WO2012029046A1 - Méthode pour tester l'effet de composés sur des systèmes cellulaires - Google Patents

Méthode pour tester l'effet de composés sur des systèmes cellulaires Download PDF

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Song Huang
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Definitions

  • the present invention is in the field of the study of the effect (toxic or beneficial) of compounds, with regard to the health of animals and of man in particular. More specifically, it relates to a method for preparing compounds to be tested in a quantifiable dose and usable for evaluating their effects (toxic or beneficial) on cellular systems in vitro, ex vivo or in vivo.
  • Airborne powders or nanomaterials may be in contact with the skin, eyes, hair, respiratory system, upper digestive tract, etc. Some powders are placed on the body voluntarily. This is the case, for example, with cosmetic products, dental products or respirable / aerosol formulations for treating pulmonary pathologies. It is important to test the beneficial or toxic effect of these products. For this, it is necessary to apply the test compound to animals or cellular systems in vitro at different quantifiable doses. For compounds with little water-soluble or non-water-soluble, there is no practical method for testing these substances in a concentration or mass range from pure to the lowest masses such as femto gram.
  • the present invention proposes to develop a simple and practical method for the preparation of at least one compound to be tested in a range of concentration or mass ranging from pure to the masses most weak as the femto gram and usable to determine the effect or the toxicity of this compound.
  • the invention relates to a process for the preparation of at least one compound intended to be tested in a concentration or mass range from pure to the lowest masses such as femto gram, said process comprising the following steps: Mixing said compound with an inert excipient in a predefined quantity ratio,
  • the compressed block obtained according to the invention can be in any form. It can also be in the form of a pellet, a cube, a cylinder, a cone, a prism, a pyramid, a sphere, a polyhedron, etc. It can be water soluble.
  • the block manufactured according to the method of the invention is a pellet.
  • the compound to be tested may be any type of natural compound or compound obtained by chemical or biological synthesis, mixtures of formulations of such compounds and whose effects are studied.
  • These are compounds that can be used in the cosmetic or pharmaceutical field or in any other field of the industry. They can be in the form of a powder, particles, a liquid. They can be water-soluble, not very hydrosoluble or not water-soluble.
  • This method makes it possible to test the effect or the toxicity of any compound, soluble or not, powders and liquids at all the desired concentrations / doses on cell systems in vitro, ex vivo or directly in vivo.
  • the compounds are diluted in an inert excipient in the form of a solid. This excipient is well tolerated by the cells and does not react with the test compound. Some polysaccharides such as the Dextran family are well tolerated by cells. On the other hand, Dextran is soluble in water and in cell culture media, making it suitable for use in efficacy and toxicity tests in vitro, ex vivo or in vivo.
  • the method according to the invention may also comprise a step of grinding the homogenized mixture prior to manufacturing the compressed block.
  • the grinding step may be replaced by a sonication step, mechanical mixing (mixer) or magnetic stirring.
  • Another subject of the invention concerns a compressed block comprising an inert excipient in solid form and at least one compound intended to be tested, said block being manufactured according to the process of the invention.
  • Another object of the invention is the use of a compressed block as defined in the present invention comprising at least one compound to be tested and an inert excipient for testing the effect or toxicity of said compound on a system. cell, said use comprising a step in which the block according to the invention is dissolved in an aqueous medium comprising the cellular system and then a step of testing the compound in the medium.
  • This cellular system can be a cellular system in vitro, ex vivo or in vivo.
  • the cells can be cultured under submerged culture conditions or at the air / liquid interface. .
  • the in vitro cell systems used to perform the tests may be human primary respiratory cells.
  • FIG. 1 The compound intended to be tested in powder form (1) and the excipient in the form of powder (2) are previously weighed. Thus, it is possible to mix these two powders in a predefined quantity ratio.
  • Figure 2 The two powders are mixed and then crushed vigorously until a homogenized mixture. The operation can be done mechanically and automatically.
  • Figure 3 The homogenized mixture is placed in a press.
  • Figure 4 The homogenized mixture is pressurized with a press to obtain a compressed solid pellet.
  • Figure 5 The pellet is recovered and weighed. The pellet can be cut to obtain the desired mass and / or shape.
  • Figure 6 The pellet is applied to an in vitro cell culture system.
  • Figure 7 The pellet begins to dissolve.
  • Figure 8 The pellet is dissolved.
  • the compound to be tested and the excipient are weighed separately (FIG. 1) and then mixed vigorously, manually or mechanically, in order to obtain a homogenized mixture containing a known quantity of the molecule (or mixture) to be tested. (Figure 2).
  • the homogenized mixture obtained is then compressed (FIGS. 3 and 4) using a press to obtain a compressed solid pellet. Any type of press can be used. The operation can be done mechanically and automatically.
  • the solid pellet obtained ( Figure 5) can then be cut into the desired shape, and weighed to find the exact mass of the excipient and the compound to be tested.
  • the pellet is then ready to be deposited and is directly usable on animals or cellular systems in vitro or ex vivo.
  • the pellet is applied to an in vitro cell system ( Figure 6).
  • the cells of the cellular system can be cultured under submerged culture conditions or at the air-air interface. liquid.
  • the pellet containing the test compound dissolves and a test step of this compound can be undertaken.
  • pellets were made to test, inter alia, the effect of chemicals (Sodium Dodecyl sulphate, Ammonium Hexachloroplatinate, CaCl 2 , NaCl, Naphthalene, etc.), cosmetic products (plant extracts, emulsifiers, etc.).
  • cosmetic products plant extracts, emulsifiers, etc.
  • pharmaceutical products solid formulations, active principles, etc.
  • nanoparticles FeO, CeO 2 , etc.
  • metallurgical products Ni, Fe, Zn, etc.
  • Pellets containing a test substance amount of 10 milligrams to 1 femtogram were prepared.
  • Sodium Dodecyl sulfate (5 mg) is mixed with dextran 60 (495 mg) in a 1% ratio.
  • the resulting mixture A1 is ground in a mortar and then the homogenized mixture is compressed with a press to form a pellet containing 1% Sodium Dodecyl sulfate.
  • the solid mixture A1 (20 mg) is mixed with dextran 60 (1 80 mg) in a 10% ratio.
  • the resulting mixture A2 is ground in a mortar and then the homogenized mixture is pressed with a press to form a pellet containing 0.1% Sodium Dodecyl sulfate.
  • Ammonium hexachloroplatinate (5 mg) is mixed with dextran 60 (245 mg) in a ratio of 2%.
  • the mixture B1 obtained is ground in a mortar and then the homogenized mixture is compressed with a press to form a pellet containing 2% ammonium hexachloroplatinate.
  • the solid mixture B1 (20 mg) is mixed with dextran 60 (180 mg) in a ratio of 10%.
  • the resulting mixture B2 is ground in a mortar and then the homogenized mixture is compressed with a press to form a pellet containing 0.2% ammonium hexachloroplatinate.
  • Iron oxide (FeO) (5 mg) is mixed with dextran 60 (995 mg) in a ratio of 0.5% (solid mixture C1).
  • the mixture C1 obtained is milled in a mortar then the homogenized mixture is compressed using a press to form a pellet containing 0.5% iron oxide.
  • the solid mixture C1 (10 mg) is mixed with dextran 60 (990 mg) in a 1% ratio (solid mixture C2).
  • the mixture C2 obtained is ground in a mortar and then the homogenized mixture is compressed using a press to form a pellet containing 0.005% iron oxide.
  • the compressed blocks were applied directly to cell systems or in culture medium.
  • Various studies using these blocks have been conducted to test the toxic effect (evaluation of cytotoxicity, cell viability and tissue integrity by release of LDH, Resazurin transformation, MTT test and measurement of Epithelial Trans Resistance), the effect on the beat. (ciliary beat frequency, mucociliary clearance), the effect on transepithelial transport (permeability), the effect on the modulation of ion channels (Ussing chambers) the effect on the modulation of soluble factors (cytokines, chemokines, metalloproteinases), the effect on mucus production (ELLA test).

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation d'au moins un composé destiné à être testé dans une gamme de concentration ou de masse allant du pur jusqu'aux masses les plus faibles tel le femto gramme, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : i) Mélange dudit composé avec un excipient inerte dans un rapport de quantités prédéfini, ii) Homogénéisation dudit mélange, iii) Fabrication d'un bloc par compression dudit mélange homogénéisé. Elle concerne également un bloc compressé selon l'invention ainsi que l'utilisation de ce bloc compressé pour tester l'effet ou la toxicité du composé sur un système cellulaire in vitro ou in vivo.

Description

Méthode pour tester l'effet de composés sur des systèmes
cellulaires
Domaine de l'invention La présente invention se situe dans le domaine de l'étude de l'effet (toxique ou bénéfique) de composés, vis-à-vis de la santé des animaux et de l'homme en particulier. Elle concerne plus précisément un procédé pour préparer des composés destinés à être testés dans une dose quantifiable et utilisable pour évaluer leurs effets (toxique ou bénéfique) sur des systèmes cellulaires in vitro, ex vivo ou in vivo.
Etat de la technique
Les poudres aéroportées ou nanomatériaux peuvent être en contact avec la peau, les yeux, les cheveux, le système respiratoire, l'appareil digestif supérieur, etc. Certaines poudres sont placées sur l'organisme de façon volontaire. C'est le cas, par exemple, des produits cosmétiques, produits dentaires ou formulations respirables/aérosol pour traiter des pathologies pulmonaires. Il est important de tester l'effet bénéfique ou toxique de ces produits. Pour cela, il est nécessaire d'appliquer le composé à tester sur des animaux ou des systèmes cellulaires in vitro à différentes doses quantifiables. Pour des composés peu hydrosolubles ou non hydrosolubles, il n'existe pas de méthode pratique permettant de tester ces substances dans une gamme de concentration ou de masse allant du pur jusqu'aux masses les plus faibles tel le femto gramme.
Exposé général de l'invention
La présente invention se propose de mettre au point un procédé simple et pratique permettant la préparation d'au moins un composé destiné à être testé dans une gamme de concentration ou de masse allant du pur jusqu'aux masses les plus faibles tel le femto gramme et utilisable pour déterminer l'effet ou la toxicité de ce composé.
L'invention concerne un procédé de préparation d'au moins un composé destiné à être testé dans une gamme de concentration ou de masse allant du pur jusqu'aux masses les plus faibles tel le femto gramme, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : i) Mélange dudit composé avec un excipient inerte dans un rapport de quantités prédéfini,
ii) Homogénéisation dudit mélange,
iii) Fabrication d'un bloc par compression dudit mélange homogénéisé.
Le bloc compressé obtenu selon l'invention peut être sous n'importe quelle forme. Il peut être également sous la forme d'une pastille, d'un cube, d'un cylindre, d'un cône, d'un prisme, d'une pyramide, d'une sphère, d'un polyèdre, etc. Il peut être hydrosoluble. De préférence, le bloc fabriqué selon le procédé de l'invention est une pastille.
Selon l'invention, le composé destiné à être testé peut être tout type de composé naturel ou de composé obtenu par synthèse chimique ou biologique, des mélanges en formulations de tels composés et dont les effets sont étudiés. Ce sont des composés qui peuvent être utilisés dans le domaine cosmétique ou pharmaceutique ou encore dans tout autre domaine de l'industrie. Ils peuvent être sous la forme d'une poudre, de particules, d'un liquide. Ils peuvent être hydrosolubles, peu hydrosolubles ou non hydrosolubles.
Cette méthode permet de tester l'effet ou la toxicité de tout composé, soluble ou non, poudres et liquides à toutes les concentrations/doses voulues sur des systèmes cellulaires in vitro, ex vivo ou directement in vivo.
Afin de pouvoir tester l'effet de composés, il est nécessaire que ces composés soient dilués pour avoir à disposition des mélanges à différentes concentrations. Pour cela, les composés sont dilués dans un excipient inerte sous la forme d'un solide. Cet excipient est bien toléré par les cellules et ne réagit pas avec le composé à tester. Certains polysaccharides telle la famille du Dextran sont bien tolérés par les cellules. D'autre part, le Dextran est soluble dans l'eau et dans les milieux de cultures cellulaires, ce qui rend son utilisation propice pour les tests d'efficacité et de toxicité in vitro, ex vivo ou in vivo.
La méthode selon l'invention peut également comprendre une étape de broyage du mélange homogénéisé préalablement à la fabrication du bloc compressé.
L'étape de broyage peut être remplacée par une étape de sonication, de mélange mécanique (mixeur) ou agitation magnétique. Un autre objet de l'invention concerne un bloc compressé comprenant un excipient inerte sous la forme solide et d'au moins un composé destiné à être testé, ledit bloc étant fabriqué selon le procédé de l'invention.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un bloc compressé tel que défini dans la présente invention comprenant au moins un composé destiné à être testé et un excipient inerte pour tester l'effet ou la toxicité dudit composé sur un système cellulaire, ladite utilisation comprenant une étape dans laquelle on dissout le bloc selon l'invention dans un milieu aqueux comprenant le système cellulaire puis une étape de test du composé dans le milieu.
Ce système cellulaire peut être un système cellulaire in vitro, ex vivo ou in vivo. Dans le cas d'un système cellulaire in vitro, les cellules peuvent être cultivées en condition de culture submergée ou encore à l'interface air/liquide. .
Les systèmes cellulaires in vitro utilisés pour réaliser les tests peuvent être des cellules respiratoires primaires humaines.
Description détaillée de l'invention
L'invention est décrite plus en détail ci-après au moyen d'exemples illustrés par les figures suivantes : Figure 1 : Le composé destiné à être testé sous forme de poudre (1 ) et l'excipient sous forme de poudre (2) sont préalablement pesés. Ainsi, on peut faire un mélange de ces deux poudres dans un rapport de quantités prédéfini.
Figure 2 : Les deux poudres sont mélangées puis broyées énergiquement jusqu'à obtention d'un mélange homogénéisé. L'opération peut se faire de façon mécanique et automatisée.
Figure 3 : Le mélange homogénéisé est placé dans une presse.
Figure 4 : Le mélange homogénéisé est pressurisé à l'aide d'une presse pour obtenir une pastille solide compressée. Figure 5 : La pastille est récupérée, puis pesée. La pastille peut être découpée pour obtenir la masse et/ou la forme désirée.
Figure 6 : La pastille est appliquée sur un système de culture cellulaire in vitro. Figure 7 : La pastille commence à se dissoudre. Figure 8 : La pastille est dissoute. De façon pratique, le composé destiné à être testé ainsi que l'excipient sont pesés séparément (Figure 1 ) puis mélangés vigoureusement, manuellement ou mécaniquement, afin d'obtenir un mélange homogénéisé contenant une quantité connue de la molécule (ou mélange) à tester (Figure 2). Le mélange homogénéisé obtenu est ensuite compressé (Figures 3 et 4) à l'aide d'une presse pour obtenir une pastille solide compressée. Tout type de presse peut être utilisé. L'opération peut se faire de façon mécanique et automatisée.
La pastille solide obtenue (Figure 5) peut être ensuite découpée selon la forme désirée, puis pesée afin de connaître la masse exacte de l'excipient et du composé destiné à être testé. La pastille est alors prête à être déposée et est directement utilisable sur des animaux ou des systèmes cellulaires in vitro ou ex vivo. La pastille est appliquée sur un système cellulaire in vitro (Figure 6). Les cellules du système cellulaire peuvent être cultivées en condition de culture submergée ou à l'interface air- liquide. La pastille contenant le composé à tester se dissout et une étape de test de ce composé peut être entreprise.
Différents pastilles ont été réalisées pour tester, entre autre, l'effet de produits chimiques (Sodium Dodecyl sulfate, Ammonium Hexachloroplatinate, CaCI2, NaCI, Naphtalene, etc.), de produits cosmétiques (extraits de plantes, émulsifiants, etc .), de produits pharmaceutiques (formulations solides, principes actifs, etc .), de nanoparticules (FeO, Ce02, etc .), de produits métallurgiques (Ni, Fe, Zn, etc.). Les excipients suivants on été testés : dextran b 1 355; dextran b 1 355 s; dextran b-1 355; dextran b1355; dextran b-1 355-s; dextran b51 2; dextran m 70; dextran t 40; dextran t 500; dextran t 70; dextran t-40; dextran t-500; dextran 40; dextran 40000; dextran 60 ; dextran 70; dextran 75; dextran 80, Mannitol, Lactose. Des pastilles contenant une quantité de substance à tester de 10 milligrammes à 1 femtogramme ont été préparées.
Procédé de préparation
Exemple 1
Le Sodium Dodecyl sulfate (5 mg) est mélangé à du dextran 60 (495 mg) dans un rapport 1 %. Le mélange A1 obtenu est broyé dans un mortier puis le mélange homogénéisé est comprimé à l'aide d'une presse pour former une pastille contenant 1 % de Sodium Dodecyl sulfate.
Le mélange solide A1 (20 mg) est mélangé à du dextran 60 (1 80 mg) dans un rapport 1 0%. Le mélange A2 obtenu est broyé dans un mortier puis le mélange homogénéisé est comprimé à l'aide d'une presse pour former une pastille contenant 0, 1 % de Sodium Dodecyl sulfate.
Exemple 2
L'Ammonium Hexachloroplatinate (5 mg) est mélangé à du dextran 60 (245 mg) dans un rapport 2%. Le mélange B1 obtenu est broyé dans un mortier puis le mélange homogénéisé est comprimé à l'aide d'une presse pour former une pastille contenant 2% d'Ammonium Hexachloroplatinate.
Le mélange solide B1 (20 mg) est mélangé à du dextran 60 (180 mg) dans un rapport 10%. Le mélange B2 obtenu est broyé dans un mortier puis le mélange homogénéisé est comprimé à l'aide d'une presse pour former une pastille contenant 0,2% d'Ammonium Hexachloroplatinate.
Exemple 3
L'Oxyde de Fer (FeO) (5 mg) est mélangé à du dextran 60 (995 mg) dans un rapport 0,5% (mélange solide C1 ). Le mélange C1 obtenu est broyé dans un mortier puis le mélange homogénéisé est comprimé à l'aide d'une presse pour former une pastille contenant 0,5% d'oxyde de Fer.
Le mélange solide C1 (10 mg) est mélangé à du dextran 60 (990 mg) dans un rapport 1 % (mélange solide C2). Le mélange C2 obtenu est broyé dans un mortier puis le mélange homogénéisé est comprimé à l'aide d'une presse pour former une pastille contenant 0,005% d'oxyde de Fer.
Utilisation du bloc compressé
Les blocs compressés ont été appliqués directement sur des systèmes cellulaires ou dans du milieu de culture. Diverses études utilisant ces blocs on été conduites pour tester l'effet toxique (évaluation de la cytotoxicité, viabilité cellulaire et intégrité tissulaire par relargage de LDH, transformation de Resazurin, test MTT et mesure de Résistance Trans Epithéliale), l'effet sur le battement ciliaire (fréquence du battement ciliaire, clairance mucociliaire), l'effet sur le transport trans-epithelial (perméabilité), l'effet sur la modulation de canaux ioniques (chambres de Ussing) l'effet sur la modulation de facteurs solubles (cytokines, chémokines, metalloproteinases), l'effet sur la production de mucus (test ELLA).
Il va sans dire que l'invention n'est pas limitée aux exemples illustrés ci-dessus.

Claims

Revendications
Procédé de préparation d'au moins un composé destiné à être testé dans une gamme de concentration ou de masse allant du pur jusqu'aux masses les plus faibles tel le femto gramme, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
i) Mélange dudit composé avec un excipient inerte dans un rapport de quantités prédéfini,
ii) Homogénéisation dudit mélange,
iii) Fabrication d'un bloc par compression dudit mélange homogénéisé.
Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit bloc est une pastille.
Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que ledit bloc est hydrosoluble.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit composé est non ou peu hydrosoluble.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit excipient est un polysaccharide issu de la famille du Dextran.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de broyage dudit mélange homogénéisé préalablement à l'étape de fabrication dudit bloc.
Bloc compressé comprenant un excipient sous la forme solide et d'au moins un composé, ledit bloc étant fabriqué selon l'une des revendications 1 à 6.
8. Bloc compressé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est sous la forme d'une pastille.
9. Utilisation d'un bloc compressé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 8 comprenant au moins un composé et un excipient inerte pour tester l'effet ou la toxicité dudit composé sur un système cellulaire, comprenant une étape dans laquelle on dissout ledit bloc dans un milieu aqueux comprenant ledit système cellulaire puis une étape de test dudit composé dans ledit milieu.
10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit système cellulaire est un système cellulaire in vitro dont les cellules sont cultivées en condition de culture submergée ou à l'interface air/milieu aqueux.
1 1 . Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit système cellulaire est un système de cellules respiratoires primaires humaines.
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