WO2012023781A2

WO2012023781A2 - 항적조 활성을 가지는 펩타이드 및 그의 용도

Info

Publication number: WO2012023781A2
Application number: PCT/KR2011/006001
Authority: WO
Inventors: 박윤경; 김시욱; 박성철
Original assignee: 조선대학교산학협력단
Priority date: 2010-08-18
Filing date: 2011-08-16
Publication date: 2012-02-23
Also published as: WO2012023781A3; WO2012023781A9

Abstract

본 발명은 적조 방제 활성을 갖는 항적조 펩타이드 P5에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명에 의한 항적조 펩타이드는 적조 유발 조류에 대하여 탁월한 항적조 활성을 나타내고, 유익한 조류에는 독성이 없으며, 자연 분해가 가능하므로 해양 생태계에 안전하고 유용하게 사용될 수 있고, 또한, 생물체 유래의 천연 항적조 펩타이드에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명에 따른 HPA3NT3 펩타이드는 탁월한 항적조 활성을 나타내며, 이러한 항적조 활성은 적조유발 생물에만 선택적으로 나타나며, 자연 분해가 가능하며, 세포 독성이 없으므로 해양 생태계에 안전하고 유용한 항적조제로써 사용될 수 있다.

Description

【명세서】

【발명의 명칭】

항적조 활성을 가지는 템타이드 및 그의 용도

【기술분야】

본 발명은 적조 생물의 생육을 저해하는 활성을 갖는 항적조 펩타이드 및 이 를 함유하는 적조 방제용 조성물에 관한 것이다.

【배경기술】

적조란 (Red tides 또는 Harmful Algal Blooms) 바다에 사는 폴랑크톤이 대량 번식하여 바닷물 색깔을 갈색이나 빨간색으로 변색시키며 생태계를 파괴시키는 현 상이다. 적조생물의 종류는 전 세계적으로 200종이 넘고 우리나라 연안에서 나타나 는 적조생물은 40종 여종이다. 적조로 인한 피해는 크게 두 가지로 나를 수 있는 데 첫째는 어패류의 대량폐사나 인명피해이고， 또 하나는 관광산업의 피해이다. 구체적으로 살펴보면, 적조생물이 독성이 있는 유독성일 경우 어폐류들이 먹이를 잡기 위하여 물을 빨아들이는 과정에서 유독성 적조생물을 먹으면 독소에 중독이 되고 결국 죽게 된다. 적조생물이 대량으로 번식한 뒤 질소， 인 등 영양염류를 다 써 버리면 일시에 죽어 해저에 가라앉게 되는데 이때 세균들이 이들을 분해하며 이 분해과정에서 세균들이 산소를 모두 써버리고 결국 해저는 무산소 상태가 되는데 운동성이 크게 떨어지는 패류들은 질식하여 죽게 된다. 또한， 적조는 주로 수온이 높고 바람이 세지 않은 늦봄과 여름에 자주 발생한다. 이 시기는 많은 관광객들이 해변을 찾아 수영을 하거나 구경을 하는 때인데 관광객들이 수영할 때 독성 적조생 물이 들어 있는 물을 마시고 죽거나 마비가 될 수 있어 미국과 스페인， 이탈리아 등 많은 유럽 국가들은 해수욕장을 폐쇄하므로 관광수입에 막대한 피해를 준다. 우리나라의 경우 남해안의 넓은 해역에서 발생하며 남해안에서 일어나던 적조가 동 해， 서해안에서도 발생하고 있다. 특히 서해안의 경우 1993년부터 천수만에서， 1995년부터는 전북연안에서 적조가 해마다 반복적으로 발생하고 있는데 1998년부터 는 유해성 적조가 대규모로 발생하고 있다. 씨. 폴리크리코이데스 종은 푸에르토 리코 (Puert) 연안에서 처음 발견되었으 며 (Margalef, 1961), 이후 북미 대서양 연안의 뉴저지주 바메가트 (Bamegat)만과 미 국 캘리포티아 연안에서 적조를 유발한 C. heterolobatumCSilva, 1967)과 같은 종 으로 간주되고 있다. 이 종은 일본의 하리마 나다 (Harima Nada)와 구주의 야츠시 로 (Yatsushiro)만에서 적조를 일으켜 수산피해를 일으킨 이래 (Yuki and Yoshimatsu, 1989), 일본 중부와 서부 연안에서도 적조를 일으켰다고 보고되었다 (Fukuyo et al . , 1990). 최근 캐나다 (Whyte et al . , 2000) , 멕시코의 캘리포니아 만 (Gulf of California)(Carate Lizarraga et al . , 2000), 및 중남미의 구아테말라 (Guatemala)의 태평양 연안에서도 적조를 일으킨다고 보고되었다. 또한 와편모조 류에 속하는 피 . 미니멈 (尸. minimum) , 및 피 . 미캔스 ( micans^ 침편모조강에 속하는 에이치 . 아카쉬우 07. akashiwo) , 샤또넬라 ^^^ Chattonel la sp.) 및 씨 . 마리나 (C. marina) 역시 적조를 유발한다고 알려져 있다. 샤또넬라 에스피 {Chattonella 의 경우 적조생물밀도가 50 이상일 때， 반경 2 ~ 5Km 수역에 걸 쳐 발생하고 어업피해가 우려되어 적조주의보가 발령되며， 적조생물밀도가 100 이 상일 때에는 반경 5Km이상 수역에 발생하여 상당한 어업피해가 예상되어 적조경보 가 발령된다. 현재까지 적조를 예방하거나 적조로 인한 피해를 줄이기 위한 여러 가지 방 법들이 연구되었다. 화학약품을 뿌리거나 초음파 분쇄기， 오존 발생기， 원심분리 기를 사용하여 화학적， 물리적으로 적조생물을 없애는 방법이 있다. 또한 점토를 이용하여 적조 원인생물을 홉착시켜 바닥으로 침전시키는 방법도 개발되었다. 그 러나 이런 방법들은 생태계에 또 다른 악영향을 미칠 수 있으며， 광범위한 적조 발 생해역에서 이용되기에는 많은 문제점이 있다. 현재 적조 원인생물을 제거하는 생 물학적 방법도 연구가 진행되고 있다. 이것은 생태계 내에서 피식자-포식자 관계 를 이용해 원하지 않는 생물을 제거하는 방법이다. 그러나， 이 방법은 생태계의 먹이 사슬을 변화시켜 또 다른 문제점을 야기할 수도 있올 것이다. 또 다른 분야 에서는 해양박테리아가 분비하는 물질에 의한 적조생물을 죽이는 방법도 활발히 연 구되고 있다. 최근에는 단백질 합성저해제， 세포벽 저해제 및 세포막에 작용을 하 는 항생제들올 사용하여 적조생물을 방제하는 시도를 하고 있다. 또는 이러한 물 질들을 모델로 하여 인위적으로 저분자 물질들을 유기합성을 하여 생산하기도 하는 데 이는 바다에서 분해가 되지 않고 축적되어 결국 농업부분에서 사용되는 농약에 의해 야기되는 문제점들처럼 해양 생태계나 바다에서 생산되는 먹거리들을 통해 인 체에까지 축적될 것이다.

이러한 문제점들을 고려해볼 때 자연분해가 가능하며 인체나 자연 생태계에 무해한 항적조제로써 사용될 수 있는 것이 펩타이드나 단백질제제이다. 이들은 또 한 유전자 조작을 통하여 대량 발현하여 생산단가를 줄일 수 있을 뿐만 아니라 적 조생물에 특이하게 부착하는 박테리아나 바이러스의 표면에 펩타이드를 발현하여 항적조 활성을 나타나게 할 수도 있을 것이다. 현재까지 벌독으로부터 정제된 양친매성 알파 나선구조를 가지는 항균 펩타 이드인 메스토파란 비 (Mastoparan B)가 적조생물인 알렉산드리움 타마렌스 {Alexandriim tamarense)^ 샤토넬라 카테나튬 (( a"o3e//a catenatum)°i\ 대해 살 조효과를 확인된 바 있다. 그러나 이 펩타이드는 낮은 농도에서 세포독성이 높게 나타나는 것으로 보고되어 있다. 세크로핀 (Cecropin) 계열의 양친매성 펩타이드는 초파리에서 처음 발견되었 고， 그 후 누에 번데기 및 돼지의 작은 창자에서도 발견되었는데， 세크로핀 A(Cecropin A)는 항균활성은 높으나 항진균 및 항암활성은 미미한 것으로 보고되었 으며 (Boman, H. G. and Hultmark, D.， Annu. Rev. Microbiol. , 1987, 41， 103)， 또 한 마가이닌 2(Magainin 2) 펩타이드는 세포독성이 없으면서 항균활성과 함께 항진 균， 항암 및 항-원생생물 효과가 있다고 알려져 있다 (Zasloff, M. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987， 84， 5449) . 아울러 , 이러한 두 펩타이드의 일부 서열들을 재조합시킨 접합 펩타이드 (conjugation peptide)를 제조하여 항균， 항진균 또는 항 암 활성이 탁월한 새로운 합성 펩타이드 (CA-MA 펩타이드)를 제조할 수 있음이 알려 져 있다 (Chan, H. C.， et al. , FEES Lett., 1989, 259, 103； Wade, D.， et al . , Int. J. Pept. Prot. Res. , 1992, 40， 429). 이러한， CA-MA 펩타이드는 박테리아 에 대하여 항생활성을 가지고 것으로 보고되었다. 상기 양전하성 펩타이드는 음전 하를 띠는 박테리아의 세포막에 전기적인 상호작용에 의하여 결합하고 친수성과 소 수성의 아미노산에 의해 양친매성 나선 구조를 가지게 세포막에 구멍을 뚫어 막전 위를 변화시키거나 세포막을 파괴하여 항균활성을 가진다. 이에， 본 발명자들은 항적조 활성을 나타내고, 유익한 조류에 대한 독성이 없으며， 자연 분해가 가능한 항적조제를 개발하고자 예의 노력한 결과， 항균 효과 가 알려진 CA-MA(£ecropin A - fegainin 2) 펩타이드의 아미노산 중 하나 또는 그 이상을 치환하여 양전하와 소수성 영역이 증가된 P5 펩타이드를 제작하여， 적조생 물 및 유익한 규조류의 배양에 첨가하여， P5 펩타이드의 적조생물에 한정적인 항적 조 활성을 확인하였다. 또한， 헬리코박터 파이오리 유래의 H 2-20) 펩타이드를 모체로 하여 소수성 부분을 증가시킨 유사체 (HPA3) 펩타이드와 HPA3 펩타이드의 불규칙한 구조를 가지 는 N-말단 부분을 절단시킨 후 양이온을 증가시킨 유사체인 HPA3NT3 펩타이드 중 HPA3NT3 펩타이드가 적조생물에 탁월한 항적조 활성을 띠고 세포 독성 (용혈활성)에 대한 안정성을 가지고 있음을 확인하였다.

따라서， P5 펩타이드 또는 HPA3NT3 펩타이드는 각각 항적조제로 유용하게 사 용할 수 있음을 밝힘으로써， 본 발명을 완성하였다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

본 발명의 목적은 우수한 항적조 활성을 갖는 P5 펩타이드， 이의 제조방법 및 상기 템타이드를 함유하는 항적조용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 우수한 항적조 활성을 갖는 HPA3NT3 펩타이드， 이 의 제조방법 및 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물을 제 공하는 것이다.

【기술적 해결방법】

본 발명은 항적조 활성을 갖는， 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열올 갖 는 P5 펩타이드를 제공한다.

또한， 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 P5 펩타이드 의 제조방법을 제공한다.

또한， 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 P5 펩타이드 를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물을 제공한다.

또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 P5 펩타이드의 적조 방제용 조성물 을 적조 발생이 예상되는 수역에 살포하는 단계를 포함하는 적조 예방 방법을 제공 한다.

또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 P5 펩타이드의 적조 방제용 조성물 을 적조 발생 수역에 살포하는 단계를 포함하는 적조 제거 방법을 제공한다.

또한， 본 발명은 적조 방제용 조성물로 사용하기 위한， P5 펩타이드를 제공 한다.

본 발명은 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는, HPA3NT3 펩타이드 를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 HPA3NT3 펩타 이드의 제조방법올 제공한다.

또한， 본 발명은 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열올 갖는 HPA3NT3 펩타 이드를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 HPA3NT3 펩타이드의 적조 방제용 조성물올 적조 발생이 예상되는 수역에 살포하는 단계를 포함하는 적조 예방 방법 올 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 HPA3NT3 펩타이드의 적조 방제용 조성물을 적조 발생 수역에 살포하는 단계를 포함하는 적조 제거 방법을 제공한다. 아울러， 본 발명은 적조 방제용 조성물로 사용하기 위한， HPA3NT3 펩타이드 를 제공한다. 이하， 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.

'적조 방제 '란 항적제, 적조 방지， 살조 및 항조류 등의 여러가지 용어로 사 용되며， 적조를 일으키는 조류 (algae)의 생장을 억제하거나， 사멸시키거나， 운동성 을 억제하는 등 조류의 증식을 막아 적조를 일으키는 현상을 제거하는 것을 의미한 다. 또한， 보다 넓게는 적조를 일으키는 원인 조류를 사멸시키거나 생육을 억제한 다는 의미도 포함한다.

'양친매성 펩타이드 (amphipathic peptide)'은 친수성 및 소수성 지역이 흔재 하고 펩타이드를 의미한다. 특히， 이러한 성질로 인해 친수성 부분은 물과 같은 극성 용매에 노출되도록 외부에 위치하고 소수성 부분은 단백질 내부에 위치하여 나선형 구조를 이를 수 있는 펩타이드를 의미한다. 이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 항적조 활성올 갖는， 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖 는 P5 템타이드를 제공한다.

본 발명의 P5 펩타이드는 세크로핀 (Cecropin A, CA)과 마가이닌 (Magainin 2， MA)을 접합시켜 제조한 서열번호 1로 기재되는 CA-MA Cecropin A - Magainin 2) 펩 타이드의 아미노산 중 하나 또는 그 이상을 치환하여 양전하와 소수성 영역이 증가 된 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 구체적으로， 본 발명의 P5 펩타이드는 친화성 나선모양을 가진 CA(Cecropin A)의 1-8 아미노산 부위와 MA(Magainin 2)의 1-12 아미노산 부위를 접합한 서열번 호 1로 기재되는 CA-MA 펩타이드의 하인즈 부위 (hinge region)와 하나 또는 그 이 상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여 양전하와 소수성 영역이 증가된 합성 펩타이드인 것이 바람직하며, 서열번호 1로 기재되는 CA-MA 펩타이드의 하인즈 부 위에 존재하는 글리신-이소루이신-글리신을 각각 프를린으로 치환하고 4번째 류신， 8번째 이소루이신， 14번째 류신， 15번째 히스티딘 각각을 라이신으로， 5번째 페닐 알라닌과 6번째 라이신， 12번째 라이신， 13번째 페닐알라닌， 16번째 세린， 17번째 알라닌， 20번째 페닐알라닌을 류신으로 치환하여 제조된 서열번호 2로 기재되는 펩 타이드인 것이 가장 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 P5 펩타이드는 씨 . 폴리크리코이데스 (C. polykrikoides) , 씨 . 마 리나 (C. marina)^ 에이치. 아카쉬우 ( akashiwo) — 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 적조유발 해조류에 대하여 항적조 활성을 갖는 것이 바람직하며， 에스. 코 스타튬 (5. cost at um)^} 대하여 항적조 활성을 나타내지 않는 것이 바람직하나， 이 에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적이 실시예에서， 서열번호 1로 기재되는 CA-MA 펩타이드의 하인즈 부위에 존재하는 글리신-이소루이신-글리신올 각각 프를린으로 치환하고 4 번째 류신， 8번째 이소루이신， 14번째 류신， 15번째 히스티딘 각각올 라이신으로, 5번째 페닐알라닌과 6번째 라이신， 12번째 라이신， 13번째 페닐알라닌， 16번째 세 린, 17번째 알라닌， 20번째 페닐알라닌을 류신으로 치환하여 제조된 서열번호 2로 기재되는 펩타이드를 제조하였다. 이와 같이 제조된 본 발명의 펩타이드를 분리 · 정제하고 그 순도를 확인한 결과 95% 이상의 순도를 나타내었으며, MALDKMatrix- Assisted Laser Desorption Ionization) 질량 분석법을 이용하여 얻은 분자량이 아 미노산서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하는 것올 확인하였다 (표 1 참조). 또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명에 따른 P5 펩타이드가 CA-MA 펩타이드 보다 뛰어난 항적조 활성을 갖는지를 확인하기 위하여， 본 발명자들은 적 조생물에 대한 상기 두 종류의 펩타이드의 50% 생육 저해농도 (50% of inhibitory concentration, IC50)를 측정하였다. 그 결과， 실험에 사용된 씨. 폴리크리코이데 스 (C. polykrikoides) , 에이치 . 아카쉬우 ( akashiwo) , 샤또넬라 에스피 (Chat tone! J a sp) , 씨. 마리나 (C. marina) , 피. 미니멈 (Z⁵. minimum) , 피. 미캔스 (P. mi cans) , 및 에스. 코스타륨 (5. costatum) 적조생물에 대하여， CA-MA 펩타이드 에 비하여 P5 펩타이드는 보다 낮은 농도에서 조류의 생육을 저해하는 것을 확인할 수 있었다 (표 2 참조). 즉， P5 펩타이드는 CA-MA에 비하여 우수한 항적조 활성을 갖고 있음을 확인할 수 있었다.

또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명에 따른 P5 펩타이드의 셀를 로우스 (celluose) 세포벽을 가지고 있는 씨. 폴리크리코이데스 (C. polykrikoides) 에 대한 항적조 활성을 관찰하였다. 배양된 씨 . 폴리크리코이데스의 배지에， CA- MA 펩타이드와 P5 펩타이드를 첨가하여 24시간 배양한 후 관찰한 결과， 64 μΜ CA- MA 펩타이드를 처리한 군에 비하여， 8 μΜ의 Ρ5 펩타이드를 처리한 군에서 씨. 폴 리크리코이데스의 외형 및 소기관들의 형태가 더욱 많이 사라지는 것을 관찰할 수 있었다 (도 1 참조).

또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서， Ρ5 펩타이드의 셀를로우스 세포벽을 갖고 있지 않은 씨. 마리나 (C. marina) 및 에이치. 아카쉬우 ( . akashiwo)^} 대한 항적조 활성을 관찰하였다. 씨. 마리나에는 P5 펩타이드를 2 μΜ 처리하였으며， 에이치. 아카쉬우 ( . a^as?/>o)에는 CA-MA 펩타이드를 4 μΜ 처리하였다. 그 결 과， 도 2에 나타난 바와 같이， CA-MA 펩타이드를 처리한 에이치. 아카쉬우에 비하 여， 낮은 농도로 처리한 Ρ5 펩타이드에서 씨. 마리나의 외형 및 소기관들의 형태가 더욱 많이 무너지는 것을 관찰할 수 있었다 (도 2 참조).

또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명에 따른 Ρ5 펩타이드를 유익 한 규조류에 처리하여， 이의 항적조 활성이 적조생물에 한정되는 것임을 확인하고 자 하였다. 에스. 코스타튬을 배양한 후， CA-MA 펩타이드 (32 μΜ) 및 Ρ5 펩타이드 (256 μΜ)를 처리한 후， 광학현미경으로 관찰한 결과， 도 3에 나타난 바와 같이， 배양 후 24시간 내지 72시간의 변화에도 상기 규조류의 변화가 관찰되지 않았다 (도 3 참조).

따라서， 본 발명에 따른 Ρ5 펩타이드는 유해한 적조생물에 대하여 항적조 활 성을 가지고 있으며, 이러한 항적조 활성은 낮은 농도에서도 유효하게 작용되며， 보다 구체적으로 샐를로우스 세포벽이 없는 적조생물부터， 셀를로우스 세포벽을 갖 는 적조생물에까지 항적조 활성을 보이며, 유익한 규조류에는 영향을 미치지 않기 때문에， Ρ5 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 조성물을 항적조제로써 유용하게 사 용될 수 있다. 또한， 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 Ρ5 펩타이드 의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 Ρ5 펩타이드는 세크로핀 (Cecropin A, CA)과 마가이닌 (Magainin 2， MA)을 접합시 켜 제조한 서 열번호 1로 기 재되는 CA-MA 펩타이드의 아미노산 중 하나 또는 그 이상을 치환하여 양전하와 소수성 영 역 이 증가된 것 이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다 .

구체적으로， 본 발명 의 P5 펩타이드의 제조방법에 있어서， 친화성 나선모양 을 가진 CA(Cecropin A)의 1-8 아미노산 부위와 MA(Magainin 2)의 1-12 아미노산 부위를 접합한 서 열번호 1로 기 재되는 CA-MA 펩타이드의 하인즈 부위 (hinge region)와 하나 또는 그 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여 양전하와 소수성 영 역 이 증가된 합성 펩타이드인 것 이 바람직하며， 서 열번호 1로 기 재되는 CA-MA 펩타이드의 하인즈 부위에 존재하는 글리신-이소루이신-글리신을 각각 프를 린으로 치환하고 4번째 류신， 8번째 이소루이신 , 14번째 류신， 15번째 히스티딘 각 각을 라이신으로， 5번째 페닐알라닌과 6번째 라이신， 12번째 라이신， 13번째 페닐 알라닌， 16번째 세린 , 17번째 알라닌 , 20번째 페닐알라닌을 류신으로 치환하는 단 계를 포함하는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다 .

본 발명의 구체적 인 실시 예에서 확인할 수 있듯이， 상기와 같은 단계를 포함 하는 제조단계에 의해서 서 열번호 1로 기 재되는 CA-MA 펩타이드의 아미노산올 치환 하여 제조된 서 열번호 2로 기 재되는 P5 펩타이드는 적조 유발 조류에 대하여 우수 한 항적조 활성을 보였다 . 또한， 본 발명은 서 열번호 2로 기 재되는 아미노산 서 열을 갖는 P5 펩타이드 를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물을 제공한다 .

본 발명의 P5 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물은 세크 로핀 (Cecropin A, CA)과 마가이닌 (Magainin 2， MA)올 접합시켜 제조한 서 열번호 1 로 기 재되는 CA-MA 펩타이드의 아미노산 중 하나 또는 그 이상을 치환하여 양전하 와 소수성 영 역 이 증가된 것 이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다 .

구체적으로， 본 발명 의 P5 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물은에 있어서 , P5 펩타이드는 친화성 나선모양을 가진 CA(Cecropin A)의 1-8 아미노산 부위와 MA(Magainin 2)의 1-12 아미노산 부위를 접합한 서 열번호 1로 기 재되는 CA-MA 펩타이드의 하인즈 부위 (hinge region)와 하나 또는 그 이상의 아미 노산을 다른 아미노산으로 치환하여 양전하와 소수성 영 역 이 증가된 합성 펩타이드 인 것 이 바람직하며， 서 열번호 1로 기 재되는 CA-MA 펩타이드의 하인즈 부위에 존재 하는 글리신-이소루이신-글리신을 각각 프를린으로 치환하고 4번째 류신， 8번째 이 소루이신， 14번째 류신， 15번째 히스티 딘 각각을 라이신으로， 5번째 페닐알라닌과 6번째 라이신， 12번째 라이신， 13번째 페닐알라닌， 16번째 세린， 17번째 알라닌， 20번째 페닐알라닌을 류신으로 치환하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.

상기 본 발명의 P5 펩타이드는 씨 . 폴리크리코이데스 (C. polykrikoides) , 씨 . 마리나 (C. marina)^ 에이치. 아카쉬우 07. akashiwo)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 적조유발 해조류에 대하여 항적조 활성올 갖는 것이 바람직하며, 에스. 코스타튬 (5. cost at urn) 대하여 항적조 활성을 나타내지 않는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.

상기 적조 방제용 조성물에 추가될 수 있는 성분으로는 이미 적조 방제용으 로 사용하고 있는 황토가 바람직하다. 그러나 이에 한정되지 않고 본 발명의 적조 방제용 펩타이드를 해양에 적절히 분산 또는 중합체에 적절히 섞어진 상태로 분산 시킴으로써 그 효과를 증진시킬 수 있는 것은 무엇이나 조성물에 추가될 수 있을 것이다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 P5 펩타이드의 적조 방제용 조성물 을 적조 발생이 예상되는 수역에 살포하는 단계를 포함하는 적조 예방 방법올 제공 한다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 P5 펩타이드의 적조 방제용 조성물 을 적조 발생 수역에 살포하는 단계를 포함하는 적조 제거 방법을 제공한다. 또한， 본 발명은 적조 방제용 조성물로 사용하기 위한, P5 펩타이드를 제공 한다. 또한， 본 발명은 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는, HPA3NT3 펩 타이드를 제공한다.

상기， HPA3NT3 펩타이드는 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것 이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 상기， HPA3NT3 펩타이드는 서열번호 4로 기재되는 HPA3 펩타이드의 9번째 글루탐산 (Glu)과 13번째 세린 (Ser)을 라이신 (Lys) 으로 치환한 서열인 것이 바람직하며， 상기 HPA3 펩타이드는 서열번호 3으로 기재 되는 헬리코박터 파이오리로부터 유래한 HP(2— 20) 펩타이드의 16번째 글루타민 (Gin)과 18번째 아미노산인 아스파르트산 (Asp)을 트립토판 (Trp)으로 치환한 서열을 갖는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다 .

또한， 상기 적조 방제용 조성물은 씨 . 폴리크리코이데스 (C. polykrikoides) , 씨. 마리나 (C. marina)^ 에이치. 아카쉬우 07. akashiwo)로— 이루어진 군에서 선택 된 1종 이상의 적조유발 해조류에 대하여 항적조 활성을 갖는 것이 바람직하며, 에 스. 코스타튬 (5. costatuniy^ 대하여 항적조 활성을 나타내지 않는 것이 바람직하 나， 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 양친매성 항적조 펩타이드를 합성하기 위하여， 헬리코박터 파이오리로부터 유래한 HP(2-20) 펩타이드와 상기 HP(2-20) 펩타이드의 16번째 아미노산인 글루타민 (Gin)과 18번째 아미노산인 아스 파르트산 (Asp)을 트립토판 (Trp)으로 치환한 유사체 HPA3 펩타이드 및 HPA3에서 구 조적으로 불규칙한 N-말단 부위를 절단한 후 양이온을 증가시키기 위하여 9번째 글 루탐산 (Glu)과 13번째 세린 (Ser)을 라이신 (Lys)으로 치환한 아미노산 서열을 갖는 HPA3NT3 펩타이드를 제조하였다 (표 3 참조).

또한， 상기 실시예에서 제조한 HPA3 펩타이드와 HPA3NT3 펩타이드의 항적조 활성을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 적조생물에 대한 상기 두 종류의 펩타이드 의 50% 생육 저해농도 (50% of inhibitory concentration, IC₅₀)를 측정하였다. 그 결과， 실험에 사용된 씨 . 폴리크리코이데스 (( . polykrikoides) , 피 . 미니멈 minimum) , 피. 미캔스 ( mi cans) , 에이치. 아카쉬우 ( akashiwo) , 에이치. 아카 쉬우 ( . akashiwo RA-02Q), 에이치. 아카쉬우 ( . akashiwo RA-018). 샤또넬라 에스 ^ Chattonella sp) , 씨. 마리나 (C. marina) , 및 에스. 코스타튬 (5. cost at urn) 적 조생물에 대하여， HPA3 펩타이드에 비하여 HPA3NT3 펩타이드는 보다 낮은 농도에서 조류의 생육을 저해하는 것을 확인할 수 있었다 (표 4 참조). 즉, HPA3NT3 펩타이 드는 HPA3에 비하여 우수한 항적조 활성이 있음을 확인할 수 있었다.

또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서， HPA3NT3 펩타이드의 셀를로우스 세포 벽을 갖고 있지 않은 씨. 마리나 (C. marina) 및 에이치. 아카쉬우 ( . akashiwo)^] 대한 항적조 활성을 관찰하였다. HP(2-20) 펩타이드， HPA3 펩타이드， 및 HPA3NT3 펩타이드 (32 μΜ/웰)를 처리한 적조에서는 펩타이드 처리 2분 후， 거의 모든 생물 체가 다 터져， 생물체 내의 물질이나 소기관들이 밖으로 유출되었으며， 특히 ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드의 활성이 가장우수하였다 (도 4 참조).

또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명에 따른 ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드의 셀를로우스 (celluose) 세포벽이 있는 씨. 폴리크리코이데스 (C. polykrikoides)^ 피. 미니멈 (ΛΗ/ / ΛΗ)에 대한 항적조 활성을 관찰하였다. 배양된 씨. 폴리크리코 이데스와 피. 미니멈의 배지에, HPA3 펩타이드， 및 HPA3NT3 펩타이드를 첨가하여 배양한 후 관찰한 결과， 세포벽이 없는 적조에 비하여， 펩타이드가 활성을 보이는 시간은 1시간 정도 더 늦지만 HPA3NT3 펩타이드가 무처리군과 HPA3 펩타이드를 처 리한 군에 비하여， 우수한 항적조 활성을 보였다 (도 5 참조).

또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명에 따른 HPA3NT3 펩타이드를 유익한 규조류에 처리하여, HPA3NT3 펩타이드의 항적조 활성이 적조생물에 선택적 으로 작용하는 것을 확인하고자 하였다. 에스. 코스타튬을 배양한 후， HPA3NT3 펩 타이드 및 HPA3 펩타이드를 처리한 후， 광학현미경으로 관찰한 결과， 도 6에 나타 난 바와 같이， 3일 동안 배양하여도 상기 규조류의 변화가 관찰되지 않았다 (도 6 참조). 즉， HPA3NT3 펩타이드는 적조 현상을 유발하는 생물에 선택적으로 항적조 활성을 보이며， 에스. 코스타튬과 같은 유해하지 않은 규조류에는 아무런 영향을 끼치지 않는 것을 확인할 수 있었다.

또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명에 따른 HPA3NT3 펩타이드의 선택적인 항적조 활성을 확인하기 위하여， 적조 현상을 유발하는 생물과 그렇지 않 은 유익한 규조류를 공동배양한 후， HPA3NT3 펩타이드와 HPA3 펩타이드를 각각 처 리한 결과， 처리 2일 후 유익한 규조류인 에스. 코스타튬에는 변화가 보이지 않았 으나， 유해한 적조 생물인 씨. 마리나， 에이치. 아카쉬우， 및 피. 미니멈은 생물체 내의 물질이나 소기관들이 사라진 것을 관찰할 수 있었다. 즉， HPA3NT3 펩타이드 의 적조생물에 대한 선택적인 항적조 활성을 확인할 수 있었다 (도 7 참조).

또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명에 따른 HPA3NT3 펩타이드가 적조 생물의 세포막에 결합하여 항적조 활성을 나타내는 것인지를 확인하기 위하 여， HPA3NT3 펩타이드에 형광물질올 표지한 후， 배지에 첨가하여 배양하였다. 그 결과， 도 8a-c에 나타난 바와 같이 셀를로우스 벽이 있는 씨. 마리나와 에이치. 아 카쉬우에서는 최외각의 세포막에 형광물질이 표지된 펩타이드가 관찰되었으며， 셀 를로우스 벽이 없는 적조생물인 피. 미니멈에서는 샐를로우스 층 바로 안쪽에 펩타 이드가 위치하는 것을 관찰할 수 있었다. 즉， 본 발명에 따른 HPA3NT3 펩타이드는 적조 생물이 세포막에 결합하여， 적조생물을 파괴하는 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 8a-c 참조).

또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서 , 본 발명에 따른 HPA3NT3 펩타이드의 항적조 활성이 적조 생물의 광합성을 저해함으로써 유도되는 것인지를 확인하기 위 하여, 적조 생물의 클로로필 에이 (chlorophyll a)의 함량을 측정하고자 하였다. 그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 에이치. 아카쉬우 알에이 -020 적조 생물에 HPA3NT3 펩타이드와 HPA3 펩타이드를 각각 처리한 후， 클로로필 에이의 함량을 측 정한 결과， 배양시간이 길어질수록 HPA3NT3 펩타이드를 처리한 군에서 클로로필 에 이의 함량이 HPA3 펩타이드를 처리한 군과 아무것도 처리하지 않은 무처리 대조군 에 비하여 현저하게 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서， 본 발명의 HPA3NT3 펩타이드는 적조 생물의 광합성을 저해하여， 적조 생물의 사멸의 유도할 수 있음을 확인하였다 (도 9 참조).

또한， 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명에 따른 HPA3NT3 펩타이드가 세포막을 투과하는지를 확인하기 위하여， 적조 생물 에이치. 아카쉬우를 배양한 뒤 ， 핵을 염색하는 싸이록스 그린 (SYTOX green)을 배지에 첨가하여 반응시킨 후, HPA3NT3 펩타이드를 0.25， 0.5μΜ 첨가한 후， 형광의 세기를 형광 분광기를 이용하 여 측정하였다. 그 결과， 도 10에 나타난 바와 같이, ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드의 농도가 증가할수록 형광의 세기가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 반면， 유해하지 않은 규조류인 에스. 코스타튬에 ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드를 256， 512 μΜ을 첨가한 후， 형광의 세기는 0에 가까웠다. 즉， ΗΡΑ3 펩타이드는 적조 생물 선택적으로 세포막을 투과 하는 성질이 있으며， 이로 인하여 싸이특스 그린의 형광 세기가 에이치. 아카쉬우 에서만 증가하는 것올 관찰할 수 있었다 (도 10 참조).

또한， 본 발명의 구체적인 실험예에서 본 발명에 따른 ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드의 세포독성을 확인하기 위하여， 물고기의 적혈구를 회석한 후， 펩타이드를 첨가한 후 , 적혈구의 파괴 정도를 트리톤 X-100(Triton X—100)의 적혈구 파괴능을 기준으로 본 발명의 펩타이드의 적혈구 파괴능을 비교하였다. 그 결과， 도 11에 나타난 바 와 같이， 벌의 독성성분으로써 용혈작용이 알려진 멜리틴 (melittin)을 첨가시에는 20 yM 이하에서부터 100%의 용혈반응이 관찰되었으나， HPA3 펩타이드를 첨가하였 을 때는 용혈반웅이 20 μΜ 이하에서는 거의 발생되지 않았으나， 64 μΜ 이상을 처 리하였을 때에는 약 80%의 용혈반응이 관찰되었다. 그러나 ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드를 첨 가하였올 때에는 128 μΜ 농도에서도 용혈반웅이 10¾> 이하로， 거의 발생하지 않은 았는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서， 본 발명의 ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드는 세포 독성이 거의 없다는 것을 확인할 수 있었다 (도 11 참조).

따라서， 본 발명에 따른 ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드는 세포 독성이 거의 없으며， 유해 하지 않은 규조류에는 영향을 미치지 않고， 적조 생물에만 선택적으로 항적조 활성 을 보였으며， 이러한 항적조 활성은 ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드가 적조 생물의 세포막에 투 과적으로 침투하여 발생하며， 또한 적조 생물 내의 클로로필 에이의 함량을 감소시 킴으로써， 적조 생물의 파괴를 유발하므로， ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드를 적조 방제용 조성 물로써 유용하게 사용할 수 있다. 또한， 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 HPA3NT3 펩타이드의 제조방법을 제공한다.

1) 서열번호 3으로 기재되는 헬리코박터 파이오리로부터 유래한 HP(2-20) 펩 타이드의 16번째 글루타민 (Gin)과 18번째 아미노산인 아스파르트산 (Asp)을 트립토 판 (Trp)으로 치환하여 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 HPA3 펩타이드 를 제조하는 단계 ; 및

2) 단계 1)에서 제조된 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 HPA3 펩타이드의 9번째 글루탐산 (Glu)과 13번째 세린 (Ser)을 라이신 (Lys)으로 치환하는 단계.

상기의 방법에 의해서 제조된 HPA3NT3 펩타이드는 세포독성이 없으며, 적조 유발하는 조류에 선택적으로 항적조 활성을 보였으며， 이러한 항적조 활성은 본 발 명에 따른 HPA3NT3 펩타이드가 적조 생물의 세포막에 결합한 뒤， 투과하며 적조 생 물의 사멸을 유도하며， 아을러 적조 생물의 광합성을 저해하여 적조를 방제할 수 있다는 것을 확인하였다. 아울러， 본 발명은 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 HPA3NT3 펩 타이드를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물을 제공한다.

상기， HPA3NT3 펩타이드는 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것 이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 상기， HPA3NT3 펩타이드는 서열번호 4로 기재되는 HPA3 펩타이드의 9번째 글루탐산 (Glu)과 13번째 세린 (Ser)을 라이신 (Lys) 으로 치환한 서열인 것이 바람직하며， 상기 HPA3 펩타이드는 서열번호 3으로 기재 되는 헬리코박터 파이오리로부터 유래한 HP(2-20) 펩타이드의 16번째 글루타민 (Gin)과 18번째 아미노산인 아스파르트산 (Asp)을 트립토판 (Trp)으로 치환한 서열을 갖는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.

또한， 상기 적조 방제용 조성물은 씨 . 폴리크리코이데스 ((：. polykrikoides) , 씨. 마리나 (C. marina)^ 에이치. 아카쉬우 07. akashiwo)로 이루어진 군에서 선택 된 1종 이상의 적조유발 해조류에 대하여 항적조 활성을 갖는 것이 바람직하며， 에 스. 코스타튬 (5. cost at um)^} 대하여 항적조 활성을 나타내지 않는 것이 바람직하 나， 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 HPA3NT3 펩타이드는 세포 독성이 거의 없으며， 유해하지 않 은 규조류에는 영향을 미치지 않고， 적조 생물에만 선택적으로 항적조 활성을 보였 으며， 이러한 항적조 활성은 HPA3NT3 펩타이드가 적조 생물의 세포막에 투과적으로 침투하여 발생하며， 또한 적조 생물 내의 클로로필 에이의 함량을 감소시킴으로써， 적조 생물의 파괴를 유발하므로， HPA3NT3 펩타이드를 적조 방제용 조성물로써 유용 하게 사용할 수 있다.

상기 적조 방제용 조성물에 추가될 수 있는 성분으로는 이미 적조 방제용으 로 사용하고 있는 황토가 바람직하다. 그러나 이에 한정되지 않고 본 발명의 적조 방제용 펩타이드를 해양에 적절히 분산 또는 중합체에 적절히 섞어진 상태로 분산 시킴으로써 그 효과를 증진시킬 수 있는 것은 무엇이나 조성물에 추가될 수 있다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 HPA3NT3 펩타이드의 적조 방제용 조성물을 적조 발생이 예상되는 수역에 살포하는 단계를 포함하는 적조 예방 방법 을 제공한다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 HPA3NT3 펩타이드의 적조 방제용 조성물을 적조 발생 수역에 살포하는 단계를 포함하는 적조 제거 방법을 제공한다. 또한， 본 발명은 적조 방제용 조성물로 사용하기 위한， HPA3NT3 펩타이드를 제공한다.

【유리한 효과】

상기에서 살펴본 바와 같이， 본 발명의 서열번호 2로 기재되는 P5 펩타이드 를 유효성분으로 함유하는 항적조용 조성물은 적조유발 해조류에 탁월한 항조류 작 용을 나타내었으며， 유익한 조류에 대해서는 항적조 활성을 나타내지 않으므로 해 양 생태계에 안전한 항적조제로써 유용하게 사용될 수 있으며， 또한， 본 발명의 HPA3NT3 펩타이드는 적조유발 해조류에 선택적으로 탁월한 항적조 작용을 나타내 며， 세포 독성을 나타내지 않으므로 해양생태계에 안전한 항적조제로 유용하게 사 용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 씨 . 폴리크리코이데스 (C. polykrikoides)쒜 대한 CA-MA와 P5 펩타이 드의 항적조 활성을 현미경으로 관찰한 그림이다: A: 펩타이드를 처리하지 않은 대조군;

B: CA-MA 펩타이드 64 μΜ을 처리한 군; 및

C: Ρ5 펩타이드 8 μΜ을 처리한 군.

도 2는 씨. 마리나 (C. marina)^ 에이치. 아카쉬우 ( . akashiwo)^] 대한 CA- MA와 P5 펩타이드의 항적조 활성을 현미경으로 관찰한 그림이다:

도 2의 A는 씨. 마리나 (C. marina) 에 대한 항적조 활성을 현미경으로 관찰 한 그림이다;

1: P5 펩타이드 2μΜ을 처리한 군;

도 2의 Β는 에이치. 아카쉬우 07. akashiwo)^} 대한 항적조 활성을 현미경으 로 관찰한 그림이다; 및

2： CA-MA 펩타이드 4 μΜ을 처리한 군.

도 3은 에스. 코스타튬 (5. cost at uw)^] 대한 본 발명의 CA-MA와 P5 펩타이드 의 영향을 보여주는 그림이다:

A: 펩타이드를 처리하지 않은 대조군;

B: CA-MA 펩타이드 32 μΜ을 처리한 군; 및

C: Ρ5 펩타이드 256 μΜ을 처리한 군.

도 4는 본 발명에 따른 ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드의 항적조 활성을 보여주는 현미경 사진이다:

도 4의 Α는 침편모조강인 씨 . 마리나 (C. marina)⁶] 대한 항적조 활성을 보여 주는 현미경사진이다;

1: 펩타이드를 처리하지 않은 대조군;

2: HP (2-20) 처리군;

3： HPA3 처리군;

4: HPA3NT3 펩타이드 처리군;

도 4의 B는 에이치.아카쉬우 ( 쑈 asA/ o)에 대한 항적조 활성을 보여주는 현 미경사진이다;

1: 펩타이드를 처리하지 않은 대조군;

2: HPC2-20) 처리군;

3： HPA3 처리군; 및

4： HPA3NT3 펩타이드 처리군.

도 5는 와편모 조류인 씨. 폴리크리코이데스 (C. polykrikoides)^ 피. 미니 멈 (尸. minimum)^] 대한 펩타이드의 항적조 활성을 보여주는 현미경 사진이다: 도 5의 A는 펩타이드를 처리하지 않은 대조군에서 펩타이드의 항적조 활성을 보여주는 현미경 사진이다;

1： 와편모 조류인 씨 . 폴리크리코이데스 (C. polykrikoides)；

2： 피 . 미니멈 ( minimum)；

도 5의 B는 HPA3 펩타이드 처리군에서의 항적조 활성을 보여주는 현미경 사 진이다;

1： 씨 . 폴리크리코이데스 (C. polykrikoides)；

2: 피 . 미니멈 ( minimum);

도 5의 C는 HPA3NT3 펩타이드 처리군에서의 항적조 활성을 보여주는 현미경 사진이다;

1： 씨 . 폴리크리코이데스 (C. polykrikoides)； 및

2: 피 . 미니멈 ( . minimum) .

도 6은 에스. 코스타튬 (5. costatum)^\ 성장에서 항적조 펩타이드의 비 -억제 활성을 보여주는 그림이다:

A: 펩타이드를 처리하지 않은 대조군;

B: HPA3 펩타이드를 128마이크로몰 (μΜ) 처리한 군; 및

C: ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드를 128마이크로몰 (μΜ)올 처리한 군.

도 7은 ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드의 선택적인 항적조 활성을 보여주는 그림이다:

A: ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드를 2마이크로몰 (μΜ) 처리하였을 때， 배양 시간에 따른 에스. 코스타튬 (5. costatum)^\ 세포 밀도를 나타낸 그래프이다;

B: HPA3NT3 펩타이드를 8마이크로몰 (μΜ) 처리하였을 때， 배양 시간에 따른 에스. 코스타튬 (S. costatu )^ 세포 밀도를 나타낸 그래프이다;

C: 씨. 마리나 (C. marina)^ 에스. 코스타튬 (S. costatum)를 동시 배양한 후 ， HPA3NT3 펩타이드를 4 μΜ 처리한 후 관찰한 그림이다;

D: 에이치. 아카쉬우 ( akashiwo)^ 에스. 코스타튬 (5. cos tat um)를 동시 배양한후， HPA3NT3 펩타이드를 1 μΜ 처리한 후 관찰한 그림이다; 및

Ε: 피 . 미니멈 ( 과 에스. 코스타튬 (5. costatum)를 동시 배양한 후， HPA3NT3 펩타이드를 8 μΜ 처리한 후 관찰한 그림이다.

도 8은 형광 라벨한 ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드를 순차적으로 초점을 맞춰 적조에서의 위치를 보여주는 그림이다:

도 8a는 형광 라벨한 HPA3NT3 펩타이드 처리 농도에 따라 에이치. 아카쉬우 (N. />o)에서의 펩타이드의 위치를 관찰한 그림이다; 도 8b는 형광 라벨한 HPA3NT3 펩타이드 처리 농도에 따라 씨. 마리나 (C.rar/z )에서의 펩타이드의 위치를 관찰한 그림이다; 및

도 8c는 형광 라벨한 HPA3NT3 펩타이드 처리 농도에 따라 피. 미니멈 (尸. ᅳ n/ im)에서의 펩타이드의 위치를 관찰한 그림이다.

도 9는 에이치 . 아카쉬우 알에이 -020 ( afesz/ RA-020)에서 HPA3NT3 처리 한 후, 배양 시간에 따른 클로로필 에이의 변화를 보여주는 그래프이다:

■： 펩타이드를 처리하지 않은 대조군;

▲： HPA3 펩타이드를 처리한 군; 및

·： HPA3NT3 펩타이드를 처리한 군.

도 10은 적조의 세포막을 HPA3NT3 펩타이드가 투과함을 보여주는 그래프이 다:

•： 에이치. 아키쉬우셰 akashiwo)에 HPA3NT3 펩타이드 0.25 μ M를 처리한 군;

Ο: 에이치. 아키쉬우 ( . akashiwo)^] HPA3NT3 펩타이드 0.5 μΜ를 처리한 군;

▲： 에스. 코스타튬 (5. cost at u )^ HPA3NT3 펩타이드 256 μΜ를 처리한 군

； 및

ᅀ: 에스. 코스타륨 (5. cost at um)^] HPA3NT3 펩타이드 512 μΜ를 처리한 군 도 11은 ΗΡΑ3와 ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드의 물고기 적혈구에 대한 적혈구 용혈 현상 을 보여주는 그래프이다:

■： ΗΡΑ3 펩타이드를 처리한 군;

♦ : ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드를 처리한 군; 및

▲： 멜리틴 (Melittin)을 처리한 군.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】 .

이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> P5펩타이드의 합성 및 분리정제

본 발명자들은 서열번호 2로 기재되는 본 발명의 P5 항적조 펩타이드를 합성 하기 위하여， 세크로핀 에이 (cecropin A)의 1 ~ 8 잔기와 마가이닌 2(magainin 2)의 1-12 기를 접합하여 만든 CA-MA 펩타이드를 치환하여 라이신과 류신이 풍부한 펩타 이드인 P5를 제조하였다 (표 1).

본 발명의 P5 항적조 펩타이드는 서열번호 1로 기재되는 CA-MA 펩타이드의 하인즈 부위에 존재하는 글리신-이소루이신-글리신 (Glycine-Isoleucine-Glycine)을 각각 프를린 (Proline)으로 치환하고 4번째 류신 (Leucine), 8번째 이소루이신 (Isoleucine), 14번째 류신 (Leucine), 15번째 히스티딘 (Hist idine) 각각을 라이신 (Lysine)으로， 5번째 페닐알라닌 (Phenylalanine)과 6번째 라이신 (Lysine), 12번째 라이신 (Lysine), 13번째 페닐알라닌 (Phenylalanine)， 16번째 세린 (Serine), 17번째 알라닌 (Alanine), 20번째 페닐알라닌 (Phenylalanine)을 류신 (Leucine)으로 치환하 여 제조하였다.

펩타이드의 합성은 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노기 보호 용기 로 이용하는 메리필드 (Merrifield)의 액상 고상법을 사용하여 합성하였다. 본 발 명의 펩타이드에서 카르복실말단이 -N¾ 형태인 펩타이드는 링크 아미드 MBHA-레진

(Rink Amide MBHA— Resin)을 출발물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링 (coupling)에 의한 펩타이드 체인 (chain)의 연장은 N-하이드록시벤조-트리아졸-디 클로-핵人 1 ^！"르보 ⁰1¹ ^드법 (N-hydroxybenzo tri azole-dicyclo- hexycarbodiimideXHOBt— DCC)에 의하여 수행하였다. 각 펩타이드 아미노 말단의 Fmoc-아미노산을 커플링시킨 후， 20% 피페리딘 /디메틸 포마마이드 (piperidine/Dimethyl formamide, 이하 'DMF' 라 약칭함) 용액으로 Fmoc기를 제거 하고 DMP 및 디클로로메탄 (dichoromethane, DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가 스로 건조시켰다. 건조시킨 레진에 트리플루오로아세틱산:페놀:티오아니졸:물:트 리이소프로필실란 (trif luoroacet ic acid(TFA) ： phenol ： thioanisole ： H20 ： triisopropylsilane = 85: 5： 5: 2.5： 2.5(vol ./vol . )) 용액을 첨가하고 4시간 동 안 반응시켜 보호기를 제거하고， 레진으로부터 펩타이드를 분리시켰다. 그 뒤, 차 가운 디에틸 에테르 (diethyl ether)로 30분 동안 반웅시킨 뒤， 원심분리기로 펩타 이드를 침전시키고， 다시 디에틸 에테르로 침전된 펩타이드를 한번 더 씻어준 뒤 침전시킨 다음 공기 중에 건조시켰다. 상기 방법으로 얻은 크루드 (crude)한 형태 의 펩타이드를 pH 8인 암모늄 바이카보네이트 (ammonium bicarbonate)에 녹여 아세 토니트릴을 그레디언트 (gradient)로하여 정제형 역상 HPLC 컬럼 (reverse phase- HPLC column)(Delta Pak, C₁₈ 300 A, 19.0 隨 x 30 cm, Waters)으로 정제하였다.

에드만 디그래데이션 (Edman degradation)방법으로 아미노 산 분석기 (Hitachi 8500 A)로 아미노산의 조성을 측정하고, MALDKMatrix-Assisted Laser Desorption Ionization) 질량 분석법을 이용하여 펩타이드의 분자량을 측정 하였다.

그 결과, 본 발명에서 합성한 CA-MA와 P5 펩타이드는 95% 이상의 순도를 나 타내었으며， MALDI 질량 분석법 (Hill, et al .， Ra id Commun. Mass Spectrometry, 1991, 5, 395)을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자 량과 일치하므로 서열번호 2로 기재되는 정확한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 가 합성되었음을 확인하였다.

【표 1】

실험에 사용된 펩타이드의 아미노산 서열

<실시예 2> P5펩타이드의 항적조 활성 측정

상기 <실시예 1〉에서 합성한 모체 CA-MA와 P5 펩타이드의 항적조 활성을 측 정하고자, 본 발명자들은 상기 두 펩타이드의 적조생물에 대한 50% 생육 저해농도 를 측정하였다. 구체적으로， 항적조 활성을 측정하기 위한 적조생물로 한국해양미 세조류은행에서 분양을 받은 씨 . 폴리크리코이데스 ( \ polykrikoides) , 에이치 . 아 카쉬우 0. akashiwo) , 샤또넬라 에스피 ( ?a c e//a sp)， 씨 . 마리나 (C. marina) , 피. 미니멈 ( minimum) , 피. 미캔스 CP. mi cans) , 및 에스. 코스타튬 (S. cos tat urn) 을 사용하였다. 상기 각 조류를 F2 배지 [150 mg NaN0₃, 8.69 mg NaH₂P04 · 9H₂0, 10 mg ferric EDTA, 0.22 mg MnCl₂, 0.11 mg CoCl₂, 0.0196 mg CuS0₄-5H₂0, ZnS0₄-7H₂0,

50 mg Na₂Si03-9H₂0, 0.012 mg Na₂Mo0₄ · 2H₂0 , 1 tg Vitamine B₁₂, 1 (ig Biotin, 0.2 g Thiamine . HC1 I li 필터된 해수]에서 배양조건 온도 22^°C, 염분 34%。， 그리고 조도 3，000 럭스 (lux)이었고， 14시간 /10시간 명암 주기로 일정하게 두고 배양하였 다. 전배양된 적조 생물 세포를 세포수 lo me의 농도로 희석하여 24 웰 (well) 마 이크로 타이트레이트 플레이트에 접종하였다. 상기 <실시예 1>에서 합성한 CA-MA 와 P5 펩타이드를 256 μΜ/웰 (well) 농도로부터 시작하여 1/2배씩 희석하여 상기 균주가 접종된 플레이트에 첨가하였다. 상기 언급한 배양조건과 동일한 조건에서 36시간 동안 배양하면서 6시간마다 적조생물의 수를 헤모사이토메터 (hemocytometer)를 이용하여 측정하였다. 배양 24시간 후， 50% 생육 저해농도 (50% of inhibitory concentration, 이하 'IC₅₀'라 약칭함) 값을 결정하였다. 그 결과， 모체 CA-MA 펩타이드에 비하여 P5 펩타이드가 적조 생물에 대하여 강한 항적조 활성을 나타내었다 (표 2). 따라서， 본 발명의 <실시예 1>에서 제조한 P5 펩타이드는 항적조 활성이 뛰어난 펩타이드임을 확인할 수 있었다.

【표 2】

적조유발 해양생물 (해조류)에 대한 항적조 활성 측정

<실시예 3>셀를로우스 세포벽이 있는 적조에 대한 항적조 활성 관찰

본 발명 P5 펩타이드의 항적조 활성을 광학 현미경상으로 가시화하기 위하 여， 셀를로우스 세포벽을 가지고 있는 씨. 폴리크리코이데스 (C. polykrikoides)를 상기 <실시예 2>에 사용한 F2 배지에 접종한 뒤 배양하였다. 배양된 적조생물을 lo mC의 농도로 24웰 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종한 뒤 모체 CA-MA 펩 타이드를 64 μΜ/웰 (well)의 농도와 P5 펩타이드를 8 μΜ/웰 (well) 농도로 상기 적 조생물이 접종된 플레이트에 첨가하여 22^°C에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 ， 가시화하기 위하여 광학 현미경 상에서 관찰하여 그 결과를 도 1에 나타내었다. 그 결과， 도 1에서 알 수 있듯이， 적조유발 생물인 씨. 폴리크리코이데스 (C. polykrikoides)^ 아무것도 처리하지 않은 경우 (음성 대조군)에는 생물의 수가 유 지되었고， 외형적 변화가 없었으며， 모체 CA-MA 펩타이드는 64 μΜ/웰의 농도로 처 리하였을 때 적조생물의 외형적 변화를 보였다. 그러나， Ρ5 펩타이드는 CA-MA 펩 타이드보다 1/8배 낮은 농도인 8 μΜ/웰의 농도로 처리한 군에서 거의 모든 생물체 에서 생물체 내의 물질이나 소기관들이 사라진 형태였다. 이로써， 본 발명의 Ρ5 펩타이드는 모체 CA-MA 펩타이드에 비하여 낮은 농도에서 항적조 효과를 보이므로, P5 펩타이드를 항적조제로 유용하게 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> 셀를로우스 세포벽이 없는 적조에서의 항적조 활성 관찰

본 발명 P5 펩타이드의 항적조 활성을 광학 현미경상으로 가시화하기 위하 여， 샐를로우스 세포벽을 가지고 있지 않은 씨. 마리나 (C. marina)^ 에이치. 아카 쉬우 ( akashiwo)를 상기 <실시예 2>에 사용한 F2 배지에 접종한 뒤 배양하였다. 배양된 적조생물을 10⁴/ ^의 농도로 24웰 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종한 뒤 모체 CA-MA 펩타이드를 4 μΜ/웰의 농도와 Ρ5 펩타이드를 2 μΜ/웰 농도로 상기 적조생물이 접종된 플레이트에 각각 첨가하여 22^°C에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후， 가시화하기 위하여 광학 현미경 상에서 관찰하여 그 결과를 도 2에 나타 내었다.

그 결과， 샐를로우스 세포벽을 가지고 있는 적조 생물에 비하여 셀를로우스 세포벽을 가지고 있지 않은 씨. 마리나 (C. marina)^ 에이치. 아카쉬우 ( . a^s o)에서 더 낮은 농도의 펩타이드 처리에 의하여 적조가 억제됨을 확인할 수 있었다. 모체 CA-MA 펩타이드는 4 μΜ/웰의 농도로 처리하였을 때 적조생물의 외 형적 변화를 보였고 Ρ5 펩타이드는 2 μΜ/웰의 농도로 처리에서 거의 모든 생물체 에서 생물체내의 물질이나 소기관들이 사라진 형태였다. 이로써 본 발명의 Ρ5 펩 타이드가 강력한 항적조 활성이 있음을 확인하였다 (도 2).

<실시예 5> 유익한규조류에 대한 Ρ5펩타이드의 항적조 활성 관찰

본 발명의 Ρ5 펩타이드의 규조류에서의 영향을 광학 현미경상으로 가시화하 기 위하여， 해양 생태계에 해로운 영향을 미치지 않는 규조류인 에스. 코스타튬 (5. costatu뗴 상기 <실시예 2>에 사용한 F2 배지에 접종한 뒤 배양하였다. 배양된 적조생물을 10⁴/ 의 농도로 24웰 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종한 뒤 모 체 CA-MA 펩타이드를 32 μΜ/웰의 농도와 Ρ5 펩타이드를 256 μΜ/웰 농도로 상기 적조생물이 접종된 플레이트에 첨가하여 22^°C에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후， 가시화하기 위하여 광학 현미경 상에서 관찰하여 그 결과를 도 3에 나타내었 다.

그 결과， 펩타이드와 규조류를 반응시킨 후 3일이 지나도 높은 농도의 펩타 이드 특히 P5가 조류에 전혀 나쁜 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다 (도 3). <실시예 6> HPA3NT3 펩타이드의 합성 및 분리정제

본 발명자들은 양친매성 항적조 펩타이드를 합성하기 위하여， 헬리코박터 파 이오리로부터 유래한 HK2-20) 펩타이드와 16번째 아미노산인 글루타민과 18번째 아미노산인 아스파르트산을 트립토판으로 치환한 유사체 HPA3 펩타이드， HPA3에서 구조적으로 불규칙한 N-말단 부위를 절단한 후 양이온을 증가시키기 위하여 9번째 글루탐산과 13번째 세린을 라이신으로 치환한 아미노산 서열을 갖는 HPA3NT3 펩타 이드를 제조하였다 (표 3).

펩타이드의 합성은 Fmoc(9— fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노기 보호 용기 로 이용하는 메리필드 (Merrifield)의 액상 고상법을 사용하여 합성하였다. 본 발 명의 펩타이드에서 카르복실말단이 -NH₂ 형태인 펩타이드는 링크 아미드 MBHA-레진

(Rink Amide MBHA-Resin)을 출발물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링 (coupling)에 의한 펩타이드 체인 (chain)의 연장은 N-하이드록시벤조-트리아졸-디 사이클로 -핵시카르보이미드법 (N-hydroxybenzo triazol eᅳ di eye 1 o— hexycarbodiimide)(HOBt-DCC)에 의하여 수행하였다.

각 펩타이드 아미노 말단의 Fmoc-아미노산을 커플링시킨 후, 20% 피페리딘 / 디메틸 포마마이드 (piperidine/Dimethyl formamide, 이하 'DMF' 라 약칭함) 용액으 로 Fmoc기를 제거하고 DMP 및 디클로로메탄 (dichoromethane, DCM)으로 여러번 씻어 준 다음 질소 가스로 건조시켰다. 건조된 레진에 트리플루오로아세틱산:페놀:티오 아니졸：물:트리이소프로필실란 (trif luoroacetic acid(TFA) ： phenol ： thioanisole ： H₂0 ： triisopropylsilane = 85: 5: 5: 2.5： 2.5(vol ./vol . )) 용액을 가하고 4시 간 동안 반웅시켜 보호기를 제거하고， 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 다음， 차 가운 디에틸 에테르 (diethyl ether)로 30분 동안 반응 시킨뒤 원심분리기로 펩타이 드를 침전시킨뒤 다시 디에틸 에테르로 침전된 펩타이드를 한번 더 씻어준뒤 침전 시키고 공기중에 말린다. 상기 방법으로 얻은 크루드 (crude)한 형태의 펩타이드를 pH 8인 암모늄 바이카보네이트 (ammonium bicarbonate)에 녹여 아세토니트릴을 그레 디언트 (gradient)로 하여 정제형 역상 HPLC 컬럼 (reverse phase-HPLC column) (Delta Pak, C₁₈ 300 A, 19.0 mm x 30 cm, Waters)으로 정제하였다. 정제된 합성 펩타이드를 에드만 디그래데이션 (Edman degradat ion)방법으로 아미노산 분석 기 (Hitachi 8500 A)로 아미노산의 조성을 측정하고， MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) 질량 분석법을 이용하여 펩타이드의 분자량을 측정하였다. 그 결과, 본 발명에서 합성한 모든 펩타이드는 95% 이상의 순도를 나타내었 으며， 측정된 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하여 정 확한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

【표 3】

시험에 사용된 펩타이드의 아미노산서열

<실시예 7> HPA3NT3 펩타이드의 항적조 활성 측정

<7-1> HPA3NT3 펩타이드의 적조생물에 대한 생육 50% 저해농도 측정

상기 <실시예 6>에서 합성한 펩타이드의 항적조 활성을 측정하였다. 구체적 으로， 항적조 활성을 측정하기 위한 적조생물로 한국해양미세조류은행에서 분양을 받은 씨 . 마리나 (C. marina) , 에이치 . 아카쉬우 ( . akashiwo) , 씨 . 폴리크리코이데 스 (C. polykrikoides) , 피 . 미니멈 ( minimum) , 그리고 에스. 코스타튬 (5. costatum ^ 사용하였다.

상기 각 조류를 F2 배지 [150 mg NaN0₃, 8.69 mg NaH₂P0₄ ^■ 9H₂0 , 10 mg ferric

EDTA, 0.22 mg MnCl_2l 0.11 mg CoCl₂₎ 0.0196 mg CuS0₄-5H₂0, ZnS0₄.7¾0, 50 mg

Na₂Si0₃.9H₂0, 0.012 mg Na₂Mo0₄ · 2H₂0 , 1 g Vitamine B₁₂, 1 Biotin, 0.2 //g

Thiamine - HC1 I \i 필터된 해수)에서 배양조건 온도 22^°C， 염분 34¾， 그리고 조 도 3,000 럭스 (lux)이었고， 14 시간 /10시간 명암 주기로 일정하게 두고 배양하였 다. 전배양된 적조 생물 세포를 세포수 10⁴/ 의 농도로 회석하여 24 웰 (well) 마 이크로 타이트레이트 플레이트에 접종하였다. 상기 <실시예 6>에서 합성한 펩타이 드를 256 마이크로몰 (μΜ)/웰 (well) 농도로부터 시작하여 1/2배씩 희석하여 상기 균주가 접종된 플레이트에 첨가하였다. 상기 언급한 배양조건에서 36시간 동안 배양하면서 6시간 마다 적조생물 수를 헤모사이토메터 (hemocytometer)를 이용하여 측정하여, 50% 생육 저해농도 (50% of inhibitory concentration, 이하 'ICso' 라 약 칭함) 값을 결정하였다. 그 결과， HP(2-20), HPA3, 및 HPA3NT3 펩타이드 모두 적조생물에 대하여 활 성을 보였지만 그 중 본 발명의 펩타이드인 HPA3NT3가 가장 강한 항적조 활성을 나 타내었다 (표 4). 따라서， 본 발명의 <실시예 6>에서 제조한 HPA3NT3 펩타이드는 항적조 활성이 뛰어난 펩타이드임을 알 수 있었다.

【표 4】

발 해양생물 (해조류)에 대한 항적조 활성 측정

<7-2> HPA3 T3 펩타이드의 셀를로우스 세포벽이 없는 적조에서의 항적조 활 성 관찰

본 발명에 따른 HPA3NT3 펩타이드가 항적조 활성을 보이는 것을 광학 현미경 상에서 가시화하기 위하여， 침편모조강인 씨. 마리나 (C. marina)^ 에이치. 아카쉬 우 ( akashiwo) , 와편모조류인 씨 . 폴리크리코이데스 (6". polykrikoides)^ 피 . 미 니멈 ( minimum) , 그리고 규조류인 에스. 코스타튬 (5. costatum)^ F2 배지 (배지 조성은 상기 <실시예 7-1>에서 서술)에 접종한 뒤 배양하였다. 배양된 적조생물을

10⁴/| 의 농도로 24웰 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종한 뒤 HP(2-20), HPA3, 그리고 HPA3NT3 펩타이드를 32 μΜ/웰 (well)의 농도로 상기 적조생물이 접 종된 플레이트에 첨가하여 22^°C에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후， 가시화하 기 위하여 광학 현미경 상에서 관찰하였다.

도 4에서 알 수 있듯이， 셀를로우스 (celluose) 세포벽을 가지고 있지 않은 적조유발 생물인 씨. 마리나 (C. marina)^ 에이치. 아카쉬우 ( . akashiwo)^<^} 아무 것도 처리하지 않은 무처리군에서는 생물의 수가 유지되고， 외형적 변화가 없었지 만, HP(2-20), HPA3, 및 HPA3NT3 펩타이드를 처리한 적조에서는 펩타이드 처리 2분 후 거의 모든 생물체가 다 터져 생물체내의 물질이나 소기관들이 밖으로 유출이 되 었는데 특히 HPA3NT3 펩타이드의 활성이 가장 좋았다. 이로써 본 발명의 HPA3NT3 펩타이드의 항적조 활성을 확인할 수 있었다.

<7-3> HPA3NT3펩타이드의 셀를로우스 세포벽이 있는 적조에 대한항적조활 성 관찰

본 발명에 따른 HPA3NT3 펩타이드의 셀를로우스 세포벽이 있는 적조에 대한 항적조 활성을 관찰하기 위하여， 와편모조류인 씨. 폴리크리코이데스 (C. polykrikoides)^ 피. 미니멈 minimum^ F2 배지 (배지조성은 상기 <실시예 7-

1>에서 서술)에 접종한 뒤 배양하였다. 배양된 적조생물을 10⁴/ ^의 농도로 24웰 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종한 뒤 HP(2-20), HPA3, 및 HPA3NT3 펩타이 드를 256 μΜ/웰 (well)의 농도로 상기 적조생물이 접종된 플레이트에 첨가하여 22 t에서 36시간 동안 배양하였다. 배양 후， 가시화하기 위하여 광학 현미경 상에서 관찰하였다.

또한， 도 5에서 볼 수 있듯이 셀를로우스 세포벽을 가지고 있는 적조인 씨. 폴리크리코이데스 (C.

셀를로우스 세포벽이 없는 적조에 비하여 HPA3NT3 펩타이드가 활성올 보이는 시간은 1시간 정 도로 더 늦었지만， 도 4의 결과와 유사하게, HPA3NT3 펩타이드가 HP(2-20), HPA3 펩타이드에 비하여 가장 좋은 활성을 보였다 (도 5).

<7-4> HPA3NT3펩타이드의 유익한규조류에 대한펩타이드의 항적조 활성 관 찰

본 발명에 따른 HPA3NT3 펩타이드의 항적조 활성이 적조현상을 유발하지 않 는 해양생물에 미치는 영향을 확인하기 위하여， 유해하지 않은 규조류인 에스. 코 스타튬 (5. costatum)을: F2 배지에 접종한 뒤 배양하였다. 배양된 적조생물을 lo ^의 농도로 24웰 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종한 뒤 HP(2-20), HPA3, 및 HPA3NT3 펩타이드를 256 μΜ/웰 (well)의 농도로 상기 적조생물이 접종된 플레 이트에 첨가하여 22^°C에서 72시간 동안 배양하였다. 배양 후， 가시화하기 위하여 광학 현미경 상에서 관찰하였다. 그 결과， 도 6에 나타난 바와 같이， 해양 생태계에 해를 주지 않은 규조류인 에스. 코스타튬 (5. costatwn)o\] 대한 HPA3NT3 펩타이드의 활성을 확인한 결과 다른 적조에서 활성이 좋은 HPA3와 HPA3NT3 펩타이드를 처리한 후， 3일이 경과하여도 규 조류인 에스. 코스타튬을 전혀 억제하지 않음을 확인하였다 (도 6).

<7-5> HPA3NT3펩타이드의 적조 생물과규조류의 공동배양에 대한항적조활 성 관찰

본 발명의 펩타이드가 적조생물에만 항적조 활성을 나타내는 것을 확인하기 위하여， 본 발명자들은 유익한 규조류인 에스. 코스타튬 (5. costatum)쉐 침편모조 강인 씨 . 마리나 (C. marina)^ 에이치 . 아카쉬우 ( . akashiwo) , 및 피 . 미니멈 mini議ᅳ)를 각각 공동배양하였다. 규조류와 적조 생물을 각각 10⁴/1 의 농도로 24 웰 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종한 뒤 에스. 코스타튬 (5. cos tat u )과 씨 . 마리나

접종된 플레이트에는 4 HPA3NT3 펩타이드 농도를, 에 스. 코스타튬 (S. cos tat urn)과 에이치. 아카쉬우 07.

접종된 플레이트에 는 1 μΜ ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드 농도를， 그리고 에스. 코스타륨 (5. costatum)과 피. 미 니멈 ( . minimum)^} 접종된 플레이트에 8 μΜ ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드 농도를 첨가하여 22^°C에서 48시간 동안 배양하였다.

그 결과， 도 7에 나타난 바와 같이， 해양 생태계에 적조를 유발하는 해로운 종과 해를 주지 않는 규조류를 공동 배양한 후， HPA3NT3 펩타이드를 처리하였을 때 2 μΜ을 처리한 Α보다 8 μΜ올 처리한 Β에서 더 좋은 활성을 확인할 수 있었고， 두 경우 모두 에스. 코스타륨 (네모)의 생존률은 높으면서 에이치. 아카쉬우 (원) , 피. 미니멈 (세모)의 수가 감소함을 확인하였다. 이를 현미경을 통하여 보았올 때에도 동일하게， 규조류인 에스. 코스타튬은 모양을 그대로 유지하고 있는 반면 적조 유 발 생물인 씨. 마리나 (C), 에이치. 아카쉬우 (D), 그리고 피. 미니멈 (Ε)은 생물체가 터져있음을 확인하였다. 이로써， 펩타이드가 유해한 적조만을 선택적으로 억제함 을 확인할 수 있었다 (도 7).

<실시예 8> ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드의 적조 세포 내 위치 확인

본 발명의 항적조 ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드와 10 mmol 탐라 (TAMRA)(Molecular probe, Eugene, OR)라는 형광물질을 상온에서 1시간 동안 반웅 시킨 후 HPLC를 통 하여 표지된 펩타이드만을 분리하였다. 이렇게 분리한 표지된 TAMRA-HPA3NT3 펩타 이드 0.5 μΜ를 10⁴/111£의 농도의 샐롤로우스 세포벽이 없는 적조인 씨. 마리나 (C. marina) , 에이치 . 아카쉬우 07. akashiwo) , 및 셀를로우스 세포벽이 있는 적조인 피 . 미니멈 mini議)ᅳ쫘 22^°C에서 5분 동안 반웅시킨 후, F2 배지로 두 번 씻었 다. 적조 생물에서의 펩타이드 위치를 확인하기 위하여， 적조 생물을 위에서부터 아래로 연속적으로 초점을 맞춰 컨포컬 현미경 (confocal microscopy)을 이용하여 적조 생물올 관찰하였다.

그 결과 도 8a-c에 나타난 바와 같이 , 탐라가 표지된 HPA3NT3 펩타이드가 적 조 세포막에 위치함을 확인할 수 있다. 특히 샐를로우스 세포벽이 없는 적조인 씨 . 마리나 (C. marina)와 에이치. 아카쉬우 ( . arasA/>o)에서는 최외각의 세포막에 위치하지만， 샐를로우스가 있는 적조인 피. 미니멈 0°. /ηϊηήηΐ )에서는 셀를로우스 층 바로 안쪽에 펩타이드가 위치함을 확인하였다 (도 8a-c).

<실시예 9> HPA3NT3 펩타이드의 광합성 저해실험

본 발명자들은 적조 생물의 클로로필 에이 (Chlorophyll a)의 함량 측정을 통 하여 , 본 발명에 따른 HPA3NT3 펩타이드의 항적조 활성을 확인하고자 하였다. 에 이치. 아카쉬우 알에이 -020을 F2 배지에 접종한 뒤 배양하였다. 배양된 적조생물 을 10⁵/ 의 농도로 12웰 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종한 뒤 HPA3 펩타이 드와 HPA3NT3 펩타이드를 각각 2 마이크로몰 ( μΜ)과 1 마이크로몰 ( μ Μ)/웰 (wel 1 )의 농도로 첨가한 후 22^°C에서 6， 12, 24， 36, 48， 72시간 동안 배양하였다.

배양 후， 샘플들을 원심분리 한 후， 추출용매인 90% 아세톤을 넣어가며 호모 게나이즈 (homogenizer)로 파쇄하였다. 파쇄된 샘플에서 클로로필 에이를 유리시키 기 위해 -20^°C에서 빛을 차단한 후 4시간 동안 방치하였다. 4시간 후 샘플을 원심 분리하고 상등액을 조심히 취하였다. 그리고 상기 상등액에서 클로로필 에이양은 전체 세포의 흡광도와 하기의 <수학식 1>을 이용하여 간략히 측정하였다.

【수학식 11

im 상기 <수학식 1>에서， A₆₆₃은 663 nm 파장에서의 흡광도이며， A₆₂₀은 620 nm 파장에서의 흡광도이고, A₇₅₀은 750 nm 파장에서의 흡광도를 나타낸다. 그 결과, 에이치. 아카쉬우 알에이 -020에 HPA3NT3 펩타이드를 처리한 시간이 길어질수록， HPA3 펩타이드를 처리한 군에 비하여 클로로필 에이의 양이 현저히 감 소하는 것을 관찰할 수 있었다. 즉， 본 발명에 따른 HPA3NT3 펩타이드가 적조생물 의 생장을 저해함을 알 수 있었다.

<실시예 10> HPA3NT3펩타이드의 적조 세포막 투과실험

적조생물 에이치. 아카쉬우 ( akashiwo)를 버퍼를 이용하여 3번 씻은 후, 세포의 양올 5 X 10⁵/웰 (well) 이 되도록 맞추었다. 적조 생물 에이치. 아카쉬우에 핵올 염색하는 싸이록스 그린 (SYTOX green) (Molecular probe, Eugene, OR)의 농도 가 1 μΜ이 되도록 넣어준 후， 96 웰 플레이트에 90 ^씩 분주하고 22^°C에서 15분 동안 반웅시켰다. 반웅이 끝난 적조 플레이트에， HPA3NT3 펩타이드를 각각 0.25， 0.5μΜ 첨가한 후， 형광의 세기를 형광 분광기를 이용하여 측정하였다. 유해하지 않은 규조류인 에스. 코스타튬의 경우， 상기와 동일한 방법으로 싸이톡스 그린을 배지에 첨가하여 반응시킨 후， ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드를 256 μΜ, 및 512 μΜ을 처리한 후， 30분 동안 싸이록스 -그린 형광의 세기를 측정하였다.

그 결과， 도 10에 나타난 바와 같이, 싸이톡스 그린은 스스로는 세포 안으로 들어가지 못하면서 핵과 결합해야 발광하는 형광물질인데 에이치. 아카쉬우 arasA/ )에서 HPA3NT3 펩타이드의 농도가 증가할수록 형광의 세기가 증가하는 것 을 관찰할 수 있었다. 이는 템타이드가 많을수록 적조 세포막에 더 많이 작용하여 싸이록스 그린이 세포 안으로 들어가 핵과 결합하여 발광하는 양이 많은 것을 의미 한다. 반면， 유해하지 않은 규조류인 에스. 코스타튬 (5. costatwn)^\} HPA3NT3 펩 타이드 256， 512 μΜ을 첨가한 후에도， 형광의 세기는 0에 가까웠다. 즉， ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드는 적조 생물의 세포막을 선택적으로 투과하는 성질이 있으며， 이로 인하 여 파괴된 세포막을 통하여 싸이록스 그린이 적조 생물 안으로 들어가 핵과 결합하 여 형광 세기가 에이치. 아카쉬우 ( . 에서만 증가하는 것을 관찰할 수 있 었다 (도 10 참조).

<실시예 11> HPA3NT3 펩타이드의 세포독성 실험

본 발명에 따론 HPA3NT3 펩타이드가 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하 여， 본 발명자들은 HPA3NT3 펩타이드의 적혈구 파괴능을 조사하였다. 구체적으로， 물고기 (광어， 완도)의 적혈구를 8%의 농도가 되도록 인산염 완층용액 (PBS, pH 7.0) 으로 3번 씻은 다음 희석하고, 여기에 본 발명에 따른 HPA3 펩타이드， HPA3NT3 펩 타이드와 멜리틴 (Melittin)으로 기재되는 항생 펩타이드를 128 마이크로몰 (μΜ)/웰 농도로부터 1/2배로 연속적으로 회석하여 37^°C에서 1시간 동안 반웅시켰다. 반응 액을 Ι,ΟΟΟΧ g로 원심분리하여 그 상등액 속에 포함된 헤모글로빈의 양을 414 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포 파괴 정도를 조사하기 위하여 1% 트리톤- XlOOCTriton X-100)을 첨가하여 홉광도를 측정하였고， 1% 트리톤 X-100의 세포 파 괴능을 100%로 하여 이를 각 펩타이드의 적혈구 파괴능과 비교하여 하기 <수학식 2>에 따라 계산하였다.

【수학식 2]

I·]- X-. A 흐확 Γ: ᅳ

%적 ¾구파괴능 | ^{^}^ ^ ) X 100

상기 <수학식 2>에서， 흡광도 Α는 414 nm 파장에서 펩타이드 용액을 처리했 을 때의 흡광도이며， 홉광도 B는 414 nm 파장에서 파괴능 0%인 PBS만 처리했을 때 의 흡광도이고， 흡광도 C는 414 nm 파장에서 1% 트리톤 X-100의 흡광도를 나타낸 다.

그 결과， 본 발명의 HPA3NT3는 세포독성을 거의 나타내지 않는 반면， 양성 대조군으로 사용한 벌독인 멜리틴은 세포 독성이 매우 높게 나타났다. 또한， HPA3 펩타이드는 20 마이크로몰 (μΜ) 이상으로 증가함에 따라， 용혈 반웅의 수치가 현저 하게 증가함을 확인할 수 있었다 (도 11).

【산업상 이용가능성】

상기에서 살펴본 바와 같이， 본 발명의 적조 방제 활성을 갖는 항적조 펩타 이드 Ρ5는 탁월한 항적조 활성을 나타내고 유익한 조류에는 독성이 없으며， 자연 분해가 가능하므로 해양 생태계에 안전하고 유용하게 사용될 수 있고, 또한， 본 발 명에서 제조한 ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드는 세포독성이 없으며， 유해하지 않은 규조류에 대 해서는 영향을 끼치지 않았으며, 적조유발 해조류에 선택적으로 탁월한 항적조 작 용을 나타내었고, ΗΡΑ3ΝΤ3 펩타이드의 세포막 투과성과 적조 생물의 클로로필 에이 의 함량을 감소시켜 적조유발 생물의 사멸을 유발하므로, 해양 생태계에 안전한 항 적조제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

【청구의 범위】

【청구항 1]

서열번호 2로 기재되는 아미노산서열을 갖는， P5 펩타이드.

【청구항 2】

서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는, HPA3NT3 펩타이드.

【청구항 3】

제 1항에 있어서， 상기 P5 펩타이드는 서열번호 1로 기재되는 CA- MACCecropin A - Magainin 2) 펩타이드의 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상을 치환하여 양전하와 소수성 영역이 증가된 펩타이드 또는 그의 유도체인 것을 특징 으로 하는 펩타이드.

【청구항 4]

제 2항에 있어서， HPA3NT3 펩타이드는 서열번호 4로 기재되는 HPA3 펩타이드 서열에서 9번째 글루탐산 (Glu)과 13번째 세린 (Ser)을 라이신 (Lys)으로 치환한 서열 인 것을 특징으로 하는 펩타이드.

【청구항 5】

제 4항에 있어서ᅳ HPA3 펩타이드는 서열번호 3으로 기재되는 헬리코박터 파 이오리로부터 유래한 HK2-20) 펩타이드 서열에서 16번째 글루타민 (Gin)과 18번째 아미노산인 아스파르트산 (Asp)을 트립토판 (Trp)으로 치환한 서열을 갖는 것을 특징 으로 하는 펩타이드.

【청구항 6]

제 1항 또는 제 2항에 있어서， 상기 펩타이드는 씨. 폴리크리코이데스 (C. polykrikoides) , 씨 . 마리나 (C. marina) 및 에이치 . 아카쉬우 ( . akashim) — 이루 어진 군에서 선택된 1종 이상의 적조유발 해조류에 대하여 항적조 활성을 갖는 것 을 특징으로 하는 펩타이드.

【청구항 7]

제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 펩타이드는 에스. 코스타튬 (5. costatum)^] 대하여 항적조 활성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 펩타이드.

【청구항 8】

서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 CA-MA(£ecropin A - Magainin 2) 펩타이드에서，

하인즈 부위 (hinge region)에 존재하는 글리신-이소루이신-글리신을 각각 프 를린으로 치환하고，

4번째 류신， 8번째 이소루이신， 14번째 류신 및 15번째 히스티딘을 각각 라 이신으로 치환하고，

5번째 페닐알라닌과 6번째 라이신， 12번째 라이신, 13번째 페닐알라닌， 16번 째 세린, 17번째 알라닌 및 20번째 페닐알라닌을 각각 류신으로 치환하는 단계를 포함하는，

제 1항의 펩타이드의 제조 방법 .

【청구항 9]

1) 헬리코박터 파이오리로부터 유래한 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서 열을 갖는 HP(2-20) 펩타이드에서 16번째 글루타민 (Gin) 및 18번째 아미노산인 아 스파르트산 (Asp)을 각각 트립토판 (Trp)으로 치환하여 서열번호 4로 기재되는 아미 노산서열올 갖는 HPA3 펩타이드를 제조하는 단계; 및

2) 단계 1)에서 제조된 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 HPA3 펩타이드에서 9번째 글루탐산 (Glu) 및 13번째 세린 (Ser)을 각각 라이신 (Lys)으로 치환하는 단계를 포함하는 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 HPA3NT3 펩타이드의 제조방법 .

【청구항 10】

제 1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물.

【청구항 11]

제 2항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물.

【청구항 12】

제 11항에 있어서， 상기 적조 방제용 조성물은 씨. 폴리크리코이데스 (C. polykrikoides) , 씨 . 마리나 (C. marina) 및 에 이치 . 아카쉬우 07. akashiwo)로 이루 어진 군에서 선택된 1종 이상의 적조유발 해조류에 대하여 항적조 활성을 갖는 것 을 특징으로 하는 적조 방제용 조성물 .

【청구항 13]

제 12항에 있어서， 상기 적조 방제용 조성물은 에스 . 코스타튬 (5. costatum) 에 대하여 항적조 활성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 적조 방제용 조성물 .

【청구항 14]

약학적으로 유효한 양의 제 1항의 펩타이드의 적조 방제용 조성물을 적조 발 생이 예상되는 수역에 살포하는 단계를 포함하는 적조 예방 방법 .

【청구항 15]

약학적으로 유효한 양의 제 2항의 펩타이드의 적조 방제용 조성물을 적조 발 생이 예상되는 수역에 살포하는 단계를 포함하는 적조 예방 방법 .

【청구항 16]

약학적으로 유효한 양의 제 1항의 펩타이드의 적조 방제용 조성물을 적조 발 생 수역에 살포하는 단계를 포함하는 적조 제거 방법 .

【청구항 17】

약학적으로 유효한 양의 제 2항의 펩타이드의 적조 방제용 조성물을 적조 발 생 수역에 살포하는 단계를 포함하는 적조 제거 방법 .

【청구항 18]

적조 방제용 조성물로 사용하기 위한， 제 1항의 펩타이드 . 【청구항 19]

적조 방제용 조성물로 사용하기 위 한， 제 2항의 펩타이드 .