectina y gelatina, en una base de polietileno y aceite mineral.
En la presente invención, la expresión "excipiente adecuado para la preparación de pomadas" se refiere a cualquier excipiente tópico farmacéuticamente aceptable indicado para la fabricación de formulaciones farmacéuticas en forma de pomada.
La formulación farmacéutica en colirio de la invención comprende el complejo de anfotericina B-y-ciclodextrina disuelto en suero salino o glucosado.
En la presente invención se reivindica también el uso de las formulaciones farmacéuticas descritas para el tratamiento de infecciones fúngicas y/o parasitarias en seres humanos y/o animales. De forma más concreta, las formulaciones farmacéuticas de la invención se pueden usar para el tratamiento de micosis superficiales, cutáneas y mucocutáneas, así como para el tratamiento de leishmaniosis cutánea.
La presente invención se refiere también al método para la preparación de las formulaciones farmacéuticas descritas anteriormente. Este método comprende, en primer lugar, la solubilización de la anfotericina B mediante formación de un complejo con -ciclodextrina y, en segundo lugar, la preparación de cada una de las formulaciones farmacéuticas de la invención (gel, crema, pomada y colirio) mediante la adición de un excipiente tópico farmacéuticamente aceptable a la solución del complejo anfotericina B-y-ciclodextrina. En concreto, el método para la preparación de las formulaciones de la presente invención comprende las siguientes etapas: a) se prepara una disolución en medio acuoso de ^-ciclodextrina y se ajusta el pH de dicha disolución hasta un valor entre 11,5 y 14,
b) a continuación se añade la anfotericina B a la disolución de la etapa (a) en una relación molar antotericina B:^-ciclodextrina entre 1 :50 y 1 :200 y se agita constantemente hasta su completa disolución,
c) se ajusta el pH de la mezcla de la etapa (b) a un valor entre 4 y 8. d) se añade un excipiente tópico farmacéuticamente aceptable a la solución del complejo anfotericina B-y-ciclodextrina de la etapa (c).
Para la preparación de la formulación farmacéutica en gel de la invención se ha de añadir como excipiente tópico en la etapa (d) del método, un excipiente adecuado para la preparación de geles y, además, se han de añadir las siguientes etapas a continuación de la etapa (d):
Etapa (e): se agita suavemente.
Etapa (f): se deja en reposo durante un tiempo comprendido entre un minuto y tres días.
En concreto, el excipiente adecuado para la preparación de geles se selecciona entre derivados de celulosa, derivados de guar, polímeros vinílicos, polímeros carboxivinílicos, polímeros acrílicos, polímeros naturales, y/o combinaciones de los mismos. De forma preferida, el excipiente adecuado para la preparación de geles se selecciona entre metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa y copolímeros reticulados de acrilato de alquilo C10-3o, tales como Carbopol® Ultrez 20 y Carbopol® ETD 2020.
Para la preparación de la formulación farmacéutica en crema de la invención se ha de añadir como excipiente tópico en la etapa (d) del método, un excipiente adecuado para la preparación de cremas, y además, se ha de añadir la siguiente etapa a continuación de la etapa (d):
Etapa (e): se agita durante un tiempo comprendido entre un minuto y una hora. En concreto, el excipiente adecuado para la preparación de cremas se selecciona entre siliconas, derivados de siliconas, bases emulgentes O/A de tipo no iónico, y/o combinaciones de los mismos. De forma preferida, el excipiente adecuado para la preparación de cremas se selecciona entre ciclometicona y dimeticona. Para la preparación de la formulación farmacéutica en pomada de la invención se ha de añadir como excipiente tópico en la etapa (d) del método, un excipiente adecuado para la preparación de pomadas, y además, se han de añadir las siguientes etapas a continuación de la etapa (c) y antes de la etapa (d):
Etapa (el): se liofiliza el complejo anfotericina B-y-ciclodextrina de la etapa (c), Etapa (c2): se pulveriza el liofilizado de la etapa (el).
En concreto, el excipiente adecuado para la preparación de pomadas se selecciona entre un excipiente adhesivo oral, parafina, derivados de parafína, bases A/O, cremas A/O, y/o combinaciones de los mismos. De forma preferida, el excipiente adecuado para la preparación de pomadas es Orábase® (mezcla comprendida por carboximetilcelulosa sódica, pectina y gelatina, en una base de polietileno y aceite mineral).
Para la preparación de la formulación farmacéutica en colirio de la invención se han de reemplazar las anteriores etapas (a) y (c) por las siguientes nuevas etapas (a') y (c'), respectivamente, añadiéndose además una nueva etapa (c' l) a continuación de la nueva etapa (c'), y omitiéndose la etapa (d):
Etapa (a'): se prepara una disolución de y-ciclodextrina en medio salino isotónico o en suero glucosado y se ajusta el pH de dicha disolución hasta un valor entre 1 1 ,5 y 14,0, Etapa (c'): se ajusta el pH de la mezcla de la etapa (b) a un valor entre 7,2 y 7,6.
Etapa (c' l): se lleva a cabo una filtración esterilizante.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención han demostrado tener una mayor actividad frente a micosis superficiales, cutáneas y mucocutáneas (se probaron 11 cepas de levadura diferentes) que la formulación convencional de la anfotericina B (anfotericina B desoxicolato) y que la formulación de anfotericina B disuelta en DMSO.
Adicionalmente, estas formulaciones han demostrado en distintos estudios in vivo ser eficaces para su uso contra Leishmania (se probaron 6 especies de Leishmania diferentes) mostrando, además, un perfil de seguridad mucho mayor que la formulación convencional de anfotericina (anfotericina B desoxicolato) y que la formulación de anfotericina B disuelta en DMSO, al presentar mucha menos citotoxicidad que dichas formulaciones.
Asimismo, las formulaciones descritas en la presente invención han mostrado una estabilidad física y química marcadamente superior frente a la de la formulación convencional de anfotericina (anfotericina B desoxicolato).
A continuación se ilustra la invención mediante los siguientes ejemplos de preparación de las nuevas formulaciones farmacéuticas de anfotericina B así como diferentes estudios realizados con el fin de evaluar los resultados concretos de eficacia y toxicidad obtenidos con estas formulaciones. Estos ejemplos son simplemente ilustrativos pero no limitativos del alcance de la invención.
Modo de realización preferido
Ejemplo 1. Formación y caracterización de complejos de anfotericina B con γ- ciclodextrina
Para preparar el complejo anfotericina B-y-ciclodextrina primero se disolvió y- ciclodextrina en agua. A continuación, se añadió hidróxido sódico 2N para aumentar el pH a 12 y posteriormente se adicionó la anfotericina B con agitación hasta su disolución completa. Una vez disuelta la anfotericina B, se procedió a neutralizar la disolución con ácido fosfórico llevando el pH a 5,5 (valor de pH para la piel). Para determinar las características de la interacción anfotericina B-y-ciclodextrina se ensayaron distintas cantidades de ambos componentes y, tras filtrar por una membrana de 0,45 μιη, las muestras se analizaron por espectrofotometría a 364 nm. De esta forma, se realizó un diagrama de solubilidad anfotericina B-y-ciclodextrina a 25°C para lo cual se preparó previamente una disolución de anfotericina B en dimetilsulfóxido con el fin de obtener una recta de calibrado que permitiera la cuantificación de la solubilidad de anfotericina B en presencia de y-ciclodextrina por comparación con los datos de solubilidad de la anfotericina B en la recta de calibrado. A partir del diagrama de solubilidad hallado se determinó que la relación molar entre la anfotericina B y la ^-ciclodextrina en el complejo formado y para las condiciones concretas en las que se realizaron los ensayos de solubilidad era de 1 :70 (anfotericina B:^-ciclodextrina) (dicho diagrama de solubilidad se muestra en la figura 1). Al mismo tiempo, la técnica espectrofotométrica permitió también la determinación del estado de agregación (monomérico, dimérico o poliagregado) de la anfotericina B en el complejo formado, ya que se había observado previamente que los picos de máxima absorbancia del espectro de IR de anfotericina B variaban según el estado de agregación de la misma. Mediante un barrido espectrofotométrico de la disolución de anfotericina B en y- ciclodextrina (ΑΜΒ-γ-CD) (tanto en medio salino como en medio glucosado) se comprobó que la disposición de la anfotericina B correspondía al estado de agregación monomérico (Torrado JJ, Espada R, Ballesteros MP y Torrado-Santiago S. Amphotericin B formulations and drug targeting. J. Pharm. Sci. 2008: 97, 2405-2425). Asimismo, se analizó el tamaño de las partículas mediante dispersión láser (Zetatrac Ultra, Microtrac Inc.). El tamaño hidrodinámico del complejo anfotericina B-y- ciclodextrina resultó ser inferior a 1 nm. Es importante resaltar que con el paso del tiempo (a partir de una semana, en el caso de la disolución de anfotericina B-y- ciclodextrina en medio salino; y a partir de dos semanas, en el caso de la disolución de anfotericina B-y-ciclodextrina en medio glucosado) se apreció en el complejo una tendencia a la agregación evidenciada por el aumento del tamaño de partícula (característica que revela la inestabilidad física).
Para finalizar la caracterización, se liofilizó una disolución acuosa del complejo anfotericina B:^-ciclodextrina en una relación molar 1 :70, y el sólido obtenido se analizó por difracción de rayos X, espectrofotometría infrarroja (IR) y calorimetría diferencial de barrido. Los resultados obtenidos tanto mediante difracción de rayos X como mediante calorimetría diferencial de barrido evidenciaban la existencia de un sólido amorfo que difería de la estructura molecular del material de partida, anfotericina B, que es un sólido cristalino. Se realizó asimismo un estudio comparativo de las distintas formulaciones preparadas, usando como técnica la espectrofotometría infrarroja. La figura 2 muestra el resultado del estudio. Comparando el espectro de IR del liofilizado (complejo anfotericina B-y- ciclodextrina) frente al de anfotericina B (mostrados ambos en la Fig. 2), se observó que la región del espectro correspondiente tanto al grupo -N¾ como al resto -OH del grupo ácido carboxílico (entre 1000 cm'1 y 1500 cm"1) había quedado oculta, lo que sugería que esos grupos de la molécula de anfotericina B podrían haberse modificado durante la formación del complejo. También podía apreciarse un estiramiento de los picos ubicados en la región alrededor de los 1800 cm"1, que corresponde a los grupos - CH3 y al resto -CO del grupo ácido carboxílico de la molécula de anfotericina B, y en la región alrededor de 1400 cm"1, que corresponde a los grupos -OH (grupos alcohol) de la misma, lo que indica la formación de enlaces de hidrógeno. Por lo tanto, los espectros de IR evidenciaron la interacción existente entre la anfotericina B y la ciclodextrina. Dicha interacción tiene como resultado un efecto solubilizante de la anfotericina por formación de micelas en una relación molar de anfotericina Β:γ- ciclodextrina de 1 :70 tal y como se dedujo anteriormente a partir del diagrama de solubilidad de anfotericina B en presencia de y-ciclodextrina. Todas las alteraciones observadas en las señales del espectro de IR correspondientes a la fracción de anfotericina y producidas por la formación del complejo anfotericina-ciclodextrina se explican por la influencia de las 70 moléculas de y-ciclodextrina sobre cada molécula de anfotericina. En vista de los resultados obtenidos y teniendo en cuenta la conveniencia de añadir un exceso de ciclodextrina para mejorar la estabilidad física del complejo evitando así problemas de agregación, hecho que había sido comprobado experimentalmente con anterioridad por los propios inventores, se estableció como preferida una relación molar (anfotericina B: ^-ciclodextrina) de 1 : 100. Es importante señalar que, en la práctica, el límite de solubilidad real de la anfotericina B en medio acuoso y a 25°C, es de 2,8 g/1 (gramos de anfotericina B por cada litro de la solución formada por anfotericina B y agua). Ejemplo 2. Preparación de distintas formulaciones farmacéuticas tópicas de anfotericina B y selección de las formulaciones preferidas de la invención 2.A. Preparación de distintas formulaciones farmacéuticas tópicas de
anfotericina B
2.A. I . Preparación de formulaciones farmacéuticas de anfotericina B-y-ciclodextrina en forma de gel:
En primer lugar, se preparó el complejo anfotericina B-y-ciclodextrina. Para ello se disolvieron 12,5 gramos de y-ciclodextrina en aproximadamente 50 mi de agua desionizada. La solución obtenida se llevó a pH 12,0 mediante la adición de hidróxido de sodio 2N, se adicionaron 125 mg de anfotericina B con agitación constante hasta su total disolución y se llevó la solución obtenida a pH 5,5 utilizando ácido fosfórico 2N, para finalmente completar el volumen a 100 mi con agua desionizada.
En segundo lugar, se prepararon distintas formulaciones en gel utilizando los siguientes agentes gelificantes:
Hidroxipropilcelulosa Tipo H (Hypromelosa)
Carbopol® ETD 2020
Carbopol® Ultrez 20
- Metilcelulosa (Metolosa 1500)
- Respecto a los geles derivados de celulosa: Se prepararon geles con hidroxipropilcelulosa al 3% en peso (p/p) y con metilcelulosa al 2% p/p. Para ello, se adicionó el agente gelificante a la solución del complejo anfotericina B con y- ciclodextrina, agitando de forma suave para no generar burbujas, y la mezcla se dejó en reposo durante 24 horas para su completa homogenización.
- Respecto a los geles con Carbopol® (derivados acrílicos): Se prepararon geles utilizando dos agentes gelificantes distintos, Carbopol® ETD 2020 y Carbopol® Ultrez 20. Para ello, se añadió en cada caso el agente gelificante a una concentración del 1% p/p, se dispersó en la solución del complejo anfotericina B con y-ciclodextrina, y se ajustó el pH a un valor de 5,5 con trietanolamina. 2.A.2. Preparación de formulaciones farmacéuticas de anfotericina B-y-ciclodextrina en forma de crema: Se ensayó una formulación en crema utilizando una mezcla de siliconas, concretamente Dow Corning 3225C (15% p/p) y ciclometicona (15% p/p). Se prepararon 100 gramos de formulación en crema de la siguiente manera:
En primer lugar se preparó el complejo anfotericina B-y-ciclodextrina. Para ello, en un vaso de precipitados, se disolvió la y-ciclodextrina en aproximadamente 40 mi de agua y se añadieron gotas de una solución de hidróxido de sodio 2 N hasta ajustar el valor del pH de la disolución a 12,0. Manteniendo la agitación constante, se agregó la anfotericina B y se continuó con la agitación hasta total disolución. Se añadieron unas gotas de una solución de ácido fosfórico 2N hasta llevar a pH 5,5. Esta solución se completó con agua hasta un volumen de 70 mi, disolviendo previamente en ella 1 gramo de cloruro sódico.
En segundo lugar, se preparó la formulación farmacéutica en crema. Para ello, en otro vaso de precipitados se mezclaron 15 mi de ciclometicona y 15 mi de Dow Corning 3225C y se agitaron utilizando un homogenizador Ultra Turrax. A esta mezcla se adicionó poco a poco y manteniendo la agitación, la solución preparada en primer lugar que contenía el complejo anfotericina B-y-ciclodextrina, y se continuó con la agitación, hasta conseguir la consistencia deseada. 2.A.3. Preparación de formulaciones farmacéuticas de anfotericina B-y-ciclodextrina en forma de pomada:
Se preparó una formulación en forma de pomada empleando el excipiente adhesivo oral Orábase®. Esta base adhesiva está constituida por carboximetilcelulosa sódica, pectina, gelatina y una mezcla de parafina líquida y polietileno. Se escogió este excipiente en concreto para la preparación de la pomada de la invención debido a sus propiedades adherentes y a su efecto protector en lesiones de la piel. En primer lugar, se preparó el complejo anfotericina B-y-ciclodextrina siguiendo el procedimiento de preparación del mismo detallado en el apartado 1 de este ejemplo. En segundo lugar, se liofilizó el complejo anfotericina B-y-ciclodextrina resultante a fin de eliminar el agua de dicho complejo. El liofilizado resultante, previamente pulverizado en un mortero, se mezcló con la base adhesiva hasta su completa homogenización sin grumos. 2.A.4. Preparación de formulaciones farmacéuticas de anfotericina B-y-ciclodextrina en forma de colirio:
Se elaboró una formulación de anfotericina B-y-ciclodextrina en forma de colirio. Para ello se preparó en primer lugar, al igual que para todas las formulaciones de la invención, el complejo anfotericina B con y-ciclodextrina. Sin embargo, para esta formulación farmacéutica en particular, la preparación del complejo anfotericina B-y- ciclodextrina presenta varias diferencias respecto al resto de formulaciones de la invención. Se disolvieron 14,375 gramos de y-ciclodextrina en aproximadamente 50 mi de, o bien una solución salina fisiológica estéril, o bien una solución estéril de dextrosa al 5% p/v. La solución obtenida se llevó a pH 12,0 con hidróxido de sodio 2N, se adicionaron 143,75 mg de anfotericina B con agitación constante hasta su total disolución y se llevó la solución obtenida a pH 7,4 utilizando ácido ortofosfórico 2N para finalmente completar el volumen hasta 100 mi con, o bien la solución salina fisiológica estéril, o bien la solución estéril de dextrosa al 5% p/v, según la solución que se usara al principio. Posteriormente, se realizó una filtración esterilizante con un filtro de 0,22 μιη de acetato de celulosa Minisart NML® Sartorius. A la hora de calcular la cantidad de cada uno de los reactivos de partida (anfotericina B y y- ciclodextrina) necesaria para la preparación de la formulación en colirio de la invención, se tuvo en cuenta que un 15% de la formulación final queda retenido en el filtro. 2.B. Caracterización de las distintas formulaciones preparadas, comparación de las mismas en términos de actividad antifúngica y selección de las formulaciones preferidas de la invención Se determinó la viscosidad de cada una de las formulaciones anteriores así como el estado de agregación de anfotericina B en cada formulación, y se evaluó el efecto in vitro de las distintas formulaciones sobre Candida albicans mediante antifungigrama por difusión. La viscosidad varió según la formulación entre 50 y 4000 cps (Brookfíeld DV-III, aguja CP41, entre 5 y 25 rpm y 20 ± 2°C). El estado de agregación se mantuvo como monomérico en todas las formulaciones menos en la formulación en gel con hidroxipropilcelulosa que varió a poliagregado. Por otra parte, en el análisis por espectrofotometría de las formulaciones en gel con Carbopol® se apreció un descenso en absorbancias con respecto a la formulación en gel con metilcelulosa lo que puede ser indicativo de una deficiente liberación de la anfotericina B.
Para el estudio de sensibilidad se utilizó como medio de cultivo agar Mueller Hinton (MHA) suplementado con 2 % p/v de glucosa y 0,5 μg/ml de azul de metileno. Se prepararon soluciones de anfotericina B en dimetilsulfóxido a las concentraciones de 600; 240; 96; 38,4 y 15,4 μg/ml. Las muestras del gel, crema y colirio de anfotericina B se disolvieron/dispersaron inicialmente en agua y luego en tampón fosfato 0,2 M pH 10,5 a una concentración de 96 μg/ml. Los discos de papel para ensayo se impregnaron con 20 μΐ de cada solución estándar y de muestra, se dejaron secar durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguidamente fueron colocados en las placas de cultivo que contenían MHA y se inocularon con la suspensión del hongo (C albicans 1394). Tras ser mantenidas en refrigeración a 5°C durante 2 horas, las placas se incubaron a 30°C durante 48 horas, para medir posteriormente los halos de inhibición. Formulación Halo de inhibición en
mm
AMB en DMSO 24,9 + 0,1
AMB desoxicolato 22,5 + 0,1
Α Β-γ-CD (gel) con metilcelulosa 24,8 + 0,2
ΑΜΒ-γ-CD (gel) con 12,6 + 0,3
hidroxipropilcelulosa
ΑΜΒ-γ-CD (gel) con Carbopol® ETD 18,1 + 0,1
2020
AMB-y-CD (gel) con Carbopol® 18,7 + 0,1
Ultrez 20
AMB-y-CD (crema) con siliconas 26,4 + 0,2
AMB-y-CD (colino) 27,0 + 0,3
Tabla 1. Resultados de actividad de las distintas formulaciones estudiadas en relación con anfotericina B disuelta en DMSO (AMB en DMSO) y anfotericina B desoxicolato (AMB desoxicolato).
Se descartaron las formulaciones con hidroxipropilcelulosa y con Carbopol al demostrar una actividad fungicida inferior. Consecuentemente, se seleccionó la formulación en gel con metilcelulosa como la formulación en gel preferida de la invención. También se estudió el posible efecto de la viscosidad del gel en la sensibilidad. Para ello se prepararon geles de metilcelulosa con concentraciones al 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 y 4,0 % p/p y con viscosidades crecientes desde 330 cps hasta 3500 cps. La actividad antimicrobiana de todas ellas fue similar, por lo que se eligió una concentración de metilcelulosa al 3% p/p como la más adecuada por su viscosidad (1520-2470 cps).
Ejemplo 3. Estudio de la actividad antifúngica de las formulaciones de la invención
Siguiendo el método de preparación de la formulación farmacéutica en gel de la invención descrito en el ejemplo 2, se preparó la formulación farmacéutica en gel de anfotericina B-y-ciclodextrina seleccionada como preferida en el ejemplo anterior. Para ello, se usaron las siguientes cantidades de los distintos reactivos, excipientes y disolventes: anfotericina B (0,125 g), y-ciclodextrina (12,5 g), metilcelulosa (3 g), pequeñas cantidades de NaOH, ácido ortofosfórico para ajustar el pH a un valor dentro del intervalo 5,5-5,7, y agua c.s.p. (cantidad suficiente para) 100. Se analizó la actividad antifúngica de esta formulación bajo diversas condiciones.
3.1. Actividad frente a distintas cepas de hongos y comparación de resultados con un control comercial (Neosensitabs®, Rosco, Dinamarca) Para este estudio se utilizaron discos patrón de anfotericina B Neo-Sensitabs® que contenían 10 μg de anfotericina B. Por otra parte, se prepararon soluciones control de anfotericina B disuelta en dimetilsulfóxido a las concentraciones de 600 y 96 μ$ de anfotericina B por mililitro de solución, con el fin de que los discos cargados con 20 μΐ de esta solución incorporaran 12 y 1,92 μg de anfotericina B por disco. Asimismo, para la formulación en gel de la invención se prepararon cuatro concentraciones en solución tampón fosfato (0,2 M pH 10,5) adecuadas para obtener discos con 0,96; 1,92; 5 y 10 μg de anfotericina B por disco, respectivamente. El medio de cultivo empleado fue MHA suplementado con 2 % p/v de glucosa y 0,5 μg/ml de azul de metileno. Este agar fundido a temperatura de 50°C fue inoculado con 3 mi de una suspensión del hongo (se utilizaron varias cepas de levadura, véase Fig. 3), previamente ajustada a una absorbancia de 0,1 a 600 nm, en solución salina fisiológica (NaCl 0,9 % p/v). Dicha suspensión del hongo se había preparado a partir de cultivos de la levadura en agar Sabouraud dextrosa incubados durante 72 horas a 30°C. Se impregnaron discos para ensayo con 20 μΐ de cada una de las soluciones de control y de cada una de las soluciones de la formulación en gel de la invención, se dejaron secar durante 15 minutos a temperatura ambiente y finalmente se depositaron sobre las placas de MHA que contenían la suspensión del hongo. En estas mismas placas de cultivo se colocaron también discos patrón de anfotericina B Neo-Sensitabs®. Estas placas se refrigeraron a 5°C durante 2 h y luego se incubaron a 30°C durante 48 h. Los resultados obtenidos al medir los halos de inhibición se muestran en la figura 3. Los resultados de este ensayo comparativo, muestran que 10 μ de anfotericina B de la formulación en gel de la invención provocan una inhibición mayor que la producida por la misma cantidad del antifúngico en los discos patrón de anfotericina B Neo- Sensitabs®. Este resultado resulta sorprendente ya el DMSO se considera promotor de la absorción al igual que la ciclodextrina y, por otra parte, la anfotericina B disuelta en DMSO se presenta en forma monomérica exactamente igual que como ocurre en el caso de la formulación de anfotericina en gel de la invención. Caben varias posibles explicaciones a estos resultados, entre ellas, la posibilidad de que el gel retenga en las proximidades mayores concentraciones de anfotericina B siendo así el efecto dilución menor que con el DMSO, y/o una mayor estabilidad física y/o química de la anfotericina en la formulación en gel colocada en el disco en comparación con la formulación disuelta en DMSO, y/o una mejor difusión de la anfotericina B a través del agar. 3.2. Ensayo de sensibilidad
Este ensayo se realizó en las mismas condiciones que el experimento descrito en el apartado 2.B. para caracterizar todas las formulaciones de anfotericina B preparadas anteriormente en el apartado 2. A.. En la tabla 2 se muestra el promedio de las medidas de los halos de inhibición (en mm) obtenidos con cada una de las soluciones control de anfotericina B disuelta en dimetilsulfóxido preparadas (solución estándar 1 (SI) (600 μ^πύ), solución estándar 2 (S2) (240 μ^ηιΐ), solución estándar 3 (S3) (96 μg/ml), solución estándar 4 (S4) (38,4 μg/ml) y solución estándar 5 (S5) (15,4 μg/ml)) y con la solución de la formulación en gel de la invención (solución de muestra (M) (96 g/ml)) para cada cepa estudiada junto con su desviación estándar correspondiente. No se obtuvo halo de inhibición, para ninguna de las cepas estudiadas, ni al usar discos impregnados con el placebo de la formulación (formulación en gel sin anfotericina B), ni con discos únicamente tratados con el medio tamponado o con DMSO. En la presente invención se entiende por placebo de la formulación, aquella formulación que no contiene el principio activo (en este caso, anfotericina B) pero cuya preparación y composición es igual a la de la formulación de la invención). Aplicando un análisis de datos mediante la prueba t-Student a los resultados obtenidos tanto con la formulación de anfotericina B disuelta en dimetilsulfóxido como con la formulación en gel de la invención, se determinó que los datos para la formulación en gel de la invención eran estadísticamente diferentes (p<0,05) a los datos de la anfotericina B disuelta en dimetilsulfóxido (las diferencias entre los valores de ambos eran estadísticamente significativas), ya que en todas las cepas estudiadas el valor t obtenido fue menor que el valor t tabulado, con lo que se anula la hipótesis de que las medias de los dos grupos de muestras son iguales.
Figure imgf000025_0001
Tabla 2. Medida en mm del diámetro de los halos de inhibición, con su correspondiente desviación estándar, obtenidos en el ensayo de sensibilidad de diferentes cepas frente a anfotericina B. Como criterio para determinar la sensibilidad se estima que halos superiores a 15 mm corresponden a cepas sensibles, menores de 10 mm a cepas resistentes, y entre 10 y 14 a cepas intermedias. 3.3. Ensayo de inhibición de crecimiento de levadura sobre membrana
Para realizar este ensayo se preparó un preinóculo en 50 mi de medio mínimo YNB (base nitrogenada de levadura) con galactosa 50 mM y se incubó a 37 °C durante toda la noche. El cultivo se centrifugó a 4500 rpm durante 5 minutos y luego se lavó dos veces con PBS (solución salina tamponada con fosfato). Las células fueron finalmente suspendidas en PBS hasta una absorbancia de 0,2 a 600 nm.
Se prepararon soluciones de la formulación en gel de la invención a las siguientes concentraciones: 25, 50, 75, 150, 300, 450 y 600 μg/ml. Con estas soluciones se impregnaron membranas estériles de celulosa (Millipore) de 0,22 μηι de diámetro de poro (6 membranas para cada una de las 1 1 cepas) durante un tiempo aproximado de 10 segundos. Posteriormente estas membranas se lavaron. Un primer grupo de ellas (3 de esas 6 membranas, para cada cepa) se enjuagaron tres veces consecutivas con una solución de PBS, mientras que un segundo grupo (las otras 3 membranas restantes) se sumergieron durante 1 hora también en PBS. Todas las membranas se dejaron secar durante 20 minutos a 37°C antes de ser inoculadas.
Se prepararon placas con agar Sabouraud dextrosa con galactosa 500 mM y sobre cada una de ellas se colocó una de las membranas que estuvieron en contacto con la formulación en gel de la invención. Se depositaron 50 μΐ de la suspensión en PBS del microorganismo en estudio sobre cada una de las membranas y se extendió esta suspensión por toda la membrana. Se secaron las placas a 37°C durante 1 hora para secar el inoculo y posteriormente se invirtieron las placas y se incubaron durante 48 horas más, reubicando la membrana dentro de la placa cada 10 ó 12 horas.
Se realizó el ensayo por triplicado para cada concentración (se usaron tres membranas para cada condición de ensayo) y además se prepararon placas control con membranas sin anfotericina B. En la tabla 3 pueden observarse al detalle los resultados por triplicado de este ensayo. Para cada cepa, la primera fila de resultados corresponde a las membranas lavadas tres veces con PBS (fila A), y la segunda fila a las membranas que se dejaron sumergidas durante una hora después de aplicar la formulación (fila B).
En este ensayo, los resultados obtenidos difieren entre sí dependiendo de la metodología utilizada y de la cepa empleada. Así, se visualizó un mayor crecimiento de todas las cepas ensayadas cuando la membrana inoculada con la formulación se dejaba en remojo durante una hora en PBS que cuando la membrana se lavaba tres veces consecutivas con esta misma solución. En concreto, el crecimiento de la especie Candida krusei fue mayor que el de las otras, lo que pone de manifiesto la mayor resistencia de esta especie frente a anfotericina B.
CONCENTRACIÓN DE ANFOTERICINA B g/ml)
CEPA CONTROL
25 50 75 150 300 450 600
A
C. albicans - ± - . . . . . . . . . . . . . . . . . .
+ + +
1394 B - ± ±
A
C. dublin. + + + + + ± - - ± . . . . . . . . . . . .
+ + +
63341 B + + + + + + + + + + + ±
A
C. glabr. + + + + + ±
+ + +
60661 B + + + + + ±
A
C. glabr. + + + + + + + + +
+ + +
60750 B + + + + + + + + + - - ± . . . . . . . . .
A
C. guillier. + + + + + ± - - ± . . . . . . . . . . . .
+ + +
62863 B + + + + + ± + + + + + ±
A
C. krusei + + + + + + + + ± - - ± - ± ± . . + . . .
+ + +
52009 B + + + + + + + + + + + ± - ± ± - ± ± - - ±
A
C. krusei + + + + + + + + ± ± ± ±
+ + +
52011 B + + + + ± ± + ± ± ± ± ±
A
C. krusei + + + - - ± . . . . . . . . . . . . . . .
+ + +
55574 B + + + ± ± ± - ± ± - - ± - - ± - - ± . . .
A
C. paraps. + + + + ± ± - - ± . . . . . . . . . . . .
+ + +
57744 B + + + + + + + + ± ± ± ±
Sacchar. A + + + + + + + + + + + + + + + 61978 B + + + + + + + + ± ± ± ±
A
Trichosp. + + + + + ±
+ + +
61978 B + + + + + + + + ±
Tabla 3. Inhibición de la formación de biopelículas.
(+) : crecimiento en toda la membrana, (±) : crecimiento en parte de la membrana, (-) : membrana sin crecimiento. A: membranas lavadas tres veces con PBS; B: membranas que se dejaron sumergidas durante una hora después de aplicar la formulación.
3.4. Ensayo de penetración de anfotericina B en biopelículas fúngicas
Para realizar este ensayo se prepararon preinóculos de cada una de las cepas en estudio en 50 mi de medio mínimo YNB con galactosa 50 mM, siguiendo el mismo procedimiento usado para el ensayo de inhibición de crecimiento de levadura sobre membrana (punto anterior 3.3.), y se incubaron a 37°C durante toda la noche. Los cultivos obtenidos se centrifugaron a 4500 rpm durante 5 minutos, posteriormente se lavaron dos veces con PBS y con las células obtenidas se preparó una suspensión en PBS y se ajustó hasta una absorbancia de 0,2 medida a 600 nm.
Para obtener las biopelículas se prepararon placas con agar Sabouraud dextrosa al que se adicionó galactosa 500 mM. Sobre cada una de las placas se colocó una membrana estéril de polipropileno de 0,22 μηι de tamaño de poro y 47 mm de diámetro que se inoculó con 50 μΐ de la suspensión en PBS. Las placas se secaron a 37°C durante 1 hora, y posteriormente se invirtieron e incubaron durante 48 horas más, reubicando la membrana dentro de la placa cada 10 ó 12 horas.
Para la incorporación de anfotericina B: Se preparó agar YNB con galactosa 500 mM, se esterilizó en autoclave y, antes de solidificar, se dividió en 6 porciones adicionándose a las mismas anfotericina B, en dos formas distintas, por un lado, la formulación de anfotericina B disuelta en dimetilsulfóxido y, por otro, la formulación en gel de la invención, para obtener placas, por duplicado (es decir, para cada una de las dos formulaciones), con las siguientes concentraciones en ambos casos: 150, 300 y 600 μg/ml. Las placas de agar YNB con galactosa a las que se les ha incorporado anfotericina B constituyen la capa A de la biopelícula de ensayo (véase la Fig. 4). Sobre las placas de agar YNB con galactosa y anfotericina B se colocaron las membranas con o sin la biopelícula del microorganismo objeto de evaluación. Como controles se utilizaron los duplicados de cada placa en los que se habían dispuesto membranas estériles utilizando para ello membranas de exactamente las mismas características, 0,22 μηι de diámetro de poro y 47 mm de diámetro, pero en esta ocasión sin biopelícula. Estas membranas constituyen la capa B de la biopelícula de ensayo (véase la Fig. 4).
Sobre esta membrana, se dispone una nueva membrana que sirve de separación por contacto directo. En esta ocasión, se trata de una membrana de 0,22 μπι de diámetro de poro y 25 mm de diámetro. Esta nueva membrana constituye la capa C de la biopelícula de ensayo (véase la Fig. 4).
Sobre esta última membrana se colocaron discos para ensayo de 6 mm de diámetro impregnados con 20 μΐ de PBS. Estos discos constituyen la capa D de la biopelícula de ensayo (véase la Fig. 4). Este sistema se incubó a 37°C durante 4 horas (Fig. 4). A lo largo del experimento estos discos, inicialmente sólo impregnados con PBS, fueron absorbiendo (en los casos donde procedía) anfotericina B conforme ésta se difundía, consiguiendo así progresivamente actividad antifúngica gracias precisamente a esa absorción de anfotericina B.
Para determinar el grado de penetración de anfotericina B a través de la biopelícula fúngica, los discos descritos anteriormente como capa D, fueron depositados sobre placas de agar Mueller Hinton inoculado con una suspensión de Candida albicans como microorganismo de referencia, de igual manera que para la determinación microbiológica de la sensibilidad frente a anfotericina B (apartado 3.2.). Se incubaron las placas a 30°C durante 48 horas y se midieron los halos de inhibición obtenidos (Samaranayake, Y. H., Ye, J., Yau, J. Y. Y., Cheung, B. P. K. and Samaranayake, L.P. In vitro method to study antifungal perfusión in Candida biofilms. Journal of Clinical Microbiology. Feb. 2005: 818-825; Al-Fattani, M. A. and Douglas, L. J. Penetration of Candida biofilm by antifungal agents. Antimicrobial agents and chemotherapy. Sep. 2004, Vol. 48, No. 9: 3291-3297). Los resultados se muestran en la tabla 4. Observando las medidas de los halos de inhibición que se obtuvieron con el control, es decir, con la membrana sin biopelícula fúngica, se aprecian claramente las diferencias respecto a la cantidad de anfotericina B que pudo llegar hasta los discos colocados sobre la última membrana y que inicialmente sólo estaban impregnados con PBS. Al igual que en los ensayos anteriores, la formulación en gel de la invención se caracteriza por una gran capacidad de penetración.
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Tabla 4. Penetración de anfotericina B en biopelículas fúngicas.
3.5. Determinación de la capacidad fungicida de anfotericina B en la biopelícula fúngica
Para realizar este ensayo se preparó un conjunto de tubos de ensayo estériles conteniendo 5 mi de PBS cada uno, tres tubos para el control y tres para cada concentración a evaluar (150, 300 y 600 μξ/ηύ). De cada cepa se usaron las placas con las membranas que se evaluaron en el ensayo de penetración de biopelículas (ensayo 3.4) y su correspondiente control. Utilizando el asa de siembra se tomó de cada membrana una fracción de colonias en un área de 2 mm y se dispersaron en uno de los tubos con PBS utilizando un agitador vortex. De esta suspensión se prepararon diluciones para inocular placas de YED (Yeast-Extract Dextrose Médium, Extracto de levadura + dextrosa), y una vez inoculadas las placas se incubaron a 30°C durante 48 horas con el fin de determinar la proporción de células viables de la biopelícula tras el tratamiento con anfotericina B. Se obtuvieron diferentes resultados dependiendo de la cepa estudiada, de tal manera que las biopelículas de las siguientes cepas:
- C. albicans 1394
- C. glabrata 60661
- C. parapsilosis 57744
- Saccharomyces 61978
- Trichosporon 61978, mostraron una mayor susceptibilidad frente a la formulación en gel de la invención que frente a la formulación de anfotericina disuelta en DMSO. El resto de las cepas, sin embargo, no mostraron diferencias significativas entre la viabilidad de las biopelículas expuestas a la formulación de anfotericina disuelta en DMSO con respecto a la formulación en gel de la invención.
En la tabla 5 puede visualizarse de forma detallada el número de colonias obtenidas para cada especie por mm de biopelícula expuesta a la acción del antifúngico.
UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC)
AMB EN FORMULACIÓN EN GEL
CEPA DIMETILSULFÓXIDO DE LA INVENCIÓN
CONTROL
150 300 600 150 300 600
ug/ml ug/ml ug/ml ug/ml ug/ml ug/ml
1 C. albicans 1394 10000 8000 6500 180 4000 120 375000 2 C. dublin. 63341
15000 12500 80 12000 220 100 112500
3 C. glabrata 60661
6000 5000 3000 0 29 14 300000
4 C. glabrata 60750
5000 15000 18000 6000 8000 6500 250000
5 C. guillier. 62863
9000 750 1250 12500 600 320 15000
6 C krusei 52009
45000 10000 6000 8000 7000 6000 175000
7 C krusei 52011
200000 150000 35000 150000 8000 7000 200000
8 C krusei 55574
9000 7500 6000 10000 7000 6000 175000
9 C paraps. 57744
7500 5000 4000 6000 25000 150 2500
10 Sacchar. 61978
225000 10000 4300 10000 6000 120 20000
11 Trichosp. 61978
4000 400 10 400 50 120 200000
Tabla 5. Viabilidad de las biopelículas expuestas a un medio con anfotericina B.
Se muestra el número de unidades formadoras de colonias por mm2 de biopelícula obtenidas después de exponer la membrana con la biopelícula del microorganismo a anfotericina B disuelta en dimetilsulfóxido en comparación con la formulación en gel de la invención.
3.6. Comparación de eficacia contra la micosis cutánea entre la formulación en gel de la invención y clotrimazol en crema
Considerando que la formulación en crema de clotrimazol es actualmente el producto de primera elección en el tratamiento de micosis cutáneas, se realizó un ensayo de sensibilidad comparativo, utilizando C. albicans como microorganismo de referencia, entre clotrimazol en crema y la formulación en gel de la invención. Para ello se prepararon diluciones de anfotericina B en dimetilsulfóxido a las concentraciones de 600; 240; 96; 38,4 y 15,4 μg/ml, al igual que en los estudios anteriores, mientras que la formulación en gel de la invención, por su parte, se diluyó hasta una concentración de 60 μg/ml. Con la crema de clotrimazol se prepararon cuatro diluciones de clotrimazol en dimetilsulfóxido, de 96; 192; 480 y 960 μg/ml, considerando que la concentración teórica del antifúngico en la crema es del 1% p/p. Se inocularon discos para ensayo con las soluciones preparadas y se dispusieron sobre las placas de MHA que contenía la suspensión de C. albicans. Se incubaron las placas durante 48 horas a 30°C y se midieron los halos de inhibición.
Los resultados obtenidos muestran notables diferencias entre las dos formulaciones en estudio. Con la crema de clotrimazol, a diferencia de la formulación en gel de la invención, únicamente se obtuvieron halos de inhibición claramente definidos con la concentración más alta (960 μg/ml). En la tabla 6 pueden observarse al detalle los resultados de este ensayo. A partir de los resultados obtenidos se observa que una concentración de 60 μ§/π 1 de anfotericina B en la formulación en gel de la invención, da lugar a un halo de inhibición similar al que forma una concentración de 960 §/ηι1 de clotrimazol en la formulación de crema.
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Tabla 6. Sensibilidad de C. albicans frente a la formulación de AMB disuelta en DMSO, formulación en gel de la invención y clotrimazol en crema.
Con el fin de comprobar que la concentración de clotrimazol se corresponde con la teórica (1% p/p), se extrajo el clotrimazol a partir de la crema, usando DMSO, se impregnaron discos para ensayo y se comparó su actividad frente al disco patrón de clotrimazol Neo Sensitabs el cual contiene 10 μ% de clotrimazol. El diámetro de los halos observados fue el mismo en ambos casos. Adicionalmente, se prepararon diluciones con la formulación en gel de la invención a la misma concentración de 10 μg y se ensayaron conjuntamente con sus respectivos discos patrón de anfotericina B Neo Sensitabs . Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 7. Es importante mencionar el hecho de que los halos de inhibición obtenidos con el clotrimazol, tanto en los discos impregnados con clotrimazol procedente de la formulación en crema como en los discos patrón de clotrimazol Neo Sensitabs®, no son tan claramente definidos como los que se obtienen con la anfotericina B.
Figure imgf000034_0001
Tabla 7. Sensibilidad comparativa de C. albicans
frente a clotrimazol, tanto en la formulación en crema
como en discos clotrimazol Neo Sensitabs®, y a
anfotericina B, tanto la formulación en gel de la
invención como AMB disuelta en DMSO. La
concentración en todos los preparados y los discos Neo
Sensitabs® fue de 10 i de antifúngico por disco. Ejemplo 4. Actividad antileishmania, citotoxicidad y seguridad de uso
En primer lugar, se determinó la actividad antiparasitaria de la formulación en gel de la invención, gel de anfotericina Β- -ciclodextrina en metilcelulosa (3% p/p), en distintas especies de Leishmania, y se comparó con la de una formulación que contenía únicamente el complejo anfotericina B-^-ciclodextrina pero sin agente gelificante y con la de anfotericina B desoxicolato. Los promastigotes de distintas cepas fueron mantenidos mediante cultivos in vitro en 20 mi de medio de cultivo Schneider Drosophila (Sigma), en frascos de cultivo con tapas que permitían el intercambio aéreo (tissue Culture Flask 25 cm2 SARTED). Los frascos se incubaron en posición horizontal en estufa de incubación a 26°C. Se hicieron pases periódicos cada 7 días y para su conservación se congelaron lxl O7 promastigotes, en fase estacionaria, en 1,5 mi de Suero Bovino Fetal, mediante congelación gradual. Se dispusieron en placas de microtitulación (SARSTED) promastigotes en fase de crecimiento logarítmico de las distintas cepas a una concentración de 1,25x106 promastigotes/ml y en un volumen final de 200 μΐ. Para la determinación de la susceptibilidad a anfotericina B se prepararon diluciones seriadas de las formulaciones de anfotericina B en medio de cultivo Schneider (5, 2,5, 0,625, 0,312, 0,156, 0,078, 0,039 y 0,019 μg/ml), que se añadieron por triplicado a las placas de microtitulación. Se incubaron a 26°C en contacto con las formulaciones y, tras 48 horas, se determinó el efecto de la anfotericina B sobre la actividad metabólica del parásito por adición de 20 μΐ de una solución de resazurina 2,5 mM (Sigma) en PBS, dejándose en incubación durante 3 h a 26°C. A continuación, se determinó la intensidad de fluorescencia en espectrofluorímetro con una longitud de onda de excitación de 535 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm. Se determinó el porcentaje de parásitos viables y la concentración inhibitoria media (IC50) por el método de regresión Probit utilizando el paquete estadístico SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) v. 15.0. La tabla 8 muestra los resultados obtenidos.
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Tabla 8. Concentraciones inhibitorias medias (IC5o) obtenidas (en μg/ml) con las distintas formulaciones en las diferentes especies de Leishmania estudiadas. 'Aislados obtenidos de lesiones cutáneas en enfermos de Bolivia.
Los resultados de la tabla 8 muestran cómo la formulación constituida únicamente por el complejo anfotericina B-^-ciclodextrina sin agente gelificante tiene una actividad equiparable, en la mayoría de especies estudiadas, a la formulación de anfotericina B desoxicolato (análogo de Fungizona®), a excepción del caso de L. infantum. Sin embargo, cuando se utilizó la formulación en gel de la invención se produjo un descenso de eficacia que posiblemente esté relacionado con la velocidad de liberación del gel (el gel se libera más lentamente que la disolución). b) En segundo lugar, se estudió la citotoxicidad en cultivos de macrófagos de la línea J774. Los macrófagos se cultivaron en medio RPMI 1640 (Sigma) y se utilizaron, en fase de crecimiento logarítmico, en placas de microtitulación (SARSTED) a una concentración de 2,5x105 células/ml y en un volumen final de 200 μΐ. Se prepararon diluciones seriadas de las distintas formulaciones de anfotericina B (ver tabla 8) en medio de cultivo RPMI-1640 (5, 2,5, 0,625, 0,156, 0,078, 0,039 y 0,019 μ^ιηΐ), que se añadieron por triplicado a las placas de microtitulación. Se dejaron en incubación a 37°C en contacto con las formulaciones y, después de 24 horas, se añadieron 20 μΐ de una solución de resazurina 2,5 mM (Sigma) en PBS, dejándose en incubación 3 h a 26°C. A continuación se determinó la intensidad de fluorescencia en espectrofluorímetro con una longitud de onda de excitación de 535 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm. Se determinó el porcentaje de macrófagos viables y la concentración citotóxica media (CC50) por el método de regresión Probit utilizando el paquete estadístico SPSS v. 15.0. La tabla 9 muestra los resultados de citotoxicidad obtenidos.
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Tabla 9. Resultados de citotoxicidad (CC50) de las formulaciones estudiadas.
De los resultados de la tabla 9 se deduce que la formulación constituida únicamente por el complejo anfotericina Β- -ciclodextrina sin agente gelificante es más citotóxica que la anfotericina B desoxicolato, sin embargo, cuando la primera se formula de tal forma que se obtiene la formulación en gel de la invención disminuye la toxicidad de una forma exponencial.
Si definimos el margen de seguridad (MS) de uso de un fármaco como el cociente entre las concentraciones tóxicas y eficaces, en este caso concreto, el MS se calcularía como el cociente entre CC50 e IC50. Los resultados de márgenes de seguridad para las distintas formulaciones estudiadas en las distintas especies de Leishmania se recogen en la tabla 10.
Especies AMB desoxicolato ΑΜΒ-γ-CD sin Formulación en gel de agente gelificante la invención
L infantum 397 75,9 783
L. amazonensis 34,3 14,7 283
L. guyanensis 92,9 31,95 270,6
LC3' 114 44,7 731,6
LDl 174,5 60,7 923,1 L. braziliensis 240 74,6 491,4
Tabla 10. Márgenes de seguridad obtenidos como cociente entre CC50 e IC5o. Aislados procedentes de lesiones cutáneas en enfermos de Bolivia.
Teniendo en cuenta que la formulación en gel de la invención se compara con formulaciones de anfotericina cuya comercialización ha sido aprobada por las agencias reguladoras pertinentes (lo que indica, entre otras cosas, que dichas formulaciones presentan un perfil de seguridad suficiente para su comercialización), los resultados de la tabla 10 muestran claramente que el gel en estudio presenta unas características de seguridad no sólo muy adecuadas para su uso in vivo sino además bastante mejores que las que presentan las formulaciones actualmente en el mercado. Se concluye, por tanto, que la formulación en gel de la invención es sensiblemente más segura para su administración en seres humanos y animales en comparación con la formulación que actualmente se prescribe para su administración en seres humanos y con la formulación constituida únicamente por el complejo ΑΜΒ-γ-CD sin agente gelificante (tabla 9) al ser drásticamente menos tóxica que estas dos formulaciones.
4.1. Actividad leishmanicida in vivo sobre el criceto dorado
Se establecieron dos grupos de 5 cricetos dorados, a los que se les administró en la almohadilla plantar de la pata posterior izquierda, a día 0 y por inyección subcutánea, lxl O7 promastigotes metacíclicos en 0,5ml de una solución de L. amazonensis en medio Schneider. En ningún caso se infectó la pata posterior derecha de los cricetos ni ninguna de las patas anteriores. En ningún caso se administró tratamiento en la pata posterior derecha de los cricetos ni en ninguna de las patas anteriores.
El día 37 postinfección (p.i.) se inició el tratamiento tópico con la formulación en pomada de la invención, mediante aplicación con espátula sobre la almohadilla plantar de la pata posterior izquierda e inmovilización durante 2 horas. Tras esta primera aplicación, se repitió el tratamiento cada 24 horas durante los 4 días siguientes completando un tratamiento de 5 días en total. Durante los días de tratamiento con la formulación en pomada de la invención, días 37 al 41 , la pata que recibió el tratamiento se mantuvo vendada y por ese motivo no se disponen datos durante ese intervalo de días.
El tamaño de la inflamación, característica de la infección por L. amazonensis, se determinó semanalmente por la medida del diámetro de las patas posteriores izquierdas infectadas y derechas no infectadas, con ayuda de un calibrador (Vernier Caliper), hasta la finalización del experimento en el día 58 p.i. (ver tabla 11).
FORMULACIÓN EN POMADA DE LA
GRUPO CONTROL INVENCIÓN
Pata izquierda Pata derecha ni Pata izquierda Pata derecha ni infectada no infectada ni infectada y infectada ni
Día
tratada tratada tratada tratada
D (mm) ±DS D (mm) ±DS D (mm) ±DS D (mm) ±DS
0 4,42 ±0,44 3,72 ±0,18 3,58 ±0,53 3,34 ±0,21
6 3,34 ±0,27 3,34 ±0,36 3,50 ±0,23 3,38 ±0,15
13 3,82 ±0,35 3,12 ±0,16 3,60 ±0,23 3,34 ±0,09
20 5,76 ±0,23 3,64 ±0,18 4,70 ±0,86 3,32 ±0,60
28 6,04 ±0,75 3,30 ±0,21 5,88 ±0,19 3,38 ±0,19
34 7,06 ±0,86 3,32 ±0,26 6,62 ±0,53 3,60 ±0,20
40 7,90 ± 1,10 3,60 ±0,41 ND ND ND ND
48 7,70 ±0,89 3,44 ±0,25 6,80 ±0,49 3,48 ±0,15
51 7,56 ±0,57 3,42 ±0,28 7,13 ±0,49 3,65 ±0,45
58 8,70 ± 1,16 3,52 ±0,24 6,98 ±0,41 3,40 ±0,08
Tabla 11. Evolución de la inflamación en la almohadilla plantar de la pata posterior izquierda de criceto dorado por infección con L. amazonensis en relación a la pata posterior derecha, ni infectada ni tratada. Clave: D: diámetro, DS: desviación estándar, ND: No Determinado.
Los resultados recogidos en la Tabla 11 y en la Figura 5 muestran una clara tendencia hacia la reducción de la intensidad de la inflamación inducida por la infección después de la aplicación del tratamiento con la formulación en pomada de la invención durante 5 días (área recuadrada en figura 5), pasados los cuales y suspendido el tratamiento, el tamaño de la lesión tiende a estabilizarse. Ejemplo 5. Análisis de la estabilidad química de las formulaciones de la invención (gel y colirio) en comparación con Fungizona®
Se empleó un método desarrollado para el análisis de anfotericina B en muestras biológicas (Espada R, Josa JM, Valdespina S, Dea MA, Ballesteros MP, Alunda JM and Torrado JJ. HPLC assay for determination of amphotericin B in biological samples. Biomedical Chromatography. 2008: 22 (4): 402-407), descartándose previamente cualquier posible interferencia por parte de los componentes de la formulación a través del análisis de los correspondientes placebos (formulaciones que contienen todos los excipientes pero sin anfotericina B). En la tabla 12 se muestran las buenas características de estabilidad de la formulación en gel de la invención. Dicha estabilidad se deduce de la escasa variación en el tiempo del valor de la concentración de anfotericina B. La formulación a evaluar (formulación en gel de la invención) se conservó a temperatura ambiente y protegida de la luz y, además de la determinación de la concentración de anfotericina B por cromatografía líquida, se midió el pH y se hizo un barrido en el espectrofotómetro para evaluar si mantenía el estado de agregación monomérico. En ninguno de los tres análisis se produjeron variaciones notables, es decir, no se apreciaron cambios significativos en la concentración de anfotericina, la formulación mantuvo su valor de pH entre 5,0 y 5,5 y no se observaron variaciones en el estado de agregación.
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Tabla 12. Concentración de anfotericina B en la formulación en gel de la invención determinada por cromatografía líquida. Se estudió también la estabilidad química de la formulación menos viscosa (colirio) de la invención y se comparó con la formulación comercial convencional de la anfotericina B (anfotericina B desoxicolato, análogo de Fungizona ).
Se prepararon dos formulaciones, en forma de colirio, del complejo anfotericina -γ- ciclodextrina. En la primera de las formulaciones se utilizó una solución fisiológica de cloruro de sodio como solvente, con la finalidad de proporcionar a la preparación la isotonicidad adecuada. En esta formulación se evaluaron el pH, el tamaño de partícula, el contenido de anfotericina B, la configuración monomérica, la esterilidad y la sensibilidad utilizando C. albicans como microorganismo de referencia. Los resultados se presentan en la tabla 13. En ella pueden observarse las diferencias entre los valores obtenidos con la formulación conservada en refrigeración frente a la conservada a temperatura ambiente.
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Tabla 13. Resultados obtenidos con la formulación en colirio de la invención con solución salina durante los 30 días evaluados con muestras a temperatura ambiente y en refrigeración. La segunda formulación de colirio se preparó utilizando una solución de glucosa al 5% p/v como solvente. Los ensayos realizados fueron los mismos que los que se llevaron a cabo sobre la primera formulación. Los resultados obtenidos se presentan en la tabla 14. En ella pueden observarse las diferencias entre los valores obtenidos con la formulación conservada en refrigeración frente a la conservada a temperatura ambiente.
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Tabla 14. Resultados obtenidos con la formulación en colirio de la invención con solución glucosa al 5% p/v durante los 30 días evaluados con muestras a temperatura ambiente y en refrigeración.
De la comparación de resultados de las tablas 13 y 14 podemos deducir que el medio en el que se disperse la anfotericina B (suero salino o glucosado) tiene un efecto crítico en la estabilidad química, siendo ésta mayor en medio salino. Por otra parte, por los datos de tamaño de partícula se observa que en ambos medios existe una tendencia a la formación de agregados y/o precipitados.
Se preparó también una formulación de anfotericina B desoxicolato en forma de colirio, a fin de hacer el estudio comparativo respecto a las dos formulaciones anteriores. A pesar de obtener mejores resultados de estabilidad química con la formulación de anfotericina B disuelta en suero salino, se optó por la dilución de anfotericina B en suero glucosado para evitar la formación de precipitados (Martindale, Guía completa de consulta farmacoterapéutica, SC. Sweetman (director). Pharma Editores S.L. 2003). Los ensayos realizados fueron los mismos que se llevaron a cabo sobre las dos formulaciones anteriores.
Para la formulación de anfotericina B desoxicolato en forma de colirio preparada en medio glucosado, se obtuvieron los resultados que se presentan en la tabla 15. Los datos de la tabla 15 muestran la inestabilidad de la formulación (en comparación con los datos de la tabla 14), evidenciada por el cambio en el pH, por la formación claramente visible de agregados que aumentaron notablemente el tamaño de partícula, y por el descenso en el porcentaje de anfotericina B.
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Tabla 15. Resultados obtenidos con la formulación en colirio de anfotericina B desoxicolato con solución glucosa al 5% p/v durante los 30 días evaluados con muestras a temperatura ambiente y en refrigeración. Los resultados indican que la formulación en colirio de la invención que contiene al complejo anfotericina B-y-ciclodextrina reconstituido en suero glucosado, mantiene sus propiedades químicas (contenido en anfotericina B) de una forma significativamente mejor (t-Student, P<0,01) que la formulación en colirio de anfotericina B desoxicolato. Especialmente importante es la diferencia en tamaño de partícula entre las dos formulaciones anteriores, existiendo una mayor agregación en la formulación comercial. Este hecho se intensifica al almacenar el producto a menor temperatura (nevera). La mayor inestabilidad de la formulación comercial se refleja también a través de los cambios en pH. Se puede concluir que las nuevas formulaciones de anfotericina B reivindicadas en la presente invención presentan unas características de estabilidad química superiores a las de la formulación de anfotericina B comercial de referencia (anfotericina B desoxicolato, análogo de Fungizona®).
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra el diagrama de solubilidad de anfotericina B en presencia de y- ciclodextrina a 25°C. (Nota: el peso molecular de la anfotericina B es 924,1 g/mol y el de la y-ciclodextrina es 1297 g/mol). Dicho diagrama representa la concentración (mM) de anfotericina B frente a la concentración (raM) de y-ciclodextrina en el límite de solubilidad de la anfotericina B a 25°C. Como se observa en la figura, la función solubilidad se puede ajustar a la ecuación de una recta de expresión: y = 0,0161 x - 0,1876. La bondad del ajuste de una recta de regresión se mide con R2 y en este caso concreto R2 = 0,9964.
La Figura 2 representa los espectros de absorción infrarroja (IR) de la molécula de anfotericina B, la molécula ^-ciclodextrina, la mezcla física anfotericina B-y- ciclodextrina (AMB-GCD) y el liofilizado de una disolución de anfotericina B-y- ciclodextrina en una relación molar 1 :70 y sin filtrar. En dichos espectros de absorción infrarroja se representa el porcentaje de transmitancia (% T) frente a la longitud de onda a la cual se produce absorción en la región de IR (cm"1). La Figura 3 muestra un diagrama de barras comparativo de la inhibición (representada mediante los diámetros (medidos en mm) de los halos de inhibición obtenidos) a la que da lugar la formulación en gel de la invención (10 μg de anfotericina B, barra izquierda) sobre distintas cepas de hongos (cepas mostradas en el eje X) en comparación con la inhibición producida por discos patrón de anfotericina B Neo- Sensitabs® en MHA (discos con 10 μg de anfotericina B, barra derecha). El fabricante de los discos patrón de anfotericina B Neo-Sensitabs® señala los siguientes parámetros para determinar la sensibilidad de un microorganismo frente a anfotericina B (AMB): Resistente (R), si el halo de inhibición es menor de 10 mm. Intermedio (I), si la medida está entre 10 y 14 mm y Sensible (S), si la medida es mayor o igual de 15 mm.
En la Figura 4 se representa el dispositivo que se usó para realizar el ensayo de penetración de anfotericina B en biopelículas de hongos (ejemplo 3.4). La capa A corresponde a una placa con agar YNB-Galactosa a la que se adicionó anfotericina B en las dos formas (anfotericina B disuelta en DMSO y la formulación en gel de la invención). La capa B representa una membrana de 0,22 μηι de diámetro de poro y 47 mm de diámetro con o sin biopelícula de Candida albicans. La capa C simboliza una membrana de 0,22 μιη de diámetro de poro y 25 mm de diámetro que sirve de separación por contacto directo. La capa D se refiere a discos para ensayo de 6 mm de diámetro impregnados con 20 μΐ de PBS.
En la Figura 5 se muestran tres gráficas. En la gráfica superior se observa la evolución en el tiempo (medido en días) del diámetro (mm) de la almohadilla plantar de las patas posteriores derecha e izquierda de los cricetos infectados, antes y después del tratamiento con la formulación en pomada de la invención. La serie representada mediante una doble línea fina continua corresponde a la evolución de la pata posterior izquierda (infectada pero sin tratamiento) de los cricetos que no recibieron tratamiento. La serie representada mediante una línea gruesa continua corresponde a la evolución de la pata posterior izquierda (infectada y con tratamiento) de los cricetos que recibieron tratamiento. La serie representada mediante una línea discontinua de rayas corresponde a la evolución de la pata posterior derecha (no infectada y sin tratamiento) de los cricetos que no recibieron tratamiento en su pata posterior izquierda. La serie representada mediante una línea discontinua de puntos corresponde a la evolución de la pata posterior derecha (no infectada y sin tratamiento) de los cricetos que recibieron tratamiento en su pata posterior izquierda con la formulación en pomada de la invención.
Las dos fotografías inferiores muestran el detalle de la almohadilla plantar de la pata posterior izquierda de un animal testigo sin tratar (izquierda) y de un animal después del tratamiento (derecha). El tratamiento se hizo desde el día 37 al 41.

Claims

REIVINDICACIONES
1. - Formulación farmacéutica tópica que comprende un complejo anfotericina B-y- ciclodextrina y un excipiente tópico farmacéuticamente aceptable en la que la relación molar anfotericina B:y-ciclodextrina en dicha formulación está dentro del intervalo entre 1 :50 y 1 :200 y presentando la anfotericina B un estado de agregación monomérico en dicha formulación.
2. - Formulación farmacéutica según la reivindicación 1 en la que la relación molar entre la anfotericina B y la y-ciclodextrina en dicha formulación es de 1 : 100.
3. - Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que dicha formulación tiene forma de gel y comprende como excipiente tópico un excipiente adecuado para la preparación de geles.
4. - Formulación farmacéutica según la reivindicación 3 en la que el excipiente adecuado para la preparación de geles se selecciona entre derivados de celulosa, derivados de guar, polímeros vinílicos, polímeros carboxivinílicos, polímeros acrílicos, polímeros naturales, y/o combinaciones de los mismos.
5. - Formulación farmacéutica según la reivindicación 4 en la que el excipiente adecuado para la preparación de geles se selecciona entre metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa y copolímeros reticulados de acrilato de alquilo C^o ·
6.- Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en la que dicha formulación tiene forma de crema y comprende como excipiente tópico un excipiente adecuado para la preparación de cremas.
7. - Formulación farmacéutica según la reivindicación 6 en la que el excipiente adecuado para la preparación de cremas se selecciona entre siliconas, derivados de siliconas, bases emulgentes aceite/agua (O/ A) de tipo no iónico, y/o combinaciones de los mismos.
8. - Formulación farmacéutica según la reivindicación 7 en la que el excipiente adecuado para la preparación de cremas se selecciona entre ciclometicona y dimeticona.
9. - Formulación farmacéutica según las reivindicaciones 1-2 en la que dicha formulación tiene forma de pomada y comprende como excipiente tópico un excipiente adecuado para la preparación de pomadas.
10. - Formulación farmacéutica según la reivindicación 9 en la que el excipiente adecuado para la preparación de pomadas se selecciona entre un excipiente adhesivo oral, parafina, derivados de parafina, bases agua/aceite (A/O), cremas agua/aceite (A/O), y/o combinaciones de los mismos.
1 1. - Formulación farmacéutica según la reivindicación 10 en la que el excipiente adecuado para la preparación de pomadas es una mezcla comprendida por carboximetilcelulosa sódica, pectina y gelatina, en una base de polietileno y aceite mineral.
12. - Formulación farmacéutica según las reivindicaciones 1-2 en la que dicha formulación tiene forma de colirio y comprende el complejo de anfotericina B-y- ciclodextrina disuelto en suero salino o glucosado.
13. - Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en el tratamiento de infecciones fúngicas y/o parasitarias en seres humanos y/o animales.
14. - Formulación farmacéutica según la reivindicación 13 en la que las infecciones fúngicas comprenden micosis superficiales, cutáneas y mucocutáneas.
15.- Formulación farmacéutica según la reivindicación 13 en la que las infecciones parasitarias comprenden leishmaniosis cutánea.
16.- Método para preparar la formulación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende:
Etapa (a): preparar una disolución en medio acuoso de y-ciclodextrina y ajustar el pH a un valor entre 1 1,5 y 14,
Etapa (b): añadir anfotericina B a la disolución de la etapa (a) en una relación molar antotericina B:/-ciclodextrina entre 1 :50 y 1 :200 y agitar constantemente hasta su completa disolución,
Etapa (c): ajustar el pH de la mezcla de la etapa (b) a un valor entre 4 y 8,
Etapa (d): añadir un excipiente tópico farmacéuticamente aceptable a la solución del complejo anfotericina B-y-ciclodextrina de la etapa (c).
17.- Método según la reivindicación 16 en el que en la etapa (a) el pH de la disolución en medio acuoso de y-ciclodextrina se ajusta a un valor de 12.
18. - Método según las reivindicaciones 16-17 en el que en la etapa (b) la relación molar antotericina B: -ciclodextrina es de 1 : 100.
19. - Método según las reivindicaciones 16-18 en el que en la etapa (c) el pH de la mezcla antotericina B:/-ciclodextrina se ajusta a un valor de 5,5.
20. - Método según las reivindicaciones 16-19 en el que el excipiente tópico de la etapa (d) es un excipiente adecuado para la preparación de geles, y en el que se añaden las siguientes etapas a continuación de la etapa (d):
Etapa (e): agitar suavemente,
Etapa (f): dejar en reposo durante un tiempo comprendido entre un minuto y tres días; donde la formulación farmacéutica que se prepara está en forma de gel.
21. - Método según la reivindicación 20 en el que el tiempo que hay que dejar en reposo la mezcla en la etapa (f) es de 24 horas.
22. - Método según las reivindicaciones 20-21 en el que el excipiente adecuado para la preparación de geles se selecciona entre derivados de celulosa, derivados de guar, polímeros vinílicos, polímeros carboxivinílicos, polímeros acrílicos, polímeros naturales, y/o combinaciones de los mismos.
23. - Método según la reivindicación 22 en el que el excipiente adecuado para la preparación de geles se selecciona entre metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa y copolímeros reticulados de acrilato de alquilo C 10-30· 24.- Método según las reivindicaciones 16-19 en el que el excipiente tópico de la etapa (d) es un excipiente adecuado para la preparación de cremas, y en el que se añade la siguiente etapa a continuación de la etapa (d):
Etapa (e): agitar durante un tiempo comprendido entre un minuto y una hora;
donde la formulación farmacéutica que se prepara está en forma de crema.
25.- Método según la reivindicación 24 en el que el excipiente adecuado para la preparación de cremas se selecciona entre siliconas, derivados de siliconas, bases emulgentes O/A de tipo no iónico, y/o combinaciones de los mismos.
26.- Método según la reivindicación 25 en el que el excipiente adecuado para la preparación de cremas se selecciona entre ciclometicona y dimeticona.
27.- Método según las reivindicaciones 16-19 en el que el excipiente tópico de la etapa (d) es un excipiente adecuado para la preparación de pomadas, y en el que se añaden las siguientes etapas a continuación de la etapa (c) y antes de la etapa (d): Etapa (el): liofilizar el complejo anfotericina B-y-ciclodextrina de la etapa (c), Etapa (c2): pulverizar el liofílizado de la etapa (el);
donde la formulación farmacéutica que se prepara está en forma de pomada.
28.- Método según la reivindicación 27 en el que el excipiente adecuado para la preparación de pomadas se selecciona entre un excipiente adhesivo oral, parafina, derivados de parafina, bases A/O, cremas A/O, y/o combinaciones de los mismos.
29. - Método según la reivindicación 28 en el que el excipiente adecuado para la preparación de pomadas es una mezcla comprendida por carboximetilcelulosa sódica, pectina y gelatina, en una base de polietileno y aceite mineral.
30. - Método según las reivindicaciones 16-19 en el que se reemplazan las anteriores etapas (a) y (c) por las siguientes nuevas etapas (a') y (c'), respectivamente, añadiéndose además una nueva etapa (c' l) a continuación de la nueva etapa (c'), y omitiéndose adicionalmente la etapa (d):
Etapa (a'): preparar una disolución de -ciclodextrina en suero salino o en suero glucosado y ajustar el pH de dicha disolución hasta un valor entre 11,5 y 14,0, Etapa (c'): ajustar el pH de la mezcla de la etapa (b) a un valor entre 7,2 y 7,6, Etapa (c' l): llevar a cabo una filtración esterilizante;
donde la formulación farmacéutica que se prepara está en forma de colirio.
31.- Método según la reivindicación 30 en el que en la etapa (c') el pH de la mezcla preparada en la etapa (b) se ajusta a un valor de 7,4.
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