WO2012015039A1 - アグロバクテリウム菌を用いた、オオムギ属植物へ遺伝子導入を行う方法およびオオムギ属植物の形質転換植物の作成方法 - Google Patents

アグロバクテリウム菌を用いた、オオムギ属植物へ遺伝子導入を行う方法およびオオムギ属植物の形質転換植物の作成方法 Download PDF

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WO
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agrobacterium
medium
plant
auxin
tissue
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祐弘 樋江井
石田　祐二
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日本たばこ産業株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants

Definitions

  • the present invention relates to a method for introducing a gene into a barley plant through an Agrobacterium.
  • the present invention further relates to a method for producing a transformed plant of a barley genus plant via an Agrobacterium.
  • direct DNA introduction method For transformation of monocotyledonous plants such as barley, wheat, corn and rice, which are the main cereals, physicochemical methods (direct DNA introduction method) such as polyethylene glycol method, electroporation method, particle gun method and agro
  • direct DNA introduction method an event that a target gene is introduced in a fragmented manner or introduced in multiple copies frequently occurs. Therefore, a transformant that does not express the target gene or shows weak and abnormal expression (gene silencing) appears frequently.
  • the method using protoplasts since the culture period is prolonged, seed sterility or malformation due to culture mutation is likely to occur in the obtained transformant.
  • the gene transfer method via Agrobacterium spp. Is introduced by fragmentation introduction of the target gene, keeping the copy number of the target gene low by controlling the expression of genes in the pathogenic region (vir region) of the Ti plasmid. There is little to be done. Therefore, many individuals can be obtained in which the target gene is highly expressed in the obtained transformant, and there is a great advantage that the difference in expression level between individuals is small compared to the direct introduction method.
  • the gene transfer method via Agrobacterium is commonly used as a method for transforming dicotyledonous plants.
  • the host of the genus Agrobacterium in nature is limited to dicotyledonous plants, and for a long time it has been thought not to infest monocotyledonous plants (Potrykus 2000: Non-patent Document 1).
  • Patent Document 2 a high-efficiency transformation method via Agrobacterium was reported for the first time in the main crop of rice.
  • Non-Patent Document 5 (1997, Non-Patent Document 5) injures immature embryos with a particle gun before inoculating Agrobacterium.
  • Trifonova et al. 2001 Non-Patent Document 12 showed that the treatment of immature barley embryos before inoculation with Agrobacterium by particle gun does not improve the transformation efficiency, almost no injury Processing is not used.
  • Callus induction medium includes Murashige & Skoog (MS) inorganic salts (Murashige & Skoog 1962 Non-Patent Document 13), 30 g / l maltose, 1.0 g / l casein hydrolyzate, 350 mg / l myo-inositol, 690 mg / l 1.0 mg / l thiamine hydrochloride, 2.5 mg / l 3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid (dicamba), 1.25 mg / l CuSO 4 5H 2 O (Bartlett et al. 2008 Non-Patent Document 9 and Harwood et al.
  • Non-Patent Document 11 3.5 g / l phytagel, pH 5.8 is commonly used (Jacobsen et al. 2006 Non-Patent Document 8, Bartlett et al. 2008 Patent Document 9, Hensel et al. 2008 Non-Patent Document 10, Harwood et al. 2008 Non-Patent Document 11).
  • the Agrobacterium suspension used as the inoculum is obtained by shaking culture overnight in a liquid medium.
  • the method of inoculating Agrobacterium is a method in which an Agrobacterium suspension is dropped onto a scutellum of an immature embryo (Jacobsen et al. 2006 Non-Patent Document 8, Bartlett et al.
  • Non-Patent Document 9 Harwood et al. 2008 Non-Patent Document 11
  • a method in which an immature embryo is immersed in an Agrobacterium suspension and then decompressed using a vacuum pump Hensel et al. 2008 Non-Patent Document 10
  • the time of inoculation that is, the time from contact of the Agrobacterium suspension with immature embryos until transfer to the coculture medium.
  • the inoculation method of either the dropping method or the immersion pressure reducing method takes about 2 hours at the longest from 20 minutes. Inoculation of Agrobacterium to immature embryos is performed on the day of isolation of immature embryos or on the next day after overnight culture.
  • dicamba 2.5 mg / l (11.3 ⁇ M) dicamba is used as a plant growth regulator in a solid medium for co-culturing with Agrobacterium (Jacobsen et al. 2006, Non-patent Document 8, Bartlett et al. 2008 Non-patent document 9, “Harwood et al.” 2008 Non-patent document 11).
  • a dicamba at a concentration of 2.5 mg / l (11.3 ⁇ M) has been conventionally used to dedifferentiate immature embryo scutellum cells and induce callus with redifferentiation ability (Wan and Lemaux 1994) Non-patent document 14). Co-culture is performed for 2-3 days.
  • Non-Patent Document 11 It is subcultured at intervals of about 2 weeks in the same medium until a callus (transformed cell mass) showing clear resistance to the selected drug is obtained. Approximately 4-6 weeks later, the selected drug-resistant callus is transplanted to a transition medium, pre-regeneration medium containing the selected drug, or a regeneration medium containing the selected drug (shoot induction medium). The callus cultured in the pre-redifferentiation culture medium is then transplanted to the regeneration medium containing the selective drug. Further, the regenerated shoots and seedlings are transplanted to a rooting medium containing a selective drug and not containing a plant growth regulator, thereby obtaining a barley transformed plant.
  • Transformation efficiency per immature embryo The transformation efficiency per immature embryo that has been reported so far is as follows. For the cultivar Golden Promise, 7% (Tingey et al. 1997 Non-Patent Document 5), 12% (Matthews et al. 2001 Non-Patent Document 15), 9.2% (Murray et al. 2004 Non-Patent Document 16), 36 % (Bartlett et al. 2008 Non-Patent Document 9), 86.7% (Hensel et al. 2008 Non-Patent Document 10). In Non-Patent Documents 9 and 10, although high efficiency is obtained in some cases, such high efficiency is not stably obtained. It is 2% (Hensel et al. 2008 Non-Patent Document 10) for the variety Tafeno, and 2% (Hensel et al. 2008 Non-Patent Document 10) for the variety Helium.
  • Non-patent Document 17 Prior art Ke et al. 2002 (Non-patent Document 17) on gene transfer into immature barley embryos by Agrobacterium is to analyze the expression of ⁇ -glucuronidase (GUS) reporter gene after co-culture with Agrobacterium Then, the transfer efficiency of T-DNA to immature embryo cells due to the difference in medium composition for co-culture was evaluated. Using an immature embryo immediately after isolation, inoculating Agrobacterium for 30 minutes and using a co-culture medium in which the basic inorganic salt concentration of the MS medium is equal (x1) or 1/10 (x0.1). Co-cultivation was performed for days.
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • 0.25 mg / l (1.1 ⁇ M) 2,4-D is low in concentration to promote dedifferentiation and is not commonly used for callus induction from the scutellum (Serhantova et al. 2004 Non-Patent Document 18) .
  • X-Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucuronic acid
  • Non-Patent Document 17 In order to investigate the impact of specific factors on the efficiency of T-DNA introduction into immature embryos, extreme conditions were used in this experiment. Continuing the culture at a 1 / 10-fold concentration condition will have a detrimental effect on the plant, so that a sufficient number of T-DNA transduction events will occur for stable transformation.
  • Non-Patent Document 17 in all tests using a medium having a concentration of 1/10 times the concentration of MS inorganic salts, the immature embryo was isolated and the coculture was completed at least 72, regardless of the presence or absence of preculture. A culture period of time (3 days) is applied.
  • Patent Document 19 a conventional technique for gene transfer into immature rice corn embryos by Agrobacterium , applied heat treatment to immature embryos of rice and corn before inoculation with Agrobacterium (Patent Documents). Reported that 1) and centrifugation (Patent Document 2) or heat and centrifugation (Patent Document 3) improve the efficiency of gene transfer to immature embryonic scutella, resulting in improved transformation efficiency did. It has also been reported that by using these treatments, transformants could be obtained from varieties that could not be transformed so far.
  • Patent Document 4 by applying pressure treatment (Patent Document 4) to immature embryos before inoculation with Agrobacterium, gene transfer efficiency into scutellum cells is improved in the same manner as centrifugation, resulting in improved transformation efficiency. It has been reported to improve. Heat, centrifugation, heat and centrifugation, and pressure treatment are all used to increase the efficiency of gene transfer into immature embryonic scutellum.
  • the present invention relates to a method for gene transfer into a plant of the genus Barde (Hordeum), which makes it possible to perform transformation with higher efficiency than the conventionally known Agrobacterium method, and a method for transforming a plant of the genus Barley
  • the purpose is to provide a creation method.
  • the present inventors have a) an anti-auxin, b) a cytokinin, c) a phenoxy auxin at a concentration of less than 2 ⁇ M, and / or a benzoic system.
  • Gene transfer efficiency can be achieved by co-culturing in a co-culture medium that satisfies one or more of the following conditions: auxin is contained at a concentration of less than 5 ⁇ M, or phenoxy auxin and / or benzoic auxin is not contained. I found it to improve. However, when this co-culture medium was used, callus formation after co-culture was suppressed, and a transformed plant could not actually be obtained.
  • the inventors have performed centrifugation and / or pressure treatment of immature embryo tissues of barley plants before inoculation with Agrobacterium, and / or In addition, the effect of centrifugation and / or pressure treatment during or after the coexisting step of culturing in the coexisting medium was examined. It was found that callus formation efficiency from embryonic tissue can be improved. As a result, according to the present invention, it has become possible to efficiently transform a barley plant. In addition, the centrifugation process and / or pressurization process to an immature embryo tissue can also be implemented either before inoculating Agrobacterium or after the coexistence step.
  • a method for producing a transformed plant of a plant of the genus Hordeum (I) inoculating Agrobacterium into immature embryo tissues of barley, and in the presence of the Agrobacterium, one or more of the following conditions a) to c): a) containing anti-auxin; b) including cytokinin, c) contains phenoxy auxin at a concentration of less than 2 ⁇ M and / or contains benzoic auxin at a concentration of less than 5 ⁇ M or does not contain phenoxy auxin and / or benzoic auxin; In the coexisting medium that satisfies the above, perform the coexistence step of culturing the above tissue, (Ii) before inoculation with Agrobacterium, during the coexistence step and / or following the coexistence step, performing a step of centrifugation and / or pressure treatment of the tissue, (Iii) performing a resting step of culturing the tissue in
  • Aspect 12 The method according to any one of aspects 1 to 11, wherein the Agrobacterium is a bacterium selected from the group consisting of LBA4404, EHA101, EHA105, AGL0, AGL1, and 58C1.
  • Aspect 13 The method according to any one of embodiments 1 to 12, wherein the plant of the genus Barley is barley (H. vulgare).
  • the present invention makes it possible to transform a barley genus plant with high efficiency. This makes it possible to stably obtain a transformed plant body with good reproducibility, and to reduce the cost for obtaining the plant body.
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of addition of anti-auxins and dicamba to a co-culture medium on gene transfer efficiency into immature barley embryos. Fifteen immature embryos were tested in each group.
  • the columns in FIG. 1 are the system from which the plant hormone is not added, the system in which 5 ⁇ M of anti-auxin TIBA is added, the system in which 1.13 ⁇ M of dichroic auxin is added, and the system in which 11.3 ⁇ M of dicamba is added. The results are shown.
  • shaft of FIG. 1 shows a GUS expression index.
  • Expression of the GUS gene in the scutellum region is 87.5 (expressed in 75% or more of the scutellum), 62.5 (expressed in 50% or more and less than 75% of the scutellum), 37.5 ( Expressed in 25% or more and less than 50% of the scutellum), 17.5 (expressed in 10% or more and less than 25% of the scutellum), 6.5 (expressed in 1% or more and less than 10% of the scutellum), 0.5 (Expressed in less than 1% exceeding 0% of the scutellum) and 0 (no expression) were evaluated, and the average value was used as the GUS expression index.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of addition of cytokinins and antiauxins to the co-culture medium on the efficiency of gene transfer into immature barley embryos. Fifteen immature embryos were tested in each group.
  • the columns in FIG. 2 are each a system without addition of plant hormones, a system with 5 ⁇ M of 6BA, a system with 5 ⁇ M of 4-PU, a system with 5 ⁇ M of zeatin, a system with 5 ⁇ M of TIBA, and 5 ⁇ M of paclobutrazol. Each added system is shown.
  • 6BA, 4-PU and Zeatin are cytokinins
  • TIBA and paclobutrazol are antiauxins.
  • FIG. 2 shows a GUS expression index.
  • the GUS expression index in FIG. 2 was determined in the same manner as described in FIG.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of the addition of 2,4-D to the co-culture medium on the efficiency of gene transfer into barley immature embryos. Fifteen immature embryos were tested in each group.
  • the columns in FIG. 3 show the results of the system without addition of plant hormones, the system with addition of 1.13 ⁇ M of 2,4-D phenoxy auxin, and the system with addition of 11.3 ⁇ M of 2,4-D, respectively, from the left. Show.
  • shaft of FIG. 3 shows a GUS expression index.
  • the GUS expression index in FIG. 3 was determined in the same manner as described in FIG.
  • the present invention is a method for introducing a gene into an immature embryo tissue of a plant of the genus Hordeum, (I) inoculating the tissue with Agrobacterium, and in the presence of the Agrobacterium, one or more of the following conditions a) to c): a) containing an antiauxin, b) including cytokinin, c) contains phenoxy auxin at a concentration of less than 2 ⁇ M and / or contains benzoic auxin at a concentration of less than 5 ⁇ M or does not contain phenoxy auxin and / or benzoic auxin; Performing a coexistence step of culturing the tissue in a co-culture medium satisfying (Ii) before inoculation with Agrobacterium, during the coexistence step and / or subsequent to the coexistence step, performing a step of centrifuging and / or pressurizing the tissue.
  • a gene transfer method is a method for introducing a gene into an immature embryo tissue of a plant of the
  • the present invention is a method for producing a transformed plant of a plant of the genus Barde (Hordeum), (I) inoculating Agrobacterium into immature embryo tissues of barley, and in the presence of the Agrobacterium, one or more of the following conditions a) to c): a) containing anti-auxin; b) including cytokinin, c) contains phenoxy auxin at a concentration of less than 2 ⁇ M and / or contains benzoic auxin at a concentration of less than 5 ⁇ M or does not contain phenoxy auxin and / or benzoic auxin; In the coexisting medium that satisfies the above, perform the coexistence step of culturing the above tissue, (Ii) before inoculation with Agrobacterium, during the coexistence step and / or following the coexistence step, performing a step of centrifugation and / or pressure treatment of the tissue, (Iii) performing a resting step of culturing the tissue in
  • the plant from which the plant tissue usable in the present invention is derived is a plant of the genus Barley.
  • a plant of the ⁇ barley genus '' in this specification it is not limited, but H. arizonicum, H. bogdanii, H. H. chilense, H. comosum, H. cordobense, H. depressum, H. erectifolium, H. euclaston, H. flexuosum, H. fuegianum, H. guatemalense, H. gussoneanum, H. intercedens, H. jubatum , H. lechleri, H. marinum, H. murinum, H.
  • H. secalinum H. stenostachys
  • H. tetraploidum H. vulgare (barley).
  • barley H. vulgare
  • the plant tissue that can be used in the present invention is an immature embryo.
  • immature embryo refers to an embryo of an immature seed that is in the ripening process after pollination.
  • the stage (ripening stage) of the immature embryo to be used in the method of the present invention is not particularly limited, and it may be collected at any time after pollination, but it is 7 to 21 days after pollination. preferable. Although immature embryos can be used on the day of removal, they may be pre-cultured immature embryos.
  • ripe seed refers to a seed that has been matured as a seed after the ripening process after pollination has been completed.
  • the gene introduction method and the preparation method of a transformed plant of this invention utilize Agrobacterium bacteria. Except for the particularly specified steps, it can be carried out according to each step of a gene transfer method and a transformation method using known Agrobacterium bacteria.
  • Coexistence step In the present invention, a coexistence step is performed in which an immature embryo tissue inoculated with Agrobacterium is cultured in the presence of the Agrobacterium. This step is a step of ensuring the introduction of DNA from Agrobacterium into plant cells by culturing the plant tissue inoculated with Agrobacterium in the presence of Agrobacterium.
  • usable plant tissues are used after being isolated and collected from a plant of the genus Barley. Therefore, in the present invention, a tissue (immature embryo) is first isolated and collected from a plant body of the genus Barley, and the isolated and collected tissue is inoculated with Agrobacterium. Alternatively, the isolated and collected tissue may be pre-cultured, and the cultured tissue may be inoculated with Agrobacterium. Preferably, the tissue on the day of collection or the day after collection is inoculated with Agrobacterium. When the tissue is precultured, the period will be described separately.
  • the size of the immature barley embryo used in the present invention is not particularly limited, but those having a size of 1.5 to 2.5 mm can be preferably used.
  • the immature embryo as described above may be subjected to heat treatment (Patent Document 1) for increasing the transformation efficiency.
  • Heat treatment is performed before inoculation with Agrobacterium. The heat treatment for increasing the transformation efficiency will be described in detail later.
  • Agrobacterium is inoculated into the tissue of a barley genus plant.
  • “inoculation” refers to bringing Agrobacterium into contact with a plant tissue (eg, scutellum), and various Agrobacterium inoculation methods are known in the art. Examples of the method include a method of adding a plant tissue to a suspension in which Agrobacterium is suspended in a liquid medium, a method of directly dropping a suspension of Agrobacterium on a plant tissue on a co-culture medium, Examples thereof include a method of injecting an Agrobacterium suspension into the tissue, a method of immersing the plant tissue in the Agrobacterium suspension, and reducing the pressure. However, the method of inoculating Agrobacterium in the present invention is not limited to these methods.
  • various additives such as acetosyringone, surfactant, porous ceramics, etc. are added to the Agrobacterium to improve the transformation efficiency by Agrobacterium. It can be included in the suspension.
  • the Agrobacterium that can be used in the present invention is not particularly limited and may be any known Agrobacterium that can be used for the Agrobacterium transformation method.
  • examples of Agrobacterium include, but are not limited to, LBA4404, EHA101, EHA105, AGL0, AGL1, or C58C1.
  • a super binary vector Non-patent Documents 2 and 3
  • a strain having a pathogenic region of Ti plasmid pTiBo542 possessed by Agrobacterium A281 (Non-patent Document 20) is used. It is preferable to use it.
  • Agrobacterium has a property of introducing a gene inserted into T-DNA of a plasmid in Agrobacterium into the plant genome. Therefore, Agrobacterium that can be used in the present invention has a plasmid in which a gene intended to be expressed in a plant is inserted into T-DNA.
  • a plant can be transformed by inoculating plant tissues with Agrobacterium having the plasmid. Thereby, the preferable character is provided to the plant cell in the tissue.
  • Examples of plasmids for Agrobacterium that can be used in the present invention include, but are not limited to, pSB131, pSB134, pNB131, and pIG121Hm.
  • the medium used in this step is referred to as “coexisting medium” in this specification.
  • the coexisting medium may be one usually used for culturing plant cells, and examples thereof include a medium based on LS inorganic salts (Non-patent Document 21) and N6 inorganic salts (Non-patent Document 22).
  • a medium in which the concentration of inorganic salts and the like is lower than that usually used for example, a 1 ⁇ concentration MS medium
  • the medium is 1/2 times or less, more preferably 1/5 times or less, and a medium that is 1/10 times or less, for example, 1/10 concentration MS medium (Non-patent Document 17) can be most suitably used.
  • the present inventors have conducted intensive research, and as shown in Examples 1 and 2 below, by adding antiauxins and / or cytokinins in the coexisting medium, or by adding phenoxy-type auxin in the coexisting medium and It has been found that gene transfer efficiency is remarkably improved by lowering the benzoic auxin concentration or not adding phenoxy auxin and / or benzoic auxin to the co-culture medium, or by a combination of these conditions. This is one of the most prominent features of the present invention.
  • Anti-auxin is a substance having an action of antagonistically inhibiting the action of a compound having an auxin action.
  • the antiauxin is not limited, but 2,3,5-triiodobenzoic acid (TIBA), paclobutrazol, 2,4,6-trichlorophenoxyacetic acid (2,4 , 6-T), p-chlorophenoxyisobutyric acid (PCIB), maleic hydrazide, uniconazole P and the like can be preferably added to the co-culture medium.
  • TIBA 2,3,5-triiodobenzoic acid
  • PCIB p-chlorophenoxyisobutyric acid
  • maleic hydrazide uniconazole P and the like
  • the cytokinins are not limited, but include 6-benzylaminopurine (6BA), kinetin, N-phenyl-N ′-(4-pyridylurea) (4-PU), zeatin, Thidiazuron and ⁇ -dimethylallylaminopterin (2-ip) can be preferably added to the co-culture medium.
  • the concentrations of antiauxin and cytokinin added to the co-culture medium are each preferably 0.1 to 20 ⁇ M, more preferably 0.5 to 10 ⁇ M, and most preferably 2 to 7 ⁇ M.
  • Non-patent Document 17 showed that when a 1/10 concentration MS medium without auxin was used as a barley coexisting medium, high gene transfer efficiency was obtained. However, Non-Patent Document 17 does not indicate that a transformed plant is actually obtained. Non-Patent Document 17 also shows that the gene transfer efficiency is lower when auxin is not added to the MS medium at the same concentration than when low concentration 2,4-D is added. Such disclosure in Non-Patent Document 17 suggests that it is disadvantageous in terms of gene transfer efficiency that no auxin is added, and a small amount of 2,4-D is necessary.
  • the concentration of the phenoxy auxin in the co-culture medium is 2 ⁇ M or less, preferably 1 ⁇ M or less, more preferably 0.5 ⁇ M or less, more preferably 0.3 ⁇ M or less.
  • concentration of the benzoic auxin is 5 ⁇ M or less, preferably 4 ⁇ M or less, more preferably 3 ⁇ M or less, further preferably 2 ⁇ M or less, and most preferably no additive.
  • these concentrations of phenoxy auxin and benzoic auxin may be included.
  • the phenoxy auxin is not limited, but 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5- T) and the like, and 3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid (dicamba), 4-amino-3,5,6-trichloro-2-pyridinecarboxylic acid (picloram), etc. are suitable as benzoic auxins.
  • dicamba 3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid
  • picloram 4-amino-3,5,6-trichloro-2-pyridinecarboxylic acid
  • other auxins such as indole-3-acetic acid (IAA) and ⁇ -naphthalene acetic acid (NAA) may be added to the co-culture medium.
  • the present inventors actually did not add the plant growth regulator described in Non-patent Document 17, or added 1/10 concentration of 2,4-D at a very low concentration of 0.25 mg / l (1.13 ⁇ M).
  • the MS medium was used as a barley co-culture medium, and transformation experiments were conducted. However, even when a sufficient amount of auxin was added in the resting and selection processes, callus formation from immature embryos after co-culture was extremely severe. The callus was hardly obtained.
  • Non-Patent Document 17 investigates how various conditions in co-cultivation affect gene transfer efficiency during co-cultivation, and the conditions used in the experiment are directly applied to transformation. It is not supposed to be possible. Actually, in Non-Patent Document 17, “In order to investigate the impact of specific factors on the efficiency of T-DNA introduction into immature embryos, extreme conditions were used in this experiment .... MS Continuing the cultivation at a 1 / 10-fold concentration of inorganic salts will have a detrimental effect on the plant, and therefore a sufficient number of T-DNA transduction events for stable transformation.
  • the present inventors considered that callus formation could be performed while maintaining high gene transfer efficiency even if conditions for suppressing dedifferentiation of blastocyst cells were given to the co-culture medium. Repeated.
  • the scutellum of immature barley embryos co-cultured in a co-culture medium containing no auxin or containing a low concentration of auxin before the Agrobacterium inoculation, during and / or after the coexistence process
  • There is a remarkable effect of improving the callus induction rate by centrifugation treatment to immature embryos, before inoculation of Agrobacterium, during coexistence process and / or pressurization treatment to immature embryos after coexistence process, or combination of these treatments I found out.
  • Non-Patent Documents 25 and 26 examples of such additives include silver nitrate (Non-Patent Documents 25 and 26) and cysteine (Non-Patent Document 23).
  • “Cultivation” in this step refers to placing a plant tissue on a solidified co-culture medium or in a liquid co-culture medium and growing it at an appropriate temperature, light / dark conditions and period.
  • the form of the medium is not particularly limited as long as the medium components are sufficiently supplied to the plant tissue.
  • Solidification of the co-culture medium can be carried out by adding a solidifying agent known in the art, and as such a solidifying agent, for example, agarose or the like is known. In the present invention, such a solidified co-culture medium can be suitably used.
  • the culture temperature in this step can be appropriately selected, and is preferably 18 ° C-30 ° C, more preferably 25 ° C.
  • the culture in this step is preferably performed in a dark place, but is not limited thereto.
  • the culture period of this step can also be selected as appropriate.
  • the coexistence process is generally performed for 2 to 3 days, whereas the present inventors coexist for 2 to 3 days under the conditions of the present invention for suppressing dedifferentiation and callus formation.
  • the culture period in the coexistence step of the present invention is preferably 6 hours to 36 hours, more preferably 12 hours to 24 hours.
  • the present inventors proceeded with research and performed pre-culture before inoculation with Agrobacterium, culturing under conditions where phenoxy auxin and / or benzoic auxin was reduced or removed, the same as in the case of the coexistence step described above. Furthermore, the present inventors have found that callus formation from barley immature embryos after the coexistence process is inhibited. Therefore, in the present invention, regardless of whether it is precultured or cocultured, the period during which the phenoxy auxin and / or benzoic auxin is reduced or removed from the isolation of the immature embryo to the end of the coculture. Is preferably 6 hours to 36 hours, more preferably 12 hours to 24 hours.
  • the co-culture method in the present invention promotes gene transfer to the scutellum side of immature embryos.
  • a method of placing and culturing immature embryos so that the scutellum side faces upward and the hypocotyl side is in contact with the medium can be preferably used.
  • the immature embryo is generally placed so that the scutellum side is in contact with the medium downward, and the method is greatly different from the present invention.
  • centrifugal treatment and / or pressurization treatment are carried out by carrying out centrifugal treatment of barley immature embryos before, during and / or following the coexistence of Agrobacterium. It was found that even barley immature embryos co-cultured under the suppressive condition have a remarkable effect that callus can be sufficiently induced.
  • the conditions for centrifugation in this case may be the same as those described in WO2002 / 012520 (Patent Document 2). Specifically, it is performed in a centrifugal acceleration range of about 100G to 250,000G, 500G to 200,000G, preferably 1000G to 150,000G, and most preferably about 1100G to 110,000G.
  • the time for the centrifugal treatment is appropriately selected according to the centrifugal acceleration, but it is usually preferable to carry out the treatment for 1 second or longer. There is no particular upper limit on the centrifugation time, but the object can usually be achieved in about 10 minutes. In addition, when the centrifugal acceleration is large, the gene transfer efficiency can be significantly improved even when the centrifugal acceleration is very short, for example, 1 second or less. On the other hand, when the centrifugal acceleration is small, it is preferable to perform the centrifugation process for a long time. Appropriate centrifugation conditions can be easily set through routine experiments. Such centrifugation may be performed either before or after excision of the hypocotyl described later.
  • the centrifugation treatment may be performed before or after the co-culture, or may be taken out during the co-culture and centrifuged, but is preferably performed before and / or after the co-culture.
  • the point which performs the centrifugation process of plant material is the most remarkable characteristic in this invention.
  • Example 3 in a system cultured in a co-culture medium not added with a plant growth regulator, centrifugation to barley immature embryos before inoculation with Agrobacterium and / or immature embryos after the coexistence step It was found that the centrifugal treatment also has a remarkable effect of improving the callus induction rate from barley immature embryos.
  • Example 4 it was found that even in a system cultured in a co-culture medium supplemented with anti-auxin, good callus formation was observed by centrifugation.
  • the pressure treatment of immature embryos before inoculation with Agrobacterium and / or the pressure treatment of immature embryos after the coexistence process also increases the callus induction rate from barley immature embryos, similar to the above-mentioned centrifugation. There is a remarkable effect to improve.
  • the pressure treatment can be performed using, for example, a method described in WO2005 / 018169 (Patent Document 4).
  • the pressure treatment is not limited, but is preferably performed in the range of 1.7 to 10 atm, more preferably in the range of 2.4 to 8 atm.
  • the pressure treatment time can be appropriately selected according to the magnitude of the pressure, but is preferably 0.1 second or more and 4 hours, and more preferably 1 second to 30 minutes. Further, the pressure treatment may be performed either before or after excision of the hypocotyl.
  • the pressure treatment may be performed before or after the co-culture, and may be performed during the co-culture, but is preferably performed before and / or after the co-culture.
  • the point which pressurizes a plant material is also the most remarkable characteristic in this invention.
  • the combination of the above centrifugal treatment and pressure treatment can be suitably performed.
  • “before inoculation with Agrobacterium” means that the treatment is performed before the step of inoculating Agrobacterium before co-culture.
  • in the coexistence process means that the treatment is performed during the co-cultivation.
  • after the coexistence step means that the treatment is performed in the resting step performed after the co-culture.
  • “perform the centrifugation and / or pressure treatment of the tissue before inoculation with Agrobacterium, during the coexistence step and / or following the coexistence step” 1) A mode in which centrifugation and / or pressure treatment is performed before inoculation with Agrobacterium; 2) A mode in which, after inoculation with Agrobacterium, centrifugation and / or pressure treatment is performed during co-cultivation; 3) A mode in which centrifugation and / or pressure treatment is performed after the coexistence step and before the resting step; 4) A mode of carrying out centrifugal treatment and / or pressure treatment in the resting step; and 5) A mode of carrying out centrifugal treatment and / or pressure treatment in a plurality of stages 1) to 4) above. . All of these embodiments are encompassed by the present invention.
  • the plant tissue is cultured in a resting medium after the coexistence process.
  • This step is a step of removing the Agrobacterium from the plant cell and growing the plant cell after the coexistence step.
  • the medium used in this step is referred to as “resting medium” in this specification.
  • the resting medium may be one usually used for culturing plant cells, and examples thereof include a medium based on LS inorganic salts (Non-patent Document 21) and N6 inorganic salts (Non-patent Document 22).
  • the resting medium in this step preferably contains an antibiotic. Unlike the antibiotics for selection used in the following selection process, the antibiotics contained in the resting medium are intended to eliminate Agrobacterium. Although not limited, cefotaxime and / or carbenicillin can be preferably used as an antibiotic.
  • the resting medium in this step preferably contains a plant growth regulator.
  • plant growth regulators benzoic auxins and / or phenoxy auxins can be preferably used. Since auxins generally have an action to dedifferentiate plant tissues, most or all of the plant tissues become dedifferentiated tissues (callus) in this step and the subsequent selection step.
  • the term “dedifferentiated tissue” or “callus” is used by culturing a part (explant) of a differentiated plant tissue in a medium containing a plant growth regulator such as auxin or cytokinin. The resulting tissue refers to an amorphous and undifferentiated cell mass that does not have the form of the original plant tissue.
  • “Cultivation” in this step means that a plant tissue is placed on a solidified resting medium or in a liquid resting medium, and allowed to grow at an appropriate temperature, light / dark conditions and period.
  • the form of the medium is not particularly limited as long as the medium components are sufficiently supplied to the plant tissue.
  • the solidification of the resting medium can be carried out by adding a solidifying agent known in the art, and as such a solidifying agent, for example, agarose or the like is known.
  • the culture temperature in this step can be appropriately selected, and is preferably 20 ° C-35 ° C, more preferably 25 ° C.
  • the culture in this step is preferably performed in a dark place, but is not limited thereto.
  • the culture period in this step can also be appropriately selected, and is preferably 1 to 20 days, more preferably 10 days.
  • the selection process and the redifferentiation process described below are generally performed in the plant transformation method using Agrobacterium.
  • this selection step is not essential.
  • the transformation improvement treatment described later when the transformation improvement treatment described later is performed, the target transformant can be obtained without going through the selection step.
  • the following description is for illustration and this invention is not limited by the following description.
  • This step is a step of selecting a transformant from the tissue obtained in the above step based on the presence or absence of gene transfer.
  • the medium used in this step is referred to as “selection medium” in the present specification.
  • Examples of the medium that can be used as the selection medium include media based on LS inorganic salts (Non-Patent Document 21) and N6 inorganic salts (Non-Patent Document 22).
  • auxins are added to the selective medium.
  • the selection medium contains a plant growth regulator.
  • the auxin used in the selection process is not particularly limited, but is preferably dicamba and / or 2,4-D. Furthermore, various additives can be added as necessary.
  • the selection of the transformed plant can be performed, for example, by culturing the plant that has undergone the coexistence step and / or the resting step in a selection medium containing an appropriate selection agent, and determining whether or not there is resistance to the selection agent.
  • the selective drug that can be used in this step those usually used in the technical field can be used.
  • antibiotics or herbicides can be used as selective drugs.
  • the antibiotic for example, hygromycin, chloramphenicol, G418, kanamycin, or blasticidin S can be used.
  • the herbicide for example, phosphinoslysin, bialaphos or glyphosate can be used.
  • the DNA inserted into the T-DNA in Agrobacterium may contain not only genes intended to be expressed in plants but also, for example, resistance genes for selected drugs. is necessary. Resistance genes for such selective drugs are known in the art.
  • this step for example, when selection is performed in a selection medium containing hygromycin, it is necessary that the plant be introduced with a hygromycin resistance gene in addition to the gene intended to be expressed in the plant.
  • selection of transformed plants can be performed based on the sugar requirement of plant cells.
  • Sugars that can be used by plant cells include sucrose and glucose, but it is known that mannose cannot be used. Therefore, when plant tissues are cultured in a medium containing mannose as the main carbon source, the plant tissues die off or cease to grow because there is little or no available sugar.
  • Selection based on sugar requirement utilizes this principle. That is, in order to use this selection method, DNA inserted into T-DNA in Agrobacterium is not only a gene intended to be expressed in plants, but also phosphorylated mannose isomerase (PMI). ) It is necessary to include a gene. Here, the plant cell introduced with the PMI gene can use mannose as a carbon source.
  • PMI phosphorylated mannose isomerase
  • Non-Patent Document 24 Such a method can also be performed for other sugars. For example, since a plant cell into which a xylose isomerase gene has been introduced can use xylose as a carbon source, it can be applied to such a method.
  • This step can be repeated several times by changing the component composition of the medium.
  • the concentration of the selected drug is increased in each selection step, thereby increasing the certainty of drug selection and increasing the possibility of obtaining transformed plants.
  • This selection process is preferably performed at least once, more preferably twice.
  • the transformed tissue is efficiently obtained by cutting off the proliferated portion of the tissue cultured in the medium containing the selected drug and subjecting only the proliferated portion to the next selection step. It is also possible to do.
  • “Cultivation” in this step means that a plant tissue is placed on a solidified selection medium or in a liquid selection medium and grown at an appropriate temperature, light and dark conditions and period.
  • the form of the medium is not particularly limited as long as the medium components are sufficiently supplied to the plant tissue.
  • the selection medium can be solidified, for example, with agarose or the like.
  • the culture temperature in this step can be appropriately selected, and is preferably 20 ° C-35 ° C, more preferably 25 ° C.
  • the culture in this step is preferably performed in a dark place, but is not limited thereto.
  • the culture period of this step can also be selected as appropriate.
  • the selection process is performed twice, the primary selection is performed for 2 weeks and the secondary selection is performed for 2 weeks, for a total of 4 weeks.
  • the entire selection process is preferably performed for 3-8 weeks, more preferably 4-6 weeks.
  • Redifferentiation step After the tissue cultured in the resting medium is selected if necessary, a step of redifferentiation in the redifferentiation medium is performed.
  • the medium used in this step is referred to as “regeneration medium” in the present specification.
  • the regeneration medium does not contain auxins.
  • barley transformation may use pre-regeneration culture medium (transition medium, pre-regeneration medium).
  • This medium usually contains auxins (Jacobsen et al. 2006, Non-Patent Document 8, Bartlett et al. 2008, Non-Patent Document 9, Harwood et al. 2008, Non-Patent Document 11).
  • the pre-redifferentiation culture medium may contain a selective drug. The tissue cultured in the pre-redifferentiation culture medium is transferred to the regeneration medium and cultured.
  • the regeneration medium may contain a selective drug.
  • the selective drugs that can be used in this step are the same as those defined in the selection step. However, in this step, it is not always necessary to use the same selected drug as the selected drug used in the selection step. In that case, it is necessary for the plant to be introduced with resistance genes for two or more selected drugs from Agrobacterium.
  • Redifferentiation in the present invention means that a plant tissue that has been completely or partially dedifferentiated again acquires the properties of the original plant tissue or plant body.
  • auxins are used during the coexistence process and / or resting process and / or selection process, all or part of the plant tissue is dedifferentiated. Therefore, by subjecting to this step, the dedifferentiated tissue is redifferentiated and a completely transformed plant body can be obtained.
  • “Cultivation” in this step refers to placing a plant tissue on a solidified regeneration medium or in a liquid regeneration medium and growing it at an appropriate temperature, light / dark conditions and period.
  • the form of the medium is not particularly limited as long as the medium components are sufficiently supplied to the plant tissue.
  • the regeneration medium can be solidified using, for example, agarose.
  • the culture temperature in this step can be appropriately selected, and is preferably 20 ° C-35 ° C, more preferably 25 ° C.
  • the culture in this step is preferably performed under illumination for 16-24 hours / day, but is not limited thereto.
  • the culture period in this step can also be appropriately selected, and is preferably 7 days to 21 days, more preferably 14 days.
  • transformation improvement treatment refers to a treatment for achieving an improvement in transformation efficiency.
  • Such a transformation improving process is not limited, but includes, for example, the following or a combination thereof.
  • Non-Patent Document 26 2003: Non-Patent Document 26
  • Heat treatment Reference: WO1998 / 054961: Patent Document 1
  • c) treatment of inoculating Agrobacterium in the presence of powder see: WO2007 / 069643: Patent Document 5
  • g) Treatment of adding cysteine to the co-culture medium Treatment of adding cysteine to the co-culture medium.
  • heat treatment and powder addition are both treatments for improving gene transfer efficiency, and addition of silver nitrate has an effect of improving the callus induction rate.
  • Non-Patent Document 25 Zhao et al. 2001
  • Ishida et al. 2003 Non-Patent Document 26
  • Silver nitrate can be added to the co-culture medium at a concentration of 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 10 ⁇ M, for example.
  • the heat treatment can be performed using, for example, a method described in WO1998 / 054961 (Patent Document 1).
  • the plant material is treated at 33 ° C. to 60 ° C., preferably 37 ° C. to 52 ° C., for 5 seconds to 24 hours, preferably 1 minute to 24 hours before contacting with Agrobacterium.
  • the treatment of inoculating Agrobacterium in the presence of powder can be performed using, for example, the method described in WO2007 / 069643 (Patent Document 5). Specifically, for example, it is performed by mixing Agrobacterium suspension and powder and inoculating the plant material, or mixing plant and powder and inoculating it with Agrobacterium.
  • the powder is not limited, but is a porous powder, glass wool, or activated carbon, preferably porous ceramic, glass wool, or activated carbon, more preferably hydroxyapatite, silica gel, or glass wool.
  • cysteine can be added to the co-culture medium at 10 mg / l to 1 g / l, preferably 50 mg / l to 750 mg / l, more preferably 100 mg / l to 500 mg / l.
  • a preferable transformation improving treatment is a treatment of adding AgNO 3 to the co-culture medium, a heat treatment, a treatment of inoculating Agrobacterium in the presence of powder, a treatment of adding cysteine to the co-culture medium, or a combination thereof. is there.
  • the means for “physically / chemically damaging one or more sites selected from the radicle, bud, and hypocotyl” is not particularly limited, and various physical Processing and chemical processing are included.
  • the physical treatment includes, but is not limited to, for example, excision or injury with a sharp blade (for example, a scalpel), removal or injury with an instrument having a sharp tip (for example, tweezers), and the like.
  • the chemical treatment includes, for example, treatment with an agent such as an acidic or alkaline substance that loses or reduces the function of plant cells, or a herbicide component that is toxic to cells.
  • the embryo is a part that will become a plant in the future, and includes the roots, shoots, and hypocotyls.
  • the hypocotyl is a cylindrical portion that becomes the axis of the embryo, and buds are generated from the upper end and radicles are generated from the lower end.
  • the radicle, bud, and hypocotyl are understood as meanings commonly used in this technical field.
  • one or more sites selected from radicles, buds, and hypocotyls refers to larvae, shoots, hypocotyls. Mean all combinations selected from one, two, or three sites. Specifically, the combinations are as follows: 1) larvae, 2) larvae, 3) hypocotyls, 4) larvae and larvae, 5) larvae and hypocotyls, 6) buds and embryos Axes, 7) Roots and shoots and hypocotyls.
  • “before inoculation with Agrobacterium” means that the treatment is performed before the step of inoculating Agrobacterium before co-culture.
  • in the coexistence process means that the treatment is performed during the co-cultivation.
  • after the coexistence step means that the treatment is performed in the resting step performed after the coexistence engineering culture.
  • the immature embryo tissue is selected from larvae, buds, and hypocotyls before inoculation of Agrobacterium to the immature embryo tissue, during and / or after the coexistence step 1 "Performs a process of physically / chemically damaging more parts" 1) A mode in which the site is damaged before inoculation with Agrobacterium; 2) Aspect of damaging the above site after inoculation with Agrobacterium; 3) A mode in which the site is damaged after the coexistence step and before the resting step; 4) A mode of damaging the site in the resting process; and 5) A mode of damaging the site in any one of steps 1) to 4). All of these embodiments are encompassed by the present invention.
  • “high transformation efficiency” means that a target gene is introduced into plant cells with high efficiency, that transformed callus is induced with high efficiency from immature embryos, etc., and that high efficiency is obtained from transformed callus. It is a concept that includes re-differentiation.
  • “transformation efficiency is improved” means that the introduction efficiency of a target gene into a plant cell is improved, the rate of induction of transformed callus from immature embryos, etc. is improved, This is a concept including improvement of regeneration efficiency.
  • Whether or not a gene has been introduced into a plant tissue can be determined by various known methods. For example, by using a gene to be transformed as a reporter gene such as GUS ( ⁇ -glucuronidase) gene, luciferase gene or GFP gene, the presence or absence of transformation can be confirmed by visualizing the expression site of these reporter genes by a simple and known method. It is possible to confirm about.
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • GFP luciferase gene
  • plant cells can be cultured in a medium containing antibiotics or herbicides, or antibiotic solutions or herbicide solutions can be added to plants. It is also possible to confirm the presence or absence of transformation using the resistance expression as an index.
  • Example 1 Effect of co-culture medium composition on gene transfer efficiency (anti-auxin, auxin) Materials and Methods Immature embryos (size 1.5-2.0 mm) from which the hypocotyl of barley (variety: Golden Promise) was removed were aseptically collected and submerged in 2 ml microtubes containing 1 ml sterile water. In order to increase gene transfer efficiency, the tube containing the immature embryo was heat-treated at 43 ° C. for 5 minutes in a water bath.
  • Immature embryos were washed once with a liquid callus induction medium CIMT (Tingay et al. 1997 Non-Patent Document 5) excluding plant growth regulators (hereinafter collectively referred to as anti-auxin, cytokinin, and auxin).
  • An immature embryo inoculated with Agrobacterium was mixed with 100 ⁇ M acetosyringone in barley co-culture medium (1/10 concentration of MS inorganic salt and MS vitamin, 10 g / l glucose, 0.5 g / l MES, 5 ⁇ M AgNO 3 and 5 ⁇ M CuSO 4 , PH 5.8 , 8 g / l agarose) and placed so that the scutellum side faces upward.
  • test was implemented in 4 test areas which added two types of plant growth regulators to the co-culture medium. That is, there were 4 test groups of hormone-free without plant growth regulator added, 5 ⁇ M TIBA (antiauxin), 1.13 ⁇ M dicamba (auxin), 11.3 ⁇ M dicamba (auxin).
  • Immature embryos cultured for 24 hours at 25 ° C. in the dark were treated with CIMT resting medium supplemented with 0.5 mg / l 2,4-D and 1.25 mg / l CuSO 4 .5H 2 O (Tingay et al. 1997 It was transplanted to Patent Document 5).
  • the resting medium was supplemented with 250 mg / l carbenicillin 100 mg / l cefotaxime for Agrobacterium sterilization.
  • immature embryos were immersed in 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8) containing 0.1% Triton X-100. And left at 37 ° C.
  • a phosphate buffer containing 1.0 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucuronic acid (X-gluc) and 20% methanol was added. After overnight treatment at 37 ° C., the expression of GUS gene was examined.
  • GUS gene in the scutellum region is 87.5 (expressed in 75% or more of the scutellum), 62.5 (expressed in 50% or more and less than 75% of the scutellum), 37.5 ( Expressed in 25% or more and less than 50% of the scutellum), 17.5 (expressed in 10% or more and less than 25% of the scutellum), 6.5 (expressed in 1% or more and less than 10% of the scutellum), 0.5 Evaluation was made in 7 stages (exceeding 0% and less than 1% of the scutellum) and 0 (no expression), and the average value was expressed as a GUS expression index. The number of immature embryos tested was 15 in each group. The number of immature embryos tested was 15 in each group.
  • Example 2 Effect of co-culture medium composition on gene transfer efficiency (cytokinin, anti-auxin) Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Agrobacterium inoculation methods are the same as in Example 1. In addition, 6 test sections to which 5 types of plant growth regulators were added were used as the co-culture medium. That is, hormone-free without plant growth regulator, 5 ⁇ M 6BA, 5 ⁇ M 4-PU, 5 ⁇ M Zeatin (above, cytokinin), 5 ⁇ M TIBA, 5 ⁇ M paclobutrazol (above, anti-auxin) 6 The test area was designated. CIMT resting with immature embryos cultured at 25 ° C.
  • Example 2 in the dark for 24 hours, supplemented with 0.5 mg / l 2,4-D and 1.25 mg / l CuSO 4 .5H 2 O as in Example 1. It was transplanted to a medium (Tingay et al. 1997 Non-Patent Document 5). The resting medium was supplemented with 250 mg / l carbenicillin 100 mg / l cefotaxime for Agrobacterium sterilization. After culturing in the dark at 25 ° C. for 2 days, the expression of the GUS gene was investigated in the same manner as in Example 1, and the result was expressed as a GUS expression index. The number of immature embryos tested was 15 in each group.
  • Example 3 Effect of Centrifugal Treatment on Compact Callus Formation Materials and Methods Materials and Agrobacterium inoculation methods are the same as in Example 1. The co-culture medium was free from plant growth regulators.
  • the immature embryo co-cultured for 24 hours at 25 ° C. in the dark was transferred to a 2 ml microtube containing 1 ml of sterilized water and centrifuged at 25 ° C. and 1,500 rpm (20,000 ⁇ g) for 10 minutes. Thereafter, transplanted to the same CIMT resting medium (Tingay et al. 1997 Non-Patent Document 5) supplemented with 0.5 mg / l 2,4-D and 1.25 mg / l CuSO 4 .5H 2 O as in Example 1. did.
  • the resting medium was supplemented with 250 mg / l carbenicillin 100 mg / l cefotaxime for Agrobacterium eradication.
  • the scutellum of each immature embryo was divided into 4 parts. Divided sections were transplanted to a medium having the same composition. Thereafter, the culture was further continued for 8 days under the same culture conditions. After the culture, the shape of the callus formed on the scutellum divided section was observed. In barley, only callus with a compact and embryogenic shape can be subcultured and has the potential to re-differentiate in the future. On the other hand, spongy callus containing a lot of water is often formed, but such callus has lost redifferentiation ability. Therefore, the number of scutellum sections that formed compact callus was counted and used as the callus formation rate.
  • the gene introduction region can be used even if resting culture is performed without any treatment. It was revealed that compact callus formation from blastocyst cells is strongly suppressed. On the other hand, 80% of the test plots subjected to the centrifugal treatment formed compact callus, suggesting the possibility of obtaining transformed callus at a certain frequency by subsequent selection with hygromycin. In addition, the present inventors have found that a similar callus formation promoting effect is also obtained when immature embryos before inoculation with Agrobacterium are subjected to centrifugal treatment or pressure treatment.
  • Example 4 Effect of Centrifugal Treatment on Hygromycin-resistant Callus Formation Materials and Methods Materials and Agrobacterium inoculation methods, heat treatment conditions, coexistence steps, centrifugation treatment conditions and resting steps are the same as in Example 3.
  • 5 ⁇ M TIBA which is an antiauxin, was added to the co-culture medium. The resting process was continued for 10 days after dividing the scutellum into 4 parts. After the resting process, each divided scutellum section was further divided into 4 parts (16 parts per immature embryo), and CIMT selection medium (Tingay et al.) Supplemented with 50 mg / l hygromycin B and 1.25 mg / l CuSO 4 .5H 2 O. al.
  • Example 5 Effect of co-culture medium composition on gene transfer efficiency (hormone free, 2,4-D) Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Methods Materials and Agrobacterium inoculation methods are the same as in Example 1. That is, a co-culture medium containing 1/10 concentration of MS inorganic salt was used. As test plots, three types were used: a hormone-free co-culture medium containing no plant growth regulator, and a co-culture medium supplemented with 1.13 ⁇ M 2,4-D and 11.3 ⁇ M 2,4-D. The immature embryo co-cultured for 24 hours in the dark at 25 ° C. was subjected to CIMT-less addition of 0.5 mg / l 2,4-D and
  • Ting medium (Tingay et al. 1997 Non-Patent Document 5) was transplanted.
  • the resting medium was supplemented with 250 mg / l carbenicillin 100 mg / l cefotaxime for Agrobacterium sterilization.
  • the expression of the GUS gene was investigated in the same manner as in Example 1, and the result was expressed as a GUS expression index.
  • the number of immature embryos tested was 15 in each group.
  • Example 6 Effect of Centrifugal Treatment Before Agrobacterium Inoculation and After Co-culture on Compact Callus Formation Materials and Methods Preparation of materials and Agrobacterium inoculation method are the same as in Example 1. Heat treatment to immature embryos was performed in the same manner. Note that 5 ⁇ M of TIBA was added to the co-culture medium.
  • Example 7 Preparation of a comparative material for transformation efficiency and inoculation with Agrobacterium using a conventional coexisting medium containing daikanba and a coexisting medium with 1/10 concentration of MS inorganic salt are the same as in Example 1. The heat treatment was performed in the same manner.
  • Test plot (1) An immature embryo inoculated with Agrobacterium was obtained from Harwood et al. The scutellum was placed downward in the co-culture medium described in (2008 Non-Patent Document 11). Co-culture was performed at 25 ° C. in the dark for 3 days. Centrifugation was not performed in this test section.
  • Test group (2) The isolated immature embryo was transferred to a 2 ml microtube containing 1 ml of sterilized water and centrifuged at 15,000 rpm (20,000 ⁇ g) for 10 minutes at 25 ° C. Thereafter, the cells were cocultured in the same manner as in the test group (1).
  • Test plot (3) After co-culture as in test plot (1), immature embryos were transferred to a 2 ml microtube containing 1 ml of sterile water and 10 ° C. at 25 ° C. and 15,000 rpm (20,000 ⁇ g). Centrifuged for minutes.
  • Test plot (4) immature embryos inoculated with Agrobacterium, barley co-culture medium containing 100 ⁇ M acetosyringone (1/10 concentration of MS inorganic salt and MS vitamin, 10 g / l glucose, 5 ⁇ M TIBA, 0.5 g / l MES, 5 ⁇ M AgNO 3 and 5 ⁇ M CuSO 4 , pH 5.8, 8 g / l agarose) and placed so that the scutellum faces upward. The cells were cultured at 25 ° C. in the dark for 24 hours. Centrifugation was not performed in this test section.
  • Test group (5) The isolated immature embryo was transferred to a 2 ml microtube containing 1 ml of sterilized water and centrifuged at 15,000 rpm (20,000 ⁇ g) for 10 minutes at 25 ° C. Thereafter, the cells were cocultured in the same manner as in the test group (4).
  • Test plot (7) Excluding TIBA, which is a plant growth regulator, from the co-culture medium of test plot (4), after co-cultivation was carried out in the same manner as in test plot (4), immature embryos were placed in 2 ml containing 1 ml of sterile water. It was transferred to a microtube and centrifuged at 15,000 rpm (20,000 ⁇ g) for 10 minutes at 25 ° C.
  • the immature embryos obtained in the test groups (1), (2), (3), (4), (5), (6), and (7) were 0.5 mg / l 2,4-D, respectively. And transplanted to a CIMT resting medium (Tingay et al. 1997 Non-Patent Document 5) containing no selection drug supplemented with or.
  • the resting medium was supplemented with 250 mg / l carbenicillin 100 mg / l cefotaxime for Agrobacterium sterilization. After culturing in the dark at 25 ° C. for 7 days, immature embryos were divided into 4 parts, and CIMT resting medium without selection drug (Tingay et al.
  • Non-Patent Document 5 After resting culture for 10 days in the dark at 25 ° C., the 4 immature embryo sections were further divided into 3 to 6 sections (12 to 24 sections per immature embryo), and 0.1 mg / l 2,4-D, It was plated in 1.5 [mu] M CuSO 4 and 75 mg / l hygromycin CIMT selection medium supplemented with (Tingay et al.1997 non-Patent Document 5). And it culture
  • the obtained hygromycin-resistant callus was placed on a transition medium (Harwood et al. (2008 Non-Patent Document 11)) containing no hygromycin, and only one per divided section. For about 2 weeks.
  • the obtained green cell mass or shoot was placed on a regeneration medium (Harwood et al. (2008 Non-Patent Document 11)) containing 30 mg / l hygromycin, 0.2 mg / l indolebutyric acid (IBA) and 5 ⁇ M CuSO 4 . Then, the cells were cultured for about 2 weeks under light conditions at 25 ° C.
  • phosphate buffer pH 6.8 containing 0.1% Triton X-100 (registered trademark), and 1% at 37 ° C. Let stand for hours. After removing the phosphate buffer, a phosphate buffer containing 1.0 mM mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucuronic acid (X-gluc) and 20% methanol was added. After treatment at 37 ° C. for 24 hours, the expression of the GUS gene was examined. In addition, the GUS gene expression was investigated on a single leaf from a maximum of one plant per slice of immature embryo divided.
  • test group 4 in which the immature embryo was not centrifuged, a compact callus having redifferentiation ability was not formed, and no transformant was obtained.
  • no transformants could be obtained from immature embryos cultured in the conventional coexisting medium containing dicamba after centrifugation in Test Group 2. This is because T-DNA was introduced into a portion of an immature embryo in which callus was not formed later by performing centrifugation before co-culture.
  • expression of the GUS gene was detected near the center of the immature embryo on the hypocotyl side.
  • test group 6 in which 5 ⁇ M TIBA, which is an anti-auxin, was added to the co-culture medium showed a higher transformation efficiency than the hormone-free test group 7.
  • Example 8 Genetic analysis of the transgene in the next generation of self-breeding transformants
  • Example 6 Two hygromycin-resistant and GUS-positive transformed plants obtained from different immature embryos in the test section (6) were cultivated in a greenhouse. From the immature seeds obtained, 1.5 to 2.0 mm immature embryos were aseptically collected. The immature embryo was placed on a regeneration medium containing 5 ⁇ M CuSO 4 (Harwood et al. (2008 Non-Patent Document 11)) and cultured under light conditions at 25 ° C. for about 2 weeks.
  • T1 self-fertilizing next generation

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Abstract

　本発明は、従来公知のアグロバクテリウム法に比べて、高い効率でオオムギ属の植物の形質転換を行うことができる、遺伝子導入方法、および、形質転換植物の作成方法を提供することを課題とする。　本発明の方法は、アグロバクテリウム菌を接種する前、共存工程中および／または共存工程に次いで、オオムギ属植物の未熟胚組織を遠心処理および／または加圧処理をする工程を含み、その共存培地が、ａ）アンチオーキシンを含む、ｂ）サイトカイニンを含む、ｃ）フェノキシ系オーキシンを２μＭ未満の濃度で含むおよび／またはベンゾイック系オーキシンを５μＭ未満の濃度で含むか、あるいは、フェノキシ系オーキシンおよび／またはベンゾイック系オーキシンを含まない；の１つまたは複数の条件を満たすことを特徴とする。

Description

アグロバクテリウム菌を用いた、オオムギ属植物へ遺伝子導入を行う方法およびオオムギ属植物の形質転換植物の作成方法
　本発明は、アグロバクテリウム属細菌を介してオオムギ属の植物へ遺伝子導入を行う方法に関する。本発明は更に、アグロバクテリウム属細菌を介して、オオムギ属の植物の形質転換植物を作成する方法に関する。
　主要穀類であるオオムギ、コムギ、トウモロコシ、イネなどの単子葉植物の形質転換方法には、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などの物理化学的方法（ＤＮＡの直接導入法）とアグロバクテリウム属細菌が持つ機能を利用する生物学的方法（ＤＮＡの間接導入法）が知られている。直接導入法では、目的遺伝子が、断片化されて導入される、多コピー導入されるという事象が高頻度で生じる。そのため、目的遺伝子が発現しない、または、弱く異常な発現（ジーンサイレンシング）を示す形質転換体が高頻度で出現する。また、プロトプラストを用いる方法では、培養期間が長期化するため、得られた形質転換体において、培養変異による種子不稔や奇形などが生じ易い。
　それに対し、アグロバクテリウム属細菌を介する遺伝子導入法は、Ｔｉプラスミドの病原性領域（ｖｉｒ領域）における遺伝子群の発現制御等により、目的遺伝子の導入コピー数は低く保たれ、断片化されて導入されることも少ない。そのため、得られた形質転換体において目的遺伝子が高発現する個体が多く得られ、直接導入法に比べると、発現量の個体間差も少ないという大きな利点がある。
　アグロバクテリウム属細菌を介した遺伝子導入法は、双子葉植物の形質転換法として普遍的に用いられている。もともと、自然界におけるアグロバクテリウム属細菌の宿主は双子葉植物に限定されており、長い間、単子葉植物には寄生しないと考えられてきた（Potrykus 2000: 非特許文献１）。しかしながら、供試組織の検討、培地組成の改良、アグロバクテリウム菌株の選定などの詳細な研究の結果、主要穀物であるイネで初めてアグロバクテリウム属細菌を介した高効率形質転換方法が報告された（Hiei et al. 1994: 非特許文献２）。イネでの成功に続いて、トウモロコシ（Ishida et al. 1996　非特許文献３）、コムギ（Cheng et al. 1997　非特許文献４）、オオムギ（Tingay et al. 1997　非特許文献５）およびソルガム（Zhao et al. 2000　非特許文献６）でのアグロバクテリウムを介した形質転換の成功が報告された。アグロバクテリウムによる単子葉穀物の形質転換の材料として、未熟胚および短期間培養した未熟胚は最適であり、トウモロコシ、コムギ、オオムギなどの作物において、未熟胚はアグロバクテリウム感染の主要なターゲットとなっている（Cheng et al. 2004　非特許文献７)。
　オオムギにおけるアグロバクテリウムによる形質転換の最初の成功例は、やはり、未熟胚を材料に用いる方法である(Tingay et al. 1997　非特許文献５)。近年報告されているオオムギ形質転換方法（Jacobsen et al. 2006　非特許文献８, Bartlett et al. 2008　非特許文献９, Hensel et al. 2008　非特許文献１０, Harwood et al. 2008　非特許文献１１）も、下記に具体的に記載するように、基本的にTingay et al.(1997　非特許文献５)の方法と同様である。ただし、Tingay et al.(1997　非特許文献５)は、アグロバクテリウム接種前に未熟胚へパーティクルガンによる付傷を行っている。しかしながら、Trifonova et al.(2001　非特許文献１２)が、アグロバクテリウムの接種前のオオムギ未熟胚へのパーティクルガンによる付傷処理が形質転換効率を向上させないことを示して以来、ほとんど、付傷処理は利用されていない。
　１．未熟胚を用いたアグロバクテリウムによるオオムギ形質転換方法の従来技術
　　１）未熟胚の単離とアグロバクテリウムの接種
　未熟胚の直径が１．５－２．０ｍｍに育ったオオムギの穂から未熟種子を採取し、次亜塩素酸ナトリウム溶液で殺菌し、無菌的に未熟胚を取り出す。得られた未熟胚から胚軸を切除し、オオムギのカルス誘導培地に胚盤を上向きに置床する。カルス誘導培地には、Murashige & Skoog (MS) 無機塩類（Murashige & Skoog 1962　非特許文献１３）、３０ｇ／ｌ マルトース、１．０ｇ／ｌ カゼイン加水分解物、３５０ｍｇ／ｌ ミオ－イノシトール、６９０ｍｇ／ｌ、１．０ｍｇ／ｌ 塩酸チアミン、２．５ｍｇ／ｌ ３，６－ジクロロ－２－メトキシ安息香酸（ダイカンバ）、１．２５ｍｇ／ｌ ＣｕＳＯ４５Ｈ２Ｏ（Bartlett et al. 2008　非特許文献９およびHarwood et al. 2008　非特許文献１１でのみ添加）、３．５　ｇ／ｌ フィタゲル、ｐＨ５．８が共通して用いられている（Jacobsen et al. 2006　非特許文献８, Bartlett et al. 2008　非特許文献９, Hensel et al. 2008　非特許文献１０, Harwood et al. 2008　非特許文献１１）。 接種源に用いるアグロバクテリウム懸濁液は、液体培地で一晩振盪培養することにより得る。アグロバクテリウムの接種方法は、未熟胚の胚盤上にアグロバクテリウム懸濁液を滴下する方法（Jacobsen et al. 2006　非特許文献８, Bartlett et al. 2008　非特許文献９, Harwood et al. 2008　非特許文献１１）と、未熟胚をアグロバクテリウム懸濁液中に浸漬した後、真空ポンプを用いて減圧を行う方法が行われている（Hensel et al. 2008　非特許文献１０）。接種が行われる時間、すなわち、アグロバクテリウム懸濁液と未熟胚が接触してから共存培養の培地への移植を行うまでの時間については、これらの報告中には、具体的な記述がないが、滴下法も浸漬減圧法のどちらの接種方法も２０分から長くても２時間程度であると考えられる。なお、未熟胚へのアグロバクテリウムの接種は、未熟胚を単離した当日、または、一晩培養した翌日に行われている。
　　２）アグロバクテリウムとの共存培養
　アグロバクテリウムを滴下法または浸漬減圧法を用いて接種した後、未熟胚は、共存培養用の培地へ移動される。未熟胚は、胚盤側を下向きに培地に接するよう置床されるのが一般的である（Jacobsen et al. 2006　非特許文献８, Bartlett et al. 2008　非特許文献９, Hensel et al. 2008　非特許文献１０, Harwood et al. 2008　非特許文献１１）。未熟胚を置床する際の向きについて、Hensel et al. (2008　非特許文献１０) は、胚盤側を下向きに置床して共存培養を行った場合、２９％の形質転換効率であったのに対し、胚盤を上向きにした場合には、約７分の１に当たる４．１％の形質転換効率に止まったことを報告している。
　アグロバクテリウムとの共存培養を行う固体培地の植物成長調節物質には、２．５ｍｇ／ｌ（１１．３μＭ）ダイカンバが用いられている（Jacobsen et al. 2006　非特許文献８, Bartlett et al. 2008　非特許文献９, Harwood et al. 2008　非特許文献１１）。２．５ｍｇ／ｌ（１１．３μＭ）の濃度のダイカンバは、従来から、未熟胚の胚盤細胞を脱分化し、再分化能力を有するカルスを誘導することに用いられてきた（Wan and Lemaux 1994　非特許文献１４）。共存培養は、２－３日間実施される。
　　３）形質転換細胞の選抜および再分化
　共存培養後、未熟胚は、上述のカルス誘導培地にアグロバクテリウムを除菌するための抗生物質（例としては、１６０　ｍｇ／ｌ チメンチン）と５０　ｍｇ／ｌ ハイグロマイシンなどの選抜薬剤を添加した培地へ置床される。カルスを誘導するための植物成長調節物質には、2.5 mg/l （11.3μM）ダイカンバが共通して用いられている（Jacobsen et al. 2006　非特許文献８, Bartlett et al. 2008　非特許文献９, Hensel et al. 2008　非特許文献１０, Harwood et al. 2008　非特許文献１１）。選抜薬剤に対して明瞭な耐性を示すカルス（形質転換細胞塊）が得られるまで、同培地で２週間程度の間隔で継代される。およそ４－６週間後、選抜薬剤耐性カルスは、選抜薬剤を含む再分化前培養培地（transition medium, pre-regeneration medium）もしくは、選抜薬剤を含む再分化培地（シュート誘導培地）に移植される。再分化前培養培地で培養したカルスは、その後、選抜薬剤を含む再分化培地に移植される。さらに、再分化したシュートおよび幼植物体は、選抜薬剤を含み植物成長調節物質を含まない発根培地に移植され、オオムギ形質転換植物体が得られる。
　　４）未熟胚当たりの形質転換効率について
　これまでに報告されている１未熟胚当たりの形質転換効率は、以下の通りである。
品種Golden Promiseでは、 ７％ (Tingey et al. 1997　非特許文献５)、１２％（Matthews et al. 2001　非特許文献１５）、９．２％ (Murray et al. 2004　非特許文献１６)、３６％(Bartlett et al. 2008　非特許文献９)、８６．７％ (Hensel et al. 2008　非特許文献１０)。なお、非特許文献９や１０においては、場合によって高効率ではあるものの、このような高い効率が安定的に得られているものではない。品種Ｔａｆｅｎｏでは、２％(Hensel et al. 2008　非特許文献１０)、品種Heliumでは、２％（Hensel et al. 2008　非特許文献１０）である。
　２．アグロバクテリウムによるオオムギ未熟胚への遺伝子導入に関する従来技術
　Ke et al. 2002（非特許文献１７)は、アグロバクテリウムとの共存培養後におけるβ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ （ＧＵＳ）レポーター遺伝子の発現を解析することで、共存培養用の培地組成の違いによる未熟胚細胞へのＴ－ＤＮＡの転移効率を評価した。単離直後の未熟胚を用い、３０分間アグロバクテリウムを接種、ＭＳ培地の基本無機塩類濃度を等倍（ｘ１）または１／１０倍（ｘ ０．１）とした共存培地を用いて、３日間共存培養を実施した。オーキシン作用を有する植物成長調節物質である０．２５ｍｇ／ｌ（１．１μＭ）２，４－ジクロロフェノキシ酢酸(２，４－Ｄ) を添加または無添加の共存培地を用いた。０．２５ｍｇ／ｌ （１．１μＭ）２，４－Ｄは脱分化を促すには濃度が低く、胚盤からのカルス誘導には通常使用されていない（Serhantova et al. 2004　非特許文献１８）。共存培養後における５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－グルクロン酸（Ｘ－Ｇｌｕｃ)を用いたＧＵＳの組織化学的観察の結果、ＭＳ無機塩類を１／１０倍濃度とした培地試験区で、胚盤細胞への遺伝子導入効率が高く、ＭＳ無機塩類を１／１０倍濃度でかつ植物成長調節物質を無添加とした培地試験区でさらに効率が高まることを示した (Ke et al. 2002　非特許文献１７)。
　しかしながら、Ke et al. (2002　非特許文献１７)によるこれらの試験は、共存培養におけるさまざまな条件が、共存培養時の遺伝子導入効率にどのような影響を及ぼすかについて調査しているに過ぎず、未熟胚からのカルス形成、形質転換細胞の選抜および形質転換体の獲得に関する結果は一切示されていない。実際、非特許文献１７においては、「特定の要素が、未熟胚へのＴ－ＤＮＡ導入効率に及ぼすインパクトを調べるために、本実験では極端な条件が用いられた。・・・ＭＳ無機塩類が１／１０倍の濃度の条件で培養を継続することは、植物に有害な影響を与えるだろう。従って、安定的な形質転換のためには、十分な数のＴ－ＤＮＡ導入イベントが起こる条件と、レシピエントとなる植物細胞が再分化能を維持できる条件との微妙なバランスを見出すことが必要となるであろう。」と考察している。なお、非特許文献１７では、ＭＳ無機塩類が１／１０倍の濃度の培地を用いたすべての試験において、前培養の有無に関わらず、未熟胚を単離してから共存培養終了まで最短でも７２時間（３日間）の培養期間を適用している。
　３．アグロバクテリウムによるイネ・トウモロコシ未熟胚への遺伝子導入に関する従来技術
　Hiei et al. (2006　非特許文献１９)は、アグロバクテリウムを接種する前のイネおよびトウモロコシの未熟胚に対し、熱処理（特許文献１）や遠心処理（特許文献２）あるいは熱および遠心処理（特許文献３）を行うことにより、未熟胚胚盤への遺伝子導入効率が向上し、結果的に形質転換効率が向上することを報告した。これらの処理を用いることにより、これまで形質転換できなかった品種で形質転換体を得ることができたことも報告している。また、アグロバクテリウムを接種する前の未熟胚に加圧処理（特許文献４）をすることにより、遠心処理と同様に胚盤細胞への遺伝子導入効率が向上し、結果的に形質転換効率が向上することが報告されている。熱、遠心、熱および遠心、加圧処理は、何れも、未熟胚胚盤への遺伝子導入効率を上げるために用いられている。
ＷＯ１９９８／０５４９６１ ＷＯ２００２／０１２５２０ ＷＯ２００２／０１２５２１ ＷＯ２００５／０１７１６９ ＷＯ２００７／０６９６４３
Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，　Ｉ　（１９９０）　Ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｔｏ　ｃｅｒｅａｌｓ：　ａｎ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．　Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：５３５－５４２． Ｈｉｅｉ，　Ｙ．，　Ｏｈｔａ，　Ｓ．，　Ｋｏｍａｒｉ，　Ｔ．　ａｎｄ　Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ，　Ｔ．　（１９９４）　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｃｅ　（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔ－ＤＮＡ．　Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ　６：２７１－２８２． Ｉｓｈｉｄａ，　Ｙ．，　Ｓａｉｔｏ，　Ｈ．，　Ｏｈｔａ，　Ｓ．，　Ｈｉｅｉ，　Ｙ．，　Ｋｏｍａｒｉ，　Ｔ．　ａｎｄ　Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ，　Ｔ．　（１９９６）　Ｈｉｇｈ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｉｚｅ　（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　Ｌ．）　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１４：７４５－７５０． Ｃｈｅｎｇ，　Ｍ．，　Ｆｒｙ，　Ｊ．　Ｅ．，　Ｐａｎｇ，　Ｓ．，　Ｚｈｏｕ，　Ｈ．，　Ｈｉｒｏｎａｋａ，　Ｃ．　Ｍ．，　Ｄｕｎｃａｎ，　Ｄ．　Ｒ．，　Ｃｏｎｎｅｒ，　Ｔ．　Ｗ．，　　Ｗａｎ，　Ｙ．　（１９９７）　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１１５：　９７１－９８０． Ｔｉｎｇａｙ，　Ｓ．，　ＭｃＥｌｒｏｙ，　Ｄ．，　Ｋａｌｌａ，　Ｒ．，　Ｆｉｅｇ，　Ｓ．，　Ｗａｎｇ，　Ｍ．，　Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，　Ｓ．，　Ｂｒｅｔｔｅｌｌ，　Ｒ．　（１９９７）　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂａｒｌｅｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　Ｐｌａｎｔ　Ｊ．　１１：　１３６９－１３７６． Ｚｈａｏ，　Ｚ．－Ｙ．，　Ｃａｉ，　Ｔ．，　Ｔａｇｌｉａｎｉ，　Ｌ．，　Ｍｉｌｌｅｒ，　Ｍ．，　Ｗａｎｇ，　Ｎ．，　Ｐｅｎｇ，　Ｈ．，　Ｒｕｄｅｒｔ，　Ｍ．，　Ｓｃｈｏｅｄｅｒ，　Ｓ．，　Ｈｏｎｄｒｅｄ，　Ｄ．，　Ｓｅｌｔｚｅｒ，　Ｊ．，　Ｐｉｅｒｃｅ，　Ｄ．　（２０００）　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｓｏｒｇｈｕｍ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　４４：　７８９－７９８． Ｃｈｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　（２００４）　Ｉｎｖｉｔｅｄ　ｒｅｖｉｅｒ：　Ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ．　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ．　Ｄｅｖ．　Ｂｉｏｌ．　Ｐｌａｎｔ　４０：３１－４５． Ｊａｃｏｂｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．　（２００６）　Ｂａｒｌｅｙ　（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　Ｌ．）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　ｖｏｌ．３４３　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒoｔｏｃｏｌｓ，　ｖｏｌｕｍｅ　１，　Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｋａｎ　Ｗａｎｇ，　Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．，　Ｔｏｔｏｗａ，　ＮＪ，　１７１－１８３． Ｂａｒｔｌｅｔｔ，　Ｊ．　Ｇ．，　Ａｌｖｅｓ，　Ｓ．　Ｃ．， Ｓｍｅｄｌｅｙ，　Ｍ．，　Ｓｎａｐｅ，　Ｊ．　Ｗ．，　Ｈａｒｗｏｏｄ，　Ｗ．　Ａ．　（２００８） Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂａｒｌｅｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｐｌａｎｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　４：１－１２． Ｈｅｎｓｅｌ，　Ｇ．，　Ｖａｌｋｏｖ， Ｖ．，　Ｍｉｄｄｌｅｆｅｌｌ－Ｗｉｌｌｉａｍｓ，　Ｊ．， Ｊｏｃｈｅｎ　Ｋｕｍｌｅｈｎ，　Ｊ． ( Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｂａｒｌｅｙ： Ｔｈｅ　ｗａｙ　ｆｏｒｗａｒｄ ｔｏ　ｍｏｄｕｌａｔｅ　ｐｌａｎｔ－ｍｉｃｒｏｂｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １６５：７１－８２． Ｈａｒｗｏｏｄ，　Ｗ．　Ａ．，　Ｂａｒｔｌｅｔｔ， Ｊ．　Ｇ．，　Ａｌｖｅｓ， Ｓ．　Ｃ．，　Ｐｅｒｒｙ，　Ｍ．，　Ｓｍｅｄｌｅｙ，　Ｍ．　Ａ．， Ｌｅｙｌａｎｄ， Ｎ．，　Ｓｎａｐｅ，　Ｊ．　Ｗ．　（２００８） Ｂａｒｌｅｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｗｈｅａｔ，　Ｂａｒｌｅｙ　ａｎｄ　Ｏａｔｓ，　ｖｏｌ．　４７８， Ｊｏｎｅｓ，　Ｈ．　Ｄ．　ａｎｄ　Ｓｈｅｗｒｙ， Ｐ．　Ｒ．　（ｅｄｓ．），　Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ., Ｓｐｒｉｎｇ　Ｓｔｒｅｅｔ，　ＮＹ，　１３７－１４７． Ｔｒｉｆｏｎｏｖａ，　Ａ．，　， Ｍａｄｓｅｎ，　Ｓ．，　Ｏｌｅｓｅｎ，　Ａ. （２００１） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｇｅｎｅ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ａｎｄ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｉｎｔｏ ｂａｒｌｅｙ　ｕｎｄｅｒ　ａ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ iｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１６１：８７１－８８０． Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，　Ｔ．，　Ｓｋｏｏｇ，　Ｆ． （１９６２）　Ａ　ｒｅｖｉｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ　ｂｉｏ　ａｓｓａｙｓ ｗｉｔｈ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ　１５：４７３－４９７． Ｗａｎ，　Ｙ．，　Ｌｅｍａｕｘ，　Ｐ．　Ｇ．　（１９９４） Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌａｒｇｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｆｅｒｔｉｌｅ　ｂａｒｌｅｙ　ｐｌａｎｔｓ． Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　１０４：３７－４８． Ｍａｔｔｈｅｗｓ，　Ｐ．　Ｒ．，　Ｗａｎｇ，　Ｍ－Ｂ．，　Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，　Ｐ．　Ｍ．，　Ｔｈｏｒｎｔｏｎ， Ｓ．，　Ｆｉｅｇ，　Ｓ．　Ｊ．，　Ｇｕｂｌｅｒ，　Ｆ．，　Ｊａｃｏｂｓｅｎ，　Ｊ．　Ｖ．　（２００１） Ｍａｒｋｅｒ　ｇｅｎｅ　ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ tｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｂａｒｌｅｙ， ｕｓｉｎｇ　ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ　ａｄｊａｃｅｎｔ ‘ｔｗｉｎ　Ｔ－ＤＮＡｓ’ ｏｎ　ａ　ｓｔａｎｄａｒｄ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　７：１９５－２０２． Ｍｕｒｒａｙ，　Ｆ．，　Ｂｒｅｔｔｅｌｌ，　Ｒ．， Ｍａｔｔｈｅｗｓ，　Ｐ．，　Ｂｉｓｈｏｐ，　Ｄ．，　Ｊａｃｏｂｓｅｎ， J．　（２００４）　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｂａｒｌｅｙ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ＧＦＰ ａｎｄ　ＧＵＳ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅｓ． Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　２２：３９７－４０２． Ｋｅ　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒｙ　Ｔ-ＤＮＡ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｎｔｏ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｉｍｍａｔｕｒｅ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｏｆ　ｂａｒｌｅｙ　ａｎｄ　ｗｈｅａｔ．　Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ　１２６：３３３－３４３. Ｓｅｒｈａｎｔｏｖa，　Ｖ．，　Ｅｈｒｅｎｂｅｒｇｅｒｏｖa，　Ｊ．， Ｏｈｎｏｕｔｋｏｖa， Ｌ．　Ｃａｌｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ ｓｐｒｉｎｇ　ｂａｒｌｅｙ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ　ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｚｅｃｈ　Ｒｅｐｕｂｌｉｃ． （２００４）　Ｐｌａｎｔ，　Ｓｏｉｌ ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ５０：４５６－４６２ Ｈｉｅｉ，　Ｙ．，　Ｉｓｈｉｄａ，　Ｙ．，　Ｋａｓａｏｋａ，Ｋ．，　Ｋｏｍａｒｉ，　Ｔ．　（２００６）　Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｃｅ　ａｎｄ　ｍａｉｚｅ　ｂｙ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｉｍｍａｔｕｒｅ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ｗｉｔｈ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｈｅａｔ　ｐｒｉｏｒ　ｔｏ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　８７：２３３－２４３． Ｗａｔｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．　（１９７５）　Ｐｌａｓｍｉｄ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｏｆ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１２３：２５５－２６４． Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ，　Ｅ．，　Ｓｋｏｏｇ，　Ｆ．　（１９６５）　Ｏｒｇａｎｉｃ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｐｌａｎｔ．　１８：１００－１２７． Ｃｈｕ，　Ｃ．－Ｃ．　（１９７８）　Ｔｈｅ　Ｎ６　ｍｅｄｉｕｍ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｔｏ　ａｎｔｈｅｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｃｅｒｅａｌ　ｃｒｏｐｓ．　Ｉｎ：　Ｐｒｏｃ．　Ｓｙｍｐ．　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ．　Ｐｅｋｉｎｇ：　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｅｓｓ，　ｐｐ　４３－５０． Ｃｈｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　（２００４）　Ｉｎｖｉｔｅｄ　ｒｅｖｉｅｒ：　Ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ．　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ．　Ｄｅｖ．　Ｂｉｏｌ．　Ｐｌａｎｔ　４０：３１－４５． Ｎｅｇｒｏｔｔｏ，　Ｄ．，　Ｊｏｌｌｅｙ，　Ｍ．，　Ｂｅｅｒ，　Ｓ．，　Ｗｅｎｃｋ，　Ａ．　Ｒ．，　Ｈａｎｓｅｎ，　Ｇ．　（２０００）　Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅ　ａｓ　ａ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍａｒｋｅｒ　ｔｏ　ｒｅｃｏｖｅｒ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍａｉｚｅ　ｐｌａｎｔｓ　（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　Ｌ．）　ｖｉａ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１９：　７９８－８０３． Ｚｈａｏ，　Ｚ．－Ｙ．，　Ｇｕ，　Ｗ．，　Ｃａｉ，　Ｔ．，　Ｔａｇｌｉａｎｉ，　Ｌ．，　Ｈｏｎｄｒｅｄ，　Ｄ．，　Ｂｏｎｄ，　Ｄ．，　Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，　Ｓ．，　Ｒｕｄｅｒｔ，　Ｍ．，　Ｐｉｅｒｃｅ，　Ｄ．　（２００１）　Ｈｉｇｈ　ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ｉｎ　ｍａｉｚｅ．　Ｍｏｌ．　Ｂｒｅｅｄ．　８：　３２３－３３３． Ｉｓｈｉｄａ，　Ｙ．，　Ｓａｉｔｏ，　Ｈ．，　Ｈｉｅｉ，　Ｙ．，　Ｋｏｍａｒｉ，　Ｔ．　（２００３）　Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｉｚｅ　（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　Ｌ．）　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０：５７－６６． Ｆｒａｍｅ　ｅｔ　ａｌ．　（２００６）　Ｍａｉｚｅ　（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　Ｌ．）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　ｖｏｌ．３４３　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｐｔｏｃｏｌｓ，　ｖｏｌｕｍｅ　１，　Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｋａｎ　Ｗａｎｇ，　Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．，　Ｔｏｔｏｗａ，　ＮＪ，　１８５－１９９． Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ，　Ｄ．　Ｊ．，　Ｎｅｓｔｅｒ,　Ｅ．Ｗ．　（１９８０） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｍｕｔａｎｔｓ　ａｆｆｅｃｔｅｄ　ｉｎ ｃｒｏｗｎ　ｇａｌｌ　ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ　ｏｃｔｏｐｉｎｅ　ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ． １１４４：７３２－４３．
　本発明は、従来公知のアグロバクテリウム法と比較して高い効率で形質転換することを可能とする、オオムギ属（Hordeum）の植物へ遺伝子導入を行う方法、および、オオムギ属の形質転換植物の作成方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題の解決のために鋭意研究に努めた結果、ａ）アンチオーキシンを含む、ｂ）サイトカイニンを含む、ｃ）フェノキシ系オーキシンを２μＭ未満の濃度で含むおよび／またはベンゾイック系オーキシンを５μＭ未満の濃度で含むか、あるいは、フェノキシ系オーキシンおよび／またはベンゾイック系オーキシンを含まない；の１つまたは複数の条件を満たす共存培地の中で共存培養をすることにより、遺伝子導入効率が向上することを見出した。しかし、この共存培地を用いた場合には、共存培養後のカルス化が抑制され、実際に形質転換植物を得ることはできなかった。この問題に対処するために、本発明者らは前記要件に加えて、アグロバクテリウム菌を接種する前のオオムギ属植物の未熟胚組織を遠心処理および／または加圧処理をすること、および／または共存培地で培養する共存工程中に若しくは共存工程に次いで、遠心処理および／または加圧処理をすることの効果を検討したところ、このようなカルス形成抑制条件の下でも、オオムギ属植物の未熟胚組織からのカルス形成効率を向上させることができることを見出した。その結果本発明により、オオムギ属植物において効率よく形質転換を行うことが可能となった。なお、未熟胚組織への遠心処理および／または加圧処理は、アグロバクテリウム菌を接種する前または共存工程後のどちらかに実施することもできる。
　本発明は、好ましくは以下に記載するような態様により行われるが、これに限定されるものではない。
［態様１］
　オオムギ属（Hordeum）の植物の、未熟胚組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
　（ｉ）アグロバクテリウム菌を上記組織へ接種し、該アグロバクテリウム菌の存在下で、以下のａ）からｃ）の１つまたは複数の条件
ａ）アンチオーキシンを含む、
ｂ）サイトカイニンを含む、
ｃ）フェノキシ系オーキシンを２μＭ未満の濃度で含むおよび／またはベンゾイック系オーキシンを５μＭ未満の濃度で含むか、あるいは、フェノキシ系オーキシンおよび／またはベンゾイック系オーキシンを含まない；
を満たす共存培地の中で、上記組織を培養する共存工程を行う、
（ｉｉ）アグロバクテリウム菌の接種前、共存工程中および／または共存工程に次いで、上記組織を遠心処理および／または加圧処理する工程を行う、
　ことを含む、上記方法。
［態様２］
　オオムギ属（Hordeum）の植物の、形質転換植物の作成方法であって、
（ｉ）アグロバクテリウム菌をオオムギの未熟胚組織へ接種し、該アグロバクテリウム菌の存在下で、以下のａ）からｃ）の１つまたは複数の条件
ａ）アンチオーキシンを含む、
ｂ）サイトカイニンを含む、
ｃ）フェノキシ系オーキシンを２μＭ未満の濃度で含むおよび／またはベンゾイック系オーキシンを５μＭ未満の濃度で含む、あるいは、フェノキシ系オーキシンおよび／またはベンゾイック系オーキシンを含まない；
を満たす共存培地の中で、上記組織を培養する共存工程を行い、
（ｉｉ）アグロバクテリウム菌の接種前、共存工程中および／または共存工程に次いで、上記組織を遠心処理および／または加圧処理する工程を行い、
　（ｉｉｉ）上記組織をレスティング培地で培養するレスティング工程を行い、そして、
　（ｉｖ）上記組織を再分化培地で再分化させる工程を行う、
ことを含む、上記方法。
［態様３］
　前記共存工程開始後６時間ないし３６時間以内に、レスティング工程を開始する、態様１または態様２に記載の方法。
［態様４］
　前記共存工程開始後１２時間ないし２４時間以内に、レスティング工程を開始する、態様３に記載の方法。
［態様５］
　未熟胚を単離後６時間ないし３６時間以内に、共存工程を終えレスティング工程を開始する、態様１または態様２に記載の方法。
［態様６］
　未熟胚を単離後１２時間ないし２４時間以内に、共存工程を終えレスティング工程を開始する、態様５に記載の方法。
［態様７］
　上記未熟胚組織に対するアグロバクテリウム菌の接種前、共存工程中および／または共存工程に次いで、上記未熟胚組織において幼根、幼芽、および胚軸から選択される１またはそれ以上の部位を物理的／化学的に損傷する工程を行う態様１ないし態様６のいずれか１に記載の方法。
［態様８］
　前記共存培養において前記未熟胚組織を、胚盤側を上向きにし、かつ、胚軸側を前記共存培地に接するように置床して培養する、態様１ないし態様７のいずれか１に記載の方法。
［態様９］
　以下の形質転換効率向上処理のうち、少なくとも１つを行う、態様１ないし態様８のいずれか１に記載の方法。
　a）熱処理；
　b）硝酸銀の共存培地への添加；
　c）粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理；
［態様１０］
　上記（ｉｉｉ）レスティング工程と、（ｉｖ）再分化工程の間に薬剤選抜工程を含む、態様１ないし態様９のいずれか１に記載の方法。
［態様１１］
　（ｉｉｉ）レスティング培地、および／または、薬剤選抜工程の選抜培地が、植物成長調節物質を含む、態様１ないし態様１０いずれか１に記載の方法。
［態様１２］
　前記アグロバクテリウム菌が、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５、ＡＧＬ０、ＡＧＬ１、および５８Ｃ１からなる群から選択される菌である、態様１ないし態様１１のいずれか１に記載の方法。
［態様１３］
　オオムギ属の植物がオオムギ（H. vulgare）である、態様１ないし態様１２のいずれか１に記載の方法。
　本発明により、高い効率でオオムギ属の植物の形質転換を行うことが可能となった。これにより、形質転換した植物体を安定して再現性よく得ることが可能となり、当該植物体を得るためのコストを削減することも可能となる。
図１は、共存培地へのアンチオーキシン類およびダイカンバの添加が、オオムギ未熟胚への遺伝子導入効率へ及ぼす影響を示したグラフである。各区１５個の未熟胚を供試した。図１におけるカラムは左からそれぞれ、植物ホルモンを添加しない系、アンチオーキシンであるＴＩＢＡを５μＭ添加した系、ベンゾイック系オーキシンであるダイカンバを１．１３μＭ添加した系、およびダイカンバを１１．３μＭ添加した系の結果を示す。図１の縦軸はＧＵＳ発現インデックスを示す。ＧＵＳ遺伝子の胚盤領域における発現を個々の未熟胚について、８７．５（胚盤の７５％以上で発現）、６２．５（胚盤の５０％以上７５％未満で発現）、３７．５（胚盤の２５％以上５０％未満で発現）、１７．５（胚盤の１０％以上２5％未満で発現）、６．５（胚盤の１％以上１０％未満で発現）、０．５（胚盤の０％を超えて１％未満で発現）、０（発現なし）の７段階で評価し、平均値をＧＵＳ発現インデックスとした。 図２は、共存培地へのサイトカイニン類およびアンチオーキシン類の添加がオオムギ未熟胚への遺伝子導入効率へ及ぼす影響を示したグラフである。各区１５個の未熟胚を供試した。図２におけるカラムはそれぞれ、植物ホルモンを添加しない系、６ＢＡを５μＭ添加した系、４-ＰＵを５μＭ添加した系、ゼアチンを５μＭ添加した系、ＴＩＢＡを５μＭ添加した系、パクロブトラゾールを５μＭ添加した系を、それぞれ示す。なお、６ＢＡ、４-ＰＵおよびＺｅａｔｉｎはサイトカイニンであり、ＴＩＢＡとパクロブトラゾールはアンチオーキシンである。図２の縦軸はＧＵＳ発現インデックスを示す。図２のＧＵＳ発現インデックスは、図１において述べたのと同様にして求めた。 図３は、共存培地への２，４－Ｄの添加が、オオムギ未熟胚への遺伝子導入効率へ及ぼす影響を示したグラフである。各区１５個の未熟胚を供試した。図３におけるカラムは左からそれぞれ、植物ホルモンを添加しない系、フェノキシ系オーキシンである２，４－Ｄを１．１３μＭ添加した系、および２，４－Ｄを１１．３μＭ添加した系の結果を示す。図３の縦軸はＧＵＳ発現インデックスを示す。図３のＧＵＳ発現インデックスは、図１において述べたのと同様にして求めた。
発明の実施をするための形態
　以下に、本発明の構成を具体的に説明する。
　本発明は、オオムギ属（Hordeum）の植物の、未熟胚組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
　（ｉ）アグロバクテリウム菌を上記組織へ接種し、該アグロバクテリウム菌の存在下で、以下のａ）からｃ）の１つまたは複数の条件
ａ）アンチオーキシンを含む、
ｂ）サイトカイニンを含む、
ｃ）フェノキシ系オーキシンを２μＭ未満の濃度で含むおよび／またはベンゾイック系オーキシンを５μＭ未満の濃度で含むか、あるいは、フェノキシ系オーキシンおよび／またはベンゾイック系オーキシンを含まない；
を満たす共存培地の中で、上記組織を培養する共存工程を行う、
（ｉｉ）アグロバクテリウム菌の接種前、共存工程中および／または共存工程に次いで、上記組織を遠心処理および／または加圧処理する工程を行う、
　ことを含む、遺伝子導入方法を提供する。
　更に本発明は、オオムギ属（Hordeum）の植物の、形質転換植物の作成方法であって、
（ｉ）アグロバクテリウム菌をオオムギの未熟胚組織へ接種し、該アグロバクテリウム菌の存在下で、以下のａ）からｃ）の１つまたは複数の条件
ａ）アンチオーキシンを含む、
ｂ）サイトカイニンを含む、
ｃ）フェノキシ系オーキシン２μＭ未満の濃度で含むおよび／またはベンゾイック系オーキシンを５μＭ未満の濃度で含むか、あるいは、フェノキシ系オーキシンおよび／またはベンゾイック系オーキシンを含まない；
を満たす共存培地の中で、上記組織を培養する共存工程を行い、
（ｉｉ）アグロバクテリウム菌の接種前、共存工程中および／または共存工程に次いで、上記組織を遠心処理および／または加圧処理する工程を行い、
　（ｉｉｉ）上記組織をレスティング培地で培養するレスティング工程を行い、そして、
　（ｉｖ）上記組織を再分化培地で再分化させる工程を行う、
ことを含む、上記方法を提供する。
　本発明において使用可能な植物組織が由来する植物はオオムギ属の植物である。なお本明細書における「オオムギ属」の植物の例として、限定されるものではないが、H. arizonicum、H. bogdanii、H. brachyantherum （ホソムギクサ） 、H. brevisubulatum、H. bulbosum、H. capense、H. chilense、H. comosum、H. cordobense、H. depressum、H. erectifolium、H. euclaston、H. flexuosum、H. fuegianum、H. guatemalense、H. gussoneanum、H. intercedens、H. jubatum（ホソノゲムギ）、H. lechleri 、H. marinum（ハマムギクサ）、H. murinum（ムギクサ）、H. muticum、H. patagonicum、H. parodii、H. procerum、H. pubiflorum 、H. pusillum（ミナトムギクサ）、H. roshevitzii、H. secalinum、H. stenostachys 、H. tetraploidumおよびH. vulgare（オオムギ）を挙げることができる。本発明においてオオムギ（H. vulgare）は、とりわけ好適である。なお本明細書において「オオムギ（H. vulgare）」と記載した場合には、「オオムギ属」の中で「オオムギ」という特定の植物種を示すものとする。
　また、本発明において使用可能な植物組織は、未熟胚である。本明細書において「未熟胚」とは、受粉後の登熟過程にある未熟種子の胚をいう。本発明の方法に供される未熟胚のステージ（熟期）は特に限定されるものではなく、受粉後いかなる時期に採取されたものであってもよいが、受粉後７から２１日後のものが好ましい。未熟胚は取り出した当日使用することができるが、前培養した未熟胚であっても良い。また本明細書において「完熟種子」とは、受粉後の登熟過程が終了して種子として完熟しているものをいう。
　以下、上記の各工程について詳しく説明する。
　１．本発明の各工程について
　本発明の遺伝子導入方法及び形質転換植物の作成方法は、アグロバクテリウム細菌を利用する。特に明記する工程以外は、公知のアグロバクテリウム細菌を利用した遺伝子導入方法、形質転換方法の各工程に従って行うことが可能である。
　　（１）共存工程について
　本発明において、アグロバクテリウム菌を接種した、未熟胚組織を、該アグロバクテリウム菌の存在下で培養する、共存工程を行う。本工程は、アグロバクテリウム菌を接種した植物組織を、アグロバクテリウム菌の共存下にて培養することにより、アグロバクテリウム菌から植物細胞へのＤＮＡの導入を確実にする工程である。
　本発明の遺伝子導入方法と形質転換植物の作成方法では、好ましくは、使用可能な植物組織を、オオムギ属植物の植物体から単離・採取してから用いる。よって本発明においては、オオムギ属植物の植物体から組織（未熟胚）をまず単離・採取し、単離・採取されたその組織にアグロバクテリウム菌の接種を行う。また、単離・採取された組織を前培養し、培養したその組織にアグロバクテリウム菌の接種を行ってもよい。好ましくは、採取当日もしくは採取の翌日の組織にアグロバクテリウム菌の接種を行う。組織の前培養を行う場合、その期間については別途述べる。
　本発明において使用するオオムギ未熟胚は、その大きさは特に限定される訳ではないが、１．５－２．５ｍｍの大きさのものを、好ましく用いることができる。
　上記のような未熟胚は、形質転換効率を上昇させるための熱処理（特許文献１）がなされていてもよい。熱処理は、アグロバクテリウム菌の接種の前に施される。形質転換効率を上昇させるための熱処理については、後に詳細に述べる。
　本発明においては、オオムギ属植物の組織にアグロバクテリウム菌が接種される。
　本明細書で使用する「接種」とは、アグロバクテリウム菌を植物の組織（例えば胚盤）に接触させることをいい、当該技術分野においては種々のアグロバクテリウム菌接種方法が公知である。当該方法としては、例えば、アグロバクテリウム菌を液体培地に懸濁した懸濁液に植物組織を加える方法、共存培地上の植物組織にアグロバクテリウム菌の懸濁液を直接滴下する方法、植物組織中にアグロバクテリウム菌懸濁液を注入する方法、およびアグロバクテリウム菌懸濁液中に植物組織を浸漬し減圧する方法等があげられる。しかしながら、本発明におけるアグロバクテリウム菌の接種方法は、これらの方法に限定されない。
　当該アグロバクテリウム菌を接種するにあたり、アグロバクテリウム菌による形質転換効率を改善するために、例えば、アセトシリンゴン、界面活性剤、多孔性セラミックス等の種々の添加剤をアグロバクテリウム菌の懸濁液中に含ませることが可能である。
　本発明に使用可能なアグロバクテリウム菌は特に限定されず、アグロバクテリウムによる形質転換法に使用可能な、公知のいずれのアグロバクテリウム菌であってよい。本発明の好ましい態様において、アグロバクテリウム菌は、例えば、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５、ＡＧＬ０、ＡＧＬ１、またはＣ５８Ｃ１等が挙げられるが、これに限定されない。ベクターにスーパーバイナリーベクター（非特許文献２および３）を使用しない場合には、形質転換効率の観点から、アグロバクテリウムＡ２８１(非特許文献２０)が有するＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２の病原性領域を有する菌株を用いることが好ましい。
　アグロバクテリウム菌は、アグロバクテリウム菌内のプラスミドのＴ－ＤＮＡの中に挿入された遺伝子を植物のゲノム中に導入する性質を有することが公知である。そのため、本発明で使用可能なアグロバクテリウム菌は、植物内で発現させることを意図する遺伝子をＴ－ＤＮＡ中に挿入したプラスミドを有する。そして、当該プラスミドを有するアグロバクテリウム菌を植物組織に接種することにより植物を形質転換することが可能である。これにより、組織中の植物細胞に好ましい形質が付与される。本発明において使用可能なアグロバクテリウム菌用のプラスミドは、例えば、ｐＳＢ１３１、ｐＳＢ１３４、ｐＮＢ１３１およびｐＩＧ１２１Ｈｍ等があげられるが、これに限定される訳ではない。
　本工程で使用される培地は、本明細書中では「共存培地」という。共存培地は、植物細胞を培養するために通常使用されるものでよく、例えば、ＬＳ無機塩類（非特許文献２１）やＮ６無機塩類（非特許文献２２）を基本とする培地等があげられる。限定されるものではないが、本発明においては、無機塩類等の濃度を通常使用されるもの（例えば等倍濃度ＭＳ培地）よりも低下させた培地が好ましく、例えば、含まれるＭＳ無機塩類が１／２倍以下、より好ましくは１／５倍以下の培地であり、１／１０倍以下の培地、例えば１／１０濃度ＭＳ培地（非特許文献１７）を最も好適に使用することができる。
　本発明者らは鋭意研究を行い、下記の実施例１および２に示されるように、共存培地中にアンチオーキシン類および／またはサイトカイニン類を添加することで、あるいは共存培地中のフェノキシ系オーキシンおよび／またはベンゾイック系オーキシン濃度を低くするか共存培地にフェノキシ系オーキシンおよび／またはベンゾイック系オーキシンを添加しないことで、あるいはこれらの条件の組み合わせで、遺伝子導入効率が顕著に向上することを見出した。これは本発明における、最も顕著な特徴の一つである。
　アンチオーキシンは、オーキシン作用をもつ化合物の作用を拮抗的に阻害する作用を持つ物質である。本発明においては、アンチオーキシンとして、限定されるものではないが、２，３，５－トリヨードベンゾイックアシッド(ＴＩＢＡ)、パクロブトラゾール、２，４，６－トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，６－Ｔ）、ｐ－クロロフェノキシイソ酪酸（ＰＣＩＢ）、マレイン酸ヒドラジドおよびウニコナゾールＰなどを、共存培地中に好ましく添加することができる。
　また、本発明において、サイトカイニン類として、限定されるものではないが、６－ベンジルアミノプリン(６ＢＡ)、キネチン、Ｎ－フェニル－Ｎ‘－（４－ピリジルウレア）(４－ＰＵ)、ゼアチン、チジアズロンおよびγ-ジメチルアリルアミノプテリン(２－ｉｐ)などを、共存培地中に、好ましく添加することができる。なお共存培地に添加されるアンチオーキシンとサイトカイニンの濃度はそれぞれ、好ましくは０．１～２０μＭ、更に好ましくは０．５～１０μＭ、最も好ましくは２～７μＭである。
　通常、共存培地およびレスティング培地に、フェノキシ系オーキシンおよび／またはベンゾイック系オーキシンを添加することは、共存培養中に胚盤細胞の脱分化を促し、レスティング培地以降のカルス形成を容易にするために重要と考えられている。そのため、オオムギにおける再現性のある形質転換の成功例では（Tingay et al. 1997  非特許文献５、Jacobsen et al. 2006　非特許文献８, Bartlett et al. 2008　非特許文献９, Hensel et al. 2008　非特許文献１０, Harwood et al. 2008　非特許文献１１）、これらのオーキシンが１０μＭ以上の濃度で添加された等倍濃度のＭＳ培地が使用されてきた。しかし、Ke et al. 2002（非特許文献１７)は、オーキシンを添加しない１／１０濃度のＭＳ培地をオオムギの共存培地に使用した場合、高い遺伝子導入効率が得られることを示した。但し、非特許文献１７は、実際に形質転換植物が得られることを示したものではない。なお、非特許文献１７では、等倍濃度のＭＳ培地にオーキシンを添加しない場合は、低濃度の２，４－Ｄを添加した場合よりも、遺伝子導入効率が低下することも示されている。非特許文献１７におけるこのような開示は、オーキシンを全く添加しないことは遺伝子導入効率の点で不利であり、少量の２，４－Ｄは必要であると示唆するものである。
　本発明者らは、下記の実施例１に示されるように、共存培地中において、胚盤のカルス化を誘導する作用が強いフェノキシ系オーキシンおよび／またはベンゾイック系オーキシンの濃度が低い方が、遺伝子導入効率が向上することを見出した。限定されるものではないが、具体的には、共存培地におけるフェノキシ系オーキシンの濃度は、２μＭ以下、好ましくは１μＭ以下、さらに好ましくは０．５μＭ以下、さらに好ましくは０．３μＭ以下であり、最も好ましくは無添加である。また、ベンゾイック系オーキシンの濃度は、５μＭ以下、好ましくは４μＭ以下、さらに好ましくは３μＭ以下、さらに好ましくは２μＭ以下であり、最も好ましくは無添加である。さらには、これらの濃度のフェノキシ系オーキシン、ベンゾイック系オーキシンを両方含んでもよい。
　なお本発明においては、限定される訳ではないが、フェノキシ系オーキシンとして、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、２，４，５－トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５－Ｔ）などを、またベンゾイック系オーキシンとして、３，６－ジクロロ－２－メトキシベンゾイックアシッド（ダイカンバ）、４－アミノ－３，５，６－トリクロロ－２－ピリジンカルボン酸（ピクロラム）などを好適に利用することができる。さらに他のオーキシン類であるインドール－３－酢酸（ＩＡＡ）およびα－ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）などを共存培地に添加してもよい。
　ところで、共存培地のフェノキシ系オーキシンおよび／またはベンゾイック系オーキシンを無添加あるいは低濃度とし、サイトカイニン類および／またはアンチオーキシン類を添加することは、明らかに胚盤細胞の脱分化およびカルス形成を促進しない。それどころか抑制する条件に相当する。以上の知見から、本発明者らは、共存工程において脱分化およびカルス形成を抑制する条件が、オオムギ未熟胚の胚盤への遺伝子導入効率を向上させることを見出した。この点は、本発明における顕著な特徴の一つである。
　しかしながら、このように胚盤細胞の脱分化を抑制する条件を共存培地に与えた場合、共存培養後のレスティング工程または選抜工程において胚盤細胞のカルス化が抑制されてしまうことが想定される。実際に、オーキシンを添加しないあるいはごく低濃度のオーキシンを添加した条件で行われた非特許文献１７の試験では、未熟胚からのカルス形成、形質転換細胞の選抜および形質転換体の獲得に関する結果は一切示されていない。
　本発明者らは実際に、非特許文献１７に記載の植物成長調節物質を添加しないあるいはごく低濃度の０．２５ｍｇ／ｌ（１．１３μM)の２，４－Ｄを添加した１／１０濃度のＭＳ培地を、オオムギの共存培地に用いて形質転換の実験を行ったが、レスティング工程や選抜工程で十分量のオーキシンを添加しても、共存培養後の未熟胚からのカルス形成は極端に阻害され、ほとんどカルスを得ることができなかった。
　そもそも非特許文献１７は、共存培養におけるさまざまな条件が、共存培養時の遺伝子導入効率にどのような影響を及ぼすかについて調査したものであり、当該実験で使用した条件がそのまま形質転換にも適用できるとは想定されていない。実際に非特許文献１７においては、「特定の要素が、未熟胚へのＴ－ＤＮＡ導入効率に及ぼすインパクトを調べるために、本実験では極端な条件が用いられた。・・・・・・ＭＳ無機塩類が１／１０倍の濃度の条件で培養を継続することは、植物に有害な影響を与えるだろう。従って、安定的な形質転換のためには、十分な数のＴ－ＤＮＡ導入イベントが起こる条件と、レシピエントとなる植物細胞が再分化能を維持できる条件との微妙なバランスを見出すことが必要となるであろう。」と考察している。すなわち上記記載から判るように、Ke et al.はＭＳ無機塩類の濃度や２，４－Ｄが遺伝子導入効率に及ぼす効果を検討しているものの、実際に安定的な形質転換を行うためには、これらを、遺伝子導入効率を下げて再分化能を向上させるような量に調整する必要があるとの認識をしている。
　しかし本発明者らは、たとえ胚盤細胞の脱分化を抑制する条件を共存培地に与えても、高い遺伝子導入効率を維持したまま、カルス形成を行うことができるのではないかと考え、鋭意研究を重ねた。その結果、オーキシンを含まない、あるいは低濃度のオーキシンを含んだ共存培地で共存培養したオオムギ未熟胚の胚盤であっても、アグロバクテリウム接種前、共存工程中および／または共存工程に次いでの未熟胚への遠心処理、アグロバクテリウム接種前、共存工程中および／または共存工程に次いでの未熟胚への加圧処理、あるいはこれらの処理の併用により、カルス誘導率を向上させる顕著な効果があることを見出した。そして、このような処理を行うことにより初めて、上記のようなカルス形成を抑制する条件の共存培地を用いた場合でも、レスティング工程の胚盤からのカルス形成を問題なく生じさせることができることを見出した。なお、これらの処理は１／１０倍濃度のＭＳ培地でなされたものであったが、植物に有害な影響は見られなかった。以上の発見は本発明における、最も顕著な特徴である。遠心処理と加圧処理の条件や効果については、下記において詳細に述べる。
　なお、更に形質転換効率を上昇させるために、共存培地中に種々の添加剤を加えることも可能である。このような添加剤としては、例えば、硝酸銀（非特許文献２５および２６）、システイン（非特許文献２３）があげられる。
　本工程における「培養」とは、固化した共存培地の上または液体状の共存培地の中などに植物組織を置床し、適切な温度、明暗条件および期間で生育させることをいう。本発明において、培地の態様は、培地成分が植物組織に十分供給されるものであれば特に限定されない。共存培地の固化は、当該技術分野において公知の固化剤を添加することにより行うことができ、そのような固化剤としては、例えばアガロース等が知られている。本発明においては、このような固化した共存培地を好適に使用することができる。
　本工程における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは１８℃－３０℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、本工程の培養は好ましくは暗所で行われるが、これに限定されない。
　本工程の培養期間もまた適宜選択可能である。しかしながら、従来法では、共存工程を２ないし３日間とするのが一般的であるのに対し、本発明者らは、本発明の、脱分化およびカルス形成を抑制する条件で２ないし３日間共存培養を行うと、遠心処理や加圧処理などの処理を行っても、共存工程後における未熟胚からのカルス形成が阻害されてしまうという問題に直面した。そして鋭意検討の後、このようなカルス形成阻害が、共存培養期間を短縮することにより解決でき、かつ、共存培養期間を短縮しても遺伝子導入も十分なされることを見出した。このように、本発明の共存工程における培養期間は、好ましくは６時間ないし３６時間、より好ましくは１２時間ないし２４時間である。
　さらに、本発明者らは研究を進め、アグロバクテリウム接種前の前培養を行った場合、フェノキシ系オーキシンおよび／またはベンゾイック系オーキシンを低減または除去した条件で培養すると、上記共存工程の場合と同様に、共存工程後におけるオオムギ未熟胚からのカルス形成が阻害されることを見出した。従って、本発明において、前培養・共存培養の区別を問わず、未熟胚の単離から共存培養の終了までに、フェノキシ系オーキシンおよび／またはベンゾイック系オーキシンを低減または除去した条件で培養された期間が合計で、６時間ないし３６時間であることが好ましく、さらに好ましくは１２時間ないし２４時間である。
　本発明における共存培養方法は、未熟胚の胚盤側への遺伝子導入を促進する。その効果を生じせしめるには、未熟胚は胚盤側を上向きに、胚軸側を培地に接するように置床し培養する方法を好ましく用いることができる。従来法では、未熟胚は胚盤側を下向きに培地に接するよう置床されるのが一般的であり、本発明とは手法が大きく異なっている。（Jacobsen et al. 2006　非特許文献８, Bartlett et al. 2008　非特許文献９, Hensel et al. 2008　非特許文献１０, Harwood et al. 2008　非特許文献１１）。
　　（２）遠心処理および／または加圧処理について
　本発明において、アグロバクテリウム接種前、共存工程中および／または共存工程に次いでのオオムギ未熟胚の遠心処理を行うことにより、脱分化およびカルス形成を抑制する条件で共存培養したオオムギ未熟胚であっても、十分にカルスを誘導することのできるという顕著な効果があることを見出した。この場合の遠心処理の条件は、ＷＯ２００２／０１２５２０（特許文献２）に記載の条件と同様でよい。具体的には、通常１００Ｇ～２５万Ｇ、５００Ｇ～２０万Ｇ、好ましくは１０００Ｇ～１５万Ｇ、最も好ましくは１１００Ｇ～１１万Ｇ程度の遠心加速度範囲で行われる。また、遠心処理の時間は、遠心加速度に応じて適宜選択されるが、通常１秒間以上行うことが好ましい。遠心時間の上限は特にないが、通常、１０分間程度で目的を達成することができる。また、遠心処理時間は、遠心加速度が大きい場合にはごく短い時間、例えば１秒以下でも遺伝子導入効率を有意に向上させることができる。一方、遠心加速度が小さい場合には、遠心処理を長く行うことが好ましい。なお、適切な遠心処理条件は、ルーチンな実験により容易に設定することができる。このような遠心処理は、後に述べる胚軸の切除の前後のいずれで行ってもよい。
　本発明において、遠心処理は、共存培養の前でも後でもよく、また、共存培養中に取り出して遠心処理を行ってもよいが、共存培養前および／または共存培養後に行うことが好ましい。このように植物材料の遠心処理を行う点が、本発明における、最も顕著な特徴である。なお下記の実施例３において、植物成長調節物質を添加しない共存培地で培養した系での、アグロバクテリウムを接種する前のオオムギ未熟胚への遠心処理および／または共存工程後の未熟胚への遠心処理も、オオムギ未熟胚からのカルス誘導率を向上させる顕著な効果があることを見出した。更に下記の実施例４において、アンチオーキシンを添加した共存培地で培養した系においても、遠心処理を行うことにより、良好なカルス形成が認められることを見出した。
　また、アグロバクテリウムを接種する前の未熟胚への加圧処理および／または共存工程後の未熟胚への加圧処理も、上記の遠心処理と同様に、オオムギ未熟胚からのカルス誘導率を向上させる顕著な効果がある。加圧処理は、例えばＷＯ２００５／０１７１６９（特許文献４）に記載の方法を用いて行うことができる。加圧処理は、限定されるわけではないが、好ましくは１．７気圧ないし１０気圧の範囲、より好ましくは２．４気圧ないし８気圧の範囲で行われる。また、加圧処理時間は、圧力の大きさに応じて適宜選択することができるが、好ましくは０．１秒間以上４時間であり、さらに好ましくは１秒間ないし３０分間である。また、加圧処理は、胚軸の切除の前後のいずれで行ってもよい。
　本発明において、加圧処理は、共存培養の前でも後でもよく、また、共存培養中に加圧処理を行ってもよいが、共存培養前および／または共存培養後に行うことが好ましい。このように植物材料の加圧処理を行う点も、本発明における、最も顕著な特徴である。
　さらに、本発明においては、上記のような遠心処理と加圧処理の併用も好適に行うことができる。
　本明細書において「アグロバクテリウムの接種前」とは、共存培養前の、アグロバクテリウムを接種する工程の前において、処理を行うことを意味する。
　また本明細書において「共存工程中」とは、共存培養の途中において処理を行うことを意味する。
　また本明細書において「共存工程に次いで」とは、共存培養の後に行うレスティング工程において処理を行うことを意味する。
　よって本明細書において、「アグロバクテリウム菌の接種前、共存工程中および／または共存工程に次いで、上記組織の遠心処理および／または加圧処理する工程を行う」とは、
　１）アグロバクテリウムの接種前において遠心処理および／または加圧処理をする態様；
　２）アグロバクテリウムの接種後、共存培養中に遠心処理および／または加圧処理をする態様；
　３）共存工程後、レスティング工程の前に遠心処理および／または加圧処理をする態様；
　４）レスティング工程において遠心処理および／または加圧処理をする態様；および
　５）上記１）ないし４）のいずれかの複数の段階において遠心処理および／または加圧処理をする態様、を意味する。それらの態様は全て本発明に包含される。
　　（３）レスティング工程について
　本発明の形質転換植物の作成方法においては、上記共存工程の後にさらにレスティング工程、再分化工程を経て、形質転換植物を作成する。
　レスティング工程においては、共存工程後に植物組織をレスティング培地で培養する。本工程は、共存工程の後に植物細胞からアグロバクテリウム菌を除くとともに植物細胞の増殖を行う工程である。
　本工程で使用される培地は、本明細書中では「レスティング培地」という。レスティング培地は、植物細胞を培養するために通常使用されるものでよく、例えば、ＬＳ無機塩類（非特許文献２１）やＮ６無機塩類（非特許文献２２）を基本とする培地等があげられる。なお本工程におけるレスティング培地は、好ましくは抗生物質を含む。レスティング培地中に含まれる抗生物質は、下記の選抜工程で用いる選抜用の抗生物質とは異なり、アグロバクテリウムの除菌を目的とする。限定される訳ではないが、抗生物質として、セフォタキシムおよび／またはカルベニシリンを好ましく使用することができる。
　本工程におけるレスティング培地中には、好ましくは、植物成長調節物質を含む。植物成長調節物質として、ベンゾイック系オーキシン類および／またはフェノキシ系オーキシン類を、好ましく利用できる。オーキシン類は一般に植物組織を脱分化させる作用を有するために、本工程および続く選抜工程において、ほとんどの植物組織は一部または全部が脱分化組織（カルス）となる。本明細書で使用する、「脱分化組織」または「カルス」の用語は、分化した植物組織の一部（外植片）をオーキシンやサイトカイニン等の植物成長調節物質を含む培地で培養することにより得られる組織で、元来の植物組織としての形態を有さない無定形で未分化状態の細胞塊をいう。したがって、脱分化組織の状態でレスティング工程を開始する場合、および分化している植物組織がレスティング工程中または続く選抜工程中にすべてが脱分化および一部が脱分化する場合等の、脱分化組織が関係するいかなる態様も本発明の範囲内である。
　本工程における「培養」とは、固化したレスティング培地の上または液体状のレスティング培地の中などに植物組織を置床し、適切な温度、明暗条件および期間で生育させることをいう。本発明において、培地の態様は、培地成分が植物組織に十分供給されるものであれば特に限定されない。レスティング培地の固化は、当該技術分野において公知の固化剤を添加することにより行うことができ、そのような固化剤としては、例えばアガロース等が知られている。本工程における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは２０℃－３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、本工程の培養は好ましくは暗所で行われるが、これに限定されない。本工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、好ましくは１日－２０日、より好ましくは１０日である。
　なお、本明細書におけるレスティング工程において、形質転換体の選抜を行ってもよい。すなわち、次に記載する選抜工程と本レスティング工程を同時に行ってもよい。この場合、下記に記載の選抜培地を使用することもできる。以上のようにレスティング培地に選抜薬剤を添加して形質転換植物を選抜する場合も、本明細書におけるレスティング工程に含まれる。
　　（４）選抜工程について
　以下に記載する選抜工程および再分化工程は、アグロバクテリウム菌による植物の形質転換方法において一般に行われている方法である。なお本発明の形質転換植物の作成方法において、この選抜工程は必須のものではない。例えば、後に述べる形質転換向上処理をした場合には、選抜工程を経なくても目的とする形質転換体を得ることができるからである。なお選抜工程を行う場合、以下の記載は例示のためのものであり、本発明は以下の記載により限定されるものではない。
　本工程は、上記工程により得られた組織から、形質転換体を遺伝子導入の有無により選抜する工程である。本工程で使用される培地は、本明細書中では「選抜培地」という。選抜培地として使用可能な培地には、例えば、ＬＳ無機塩類（非特許文献２１）やＮ６無機塩類（非特許文献２２）を基本とする培地があげられる。
　一般的なアグロバクテリウム菌を用いた形質転換法によれば、選抜培地中には、オーキシン類が添加される。本発明においても、選抜培地が植物成長調節物質を含むのは、好ましい態様である。本選抜工程で使用されるオーキシン類は特に限定されないが、好ましくはダイカンバおよび／または２，４－Ｄである。さらに、必要に応じて、種々の添加物を加えることが可能である。
　形質転換植物の選抜は、例えば、適当な選抜薬剤を含む選抜培地で、上記共存工程および／またはレスティング工程を経た植物を培養し、選抜薬剤に対する耐性の有無により行うことができる。本工程に使用可能な選抜薬剤は、当該技術分野で通常使用されるものを用いることが可能である。例えば、選抜薬剤としては、抗生物質または除草剤を使用可能である。抗生物質としては、例えば、ハイグロマイシン、クロラムフェニコール、Ｇ４１８、カナマイシン、またはブラストサイジンＳ等が使用可能である。さらに、除草剤としては、例えば、フォスフィノスライシン、ビアラフォスまたはグリホセート等が使用可能である。
　本選抜工程を行うためには、アグロバクテリウム菌中のＴ－ＤＮＡ中に挿入したＤＮＡは、植物に発現させることを意図する遺伝子のみならず、例えば、選抜薬剤に対する耐性遺伝子等を含むことが必要である。このような選抜薬剤に対する耐性遺伝子は当該技術分野においては公知である。本工程において、例えばハイグロマイシンを含む選抜培地において選抜を行う場合、植物には、植物内で発現させることを意図する遺伝子に加え、ハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されていることが必要である。
　あるいは、形質転換植物の選抜は、植物細胞の糖要求性に基づいて行うことが可能である。植物細胞が利用できる糖にはシュークロース、グルコースなどがあるが、マンノースは利用できないことが知られている。したがって、マンノースを主たる炭素源とする培地で植物組織を培養すると、利用できる糖がない、または少ないために植物組織は枯死または成長を休止する。糖要求性に基づく選抜はこの原理を利用するものである。即ち、この選抜方法を利用するためには、アグロバクテリウム菌中のＴ－ＤＮＡ中に挿入したＤＮＡは、植物に発現させることを意図する遺伝子のみならず、リン酸化マンノースイソメラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ：ＰＭＩ）遺伝子を含むことが必要となる。ここで、ＰＭＩ遺伝子を導入された植物細胞は、マンノースを炭素源として利用できるようになる。したがって、上記のようなアグロバクテリウム菌により形質転換された植物組織のみが、マンノースを主たる炭素源とする培地で生育することが可能となり、これにより形質転換植物組織のみを選抜することが可能となる（非特許文献２４）。このような方法は、他の糖についても行うことができる。例えば、キシロースイソメラーゼ遺伝子を導入された植物細胞は炭素源としてキシロースを利用することが可能となるため、このような方法に適用可能である。
　また、容易に検出可能な遺伝子をスクリーニングの指標として導入し、当該遺伝子の発現の有無により選抜することも可能である。このようなスクリーニングの指標となる遺伝子としては、ＧＦＰ遺伝子等があげられる。これらの遺伝子を発現する細胞・組織を検出する方法は当該技術分野において公知である。
　本工程は、培地の成分組成を変更して、複数回繰り返して行うことも可能である。例えば、複数回の選抜工程では、選抜薬剤の濃度を各選抜工程で上昇させることにより、薬剤選抜の確実性が増し、形質転換植物体を得られる可能性を上昇させることが可能となる。本選抜工程は、好ましくは少なくとも１回、より好ましくは２回行われる。また、複数回選抜工程を行う場合には、選抜薬剤を含む培地で培養した組織のうち増殖した部分を切り取り、当該増殖部分のみを次の選抜工程に供することにより、効率よく形質転換組織を獲得することも可能である。
　本工程における「培養」とは、固化した選抜培地の上または液体状の選抜培地の中などに植物組織を置床し、適切な温度、明暗条件および期間にて生育させることをいう。本発明において、培地の態様は、培地成分が植物組織に十分供給されるものであれば特に限定されない。選抜培地の固化は、上記のように例えばアガロース等により行うことが可能である。本工程における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは２０℃－３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、本工程の培養は好ましくは暗所で行われるが、これに限定されない。本工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、例えば、２回選抜工程が行われる場合には、１次選抜は２週間、そして２次選抜は２週間の計４週間行われる。また、複数回の選抜工程全体では好ましくは３－８週間、より好ましくは４－６週間行われる。また、複数回の選抜を行う場合には、各回毎に培養期間、温度および明暗条件を変更することも可能である。
　　（５）再分化工程
　レスティング培地で培養した組織を、必要ならば選抜した後に、再分化培地で再分化させる工程を行う。本工程で使用される培地は、本明細書中では「再分化培地」という。再分化培地は、オーキシン類は含まない。
　オオムギの形質転換には、再分化前培養培地（transition medium, pre-regeneration　medium）が用いられる場合がある。この培地は、通常オーキシン類を含む（Jacobsen et al. 2006　非特許文献８, Bartlett et al. 2008　非特許文献９, Harwood et al. 2008　非特許文献１１）。再分化前培養培地には、選抜薬剤を含んでもよい。再分化前培養培地で培養した組織は再分化培地に移され培養される。
　再分化培地は選抜薬剤を含んでもよい。本工程において使用可能な選抜薬剤は、選抜工程において定義したものと同様である。しかしながら、本工程において必ずしも選抜工程で用いた選抜薬剤と同じ選抜薬剤を用いなくとも良い。その場合には、植物にはアグロバクテリウム菌から、２種類以上の選抜薬剤に対する耐性遺伝子が導入されている必要がある。
　本発明における「再分化」とは、全部または一部が脱分化していた植物組織が、再び元の植物組織または植物体の性質を獲得することをいう。共存工程および／またはレスティング工程および／または選抜工程中にオーキシン類を使用すると、植物組織の全部または一部が脱分化する。したがって、本工程に供することにより、脱分化組織が再分化し、完全な形質転換植物体を得ることが可能となる。
　本工程における「培養」とは、固化した再分化培地の上または液体状の再分化培地の中などに植物組織を置床し、適切な温度、明暗条件および期間にて生育させることをいう。本発明において、培地の態様は、培地成分が植物組織に十分供給されるものであれば特に限定されない。再分化培地の固化は、上記のように例えばアガロース等により行うことが可能である。本工程における培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは２０℃－３５℃、さらに好ましくは２５℃で行われる。また、本工程の培養は好ましくは１６－２４時間／日の照明下で行われるが、これに限定されない。本工程の培養期間もまた適宜選択可能であり、好ましくは７日－２１日、より好ましくは１４日である。
　２．本発明で用いられる形質転換向上処理について
　また本発明の遺伝子導入方法と形質転換植物の作成方法において、上記で述べた遠心処理と加圧処理に加えて、以下に述べる形質転換向上処理を行ってもよい。本明細書において「形質転換向上処理」とは、形質転換効率の向上を達成するための処理をいう。このような形質転換向上処理としては、限定されるものではないが、例えば以下のようなものあるいはこれらの組み合わせが含まれる。
　a）硝酸銀の共存培地への添加（参照：ＡｇＮＯ３（Ｚｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．　２００１：非特許文献２５、Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．　２００３：非特許文献２６）、
　b）熱処理（参照：ＷＯ１９９８／０５４９６１：特許文献１）、
　c）粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理（参照：ＷＯ２００７／０６９６４３：特許文献５）、ならびに、
　ｇ）共存培地にシステインを添加する処理（Ｆｒａｍｅ　ｅｔ　ａｌ．　２００６：非特許文献２７）。
　このうち、熱処理、粉体の添加はいずれも遺伝子導入効率を向上させる処理であり、硝酸銀の添加はカルス誘導率を向上させる効果がある。
　硝酸銀の共存培地への添加は、例えば、Ｚｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．　２００１（非特許文献２５）、Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．　２００３（非特許文献２６）。硝酸銀は、例えば、１μＭないし５０μＭ、好ましくは１μＭないし１０μＭの濃度で、共存培地に添加しうる。
　熱処理は、例えばＷＯ１９９８／０５４９６１（特許文献１）に記載の方法を用いて行うことができる。例えば、植物材料をアグロバクテリウム菌と接触させる前に、３３℃ないし６０℃、好ましくは３７℃ないし５２℃で、５秒間ないし２４時間、好ましくは１分間ないし２４時間、処理する。　
　粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理は、例えばＷＯ２００７／０６９６４３（特許文献５）に記載の方法を用いて行うことができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウム懸濁液と粉体を混合して植物材料に接種する、あるいは、植物と粉体を混合してこれにアグロバクテリウムを接種する、といった方法で行う。粉体は、限定されるものではないが、多孔質の粉体、グラスウール、または活性炭であり、好ましくは多孔性セラミックス、グラスウールまたは活性炭、さらに好ましくはハイドロキシアパタイト、シリカゲル、グラスウールである。
　共存培地にシステインを添加する処理では、システインを１０ｍｇ／ｌないし１ｇ／ｌ、好ましくは５０ｍｇ／ｌないし７５０ｍｇ／ｌ、より好ましくは１００ｍｇ／ｌないし５００ｍｇ／ｌで、共存培地に添加しうる。
　当業者は、これらの処理を適切なタイミング・条件で行うことができる。また、これらを適宜組み合わせることは、形質転換効率向上のために一層好ましい。従って、好ましい形質転換向上処理は、共存培地にＡｇＮＯ３を添加する処理、熱処理、粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理、あるいは共存培地にシステインを添加する処理、またはこれらの組み合わせである。なお下記の実施例に示したように、熱処理と共存培地にＡｇＮＯ３を添加する処理を組み合わせることは、本発明の好ましい態様である。
　３．幼根、幼芽、および胚軸から選択される１またはそれ以上の部位の物理的／化学的な損傷を行う処理について
　本発明においては、アグロバクテリウムの接種前、共存工程中および／または共存工程に次いで、未熟胚組織において幼根、幼芽、および胚軸から選択される１またはそれ以上の部位を物理的／化学的に損傷する処理を行うことができる。
　本発明において、「幼根、幼芽、および胚軸から選択される１またはそれ以上の部位を物理的／化学的に損傷する」ための手段は特に限定されるものではなく、様々な物理的処理、および化学的処理が含まれる。限定される訳ではないが、物理的処理には、例えば、鋭利な刃物（例えばメス）による切除あるいは付傷、鋭利な先端をもつ器具（例えばピンセット）による除去あるいは付傷等が含まれる。化学的処理には、例えば、植物細胞の機能を消失あるいは低減させる酸性、アルカリ性の物質、細胞に毒性を有する除草剤成分等の薬剤による処理、などが含まれる。本発明において、幼根、幼芽、および胚軸から選択される１またはそれ以上の部位を物理的に「取り除く」ことは好ましい態様である。
　なお胚は将来植物体になる部分であり、幼根、幼芽、胚軸を含む。胚軸とは、胚の軸となる円柱形の部分であり、その上端から幼芽が、その下端から幼根が発生する。本明細書において幼根、幼芽、胚軸とは、本技術分野で通常に用いられている意味に解されるものである。
　また本明細書において、「幼根、幼芽、および胚軸から選択される１またはそれ以上の部位」（以下、「上記部位」という）とは、幼根、幼芽、胚軸の中の１つ、２つ、または３つの部位から選択された全ての組み合わせを意味する。具体的にはその組み合わせは以下の通りである；１）幼根、２）幼芽、３）胚軸、４）幼根および幼芽、５）幼根および胚軸、６）幼芽および胚軸、７）幼根および幼芽および胚軸。
　アグロバクテリウム菌を介した遺伝子導入を行うために、植物組織を脱分化させてカルス化する必要があるので、このように幼根、幼芽、胚軸の存在は胚盤細胞の良好なカルス形成を阻害する。よって胚軸と共に幼根、幼芽も削除することは、本発明において好適な態様である。しかし幼根、幼芽が未だ出てきていない状態の胚軸においては、胚軸のみを取り除くことによっても本発明の目的を達成することができる。
　本明細書において「アグロバクテリウムの接種前」とは、共存培養前の、アグロバクテリウムを接種する工程の前において、処理を行うことを意味する。
　また本明細書において「共存工程中」とは、共存培養の途中において処理を行うことを意味する。
　また本明細書において「共存工程に次いで」とは、共存工培養の後に行うレスティング工程において処理を行うことを意味する。
　よって本明細書において、「上記未熟胚組織に対するアグロバクテリウム菌の接種前、共存工程中および／または共存工程に次いで、上記未熟胚組織において幼根、幼芽、および胚軸から選択される１またはそれ以上の部位を物理的／化学的に損傷する工程を行う」とは、
　１）アグロバクテリウムの接種前において上記部位を損傷する態様；
　２）アグロバクテリウムの接種後、上記部位を損傷する態様；
　３）共存工程後、レスティング工程の前に上記部位を損傷する態様；
　４）レスティング工程において上記部位を損傷する態様；および
　５）上記１）ないし４）のいずれかの複数の段階において上記部位を損傷する態様、を意味する。それらの態様は全て本発明に包含される。
　４．本発明の方法による効果
　本発明の遺伝子導入方法と本発明の形質転換植物の作成方法により、安定的に高い効率でオオムギ属植物の形質転換を行うことができる。よって植物の形質転換効率の向上が達成される。
　本明細書において「形質転換効率が高い」とは、高い効率で目的遺伝子が植物細胞へ導入されること、未熟胚等から高い効率で形質転換カルスが誘導されること、形質転換カルスから高い効率で再分化が起こること、を包含する概念である。また本明細書において「形質転換効率が向上する」とは、目的遺伝子の植物細胞への導入効率が向上すること、未熟胚等からの形質転換カルス誘導率が向上すること、形質転換カルスからの再分化効率が向上すること、を包含する概念である。
　植物組織に遺伝子導入がされたか否かは、公知の種々の方法により決定可能である。例えば、形質転換する遺伝子をＧＵＳ（β－グルクロニダーゼ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子あるいはＧＦＰ遺伝子などのレポーター遺伝子として利用し、簡便な公知の方法でこれらのレポーター遺伝子の発現部位を目視することにより形質転換の有無について確認することが可能である。また、抗生物質抵抗性遺伝子や除草剤抵抗性遺伝子などの選抜マーカー遺伝子を利用して、抗生物質あるいは除草剤を含む培地で植物細胞を培養することにより、あるいは抗生物質溶液や除草剤溶液を植物に処理することにより、その抵抗性の発現を指標に形質転換の有無を確認することも可能である。
　以下、実施例によって本発明を説明するが、実施例は例証のためのものであり、本発明を制限するものではない。本発明の範囲は、請求の範囲の記載に基づいて判断される。さらに、当業者は本明細書の記載に基づいて、容易に修正、変更を加えることが可能である。
実施例１
　　共存培地組成が遺伝子導入効率に及ぼす効果（アンチオーキシン、オーキシン）
　　材料および方法
　オオムギ（品種：Ｇｏｌｄｅｎ　Ｐｒｏｍｉｓｅ）の胚軸を除去した未熟胚（大きさ１．５－２．０ｍｍ）を無菌的に採取し、１ｍｌ滅菌水を入れた２ｍｌマイクロチューブに沈めた。遺伝子導入効率を高めるため、未熟胚の入ったチューブを４３℃で５分間ウォーターバスにて加熱処理を行った。１００μＭアセトシリンゴンを含むＭＧ／Ｌ液体培地(非特許文献２８)にハイグロマイシン耐性遺伝子を有するアグロバクテリウム菌株　ＥＨＡ１０１（ｐＩＧ１２１Ｈｍ）（非特許文献２）を懸濁し、一晩（約２０時間）２８℃で振盪培養（１８０ｒｐｍ）を行い接種源とした。菌濃度は、O.D.値 ＝ 1.0（６６０ｎｍ）に調整した。熱処理した未熟胚に接種源を加え、真空ポンプを用いて５００ｍｂａｒで１０分間の減圧処理を行った。植物成長調節物質（以下、アンチオーキシン、サイトカイニン、およびオーキシンを総称して植物成長調節物質という）を除いた液体カルス誘導培地ＣＩＭＴ（Tingay et al. 1997　非特許文献５）で一度未熟胚を洗浄した。アグロバクテリウムを接種した未熟胚を１００μＭアセトシリンゴン含有のオオムギ共存培地（１／１０濃度のＭＳ無機塩およびＭＳビタミン、１０ｇ／ｌグルコース、０．５ｇ／ｌ　ＭＥＳ、５μＭ　ＡｇＮＯ３および５μＭ　ＣｕＳＯ４、ｐＨ５．８、８ｇ／ｌアガロース）上へ移植し、胚盤側が上向きになるように置床した。なお、共存培地には植物成長調節物質を２種類添加した４試験区で試験を実施した。すなわち、植物成長調節物質無添加のホルモンフリー、５μＭ　ＴＩＢＡ（アンチオーキシン）、１．１３μＭ　ダイカンバ（Ｄｉｃａｍｂａ）（オーキシン）、 １１．３μＭ　ダイカンバ（Ｄｉｃａｍｂａ）（オーキシン）の４試験区とした。
　２５℃、暗黒下で２４時間培養した未熟胚を、０．５ｍｇ／ｌ　２，４－Ｄおよび１．２５ｍｇ／ｌ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを添加したＣＩＭＴレスティング培地（Tingay et al. 1997　非特許文献５）に移植した。なお、本レスティング培地にはアグロバクテリウム除菌用に２５０ｍｇ／ｌ カルベニシリン　１００ｍｇ／ｌ セフォタキシムを添加した。２５℃暗黒下で２日間培養した後、２５℃暗黒下で２日間培養した後、未熟胚を０．１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸漬し、３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液を除いた後、１．０ｍＭ　５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－グルクロン酸（Ｘ－ｇｌｕｃ）および２０％メタノール含むリン酸緩衝液を添加した。３７℃で一晩処理した後、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。ＧＵＳ遺伝子の胚盤領域における発現を個々の未熟胚について、８７．５（胚盤の７５％以上で発現）、６２．５（胚盤の５０％以上７５％未満で発現）、３７．５（胚盤の２５％以上５０％未満で発現）、１７．５（胚盤の１０％以上２５％未満で発現）、６．５（胚盤の１％以上１０％未満で発現）、０．５（胚盤の０％を超えて１％未満で発現）、０（発現なし）の７段階で評価し、平均値をＧＵＳ発現インデックスとし数値化した。供試した未熟胚数は各区１５個とした。供試した未熟胚数は各区１５個とした。
　　結果および考察
　未熟胚を用いたアグロバクテリウムによるオオムギの形質転換方法で最も用いられている１１．３μＭ ダイカンバ（Tingay et al. 1997　非特許文献５、Jacobsen et al. 2006　非特許文献８、 Bartlett et al. 2008　非特許文献９、 Hensel et al. 2008　非特許文献１０、 Harwood et al. 2008　非特許文献１１）では、最も遺伝子導入効率が低かった（図１、第４カラム）。１．１３μＭ ダイカンバの添加（図１、第３カラム）では、植物成長調節物質を添加しなかった区（図１、第１カラム）と同程度の遺伝子導入効率が観察された。このことは、Ke et al. (2002　非特許文献１７)が１／１０濃度のＭＳ培地共存培地に用い、２，４－Ｄを添加して得られた結果と類似している。なお、アンチオーキシン（５μＭ　ＴＩＢＡ）の添加は、オオムギ未熟胚胚盤への遺伝子導入効率を顕著に高めた（図１、第２カラム）。
　実施例２
　　共存培地組成が遺伝子導入効率に及ぼす効果（サイトカイニン、アンチオーキシン）
　　材料および方法
　材料およびアグロバクテリウムの接種方法は、実施例１と同一である。なお、共存培地には植物成長調節物質を５種類添加した６試験区を供試した。すなわち、植物成長調節物質無添加のホルモンフリー、５μＭ ６ＢＡ、５μＭ ４－ＰＵ、５μＭ ゼアチン（Ｚｅａｔｉｎ）（以上、サイトカイニン）、５μＭ ＴＩＢＡ、５μＭ パクロブトラゾール（Ｐａｃｌｏｂｕｔｒａｚｏｌ）（以上、アンチオーキシン）の６試験区とした。２５℃、暗黒下で２４時間培養した未熟胚を、実施例１と同じ、０．５ ｍｇ／ｌ ２，４－Ｄおよび１．２５　ｍｇ／ｌ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを添加したＣＩＭＴレスティング培地（Tingay et al. 1997　非特許文献５）に移植した。 なお、本レスティング培地にはアグロバクテリウム除菌用に２５０ｍｇ／ｌ　カルベニシリン　１００ｍｇ／ｌ　セフォタキシムを添加した。２５℃暗黒下で２日間培養した後、実施例１と同様にＧＵＳ遺伝子の発現を調査し、ＧＵＳ発現インデックスとし数値化した。供試した未熟胚数は各区１５個とした。
　　結果および考察
　植物成長調節物質を添加しなかった区で最も遺伝子導入効率が低く、インデックスは１５前後を示した（図２、第１カラム）。その他のサイトカイニン類、アンチオーキシン類は３０以上の数値を示した（図２、第２から第６カラム）。このことから、共存培地へのサイトカイニン類、アンチオーキシン類の添加により、オオムギ未熟胚胚盤への遺伝子導入効率が顕著に高まることが初めて明らかとなった。
実施例３
　　遠心処理がコンパクトなカルス形成に及ぼす効果
　　材料および方法
　材料およびアグロバクテリウムの接種方法は、実施例１と同一である。なお、共存培地は植物成長調節物質を無添加とした。
　２５℃、暗黒下で２４時間共存培養した未熟胚を、１ｍｌ滅菌水を入れた２ｍｌマイクロチューブに移し、２５℃、１，５００ｒｐｍ (２０，０００ ｘｇ)で１０分間遠心処理を実施した。その後、実施例１と同じ、０．５ｍｇ／ｌ　２，４－Ｄおよび１．２５ｍｇ／ｌ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを添加したＣＩＭＴレスティング培地（Tingay et al. 1997　非特許文献５）に移植した。 なお、本レスティング培地にはアグロバクテリウム除菌用に２５０ｍｇ／ｌ　カルベニシリン　１００ｍｇ／ｌ　セフォタキシムを添加した。２５℃暗黒下で２日間培養した後、各未熟胚の胚盤を４分割した。分割切片を同組成の培地へ移植した。その後、さらに同培養条件で８日間培養を継続した。培養後、胚盤分割切片上に形成されたカルスの形状を観察した。オオムギでは、コンパクトでエンブリオジェニックな形状をしたカルスのみが継代培養が可能であり、将来的に再分化する可能性を有する。一方で、水分を多く含んだスポンジ状のカルスがしばしば形成されるが、このようなカルスは再分化能を失っている。従って、コンパクトなカルスを形成した胚盤切片の数を数え、カルス形成率とした。
　　結果および考察
　遠心処理を実施した試験区からは、８０％の効率でコンパクトなカルスが形成されたのに対し（表１、下段）、遠心処理を行っていない試験区では、その１／４以下の１７．５％がコンパクトなカルスを形成するにとどまった（表１、上段）。Ke et al. (2002　非特許文献１７)において、植物成長調節物質を含まない共存培地で遺伝子導入効率が一定程度向上することが示されていたが、同文献中の「１／１０濃度のＭＳ培地で培養を継続すると、植物材料に有害な影響がある。」および「安定的形質転換には、十分な数の遺伝子導入受容細胞が再分化能を維持していると同時に、十分な数のＴ－ＤＮＡ導入イベントを植物材料中に生じさせるという優れたバランスを見出す必要がある。」などの記載にあるとおり、そのまま何の処理も加えないでレスティング培養を実施しても、遺伝子導入領域である胚盤細胞からのコンパクトなカルスの形成が強く抑制されることが明らかとなった。一方、遠心処理を実施した試験区では、８０％がコンパクトなカルスを形成し、その後のハイグロマイシンによる選抜で形質転換カルスを一定頻度で得られる可能性を示唆した。なお、本発明者らは、アグロバクテリウム接種前の未熟胚に遠心処理や加圧処理を実施した場合も同様なカルス形成促進効果があることを見出している。さらに、本実験系では、アグロバクテリウム接種前の未熟胚に遠心処理および加圧処理を実施しても、共存培養後の未熟胚への遺伝子導入効率は向上せず、あくまでコンパクトなカルスの形成促進に効果が見られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例４
　　遠心処理がハイグロマイシン耐性カルスの形成に及ぼす効果
　　材料および方法
　材料およびアグロバクテリウムの接種方法、熱処理条件、共存工程、遠心処理条件およびレスティング工程は、実施例３と同一である。なお、共存培地にはアンチオーキシンである５μＭ ＴＩＢＡを添加した。胚盤を４分割したのち１０日間レスティング工程を継続した。レスティング工程後、各分割胚盤切片をさらに４分割（未熟胚当たり１６分割）し、５０ｍｇ／ｌ　ハイグロマイシンＢおよび１．２５ｍｇ／ｌ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを添加したＣＩＭＴ選抜培地（Tingay et al. 1997　非特許文献５）に移植した。本選抜培地にはアグロバクテリウム除菌用に２５０ｍｇ／ｌ　カルベニシリンを添加した。なお各胚盤切片は、由来する未熟胚ごとに培地上に区分けして置床した。２５℃暗黒下で ２週間培養した後、水分を多く含むスポンジ状のカルスではなく、コンパクトなカルスを選んで、同組成の２次選抜培地へ移植し、同条件でさらに３週間培養した。培養後、選抜培地上で増殖したハイグロマイシン耐性のコンパクトなカルスをカウントした。なお、同じ未熟胚由来の胚盤切片から複数の耐性カルスが得られた場合があっても、未熟胚当たりでは最大で１つのハイグロマイシン耐性カルスまでをカウントの対象とした。
　また、従来実施されてきた形質転換方法と比較をするため、Harwood et al. (2008　非特許文献１１)のプロトコルに従い、形質転換を実施した。上述した実施例との違いは、共存培地の組成が等倍（ｘ１）のＭＳ培地を用い、ダイカンバを２．５ｍｇ／ｌ添加している点である。また、レスティング培地には、Harwood et al. (2008)のプロトコルに従い、２，４－Ｄは添加しなかった点も異なる。一方で、条件を同一とするため、遺伝子導入向上処理として熱処理を他試験区と同条件で実施し、アグロバクテリウムの接種方法には他の試験区と同様に減圧処理を実施した。なお、選抜培地の組成は他試験区と同様である。
　　結果および考察
　修正Harwood et al.(2008　非特許文献１１)のプロトコルによる従来法では、共存培養終了後、２日目の遺伝子導入効率は、遠心処理なし試験区および遠心処理試験区に比べて、遺伝子導入効率（ＧＵＳ発現）は低かった（データ非表示）。しかしながら、レスティング工程においてコンパクトなカルスは問題なく形成された。ハイグロマイシンによる選抜により生き残ったカルスは、遠心処理試験区に比べると少なく、結果的に２次選抜までで３３．３％の効率にとどまった（表２、上段）。共存培養後に遠心処理を実施しなかった未熟胚では遺伝子導入効率は高かったものの、コンパクトなカルスがほとんど形成されず、選抜培地で生き残るカルスを見出すことはできなかった（表２、中段）。共存培養後に遠心処理を実施した形質転換系では、コンパクトなカルスが数多く形成され、２次選抜までで８０％の未熟胚からハイグロマイシン耐性カルスを得ることができた（表２、下段）。この結果は、アンチオーキシンＴＩＢＡにより高効率の遺伝子導入を生じた未熟胚胚盤細胞について、遠心処理をしない場合には通常のカルス形成に至らないが、遠心処理をした場合には通常のカルス形成とほぼ同様にコンパクトなカルスが形成され、選抜工程でも従来法と同様に選抜カルスを得られることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例５
　　共存培地組成が遺伝子導入効率に及ぼす効果（ホルモンフリー、２，４－Ｄ）
　　材料および方法
　材料およびアグロバクテリウムの接種方法は、実施例１と同一である。すなわち、１／１０濃度のＭＳ無機塩を含む共存培地を用いた。試験区としては、植物成長調節物質を含まないホルモンフリーの共存培地、１．１３μＭ　２，４－Ｄならびに１１．３μＭ　２，４－Ｄを添加した共存培地の３種類を供試した。２５℃、暗黒下で２４時間共存培養した未熟胚を、実施例１と同じ、０．５ ｍｇ／ｌ ２，４－Ｄおよび１．２５　ｍｇ／ｌ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを添加したＣＩＭＴレスティング培地（Tingay et al. 1997　非特許文献５）に移植した。 なお、本レスティング培地にはアグロバクテリウム除菌用に２５０ｍｇ／ｌ　カルベニシリン　１００ｍｇ／ｌ　セフォタキシムを添加した。２５℃暗黒下で２日間培養した後、実施例１と同様にＧＵＳ遺伝子の発現を調査し、ＧＵＳ発現インデックスとし数値化した。供試した未熟胚数は各区１５個とした。
　　結果および考察
　植物成長調節物質を添加しなかったホルモンフリーの共存培地で最も遺伝子導入効率が高かった（図３、第１カラム）。これに対し、１１．３μＭ ２，４－Ｄを添加した共存培地を用いた場合には、遺伝子導入効率は最も低い値を示した（図３、第３カラム）。１．１３μＭ ２，４－Ｄの添加（図３、第２カラム）でも、ホルモンフリーの共存培地（図３、第１カラム）と比較すると遺伝子導入効率は１／６程度と非常に低い値を示した。実施例１で、２，４－Ｄと同じオーキシン１．１３μＭ　ダイカンバ添加区がホルモンフリー区と同等の遺伝子導入効率を示した結果とは大きく異なった（図１第１カラムおよび図１第３カラム）。このことは、フェノキシ系オーキシンの２，４－Ｄとベンゾイック系オーキシンのダイカンバとの間で、それらのオーキシン濃度が遺伝子効率に及ぼす影響が異なっていることを示しており、それは、両者の作用性がやや異なることに由来すると考えられる。
実施例６
　　アグロバクテリウム接種前と共存培養後における遠心処理がコンパクトなカルス形成に及ぼす効果
　　材料および方法
　材料の調製およびアグロバクテリウムの接種方法は、実施例１と同様である。未熟胚への熱処理も同様に実施した。なお、共存培地にはＴＩＢＡを５μＭ添加した。
　試験区（１）アグロバクテリウム接種前遠心処理：単離した未熟胚を、１ｍｌ滅菌水を入れた２ｍｌマイクロチューブに移し、２５℃、１５，０００ｒｐｍ (２０，０００ ｘｇ)で１０分間遠心処理を実施した。その後アグロバクテリウムの接種を行った。
　試験区（２）共存培養後遠心処理：実施例４と同様に２４時間の共存培養を行ったのち、未熟胚を１ｍｌ滅菌水が入った２ｍｌマイクロチューブに移し、２５℃、１５，０００ｒｐｍ (２０，０００ ｘｇ)で１０分間遠心処理を実施した。レスティング培養以降の培養方法および培養期間は、実施例４と同様とした。
　　結果および考察
　アグロバクテリウム接種前遠心処理を実施した試験区（試験区１、表３上段）と共存培養後遠心処理を行った試験区（試験区２、表３下段）では、ほぼ同様の高い効率で遺伝子導入領域である胚盤細胞からのコンパクトなカルスの形成が行われた。すなわち、遠心処理をアグロバクテリウム接種前に行っても、共存培養後に行っても、カルスの形成は促進された。なお、滅菌水中で７，１００ｈＰａの強さで５分間加圧した未熟胚でも同様なカルスの形成に対する効果が見られ、アグロバクテリウム接種前でも共存培養後でもその効果に違いは見られなかった。アグロバクテリウム接種前に遠心処理および加圧処理を行っても、遺伝子導入の効率は特に向上しなかった。なお、本実施例６で用いた共存培地を用いて、共存培養期間を４８時間（２日間）または７２時間（３日間）とさらに長くした試験を実施した。しかしながら、カルス形成が強く抑制され、上記強度の遠心処理をアグロバクテリウム接種前または共存培養後に実施しても、レスティング培地で未熟胚から再分化能を有するコンパクトなカルスはほとんど形成されなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例７
　　ダイカンバを含む従来法共存培地とＭＳ無機塩を１／１０濃度とした共存培地による形質転換効率の比較
　材料の調製とアグロバクテリウムの接種については実施例１と同様である。熱処理も同様に実施した。
試験区（１）：アグロバクテリウムを接種した未熟胚をHarwood et　al．（2008　非特許文献１１）に記載の共存培地に胚盤を下向きに置床した。共存培養は、２５℃、暗黒下で３日間実施した。この試験区においては遠心処理を行わなかった。
試験区（２）：単離した未熟胚を１ｍｌ滅菌水が入った２ｍｌマイクロチューブに移し、２５℃、１５，０００ｒｐｍ (２０，０００ ｘｇ)で１０分間遠心処理した。その後は、試験区（１）と同様に共存培養した。
試験区（３）：試験区（１）と同様に共存培養を実施したのち、未熟胚を１ｍｌ滅菌水が入った２ｍｌマイクロチューブに移し、２５℃、１５，０００ｒｐｍ (２０，０００ ｘｇ)で１０分間遠心処理した。
試験区（４）：アグロバクテリウムを接種した未熟胚を１００μＭアセトシリンゴン含有のオオムギ共存培地（１／１０濃度のＭＳ無機塩およびＭＳビタミン、１０ｇ／ｌグルコース、５μＭ　ＴＩＢＡ、０．５ｇ／ｌ　ＭＥＳ、５μＭ　ＡｇＮＯ３および５μＭ　ＣｕＳＯ４、ｐＨ５．８、８ｇ／ｌアガロース）上へ移植し、胚盤が上向きになるように置床した。２５℃、暗黒下で２４時間培養した。この試験区においては遠心処理を行わなかった。
試験区（５）：単離した未熟胚を１ｍｌ滅菌水が入った２ｍｌマイクロチューブに移し、２５℃、１５，０００ｒｐｍ (２０，０００ ｘｇ)で１０分間遠心処理した。その後は、試験区（４）と同様に共存培養した。
試験区（６）：試験区（４）と同様に共存培養を実施したのち、未熟胚を１ｍｌ滅菌水が入った２ｍｌマイクロチューブに移し、２５℃、１５，０００ｒｐｍ (２０，０００ ｘｇ)で１０分間遠心処理した。
試験区（７）：試験区（４）の共存培地から植物成長調節物質であるＴＩＢＡを除き、試験区（４）と同様に共存培養を実施したのち、未熟胚を１ｍｌ滅菌水が入った２ｍｌマイクロチューブに移し、２５℃、１５，０００ｒｐｍ (２０，０００ ｘｇ)で１０分間遠心処理した。
　すなわち、試験区（１）、（２）、（３）では、オーキシンのダイカンバと通常濃度のＭＳ無機塩類を含有する共存培地を用いた。これに対し、試験区（４）、（５）、（６）では、アンチオーキシンのＴＩＢＡと１／１０濃度のＭＳ無機塩類を含有する共存培地を用いた。また、試験区（７）では、ホルモンフリーの１／１０濃度のＭＳ無機塩類を含有する共存培地を用いた。
　上記、試験区（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）で得た未熟胚を、それぞれ、０．５ｍｇ／ｌ　２，４－Ｄおよびを添加した選抜薬剤を含まないＣＩＭＴレスティング培地（Tingay et al． 1997　非特許文献５）に移植した。なお、本レスティング培地にはアグロバクテリウム除菌用に２５０ｍｇ／ｌ カルベニシリン　１００ｍｇ／ｌ セフォタキシムを添加した。２５℃暗黒下で７日間培養した後、未熟胚を４分割し、０．２ｍｇ／ｌ　２，４－Ｄおよび５μＭ　ＣｕＳＯ４を添加した選抜薬剤を含まないＣＩＭＴレスティング培地（Tingay et al． 1997　非特許文献５）に移植した。２５℃暗黒下で１０日間レスティング培養を行った後、４分割した未熟胚切片を各々さらに３ないし６分割（未熟胚当たり１２ないし２４切片）し、０．１ｍｇ／ｌ　２，４－Ｄ、１．５μＭ　ＣｕＳＯ４および７５ｍｇ／ｌハイグロマイシンを添加したＣＩＭＴ選抜培地（Tingay et al．1997　非特許文献５）に置床した。そして、２５℃暗黒下で１０日間培養した。次に、ハイグロマイシン耐性と思われる細胞塊を有する切片を同組成の選抜培地に継代し、２５℃暗黒下でさらに１０日間培養した。
　得られたハイグロマイシン耐性カルスを分割切片につき１つだけ、ハイグロマイシンを含まないＴｒａｎｓｉｔｉｏｎ（再分化前培養）培地（Harwood et al．（2008　非特許文献１１））に置床し、２５℃明条件下で約２週間培養した。得られた緑化細胞塊またはシュートを３０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、０．２ｍｇ／ｌのインドール酪酸（ＩＢＡ）および５μＭ ＣｕＳＯ４を含む再分化培地（Harwood et al．（2008　非特許文献１１））に置床し２５℃明条件下で約２週間培養した。
　得られたハイグロマイシン耐性植物体の葉の一部を切り取り０．１ ％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（登録商標）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸漬し、３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液を除いた後、１．０ ｍＭ ５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－グルクロン酸（Ｘ－ｇｌｕｃ）および２０ ％メタノールを含むリン酸緩衝液を添加した。３７℃で２４時間処理した後、ＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。なお、ＧＵＳ遺伝子の発現の調査は、分割した未熟胚切片１個につき最大で１植物体からの１枚の葉において実施した。
　結果および考察
　オーキシンのダイカンバを含む従来法共存培地を用いた形質転換では、未熟胚当たりの形質転換効率は試験区１（遠心処理なし）で３０％、試験区３（共存培養後遠心処理）で２０％であった（表４）。これに対し、未熟胚に遠心処理しＭＳ無機塩類を１／１０濃度とした共存培地を用いた３種類の試験区、試験区５（アグロバクテリウム接種前遠心処理）では９０％、試験区６（共存培養後遠心処理）では１００％、試験区７（ホルモンフリー共存培地および共存培養後遠心処理）でも８０％という非常に高い形質転換効率を示した。未熟胚に遠心処理を施さなかった試験区４では、再分化能を有するコンパクトなカルスが形成されず、形質転換体は全く得られなかった。また、試験区２の遠心処理をした後ダイカンバ含有の従来法共存培地で培養した未熟胚からも、全く形質転換体を得ることができなかった。これは、共存培養前に遠心処理を行うことによって、後にカルスが形成されない未熟胚の部分にＴ－ＤＮＡが導入されたことによるものである。実際に、共存培養後のＧＵＳアッセイで、未熟胚の胚軸側の中心付近にＧＵＳ遺伝子の発現が検出された。また、共存培地にアンチオーキシンである５μＭ　ＴＩＢＡを添加した試験区６がホルモンフリーの試験区７より形質転換効率が高い傾向を示した。
　以上述べたように、アンチオーキシンのＴＩＢＡを５μＭ含有する共存培地および植物成長調節物質を含まない共存培地で培養した試験区では遠心処理を行うことにより、形質転換効率の大きな上昇が認められた（試験区５、６、７）。その効果は遠心処理をアグロバクテリウム接種前に行った場合（試験区５）でも、共存培養後に行った場合（試験区６、７）でも同様であった。一方、従来より用いられている１１．３μＭ　ダイカンバ（ベンゾイック系オーキシン）を含有する共存培地で培養した試験区においては、遠心処理による形質転換効率の上昇は認められなかった（試験区２、３）。この結果は、オーキシンを含まない培地で共存培養を行うことにより高い効率で目的遺伝子が植物細胞に導入され、併せて遠心処理を行うことで未熟胚からのカルス誘導効率も向上し、その結果、形質転換効率が大きく上昇するという本発明の効果を明確に示すものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例８
　　形質転換体の自殖次世代における導入遺伝子の遺伝解析
　実施例６試験区（６）の異なる未熟胚から得られた２個体のハイグロマイシン耐性かつＧＵＳ陽性の形質転換植物を温室において栽培し、得られた未熟種子から１．５～２．０ｍｍの未熟胚を無菌的に採種した。当該未熟胚を、５μＭ ＣｕＳＯ４を含む再分化培地（Harwood et al．（2008　非特許文献１１））に置床し、２５℃明条件下で約２週間培養した。得られた自殖次世代（Ｔ１）植物体の根の一部を切り取り、１．０ ｍＭ ５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－グルクロン酸（Ｘ－ｇｌｕｃ）および２０％メタノールを含むリン酸緩衝液に浸漬した。３７℃で２４時間処理した後、切断根におけるＧＵＳ遺伝子の発現を調査した。また、Ｔ１植物体を３０ｍｇ／ｌハイグロマイシンと５μＭ ＣｕＳＯ４を含む再分化培地（Harwood et al．（2008　非特許文献１１））に置床し、２５℃明条件下で約１０日間培養することにより、ハイグロマイシン耐性を調査した。
　結果および考察
　根でＧＵＳの発現が観察されたＴ１個体は、すべてハイグロマイシン耐性を示した（表５）。根でＧＵＳの発現が認められなかったＴ１個体は、すべて３０ｍｇ／ｌハイグロマイシン含有の再分化培地で褐変し枯死した（表５）。これは、用いた形質転換系統が２系統とも同様であった。また、導入遺伝子の発現個体と非発現個体の比率は、１因子分離の予測値３：１に適合していた（表５）。この結果は、ＧＵＳ遺伝子とハイグロマイシン耐性遺伝子を含有するＴ－ＤＮＡが、アグロバクテリウム菌株ＥＨＡ１０１／ｐＩＧ１２１Ｈｍを介してオオムギゲノムに組み込まれ、メンデルの法則に従い自殖次世代に遺伝子したことを明確に示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005

Claims (13)

  1. 　オオムギ属（Hordeum）の植物の、未熟胚組織へ、遺伝子導入を行う方法であって、
    　（ｉ）アグロバクテリウム菌を上記組織へ接種し、該アグロバクテリウム菌の存在下で、以下のａ）からｃ）の１つまたは複数の条件
    ａ）アンチオーキシンを含む、
    ｂ）サイトカイニンを含む、
    ｃ）フェノキシ系オーキシンを２μＭ未満の濃度で含むおよび／またはベンゾイック系オーキシンを５μＭ未満の濃度で含むか、あるいは、フェノキシ系オーキシンおよび／またはベンゾイック系オーキシンを含まない；
    を満たす共存培地の中で、上記組織を培養する共存工程を行う、
    （ｉｉ）アグロバクテリウム菌の接種前、共存工程中および／または共存工程に次いで、上記組織を遠心処理および／または加圧処理する工程を行う、
    　ことを含む、上記方法。
  2. 　オオムギ属（Hordeum）の植物の、形質転換植物の作成方法であって、
    （ｉ）アグロバクテリウム菌をオオムギの未熟胚組織へ接種し、該アグロバクテリウム菌の存在下で、以下のａ）からｃ）の１つまたは複数の条件
    ａ）アンチオーキシンを含む、
    ｂ）サイトカイニンを含む、
    ｃ）フェノキシ系オーキシンを２μＭ未満の濃度で含むおよび／またはベンゾイック系オーキシンを５μＭ未満の濃度で含むか、あるいは、フェノキシ系オーキシンおよび／またはベンゾイック系オーキシンを含まない；
    を満たす共存培地の中で、上記組織を培養する共存工程を行い、
    （ｉｉ）アグロバクテリウム菌の接種前、共存工程中および／または共存工程に次いで、上記組織を遠心処理および／または加圧処理する工程を行い、
    　（ｉｉｉ）上記組織をレスティング培地で培養するレスティング工程を行い、そして、
    　（ｉｖ）上記組織を再分化培地で再分化させる工程を行う、
    ことを含む、上記方法。
  3. 　前記共存工程開始後６時間ないし３６時間以内に、レスティング工程を開始する、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 　前記共存工程開始後１２時間ないし２４時間以内に、レスティング工程を開始する、請求項３に記載の方法。
  5. 　未熟胚を単離後６時間ないし３６時間以内に、共存工程を終えレスティング工程を開始する、請求項１または請求項２に記載の方法。
  6. 　未熟胚を単離後１２時間ないし２４時間以内に、共存工程を終えレスティング工程を開始する、請求項５に記載の方法。
  7. 　上記未熟胚組織に対するアグロバクテリウム菌の接種前、共存工程中および／または共存工程に次いで、上記未熟胚組織において幼根、幼芽、および胚軸から選択される１またはそれ以上の部位を物理的／化学的に損傷する工程を行う請求項１ないし請求項６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記共存培養において前記未熟胚組織を、胚盤側を上向きにし、かつ、胚軸側を前記共存培地に接するように置床して培養する、請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　以下の形質転換効率向上処理のうち、少なくとも１つを行う、請求項１ないし請求項８のいずれか１項に記載の方法。
    　a）熱処理；
    　b）硝酸銀の共存培地への添加；
    　c）粉体の存在下でアグロバクテリウムを接種する処理；
  10. 　上記（ｉｉｉ）レスティング工程と、（ｉｖ）再分化工程の間に薬剤選抜工程を含む、請求項１ないし請求項９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　（ｉｉｉ）レスティング培地、および／または、薬剤選抜工程の選抜培地が、植物成長調節物質を含む、請求項１ないし請求項１０いずれか１項に記載の方法。
  12. 　前記アグロバクテリウム菌が、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５、ＡＧＬ０、ＡＧＬ１、および５８Ｃ１からなる群から選択される菌である、請求項１ないし請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　オオムギ属の植物がオオムギ（H. vulgare）である、請求項１ないし請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
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