WO2012026850A1 - Method for the rapid determination of blood atherogenicity - Google Patents

Method for the rapid determination of blood atherogenicity Download PDF

Info

Publication number
WO2012026850A1
WO2012026850A1 PCT/RU2011/000620 RU2011000620W WO2012026850A1 WO 2012026850 A1 WO2012026850 A1 WO 2012026850A1 RU 2011000620 W RU2011000620 W RU 2011000620W WO 2012026850 A1 WO2012026850 A1 WO 2012026850A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mmlp
pvp
serum
blood
buffer
Prior art date
Application number
PCT/RU2011/000620
Other languages
French (fr)
Russian (ru)
Inventor
Батожаб Батожаргалович ШОЙБОНОВ
Валерия Юрьевна БАРОНЕЦ
Леонид Федорович ПАНЧЕНКО
Аслан Амирханович КУБАТИЕВ
Original Assignee
Учреждение Российской Академии Медицинских Наук Нии Общей Патологии И Патофизиологии Рамн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Учреждение Российской Академии Медицинских Наук Нии Общей Патологии И Патофизиологии Рамн filed Critical Учреждение Российской Академии Медицинских Наук Нии Общей Патологии И Патофизиологии Рамн
Priority to EA201200991A priority Critical patent/EA201200991A1/en
Publication of WO2012026850A1 publication Critical patent/WO2012026850A1/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/323—Arteriosclerosis, Stenosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the invention relates to clinical biochemistry, and can be used for rapid diagnosis of atherosclerosis at the preclinical stage.
  • Atherosclerosis is a chronic autoimmune disease of the arteries that occurs as a result of lipid metabolism disturbance and is accompanied by the deposition of lipids and macrophages in the intimal-medial layer of blood vessels. Deposits form in the form of atheromatous plaques. Subsequent growth of connective tissue in them (sclerosis), and calcium deposition lead to deformation and narrowing of the lumen of the arteries up to clogging. Every year, statistics inexorably notes an increase in indicators of morbidity and mortality from cardiovascular diseases, and in the first place, such as stroke and myocardial infarction. According to the forecast of the World Health Organization, mortality in the world from cardiovascular diseases by 2020 may reach 25 million people per year. Currently, against the backdrop of rapid progress in the development of new drugs for the treatment of atherosclerosis, there is an urgent need for new markers of atherogenesis, which could become a kind of measure of the effectiveness of the tested drugs and significantly reduce the test time.
  • Atherosclerotic plaques The formation of atherosclerotic plaques, platelet adhesion, the threat of thrombosis - a “pre-thrombotic” condition in atherosclerosis.
  • Violation of the blood supply to organs and tissues coronary heart disease, brain, acute myocardial infarction, strokes, etc.).
  • Atherosclerosis is made at stage 5, when a relatively healthy person aged 40 - 50 years develops complications of undiagnosed atherosclerosis in the form of acute stroke or myocardial infarction.
  • Modified (oxidized) lipoproteins are one of the key factors in atherosclerosis leading to cardiovascular disease (CVD), the leading cause of death in developed countries. Most CVDs are due to coronary arteriosclerosis.
  • CVDs cardiovascular disease
  • One of the key points in the pathogenesis of atherosclerosis is the intracellular accumulation of lipids in the proteoglycan layer of the intima of the arteries.
  • Low density lipoproteins isolated from the blood of patiens with coronary heart disease induce the accumulation of lipids in human aortic cells // Exp. Mol. Pathol.-1989.-V.50.-P.337-347).
  • mmLP multi-modified low-density lipoproteins
  • mmLP have a low content of sialic acids, mannose and other monosaccharides. It was shown that mmLP selectively bind and activate the C1 component of the complement system (Biro A., Thielens NM, Cervenak L., et al. Modified low density lipoproteins differentially bind and activate the CI complex of complement // Mol. Immunol.-2007.- V. 44, N ° 6 - P. l 169-1177). Oxidation-Modified Low Density Lipoproteins (OHLPs) are immunogenic and induce autoimmune response in humans.
  • OHLPs Oxidation-Modified Low Density Lipoproteins
  • Autoantibodies to oXLP are predominantly pro-inflammatory IgGl and IgG3 isotypes and, when the immune complex is formed, activate the classical complement system pathway and trigger phagocytosis by cells expressing Fey receptors (Saad AF, Virella G., Chassereau C, et al. OxLDL immune regulate complement and induce cytokine production by MonoMac 6 cells and human macrophages // J. Lipid Res - 2006.-V.47.-P.1875- 1983).
  • modified oxidized lipoproteins are enzyme-linked immunosorbent assays using monoclonal antibodies to oxLP, MDA-modified drugs, excessively glycosylated drugs ([Virella G., Derrick M.V., Pate V., et al. Development of capture assay for different modification of human low-density lipoprotein // Clinical and Diagnostic Lab. Immunol. 2005. -V. 12, jVe 1.- P.68-75).
  • reagent which is a mixture of 6 components: 0.2 M potassium phosphate, 0.12 M potassium iodide, 0.1 mM sodium azide, 2 g / l polyethylene glycol, 0.1 g / l alkylbenzyldimethylammonium chloride, HMM ammonium molybdate), 24 ⁇ M ethylenediaminetetraacetic acid, 20 ⁇ M butylated hydroxytoluene).
  • reagent which is a mixture of 6 components: 0.2 M potassium phosphate, 0.12 M potassium iodide, 0.1 mM sodium azide, 2 g / l polyethylene glycol, 0.1 g / l alkylbenzyldimethylammonium chloride, HMM ammonium molybdate
  • 24 ⁇ M ethylenediaminetetraacetic acid 20 ⁇ M butylated hydroxytoluene
  • LDL must be isolated from serum by ultracentrifugation. This operation takes a total of about 2 days;
  • Isolated LDL must be dialyzed from excess NaBr added during the isolation period for at least 8 hours;
  • the commercial preparation proposed in the prototype is a mixture of 6 reagents and is manufactured by Merk (Germany), Katal. No 14106.
  • the disadvantage of this method is the complexity, high cost, complexity, duration of the study (more than 2 days).
  • the objective of the invention is to develop a method that eliminates the above disadvantages, expanding the arsenal of methods for the early diagnosis of atherosclerosis for clinical diagnostic laboratories due to the simplification of technology, reducing the time of the procedure (up to 10 min), as well as its multiple cost reduction.
  • the problem is solved by adding a solution of polyvinylpyrrolidone (PVP) to human blood serum, determining the degree of turbidity of the serum solution by the turbidimetric method and calculating the content [mmLP] using the formula below.
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • the technical result obtained by the implementation of the invention is to expand the arsenal of reagents for the specific aggregation of mmLP, obtain a test system to determine the level of [mmLP], simplify, reduce the duration of the research procedure, as well as reduce its cost.
  • Buffer-1 for aggregation of mmLP is prepared by dissolving 10 g of PVP (relative molecular weight of 12600 ⁇ 2700) in 100 ml of 0.01 M Tris-HCl buffer, pH 7.4, containing 0.1 M NaCl. Buffer-2 differs from Buffer-1 in the absence of PVP. Buffer-1 is added to blood serum, mixed thoroughly, incubated, the degree of turbidity is measured spectrophotometrically and the level of [mmLP] is calculated by the formula: [mmLP], ED - [ ⁇ réelle - ⁇ ⁇ ] ⁇ 100, where:
  • [mmLP] the level of mmLP content in the experimental sample in arbitrary units (UNITS);
  • E is the optical density of the control sample, serum with the appropriate amount of buffer-2 without PVP (control buffer), units opt. pl .;
  • Example 1 Determination of the optimal concentration of PVP for the precipitation of mmLP in the blood serum of patients with cardiovascular diseases. 100-500 ⁇ l of a 10% solution of PVP in 0.01 M Tris-HC1 buffer, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl, is added to 50 ⁇ l of the pulled blood serum from 10 patients with cardiovascular diseases (CVD). mix thoroughly and incubate at room temperature for 10 min in 9 well flat-bottomed cuvettes of the FP-901 biochemistry analyzer (Labsystem, Finland). The degree of turbidity is determined turbidimetrically at a wavelength of 450 nm. Serum samples with an appropriate amount of 0.01 M Tris-HC1 buffer, pH 7.4, containing 0, 15 M NaCl are used as the blank.
  • Example 2 Determination of cholesterol, triacylglyceride (TAG) and total proteins in PVP precipitates.
  • TAG triacylglyceride
  • the following experiments were performed to confirm the presence of mmLP in PVP precipitates. From 0.5 ml of the pulled serum of patients with coronary heart disease and control healthy donors, PVP precipitates were prepared under conditions of 8.9% PVP. The precipitate was precipitated by centrifugation at 6000 rpm for 20 min at 23 ° C. The supernatant was carefully decanted, the PVP precipitate was washed 2 times with 8.9%) PVP solution and resuspended in 0.5 ml of 0.01 M Tris-HC1 buffer, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl. In the obtained PVP precipitates, the content of cholesterol, TAG, and total proteins was determined using reagents of the company Deacon-DS, Russia. The results are presented in table 3.
  • the cholesterol content in the PVP-precipitate of the pulsed serum of patients with coronary heart disease is 12 times higher, and the TAG is 16 times higher than in the PVP-precipitate from healthy donor serum.
  • the total protein content is 1, 3 times higher in PVP-precipitate patients.
  • Example 3 The selection of the optimal incubation time of a mixture of serum with PVP for the aggregation of mmLP. 400 ⁇ l of a 10% solution of PVP in 0.01 M Tris-HC1 buffer, pH 7.4 containing 0.15 M NaCl is added to 50 ⁇ l of the pulled serum of patients with coronary artery disease and healthy donors, and they are thoroughly mixed and incubated at room temperature for 10, 20 , 30 and 60 min in 9 well flat-bottomed cuvettes of biochemical analysis of the torus FP-901 ("Labsystem", Finland). The degree of turbidity is determined turbidimetrically at a wavelength of 450 nm.
  • Serum samples with an appropriate amount of 0.01 M Tris-HC1 buffer, pH 7.4, containing 0.1 M NaCl are used as the blank.
  • the results are shown in table 4.
  • the aggregation of mmLP proceeds for a maximum of 10 minutes. With further incubation, there is a slight aggregation of the residual amount of mmLP (approximately 8%).
  • the level of mmLP in the pulsed serum of healthy donors during an incubation of 60 min remains unchanged at the level of 8.3 PIECES.
  • Example 4 Determination of complement binding of guinea pig with mmLP precipitates as a function of concentration.
  • a solution of PVP-precipitate (4.3 mg / ml protein) prepared from the pulled serum of patients with coronary artery disease and diluted 1: 99 with VBS buffer.
  • 20 ⁇ l of a solution diluted 1: 19 of guinea pig complement are added.
  • the total volume was adjusted to 0.3 ml with VBS 2+ buffer and incubated for 20 min at 37 ° C.
  • 200 ⁇ l of sheep erythrocytes sensitized with rabbit antibodies (EA) were added and incubated for 30 min at 37 ° C.
  • mmLP precipitated in a solution of 8.9% PVP have complement-binding ability, and the effect is dose-dependent.
  • concentration of PVP 8.9%>
  • a decrease in the amount of precipitated cholesterol, TAG, proteins, as well as a complement of the binding activity of PVP precipitates is observed in the system (data not shown).
  • the determination of the complement-binding ability of the PVP precipitate indicates the presence of mmLP and the specific interaction of mmLP with the complement of guinea pig.
  • the determination of cholesterol, TAG and total proteins in the PVP precipitate at a concentration of 8.9%), as well as the maximum complement-binding ability confirms the optimal concentration of 8.9% PVP in the system for the specific aggregation of mmLP from the serum of patients with atherosclerotic disease.
  • Example 5 The effect of mmLP on platelet aggregation.
  • mmLPs were prepared under 8.9% PVP conditions as described in Example 2.
  • blood was obtained from the marginal vein of the rabbit ear in a 3.8% sodium citrate solution (9: 1 by volume). Centrifuged blood at 150 g for 10 min. The supernatant, which is a platelet-rich plasma (BTP) of blood, was used to analyze platelet aggregation.
  • BTP platelet-rich plasma
  • Platelet aggregation studies were carried out according to the Born method (Born GV Aggregation of blood platelets by ADP and its reversal // Nature. - 1962. - V. 194. - P.
  • O'Brien JR Platelet aggregation Part I
  • O'Brien JR Platelet aggregation Part II
  • Some resalts from a new method of study // J. Clin. Path. - 1962. - V.15, J4S 5 - P. 452-455 Some resalts from a new method of study // J. Clin. Path. - 1962. - V.15, J4S 5 - P. 452-455
  • the principle of the method is based on a change in the optical density of BTP upon the addition of aggregation inductors. During aggregation, the platelet suspension becomes more transparent and, due to a decrease in optical density, the light transmission increases. This is graphically displayed by the deviation of the curve from the zero line (0% aggregation) to 100% aggregation.
  • the degree of platelet aggregation under the action of mmLP was characterized by the value of V op / V k , where V op and B k are the change in light transmission of platelet-rich plasma containing mmLP and the control sample, respectively.
  • V op and B k are the change in light transmission of platelet-rich plasma containing mmLP and the control sample, respectively.
  • the PVP precipitate prepared from the serum of patients with coronary artery disease causes platelet hyperreactivity.
  • Example 6 The effect of concentration and incubation time mmLP on platelet aggregation. Definition: 0.25 ml of TBP was placed in an aggregometer cuvette, heated to 37 ° C for 1 min with constant stirring, and 0% aggregation was set. Increasing concentrations of mmLP preparation prepared from the serum of patients with coronary artery disease were added to the experimental sample, they were additionally incubated for 4 min and platelet aggregation was performed by the introduction of an ADP inducer (final concentration of 1.25 ⁇ M). Aggregation for 5 minutes was recorded. The results are presented in table 7.
  • the effect of enhancing platelet aggregation under the influence of mmLP 1) depends on the concentration, and the effect of saturation is observed; 2) preliminary incubation is practically not required for the binding of mmLP to platelets, which indicates a very high affinity and is most likely associated with the interaction of mmLP with scavenger receptors on the platelet membrane.
  • Example 7 The effect of serum storage on the level of mmLP.
  • the level of mmLP was determined by the proposed method on the day of blood sampling and after 7 days of storage at 4 ° C in the serum of patients with coronary artery disease and healthy donors. The results are presented in table 8.
  • the degree of turbidity was determined turbidimetrically at a wavelength of 450 nm. Serum samples with an appropriate amount of buffer-2 (0.01 M Tris-HCl buffer, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl) were used as a blank. The levels of [mmLP] were calculated using the formula above. The results are shown in table 9.
  • the level of [mmLP] ranged from 1.1 to 9.9 units. and the average value was 4.59 ⁇ 2.58.
  • the content [mmLP] ranged from 9.9 to 37.1 units. and the average value was 21, 26 ⁇ 10.64 UE, which is 4.6 times more than the normal indicator. It should be noted that when using other biochemical analyzers in each laboratory, the range of normal values [mmLP] for the examined population should be specified.
  • mmLP have a pro-inflammatory effect due to the binding and activation of the complement system; b) mmLPs have a thrombogenic effect due to platelet hyperaggregation.
  • Example 9 Determination by rapid method of the optimal concentration of PVP to detect atherogenic plasma of patients with cardiovascular diseases.
  • citrated blood plasma of a person For the development of rapid determination used citrated blood plasma of a person. To 50 ⁇ l of the pulsed blood plasma from 10 patients with coronary heart disease (CHD), 100-800 ⁇ l of a 10% solution of PVP in 0.01 M Tris-HC1 buffer, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl are added. mix thoroughly and incubate at room temperature for 10 minutes. The degree of turbidity of the solution is determined visually in comparison with the control sample and is estimated as weak turbidity - (+) and strong - (++++). As a control, use blood plasma samples with the appropriate amount buffer not containing PVP, and evaluated as - (-). The results are shown in table 10.
  • Example 10 Rapid determination of blood atherogenicity in patients with coronary heart disease and healthy donors.
  • Studies of the atherogenicity of blood plasma by the proposed express method were performed in 64 patients with coronary heart disease with instrumentally confirmed coronary artery atherosclerosis and 60 healthy donors (control group).
  • 400 ⁇ l of buffer-1 (10% PVP in 0.01 M Tris-HCl buffer, pH 7.4 containing 0, 15 M NaCl) was added to 50 ⁇ l of the studied blood plasma, thoroughly mixed and incubated at room temperature for 10 min in transparent test tubes. The degree of turbidity (atherogenicity) was determined visually in comparison with the control sample.
  • As a control used plasma samples with the appropriate amount buffer-2 (0.01 M Tris-HC1 buffer, pH 7.4, containing 0.1 M NaCl). The results are shown in table 12.
  • Example 11 The study of blood atherogenicity in 750 employees of the company "MOSENERGO" undergoing a routine medical examination. During the medical examination, blood was examined for glucose and lipid profile. Additionally, all employees were examined for blood atherogenicity by the developed method. Blood atherogenicity was detected in 288 (38.4%) relatively healthy employees. From the group with atherogenic blood (elevated mmLP), 21 people under the age of 40 years with normal lipid profiles were selected for further instrumental examination for changes in the intimal-medial layer of the carotid arteries. To assess the condition of the wall of the carotid arteries, high-resolution ultrafonography was used in the B mode using a linear vascular sensor with a frequency of 7.5 MHz.
  • the examination protocol included scanning the left and right carotid arteries and the area of the carotid sinus with focusing on the posterior wall of the arteries in three fixed projections - anterolateral, lateral and posterolateral. The examination was carried out in a prone position after a 15-minute rest. All measurements were performed sequentially for one session. The scanning procedure was recorded on a super-VHS PAL high-definition video recorder. Records were analyzed by a certified operator. The thickness of the intimal-medial layer of the carotid arteries was measured using the Prosound computer program (R. Seltzer, USA). The measurement was carried out on a section of the common carotid artery 10 mm long, opposite the beginning of the carotid sinus.
  • the thickness of the intimal-medial layer of the posterior wall of the common carotid artery was determined as the distance from the leading edge of the first echogenic zone to the leading edge of the second echogenic zone.
  • the average value of three measurements was considered as an integral indicator of the intimal-medial layer thickness.
  • the developed express method for determining blood atherogenicity allows one to detect earlier pre-atherosclerotic conditions at the stage of morphological changes in the intimal-medial layer of the carotid arteries. Subsequently, persons with instrumentally confirmed carotid atherosclerosis arteries were instrumentally examined for coronary arteriosclerosis and coronary arteriosclerosis was not detected.
  • the proposed method is simple, includes only 2 operations: mixing serum with a solution of PVP and registration of turbidity. To prepare the buffer, widespread reagents are needed: PVP, NaCl, and Tris-HCl.
  • PVP polyvinyl
  • NaCl aqueous cellulose
  • Tris-HCl aqueous cellulose
  • the method allows to detect the presence of mmLP directly in serum without prior fractionation. The method is fast (10 min for 1 analysis).
  • the use of a simple and quick method for determining blood atherosclerosis makes it possible to identify preclinical conditions of atherosclerosis, can serve as a specific biochemical marker for the treatment of atherosclerotic diseases, allows for an in-depth study of the pathogenesis of atherosclerosis, enables their early prevention and allows monitoring the effectiveness of the therapy.
  • the content of cholesterol, TAG and proteins in PVP-precipitates prepared from the pulled blood serum of patients with coronary artery disease and healthy donors
  • mmLP Atherogenicity

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

The invention relates to clinical biochemistry and can be used for the rapid determination of blood atherogenicity by means of the aggregation of multiply modified blood lipoproteins. The multiply modified lipoproteins are aggregated in a buffer containing 10% PVP 12600 at a plasma:buffer ratio of 1:8. The method detects the preclinical stages of atherosclerosis prior to morphological changes in the intima-media complex of the brachio-cephalic arteries. The proposed testing system can also be used for monitoring the effectiveness of the treatment of atherosclerotic diseases.

Description

СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЯ АТЕРОГЕННОСТИ  METHOD FOR EXPRESS DETERMINATION OF ATEROGENICITY
КРОВИ  BLOOD
Изобретение относится к клинической биохимии, и может быть использовано для экспресс-диагностики атеросклероза на доклинической стадии.  The invention relates to clinical biochemistry, and can be used for rapid diagnosis of atherosclerosis at the preclinical stage.
Атеросклероз - хроническое аутоиммунное заболевание артерий, возникающее вследствие нарушения липидного обмена и сопровождающееся отложением липидов, макрофагов в интимо- медиальном слое сосудов. Отложения формируются в виде атероматозных бляшек. Последующее разрастание в них соединительной ткани (склероз), и отложение кальция приводят к деформации и сужению просвета артерий вплоть до закупорки. С каждым годом статистика неумолимо констатирует рост показателей заболеваемости и смертности от сердечно-сосудистых заболеваний, и в первую очередь, таких как инсульт и инфаркт миокарда. По прогнозу Всемироной организации здравоохранения смертность в мире от сердечно-сосудистых заболеваний к 2020 году может составить 25 млн человек в год. В настоящее время на фоне стремительного прогресса в разработке новых препаратов для лечения атеросклероза возникла острая потребность в новых маркерах атерогенеза, которые могли бы стать своеобразным мерилом эффективности испытуемых препаратов и существенно сократили бы сроки испытаний. Atherosclerosis is a chronic autoimmune disease of the arteries that occurs as a result of lipid metabolism disturbance and is accompanied by the deposition of lipids and macrophages in the intimal-medial layer of blood vessels. Deposits form in the form of atheromatous plaques. Subsequent growth of connective tissue in them (sclerosis), and calcium deposition lead to deformation and narrowing of the lumen of the arteries up to clogging. Every year, statistics inexorably notes an increase in indicators of morbidity and mortality from cardiovascular diseases, and in the first place, such as stroke and myocardial infarction. According to the forecast of the World Health Organization, mortality in the world from cardiovascular diseases by 2020 may reach 25 million people per year. Currently, against the backdrop of rapid progress in the development of new drugs for the treatment of atherosclerosis, there is an urgent need for new markers of atherogenesis, which could become a kind of measure of the effectiveness of the tested drugs and significantly reduce the test time.
В развитии атеросклероза четко прослеживается следующая последовательность событий (стадии): 1. Повышение уровня окисленных (модифицированных, атерогенных) липопротеинов в крови; 2. Дисфункция эндотелия в виде утолщения интимо-медиального слоя артерий; 3. Аутоиммунная реакция организма (образование антител к атерогенным липопротеинам), повышение уровня содержания иммунных комплексов, содержащих модифицированные липопротеины; 4. Иммунные нарушения, сопровождающиеся нарушением выведения иммунных комплексов, появление в крови макрофагов, «фаршированных» иммунными комплексами, содержащими модифицированные липопротеины («Пенистые» клетки); 5. Формирование атеросклеротических бляшек, адгезия тромбоцитов, угроза тромбоза - «предтромботическое» состояние при атеросклерозе. Нарушение кровоснабжения органов и тканей (ишемическая болезнь сердца, мозга, острые инфаркты миокарда, инсульты и т.д.). The following sequence of events (stages) can be clearly seen in the development of atherosclerosis: 1. An increase in the level of oxidized (modified, atherogenic) lipoproteins in the blood; 2. Endothelial dysfunction in the form of a thickening of the intimal-medial layer of arteries; 3. Autoimmune reaction of the body (the formation of antibodies to atherogenic lipoproteins), an increase in the level of immune complexes containing modified lipoproteins; 4. Immune disorders accompanied by impaired elimination of immune complexes, the appearance in the blood of macrophages "stuffed" with immune complexes containing modified lipoproteins ("Foamy"cells); 5. The formation of atherosclerotic plaques, platelet adhesion, the threat of thrombosis - a “pre-thrombotic” condition in atherosclerosis. Violation of the blood supply to organs and tissues (coronary heart disease, brain, acute myocardial infarction, strokes, etc.).
Чаще всего диагноз атеросклероз выставляется на 5 стадии, когда у относительно здорового человека в возрасте 40 - 50 лет развивается осложнения не диагностированного атеросклероза в виде острого инсульта или инфаркта миокарда. Most often, the diagnosis of atherosclerosis is made at stage 5, when a relatively healthy person aged 40 - 50 years develops complications of undiagnosed atherosclerosis in the form of acute stroke or myocardial infarction.
Модифицированные (окисленные) липопротеины являются одним из ключевых факторов атеросклероза, приводящего к возникновению сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) - основной причины смертности в развитых странах. Большинство ССЗ являются следствием атеросклероза коронарных артерий. Одним из ключевых моментов патогенеза атеросклероза является внутриклеточное накопление липидов в протеогликановом слое интимы артерий. В экспериментах in vitro показано, что химическая модификация липопротеинов низкой плотности (ацетилирование, обработка малоновым диальдегидом, окисление ионами металлов переменной валентности, избыточное гликозилирование и т.д.) приводит к накоплению липидов в культивируемых клетках эндотелия и макрофагах (Brown M.S., Fogelman J.L. Lipoprotein metabolism in the macrophage: implications for cholesterol deposition in atherosclerosis // Annu. Rev. Biochem. - 1983.-V. 52.-223-261 ; Lopes-Virella M.F., Klein R.L., Lyons T.J., Stevenson H.C., Witztum J.L. In vitro glycosylated LDL enhances cholesteryl ester synthesis and accumulation in human monocyte-derived macrophages // Diabetes.-1988.-V.37 -P.550- 557). Способность патологической сыворотки вызывать накопление липидов в эндотелиальных клетках определяют как атерогенность крови. Показано, что атерогенные свойства модифицированных липопротеинов низкой плотности (мЛП) связаны с образованием ассоциатов мЛП (Tertov V.V., Orekhov A.N., Martsenyuk O.N., et al. Low density lipoproteins isolated from the blood of patiens with coronary heart disease induce the accumulation of lipids in human aortic cells // Exp. Mol. Pathol.-1989.-V.50.-P.337-347). После установления факта атерогенности модифицированных in vitro липопротеинов, в сыворотке крови больных с ишемической болезнью сердца (ИБС) были обнаружены циркулирующие множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ммЛП) (Orekhov A..N., Tertov V.V., Mukhin D.N., et al. Insolubilization of low density lipoprotein induces cholesterol accumulation in cultured subendothelial cells of human aorta // Atherosclerosis.-1989.-V.79.-P.59-70; Tertov V.V., Sobenin I. A., Tonevitsky A.G., et al. Isolation of atherogenic modified (desialylated) low density lipoprotein from blood of atherosclerotic patiens: separation from native lipoprotein by affinity chromatography // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1990.-V.167.-P. l 122- 1 127), значительно отличающиеся от нативных по физико-химическим свойствам. Так, ммЛП имеют пониженное содержание сиаловых кислот, маннозы и других моносахаридов. Показано, что ммЛП избирательно связывают и активируют С1 компонент системы комплемента (Biro A., Thielens N.M., Cervenak L., et al. Modified low density lipoproteins differentially bind and activate the CI complex of complement // Mol. Immunol.-2007.-V.44,N°6 - P. l 169-1177). Модифицированные окислением липопротеины низкой плотности (охЛП) являются иммуногенными и индуцируют з аутоиммунный ответ у людей. Аутоантитела к охЛП являются преимущественно про-воспалительными IgGl и IgG3 изотипами и при образовании иммунного комплекса активируют классический путь системы комплемента и запускают фагоцитоз клетками, экспрессирующими Fey рецепторы (Saad A.F., Virella G., Chassereau С, et al. OxLDL immune complexes activate complement and induce cytokine production by MonoMac 6 cells and human macrophages // J. Lipid Res - 2006.-V.47.-P.1875- 1983). Одним из наиболее патогенных свойств охЛП является взаимодействие с тромбоцитами, приводящее к их гиперреактивности (Korporaal S.J. A., Gorter G., van Rijn H.J.M., Akkerman J- W.N. Effect of oxidation on the platelet-activating properties of low-density lipoprotein // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.-2005.-V.25 - P.867-872) и к сосудистому воспалению (Daub К., Seizer P., Stellos К., et al. Oxidized LDL-activated platelets induce vascular inflammation // Semin. Thromb. Hemost.-2010.-V. 36, JVfe 2.-P.146-156). Modified (oxidized) lipoproteins are one of the key factors in atherosclerosis leading to cardiovascular disease (CVD), the leading cause of death in developed countries. Most CVDs are due to coronary arteriosclerosis. One of the key points in the pathogenesis of atherosclerosis is the intracellular accumulation of lipids in the proteoglycan layer of the intima of the arteries. In vitro experiments have shown that chemical modification of low-density lipoproteins (acetylation, malondialdehyde treatment, oxidation by metal ions of variable valency, excessive glycosylation, etc.) leads to the accumulation of lipids in cultured endothelial cells and macrophages (Brown MS, Fogelman JL Lipoprotein metabolism in the macrophage: implications for cholesterol deposition in atherosclerosis // Annu. Rev. Biochem. - 1983.-V. 52.-223-261; Lopes-Virella MF, Klein RL, Lyons TJ, Stevenson HC, Witztum JL In vitro glycosylated LDL enhances cholesteryl ester synthesis and accumulation in human monocyte-derived macrophages // Diabetes.-1988.-V.37 -P.550-557). The ability of pathological serum to cause lipid accumulation in endothelial cells is defined as blood atherogenicity. The atherogenic properties of modified low density lipoproteins (MLPs) have been shown to be associated with the formation of MLP associates (Tertov VV, Orekhov AN, Martsenyuk ON, et al. Low density lipoproteins isolated from the blood of patiens with coronary heart disease induce the accumulation of lipids in human aortic cells // Exp. Mol. Pathol.-1989.-V.50.-P.337-347). After the fact of atherogenicity of modified in vitro lipoproteins was established, circulating, multi-modified low-density lipoproteins (mmLP) were found in the blood serum of patients with coronary heart disease (IHD) (Orekhov A.N., Tertov VV, Mukhin DN, et al. Insolubilization of low density lipoprotein induces cholesterol accumulation in cultured subendothelial cells of human aorta // Atherosclerosis.-1989.-V.79.-P.59-70; Tertov VV, Sobenin IA, Tonevitsky AG, et al. Isolation of atherogenic modified (desialylated ) low density lipoprotein from blood of atherosclerotic patiens: separation from native lipoprotein by affinity chromatography // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1990.-V.167.-P. l 122-1 1 127), significantly different from native s on physical and chemical properties. So, mmLP have a low content of sialic acids, mannose and other monosaccharides. It was shown that mmLP selectively bind and activate the C1 component of the complement system (Biro A., Thielens NM, Cervenak L., et al. Modified low density lipoproteins differentially bind and activate the CI complex of complement // Mol. Immunol.-2007.- V. 44, N ° 6 - P. l 169-1177). Oxidation-Modified Low Density Lipoproteins (OHLPs) are immunogenic and induce autoimmune response in humans. Autoantibodies to oXLP are predominantly pro-inflammatory IgGl and IgG3 isotypes and, when the immune complex is formed, activate the classical complement system pathway and trigger phagocytosis by cells expressing Fey receptors (Saad AF, Virella G., Chassereau C, et al. OxLDL immune regulate complement and induce cytokine production by MonoMac 6 cells and human macrophages // J. Lipid Res - 2006.-V.47.-P.1875- 1983). One of the most pathogenic properties of oXLP is interaction with platelets leading to their hyperreactivity (Korporaal SJA, Gorter G., van Rijn HJM, Akkerman J-WN Effect of oxidation on the platelet-activating properties of low density lipoprotein // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.-2005.-V.25 - P.867-872) and to vascular inflammation (Daub K., Seizer P., Stellos K., et al. Oxidized LDL-activated platelets induce vascular inflammation // Semin Thromb. Hemost.-2010.-V. 36, JVfe 2.-P.146-156).
Наиболее разрабатываемыми методами определения модифицированных окисленных липопротеинов являются иммуноферментные тесты с использованием моноклональных антител к охЛП, МДА-модифицированным ЛП, избыточно гликозилированным ЛП ([Virella G., Derrick М.В., Pate V., et al. Development of capture assay for different modification of human low-density lipoprotein // Clinical and Diagnostic Lab. Immunol.- 2005. -V. 12, jVe 1.- P.68-75). The most developed methods for the determination of modified oxidized lipoproteins are enzyme-linked immunosorbent assays using monoclonal antibodies to oxLP, MDA-modified drugs, excessively glycosylated drugs ([Virella G., Derrick M.V., Pate V., et al. Development of capture assay for different modification of human low-density lipoprotein // Clinical and Diagnostic Lab. Immunol. 2005. -V. 12, jVe 1.- P.68-75).
Существенным недостатком иммуноферментых тест-систем для исследований является использование моноклональных антител, специфичных только к одному эпитопу модифицированных липопротеинов, трудоемкость и высокая себестоимость. A significant drawback of enzyme immunoassay test systems for research is the use of monoclonal antibodies specific for only one epitope of modified lipoproteins, the complexity and high cost.
Наиболее близким к предлагаемому способу экспресс определения атерогенности крови является способ, описанный в работе (El-Saadani M., Esterbauer H., El-Bayed M., et al. A spectrophotometric assay for lipid peroxides in serum lipoproteins using a commercially available reagent//J.Lipid Res.- 1989. -V.30). Суть его заключается в следующем: к 100 мкл Л1ШП, предварительно выделенных из сыворотки методом ультрацентрифугирования и отдиализованных в течение 15-20 час. добавляют 1 мл реагента (представляющего собой смесь 6 компонентов: 0,2М фосфат калия, 0, 12 М йодистого калия, 0, 15 мМ азид натрия, 2 г/л полиэтиленгликоля, 0, 1 г/л алкилбензилдиметиламмонийхлорида, ЮмМ молибдата аммония), 24 мкМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 20 мкМ бутилированного гидрокситолуола). Далее смесь инкубируют 30 мин в темноте и измеряют на спектрофотометре светопропускание при 365 нм (6 манипуляций не считая выделения ЛПНП из сыворотки). Данный метод имеет ряд недостатков: Closest to the proposed method, the express determination of blood atherogenicity is the method described in (El-Saadani M., Esterbauer H., El-Bayed M., et al. A spectrophotometric assay for lipid peroxides in serum lipoproteins using a commercially available reagent // J. Lipid Res. 1989. -V.30). Its essence is as follows: to 100 μl L1ShP, previously isolated from serum by ultracentrifugation and dialyzed for 15-20 hours. add 1 ml of reagent (which is a mixture of 6 components: 0.2 M potassium phosphate, 0.12 M potassium iodide, 0.1 mM sodium azide, 2 g / l polyethylene glycol, 0.1 g / l alkylbenzyldimethylammonium chloride, HMM ammonium molybdate), 24 μM ethylenediaminetetraacetic acid, 20 μM butylated hydroxytoluene). The mixture is then incubated for 30 min in the dark and the light transmission at 365 nm is measured on a spectrophotometer (6 manipulations excluding the isolation of LDL from serum). This method has several disadvantages:
1. ЛПНП необходимо изолировать из сыворотки методом ультрацентрифугирования. Эта операция занимает в общей сложности около 2 суток; 1. LDL must be isolated from serum by ultracentrifugation. This operation takes a total of about 2 days;
2. Изолированные ЛПНП необходимо диализовать от избытка NaBr, добавленного в период выделения, течение не менее 8 часов; 2. Isolated LDL must be dialyzed from excess NaBr added during the isolation period for at least 8 hours;
3. В период такого длительного выделения ЛПНП могут претерпевать окислительную модификацию, что искажает суть получаемых результатов. 3. During such a long period of isolation, LDL can undergo an oxidative modification, which distorts the essence of the results.
4. Определение продуктов окисления липидов осуществляется по реакции: ROOH + 2Г + 2Н+— -> I2 + ROH + Н20, т.е. определяется только гидроперекиси липидов (ROOH). Однако в ходе окисления ЛПНП образуются много других молекулярных (альдегиды, кетоны) и радикальных (ОН, липидные радикалы и т.п.) продуктов, участие которых в окислительной модификации ЛПНП остается неучтенным. 4. The determination of lipid oxidation products is carried out according to the reaction: ROOH + 2Г + 2Н + - -> I 2 + ROH + Н 2 0, ie determined only by lipid hydroperoxide (ROOH). However, during the oxidation of LDL, many other molecular (aldehydes, ketones) and radical (OH, lipid radicals, etc.) are formed products whose participation in the oxidative modification of LDL remains unaccounted for.
5. Указанные выше реакция не является специфической, поскольку Г может взаимодействовать с другими окислителями, присутствующими в системе (например, с ионами металлов переменной валентности). 5. The above reaction is not specific, since G can interact with other oxidizing agents present in the system (for example, with metal ions of variable valency).
6. Предлагаемый в прототипе коммерческий препарат является смесью 6-и реактивов и выпускается фирмой Merk (Германия), катал. No 14106. 6. The commercial preparation proposed in the prototype is a mixture of 6 reagents and is manufactured by Merk (Germany), Katal. No 14106.
В настоящее время в клинической лабораторной практике отсутствуют доступные для рутинных исследований реагенты и методы определения содержания ммЛП в сыворотке. Учитывая важную патогенетическую роль ммЛП при атеросклерозе, остается актуальной разработка простых, доступных для клинических лабораторных исследований, способов определения ммЛП. Currently, in clinical laboratory practice, there are no reagents and methods for determination of serum mmLP available for routine studies. Given the important pathogenetic role of mmLP in atherosclerosis, it remains relevant to develop simple methods for determining mmLP that are available for clinical laboratory research.
Известен способ определения атерогенности сыворотки крови по ее способности вызывать накопление холестерина в культивируемых гладкомышечных клетках (Tertov V.V., Orekhov A.N., Nikitina N.A. et al. Peritoneal macrophages: a model for detecting atherogenic potential in patiens' blood serum // Ann.Med. - 1989. - V. 21(6). - P.455-459). A known method for determining the atherogenicity of blood serum by its ability to cause the accumulation of cholesterol in cultured smooth muscle cells (Tertov VV, Orekhov AN, Nikitina NA et al. Peritoneal macrophages: a model for detecting atherogenic potential in patiens' blood serum // Ann.Med. - 1989 . - V. 21 (6) .- P.455-459).
Недостатком этого способа являются трудоемкость, высокая себестоимость, сложность, длительность проведения исследования (более 2 суток). The disadvantage of this method is the complexity, high cost, complexity, duration of the study (more than 2 days).
Задачей изобретения является разработка способа, устраняющего вышеуказанные недостатки, расширение арсенала способов для ранней диагностики атеросклероза для клинико-диагностических лабораторий б за счет упрощения технологии, сокращения времени проведения процедуры (до 10 мин), а также его многократное удешевление. The objective of the invention is to develop a method that eliminates the above disadvantages, expanding the arsenal of methods for the early diagnosis of atherosclerosis for clinical diagnostic laboratories due to the simplification of technology, reducing the time of the procedure (up to 10 min), as well as its multiple cost reduction.
Поставленная задача решается путем добавления к сыворотке крови человека раствора поливинилпирролидона (ПВП), определения степени помутнения раствора сыворотки турбидиметрическим способом и расчета содержания [ммЛП] по приведенной ниже формуле. The problem is solved by adding a solution of polyvinylpyrrolidone (PVP) to human blood serum, determining the degree of turbidity of the serum solution by the turbidimetric method and calculating the content [mmLP] using the formula below.
Техническим результатом, получаемым при реализации изобретения, является расширение арсенала реагентов для специфической агрегации ммЛП, получение тест-системы для определения уровня [ммЛП], упрощение, сокращение длительности процедуры исследования, а также его удешевление. The technical result obtained by the implementation of the invention is to expand the arsenal of reagents for the specific aggregation of mmLP, obtain a test system to determine the level of [mmLP], simplify, reduce the duration of the research procedure, as well as reduce its cost.
Этот результат достигается тем, что определение ммЛП в сыворотке крови человека проводят путем обработки ее 10% раствором поливинилпирролидона (ПВП)- 12600 при объемном соотношении [сыворотка:Буфер-1] [от (1 :3) до (1 :8)] (содержание ПВП в инкубационной смеси от 7,5% до 8,9%, соответственно, инкубирования в течение 10 мин при комнатной температуре, измерения светопоглощения в опытной и контрольной пробах, вычисления разности между ними, при этом при величине разности более 10,0 ЕД. констатируют атерогенность крови. This result is achieved in that the determination of mmLP in human serum is carried out by treating it with a 10% solution of polyvinylpyrrolidone (PVP) - 12600 with a volume ratio of [serum: Buffer-1] [from (1: 3) to (1: 8)] ( the PVP content in the incubation mixture is from 7.5% to 8.9%, respectively, incubation for 10 min at room temperature, measuring light absorption in the experimental and control samples, calculating the difference between them, while with a difference of more than 10.0 PIECES ascertain atherogenicity of blood.
Буфер- 1 для агрегации ммЛП готовят растворением 10 г ПВП (относительная молекулярная масса 12600±2700) в 100 мл 0,01М Трис- HCl-буфера, рН 7,4, содержащего 0, 15 М NaCl. Буфер-2 отличается от Буфера- 1 отсутствием ПВП. Буфер- 1 добавляют к сыворотке крови, тщательно перемешивают, инкубируют, измеряют степень помутнения спетрофотометрически и рассчитывают уровень содержания [ммЛП] по формуле: [ммЛП], ЕД - [Ео - Εκ] χ 100, где: Buffer-1 for aggregation of mmLP is prepared by dissolving 10 g of PVP (relative molecular weight of 12600 ± 2700) in 100 ml of 0.01 M Tris-HCl buffer, pH 7.4, containing 0.1 M NaCl. Buffer-2 differs from Buffer-1 in the absence of PVP. Buffer-1 is added to blood serum, mixed thoroughly, incubated, the degree of turbidity is measured spectrophotometrically and the level of [mmLP] is calculated by the formula: [mmLP], ED - [Ео - Ε κ ] χ 100, where:
[ммЛП] - уровень содержания ммЛП в опытной пробе в условных единицах (ЕД.); [mmLP] - the level of mmLP content in the experimental sample in arbitrary units (UNITS);
Е0 - оптическая плотность опытной пробы при длине волны 450 нм, ед. опт. пл.; E 0 - the optical density of the experimental sample at a wavelength of 450 nm, units opt. pl .;
Е - оптическая плотность контрольной пробы, сыворотки с соответствующим количеством буфера-2 без ПВП (контрольный буфер), ед. опт. пл.; E is the optical density of the control sample, serum with the appropriate amount of buffer-2 without PVP (control buffer), units opt. pl .;
100 - коэффициент перерасчета в единицы (ЕД). 100 - conversion factor to units (units).
Пример 1. Определение оптимальной концентрации ПВП для преципитации ммЛП в сыворотке крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. К 50 мкл пулированной сыворотки крови от 10 больных сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ) добавляют 100-500 мкл 10% раствора ПВП в 0,01М Трис-НС1-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl. тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин в 9 луночных плоскодонных кюветах биохимического анализатора FP-901 ("Labsystem", Финляндия). Степень помутнения определяют турбидиметрически при длине волны 450 нм. В качестве бланка используют пробы сыворотки с соответствующим количеством 0,01М Трис-НС1-буфера, рН 7,4, содержащего 0, 15 M NaCl. Рассчитывают уровень содержания [ммЛП] по формуле. Полученные результаты приведены в таблице 1. Как видно из данных, представленных в таблице 1 , с увеличением концентрации ПВП в инкубационной системе с 6,7% до 8,9% наблюдается агрегация ммЛП и помутнение раствора. Максимальная агрегация ммЛП достигается при концентрации 8,0%, т.е. при объемном соотношении сыворотка: среда (1 :4). При дальнейшем увеличении концентрации ПВП свыше 8,0% наблюдается снижение степени агрегации. Example 1. Determination of the optimal concentration of PVP for the precipitation of mmLP in the blood serum of patients with cardiovascular diseases. 100-500 μl of a 10% solution of PVP in 0.01 M Tris-HC1 buffer, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl, is added to 50 μl of the pulled blood serum from 10 patients with cardiovascular diseases (CVD). mix thoroughly and incubate at room temperature for 10 min in 9 well flat-bottomed cuvettes of the FP-901 biochemistry analyzer (Labsystem, Finland). The degree of turbidity is determined turbidimetrically at a wavelength of 450 nm. Serum samples with an appropriate amount of 0.01 M Tris-HC1 buffer, pH 7.4, containing 0, 15 M NaCl are used as the blank. Calculate the level of content [mmLP] by the formula. The results are shown in table 1. As can be seen from the data presented in table 1, with an increase in the concentration of PVP in the incubation system from 6.7% to 8.9%, aggregation of mmLP and turbidity of the solution are observed. The maximum aggregation of mmLP is achieved at a concentration of 8.0%, i.e. with a volume ratio of serum: medium (1: 4). With a further increase in the concentration of PVP over 8.0%, a decrease in the degree of aggregation is observed.
Для подтверждения агрегации именно ммЛП сыворотки больных атеросклерозом в 8,0% растворе ПВП нами была исследована пулированная сыворотка от 10 здоровых доноров при условиях, описанных выше. Полученные результаты представлены в таблице 2. To confirm the aggregation of exactly mmLP serum of patients with atherosclerosis in an 8.0% PVP solution, we studied the pulled serum from 10 healthy donors under the conditions described above. The results are presented in table 2.
Добавление к пулированной сыворотке крови здоровых доноров возрастающих концентрации 10% ПВП приводит к незначительной агрегации нативных липопротеинов при концентрации ПВП в системе начиная с 7,5% до 8,3%. При дальнейшем увеличении содержания в системе свыше 8,6% агрегации нативных липопротеинов не наблюдается. В дальнейших исследованиях нами использовалась концентрация ПВП для агрегации ммЛП равная 8,9%>, что соответствует соотношению сыворотка : среда (1 :8). The addition of healthy donors with increasing concentrations of 10% PVP to pooled blood serum leads to insignificant aggregation of native lipoproteins at a concentration of PVP in the system from 7.5% to 8.3%. With a further increase in the content in the system of more than 8.6%, aggregation of native lipoproteins is not observed. In further studies, we used the concentration of PVP for the aggregation of mmLP equal to 8.9%>, which corresponds to the ratio of serum: medium (1: 8).
Пример 2. Определение содержания холестерина, триацилглицерида (ТАГ) и общих белков в ПВП-преципитатах. Для подтверждения наличия ммЛП в ПВП-преципитатах были проведены следующие эксперименты. Из 0,5 мл пулированной сыворотки больных ИБС и контрольных здоровых доноров были приготовлены ПВП- преципитаты в условиях 8,9% ПВП. Преципитат был осажден путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 20 мин при 23°С. Супернатант тщательно декантировали, ПВП-преципитат 2 раза отмывали 8,9%) раствором ПВП и ресуспендировали в 0,5 мл 0,01М Трис-НС1-буфера, pH 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. В полученных ПВП-преципитатах определяли содержание холестерина, ТАГ и общих белков с использованием реактивов фирмы « Диакон- ДС», Россия. Полученные результаты представлены в таблице 3. Example 2. Determination of cholesterol, triacylglyceride (TAG) and total proteins in PVP precipitates. The following experiments were performed to confirm the presence of mmLP in PVP precipitates. From 0.5 ml of the pulled serum of patients with coronary heart disease and control healthy donors, PVP precipitates were prepared under conditions of 8.9% PVP. The precipitate was precipitated by centrifugation at 6000 rpm for 20 min at 23 ° C. The supernatant was carefully decanted, the PVP precipitate was washed 2 times with 8.9%) PVP solution and resuspended in 0.5 ml of 0.01 M Tris-HC1 buffer, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl. In the obtained PVP precipitates, the content of cholesterol, TAG, and total proteins was determined using reagents of the company Deacon-DS, Russia. The results are presented in table 3.
Как видно из данных, представленных в таблице 3, в ПВП- преципитате пулированной сыворотки больных ИБС содержание холестерина в 12 раз, а ТАГ - в 16 раз больше, чем в ПВП-преципитате из сыворотки здоровых доноров. Содержание общего белка в 1 ,3 раза выше в ПВП-преципитате больных. As can be seen from the data presented in table 3, the cholesterol content in the PVP-precipitate of the pulsed serum of patients with coronary heart disease is 12 times higher, and the TAG is 16 times higher than in the PVP-precipitate from healthy donor serum. The total protein content is 1, 3 times higher in PVP-precipitate patients.
Таким образом, наличие холестерина, ТАГ и белка в ПВП- преципитатах из сывороток свиде тельствует о липопротеиновой природе агрегатов, образующихся в присутствии 8,9% ПВП. Повышенный уровень ПВП-преципитата, содержащего ммЛП у больных с ИБС, является специфическим маркером атеросклеротического процесса. Thus, the presence of cholesterol, TAG, and protein in PVP precipitates from serum indicates the lipoprotein nature of aggregates formed in the presence of 8.9% PVP. An increased level of PVP-precipitate containing mmLP in patients with coronary artery disease is a specific marker of the atherosclerotic process.
Пример 3. Подбор оптимального времени инкубации смеси сыворотки с ПВП для агрегации ммЛП. К 50 мкл пулированной сыворотки больных ИБС и здоровых доноров добавляют 400 мкл 10% раствора ПВП в 0,01М трис-НС1-буфере, рН 7,4 содержащего 0,15М NaCl, тщательно перемешиваю т и инкубируют при комнатной температуре в течение 10, 20, 30 и 60 мин в 9 луночных плоскодонных кюветах биохимического анализа тора FP-901 ("Labsystem", Финляндия). Степень помутнения определяю т турбидиметрически при длине волны 450 нм. В качестве бланка используют пробы сыворотки с соответствующим количеством 0,01М Трис-НС1-буфера, рН 7,4, содержащего 0, 15 М NaCl. Полученные результаты приведены в таблице 4. Как видно из данных, представленных в таблице 4, в пулированной сыворотке крови больных ИБС агрегация ммЛП максимально протекает в течение 10 минут. При дальнейшей инкубации наблюдается незначительная агрегация остаточного количества ммЛП (примерно 8%). Уровень ммЛП в пулированной сыворотке здоровых доноров при инкубации 60 мин остается без изменений на уровне 8,3 ЕД. Example 3. The selection of the optimal incubation time of a mixture of serum with PVP for the aggregation of mmLP. 400 μl of a 10% solution of PVP in 0.01 M Tris-HC1 buffer, pH 7.4 containing 0.15 M NaCl is added to 50 μl of the pulled serum of patients with coronary artery disease and healthy donors, and they are thoroughly mixed and incubated at room temperature for 10, 20 , 30 and 60 min in 9 well flat-bottomed cuvettes of biochemical analysis of the torus FP-901 ("Labsystem", Finland). The degree of turbidity is determined turbidimetrically at a wavelength of 450 nm. Serum samples with an appropriate amount of 0.01 M Tris-HC1 buffer, pH 7.4, containing 0.1 M NaCl are used as the blank. The results are shown in table 4. As can be seen from the data presented in table 4, in the pooled blood serum of patients with coronary artery disease, the aggregation of mmLP proceeds for a maximum of 10 minutes. With further incubation, there is a slight aggregation of the residual amount of mmLP (approximately 8%). The level of mmLP in the pulsed serum of healthy donors during an incubation of 60 min remains unchanged at the level of 8.3 PIECES.
Таким образом, для выявления повышенного уровня [ммЛП] 10 минутная инкубация является оптимальной для рутинных исследований атерогенности крови. Thus, to detect an elevated level [mmLP], 10 minute incubation is optimal for routine studies of blood atherogenicity.
Пример 4. Определение связывания комплемента морской свинки преципитатами ммЛП в зависимости от концентрации. К 10-160 мкл раствора ПВП-преципитата (4,3 мг/мл по белку), приготовленного из пулированной сыворотки больных с ИБС и разбавленного в соотношении 1 :99 буфером VBS , добавляют 20 мкл раствора, разбавленного 1 : 19 комплемента морской свинки. Общий объем доводили до 0,3 мл буфером VBS2+ и инкубировали 20 мин при 37°С. После предварительной инкубации добавляли 200 мкл эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика (ЕА) и инкубировали 30 мин при 37°С. После инкубации в каждую пробу добавляли по 2,5 мл холодного раствора 0, 15 М NaCl, центрифугировали и определяли величину А405 супернатанта. Контрольная проба не содержала ПВП- преципитата. Пониженный гемолиз в опытных пробах по сравнению с контролем свидетельствовал о наличии связывания комплемента. Степень лизиса эритроцитов (У) определяли по формуле: Example 4. Determination of complement binding of guinea pig with mmLP precipitates as a function of concentration. To 10-160 μl of a solution of PVP-precipitate (4.3 mg / ml protein) prepared from the pulled serum of patients with coronary artery disease and diluted 1: 99 with VBS buffer, 20 μl of a solution diluted 1: 19 of guinea pig complement are added. The total volume was adjusted to 0.3 ml with VBS 2+ buffer and incubated for 20 min at 37 ° C. After preliminary incubation, 200 μl of sheep erythrocytes sensitized with rabbit antibodies (EA) were added and incubated for 30 min at 37 ° C. After incubation, 2.5 ml of a cold solution of 0.15 M NaCl was added to each sample, centrifuged, and A 40 5 supernatant was determined. The control sample did not contain PVP precipitate. Reduced hemolysis in experimental samples compared with the control testified to the presence of complement binding. The degree of lysis of red blood cells (U) was determined by the formula:
У (%) = [(X-R)/(H-R) l00], Y (%) = [(X-R) / (H-R) l00],
где Н, R и Х-величины оптической плотности Α4ι2 в гемолитических системах контрольной пробы, в контроле спонтанного лизиса ЕА и в опытной пробе, соответственно. Степень связывания комплемента (ССК) определяли по формуле: where H, R and X-values of optical density Α 4 ι 2 in hemolytic systems of the control sample, in the control of spontaneous lysis of EA and experimental test, respectively. The degree of complement fixation (CCK) was determined by the formula:
ССК (%) = 100 - У  SSK (%) = 100 - U
Данные о степени связывания комплемента при разных концентрациях ПВП-преципитата приведены в таблице 5.  Data on the degree of complement fixation at different concentrations of PVP precipitate are shown in table 5.
Как видно из данных, представленных в таблице 5, ммЛП, преципитированные в растворе 8,9% ПВП, обладают комплемент- связывающей способностью, причем эффект является дозо-зависимым. При увеличении концентрации ПВП выше 8,9%> в системе наблюдается уменьшение количества преципитированного холестерина, ТАГ, белков, а также комплемент связывающей активности ПВП преципитатов (данные не приведены).  As can be seen from the data presented in table 5, mmLP precipitated in a solution of 8.9% PVP have complement-binding ability, and the effect is dose-dependent. With an increase in the concentration of PVP above 8.9%>, a decrease in the amount of precipitated cholesterol, TAG, proteins, as well as a complement of the binding activity of PVP precipitates is observed in the system (data not shown).
Таким образом, определение комплемент-связывающей способности ПВП-преципитата свидетельствует о наличии ммЛП и о специфическом взаимодействии ммЛП с комплементом морской свинки. Определение холестерина, ТАГ и общих белков в ПВП-преципитате при концентрации 8,9%), а также максимальная комплемент-связывающая способность подтверждает оптимальную концентрацию 8,9% ПВП в системе для специфической агрегации ммЛП из сыворотки больных с атеросклеротической болезнью.  Thus, the determination of the complement-binding ability of the PVP precipitate indicates the presence of mmLP and the specific interaction of mmLP with the complement of guinea pig. The determination of cholesterol, TAG and total proteins in the PVP precipitate at a concentration of 8.9%), as well as the maximum complement-binding ability confirms the optimal concentration of 8.9% PVP in the system for the specific aggregation of mmLP from the serum of patients with atherosclerotic disease.
Пример 5. Влияние ммЛП на агрегацию тромбоцитов. ммЛП были приготовлены в условиях 8,9% ПВП как описано в примере 2. Для исследования агрегации тромбоцитов получали кровь из краевой вены уха кролика в 3,8% раствор цитрата натрия (9: 1 по объему). Центрифугировали кровь при 150 g в течение 10 мин. Супернатант, представляющий собой богатую тромбоцитами плазму (БТП) крови, использовали для анализа агрегации тромбоцитов. Исследования агрегации тромбоцитов проводили по методу Born (Born G.V. Aggregation of blood platelets by ADP and its reversal // Nature. - 1962. - V. 194. - P. 927-929) в модификации O'Brien (O'Brien J.R. Platelet aggregation: Part I Some effect of the adenosine phosphates, thrombin, and cocaine upon platelet adehesiveness // J. Clin. Path. - 1962. - V.15, N° 5. - P. 446-452; O'Brien J.R. Platelet aggregation: Part II Some resalts from a new method of study// J. Clin. Path. - 1962. - V.15, J4S 5. - P. 452-455) с графической регистрацией на агрегометре фирмы Crono-Log Со. (США). Принцип метода основан на изменении оптической плотности БТП при добавлении индукторов агрегации. При агрегации суспензия тромбоцитов становится более прозрачной и за счет падения оптической плотности светопропускание растет. Графически это отображается отклонением кривой от нулевой линии (0% агрегации) до 100% агрегации. Example 5. The effect of mmLP on platelet aggregation. mmLPs were prepared under 8.9% PVP conditions as described in Example 2. To study platelet aggregation, blood was obtained from the marginal vein of the rabbit ear in a 3.8% sodium citrate solution (9: 1 by volume). Centrifuged blood at 150 g for 10 min. The supernatant, which is a platelet-rich plasma (BTP) of blood, was used to analyze platelet aggregation. Platelet aggregation studies were carried out according to the Born method (Born GV Aggregation of blood platelets by ADP and its reversal // Nature. - 1962. - V. 194. - P. 927-929) in the modification of O'Brien (O'Brien JR Platelet aggregation: Part I Some effect of the adenosine phosphates, thrombin, and cocaine upon platelet adehesiveness // J. Clin. Path. - 1962. - V.15, N ° 5. - P. 446-452; O'Brien JR Platelet aggregation: Part II Some resalts from a new method of study // J. Clin. Path. - 1962. - V.15, J4S 5 - P. 452-455) with graphical registration on an aggregometer of Crono-Log Co. (USA). The principle of the method is based on a change in the optical density of BTP upon the addition of aggregation inductors. During aggregation, the platelet suspension becomes more transparent and, due to a decrease in optical density, the light transmission increases. This is graphically displayed by the deviation of the curve from the zero line (0% aggregation) to 100% aggregation.
Ход определения: 0,25 мл ТБП помещали в кювету агрегометра, прогревали до 37°С в течение 1 мин при постоянном перемешивании и выставляли 0% агрегации. В опытную пробу вносили препарат ммЛЛ, дополнительно инкубировали в течение 4 мин и проводили агрегацию тромбоцитов введением индуктора АДФ (конечная концентрация 1 ,25 мкМ). Регистрировали агрегацию в течение 5 мин. За 100% агрегации принимали светопропускание пробы, содержащей 0,25 мл тромбоцит бедной плазмы. В качестве параметров агрегации использовали максимальный процент снижения оптической плотности - В (%). Степень агрегации тромбоцитов при действии ммЛП характеризовали величиной Воп/Вк, где Воп и Вк - изменение светопропускания соответственно богатой тромбоцитами плазмы, содержащей ммЛП, и контрольного образца. Результаты представлены в таблице 6. Definition: 0.25 ml of TBP was placed in an aggregometer cuvette, heated to 37 ° C for 1 min with constant stirring, and 0% aggregation was set. The mmLL preparation was introduced into the experimental sample, additionally incubated for 4 min, and platelet aggregation was performed by the introduction of an ADP inducer (final concentration of 1.25 μM). Aggregation for 5 minutes was recorded. For 100% of the aggregations, the light transmission of a sample containing 0.25 ml of a poor platelet plasma was taken. As the aggregation parameters, the maximum percentage of decrease in optical density - B (%) was used. The degree of platelet aggregation under the action of mmLP was characterized by the value of V op / V k , where V op and B k are the change in light transmission of platelet-rich plasma containing mmLP and the control sample, respectively. The results are presented in table 6.
Как видно из данных, представленных в таблице 6, предварительное введение ммЛП при конечной концентрации 0,4 мкг/мл вызывает усиление агрегации, в то время как ПВП-преципитат из сыворотки контрольной группы здоровых доноров практически не оказывает влияния на функцию тромбоцитов. As can be seen from the data presented in table 6, the preliminary introduction of mmLP at a final concentration of 0.4 μg / ml causes increased aggregation, while the PVP precipitate from the serum of the control group of healthy donors has virtually no effect on platelet function.
Таким образом, ПВП-преципитат, приготовленный из сыворотки больных ИБС, вызывает гиперреактивность тромбоцитов. Thus, the PVP precipitate prepared from the serum of patients with coronary artery disease causes platelet hyperreactivity.
Пример 6. Влияние концентрации и времени инкубации ммЛП на агрегацию тромбоцитов. Ход определения: 0,25 мл ТБП помещали в кювету агрегометра, прогревали до 37°С в течение 1 мин при постоянном перемешивании и выставляли 0% агрегации. В опытную пробу вносили возрастающие концентрации препарата ммЛП, приготовленного из сыворотки больных ИБС, дополнительно инкубировали в течение 4 мин и проводили агрегацию тромбоцитов введением индуктора АДФ (конечная концентрация 1 ,25 мкМ). Регистрировали агрегацию в течение 5 мин. Результаты представлены в таблице 7. Example 6. The effect of concentration and incubation time mmLP on platelet aggregation. Definition: 0.25 ml of TBP was placed in an aggregometer cuvette, heated to 37 ° C for 1 min with constant stirring, and 0% aggregation was set. Increasing concentrations of mmLP preparation prepared from the serum of patients with coronary artery disease were added to the experimental sample, they were additionally incubated for 4 min and platelet aggregation was performed by the introduction of an ADP inducer (final concentration of 1.25 μM). Aggregation for 5 minutes was recorded. The results are presented in table 7.
Как видно из данных, представленных в таблице 7, эффект усиления агрегации тромбоцитов под влиянием ммЛП имеет дозо- зависимый характер. Причем, до 10 мкг/мл ммЛП наблюдается усиление агрегации тромбоцитов, а свыше 10 мкг/мл наблюдается плато, что свидетельствует об эффекте насыщения, т.е. увеличение концентрации в 2 раза (20 мкг/мл) не вызывает дальнейший эффект. As can be seen from the data presented in table 7, the effect of enhancing platelet aggregation under the influence of mmLP is dose-dependent in nature. Moreover, up to 10 μg / ml mmLP there is an increase in platelet aggregation, and over 10 μg / ml a plateau is observed, which indicates the saturation effect, i.e. a 2-fold increase in concentration (20 μg / ml) does not cause a further effect.
Влияние времени предварительной инкубации ммЛП с тромбоцитами на функцию тромбоцитов. Для этих исследований использовали концентрацию 10мкг/мл ммЛП. Использовали два интервала времени - 0 мин и 5 мин. В первой серии экспериментов к богатой тромбоцитами плазме добавляли ммЛП и сразу запускали агрегацию тромбоцитов добавлением АДФ без предварительной инкубации. Во второй серии экспериментов после добавления ммЛП к ТБП инкубировали 5 мин и затем добавляли индуктор АДФ. Полученные данные свидетельствуют о том, что эффект усиления агрегации тромбоцитов практически не зависит от времени предварительной инкубации. The effect of pre-incubation of mmLP with platelets on platelet function. For these studies, a concentration of 10 μg / ml mmLP was used. Used two time intervals - 0 min and 5 minutes In the first series of experiments, mmLP was added to platelet-rich plasma and platelet aggregation was immediately started by the addition of ADP without preliminary incubation. In the second series of experiments, after adding mmLP to TBP was incubated for 5 min and then an ADP inducer was added. The data obtained indicate that the effect of enhancing platelet aggregation is practically independent of the time of preliminary incubation.
Таким образом, эффект усиления агрегации тромбоцитов под действием ммЛП: 1) зависит от концентрации, причем наблюдается эффект насыщения; 2) для связывания ммЛП с тромбоцитами практически не требуется предварительная инкубация, что свидетельствует об очень высокой аффинности и скорее всего связано с взаимодействием ммЛП со «скавенж» рецепторами на мембране тромбоцитов. Thus, the effect of enhancing platelet aggregation under the influence of mmLP: 1) depends on the concentration, and the effect of saturation is observed; 2) preliminary incubation is practically not required for the binding of mmLP to platelets, which indicates a very high affinity and is most likely associated with the interaction of mmLP with scavenger receptors on the platelet membrane.
Пример 7. Влияние хранения сыворотки на уровень содержания ммЛП. Определяли уровень содержания ммЛП предлагаемым способом в день забора крови и через 7 суток хранения при 4°С сыворотки больных ИБС и здоровых доноров. Результаты представлены в таблице 8. Example 7. The effect of serum storage on the level of mmLP. The level of mmLP was determined by the proposed method on the day of blood sampling and after 7 days of storage at 4 ° C in the serum of patients with coronary artery disease and healthy donors. The results are presented in table 8.
Полученные результаты убедительно свидетельствуют о том, что уровень ммЛП в сыворотке крови при хранении в течение 7 суток при 4°С не меняется у здоровых доноров. В то время как данный показатель начинает возрастать при хранении сыворотки больных ИБС. Параллельно с повышением уровня ммЛП возрастает бланк сыворотки у больных ИБС. Данный факт может свидетельствовать о том, что при хранении сыворотки крови больных ИБС при 4°С с одной стороны наблюдается дальнейшая модификация липопротеинов низкой плотности, с другой стороны, повышение бланка сыворотки свидетельствует о наличии повышенного уровня криоглобулинов, которые преципитируют при 4°С. Пример 8. Определение уровня содержания [ммЛП] в сыворотке крови у больных ИБС и здоровых доноров с использованием биохимического анализатора FP-901 ("Labsystem" Финляндия). Проведены исследования содержания [ммЛП] предлагаемым способом в сыворотке 18 больных ИБС и 60 здоровых доноров (контрольная группа) с использованием биохимического анализатора FP-901 ("Labsystem" Финляндия). К 50 мкл исследуемой сыворотки добавляли 400 мкл 10% ПВП в 0,01М трис-НС1-буфере, рН 7,4, содержащем 0Д5М NaCl, тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин в 9 луночных плоскодонных кюветах биохимического анализатора FP-901 ("Labsystem", Финляндия). Степень помутнения определяли турбидиметрически при длине волны 450 нм. В качестве бланка использовали пробы сыворотки с соответствующим количеством буфера-2 (0,01М Трис-НС1-буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl). Рассчитывали уровень содержания [ммЛП] по формуле, приведенной выше. Полученные результаты приведены в таблице 9. The results obtained convincingly indicate that the level of mmLP in serum during storage for 7 days at 4 ° C does not change in healthy donors. While this indicator begins to increase during storage of serum of patients with coronary heart disease. In parallel with an increase in the level of mmLP, the serum form in patients with coronary artery disease increases. This fact may indicate that upon storage of blood serum of patients with coronary heart disease at 4 ° C, on the one hand, further modification of low density lipoproteins is observed, on the other hand, an increase in serum form indicates the presence of an increased level of cryoglobulins, which precipitate at 4 ° C. Example 8. The determination of the level of [mmLP] in the blood serum of patients with coronary artery disease and healthy donors using a biochemical analyzer FP-901 ("Labsystem" Finland). The content of [mmLP] by the proposed method in the serum of 18 patients with coronary heart disease and 60 healthy donors (control group) was studied using a FP-901 biochemistry analyzer (Labsystem Finland). To 50 μl of the test serum, 400 μl of 10% PVP in 0.01 M Tris-HC1 buffer, pH 7.4, containing 0D5 M NaCl was added, thoroughly mixed and incubated at room temperature for 10 min in 9 well flat-bottomed cuvettes of the FP- biochemical analyzer 901 (Labsystem, Finland). The degree of turbidity was determined turbidimetrically at a wavelength of 450 nm. Serum samples with an appropriate amount of buffer-2 (0.01 M Tris-HCl buffer, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl) were used as a blank. The levels of [mmLP] were calculated using the formula above. The results are shown in table 9.
В контрольной группе уровень содержания [ммЛП] колебался от 1,1 до 9,9 ЕД. и среднее значение составило 4,59±2,58. Данная величина ммЛП нами принята за нормальный показатель у здоровых доноров. У больных ИБС содержание [ммЛП] колебалось от 9,9 до 37,1 ЕД. и среднее значение составило 21 ,26±10,64 У.Е., что в 4,6 раза больше нормального показателя. Нужно отметить, что при использовании других биохимических анализаторов в каждой лаборатории должен быть уточнен диапазон нормальных величин [ммЛП] для обследуемого контингента людей. In the control group, the level of [mmLP] ranged from 1.1 to 9.9 units. and the average value was 4.59 ± 2.58. We took this value of mmLP as a normal indicator in healthy donors. In patients with coronary artery disease, the content [mmLP] ranged from 9.9 to 37.1 units. and the average value was 21, 26 ± 10.64 UE, which is 4.6 times more than the normal indicator. It should be noted that when using other biochemical analyzers in each laboratory, the range of normal values [mmLP] for the examined population should be specified.
Таким образом, из приведенных выше примеров следует, что: 1. В присутствии 8,9% ПВП из сыворотки больных с ИБС агрегируют ммЛП, в то время как у здоровых доноров не наблюдается агрегации нативных ЛП; Thus, from the above examples it follows that: 1. In the presence of 8.9% PVP from the serum of patients with coronary artery disease, mmLP aggregates, while in healthy donors, no aggregation of native LPs is observed;
2. 10 мин инкубация смеси сыворотки с ПВП приводит к максимальной преципитации ммЛП у больных ИБС. 2. 10 min incubation of the serum mixture with PVP leads to the maximum precipitation of mmLP in patients with coronary artery disease.
3. Атерогенность ммЛП подтверждается двумя независимыми тестами: а) ммЛП обладают про-воспалительным эффектом за счет связывания и активации системы комплемента; б) ммЛП обладают тромбогенным эффектом, обусловленным гиперагрегацией тромбоцитов. 3. The atherogenicity of mmLP is confirmed by two independent tests: a) mmLP have a pro-inflammatory effect due to the binding and activation of the complement system; b) mmLPs have a thrombogenic effect due to platelet hyperaggregation.
4. Хранение сыворотки при 4°С не приводит к появлению ммЛП в сыворотке крови здоровых доноров, в то время как в сыворотке больных с ИБС наблюдается спонтанная агрегация ммЛП наряду с криопреципитацией. 4. Storage of serum at 4 ° C does not lead to the appearance of mmLP in the blood serum of healthy donors, while in the serum of patients with coronary heart disease there is a spontaneous aggregation of mmLP along with cryoprecipitation.
Пример 9. Определение экспресс-способом оптимальной концентрации ПВП для выявления атерогенности плазмы крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. Example 9. Determination by rapid method of the optimal concentration of PVP to detect atherogenic plasma of patients with cardiovascular diseases.
Для разработки экспресс-определения использовали цитратную плазму крови человека. К 50 мкл пулированной плазмы крови от 10 больных ишемической болезнью сердца (ИБС) добавляют 100-800 мкл 10% раствора ПВП в 0,01М Трис-НС1-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl. тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Степень помутнение раствора определяют визуально по сравнению с контрольной пробой и оценивают как слабое помутнение - (+) и сильное - (++++). В качестве контроля используют пробы плазмы крови с соответствующим количеством буфера, не содержащего ПВП, и оценивают как - (-). Полученные результаты приведены в таблице 10. For the development of rapid determination used citrated blood plasma of a person. To 50 μl of the pulsed blood plasma from 10 patients with coronary heart disease (CHD), 100-800 μl of a 10% solution of PVP in 0.01 M Tris-HC1 buffer, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl are added. mix thoroughly and incubate at room temperature for 10 minutes. The degree of turbidity of the solution is determined visually in comparison with the control sample and is estimated as weak turbidity - (+) and strong - (++++). As a control, use blood plasma samples with the appropriate amount buffer not containing PVP, and evaluated as - (-). The results are shown in table 10.
Как видно из данных, представленных в таблице 10, с увеличением концентрации ПВП в инкубационной системе с 7,1% до 8,9% наблюдается помутнение, обусловленное агрегацией ммЛП, с максимальным помутнением при 8,9% ПВП, т.е. при объемном соотношении плазма:буфер (1 :8). При дальнейшем увеличении концентрации ПВП свыше 8,9% наблюдается снижение степени агрегации ммЛП, которое характеризуется уменьшением мутности. As can be seen from the data presented in table 10, with an increase in the concentration of PVP in the incubation system from 7.1% to 8.9%, turbidity is observed due to the aggregation of mmLP with a maximum turbidity at 8.9% PVP, with a volume ratio of plasma: buffer (1: 8). With a further increase in the concentration of PVP over 8.9%, a decrease in the degree of aggregation of mmLP is observed, which is characterized by a decrease in turbidity.
Для подтверждения агрегации ммЛП плазмы крови больных ИБС в 8,9% растворе ПВП нами была исследована пулированная плазма 10 здоровых доноров при условиях, описанных выше. Полученные результаты представлены в таблице 11. To confirm the aggregation of mmLP in the blood plasma of patients with coronary heart disease in an 8.9% PVP solution, we studied the pulsed plasma of 10 healthy donors under the conditions described above. The results are presented in table 11.
Добавление к пулированной плазме крови здоровых доноров возрастающих концентрации 10% ПВП не приводит к агрегации нормальных липопротеинов низкой и очень низкой плотности. Adding to the pulsed blood plasma of healthy donors an increasing concentration of 10% PVP does not lead to aggregation of normal low and very low density lipoproteins.
Пример 10. Экспресс-определение атерогенности крови у больных ИБС и здоровых доноров. Проведены исследования атерогенности плазмы крови предлагаемым экспресс-способом у 64 больных ИБС с инструментально подтвержденным атеросклерозом коронарных артерий и 60 здоровых доноров (контрольная группа). К 50 мкл исследуемой плазме крови добавляли 400 мкл буфера- 1 (10% ПВП в 0,01М трис-НС1- буфере, рН 7,4, содержащем 0, 15М NaCl), тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин в прозрачных пробирках. Степень помутнения (атерогенность) определяли визуально по сравнению с контрольной пробой. В качестве контроля использовали пробы плазмы с соответствующим количеством буфера-2 (0,01M Трис-НС1-буфера, pH 7,4, содержащего 0, 15 М NaCl). Полученные результаты приведены в таблице 12. Example 10. Rapid determination of blood atherogenicity in patients with coronary heart disease and healthy donors. Studies of the atherogenicity of blood plasma by the proposed express method were performed in 64 patients with coronary heart disease with instrumentally confirmed coronary artery atherosclerosis and 60 healthy donors (control group). 400 μl of buffer-1 (10% PVP in 0.01 M Tris-HCl buffer, pH 7.4 containing 0, 15 M NaCl) was added to 50 μl of the studied blood plasma, thoroughly mixed and incubated at room temperature for 10 min in transparent test tubes. The degree of turbidity (atherogenicity) was determined visually in comparison with the control sample. As a control, used plasma samples with the appropriate amount buffer-2 (0.01 M Tris-HC1 buffer, pH 7.4, containing 0.1 M NaCl). The results are shown in table 12.
Как видно из данных, представленных в таблице 12, в контрольной группе доноров атерогенность не определялась, в то время как у больных ИБС атерогенность выявлена в 53 случаях, что составляет 79% обследованных проб плазмы крови больных ИБС с инструментально подтвержденным атеросклерозом. Учитывая то, что больным с ИБС в стационаре проводилась терапия препаратами, снижающими холестерин, можно предполагать, что отсутствие атерогенности у 21% больных ИБС свидетельствует об эффективности анти- атеросклеротической терапии. В перспективе исследования атерогенности у больных с ИБС или другими атеросклеротическими заболеваниями до лечения и в ходе лечения позволит контролировать эффективность проводимой терапии. As can be seen from the data presented in table 12, atherogenicity was not determined in the control group of donors, while atherosclerosis was detected in 53 cases in patients with coronary artery disease, which is 79% of the examined plasma samples of patients with coronary artery disease with instrumentally confirmed atherosclerosis. Considering that patients with coronary artery disease in the hospital were treated with drugs that lower cholesterol, it can be assumed that the absence of atherogenicity in 21% of patients with coronary artery disease indicates the effectiveness of anti-atherosclerotic therapy. In the future, studies of atherogenicity in patients with coronary heart disease or other atherosclerotic diseases before treatment and during treatment will allow monitoring the effectiveness of the therapy.
Пример 11. Исследование атерогенности крови у 750 сотрудников компании «МОСЭНЕРГО», проходящих плановый медицинский осмотр. В ходе медицинского осмотра исследовали кровь на глюкозу и липидный профиль. Дополнительно у всех сотрудников исследовали кровь на атерогенность разработанным методом. Атерогенность крови выявлена у 288 (38,4%) относительно здоровых сотрудников. Из группы с атерогенной кровью (повышенный уровень ммЛП) были отобраны 21 человек в возрасте до 40 лет с нормальными липидными профилями для дальнейшего инструментального обследования на наличие изменений интимо-медиального слоя сонных артерий. Для оценки состояния стенки сонных артерий использовали ультрафонографию высокого разрешения в В-режиме с использованием линейного сосудистого датчика с частотой 7,5 МГц. Протокол обследования включал в себя сканирование левой и правой сонных артерий и области каротидного синуса с фокусированием на задней стенке артерий в трех фиксированных проекциях - переднебоковой, боковой и заднебоковой. Обследование проводили в положении лежа после 15-минутного отдыха. Все измерения проводили последовательно в течение одной сессии. Процедуру сканирования записывали на видеомагнитофон высокого разрешения стандарта супер-VHS PAL. Анализ записей проводил сертифицированный оператор. Толщину интимо-медиального слоя сонных артерий измеряли с помощью компьторной программы Prosound (R. Seltzer, USA). Измерение проводили на участке общей сонной артерии длиной 10 мм, противолежащем началу каротидного синуса. Толщину интимо-медиального слоя задней стенки общей сонной артерии определяли как расстояние от ведущего края первой эхогенной зоны до ведущего края второй эхогенной зоны. Среднее значение трех измерений (переднебоковой, боковой и заднебоковой проекциях) рассматривали как интегральный показатель толщины интимо- медиального слоя. Example 11. The study of blood atherogenicity in 750 employees of the company "MOSENERGO" undergoing a routine medical examination. During the medical examination, blood was examined for glucose and lipid profile. Additionally, all employees were examined for blood atherogenicity by the developed method. Blood atherogenicity was detected in 288 (38.4%) relatively healthy employees. From the group with atherogenic blood (elevated mmLP), 21 people under the age of 40 years with normal lipid profiles were selected for further instrumental examination for changes in the intimal-medial layer of the carotid arteries. To assess the condition of the wall of the carotid arteries, high-resolution ultrafonography was used in the B mode using a linear vascular sensor with a frequency of 7.5 MHz. The examination protocol included scanning the left and right carotid arteries and the area of the carotid sinus with focusing on the posterior wall of the arteries in three fixed projections - anterolateral, lateral and posterolateral. The examination was carried out in a prone position after a 15-minute rest. All measurements were performed sequentially for one session. The scanning procedure was recorded on a super-VHS PAL high-definition video recorder. Records were analyzed by a certified operator. The thickness of the intimal-medial layer of the carotid arteries was measured using the Prosound computer program (R. Seltzer, USA). The measurement was carried out on a section of the common carotid artery 10 mm long, opposite the beginning of the carotid sinus. The thickness of the intimal-medial layer of the posterior wall of the common carotid artery was determined as the distance from the leading edge of the first echogenic zone to the leading edge of the second echogenic zone. The average value of three measurements (anterolateral, lateral, and posterolateral projections) was considered as an integral indicator of the intimal-medial layer thickness.
В результате ультразвукового исследования у 12 человек (57%) было выявлено утолщение интимо-медиального слоя сонных артерий и подтвержден диагноз атеросклероз. У остальных 9 человек (43%) данный показатель оставался в пределах нормальных величин и свидетельствовал о том, что повышенный уровень ммЛП у данных лиц не привел к морфологическим изменениям (утолщению) интимо- медиального слоя в сонных артериях. As a result of ultrasound examination in 12 people (57%), a thickening of the intimal-medial layer of the carotid arteries was revealed and the diagnosis of atherosclerosis was confirmed. In the remaining 9 people (43%), this indicator remained within the normal range and testified to the fact that the increased level of mmLP in these individuals did not lead to morphological changes (thickening) of the intima-medial layer in the carotid arteries.
Таким образом, разработанный экспресс-способ определения атерогенности крови позволяет выявлять более ранние пред- атеросклеротические состояния на стадии до морфологических изменений в интимо-медиальном слое сонных артерий. В дальнейшем лица с инструментально подтвержденным атеросклерозом сонных артерий были инструментально обследованы на наличие атеросклероза коронарных артерий и атеросклероз коронарных артерий не был выявлен. Thus, the developed express method for determining blood atherogenicity allows one to detect earlier pre-atherosclerotic conditions at the stage of morphological changes in the intimal-medial layer of the carotid arteries. Subsequently, persons with instrumentally confirmed carotid atherosclerosis arteries were instrumentally examined for coronary arteriosclerosis and coronary arteriosclerosis was not detected.
Предлагаемый способ отличается простотой, включает всего 2 операции: смешивание сыворотки с раствором ПВП и регистрацию мутности. Для приготовления буфера необходимы широко распространенные реактивы: ПВП, NaCl и трис-HCl. Способ позволяет регистрировать наличие ммЛП непосредственно в сыворотке без предварительного ее фракционирования. Способ быстр (10 мин на 1 анализ). Использование простого и быстрого в осуществлении способа определения атерогенности крови позволяет выявлять доклинические состояния атеросклероза, может служить специфическим биохимическим маркером для терапии атеросклеротических заболеваний, позволит проводить углубленное исследование патогенеза атеросклероза, дает возможность их ранней профилактики и позволяет контролировать эффективность проводимой терапии. The proposed method is simple, includes only 2 operations: mixing serum with a solution of PVP and registration of turbidity. To prepare the buffer, widespread reagents are needed: PVP, NaCl, and Tris-HCl. The method allows to detect the presence of mmLP directly in serum without prior fractionation. The method is fast (10 min for 1 analysis). The use of a simple and quick method for determining blood atherosclerosis makes it possible to identify preclinical conditions of atherosclerosis, can serve as a specific biochemical marker for the treatment of atherosclerotic diseases, allows for an in-depth study of the pathogenesis of atherosclerosis, enables their early prevention and allows monitoring the effectiveness of the therapy.
Таблица 1 Table 1
Влияние ПВП на агрегацию ммЛП в пулированной сыворотке крови больных с атеросклерозом коронарных сосудов Influence of PVP on the aggregation of mmLP in pooled blood serum of patients with coronary atherosclerosis
Figure imgf000023_0001
Таблица 2
Figure imgf000023_0001
table 2
Влияние ПВП на агрегацию нативных липопротеинов в пулированной сыворотке крови здоровых доноров Influence of PVP on the aggregation of native lipoproteins in the pooled blood serum of healthy donors
Figure imgf000024_0001
Таблица 3
Figure imgf000024_0001
Table 3
Содержание холестерина, ТАГ и белков в ПВП-преципитатах приготовленных из пулированной сыворотки крови больных ИБС и здоровых доноров The content of cholesterol, TAG and proteins in PVP-precipitates prepared from the pulled blood serum of patients with coronary artery disease and healthy donors
Figure imgf000025_0001
Таблица 4
Figure imgf000025_0001
Table 4
Влияние времени инкубации сыворотки с 8,9% ПВП на агрегацию ммЛП The effect of the incubation time of serum with 8.9% PVP on the aggregation of mmLP
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000026_0001
Таблица 5Table 5
Степень связывания комплемента [ммЛП] в ПВП-преципитате в The degree of complement fixation [mmLP] in the PVP precipitate in
зависимости от концентрации  concentration dependent
Figure imgf000026_0002
Таблица 6
Figure imgf000026_0002
Table 6
Влияние ммЛП на агрегацию тромбоцитов The effect of mmLP on platelet aggregation
(индуктор АДФ, 1,25 мкМ/л)  (ADP inductor, 1.25 μM / L)
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000027_0001
Таблица 7Table 7
Влияние концентрации ммЛП на агрегацию тромбоцитов The effect of the concentration of mmLP on platelet aggregation
(индуктор АДФ, 1 ,25 мкМ/л)  (ADP inductor, 1.25 μM / L)
Figure imgf000027_0002
Таблица 8
Figure imgf000027_0002
Table 8
Влияние длительности хранения сыворотки крови на содержание ммЛП The effect of the duration of storage of serum on the content of mmLP
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000028_0001
Таблица 9 Table 9
Содержание [ммЛП] в сыворотке крови у больных ИБС и Serum [mmLP] content in patients with coronary artery disease and
здоровых доноров  healthy donors
Figure imgf000028_0002
Таблица 10
Figure imgf000028_0002
Table 10
Влияние ПВП на агрегацию множественно (ммЛП) в пулированной плазме крови больных ИБС The effect of PVP on multiple aggregation (mmLP) in the pulsed plasma of patients with coronary artery disease
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000029_0001
Таблица 11 Table 11
Влияние ПВП на агрегацию нативных липопротеинов в пулированной плазме крови здоровых доноров The effect of PVP on the aggregation of native lipoproteins in the pulsed plasma of healthy donors
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000030_0001
Таблица 12 Table 12
Атерогенность (ммЛП) крови больных ИБС и здоровых доноров по результатам экспресс-анализа цитратной плазмы Atherogenicity (mmLP) of blood of patients with coronary heart disease and healthy donors according to the results of rapid analysis of citrate plasma
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000031_0001

Claims

Формула изобретения Claim
1. Способ экспересс-определения атерогенности крови человека путем обработки сыворотки крови химическим реагентом с последующей регистрацией светопоглощения полученной смеси, отличающийся тем, что обработку ведут в цельной сыворотке крови 7,5-8,9%-ым раствором поливинилпирролидона, при объемном соотношении сыворотка:поливинилпирролидон от 1 :3 до 1 :8, пробы инкубируют 10 мин при комнатной температуре, измеряют светопоглощение в опытной и контрольной пробах, вычисляют разность между ними и при величине разности более 10 ЕД констатируют наличие атеросклеротического процесса в организме человека.  1. The method of express-determination of human blood atherogenicity by treating blood serum with a chemical reagent followed by recording the light absorption of the resulting mixture, characterized in that the processing is carried out in whole blood serum with a 7.5-8.9% solution of polyvinylpyrrolidone, with a volume ratio of serum: polyvinylpyrrolidone from 1: 3 to 1: 8, the samples are incubated for 10 min at room temperature, the light absorption in the experimental and control samples is measured, the difference between them is calculated, and when the difference is more than 10 PIECES, e atherosclerotic process in the human body.
2. Способ экспресс-определения атерогенности крови человека, заключающийся в том, что цельную плазму крови обрабатывают буфером, содержащим 10% поливинилпирролидон (ПВП) при объемном соотношении плазма:ПВП (1 :8), инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре, и при визуальном определении помутнения в пробе констатируют наличие атеросклероза у обследуемого человека. 2. The method of rapid determination of atherogenicity of human blood, which consists in the fact that whole blood plasma is treated with a buffer containing 10% polyvinylpyrrolidone (PVP) at a volume ratio of plasma: PVP (1: 8), incubated for 10 min at room temperature, and with a visual determination of turbidity in the sample, the presence of atherosclerosis in the examined person is noted.
3. Тест-система экспресс-определения атерогенности крови человека включает буфер- 1 для агрегации множественно модифицированных липопротеинов, представляющий собой 10% поливинилпирролидон 12600±2700 в 0,01 М Трис-НС1-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, буфер-2 для контрольной пробы, представляющий собой 0,01М Трис-НС1-буфер, рН 7,4, содержащий 0, 15 М NaCl. 3. The test system for the express determination of human blood atherogenicity includes buffer-1 for aggregation of multiple modified lipoproteins, which is 10% polyvinylpyrrolidone 12600 ± 2700 in 0.01 M Tris-HC1 buffer, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl, buffer-2 for the control sample, which is 0.01 M Tris-HC1 buffer, pH 7.4, containing 0.1 M NaCl.
PCT/RU2011/000620 2010-08-24 2011-08-16 Method for the rapid determination of blood atherogenicity WO2012026850A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201200991A EA201200991A1 (en) 2010-08-24 2011-08-16 METHOD FOR EXPRESS DETERMINING BLOOD ATHEROGENICITY

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2010135176/15A RU2437098C1 (en) 2010-08-24 2010-08-24 Method for instant determination of blood atherogenicity (versions)
RU2010135176 2010-08-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012026850A1 true WO2012026850A1 (en) 2012-03-01

Family

ID=45404444

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2011/000620 WO2012026850A1 (en) 2010-08-24 2011-08-16 Method for the rapid determination of blood atherogenicity

Country Status (3)

Country Link
EA (1) EA201200991A1 (en)
RU (1) RU2437098C1 (en)
WO (1) WO2012026850A1 (en)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2501013C1 (en) * 2012-07-26 2013-12-10 Батожаб Батожаргалович Шойбонов Method for determining minimum modified lipoproteins of low density in serum or plasma of human blood
RU2497116C1 (en) * 2012-08-10 2013-10-27 Батожаб Батожаргалович Шойбонов Method to determine atherogenicity of human blood
RU2549466C1 (en) * 2013-12-19 2015-04-27 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Нии Общей Патологии И Патофизиологии" Рамн Instant method for assessing atherogenicity of immune complexes of human blood serum
RU2549467C1 (en) * 2013-12-19 2015-04-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИНФ им. П.К. Анохина" РАМН) Method of determination of atherogenicity of immune complexes
RU2696569C1 (en) * 2018-11-15 2019-08-05 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский экономический университет им. Г.В. Плеханова" Method for determining atherogenic activity of food products

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1467516A1 (en) * 1986-07-14 1989-03-23 Белорусский Научно-Исследовательский Институт Туберкулеза Method of analyzing disturbance of lipoprotein spectrum of blood plasma
RU94010187A (en) * 1994-03-22 1996-09-27 Институт хирургии Восточно-сибирского научного центра СО РАМН Method of determining aggregation capacity of atherogenic lipoproteins
MXPA06012139A (en) * 2004-04-20 2007-01-17 Kimberly Clark Co Optical method and system to determine distribution of lipid particles in a sample.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1467516A1 (en) * 1986-07-14 1989-03-23 Белорусский Научно-Исследовательский Институт Туберкулеза Method of analyzing disturbance of lipoprotein spectrum of blood plasma
RU94010187A (en) * 1994-03-22 1996-09-27 Институт хирургии Восточно-сибирского научного центра СО РАМН Method of determining aggregation capacity of atherogenic lipoproteins
MXPA06012139A (en) * 2004-04-20 2007-01-17 Kimberly Clark Co Optical method and system to determine distribution of lipid particles in a sample.

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
M. EL-SAADANI ET AL.: "A spectrophotometric assay for lipid peroxides in serum lipoproteins using a commercially available reagent.", JOURNAL OF LIPID RESEARCH, vol. 30, 1989, pages 627 - 630 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2437098C1 (en) 2011-12-20
EA201200991A1 (en) 2013-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Horvath et al. Measurement of von Willebrand factor as the marker of endothelial dysfunction in vascular diseases
Lindsey et al. A Clinical Comparison of Calculated versus Direct Measurement of Low‐Density Lipoprotein Cholesterol Level
Bagrel et al. Relations between reported alcohol consumption and certain biological variables in an" unselected" population.
Gungor et al. Endothelial dysfunction markers in low cardiovascular risk individuals: comparison of males and females
WO2012026850A1 (en) Method for the rapid determination of blood atherogenicity
Yamanishi et al. Plasma concentrations of platelet-specific proteins in different stages of essential hypertension: interactions between platelet aggregation, blood lipids and age
RU2444014C1 (en) Medium and method for detection of multiply modified blood serum lipoproteins
JPH08509806A (en) Methods and assays
NO335704B1 (en) Quick test and kit for diagnosis of Alzheimer's disease.
RU2498307C2 (en) Method for evaluating risk of clinical complications of atherosclerosis
Steward et al. Circulating antigen-antibody complexes in onchocerciasis.
Cooper et al. Family history of hypertension and red cell cation transport in high school students
Ramsis et al. Relation between carotid intima-media thickness, platelet surface activation and endothelial cell markers
RU2694531C1 (en) Method for diagnosing lipidemia
RU2694538C1 (en) Diagnostic technique for early and late stages of lipidemia
Irish et al. Lipoprotein (a) concentration in diabetes: relationship to proteinuria and diabetes control
RU2680848C1 (en) Method for assessing character of autoimmune reaction of human body to multiple modified low-density lipoproteins in lytic test
RU2592238C1 (en) Method for separation and quantitative determination of multiply modified low-density lipoproteins
RU2437103C2 (en) Method for detection of disturbed cholesterol metabolism in body
Donnelly et al. Is heparinized plasma suitable for use in routine biochemistry?
Jabbar et al. To compare the total cholesterol and HDL-cholesterol before and after ultra-centrifugation in lipemic samples
RU2721687C1 (en) Method for prediction of possible thrombogenic complications in atherogenic genesis lipidemia and clinical diagnosis of stress angina of different functional classes
Akanji et al. Lipoprotein (a), tissue plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor 1 levels in hyperlipidaemic patients in Kuwait
RU2694534C1 (en) Method for assessing the effectiveness of the treatment of lipidemia
RU2714689C1 (en) Method for prediction of clinical course of lipidemia

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11820245

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201200991

Country of ref document: EA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11820245

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1