WO2012033334A2 - 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법 - Google Patents

부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a recombinant microorganism having improved butanol producing ability and a method for preparing butanol using the same, and more particularly, 2-ketoisovalerate by introducing 2-ketoisovalerate, a precursor of L-valine, as an intermediate, and introducing the VorABC gene.
  • the present invention relates to a recombinant microorganism having improved butanol producing ability which can be converted to one-step by isobutyryl-CoA and a method for producing butanol using the same.
  • biobutanol has the characteristics of being suitable as a fuel such as energy density, volatility control, sufficient octane number, and low impurities, and is more energy efficient than ethanol, better mixed with gasoline, and can use existing oil pipes or automobile engines as it is It has Therefore, if the most suitable butanol as a substitute fuel is mass-produced using microorganisms, it can bring about the import effect of crude oil import and the environmental effect of reducing greenhouse gas emissions.
  • Butanol can be produced biologically by anaerobic Acetone-Butanol-Ethanol (ABE) fermentation of Clostridial strains (Jones, DT and Woods, DR, Microbiol. Rev. , 50: 484, 1986; Rogers, P., Adv. Appl.Microbiol. , 31: 1,1986; Lesnik, EA et al., Necleic Acids Research , 29: 3583,2001), and this method has been a major source of butanol and acetone for over 40 years until the 1950s. Clostridial strains are difficult to further strain because they are difficult to grow and lack complete molecular biological tools and omics technology.
  • ABE Acetone-Butanol-Ethanol
  • butanol production pathway in Clostridium acetobutylicum is shown in Figure 1 (Lee, SY et al., Biotechnology and Bioengineering 101: 209,2008). Butanol production was attempted by introducing the pathway into Escherichia coli, including some enzymes ( The activity of crotonase, ⁇ -hydroxybutyryl-coenzyme A dehydrogenase, butyryl-CoA dehydrogenase is very low or very low (Boynton, ZL et al., J. Biotechnol ., 178: 3015-3024,1996) and the reaction is as effective as that of Clostridiumacetobutylicum . It is hard to catalyze.
  • the gene new configuration coding for the enzyme to convert the 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA in microorganisms having a producing ability of a 2-ketoisovalerate of L- valine precursor metabolism circuit for converting 2-ketoisovalerate to butanol bkdAB- Recombinant microorganisms with butanol production were produced by introducing lpdV , but three genes involved in the conversion of 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA, bkdA1, bkdB and lpdV , were involved in complex interactions. There was a disadvantage of difficulty.
  • the present inventors have made diligent efforts to increase the efficiency of converting 2-ketoisovalerate to butanol by simplifying the process of converting 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA.
  • VorA, VorB and VorC three genes areobutyryl-
  • the present invention was completed to confirm that it is involved in the conversion to CoA and to produce a recombinant microorganism incorporating the same, and to confirm that the recombinant microorganism has higher butanol performance than conventional recombinant microorganisms.
  • Another object of the present invention to provide a method for producing butanol using the recombinant microorganism.
  • Still another object of the present invention is to provide a recombinant microorganism having isobutyryl-CoA generating ability in 2-ketoisovalerate into which the VorABC gene is introduced and a method for producing isobutyryl-CoA in 2-ketoisovalerate using the same.
  • the present invention is VorA (2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), an enzyme for converting 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA in a microorganism having the ability to produce 2-ketoisovalerate, a precursor of L-valine, Butyryl-CoA, a gene encoding the VorABC enzyme, consisting of VorB (2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) and VorC (2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit), which encodes an enzyme that converts isobutyryl-CoA to butyryl-CoA It provides a method for producing a recombinant microorganism having a butanol generating ability, characterized by introducing a gene encoding an enzyme for converting butyraldehyde and a gene encoding an enzyme for converting butyraldehyde
  • the present invention also relates to a microorganism prepared by the above-described method, VorA (2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), which is an enzyme for converting 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA in a microorganism having the ability to produce 2-ketoisovalerate, a precursor of L-valine , Butyryl-CoA, a gene encoding the VorABC enzyme, consisting of VorB (2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) and VorC (2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit), an enzyme that converts isobutyryl-CoA to butyryl-CoA It provides a recombinant microorganism having a butanol generating ability, characterized in that the gene encoding the enzyme for converting to butyraldehyde and the gene encoding the enzyme for converting butyral
  • the present invention also relates to a microorganism having the ability to produce 2-ketoisovalerate, a precursor of L-valine, VorA (2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB (2-oxoisovalerate), an enzyme that converts 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA.
  • VorABC a gene encoding the VorABC enzyme consisting of ferredoxin oxidoreductase) and VorC (2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit), a gene encoding an enzyme that converts isobutyryl-CoA to butyryl-CoA, an enzyme that converts butyryl-CoA to butyraldehyde
  • a gene encoding a gene and a gene encoding an enzyme for converting butyraldehyde to butanol are introduced, a gene encoding an enzyme involved in L-isoleucine biosynthesis, a gene encoding an enzyme involved in L-leucine biosynthesis, D- Attenuated or deleted genes encoding enzymes involved in pantothenic acid biosynthesis and genes encoding enzymes involved in L-valine biosynthesis It provides a recombinant microorganism having a butanol generating ability characterized in that.
  • the gene encoding the enzyme involved in L-isoleucine biosynthesis is ilvA (gene encoding threonine dehydratase), the gene encoding the enzyme involved in L-leucine biosynthesis is leuA (2-isopropylmalate gene encoding the synthase), and the gene encoding the enzyme involved in D-pantothenic acid biosynthesis is panB (the gene encoding 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase), and encodes the enzyme involved in the L-valine biosynthesis.
  • the microorganism having the ability to produce 2-ketoisovalerate includes (a) a deletion of lacI (gene encoding lacoperonrepressor) gene; (b) eliminating feedback inhibition of the ilvH (acetohydroxyacidsynthaseisozymeIII) gene; (c) substituting a strong promoter for the native promoter, including the attenuator of ilvGMEDA (acetohydroxyacid synthaseisozymeI) and ilvBN (Acetohydroxy acid synthase isozyme II) operon; And (d) it may be characterized in that it is further mutated by a method selected from the group consisting of the introduction of the expression vector containing a strong promoter.
  • the present invention also provides a method for producing butanol, comprising culturing the recombinant microorganism prepared above to produce butanol, and recovering butanol from the culture.
  • the present invention also relates to a microorganism having the ability to produce 2-ketoisovalerate, a precursor of L-valine, VorA (2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB (2-oxoisovalerate) Recombinant microorganisms having isobutyryl-CoA-producing ability in 2-ketoisovalerate, wherein a gene encoding VorABC enzyme ( VorABC ) consisting of ferredoxin oxidoreductase) and VorC (2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit) is introduced.
  • VorABC VorABC enzyme
  • the present invention provides a method for producing isobutyryl-CoA from 2-ketoisovalerate, in which isobutyryl-CoA is produced by culturing microorganisms, and then isobutyryl-CoA is recovered from the culture.
  • the present invention is an enzyme for converting 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA, VorA (2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB (2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) and VorC (2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)
  • a method for converting 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA using a constituent VorABC enzyme or a recombinant microorganism expressing the enzyme are constituent VorABC enzyme or a recombinant microorganism expressing the enzyme.
  • Figure 1 shows the butanol production pathway of C. acetobutylicum ATCC 824 strain.
  • Figure 2 shows a metabolic circuit for biosynthesis of butanol from 2-ketoisovalerate in microorganisms having the ability to produce 2-ketoisovalerate, a precursor of L-valine.
  • Figure 3 shows the construction of the sacB homologous recombination pSacHR06 vector.
  • Figure 4 shows the construction of the pKBRilvBNCD-ptac-adhEbdhAB vector.
  • FIG. 5 shows the process of 2-ketoisovalerate is converted to isobutyryl-CoA.
  • a new metabolic circuit for converting 2-ketoisovalerate to butanol is introduced by introducing VorABC , a gene encoding an enzyme for converting 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA, into a microorganism having the ability to produce 2-ketoisovalerate, a precursor of L-valine.
  • VorABC a gene encoding an enzyme for converting 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA
  • the VorABC gene encoding an enzyme for converting 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA and the enzyme encoding isobutyryl-CoA to butyryl-CoA in microorganisms capable of producing 2-ketoisovalerate, a precursor of L-valine.
  • the introduction of a gene encoding an enzyme that converts butyryl-CoA to butyraldehyde and a gene that encodes an enzyme that converts butyraldehyde to butanol predict that butanol will be produced from 2-ketoisovalerate, in particular by the VorABC gene.
  • the conversion of ketoisovalerate to isobutyryl-CoA in one step was also predicted to increase butanol production capacity.
  • Microorganisms having the ability to produce 2-ketoisovalerate may use bacteria, yeasts, molds, and the like, preferably Corynebacterium genus, Brevibacterium genus and Escherichia coli, etc. 2 There is no limit as long as you have the ability to generate -ketoisovalerate
  • microorganisms having the ability to produce 2-ketoisovalerate may use mutant microorganisms (Val) (Korean Patent No. 832,740) having high L-valine performance, or further increase the accumulation rate of 2-ketoisovalerate.
  • mutant microorganisms (Val) having a high performance in the L-valine was intended to use a mutant microorganism that weakened or deleted the gene encoding the enzyme involved in L-valine biosynthesis.
  • the term "attenuation” refers to a concept encompassing a mutation, substitution or deletion of some bases of a gene or introduction of some bases to reduce the activity of an enzyme expressed by the gene of interest. It includes everything that blocks some or much of the biosynthetic pathway.
  • amplification means that some bases of the gene are mutated, substituted or deleted, introduced into some bases, or introduced into a gene from another microorganism encoding the same enzyme to increase the activity of the corresponding enzyme. It is a concept that encompasses letting.
  • Figure 2 shows a metabolic circuit for biosynthesis of butanol from 2-ketoisovalerate in microorganisms having the ability to produce 2-ketoisovalerate, a precursor of L-valine.
  • VorA (2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit)
  • VorB which converts 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA
  • VorB (2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase)
  • a gene encoding a VorABC enzyme consisting of VorC (2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)
  • a gene encoding an enzyme converting isobutyryl-CoA to butyryl-CoA, and an enzyme converting butyryl-CoA to butyraldehyde Genes encoding genes and enzymes converting butyraldehyde to butanol were introduced.
  • the enzyme for converting isobutyryl-CoA to butyryl-CoA is isobutyryl-CoA mutase
  • the enzyme for converting butyryl-CoA to butyraldehyde is butyraldehyde dehydrogenase
  • the enzyme for converting butyraldehyde to butanol is butanol dehydrogenase It can be characterized by.
  • the gene encoding the enzyme for converting 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA may be characterized as VorABC (SEQ ID NO: 46) derived from Methanosarcina acetivorans , that is, encoding 2-ketoisovalerate ferredoxin reductase gene is VorB of Methanosarcina acetivorans derived from the gene coding for 2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase may be characterized in that the Methanosarcina acetivorans VorA and VorC derived.
  • VorABC SEQ ID NO: 46
  • the gene encoding the enzyme for converting the isobutyryl-CoA to butyryl-CoA may be characterized as icmAB derived from Streptomyces avermitilis , but limited insofar as it is expressed in a host cell to be introduced from other microorganisms to exhibit the same enzyme activity There will be no.
  • the gene encoding the enzyme for converting the butyryl-CoA to butyraldehyde may be characterized as adhE derived from Clostridium acetobutylicum
  • the gene encoding the enzyme for converting the butyraldehyde to butanol may be bdhAB derived from Clostridium acetobutylicum
  • even if derived from other microorganisms will not be limited as long as they express the same enzyme activity expressed in the host cell to be introduced.
  • microorganisms having the ability to produce 2-ketoisovalerate, the precursor of L-valine of the present invention in order to improve the accumulation rate of 2-ketoisovalerate, it is preferable to use a mutated microorganism. Specifically, mutations are made so that expression of a gene encoding an enzyme involved in 2-ketoisovalerate biosynthesis is increased, a gene encoding an enzyme involved in L-isoleucine biosynthesis, a gene encoding an enzyme involved in L-leucine biosynthesis, Preference is given to using microorganisms which have attenuated or deleted genes encoding enzymes involved in D-pantothenic acid biosynthesis and genes encoding enzymes involved in L-valine biosynthesis.
  • the gene encoding the enzyme involved in L-isoleucine biosynthesis is ilvA (gene encoding threonine dehydratase), the gene encoding the enzyme involved in L-leucine biosynthesis is leuA (2-isopropylmalate gene encoding the synthase), and the gene encoding the enzyme involved in D-pantothenic acid biosynthesis is panB (the gene encoding 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase), and encodes the enzyme involved in the L-valine biosynthesis.
  • the strong promoter may be selected from the group consisting of trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter and trp promoter, the expression vector comprising the strong promoter is ilvB, ilvN, ilvC and It may be characterized in that the vector containing the ilvD gene.
  • a mutant microorganism having an excellent accumulation rate of 2-ketoisovalerate is produced, and then a gene encoding an enzyme involved in preparing butanol from 2-ketoisovalerate is prepared. It was introduced to produce a recombinant microorganism having a butanol generating ability.
  • lacI After the gene is removed, has been feedback inhibition of ilvH is removed, making the E. coli W3110 competent cells replacement of the intact promoter including the attenuator of the ilvGMEDA and ilvBN operon with tac promoter having a strong transcription activity, i lvA
  • a mutant microorganism having an excellent accumulation rate of 2-ketoisovalerate was produced.
  • branched chain ketoacid dehydrogenase from Pseudomonas putida KT2440 (E1 subunit: the dehydrogenase-decarboxylase, E2 subunit: the transacylase, E3: complex of lipoamide dehydrogenase) and Bacillus subtilis , respectively, encoded by the genes bkdA , bkdB , lpdV
  • E1 subunit the dehydrogenase-decarboxylase
  • E2 subunit the transacylase
  • E3 complex of lipoamide dehydrogenase
  • Bacillus subtilis respectively, encoded by the genes bkdA , bkdB , lpdV
  • the process of branched chain ketoacid dehydrogenase (a complex of subunits encoded by the bkdA1 , bkdA2, bkdB and lpdV genes) involved in valine catabolism and converting 2-ket
  • Vor of Methanosarcina acetivorans originated to help A VorABC enzyme consisting of A (2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit, SEQ ID NO: 43), VorB (2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase, SEQ ID NO: 44), and VorC (2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit, SEQ ID NO: 45) Genes encoding were cloned.
  • isobutyryl-CoA mutase (icmA , a complex of proteins encoded by the icmB gene) from Streptomyces avermitilis converts isobutyryl-CoA to butyryl-CoA (Zerbe-Burkhardt, K., et al ., J. Biol . Chem, 273:.
  • butyryl-CoA from 2-ketoisovalerate and then cloning the gene, derived Clostridiumacetobutylicum the adhE (coding for butyraldehyde dehydrogenase gene) and bdhAB (Clostridiumacetobutylicum the butanol dehydrogenase, based on Finally, butanol was synthesized from butyryl-CoA.
  • the conversion of 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA by the bkdA , bkdB , and lpdV genes is performed after the enzyme encoded by the bkdA1 gene converts 2-ketoisovalerate to 2-methy-1-hydroxypropyl-Thpp 2-methyl propanoyl) -dihydrilpoamide-E the following, by the enzyme encoded by the gene bkdB 2- (2-methyl propanoyl) -dihydrilpoamide -E switches to the switches to isobutyryl CoA, also an enzyme encoded by the gene lpdV In relation to the fictitious process, it was confirmed that the whole complex interaction, while the VorABC gene is introduced, 2-ketoisovalerate is directly converted to isobutyryl-CoA (Fig. 5).
  • IlvB (genes encoding acetoxyhydroxy synthase I large subunit), ilvN (genes encoding acettohydroxyacidsynthaseIsmallsubunit ), ilvC (genes encoding acettohydroxyacidisomeroreductase), and ilvD (dihydroxy-acid dehydratase), which are essential genes for 2-ketoisovalerate accumulation
  • Gene encoding the enzyme encoding the enzyme converting 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA the gene encoding the enzyme converting isobutyryl-CoA to butyryl-CoA, butyrryl-CoA butyraldehyde in the pKKilvBNCD vector cloned sequentially
  • a recombinant microorganism having a butanol producing ability was prepared by preparing a vector containing a gene encoding an enzyme for converting the enzyme and a gene encoding an enzyme
  • a gene ( VorABC ), isobutyryl-CoA, butyryl-CoA, which encodes an enzyme for converting 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA, is converted into a microorganism having the ability to produce 2-ketoisovalerate, a precursor of L-valine.
  • icmAB encoding an enzyme that, by introduction of a gene (bdhAB) to the gene (adhE) and butyraldehyde encoding an enzyme that converts butyryl-CoA to butyraldehyde encoding an enzyme which converts into butanol to produce a recombinant microorganism, It was confirmed that butanol generating ability in the recombinant microorganism is significantly increased.
  • VorABC since the VorABC enzyme is converted from 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA, a gene ( VorABC ) encoding an enzyme encoding 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA is converted to a microorganism having the ability to produce 2-ketoisovalerate.
  • the recombinant microorganism may be introduced to produce a isobutyryl-CoA by culturing the recombinant microorganism, and the use of the recombinant microorganism may convert 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA with high efficiency even under anaerobic conditions.
  • E. coli W3110 was used as the host microorganism, but other E. coli, bacteria, yeast and fungi were used to enhance the L-valine production ability and to introduce the genes of enzymes involved in the biosynthesis of butanol from 2-ketoisovalerate. It is also apparent to those skilled in the art to prepare butanol using the same.
  • PSacHR06 vector was constructed for the purpose of using sacB homologous recombination technique (Wohlleben et. Al., J. Bacteriol. , 174: 5462,1992) from Bacillus sutless for the substitution of specific bases or bases of chromosomal DNA (FIG. 3). ).
  • Figure 3 shows the manufacturing process of Figure sacB homologous recombination pSacHR06.
  • the 1522 bp fragment obtained by cleaving the pUC19 vector with Nde I and Ahd I was used to replace the pUC19 (New England Biolab) vector with ampicillin resistance to kanamycin. New England Biolabs) was subjected to DNA condensation reaction with 1340bp fragment obtained by cutting with StuI to obtain pUC19KM vector.
  • the pUC19KKS vector was obtained by condensation of the 2.5kb fragment obtained by cleaving the pUC19KM vector with Pvu II and the 400bp fragment obtained by cleaving the pBlu2KSP (full name: pBluescriptIIKS (+)) vector with Pvu II. Then, PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 1 and 2 and the pUC19 vector template to enable easy removal of the origin of DNA replication into the vector. DNA fragments having origins of replication were obtained. The fragment was digested with Sal I and Dra III, and the pUC19K vector was obtained by DNA condensation reaction with the 1.5kb fragment obtained by digesting the pUC19KKS vector with Sal I and Dra III.
  • a DNA fragment having a sacB gene was synthesized by PCR using a genomic DNA template of Bacillus sutless and primers of SEQ ID NOs: 3 and 4. Both the synthesized DNA fragment and the pUC19K vector were cleaved and condensed with XbaI, SpeI and EcoRV enzymes to produce a new vector with the sacB gene, which was named pSacHR06.
  • the pSacHR06 vector has a sacB gene derived from Bacillus circus and can be used for sacB positive selection because restriction enzymes can be used to easily remove and reconstruct DNA replication origin.
  • lacI_1stup 5'-gtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccgg tgtctcttagattgcagcattacacgtcttg-3 '
  • lacI_1stdo 5'-tcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctg cattaatgcacttaacggctgacatggg-3 '
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 7 and 8, 9 and 10, and E. coli W3110 genomic DNA template, respectively, and then the obtained two PCR fragments were mixed at the same concentration to form a template.
  • the 1280 bp PCR fragment obtained by the above method was digested with Pst I and Sal I enzymes, inserted into pSacHR06, a vector for sacB homologous recombination, also digested with Pst I and Sal I enzymes, and then sequencing, to the 41st of ilvH . It was confirmed that base (G) and 50th base (C) were substituted with A and T, respectively.
  • the obtained vector was cleaved with an NheI enzyme to delete a replication origin, then self-ligation, and then electrophorically transferred to E. coli W3110 competent cells (comporation-competent cells) in which the lacI gene produced in 1-1-2 was deleted. Porated. Next, a strain from which feedback inhibition was removed by sacB positive selection (Wohlleben et al ., J. Bacteriol ., 174: 5462, 1992) was obtained.
  • PCR was performed on SEQ ID NOs: 11, 12, 13, and 14 using a pair of primers and an E. coli W3110 genomic DNA template, respectively, and then PCR fragments, ilvGatt1 and ilvGatt2 were obtained, respectively. .
  • PCR and cloning were performed in the same manner as the ilvGMEDA attenuator removal using SEQ ID NOs. 15, 16, 17, and 18 as a pair of primers, respectively, and the E. coli W3110 competent from which the ilvGMEDA attenuator was removed.
  • the cells were electroporated.
  • the native promoter including the ilvBN attenuator could be replaced with the tac promoter.
  • panB, ilvE and leuA genes in W3110 substituted with the tac promoter of the ilvGMEDA and ilvBN operon attenuator SEQ ID NOs: 19 to 26 3-methyl-2- one of the above-mentioned step (a gene coding for the first enzyme in isoleucine biosynthesis pathway of threonine dehydratase) ilvA by the inactivation method, panB (enzymes required for pantothenate biosynthesis in the 1-1-2 using genes encoding oxobutanoate hydroxymethyltransferase), ilvE (gene encoding branched chain amino acid aminotransferase among the enzymes required for valine biosynthesis), and leuA (gene encoding 2-isopropylmalate synthase among enzymes required for leucine biosynthesis) were deleted .
  • the lacI gene produced in 1-1-4 was removed, the feedback inhibition of ilvH was removed, and the original promoter including the attenuator of ilvGMEDA and ilvBN operon was replaced with a tac promoter having strong transcriptional activity. Deletion of these four genes was induced in cells.
  • panB1stup 5'-atgaaaccgaccaccatctccttactgcagaagtacaaac aggaaaaaagattgcagcattacacgtcttg-3 '
  • panB1stdo 5'-ttaatggaaactgtgttcttcgcccggataaacgccggact ccacttcagcacttaacggctgacatggg-3 '
  • ilvB gene encoding acetohydroxy acid synthase I large subunit
  • ilvN gene encoding acetohydroxyacidsynthaseIsmallsubunit
  • ilvC gene encoding acetohydroxyacidisomeroreductase
  • ilvD gene encoding dihydroxy-acid dehydratase and the like were sequentially cloned into a pKK223-3 expression vector (Pharmacia Biotech) to obtain a pKKilvBNCD vector, and sequencing confirmed the base sequence.
  • the pKKilvBNCD the vector a 8.0kb fragment and, pBR322 vector digested with Pci I and Sph I enzymes were finally obtained a pKBRilvBNCD vector by ligation with the 1.9kb fragment digested with Pci I and Sph I enzymes (see Fig. 4).
  • PCR was performed using the primer of SEQ ID NO: 33 and the primer of SEQ ID NO: 34.
  • the tac promoter secured therefrom was digested with Xba I and inserted into the same restriction enzyme cleavage site of the pKBRilvBNCD vector prepared in Example 1-1-6 to obtain a pKBRilvBNCD-ptac vector.
  • acetobutylicum ATCC 824 genomic DNA was used as a template, and the PCR reaction was performed using the primer of SEQ ID NO: 35 and the primer of SEQ ID NO: 36.
  • the obtained adhE gene was cut into NheI and StuI , and inserted into the same restriction enzyme cleavage site of the pKBRilvBNCD-ptac vector to obtain a pKBRilvBNCD-ptac-adhE vector.
  • PCR reaction was performed using C. acetobutylicum ATCC 824 genomic DNA as a template and a primer of SEQ ID NO: 37 and a primer of SEQ ID NO: 38.
  • the obtained bdhAB gene was cut with StuI and inserted into the same restriction enzyme cleavage site of the pKBRilvBNCD-ptac-adhE vector to prepare a pKBRilvBNCD-ptac-adhE-bdhAB vector (see FIG. 4).
  • adhErs 5'-acgtaggcctatagtctatgtgcttcatga-3 '
  • the pTac15K vector (p15A origin, low copies, KmR; KAISTMBEL stock) was constructed by cloning vorA , vorB , and vorC operon of Methanosarcina acetivorans using primers of SEQ ID NOs: 39 and 40 to construct a pTac15K_VorABC vector.
  • VorABCF-2 5'-TATAGAGCTCATGGCAAAAAATGATGAAAA-3 '
  • VorABCR-2 5'-TATTTCTAGATCATACCTTATACTCTCTTGCCC-3 '
  • the ptmA and icmB genes of Streptomyces avermitilis were cloned into the pTac15K_VorABC vector using primers SEQ ID NOs: 41 and 42 to construct a pTac15K_VorABC_ptac_icmAB vector.
  • Butanol-producing microorganisms prepared in 1-2 were selected from LB plate medium to which 50 ⁇ g / ml and 30 ⁇ g / ml of ampicillin and chloramphenicol were added.
  • the transformed strain and the butanol producing microorganism specified in Korean Patent Application No. 10-2009-0059560 were inoculated in 10 ml LB medium and precultured at 37 ° C. for 12 hours. Then, after sterilization, glucose (10 g / L) was added to a 250 ml flask containing 100 ml LB taken out at 80 ° C. or higher, inoculated with 1 ml of the above preculture, and incubated at 31 ° C. for 12 hours.
  • the present invention has an effect of providing a recombinant microorganism having improved butanol production ability having butanol biosynthesis from 2-ketoisovalerate which is a precursor of L-valine.
  • the recombinant microorganism according to the present invention is easy to grow and has a high possibility of strain improvement due to additional metabolic flow, and thus is useful as an industrial production microorganism of butanol, and converts 2-ketoisovalerate to isobutyryl-CoA.
  • Simplification has the effect of providing a recombinant microorganism having high butanol production.

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Abstract

본 발명은 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate를 중간체(intermediate)로 하여 부탄올을 생합성하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 미생물은 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 재조합 미생물은 기존의 Clostridium acetobutylicum과달리성장이용이하고, 추가 대사흐름 조작으로 인한 균주개량의 가능성이 크므로 부탄올의 산업적 생성 미생물로 추가 대사흐름 조작으로 인한 균주개량의 가능성이 크므로 부탄올의 산업적 생성 미생물로 유용하며, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 과정을 단순화시킴으로써 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물을 제공하는 효과가 있다.

Description

부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법
본 발명은 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate를 중간체(intermediate)로 하고 VorABC유전자를도입하여 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 one-step으로 전환시킬 수 있는 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.
최근 고유가와 환경 문제로 인해 미생물을 이용한 바이오연료 생산이 큰 관심을 끌고 있다. 최근 바이오 부탄올이 휘발유의 대체 연료로 부상하면서 시장 규모가 매우 빠른 속도로 증가하고 있다. 현재 전세계적으로 연간 10~12 billion pound의 부탄올이 생산되고 있으며, 7~8.4 billion dollar의 시장규모를 이루고 있다 (Lee, S.Y. etal.,BiotechnologyandBioengineering101:209,2008). 특히, 바이오부탄올은 에너지 밀도, 휘발성 제어, 충분한 옥탄가, 낮은 불순물 등 연료로서 적합한 특성을 갖고, 에탄올 보다 에너지 효율이 높고 휘발유와 더욱 잘 섞이며, 기존의 송유관이나 자동차 엔진 등을 그대로 사용할 수 있다는 장점을 지니고 있다. 따라서 대체연료로 가장 적합한 부탄올을 미생물을 이용하여 대량 생산한다면, 원유 수입 대체 효과 및 온실 가스 배출 감소로 인한 환경적 효과 등을 가져올 수 있다.
부탄올은 Clostridial 균주의 혐기적 ABE (Acetone-Butanol-Ethanol) fermentation에 의해 생물학적 방법으로 생산될 수 있는데 (Jones, D. T. and Woods, D. R., Microbiol. Rev., 50:484,1986; Rogers, P., Adv.Appl. Microbiol., 31:1,1986; Lesnik,E.A.etal., NecleicAcids Research,29:3583,2001), 이러한 방법이 1950년대 까지만 해도 40년 이상에 걸쳐 부탄올과 아세톤의 주요 공급원이었다. Clostridial 균주는 성장 조건이 까다롭고 분자생물학적 tool 및 omics technology 등이 완전히 갖추어져 있지 않아서 추가 균주 개량에 어려움이 있다.
따라서, 성장이 우수하고 다양한 omics technology가 구비된 대장균 등에서의 부탄올 생산이 요구되고 있다. 특히, 대사공학 또는 omics technology 등을 이용한 균주 개발이 전무한 상태이므로 무한한 개발 잠재력이 있다고 하겠다.
Clostridium acetobutylicum 에서의 부탄올 생성 pathway는 도 1에 나타난 바와 같다 (Lee, S.Y. etal., Biotechnology and Bioengineering 101:209,2008).대장균에도 해당 pathway를 도입하여 부탄올 생산이 시도되었는데, 이 중 일부 효소들 (crotonase, β-hydroxybutyryl-coenzyme A dehydrogenase, butyryl-CoA dehydrogenase)의 활성이 매우 낮거나 거의 없어서 (Boynton, Z. L. et al., J. Biotechnol., 178:3015-3024,1996) Clostridiumacetobutylicum에서처럼 효과적으로 해당 반응을 catalyze 하기는 힘들다.
따라서, 부탄올 생합성 경로를 도입하여 부탄올 생성능을 가지는 재조합 박테리아를 제작하고, 이를 이용하여 부탄올 생산을 시도한 바 있으나, 그 생성량이 미미하였다 (WO2007/041269A2).
또한, valine의 전구체인 2-ketoacid로부터 butanol, isobutanol 등의 다양한 chain alcohol 생산을 시도하였고(Shota Atsumi et al.,Nature, 451,2008),재조합 미생물을 이용하여 pyruvate로부터 α-ketoisovalerate를 거쳐 isobutanol 생산을 시도하였으나(US2007/0092957A1), 생산되는 butanol 및 isobutanol의 수율이 낮은 문제점이 있었다 (Shota Atsumi et al., Nature, 451,2008).
또한, 2-ketoisovalerate를 부탄올로 전환시키는 대사회로를 새로이 구성하고, L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자인 bkdAB-lpdV를도입하여부탄올생성능을가지는재조합미생물을제작하였으나, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 과정에 bkdA1, bkdB 및 lpdV 세가지 유전자가 복잡한 interaction을 통해 관여하고 있어서 세 가지 유전자의 발현량을 조절하기 어렵다는 단점이 있었다.
이에, 본 발명자들은 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 과정을 단순화시킴으로써 2-ketoisovalerate를 부탄올로 전환시키는 효율을 증대시키기 위하여 예의 노력한 결과, VorA, VorB 및 VorC 세가지유전자가 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 데 관여한다는 것을 규명함과 아울러 이를 도입한 재조합 미생물을 제작하고, 상기 재조합 미생물이 기존의 재조합 미생물에 비하여 부탄올 고생성능을 가지는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 부탄올의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 VorABC 유전자가 도입되어 있는 2-ketoisovalerate에서 isobutyryl-CoA 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 2-ketoisovalerate에서 isobutyryl-CoA 를 생산하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시키는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조되고, L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있는 것임을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvA(threonine dehydratase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 leuA(2-isopropylmalate synthase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 panB(3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvE(branched chain amino acid aminotransferase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 (a) lacI(lacoperonrepressor를 암호화하는 유전자) 유전자의 결실; (b) ilvH(acetohydroxyacidsynthaseisozymeIII)유전자의 피드백 저해(feedback inhibition) 제거; (c) ilvGMEDA(acetohydroxyacidsynthaseisozymeI)및 ilvBN(Acetohydroxy acid synthase isozyme II) 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환; 및 (d) strong promoter를 포함하는 발현벡터의 도입으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 추가로 변이되어 있는 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 제조된 재조합 미생물을 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자(VorABC)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 2-ketoisovalerate에서 isobutyryl-CoA 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양하여 isobutyryl-CoA를 생성시킨 다음, 배양액으로부터 isobutyryl-CoA를 회수하는 것을 특징으로 하는 2-ketoisovalerate에서 isobutyryl-CoA를 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소 또는 상기 효소를 발현하는 재조합 미생물을 이용하는 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 방법을 제공한다.
도 1은 C. acetobutylicum ATCC 824 균주의 부탄올 생성 pathway를 나타낸 것이다.
도 2는 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에서 2-ketoisovalerate로부터 부탄올을 생합성하는 대사회로를 나타낸 것이다.
도 3은 sacB homologous recombination pSacHR06 벡터의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 4는 pKBRilvBNCD-ptac-adhEbdhAB 벡터의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 5는 2-ketoisovalerate가 isobutyryl-CoA로 전환되는 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 pTac15k_VorABC_ptac_icmAB 벡터를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
본 발명에서는 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자인 VorABC를도입함으로써 2-ketoisovalerate를 부탄올로 전환시키는 대사회로를 새로이 구성하여, 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물을 제작하고, 제작된 재조합 미생물이 부탄올을 합성할 수 있는지 확인하고자 하였다.
즉, L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 VorABC 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시킬 경우, 2-ketoisovalerate로부터 부탄올이 생성될 것으로 예측하고, 특히 VorABC 유전자에의해2-ketoisovalerate를 one-step으로 isobutyryl-CoA로 전환시킴으로써 부탄올 생성능도 증가할 것으로 예측하였다.
상기 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 박테리아, 효모, 곰팡이 등을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속 및 대장균 등을 이용할 수 있으나, 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지고 있는 한 제한이 없다
2-ketoisovalerate는 발린의 전구체이므로, 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물(Val)(한국등록특허 제832,740호)을 이용하거나, 2-ketoisovalerate의 축적율을 더욱 증가시키기 위하여 상기 L-발린 고생성능을 가지는 변이 미생물(Val)에서 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 약화 또는 결실시킨 변이 미생물을 이용하고자 하였다.
본 발명에서 "약화"란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나 일부 염기를 도입시켜 해당유전자에 의해 발현되는 효소의 활성을 감소시키는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로의 일부 또는 상당부분을 차단하는 모든 것을 포함한다.
본 발명에서 "증폭"이란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시키거나, 또는 동일한 효소를 코딩하는 다른 미생물 유래의 유전자를 도입시켜 대응하는 효소의 활성을 증가시키는 것을 포괄하는 개념이다.
도 2는 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에서 2-ketoisovalerate로부터 부탄올을 생합성하는 대사회로를 나타낸 것이다.
2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물을 이용하여, 2-ketoisovalerate로부터 부탄올을 제작하기 위하여, 2-ketoisovalerate를 부탄올로 전환시키는 대사회로를 새로이 구성하고, 이를 구성하는 각 효소들을 코딩하는 유전자를 도입시켰다. 즉, L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시켰다.
본 발명에 있어서, 상기 isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소는 isobutyryl-CoA mutase이며, 상기 butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소는 butyraldehyde dehydrogenase이고, 상기 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소는 butanol dehydrogenase인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Methanosarcina acetivorans 유래의VorABC (서열번호 46)인 것을 특징으로 할 수 있고, 즉, 2-ketoisovalerate ferredoxin reductase를 코딩하는 유전자는 Methanosarcina acetivorans 유래의VorB이고, 2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase를 코딩하는 유전자는 Methanosarcina acetivorans 유래의VorA 및 VorC인것을특징으로할수있다. 또한, 상기 isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Streptomyces avermitilis 유래의 icmAB인것을특징으로할수있으나, 다른 미생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 효소 활성을 나타내는 한 제한이 없을 것이다.
또한, 상기 butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Clostridium acetobutylicum 유래의 adhE인것을특징으로할수있고, 상기 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Clostridium acetobutylicum 유래의 bdhAB인것을특징으로할수있으나, 다른 미생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 효소 활성을 나타내는 한 제한이 없을 것이다.
한편, 본 발명의 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 2-ketoisovalerate의 축적율을 향상시키기 위하여, 변이시킨 미생물을 사용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 2-ketoisovalerate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 변이시키고, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 약화 또는 결실시킨 미생물을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvA(threonine dehydratase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 leuA(2-isopropylmalate synthase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 panB(3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvE(branched chain amino acid aminotransferase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있다.
아울러, 2-ketoisovalerate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키기 위하여, (a) lacI(lacoperonrepressor를 암호화하는 유전자) 유전자를 결실시키거고, (b) ilvH(acetohydroxyacidsynthaseisozymeIII)유전자의 피드백 저해(feedback inhibition)를 제거시키고; (c) ilvGMEDA(acetohydroxyacidsynthaseisozymeI)및 ilvBN(Acetohydroxy acid synthase isozyme II) 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환시키고, (d) strong promoter를 포함하는 발현벡터를 도입시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 strong promoter를 포함하는 발현벡터는 ilvB, ilvN, ilvC 및 ilvD 유전자를 함유하는 벡터인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 2-ketoisovalerate로부터 부탄올을 제조하기 위하여, 2-ketoisovalerate의 축적율이 우수한 변이 미생물을 제작한 다음, 여기에 2-ketoisovalerate로부터 부탄올을 제조하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시켜 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제작하였다.
먼저, lacI 유전자가 제거되고, ilvH의 feedback inhibition이 제거되었으며, ilvGMEDA및 ilvBN 오페론의 attenuator를 포함한 본래의 promoter가 강력한 전사활성을 가지는 tac promoter로 치환된 대장균 W3110 컴피턴트 세포를 제작한 후, ilvA,panB,leuA및 ilvE 유전자의 결실을 유도하여, 2-ketoisovalerate의 축적율이 우수한 변이 미생물을 제작하였다.
다음으로, Pseudomonas putida KT2440 유래의 branched chain ketoacid dehydrogenase (bkdA,bkdB,lpdV유전자에 의해 각각 코딩되는 E1 subunit: the dehydrogenase-decarboxylase, E2 subunit: the transacylase, E3: lipoamide dehydrogenase의 complex) 및 Bacillus subtilis 유래의 branched chain ketoacid dehydrogenase (bkdA1,bkdA2,bkdB,lpdV유전자에 의해 각각 코딩되는 subunit의 complex)가 발린의 catabolism에 관여하여 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 과정은(Sokatch, J. R. et al., J. Bacteriol., 148:647-652,1981; SykesP. J. etal., J. Bacteriol., 169:1619-1625,1987; Namba, Y., et al., J. Biol. Chem., 244:4437-4447)bkdA1, bkdB 및 lpdV 유전자가복잡한 interaction을 통해 이루어지기 때문에 세 가지 유전자의 발현량을 조절하는 데 어려움이 있었던 점에 착안하여, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 one-step으로 전환시킬 수 있도록 Methanosarcina acetivorans 유래의 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit, 서열번호 43), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase, 서열번호 44) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit, 서열번호 45)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자들을 클로닝하였다.
그리고, Streptomyces avermitilis 유래의 isobutyryl-CoA mutase (icmA,icmB유전자에 의해 코딩되는 단백질의 complex)가 isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시킨다는 사실 (Zerbe-Burkhardt, K., et al., J. Biol. Chem., 273:6508-6517,1998)에 근거하여 상기 유전자를 차례로 클로닝하여 2-ketoisovalerate로부터 butyryl-CoA를 만들고, Clostridiumacetobutylicum유래의 adhE (butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자)와 bdhAB (Clostridiumacetobutylicum의 butanol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 추가로 도입하여 최종적으로 butyryl-CoA로부터 butanol을 합성하고자 하였다.
bkdA, bkdB,lpdV 유전자에 의해 2-ketoisovalerate가 isobutyryl-CoA로 전환되는 과정은, bkdA1유전자에 의해 코딩되는 효소가 2-ketoisovalerate를 2-methy-1-hydroxypropyl-Thpp로 전환시킨 후 다시 2-(2-methyl propanoyl)-dihydrilpoamide-E로 전환된 다음, bkdB유전자에 의해 코딩되는 효소에 의해 2-(2-methyl propanoyl)-dihydrilpoamide-E가 isobutyryl CoA로 전환되고, 또한 lpdV 유전자에의해코딩되는효소가상기과정에관여하여, 전체적으로 복잡한 interaction을 통해 이루어지는 반면에, VorABC유전자를 도입한 경우에는 2-ketoisovalerate가 isobutyryl-CoA로 바로 전환되는 것을 확인하였다(도 5).
즉, 2-ketoisovalerate 축적에 필수적인 유전자들인 ilvB(acetohydroxy acid synthase I large subunit을 암호화하는 유전자), ilvN(acetohydroxyacidsynthaseIsmallsubunit을 암호화하는 유전자), ilvC(acetohydroxyacidisomeroreductase를 암호화하는 유전자), 및 ilvD(dihydroxy-acid dehydratase를 암호화하는 유전자) 등이 순차적으로 클로닝된 pKKilvBNCD 벡터에 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 등을 도입시킨 벡터를 제작한 후, 이를 상기 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에 도입시킴으로써 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제작하였다.
상기 제작된 재조합 미생물을 글루코즈 함유 배지에서 배양한 결과, 부탄올이 생성되는 것을 확인할 수 있었다(표 1).
최종적으로, 본 발명에서는 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자(VorABC),isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자(icmAB),butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자(adhE)및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자(bdhAB)를 도입시켜 재조합 미생물을 제작하고, 상기 재조합 미생물에서 부탄올 생성능이 획기적으로 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명에 따르면, VorABC 효소에 의하여 2-ketoisovalerate에서 isobutyryl-CoA로 전환되므로, 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자(VorABC)를 도입시켜 재조합 미생물을 제작하고, 상기 재조합 미생물을 배양하여 isobutyryl-CoA를 생성할 수 있으며, 상기 재조합 미생물을 이용하면 혐기 조건에서도 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 높은 효율로 전환시킬 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 대장균 W3110을 숙주 미생물로 이용하였으나, 다른 대장균이나, 박테리아, 효모 및 곰팡이를 사용하여 L-발린 생성능을 향상시키고, 2-ketoisovalerate로부터 부탄올을 생합성하는데 관여하는 효소의 유전자를 도입시킨 다음, 이를 이용하여 부탄올을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 도입 대상 유전자로 특정 균주 유래인 것만을 예시하였으나, 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 활성을 나타내는 한 그 제한이 없다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 VorABC 효소의 반응으로 2-ketoacid의 keto기가 제거되고 CoA기가 새롭게 결합함으로써 2-ketoisovalerate가 isobutyryl-CoA로 전환되는 것만을 확인하였으나, VorABC 효소의 이러한 기능을 확인한 이상 VorABC 효소가 2-ketoisovalerate에 대하여만 이러한 반응을 일으키는 것이 아니라 다른 여러 종류의 2-ketoacid에 대하여도 ferredoxin oxidoreductase의 기능을 나타낸다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
아울러, 하기 실시예에서는 특정 배지와 배양방법만을 예시하였으나, 문헌에 보고된 바와 같이, 유청(whey), CSL(corn steep liquor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용한 경우나, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양 등 다양한 방법을 사용하는 것 (Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26:63,2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58:663,2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25:111,2003; Lee et al. ,Appl. Microbiol. Biotechnol., 54:23,2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72:41,2001)도 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 따른 유전자를 제거하기 위하여 특정 벡터와 숙주세포로 카다베린 생성 미생물인 에스케리치아 속(Escherichiasp.) 미생물만을 예시하였으나, 다른 종류의 벡터와 카다베린 생성 미생물들을 사용하는 것 역시 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
실시예 1: 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물을 이용한 부탄올 생성능을 갖는 재조합 미생물 제작 및부탄올의 생성능 측정
본 발명자의 한국 등록특허 (분지쇄 아미노산 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를 이용한 분지쇄 아미노산의 제조방법, 등록번호: 10-0832740, 등록일자: 2008. 5. 21)를 참조하여 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물을 이용한 부탄올 생성능을 갖는 재조합 미생물을 제작하였다.
1-1: 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물의 제작
1-1-1: pSacHR06의 제작
염색체 DNA의 특정 염기 또는 염기들의 치환을 위해 바실러스 서틀리스 유래의 sacB homologous recombination 기법(Wohlleben et. al., J. Bacteriol., 174:5462,1992)을 이용할 목적으로 pSacHR06 벡터를 제작하였다(도 3). 도 3은 도 sacB homologous recombination pSacHR06의 제작과정을 나타낸 것이다.
먼저, pUC19(New England Biolab) 벡터의 엠피실린(ampicillin)에 대한 내성 특성을 카나마이신(kanamycin)에 대한 내성 특성으로 치환하기 위하여 pUC19 벡터를 NdeI 및 AhdI으로 절단하여 얻은 1522bp 절편을 pACYC177 벡터(New England Biolabs)를 StuI으로 절단하여 얻은 1340bp 절편과 DNA 축합반응을 수행하여 pUC19KM 벡터를 얻었다.
다음으로, 상기 pUC19KM 벡터를 PvuII로 절단하여 얻은 2.5kb 절편과 pBlu2KSP(full name: pBluescriptIIKS(+)) 벡터를 PvuII로 절단하여 얻은 400bp 절편을 축합반응하여 pUC19KKS 벡터를 얻었다. 이후 상기 벡터에 DNA 복제 원점의 용이한 제거가 가능하도록 하기 위해 서열번호 1 및 2의 프라이머와 pUC19 벡터 주형을 이용하여 PCR을 수행하였고, 그 결과 동일한 절단효소들의 인식부위를 양쪽 끝에 각각 가지고 있으며 DNA 복제기점을 가지는 DNA 절편을 획득하였다. 상기 절편을 SalI 및 DraIII로 절단하고, pUC19KKS 벡터를 SalI 및 DraIII로 절단하여 얻은 1.5kb 절편과 DNA 축합반응 하여 pUC19K 벡터를 얻었다. 상기 pUC19K 벡터에 바실러스 서틀리스(Bacillussubtilis)의 sacB 유전자를 도입하기 위하여 바실러스 서틀리스의 genomic DNA 주형과 서열번호 3 및 4의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 sacB 유전자를 가지는 DNA 절편을 합성하였고, 상기 합성된 DNA 절편과 pUC19K 벡터 모두를 XbaI, SpeI 및 EcoRV 효소로 절단하고 축합하여 sacB 유전자를 가지는 새로운 벡터를 제작하였고 이를 pSacHR06으로 명명하였다.
pSacHR06 벡터는 바실러스 서틀리스 유래의 sacB 유전자를 가지며 제한효소를 사용하여 용이하게 DNA 복제 원점의 제거와 재축합 반응을 수행할 수 있기 때문에 sacB positive selection에 사용 가능하다.
[서열번호 1] pucoriup: 5’-agccgtcgacgctagcgcatgcacgcgtgtgcacccatggga cgtcctcactgactcgctgcgctc-3’
[서열번호 2] pucorido: 5'-ggctcacaacgtggctagcgacgtcgtgcacccatgggttcc actgagcgtcagacc-3'
[서열번호 3] sacBf: 5'-actctctagacgcgggtttgttactgataa-3'
[서열번호 4] sacBr: 5'-gctagatatcaggatatcggcattttcttt-3'
1-1-2: lacI 유전자의 결실
2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물인 대장균 W3110(ATTC 39936)에서 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법(Warner etal.,PNAS,6;97(12):6640-6645,2000)을 이용하여, lac operon의 repressor를 암호화하는 유전자로, lactose 분해를 담당하는 lac operon의 전사를 억제하는 기능을 갖는 lacI 유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하였다.
[서열번호 5] lacI_1stup: 5'-gtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccgg tgtctcttagattgcagcattacacgtcttg-3'
[서열번호 6] lacI_1stdo: 5'-tcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctg cattaatgcacttaacggctgacatggg-3'
1-1-3: ilvH의 feedback inhibition 제거
아지노모토 사에서 출원한 특허(US 6,737,255 B2)를 참고하여 acetohydroxy acid synthase isozyme III를 코딩하는 유전자인 ilvH의 41번째 염기(G)와 50번째 염기(C)를 각각 A와 T로 치환하였고, 대장균 W3110(ATTC 39936)의 염색체 DNA는 공지된 방법으로 분리 및 정제하였다 (Sambrook, etal.,Molecularcloning,2nded,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY,1989).
즉, 서열번호 7 및 8과 9 및 10의 프라이머와, 대장균 W3110 genomic DNA 주형을 이용하여 각각 PCR을 수행한 다음, 수득된 두개의 PCR 절편을 동일 농도로 섞어 주형으로 하고, 서열번호 7 및 10을 프라이머로 사용하여 overlapping PCR을 수행하였다. 상기와 같은 방법으로 얻은 1280bp의 PCR 절편을 PstI 및 SalI 효소로 절단하고, 역시 PstI 및 SalI 효소로 절단한 sacB homologous recombination 용 벡터인 pSacHR06에 삽입한 다음, sequencing 하여, ilvH의 41번째 염기(G)와 50번째 염기(C)가 각각 A와 T로 치환되었음을 확인하였다.
상기 수득한 벡터를 NheI 효소로 절단하여, replication origin을 결실시킨 다음, self-ligation 시키고, 상기 1-1-2에서 제작된 lacI 유전자가 결실된 대장균 W3110 컴피턴트 세포(electroporation-competent cell)에 일렉트로포레이션하였다. 다음으로, sacBpositiveselection(Wohllebenetal., J. Bacteriol., 174:5462,1992)방법에 의해 feedback inhibition이 제거된 균주를 수득하였다.
[서열번호 7] ilvH1: 5'-gactctgcagggtgatcgagactctttggcggttgac-3'
[서열번호 8] ilvH2: 5'-ggaaaaaaggccaatcacgcggaataacgcgtctgattcattttcga gtaag-3'
[서열번호 9] ilvH3: 5'-cttactcgaaaatgaatcagacgcgttattccgcgtgattggccttt tttcc-3'
[서열번호 10] ilvH4: 5'-gctccgtcgaccagtttcacaattgccccttgcgtaaa-3'
1-1-4: ilvGMEDA 및 ilvBN 오페론의 attenuator의 tac promoter로의 치환
1-1-3에서 제작된 lacI 유전자와 ilvH의 feedback inhibition이 제거된 대장균 W3110에서, acetohydroxy acid synthase isozyme I 및 II의 constitutive expression을 유도하기 위하여, acetohydroxy acid synthase isozyme I 및 II를 각각 암호화하는 ilvBN 및 ilvGMEDA 오페론의 전사조절 기작에 관여하는 attenuator를 강력한 promoter인 tac promoter로 치환하였다.
먼저, ilvGMEDA operon attenuator의 치환을 위해, 서열번호 11 및 12와 13 및 14를 각각 한 쌍의 프라이머와 대장균 W3110 genomic DNA 주형을 이용하여 PCR을 수행한 다음, PCR 절편, ilvGatt1 및 ilvGatt2를 각각 수득하였다. 상기 수득된 두 PCR 절편을 각각 SalI/BamHI 및 EcoRI/PstI효소로 절단하여 pKK223-3 벡터(Pharmacia Biotech)의 해당 효소 절단 부위에 클로닝 한 다음, sequencing으로 염기서열을 확인한 후, SalI 및 PstI 효소로 절단한 부위를 상기 pSacHR06 벡터의 해당 효소 절단 부위에 클로닝하고, 상기 feedback inhibition 제거와 동일한 방법으로, attenuator를 포함하는 native promoter를 tac promoter로 치환하였다.
ilvBN operon의 attenuator 제거를 위해, 서열번호 15 및 16과 17 및 18을 각각 한쌍의 프라이머로 사용하여 상기 ilvGMEDA attenuator 제거와 동일한 방법으로 PCR 및 클로닝한 다음, 상기에서 ilvGMEDA attenuator가 제거된 대장균 W3110 컴피턴트 세포에 일렉트로포레이션하였다. 그 결과 ilvBN attenuator를 포함하는 native promoter를 tac promoter로 치환할 수 있었다.
[서열번호 11] ilvGatt1f: 5'-gactgtcgacctaacttattggctgtaagctgttctgaggcc- 3'
[서열번호 12] ilvGatt1r: 5'-gctcggatccgaatgttgttcccttcctcgtagttcatcc-3'
[서열번호 13] ilvGatt2f: 5'-gactgaattcatgaatggcgcacagtgggtggtacatgcg- 3'
[서열번호 14] ilvGatt2r: 5'-gctcctgcagtcaccgctggctaactggatatcttttggg-3'
[서열번호 15] ilvBatt1f: 5'-gactcgtcgacagagatggtagggcggataa-3'
[서열번호 16] ilvBatt1r: 5'-gctcggatcccacactgtattatgtcaaca-3'
[서열번호 17] ilvBatt2f: 5'-gactgaattcatggcaagttcgggcacaac-3'
[서열번호 18] ilvBatt2r: 5'-gctcactgcagtgcgtcacgaatgctttctt-3'
1-1-5: ilvA,panB,ilvE및 leuA 유전자의 결실
1-1-4에서 수득된 lacI 유전자와 ilvH의 feedback inhibition이 제거되고 ilvGMEDA 및 ilvBN 오페론 attenuator의 tac promoter로의 치환된 W3110에서 ilvA, panB,ilvE및 leuA 유전자를 결실시키기 위하여, 서열번호 19 내지 26 프라이머들을 이용하여 상기 1-1-2에 언급한 one step inactivation 방법에 의해 ilvA (isoleucine 생합성 경로의 첫 번째 효소인 threonine dehydratase를 암호화하는 유전자), panB(pantothenate생합성에 필요한 효소 중 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase를 암호화하는 유전자), ilvE(valine생합성에 필요한 효소 중 branched chain amino acid aminotransferase를 암호화하는 유전자) 및 leuA (leucine 생합성에 필요한 효소 중 2-isopropylmalate synthase를 암호화하는 유전자)등의 유전자를 결실시켰다.
즉, 1-1-4에서 제작된 lacI 유전자가 제거되고, ilvH의 feedback inhibition이 제거되었으며, ilvGMEDA및 ilvBN 오페론의 attenuator를 포함한 본래의 promoter가 강력한 전사활성을 가지는 tac promoter로 치환된 대장균 W3110 컴피턴트 세포에서 상기 유전자 4종의 결실을 유도하였다.
[서열번호 19] ilvA1stup: 5'-atggctgactcgcaacccctgtccggtgctccggaaggtgc cgaatatttgattgcagcattacacgtcttg-3'
[서열번호 20] ilvA1stdo: 5'-ctaacccgccaaaaagaacctgaacgccgggttattggttt cgtcgtggccacttaacggctgacatggg-3'
[서열번호 21] panB1stup: 5'-atgaaaccgaccaccatctccttactgcagaagtacaaac aggaaaaaaagattgcagcattacacgtcttg-3'
[서열번호 22] panB1stdo: 5'-ttaatggaaactgtgttcttcgcccggataaacgccggact ccacttcagcacttaacggctgacatggg-3'
[서열번호 23] leuA1stup: 5'-atgagccagcaagtcattattttcgataccacattgcgcga cggtgaacagattgcagcattacacgtcttg-3'
[서열번호 24] leuA1stdo: 5'-ttcagaacgtgcaccatggctttggcagatgactcgacaat atcggtagcacttaacggctgacatggg-3'
[서열번호 25] ilvE1stup: 5'-atcttcgtcggtgatgttggcatgggagtaaacccgccag cgggatactctaggtgacactatagaacgcg-3'
[서열번호 26] ilvE1stdo: 5'-caggttttcgcctgcgccttcagagatataaccgttcacatc cagcgcgatagtggatctgatgggtacc-3'
1-1-6: pKBRilvBNCD 벡터의 제작
서열번호 27 내지 32의 프라이머들을 이용하여 2-ketoisovalerate 축적에 필수적인 유전자들, 즉 ilvB(acetohydroxy acid synthase I large subunit을 암호화하는 유전자), ilvN(acetohydroxyacidsynthaseIsmallsubunit을 암호화하는 유전자), ilvC(acetohydroxyacidisomeroreductase를 암호화하는 유전자), 및 ilvD(dihydroxy-acid dehydratase를 암호화하는 유전자) 등을 순차적으로 pKK223-3 발현벡터(Pharmacia Biotech)에 클로닝하여 pKKilvBNCD 벡터를 수득하고, sequencing으로 염기서열을 확인하였다. 상기 pKKilvBNCD 벡터를 PciI 및 SphI 효소로 절단한 8.0kb 절편과, pBR322 벡터를 PciI 및 SphI 효소로 절단한 1.9kb 절편을 ligation 하여 pKBRilvBNCD 벡터를 최종 수득하였다(도 4 참조).
[서열번호 27] ilvBNf: 5'-actcgaattcatggcaagttcgggcacaacat-3'
[서열번호 28] ilvBNr: 5'-actcgaattcatggcaagttcgggcacaacat-3'
[서열번호 29] ilvCf: 5'-agtgctgcagacgaggaatcaccatggctaac-3'
[서열번호 30] ilvCrSX: 5'-gctcctgcagtctagagctagcgagctcttaacccgc-3'
[서열번호 31] ilvDf: 5'-actcgagctcgagacagacactgggagtaa-3'
[서열번호 32] ilvDr: 5'-tacgtctagattaaccccccagtttcgatt-3'
1-1-7: pKBRilvBNCD-ptac-adhE-bdhAB 벡터의 제작
pTac15K 벡터를 주형으로 하고, 서열번호 33의 프라이머와 서열번호 34의 프라이머를 사용하여 PCR반응을 수행하였다. 이로부터 확보된 tac 프로모터를 XbaI 로 절단하고, 이를 상기 실시예 1-1-6에서 제작한 pKBRilvBNCD 벡터의 동일한 제한효소 절단부위에 삽입하여 pKBRilvBNCD-ptac 벡터를 수득하였다.
C. acetobutylicum ATCC 824 genomic DNA를 주형으로 하고, 서열번호 35의 프라이머와 서열번호 36의 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 이로부터 확보된 adhE 유전자를 NheI 및 StuI로절단하고, 이를 상기 pKBRilvBNCD-ptac 벡터의 동일한 제한효소 절단부위에 삽입하여 pKBRilvBNCD-ptac-adhE 벡터를 수득하였다.
다음으로, C. acetobutylicum ATCC 824 genomic DNA를 주형으로 하고, 서열번호 37의 프라이머와 서열번호 38의 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 이로부터 확보된 bdhAB 유전자를 StuI로절단하고, 이를 상기 pKBRilvBNCD-ptac-adhE 벡터의 동일한 제한효소 절단부위에 삽입하여 pKBRilvBNCD-ptac-adhE-bdhAB 벡터를 제작하였다 (도 4 참조).
[서열번호 33] tacf: 5'-atcttctagaatcggaagctgtggtatggc-3'
[서열번호 34] tacrsn: 5'-gtgctctagaaggcctgatcagctagctgtttcctgtgtga-3'
[서열번호 35] adhEfn: 5'-acgcgctagcatgaaagttacaaatcaaaa-3'
[서열번호 36] adhErs: 5'-acgtaggcctatagtctatgtgcttcatga-3'
[서열번호 37] bdhfst: 5'-atgcaggcctcaacgaaaaattcaccccct-3'
[서열번호 38] bdhrst: 5'-acgtaggcctccggtaggtttacacagatt-3'
1-1-8: pTac15K_VorABC 벡터의 제작
pTac15K 벡터(p15A origin, low copies, KmR; KAISTMBEL stock)에 Methanosarcina acetivorans의vorA, vorB,vorCoperon을 서열번호 39과 40의 프라이머들을 이용하여 클로닝하여 pTac15K_VorABC 벡터를 제작하였다.
[서열번호 39] VorABCF-2: 5'-TATAGAGCTCATGGCAAAAAATGATGAAAA-3'
[서열번호 40] VorABCR-2: 5'-TATTTCTAGATCATACCTTATACTCTCTTGCCC-3'
1-1-9: pTac15K_VorABC_ptac_icmAB 벡터의 제작
pTac15K_VorABC 벡터에 Streptomyces avermitilis의 icmA, icmB gene들을 서열번호 41 및 42의 프라이머들을 이용하여 클로닝하여 pTac15K_VorABC_ptac_icmAB 벡터를 제작하였다.
[서열번호 41] tacicmABF-1: 5'-CGCGGCATGCGAAATGAGCTGTTGACAATT-3'
[서열번호 42] tacicmABR-1: 5'-TATAGCATGCCTACGCCCCGGCAGGCTGCC-3'
1-2: 부탄올 생성균주의 제작
상기 1-1-1 내지 1-1-5의 과정을 통해 ilvGMEDA 및 ilvBN operon의 attenuator를 포함하는 native promoter가 tac promoter로 치환되고, ilvH의 feedback inhibition이 제거되고, lacI,ilvA,panB,leuA및 ilvE 유전자가 결실된 대장균 W3110 균주 {Val(△ilvE)}에 상기 1-1-6 내지 1-1-9에서 제작된 벡터를 도입하여 부탄올 생성 미생물을 제작하였다.
1-3: 부탄올 생성능의 측정
상기 1-2에서 제작된 부탄올 생성 미생물들을 엠피실린(ampicillin) 및 클로람페니콜(chloramphenicol)이 각각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖ 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 상기 형질전환 균주와 대한민국 특허출원 제10-2009-0059560호에 명시된 부탄올 생성 미생물을 10㎖ LB 배지에 접종하여 37℃에서 12시간 동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 멸균 후 80℃ 이상에서 꺼낸 100㎖ LB를 함유한 250㎖ 플라스크에 glucose (10g/L)를 첨가하고 상기 전배양액 1㎖을 접종하여, 31℃에서 12시간 배양하였다. 그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 야생형 대장균 W3110에서는 부탄올이 생성되지 않았고, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자로 bkdAB-lpdV를도입한재조합미생물의경우와비교할때(대한민국 특허출원 제10-2009-0059560호), 본 발명에 따른 재조합 변이 미생물은 32mg/L의 부탄올 생산을, bkdAB-lpdV를 도입한 재조합 미생물은 10mg/L의 부탄올을 생산을 나타내었다. 이는 100㎖ flask에서 12시간 배양한 결과이며, 즉, 본 발명에 따른 재조합 미생물에서 더 많은 양의 부탄올을 생산함을 확인하였고, large scale 배양시 더 많은 양의 부탄올이 생성될 것으로 예상된다. 이 결과로부터, 본 발명에서의 VorABC, adhE,icmAB및 bdhAB 유전자들의 과발현으로 인해 2-ketoisovalerate로부터 부탄올이 성공적으로 생성되었으며, 또한 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에 도입된 유전자 조작에 의해 2-ketoisovalerate가 축적되어 부탄올 생산에 중요한 전구체로 작용한 것을 확인할 수 있었다.
표 1
Figure PCTKR2011006607-appb-T000001
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate로부터 부탄올 생합성능을 가지는 부탄올 생성능이 개선된 재조합 미생물을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 재조합 미생물은 기존의 Clostridium acetobutylicum과달리성장이용이하고추가대사흐름조작으로인한균주개량의가능성이크므로부탄올의산업적생성미생물로유용하며, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 과정을 단순화시킴으로써 부탄올 고생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공하는 효과가 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (32)

  1. L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자를 도입시키는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 2-ketoisovalerate의 축적율을 향상시키기 위하여, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있는 것임을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvA(threonine dehydratase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 leuA(2-isopropylmalate synthase를 암호화하는 유전자)이며, 상기 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 panB(3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvE(branched chain amino acid aminotransferase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 다음으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 추가로 변이되어 있는 것임을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법: (a) lacI(lacoperonrepressor를 암호화하는 유전자) 유전자의 결실; (b) ilvH(acetohydroxyacidsynthaseisozymeIII)유전자의 피드백 저해(feedback inhibition) 제거; (c) ilvGMEDA(acetohydroxyacidsynthaseisozymeI) 및 ilvBN(Acetohydroxy acid synthase isozyme II) 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환; 및 (d) strong promoter를 포함하는 발현벡터의 도입.
  7. 제6항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 strong promoter를 포함하는 발현벡터는 ilvB, ilvN,ilvC 및 ilvD 유전자를 함유하는 벡터인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소는 isobutyryl-CoA mutase이며, 상기 butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소는 butyraldehyde dehydrogenase이고, 상기 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소는 butanol dehydrogenase인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자는 Methanosarcina acetivorans 유래의VorABC인것을특징으로하는부탄올생성능을가지는재조합미생물의제조방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Streptomyces avermitilis 유래의 icmAB인것을특징으로하는부탄올생성능을가지는재조합미생물의제조방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Clostridium acetobutylicum 유래의 adhE인것을 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Clostridium acetobutylicum 유래의 bdhAB인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물의 제조방법.
  14. L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  17. 제14항에 있어서, 상기 isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소는 isobutyryl-CoA mutase이고, 상기 butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소는 butyraldehyde dehydrogenase이고, 상기 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소는 butanol dehydrogenase인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  18. 제14항에 있어서, 상기 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자는 Methanosarcina acetivorans 유래의 VorABC인것을특징으로하는부탄올생성능을가지는재조합미생물.
  19. 제14항에 있어서, 상기 isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Streptomyces avermitilis 유래의 icmAB인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  20. 제14항에 있어서, 상기 butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Clostridium acetobutylicum 유래의 adhE인것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  21. 제14항에 있어서, 상기 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 Clostridium acetobutylicum 유래의 bdhAB인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  22. L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자, isobutyryl-CoA를 butyryl-CoA로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA를 butyraldehyde로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 butyraldehyde를 butanol로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있는 것임을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvA(threonine dehydratase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 leuA(2-isopropylmalate synthase를 암호화하는 유전자)이며, 상기 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 panB(3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase를 암호화하는 유전자)이고, 상기 L-발린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvE(branched chain amino acid aminotransferase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  24. 제22항에 있어서, 상기 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물은 다음으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 추가로 변이되어 있는 것임을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물: (a) lacI(lacoperonrepressor를 암호화하는 유전자) 유전자의 결실; (b) ilvH(acetohydroxyacidsynthaseisozymeIII)유전자의 피드백 저해(feedback inhibition) 제거; (c) ilvGMEDA(acetohydroxyacidsynthaseisozymeI) 및 ilvBN(Acetohydroxy acid synthase isozyme II) 오페론의 attenuator를 포함하는 native promoter를 strong promoter로 치환; 및 (d) strong promoter를 포함하는 발현벡터의 도입.
  25. 제24항에 있어서, 상기 strong promoter를 포함하는 발현벡터는 ilvB, ilvN,ilvC 및 ilvD 유전자를 함유하는 벡터인 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  26. 제14항의 재조합 미생물을 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
  27. 제22항 또는 제24항의 재조합 미생물을 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
  28. L-발린의 전구체인 2-ketoisovalerate의 생성능을 가지는 미생물에, 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소를 코딩하는 유전자(VorABC)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 2-ketoisovalerate에서 isobutyryl-CoA 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 VorA는 서열번호 43, VorB는 서열번호 44, VorC는 서열번호 45의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 2-ketoisovalerate에서 isobutyryl-CoA 생성능을 가지는 재조합 미생물.
  30. 제28항 또는 제29항의 재조합 미생물을 배양하여 isobutyryl-CoA를 생성시킨 다음, 배양액으로부터 isobutyryl-CoA를 회수하는 것을 특징으로 하는 2-ketoisovalerate에서 isobutyryl-CoA를 생산하는 방법.
  31. 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 효소인 VorA(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, alpha subunit), VorB(2-oxoisovalerate ferredoxin oxidoreductase) 및 VorC(2-ketoisovalerate ferredoxin reductase, gamma subunit)로 구성되는 VorABC 효소 또는 상기 효소를 발현하는 재조합 미생물을 이용하여 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 VorA는 서열번호 43, VorB는 서열번호 44, VorC는 서열번호 45의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 2-ketoisovalerate를 isobutyryl-CoA로 전환시키는 방법.
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