WO2012013147A1 - 苊并杂环类化合物及其应用 - Google Patents

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Dalian University of Technology
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    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/10—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing aromatic rings

Definitions

  • the present invention relates to a novel class of indole heterocyclic Bcl-2 family protein inhibitors and their in vivo and in vitro mimicking of BH3-only proteins, competitively binding and antagonizing Bcl-2 and Mcl-1 proteins, thereby inducing cell withering Death effects and applications as anti-cancer compounds.
  • Bcl-2 family of proteins is the most important molecular target for antagonizing and reversing the immortality of malignant tumors. Therefore, a drug that specifically antagonizes Bcl-2 protein will specifically induce tumor cell apoptosis, and ultimately achieve the goal of high selectivity, safety, high efficiency, and no toxic side effects against cancer.
  • the anti-tumor effect of the highly specific BH3 analogue (BH3 mi me ti CS ) was the most significant, with the best pharmacodynamic activity and the lowest toxic side effects.
  • a broad spectrum of anti-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins, including Bcl-2 and Mcl-1 proteins must be versatile in order to achieve a single dose of efficacy and low drug resistance.
  • anti-tumor drugs targeting Bcl-2 have not been marketed so far.
  • Bcl-2 inhibitors Of the 19 preclinical Bcl-2 inhibitors, only three are optimally in clinical stage I, II, III. . They are: ABT-737 developed by the Abbott laboratory in Illinois, USA, Obatoclax (GX15-070) developed by Gemin X, and AT-101 by Ascenta of the United States. They are all BH3 analogues, and the competition binding constant with Bcl-2 protein reaches nM level, which is much higher than the other 15 similar molecules.
  • the present invention aims to obtain a more targeted compound which is an inhibitor of Bcl-2 family proteins (including Bcl-2 and Mcl-1 proteins) which are ⁇ 3 analogs.
  • One of the objects of the present invention is to provide a class of indenocyclic heterocyclic compounds having the structure of the following formula I:
  • R 1 is selected from the group consisting of H, thiomorpholinyl and XR 4 ;
  • R 2 is selected from (CH 2 ) n Z and (CH 2 ) n Ph -( m, /?)Z, and the Z is selected from the group consisting of N0 2 , Ph, CF 3 , OCH 3 , SCH 3 , NH 2 , NHCH 3 , N(CH 3 ) 2 and a linear or branched substituted or unsubstituted -3 ⁇ 4 alkyl group, said substituent being a halogen, an amino group, a hydroxyl group, an ester group or a carboxyl group;
  • R 3 is selected from (CH 2 ) n W, and said W is selected from the group consisting of H, CN, NO 2 , NH 2 , COOH, CHO, OH and B S 3 3 H; wherein R 4 is selected from the compounds of formula I (CH 2 ) n Y, thiophenemethyl, tetrahydropyranyl, tetrahydrothiopyranyl and (CH 2 ) n Ph -(o,m,p)Y; wherein Y is a straight chain or a branched chain a substituted or unsubstituted dC 8 alkyl group, the substituent being a halogen, an amino group, a hydroxyl group, an ester group or a carboxyl group;
  • X as described in the compound of formula I is 0, s, amino, carbonyl, ester, amide or sulfonamide;
  • n described in the compound of the formula I is an integer of 0 to 4.
  • Z described in the compound of the above formula I is a linear or branched substituted or unsubstituted dC 4 alkyl group. More preferably, R 2 is (CH 2 ) 4 Ph -(o,m,p)Z, wherein Z is a linear or branched substituted or unsubstituted dC 3 alkyl group.
  • W as described in the compound of formula I above is H, NH 2 or OH. More preferably, said X is 0 or 8. Most preferably, said R 4 is Ph -( m, / )Y, wherein Y is selected from the group consisting of Ph, CF 3 , OCH 3 , SCH 3 , NH 2 , Br, isopropyl, isobutyl and sec-butyl .
  • the compound of the above formula I of the present invention is selected from the group consisting of:
  • a second object of the present invention is to provide a method for preparing a compound of the above formula I, wherein a compound of the formula i is reacted with NH 2 CHR 2 R 3 at a normal temperature for 0.5 to 8 h,
  • the method for synthesizing the above compound of the formula I of the present invention is a synthetic route in which a cyano group is substituted by a mild method, using a nucleophilic primary amine compound and 8-oxo-8H-indolo[l,2-b]pyrrole
  • the -9-carbonitrile and its derivatives are reacted to obtain a series of amino-substituted indenocyclic heterocyclic compounds of the present invention.
  • the reaction formula is as follows:
  • R 5 , R 6 and R 7 are each independently selected from the group consisting of XR 9 and H;
  • R 8 is selected from the group consisting of CN, COOH, COO R 10 and CONH R 10 ;
  • the R 9 is selected from the group consisting of (CH 2 ) n Y and (CH 2 ) n Ph - ( ⁇ , ⁇ , ⁇ ) ⁇ , and the oxime is selected from a linear or branched C 2 -C 8 alkyl group, a substituted linear or branched dC 8 alkyl group, said substituent being selected from the group consisting of halogen, amino, hydroxy, ester and carboxyl;
  • the R 1Q is selected from a substituted or unsubstituted linear or branched C r C 6 alkyl group, and the substituent is selected from a halogen, an amino group, a hydroxyl group, an ester group, a carboxyl group or (CH 2 ) n Ph - ( o, m, p) Z, wherein Z is selected from the group consisting of -CH 3 , -C 2 H 5 , -N0 2 , -Ph, -F, -CK -Br, -CF 3 , -OCH 3 , -SCH 3 , -NH 2 and -N(CH 3 ) 2 ;
  • the R 9 is selected from (CH 2 ) n Ph -(o, m, p)Y, and the Y is selected from a linear or branched C 2 -C 8 alkyl group, a substituted straight chain or a branched chain. a dC 8 alkyl group, the substituent being selected from the group consisting of halogen, amino, hydroxy, ester and carboxyl;
  • the R 1Q is selected from a substituted or unsubstituted linear or branched C r C 6 alkyl group, and the substituent is selected from a halogen, an amino group, a hydroxyl group, an ester group, a carboxyl group or (CH 2 ) n Ph - ( o, m, p) Z, wherein Z is selected from the group consisting of -CH 3 , -C 2 H 5 , -N0 2 , -Ph, -F, -CK -Br, -CF 3 , -OCH 3 , -SCH 3 , -NH 2 and -N(CH 3 ) 2 ;
  • ⁇ is an integer of 0 to 4.
  • R 5 and R 6 in the compound of the above formula X are XR 9 and hydrazine, respectively.
  • R 8 in the compound of the above formula ⁇ is CN.
  • R 9 in the compound of the above formula ( is (CH 2 ) n Ph -( m, / )Y.
  • X is 0 or S
  • Y is a linear or branched C 3 -C 5 alkyl group. Most preferably Y is isopropyl, isobutyl or sec-butyl.
  • the above compound of the formula of the present invention is selected from the group consisting of:
  • a further object of the present invention is to provide a process for the preparation of a compound of the above formula, via the following a or b route: a. 8-oxo-8H-indolo[l,2-b]pyrrole-9-
  • the nitrile is used as a raw material, and reacts with a nucleophilic alcohol, a phenol, an ester, and an amide at a temperature of 20 to 100 ° C, and a reaction time of 0.5 to 24 hours.
  • each substituent is identical to the above definition of the substituent in the compound of the formula II, and the substituent R of the above is different in the reaction.
  • the position is replaced by R 5 or R 6 .
  • FIG. 1 is a kinetic curve of the ELISA method for detecting the binding of Compound 1 to the FAM-Bid peptide to bind Bcl-2 protein
  • FIG. 2 is the kinetics of the ELISA method for detecting the binding of Compound 1 to the FAM-Bid peptide to bind Mcl-1 protein
  • Figure 3 is a kinetic curve of the fluorescence polarization method for detecting the binding of compound 13 to the FAM-Bid peptide to bind Bcl-2 protein;
  • Figure 4 is a graph showing the kinetics of the binding of Compound 13 to the FAM-Bid peptide to bind Mcl-1 protein by fluorescence polarization method
  • Figure 5 is a graph showing the results of the interaction between different concentrations of Compound 1 at the cellular level to interfere with Bcl-2/Bax;
  • Figure 6 is the interaction between Compound 1 and Bcl-2/Bax at different levels of action at the cellular level.
  • Figure 7 is a diagram showing the positive results of BH3 similarity between Bax protein and mitochondria co-localization detection compound 1;
  • Figure 8 is a negative result showing the similarity of BH3 of Bax protein and mitochondria co-localization detection compound 1;
  • Figure 9 is a result of a cytotoxicity test of Compound 1 dependent on BAX/BAK, in which Gossypol is a non-specific pair.
  • Figure 10 is a diagram showing the inhibition of Mcl-1 by Compound 1 by Western blot detection
  • Figure 11 is an electrophoresis pattern of Western blotting detection of Compound 1 against Bcl-2;
  • Figure 12 is a semi-quantitative curve of the inhibition of Mcl-1 protein by Compound 1;
  • Figure 13 is a semi-quantitative curve of the inhibition of Bcl-2 protein by Compound 1.
  • Part I Preparation and characterization of Bcl-2 family protein inhibitor compounds
  • Example 16 3-(4-Isobutylphenylthio)-8-oxo-8H-indolo[l,2-b]pyrrole-9-carbonitrile (Compound 18) and 4-(4-Isobutyl Synthesis and characterization of phenylthio)phenoxy-8--8H-indolo[l,2-b]pyrrole-9-carbonitrile (Compound 19)
  • the Bcl-2 protein binding constant is significantly lower than the corresponding values of the series of indenocyclic heterocyclic compounds which have been disclosed in the prior art; the Mcl-1 protein binding constant of the series of compounds of the present invention is significantly lower than that already disclosed in the prior art.
  • a 21 amino acid Bid BH3 peptide (amino acid: 79-99: QEDIIRNIARHLAQ VGDSMDR) was synthesized and labeled with a 6-carboxyfluorescein succinimidyl ester (FAM) as a fluorescent label (FAM-Bid) at the N-terminus.
  • the reaction system used in the competition binding assay was GST-Bcl-2 protein (40 nM) or Mcl-1 protein, and FAM-Bid polypeptide (5 nM) was dissolved in the reaction buffer (100 mM K3PO4, pH 7.5, 100 ⁇ g/ Ml bovine gamma albumin; 0.02% sodium azide).
  • binding constant of the protein (abbreviated as binding constant in Table 2) is also at the tiM level, and the specific results are shown in Table 2.
  • Example 15 Detection of BH3 similarity of compounds by fluorescence polarization energy transfer (FRET) in living cells
  • the plate was read for fluorescence.
  • the 475 nm emission wavelength was recorded in a cell group transfected only with the Bcl-2-CFP plasmid at an excitation wavelength of 433 nm.
  • the 527 nm emission wavelength was recorded in a cell group transfected only with the Bax-YFP plasmid at an excitation wavelength of 505 nm.
  • the experimental group of co-transfected Bcl-2-CFP and Bax-YFP plasmids recorded emission wavelengths at 527 nm and 475 nm with an excitation wavelength of 433 nm.
  • the value of the 527 nm emission fluorescence compared with the 475 nm emission fluorescence was FRET, and the FRET value of the individually transfected control group was set to 1.0.
  • the FRET value increased to 2.0 due to the interaction between Bcl-2 protein and Bax protein, and the interference of the two protein interactions increased with the increase of drug concentration and time, and FRET decreased.
  • Cell viability was determined by the MTT method. The test results are shown in Fig. 5 and Fig. 6. The compound interferes with the interaction between Bcl-2/Bax at a concentration of 1 ⁇ for 2 hours, showing a concentration-dependent trend.
  • Example 16 Detection of BH3 similarity of compounds by colocalization of Bax protein with mitochondria
  • one channel scans the green fluorescence of Bax-YFP, and the other channel scans the red fluorescence of the mitochondrial CMXRos probe.
  • the two channel images superimpose each other to show co-localization. Under the action of this compound, the superimposed picture showed orange fluorescence, indicating Bax shift to mitochondria, as shown in Fig. 7;
  • Figure 8 shows the test results of failure to drive BAX to mitochondrial shift and colocalization failure.
  • Example 17 Compound-dependent BAX/BAK-based cytotoxicity assay to verify the characteristics of its BH3 analogs.
  • Calcium co-precipitation was transfected with 3 ⁇ ⁇ BAX/BAK interference plasmid into MCF-7 cells. After 24 hours of transfection, cells were harvested. Western blot was used to detect the expression of BAX and BAK protein after RA interference, and the same cell group without plasmid transfection was used as the control group.
  • the transfected cells were seeded in a 96-well plate (lxlO 5 cells/well), and the control experiments of the untransfected plasmid cell group were performed in parallel, and the compound to be tested 1 was added according to the experimentally designed concentration gradient.
  • the cells were lysed with lxl0 6 6 /50 ⁇ cell lysate (62.5 mM Tris-HCL pH 6.8; 2% SDS; 10% glycine; 50 mM DTT; 0.01% bromophenol blue), centrifuged, and taken.
  • the protein supernatant was boiled at 100 °C for 5 minutes, 12% SDS-PAGE electrophoresis and transfection, the corresponding antibody was used to detect the target protein, horseradish peroxidase-labeled secondary antibody and ECL chromogenic assay was used to detect the expression of the target protein in the cells. the amount.
  • Figure 10 and Figure 11 show the inhibitory effects of Compound 1 to be tested on Mcl-1 and Bcl-2, respectively. It can be seen from the figure that the protein bands of Bcl-2 and Mcl-1 become lighter as the time of the test compound acts on the tumor cells, indicating that the compound has the effect of inhibiting these two proteins.
  • the protein band concentration in the Western image was semi-quantitatively analyzed using the KODAK Gel Logic 1500 Imaging System software. After normalization, the concentration of the protein bands is shown in Figures 12 and 13.

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Abstract

公开了一种苊并杂环类化合物及其在制备BH3类似物Bcl-2家族蛋白抑制剂中的应用。所述化合物具有通式I或II的结构：

Description

苊并杂环类化合物及其应用 技术领域
本发明涉及一类新的苊并杂环类 Bcl-2 家族蛋白抑制剂及其在体内、 体外的模拟 BH3-only蛋白， 竞争性结合和拮抗 Bcl-2和 Mcl-1蛋白， 从而诱导细胞凋亡作用和作为抗癌 化合物的应用。
说
背景技术
分子靶向抗肿瘤药物正在成为继细胞毒剂类抗肿瘤药物之后，新药研发的热点和市场化 的新生代产品。 Bcl-2家族蛋白， 是拮抗和逆转恶性肿瘤永生性的最重要的分子靶点。 所以， 特异性拮抗 Bcl-2蛋白的药物， 将通过专一诱导肿瘤书细胞凋亡， 最终实现高选择性、 安全、 高效、无毒副作用抗癌的目标。 在 Bcl-2抑制剂中， 以高特异的 BH3类似物（BH3 mimetiCS) 的抗肿瘤效果最为显著， 药效学活性最好， 毒副作用最低。此外， 还必须具备广谱拮抗 Bcl-2 家族蛋白的抗凋亡成员 （包括 Bcl-2和 Mcl-1蛋白） 的能力， 才能实现单剂有效和低耐药。
但到目前为止， 以 Bcl-2为靶点的抗肿瘤药物尚无上市产品， 仅有的 19个临床前 Bcl-2 抑制剂中， 有三个效果最优的分别处于临床 I， II， III期。 分别是： 由美国伊利诺州阿伯特实 验室研发的 ABT-737, Gemin X公司研发的 Obatoclax ( GX15-070) ， 和美国 Ascenta公司的 AT-101。 它们都是 BH3类似物， 与 Bcl-2蛋白的竞争结合常数达到 nM级， 远远高于其它 15 个同类分子。但是它们都存在不足： Gossypol, Obatoclax的 BH3类似程度不足， 不是绝对的 BH3类似物， 也就是具有不依赖 BAX/BAK的细胞毒性， 说明存在其他的作用靶点， 因此具 有毒副作用。 ABT-737虽然是特异性最高的 BH3类似物， 但是不能拮抗和结合 Mcl-1蛋白， 不是广谱的 Bcl-2家族蛋白抑制剂， 因而严重限制了其适用的病种。
本发明人既往研究的成果中公开了一系列 8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈的苊并杂环类化 合物， 并且这类化合物具有通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤生长的活性 （CN1304370C) 。 然而， 作为潜在的以凋亡为基础的抗肿瘤药物， 其开发同样面对此类药物开发的难点： 凋亡信号通 路复杂及潜在的强烈的细胞毒性及其所必然导致的用药的盲目性， 而这是导致该类药物的开 发失败的重要原因。 因此， 研究中需要突出强调药物作用的靶向性。 发明内容
本发明旨在获得靶向性更强的可作为 ΒΗ3类似物的 Bcl-2家族蛋白（包括 Bcl-2和 Mcl-1 蛋白）抑制剂的化合物。
本发明的目的之一在于提供一类苊并杂环类化合物，所述化合物具有下述通式 I的结构：
Figure imgf000004_0001
I
通式 I中：
R1选自 H、 硫吗啉基和 XR4;
R2选自（CH2)nZ和 (CH2)nPh -( m,/?)Z，所述的 Z选自 N02、 Ph、 CF3、 OCH3、 SCH3、 NH2、 NHCH3、 N(CH3)2和直链或支链的取代或未取代的 -¾烷基， 所述的取代基是卤素、 氨基、 羟基、 酯基或羧基；
R3选自（CH2)n W， 所述的 W选自 H、 CN、 N02、 NH2、 COOH、 CHO、 OH禾 B S03H; 式 I的化合物中所述的 R4选自 （CH2)nY、噻吩甲基、四氢吡喃基、四氢噻喃基和 (CH2)nPh -(o,m,p)Y; 其中所述的 Y是直链或支链的取代或未取代的 d-C8烷基， 所述的取代基是卤素、 氨基、 羟基、 酯基或羧基；
式 I的化合物中所述的 X是 0、 s、 氨基、 羰基、 酯基、 酰胺或磺酰胺；
式 I的化合物中所述的 n为 0〜4的整数。
作为优选的技术方案， 上述式 I 的化合物中所述的 Z 是直链或支链的取代或未取代的 d-C4烷基。 更为优选地， 所述的 R2是 (CH2)4Ph -(o,m,p)Z, 其中 Z是直链或支链的取代或未 取代的 d-C3烷基。
进一步优选技术方案中， 上述式 I的化合物中所述的 W是 H、 NH2或 OH。更为优选地， 所述的 X是 0或8。 最为优选的， 所述的 R4是 Ph -( m,/ )Y， 其中 Y选自 Ph、 CF3、 OCH3、 SCH3、 NH2、 Br、 异丙基、 异丁基和仲丁基。
进一步的优选技术方案中， 上述本发明的式 I的化合物选自：
9-正丁氨基 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮，
9-正己氨基 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮，
9- ( 3-苯基丙氨基） -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮，
3-乙氧基 -9- ( 3-苯基丙氨基） -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮，
3-苯甲酰基 -9-正丁氨基 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮，
9-(N-甲基丁基 -1-氨基) -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮，
3- (4-溴苯硫基） -9-正丁氨基 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮，
3- (4-溴苯硫基） -9- ( 3-苯基丙氨基） -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮，
3-硫吗啉基 -9-正丁氨基 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮， 3-硫吗啉基 -9- (3-苯基丙氨基） -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮，
3- (4-异丙基苯氧基） -9-正丁氨基 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮，
3- (4-异丙基苯氧基） -9- (3-苯基丙氨基） -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮。
本发明的目的之二在于提供一种上述式 I 的化合物的制备方法， 是式 i 的化合物与 NH2CHR2R3在常温下反应 0.5〜8 h,
Figure imgf000005_0001
其中化合物 i与 NH2CHR2R3的投料摩尔比为 1 : 5， 反应溶剂为乙腈。
上述本发明所提供的式 I的化合物中制备方法中， 各个取代基的定义与前述对式 I的化 合物中取代基的定义一致。
本发明的上述式 I的化合物的合成方法是以一种温和的方法取代氰基的合成路线， 利用 亲核试剂伯胺类化合物与 8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈及其衍生物反应， 得到本发明的一系 列氨基取代苊并杂环类化合物。 反应式如下：
Figure imgf000005_0002
I
在既往一系列本发明的苊并杂环类化合物的基础上， 本申请的发明人经过分析及试验， 筛选出上述一系列的新的具有通式 I的化合物。 这些化合物具有共同的取代特征， 即 9位由 (取代） 氨基取代。 统计的结果显示： 这类化合物与既往公开的化合物相比， 有更高的 BH3 相似性， 在制备 BH3类似物 Bcl-2家族蛋白抑制剂中具有相当的应用前景。
本发明再一方面的目的在于提供又一系列苊并杂环类化合物， 具有下述通式 II的结构：
Figure imgf000005_0003
通式 π中：
R5、 R6和 R7各自独立地选自 X R9和 H;
R8选自 CN、 COOH、 COO R10禾口 CONH R10;
当所述的 X是 0、 羰基、 酯基、 酰胺基或磺酰胺基时；
所述的 R9选自 (CH2)nY和 (CH2)nPh -(ο,ηι,ρ)Ύ, 所述的 Υ选自直链或支链的 C2-C8烷基、 取代的直链或支链的 d-C8烷基， 所述的取代基选自卤素、 氨基、 羟基、 酯基和羧基；
所述的 R1Q选自取代或未取代的直链或支链的 CrC6烷基，所述的取代基选自卤素、氨基、 羟基、 酯基、羧基或 (CH2)n Ph - ( o, m, p) Z， 其中 Z 选自 -CH3、 -C2H5、 -N02、 -Ph、 -F、 -CK -Br、 -CF3、 -OCH3、 -SCH3、 -NH2和 -N(CH3)2;
当所述的 x是 s时；
所述的 R9选自 （CH2)nPh -(o, m, p)Y,所述的 Y选自直链或支链的 C2-C8烷基、取代的直 链或支链的 d-C8烷基， 所述的取代基选自卤素、 氨基、 羟基、 酯基和羧基；
所述的 R1Q选自取代或未取代的直链或支链的 CrC6烷基，所述的取代基选自卤素、氨基、 羟基、 酯基、羧基或 (CH2)n Ph - ( o, m, p) Z， 其中 Z 选自 -CH3、 -C2H5、 -N02、 -Ph、 -F、 -CK -Br、 -CF3、 -OCH3、 -SCH3、 -NH2和 -N(CH3)2;
上述通式 II的化合物中， η为 0〜4的整数。
优选的技术方案中， 上述通式 Π的化合物中所述的 R5和 R6分别是 X R9和 Η。
再一优选技术方案中， 上述通式 Π的化合物中所述的 R8是 CN。
又一优选的技术方案中， 上述通式 Π的化合物中所述的 R9是 (CH2)nPh -( m, / )Y。 进一 步优选 X是 0或 S， Y是直链或支链的 C3-C5烷基。 最优选 Y是异丙基、 异丁基或仲丁基。
更为优选地， 上述本发明的通式 Π的化合物选自：
3- ( 4-仲丁基苯氧基） —8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈；
4- ( 4-仲丁基苯氧基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈；
3- ( 4-异丁基苯氧基） —8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈；
4- ( 4-异丁基苯氧基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈；
3- ( 4-异丙基苯氧基） —8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈；
3- ( 4-异丁基苯硫基） —8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈；
4- ( 4-异丁基苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈；
3- ( 4-异丙基苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈；
3- ( 4-仲丁基苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈。
本发明的再一目的在于提供一种上述通式 Π的化合物的制备方法， 经下述 a或 b途径： a. 以 8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈为原料， 与亲核试剂醇， 酚， 酯， 酰胺发生反应， 温 度为 20〜100°C， 反应时间 0.5〜24小时， 反应完成后蒸出溶剂， 柱层析得到 3-取代、 6-取代 或者 3，6-位双取代的 8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 腈基再经过水解， 酯化或酰胺化得本发 明的通式 Π的苊并杂环类化合物； 反应式如下：
Figure imgf000007_0001
b. 以苊醌为原料， 加入液溴回流 2小时， 得到溴代苊醌； 再与醇， 酚， 酯， 酰胺反应得 到相应的取
Figure imgf000007_0002
取代苊醌 （式 iv ) 与乙腈在硅胶弱酸性催化的条件下反应得到通式为 ii或 iii的化合物， 化合物 ii或 在 03催化， 乙腈回流 0.5〜6 h冷却后减压蒸除部分溶剂后， 过滤或柱层析 制得 3位或 4位取代的 8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈； 再经过水解， 酯化或酰胺化得本发明 的通式 Π的苊并杂环类化合物， 如下反应式：
Figure imgf000007_0003
上述本发明所提供的对通式 Π的化合物的制备方法中，各个取代基的定义与前述对通式 II的化合物中取代基的定义一致， 所述及的取代基 R在反应中进入不同的取代位置后区别为 R5或 R6。
在既往一系列本发明的苊并杂环类化合物的基础上， 本申请的发明人经过分析及试验， 筛选出上述一系列的新的通式 π的化合物。 这些化合物具有与既往公开的化合物相比相当或 更优异的 ΒΗ3相似性， 在制备 ΒΗ3类似物 Bcl-2家族蛋白抑制剂中具有相当的应用前景。
基于此，本发明的再一目的在于提供本发明的苊并杂环类化合物在制备 BH3类似物 Bcl-2 家族蛋白抑制剂中的应用。 包括将本发明的上述具有通式 I或通式 Π的化合物以有效剂量与 通常可选的药用辅料配合制剂的步骤， 按照本发明实施例的检测结果， 本发明所述及的化合 物在此应用中所需的有效剂量可能远低于现有技术中公开的化合物。 更进一步， 本发明的目 的还在于提供本发明的苊并杂环类化合物在制备高靶向性抗肿瘤药物中的应用。 附图说明
本发明附图 13幅， 其中：
附图 1是 ELISA方法检测化合物 1与 FAM-Bid肽段竞争结合 Bcl-2蛋白的动力学曲线； 附图 2是 ELISA方法检测化合物 1与 FAM-Bid肽段竞争结合 Mcl-1蛋白的动力学曲线； 附图 3是荧光偏振方法检测化合物 13与 FAM-Bid肽段竞争结合 Bcl-2蛋白的动力学曲 线；
附图 4是荧光偏振方法检测化合物 13与 FAM-Bid肽段竞争结合 Mcl-1蛋白的动力学曲 线；
附图 5是不同浓度的化合物 1在细胞水平上干扰 Bcl-2/Bax之间相互作用结果示图； 附图 6是化合物 1在细胞水平以不同的作用时间干扰 Bcl-2/Bax之间相互作用结果示图； 附图 7是 Bax蛋白与线粒体共定位检测化合物 1的 BH3类似度阳性结果示图； 附图 8是 Bax蛋白与线粒体共定位检测化合物 1的 BH3类似度阴性结果示图； 附图 9是化合物 1依赖 BAX/BAK的细胞毒性实验结果， 其中 Gossypol为非特异性对 昭.
附图 10是化合物 1对 Mcl-1抑制作用 Western 印记检测电泳图；
附图 11是化合物 1对 Bcl-2抑制作用 Western 印记检测电泳图；
附图 12是化合物 1抑制 Mcl-1蛋白作用半定量曲线；
附图 13是化合物 1抑制 Bcl-2蛋白作用半定量曲线。 具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方 式限制本发明。 第一部分： Bcl-2家族蛋白抑制剂化合物制备及其表征实施例；
实施例 1: 9-正丁氨基 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -8-酮（化合物 1 ) 的合成及表征
Figure imgf000009_0001
50 mL乙腈中加入 0.23 g 8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 0.49 mL正丁胺， 常温反应 1 h 后， 减压蒸出溶剂， 硅胶柱分离， 得到化合物 1， 产率 22%。
结构表征： M.p. 232-233 °C . 1H NMR (400M, CDC13): δ 8.63 (d, J= 8.0 Ηζ, 1Η)， 8.16 (d， J = 8.0 Ηζ, 1Η)， 8.13 (d, J= 8.4 Ηζ, 1Η)， 7.95 (d, J = 8.0 Ηζ, 1Η)， 7.75 (t， J= 8.0 Ηζ, 1Η)， 7.67 (t, J = 8.0 Ηζ, 1Η)， 4.08 (m， 2Η), 2.71 (br， 1Η)， 1.85 (m， 2Η), 1.55 (m， 2Η), 0.98 (t, J = 8.0 Ηζ, 3Η). TOF MS (EI+): C18H16N20， (m/z): calcd for 276.1263, found 276.1266. 实施例 2: 9-正己氨基 - 表征
Figure imgf000009_0002
50 mL乙腈中加入 0.23 g 8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 0.51 mL正己胺， 常温反应 1 h 后， 减压蒸出溶剂， 硅胶柱分离， 得到化合物 2， 产率 25%。
结构表征： mp: 234-235 °C . 1H NMR (400 M, CDC13): 3 8.65 (d, J= 8.0 Ηζ, 1Η)， 8.10 (d，J = 8.0 Ηζ, 1Η)， 8.05 (d, J= 8.4 Ηζ, 1Η)， 7.98 (d, J= 8.0 Ηζ, 1Η)， 7.63 (t， J= 8.0 Ηζ, 1Η)， 7.47 (t, J = 8.0 Ηζ, 1Η), 4.09 (m， 2Η), 3.69 (br， 1Η), 1.84 (m， 2Η), 1.55-1.25 (m， 6Η), 0.95 (t, J = 8.0 Ηζ, 3H). TOF MS (EI+): C20H20N2O, (m/z): calcd for 304.1576, found 304.1579. 实施例 3: 9-(3-苯基丙 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -8-酮（化合物 3) 的合成及表征
Figure imgf000009_0003
50毫升乙腈中加入 0.23 g 8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 0.77 mL 3-苯基丙胺， 常温反应 2小时。 反应完成后， 减压蒸出部分溶剂， 层析柱分离得到化合物 3， 产率 20%。
结构表征： M.p. 252-253 °C . 1H NMR (400 M, CDC13): 3 8.61 (d, J= 8.0 Ηζ, 1Η)， 8.09 (d， J = 8.0 Hz, 2H), 7.73 (t， J= 8.0 Hz, 2H), 7.54 (t， J= 8.0 Hz, 1H)， 7.47 (d, J= 8.0 Hz, 1H)， 7.34 (m， 3H): 7.16 (d， J = 8.0 Hz, 1H), 5.9 (br， 1H), 4.09 (m， 2H), 1.84 (m， 2H), 1.25 (m， 2H). TOF MS (EI+): C23H18N20， (m/z): calcd for 338.1419, found 338.1415. 实施例 4: 3-乙氧基 -9- (3- 物 4) 的合成及表征
Figure imgf000010_0001
50毫升乙腈中加入 0.27 g 3-乙氧基 -8-氧 -8H苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 0.77 mL 3-苯基丙胺， 常温反应 2小时。 反应完成后， 减压蒸出部分溶剂， 层析柱分离得到化合物 4， 收率 30%。
结构表征： M.p. 250-251 °C . 1H NMR (400M, CDC13): δ 8.55 (d, J = 8.0 Ηζ, 1Η)， 8.42 (d， J = 8.0 Ηζ, 1Η)， 7.82 (t， J= 8.4 Ηζ, 1Η)， 7.79 (d, J = 8.0 Ηζ, 1Η)， 7.41 (t, J = 8.4 Ηζ, 2Η), 7.30 (d, J = 8.4 Ηζ, 2Η), 7.12 (t, J = 8.4 Ηζ, 1Η)， 6.60 (d, J = 8.4 Ηζ, 1Η)， 4.62 (q, J = 7.6Ηζ, 2Η), 2.87 (t, J = 8.4 Ηζ, 2Η), 2.62 (ί, J = 8.4 Ηζ, 2Η), 2.09 (m， J = 8.4 Ηζ, 2Η), 2.01 (br， 1Η)， 1.31 (t, J = 7.6 Ηζ, 3Η). TOF MS EI+: C24H20N2O2， (m/z): calcd for 382.1681, found 382.1683. 实施例 5: 3-苯甲酰基 -9-正丁氨基 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -8-酮（化合物 5) 的合成及表征
50毫升乙腈中加入 0.33 g 3-苯甲酰基 -8-氧 -8H苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 0.47 mL正丁胺，常 温反应 2小时。 反应完成后， 减压蒸出部分溶剂， 层析柱分离得到化合物 5， 收率 20%。
Figure imgf000010_0002
结构表征： M.p. 262-263 。C . 1H NMR (400M, CDC13): δ 8.96 (d, J= 8.0 Ηζ, 1Η)， 8.56 (d, J = 8.0 Ηζ, 1Η)， 8.15 (d, J= 8.4 Ηζ, 1Η)， 8.01 (t， J= 8.0 Ηζ, 1Η)， 7.81 (d, J= 8.4 Ηζ, 1Η)， 7.80 (d, J = 8.4 Ηζ, 2Η), 7.68 (t, J= 8.4 Ηζ, 1Η)， 7.48 (t, J= 8.4 Ηζ, 2Η), 3.87 (t, J= 8.4 Ηζ, 2Η), 2.01 (br， 1Η)， 1.62 (m，， 2Η), 1.30 (m， 2Η), 0.91 (t， J = 7.6 Ηζ, 3Η). TOF MS EI+: C24H20N2O2， (m/z): calcd for 380.1525, found 380.1523. 实施例 6: 9-(N-甲基丁基 - -氨基) -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -8-酮（化合物 6) 的合成及表征
Figure imgf000011_0001
50 mL乙腈中加入 0.23 g 8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 0.51 mL N-甲基丁基小胺， 常温 反应 l h后， 减压蒸出溶剂， 硅胶柱分离， 得到化合物 6， 产率 25%。
结构表征： mp: 245-246 °C . 1H NMR (400M, CDC13): δ 8.45 (d, J = 8.0 Ηζ, 1Η)， 8.30 (d， J = 8.0 Ηζ, 1Η)， 8.05 (d, J= 8.4 Ηζ, 1Η)， 7.98 (t， J= 8.0 Ηζ, 1Η)， 7.87 (d, J = 8.0 Ηζ, 1Η)， 7.63 (t, J = 8.0 Ηζ, 1Η)， 3.09 (s， 3Η), 2.55 (t, J = 8.0 Ηζ, 2Η), 1.39 (m， 2Η), 1.29 (m， 2Η), 0.95 (t， J = 8.0 Hz, 3H). TOF MS (EI+): C19H18N20， (m/z): calcd for 290.1419, found 290.1415. 实施例 7: 3-(4-溴苯硫基) -9-正丁 基 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -8-酮（化合物 7) 的合成及表征
Figure imgf000011_0002
50 mL乙腈中加入 0.42 g 3-(4-溴苯硫酚) -8-氧 -8H苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 0.47 mL正丁胺， 常温反应 2 h后， 减压蒸出溶剂， 硅胶柱分离得到化合物 7， 产率 23%。
结构表征： mp: 245-246 °C . 1H NMR (400M, CDC13): δ 8.74 (br, 1Η),8.57 (d， J= 8.0 Hz, 1H)， 8.47 (d, J= 8.0 Hz, 1H)， 8.44 (d, J= 8.0 Hz, 1H)， 7.88 (t， J= 8.0 Hz, 1H)， 7.63 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.56 (d, J= 8.0 Hz, 1H)， 7.38 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 3.89 (m， 2H), 1.75 (m， 2H), 1.41 (m， 2H), 0.94 (t， J= 8.0 Hz, 3H). TOF MS (EI+): C24H19BrN2OS， (m/z): calcd for 462.0401, found 462.0405. 实施例 8: 3-(4-溴苯硫基) -9-(3-苯基丙氨基) -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -8-酮（化合物 8)的合成及表 征
Figure imgf000012_0001
50毫升乙腈中加入 0.42 g 3-(4-溴苯硫酚) -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 0.77 mL 3-苯基 丙胺， 常温反应 2小时。 反应完成后， 减压蒸出部分溶剂， 层析柱分离得到化合物 8， 产率 19 %。
结构表征： M.p.272-273 °C . 1H NMR (400 M， CDC13): δ 8.57 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.47 (d, J = 8.0 Hz, 1H)， 8.44 (d， J = 8.0 Hz, 1H)， 7.88 (t， J = 8.0 Hz, 1H)， 7.63 (m， 4H)， 7.56 (d， J = 8.0 Hz, 1H), 7.47 (m， 3H), 7.38 (d, J = 8.0 Hz, 2H), δ 6.74 (br， 1H)， 3.89 (m， 2H), 1.75 (m， 2H), 1.41 (m， 2H ). TOF MS (EI+): C29H21BrN2OS， (m/z): calcd for 524.0588, found 524.0585. 实施例 9: 3-硫吗啉基 -9-正丁 合物 9) 的合成及表征
Figure imgf000012_0002
50 mL乙腈中加入 0.33 g 3-硫吗啉基 -8-氧 -8H苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 0.47 mL正丁胺， 常 温反应 2.5 h后， 减压蒸出溶剂， 硅胶柱分离得到化合物 9， 产率 25 %。
结构表征： mp: 239-240 °C . 1H NMR (400 M, CDC13): ^ 8.59 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 8.32 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.00 (d， J = 8.4 Hz, 1H), 7.68 (t， J = 8.0 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.35 (br, 1H), 4.01 (m,-NHCH2CH2-, 2H), 3.51 (br s， -N(CH2CH2)2S)， 2.97 (br s， -N(CH2CH2)2S), 1.84 (m， -NH CH2CH2CH2-, 2H), 1.50 (m， -CH2CH20¾CH2， 2H), 0.95 (t, J = 8.0 Hz, 3H). TOF MS (EI+): C22H23N3OS, (m/z): calcd for 377.1562, found 377.1565. 实施例 10: 3-硫吗啉基 -9-(3-苯基丙氨基) -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -8-酮（化合物 10) 的合成及表 征
Figure imgf000013_0001
50毫升乙腈中加入 0.33 g 3-硫吗啉基 -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 0.77 mL 3-苯基丙 胺， 常温反应 2.5小时。 反应完成后， 减压蒸出部分溶剂， 层析柱分离得到化合物 10， 产率 18 %。
结构表征： M.p. 265-266 °C . 1H NMR (400 M, CDC13): ^ 8.58 (d, J= 8.0 Ηζ, 1Η), 8.34 (d, J = 8.0 Ηζ, 1Η)， 8.08 (d, J = 8.4 Ηζ, 1Η)， 7.68 (m， 4Η)， 7.16 (m， 3Η), 5.05 (br， 1Η)， 4.00 (m， 2Η), 3.52 (br s， -N(CH2CH2)2S), 2.89 (br s， -N(CH2CH2)2S), 1.85 (m， 2H), 1.56 (m， 2H). TOF MS (EI+): C27H25N3OS， (m/z): calcd for 439.1718, found 439.1715. 实施例 11: 3-(4-异丙基苯氧基 )-9-正丁氨基 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -8-酮（化合物 11 ) 的合成及 表征
50 mL乙腈中加入 0.36 g 3-(4-异丙基苯氧基 8-氧 -8H苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 0.47 mL正 丁胺， 常温反应 3 h后， 减 产率 23%。
Figure imgf000013_0002
结构表征： mp: 243-244 °C . 1H NMR (400 M， CDC13): δ 8.69 (d, J = 8.0 Hz, 1H)， 8.47 (d, J = 8.0 Hz, 1H)， 8.08 (d, J= 8.0 Hz, 1H)， 7.69 (t， J= 8.0 Hz, 1H)， 7.32 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.09 (d, J = 8.0 Hz, 1H)， 6.90 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.13 (br, 1H)， 4.08 (m， 2H), 2.97 (m， 1H)， 1.85 (m， 2H), 1.55 (m， 2H), 1.02 (s, 6H)， 0.88 (t, J = 8.0 Hz, 3H). TOF MS (EI+): C27H26N202， (m/z): calcd for 410.1994, found 410.1998. 实施例 12: 3-(4-异丙基苯氧基 )-9-(3-苯基丙氨基) -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -8-酮（化合物 12)的合 成及表征
Figure imgf000014_0001
50毫升乙腈中加入 0.36 g 3-(4-异丙基苯氧基 8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 0.77 mL 3- 苯基丙胺， 常温反应 3小时。 反应完成后， 减压蒸出部分溶剂， 层析柱分离得到化合物 12， 产率 19%。
结构表征： M.p.275-276 °C.1H NMR (400 M， CDC13): δ 8.59 (d， J= 8.0 Ηζ, 1Η)， 8.46 (d,J = 8.0 Ηζ, 1Η)， 7.98 (t,J= 8.0 Ηζ, 1Η)， 7.65 (d,J= 8.0 Ηζ, 1Η),7.46 (d,J= 8.0 Ηζ, 2Η), 7.39 (t,J = 8.0 Ηζ, 2Η), 7.31-7.26 (m， 5Η)， 6.80 (d,J= 8.0 Ηζ, 1Η)， 5.13 (br， 1Η)， 3.88 (m， 2Η), 2.95 (m， 1Η)， 1.75 (m， 2Η), 1.41 (m， 2Η ).1.85 (m， 2Η), 1.55 (m， 2Η), 1.02 (s， 6Η), TOF MS (EI+): C32H28N202， (m/z): calcd for 472.2151, found 472.2156. 实施例 13: 3- (4-仲丁基苯氧基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -9-腈（化合物 13)和 4- (4-仲丁 基苯氧基）苯氧基 -8- -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -9-腈（化合物 14) 的合成及表征
Figure imgf000014_0002
称取 0.99 g 5- (4-仲丁基苯氧基）苊醌， 0.33 g丙二腈用二氯甲烷溶解之后， 加入硅胶柱 中， 快速淋洗， 柱色谱分离后旋干得红色固体。 称重 1.07 g， 产率 94%。 取 0.77 g所得红色 固体， 加入 0.05gK2CO3， 20 ml乙腈加热回流 3小时， 反应完毕之后旋干反应液。 层析柱分 离 (CH2C12: 石油醚 =1: 1) 得到两种同分异构体。
化合物 13: M.p.219-220 °C.1H NMR (400M, CDC13): δ 8.92 (d， J= 8.0 Hz, 1H), 8.65(d， J = 8.8 Hz, 1H), 8.46 (d， J= 8.0 Hz, 1H), 7.87 (t， J= 8.0 Hz, 1H), 7.33 (d， J= 8.4 Hz, 2H), 7.14(d,J = 8.4 Hz, 2H), 7.04 (d,J= 8.0 Hz, 1H), 2.70 (m， 1H), 1.65 (m， 2H), 1.30 (d,J= 8.0 Hz, 3H), 0.88 (t， J= 8.0 Hz, 3H). TOF MS (EI+): C25H18N202， (m/z): calcd for 378.1368, found 378.1376.
化合物 14: M.p.278-279 °C.1H NMR (400M, CDC13): δ 8.76 (d,J= 7.6 Hz, 1H), 8.60 (d,J = 8.0 Hz, 1H)， 8.42 (d, J= 7.6 Hz, 1H)， 7.88 (t， J= 8.0 Hz, 1H)， 7.40 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.09 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.95 (d， J= 8.0 Hz, 1H), 2.70 (m， 1H), 1.65 (m， 2H), 1.30 (d,J= 8.0 Hz, 3H), 0.88 (t， J= 8.0 Hz, 3H). TOF MS EI+: C25H18N202， (m/z): calcd for 378.1368, found 378.1362. 实施例 14: 3- (4-异丁基苯氧基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -9-腈（化合物 15)和 4- (4-异丁 基苯氧基）苯氧基 -8-氧 表征
Figure imgf000015_0001
称取 0.99 g 5- (4-异丁基苯氧基）苊醌， 0.33 g丙二腈用二氯甲烷溶解之后， 加入硅胶柱 中， 快速淋洗， 柱色谱分离后旋干得红色固体。 称重 1.07 g， 产率 94%。 取 0.77g所得红色 固体， 加入 0.05gK2CO3， 20 ml乙腈加热回流 3小时， 反应完毕之后旋干反应液。 层析柱分 离 (CH2C12: 石油醚 =1: 1) 得到两种同分异构体。
化合物 15: M.p.214-215 °C.1H NMR (400 M， CDC13): δ 8.78 (d,J= 7.6 Hz, 1H), 8.60(d， J = 8.0 Hz, 1H)， 8.43 (d, J= 7.6 Hz, 1H)， 7.67 (t， J= 8.0 Hz, 1H)， 7.29 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.12(d,J = 8.0 Hz, 2H), 6.95 (d, J= 8.0 Hz, 1H)， 2.42 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 1.75 (m， 1H)， 0.75 (d,J= 8.0 Hz, 6H). TOF MS (EI+): C25H18N202， (m/z): calcd for 378.1368, found 378.1365.
化合物 16: M.p.273-274 °C.1H NMR (400 M， CDC13): δ 8.72 (d,J= 7.6 Hz, 1H), 8.53 (d， J = 8.0 Hz, 1H)， 8.38 (d,J= 7.6 Hz, 1H)， 7.98 (t，J= 8.0 Hz, 1H)， 7.31 (d,J= 8.0 Hz, 2H), 7.02 (d， J = 8.0 Hz, 2H), 6.80 (d， J= 8.0 Hz, 1H), 2.43 (d,J= 8.0 Hz, 2H), 1.75 (m， 1H), 0.75 (d,J= 8.0 Hz, 6H). TOF MS EI+: C25H18N202， (m/z): calcd for 378.1368, found 378.1363. 实施例 15: 3-(4-异丙基苯 17) 的合成及表征
Figure imgf000016_0001
50 ml乙腈中加入 1 g8-氧 -8H苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 0.54 g对异丙基苯酚， 回流 3小时， 蒸出溶剂， 层析柱分离得化合物 17， 收率 30%。
化合物 17： M.p. 272-274 °C； 1H NMR (400 M, CDC13): δ 8.92 (d， J=8.0 Ηζ, 1Η)， 8.25 (d， J=8.8 Ηζ, 2Η), 8.44 (d， J=8.0 Hz, 1H)， 7.86 (t， J=8.0 Hz, 1H)， 7.38 (d， J=8.4 Hz, 2H), 7.14 (d， J=8.4 Hz, 2H), 7.04 (d, J=8.8 Hz, 1H)， 3.01 (m， 1H)， 1.32 (d, J=8.0 Hz, 6H); TOF MS EI+(m/z): C24H16N202， 计算值： 364.1212, 实测值： 364.1215。 实施例 16: 3- (4-异丁基苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -9-腈（化合物 18)和 4- (4-异丁 基苯硫基）苯氧基 -8- -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -9-腈（化合物 19) 的合成及表征
Figure imgf000016_0002
称取 1.04 g对特戊基苯氧基苊醌， 0.33 g丙二腈用二氯甲烷溶解之后， 加入硅胶柱中， 快速淋洗， 柱色谱分离后旋干得红色固体。 称重 0.99 g， 产率 84%。取 0.79 g所得红色固体， 加入 0.05 g K2C03， 20 ml 乙腈加热回流 3 小时， 反应完毕之后旋干反应液。 层析柱分离 (CH2C12: 石油醚 =1 : 1 ) 得到两种同分异构体。 化合物 18: M.p. 234-235 。C . lU NMR (400M, CDC13): δ 8.58 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 8.41 (d，J = 8.0 Hz, 1H)， 8.30 (d, J= 7.6 Hz, 1H)， 7.53 (t， J= 8.0 Hz, 1H)， 7.31 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.02 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 8.0 Hz, 1H)， 2.75 (m， 1H)， 1.69 (m， 2H), 1.29 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 0.92 (t， J= 8.0 Hz, 3H). TOF MS (EI+): C25H18N2OS， (m/z): calcd for 394.1140, found 394.1142.
化合物 19: M.p. 282-283 °C . 1H NMR (400M, CDC13): δ 8.55 (d, J= 7.6 Hz, 1H)， 8.39 (d，J = 8.0 Hz, 1H)， 8.15 (d, J= 7.6 Hz, 1H)， 7.92 (t， J= 8.0 Hz, 1H)， 7.45 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.13 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.02 (d, J= 8.0 Hz, 1H)， 2.75 (m， 1H)， 1.69 (m， 2H), 1.29 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 0.92 (t， J= 8.0 Hz, 3H). TOF MS EI+: C25H18N2OS， (m/z): calcd for 394.1140, found 394.1137. 实施例 17: 3-(4-异丙基苯 合物 20) 的合成及表征
Figure imgf000017_0001
50mL乙腈中加入 0.69 g 8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 1.82 g对丙基苯硫酚， 常温反应 3小时， 蒸出溶剂， 层析柱分离得化合物 20， 收率 50%。
结构表征: M.p.214-215 °C . 1H NMR (400 MHz, CDC13): δ 8.57 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 8.47 (d， J = 8.4 Hz, 2H), 7.92 (d， J= 8.0 Hz, 1H)， 7.87 (d, J = 8.0 Hz, 1H)， 7.61 (t， J = 8.0 Hz, 1H)， 7.31 (t， J = 9.2 Hz, 2H), 7.22 (d, J = 8.4 Hz, 1H)， 2.87 (m， 1H)， 1.2 (d, J=8.0Hz, 6H). TOF MS (EI+): C24H16N2OS， (m/z): calcd for 380.0983, found 380.0985. 实施例 18: 3-(4-仲丁基 -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -9-腈 (化合物 21)的合成及表征
Figure imgf000017_0002
50mL乙腈中加入 0.69 g 8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 1.99 g对仲丁基苯硫酚， 常温反 应 3小时 ， 蒸出溶剂， 层析柱分离得化合物 21， 收率 42%。 结构表征： M.p.245-246 °C.1H NMR (400M, CDC13): δ 8.85 (d,J= 8.0 Hz, 1H), 8.22 (d,J = 8.0 Hz, 1H)， 8.07 (d, J= 8.4 Hz, 1H)， 7.68 (t， J= 8.0 Hz, 1H)， 7.53 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.12 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 2.55 (m, 1H)， 1.55 (m， 2H),1.31 (d,J=8.0Hz, 3H), 0.89 (t, J = 8.0 Hz, 3H)，. TOF MS (EI+): C25H18N2OS， (m/z): calcd for 394.1140, found 394.1137. 实施例 19: 6- (4-丙基苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -9-腈 (化合物 22)的合成及表征
Figure imgf000018_0001
50mL乙腈中加入 0.69g8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 1.82 g对丙基苯硫酚， 常温反应 3小时， 蒸出溶剂， 层析柱分离得化合物 22， 收率 32%。
结构表征： M.p.257-259°C.1Η NMR (400M, CDC13): δ 8.32 (d, J= 8.8Ηζ, 1Η), 8.11 (d，J = 8.8Ηζ， 1Η)， 7.95 (d,J= 8.8Ηζ， 1Η)， 7.85 (d,J= 8.0Ηζ， 1Η)， 7.57 (d,J= 8.4Ηζ， 2Η), 7.50 (t,J = 8.4Ηζ， 1Η)， 7.06 (d,J= 8.4Ηζ， 2Η), 2.87 (m， 1Η)， 1.2 (d， J=8.0Hz, 6Η). TOF MS EI+: C24H16N2OS, (m/z) calcd for 380.0983, found 380.0987. 实施例 20: 3,6-二 （4-仲丁基苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -9-腈（化合物 23) 的合成及 表征
Figure imgf000018_0002
50mL乙腈中加入 1.0g8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 2.9 g对仲丁基苯硫酚， 常温反应 30 小时， 蒸出部分溶剂， 层析柱分离得化合物 23， 收率 20%。
结构表征： M.p.268-269 °C.1H NMR (400M, CDC13): δ 8.12 (d,J= 8.8Ηζ， 1Η)， 7.60 (d,J = 8.8Ηζ， 1Η)， 7.51 (d,J= 8.0Ηζ， 4Η)， 7.48 (d,J= 8.8Ηζ， 1Η)， 7.23 (d,J= 8.8Ηζ， 1Η)， 7.08 (d,J = 8.0Hz, 4Η)， 2.55 (m， 2Η), 1.52 (m， 4Η)， 1.25 (d,J= 8.0Hz, 6H)， 0.78 (t， J= 8.0Hz, 6H). TOF MS EI+: C35H30N2OS2, (m/z): calcd for 558.1800, found 558.1803. 实施例 21: 3-[(4-胺甲基)苯甲酰基】 -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -9-腈（化合物 24)和 4- [(4-胺甲 基)苯甲酰基】 -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -9-腈（化合物 25) 的合成及表征
称取 0.95 g 5-[(4-胺甲基)苯甲酰基]苊醌， 0.33 g丙二腈用二氯甲烷溶解之后， 加入硅胶 柱中， 快速淋洗， 层析柱分离得深红色固体。 称重 0.93 g， 产率 85%。 取 0.73 g所得红色固 体， 加入 0.08 g K2C03， 20 mL乙腈加热回流 3小时， 反应完毕之后旋干反应液。 层析柱分 离 （C¾C12: 石油醚 =2: 1)得到深红色固体， 核磁检验同分异构体比例 1: 0.2。 利用制备液 相分离得到两种同分异构体。
Figure imgf000019_0001
化合物 24: Μ.ρ.289-290 °C.1HNMR(400M， CDC13): δ 8.96 (dd，J= 8.8Ηζ， 1Η)， 8.73 (d，J = 8.8Ηζ， 1Η)， 8.15 (d,J= 8.4Ηζ， 1Η)， 8.08 (t,J= 8.8Ηζ， 1Η)， 7.93 (d,J= 8.4Ηζ， 1Η)， 7.69 (d,J = 8.4Ηζ， 2Η), 7.35 (d,J= 8.4Ηζ， 2Η), 6.32 (br， 2Η), 4.36 (s， 2Η). TOF MS EI+: C23H13N302， (m/z): calcd for 363.1008, found 363.1009.
化合物 25: M.p>300°C； 1H NMR (400M, CDC13): δ 8.85 (dd， J = 8.8Hz， 1H)， 8.70 (d， J = 8.8Hz， 1H)， 8.10 (d,J= 8.4Hz， 1H)， 7.98 (t， J= 8.8Hz， 1H)， 7.86 (d,J= 8.4Hz， 1H)， 7.59 (d， J = 8.4Hz， 2H), 7.50 (d,J= 8.4Hz， 2H), 6.08 (br， 2H), 4.36 (s， 2H). TOF MS EI+: C23H13N302， (m/z): calcd for 363.1008, found 363.1005. 实施例 22: 3-己氧基 -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -9-甲酸（化合物 26) 的合成及表征
在 50 mL单口烧瓶中， 加入 60 mL浓硫酸， 在 0〜5 °C下， 分批加入 1.15 g的 3-己氧基 _8_氧 苊并 [Ub]吡咯 -9-腈， 1小时内加完， 加完后在室温继续反应 18小时， 反应混合物 为粘稠的深棕红色。 然后小心缓慢的将其滴入碎冰中， 同时剧烈搅拌， 滴完后静置， 滤饼用 大量水洗涤， 直至滤饼呈中性， 滤饼干燥后得到化合物 26， 产率 90%。
Figure imgf000020_0001
结构表征： M.p.235-237°C.1H NMR (400M, CDC13): δ 11.0 (s， 1H), 8.55 (d,J= 8.0Hz, 1H)， 8.45 (d,J= 8.0Hz, 1H)， 8.01 (t，J= 8.0Hz, 1H)， 7.71 (d,J= 8.4Hz，lH)， 6.561 (d，J= 8.4Hz， 1H)， 4.10 (t,J= 7.6Hz, 2H), 1.75 (m,J= 7.6Hz, 2H), 1.43 (m， 2H), 1.31 (m， 2H), 1.29 (m， 2H), 0.89 (t, J= 7.6Hz, 3H); TOF MS EI+: C21H19N04， (m/z): calcd for 349.1314, found 349.1316. 实施例 23: 3- (4-异丁基苯氧基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -9-甲酸乙酯（化合物 27) 的合成 及表征
Figure imgf000020_0002
在 100 mL单口烧瓶中，依次加入 3.78 g 3- (4-异丁基苯氧基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9- 甲酸， 50 mL乙腈做溶剂， 2.76 g的碳酸钾做缚酸剂， 过量 10倍的碘甲烷， 氮气保护下， 加 热至 42°C反应 18小时。 减压蒸去乙腈， 加入二氯甲烷使反应物充分溶解， 过滤之后旋干滤 液， 得黄棕色粗产品。 硅胶柱层析分离， 得到化合物 27， 产率 85%。
结构表征： M.p.215-216°C.1H NMR (400M, CDC13): δ 8.45 (d,J= 8.0Ηζ， 1Η)， 8.35 (d,J = 8.0Hz, 1Η)， 7.85 (t， J= 8.0Hz, 1H)， 7.68 (d,J= 8.4Hz， 1H)， 7.36 (d,J= 8.8Hz， 2H), 7.23 (d,J = 8.8Hz， 2H), 6.50 (d, J= 8.4Hz， 1H)， 2.45 (d, J= 8.4Hz， 2H), 1.52 (m， 2H), 1.25 (d, J= 8.4Hz， 3H), 0.93 (t， J= 8.4Hz， 3H).TOF MS EI+: C26H21N03S， (m/z): calcd for 427.1242, found 427.1245. 实施例 24: 3- (4-异丁基苯氧基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b】吡咯 -9-N-正丁基酰胺（化合物 28) 的 合成及表征
在 100 mL单口烧瓶中，依次加入 3.97 g3-(4-异丁基苯氧基）-8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9- 酸， 50 mL DMF做溶剂， 0.15 mL的三乙胺， 1.63 g的 (EtO)2P(=0)CN， 过量 10倍的正丁胺， 常温反应 1小时。 反应完毕得到黄色固体 28， 产率 35 %。
Figure imgf000021_0001
结构表征： M.p. 247 °C . 1H NMR (400M, CDC13): δ 8.49 (d, J = 8.0Hz, 1H)， 8.40 (d， J = 8.0Hz, 1H)， 7.83 (t， J = 8.0Hz, 1H)， 7.66 (d, J = 8.0Hz, 1H)， 7.46 (d, J = 8.4Hz， 2H), 7.31 (d, J = 8.4Hz， 2H), 6.63 (d， J = 8.0Hz, 1H)， 5.53 (br， 1H)， 3.21(t, J = 8.0Hz, 2H), 2.53 (m， 1H)， 1.52-1.50 (m， 7H), 1.25-1.32 (m， 5H)， 0.91 (t， J = 8.0Hz ,3H). TOF MS EI+: C25H19N203， (m/z): calcd for 395.1396, found 395.1394. 第二部分： Bcl-2家族蛋白抑制剂化合物的理化活性检测
实施例 13: 通过 ELISA方法检测化合物的 BH3类似程度
本发明人的在先研究中 （PCT/CN2010/075521 ), 使用荧光偏振的方法检测化合物与蛋白 的结合能力。 在后续的研究中发现， 由于化合物自身具有荧光， 荧光偏振方法检测过程中， 化合物的荧光会对荧光素 FAm造成干扰， 影响实验结果。 因此本申请中采用 ELISA方法检 测化合物与蛋白的结合能力。
在 ELISA专用酶标板中加入碳酸钠包被缓冲液 （0.05 M Na2C03 PH 9.0) 稀释的链霉亲 和素 100 μΙ7孔 （蛋白质含量为 10 μ§/ηΛ), 4°C过夜。 次日， 弃去孔内溶液， 用 100 μ∑的洗 涤液（NaCl 137 mM， KC1 2.7 mM, Na2HP04 4.3 mM， KH2P04 1.4 mM， 0.05% Tween-20 ) 润洗 3次之后 （以下洗涤方法相同）， 加入 100 L生物素标记的 Bim肽段， 放置 1.5-2 h， 润 洗 3次。然后加入预先孵育的不同浓度的待检测化合物 1与靶蛋白的混合溶液 (Mcl-1或 Bcl-2) 100 μΐ, 放置 l h之后润洗 3次。 加入辣根过氧化酶标记的二抗， 放置 l h之后润洗 3次。 最 后加入 TMB显色液作用 0.5 h， 加入终止液 （2 M硫酸） 终止反应。 在酶标仪上测定 450 nm 波长下各孔光吸收值， 记录结果。 用蛋白抑制率对化合物剂量对数作图求出 IC5Q值 （附图 1 和附图 2)。该化合物与 Bcl-2和 Mcl-1蛋白的竞争结合常数 (IC5Q)值分别为 142 nM和 49 nM。
按照上述相同的试验方法检测其他 11个化合物的 BH3类似程度， 它们与 Bcl-2和 Mcl-1 蛋白的结合常数 （表 1中简称结合常数） 也在 nM级， 具体结果如表 1所示。 表 1
Figure imgf000022_0001
本申请所公开的化合物与蛋白的结合能力均明显大于本发明人既往研究的成果中公开 了一系列 8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈的苊并杂环类化合物 （ WO2010054575A1； CN101423491A; J. Med. Chem, 2011,54,1101-1105； E J. Med Chem, doi: 10.1016/j.ejmech. 2011.05.062) 。 使用 spss软件进行统计学分析， 结果 值<0.05， 表明本发明的系列化合物的
Bcl-2蛋白结合常数显著低于现有技术中已经公开的系列苊并杂环类化合物的相应值；本发明 的系列化合物的 Mcl-1蛋白结合常数显著低于现有技术中已经公开的系列苊并杂环类化合物 的相应值。 实施例 14: 通过荧光偏振分析法检测化合物的 BH3类似程度
合成一个 21个氨基酸的 Bid BH3 肽段（氨基酸： 79-99： QEDIIRNIARHLAQ VGDSMDR), 并在 N端标记上 6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 （FAM) 作为荧光标签（FAM-Bid) 。 竞争结合 实验中所用的反应体系为 GST-Bcl-2蛋白 （40nM)或 Mcl-1蛋白， 和 FAM-Bid 多肽 （5nM) 溶于反应缓冲液中 （100 mM K3PO4， pH 7.5 , 100 μ g/ml 牛 γ白蛋白； 0.02%叠氮化钠） 。 在 96孔板中， 每孔加入 100 μL反应体系， 然后加入 1 不同浓度的溶于 DMSO的待检测 化合物 13的母液至实验设计所需终浓度。同时设立对照组，反应体系中只含有 Bcl-2或 Mcl-1 和 FAM-Bid (相当于 0%抑制率） 。 96孔板经过 4个小时的避光孵育后， 进行酶标仪上检测。 荧光极化值（mP)在由 530 nm波长激发产生的 485 nm发射波长下测量。竞争结合常数（ ) 值根计算公式推导得出。 该化合物与 Bcl-2和 Mcl-1蛋白的竞争结合常数 (10 值分别为 158 nM和 24 nM (附图 3和附图 4) 。
按照上述相同的试验方法检测其他 12个化合物的 BH3类似程度， 它们与 Bcl-2和 Mcl-1 蛋白的结合常数 （表 2中简称结合常数） 也在 tiM级， 具体结果如表 2所示。
表 2
Figure imgf000023_0001
实施例 15: 活细胞内荧光偏振能量转移（FRET)检测化合物的 BH3类似性
利用磷酸钙共沉淀的方法将 2 μ§ Bcl-2-CFP和 Bax-YFP质粒分别或同时转染至 Hela细 胞中， 转染 24小时后， 将细胞接种于 6孔培养板 （2xl05个 /孔）， 加入溶于 DMSO的待检测 化合物 1至终浓度 （2， 5， 10和 15 μΜ)， 药物作用 24小时后 （如附图 5 )， PBS清洗细胞 3 次， 用 GENIOS荧光酶标仪 （TECAN, Swiss)检测荧光值。 在时间依赖的实验中， 转染后的 细胞接种于 6孔板后， 加入 40 μΜ 化合物， 药物作用 3、 6和 24小时 （附图 6)， 读板检测 荧光。在只转染 Bcl-2-CFP质粒的细胞组中记录 475 nm发射波长值， 激发波长为 433 nm。在 只转染 Bax-YFP质粒的细胞组中记录 527 nm发射波长值， 激发波长为 505 nm。 对共转染 Bcl-2-CFP和 Bax-YFP质粒的细胞实验组记录 527 nm和 475 nm发射波长值，激发波长为 433 nm。 527 nm发射荧光与 475 nm发射荧光相比值即为 FRET, 将单独转染对照组的 FRET值 设为 1.0。在共转染的细胞中，由于 Bcl-2蛋白和 Bax蛋白的相互作用使得 FRET值增加至 2.0， 而随着加药浓度和时间的增加， 对两蛋白相互作用的干扰增强， FRET 随之减弱。 细胞活力 由 MTT法进行测定。 试验结果如附图 5和附图 6所示， 该化合物在 1μΜ， 作用 2小时即可 干扰 Bcl-2/Bax之间的相互作用， 呈浓度时间依赖趋势。
按照上述相同的试验方法检测其他 24个化合物， 试验证明这些化合物在不同作用浓度 和作用时间的条件下，均具有细胞内模拟 BH3-only 蛋白的作用，能明显干扰 Bcl-2/Bax之间 的相互作用。 具体结果如表 3所示。 其中浓度和时间表示测试化合物在该浓度下干扰 Bcl-2/Bax 之间的相互作用发生的时 间。
表 3
Figure imgf000024_0001
实施例 16: 通过 Bax蛋白与线粒体共定位检测化合物的 BH3类似度
利用磷酸钙共沉淀方法将 5 μ§ Bax-YFP质粒转染至 MCF-7细胞中， 转染 24小时后， 将 细胞接种于 6孔培养板 （0.2xl06个 /孔） ， 加入 10 μΜ待检测化合物 1， 作用 6小时后， PBS 清洗并同 50 nM Mito Tracker Red CMXRos (；线粒体特异探针； 红色） 避光孵育 10 min， PBS 清洗三次后， Radiance2000激光共聚焦显微镜 （Bio-Rad， USA) 扫描荧光图像。 同时进行双 通道扫描，一个通道扫描 Bax-YFP的绿色荧光，另一通道扫描指示线粒体的 CMXRos探针红 色荧光， 两通道图像相互叠加显示共定位情况。 该化合物作用下， 叠加图片呈现橘色荧光， 表示 Bax 向线粒体位移， 如附图 7所示； 对照附图 8显示不能驱动 BAX向线粒体移位， 共 定位失败的试验结果。
按照上述相同的试验方法检测其他 24个化合物，结果显示他们在不同作用浓度和作用时 间的条件下， 均具有驱动 BAX向线粒体移位的作用， 说明具有细胞内模拟 BH3-only蛋白的 作用。具体结果如表 4所示， 其中浓度和时间表示测试化合物在该浓度下模拟 BH3-only蛋白 驱动 BAX 向线粒体移位的作用发生的时间。
表 4
化合物 浓度 （μΜ) 时间 （小时）
1 1.0 3
2 0.5 3
3 0.2 2
4 3.0 4
5 5.0 5
6 4.0 4
7 0.5 3
8 0.1 1
9 0.6 3
10 0.2 1
11 0.9 3
12 0.3 2
13 5.0 4
15 5.0 3
16 4.0 3
17 1.0 1
18 5.0 4
19 3.0 3
20 5.0 3
21 2.0 2
22 5.0 3
23 1.0 3
25 6.0 4
26 5.0 5
27 2.0 3 实施例 17: 化合物依赖 BAX/BAK的细胞毒性实验验证其 BH3类似物的特性 磷酸钙共沉淀转染 3 μ§ BAX/BAK干扰质粒至 MCF-7细胞中， 转染 24小时后， 收集细 胞， Western检测 R A干扰后 BAX和 BAK蛋白表达情况， 相同处理无质粒转染的细胞组设 为对照组。 转染后的细胞接种于 96孔板中 （lxlO5个 /孔） ， 平行进行未转染质粒细胞组的对 照实验， 按实验设计浓度梯度加入待检测化合物 1， 作用 48小时后， MTT检测细胞活力， 结 果如附图 9所示， Gossypol作为非特异性 BH3类似物与本发明的化合物对比平行处理， 可见 化合物 1具有绝对依赖 BAX/BAK的细胞毒性。
按上述相同试验方法检测其他 24个化合物，通过对比检测化合物作用于转染细胞和未转 染细胞的 IC5J 变化，说明所检测化合物也均具有绝对依赖 BAX/BAK的作用特点（见表 5 )。
表 5
化合物 未转染细胞 IC5Q值 （μΜ) 转染细胞 IC5Q值 （μΜ)
1 4 >50
2 3.5 >50
3 3 >50
4 5.6 >50
5 6.5 >50
6 4.0 >50
7 1.2 >50
8 1.0 >50
9 1.3 >50
10 0.5 >50
11 4.2 >50
12 2.9 >50
13 7.5 >50
15 7.1 >50
16 8.5 >50
17 2 >50
18 6.8 >50
19 2.2 >50
20 2.1 >50
21 1.5 >50
22 1.2 >50
23 15 >50
25 6.5 >50
26 6.2 >50
27 5.6 >50 实施例 18: Western 印记检测化合物对 Mcl-l和 Bcl-2的抑制作用
(1)收集细胞样品后， 以 lxl06/50 μΐ细胞裂解液 (62.5 mM Tris-HCL pH 6.8； 2%SDS; 10%甘氨酸； 50 mM DTT; 0.01%溴酚蓝） 低温裂解， 离心， 取蛋白上清， 100 °C煮沸样品 5 分钟， 12% SDS-PAGE电泳并转膜， 相应抗体检测目的蛋白， 辣根过氧化酶标记二抗并结合 ECL显色法检测目的蛋白在细胞中的表达量。 附图 10和附图 11分别显示待检测化合物 1对 Mcl-l和 Bcl-2的抑制作用。 从图中可以看出， 随着待测化合物作用于肿瘤细胞时间的延长， Bcl-2和 Mcl-l的蛋白条带逐渐变浅， 说明化合物具有抑制这两个蛋白的作用。 利用 KODAK Gel Logic 1500成像系统软件对 Western图片中蛋白条带浓度进行半定量分析，归一化处理后， 蛋白条带的浓度如附图 12和 13所示。
经同样方法对检测下述 18个化合物， 它们均具有抑制 Bcl-2和 Mcl-l蛋白的作用。 这些 化合物下调 Mcl-l蛋白和 Bcl-2蛋白的半定量分析结果分别如表 6和表 7所示：
表 6
化合物 对照 6小时 12小时 18小时 24小时
1 1 0.99 0.99 0.58 0.21
2 1 0.99 0.99 0.50 0.19
3 1 0.99 0.99 0.49 0.18
7 1 0.99 0.99 0.51 0.20
8 1 0.99 0.99 0.42 0.10
9 1 0.99 0.99 0.49 0.20
10 1 0.99 0.99 0.45 0.12
11 1 0.99 0.99 0.57 0.22
12 1 0.99 0.99 0.45 0.16
13 1 0.99 0.99 0.42 0.14
15 1 0.99 0.99 0.39 0.12
17 1 0.99 0.99 0.58 0.11
18 1 0.99 0.99 0.36 0.10
20 1 0.99 0.99 0.50 0.23
21 1 0.99 0.99 0.49 0.18
22 1 0.99 0.99 0.60 0.37
23 1 0.99 0.99 0.70 0.41
27 1 0.99 0.99 0.57 0.29 表 Ί
化合物 对照 2小时 6小时
1 1 0.79 0.35
2 1 0.70 0.31
3 1 0.65 0.29
7 1 0.68 0.32
8 1 0.52 0.22
9 1 0.60 0.29
10 1 0.53 0.21
11 1 0.70 0.34
12 1 0.66 0.28
13 1 0.79 0.29
15 1 0.69 0.42
17 1 0.65 0.37
18 1 0.66 0.39
20 1 0.60 0.29
21 1 0.59 0.28
22 1 0.68 0.49
23 1 0.60 0.59
27 1 0.57 0.29

Claims

权 利 要 求 书
1. 一类苊并杂环类化合物， 具有通式 I的结构:
Figure imgf000029_0001
通式 I中：
R1选自 H、 硫吗啉基和 XR4;
R2选自（CH2)nZ和 (CH2)nPh -(o,m,/?)Z，所述的 Z选自 N02、 Ph、 CF3、 OCH3、 SCH3、 NH2、 NHCH3、 N(CH3)2和直链或支链的取代或未取代的 (^^8垸基， 所述的取代基是卤素、 氨基、 羟基、 酯基或羧基；
R3选自（CH2)n W， 所述的 W选自 H、 CN、 N02、 NH2、 COOH、 CHO、 OH禾卩 S03H; 所述的 R4选自 （CH2)nY、 噻吩甲基、 四氢吡喃基、 四氢噻喃基和 (CH2)nPh -(0,m,p)Y; 所 述的 Y是直链或支链的取代或未取代的 d-C8垸基， 所述的取代基是卤素、 氨基、 羟基、 酯 基或羧基；
所述的 X是 0、 S、 氨基、 羰基、 酯基、 酰胺或磺酰胺；
所述的 n为 0~4的整数。
2.权利要求 1所述的化合物，其特征在于所述的 Z是直链或支链的取代或未取代的 d-C4 院基。
3.权利要求 2所述的化合物， 其特征在于所述的 R2是 (； CH^Ph -^ Z, 其中 Z是直 链或支链的取代或未取代的 d-C3烷基。
4.权利要求 1、 2或 3所述的化合物， 其特征在于所述的 W是 H、 NH2或 OH。
5.权利要求 4所述的化合物， 其特征在于所述的 X是 0或8。
6.权利要求 5所述的化合物， 其特征在于所述的 R4是 Ph -(^ m, rfY， 其中 Y选自 Ph、 CF3、 OCH3、 SCH3、 NH2、 Br、 异丙基、 异丁基和仲丁基。
7.权利要求 1所述的化合物， 选自：
9-正丁氨基 -8H-苊并 [1 ,2-b]吡咯 -8-酮，
9-正己氨基 -8H-苊并 [1 ,2-b]吡咯 -8-酮， 9- 3-苯基丙氨基) -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮，
3-乙氧基 -9- ( 3-苯基丙氨基） -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮，
3-苯甲酰基 -9-正丁氨基 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮，
9-(N-甲基丁基 -1-氨基) -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮，
3-(4-溴苯硫基) -9-正丁氨基 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮，
3-(4-溴苯硫基) -9-(3-苯基丙氨基) -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮，
3-硫吗啉基 -9-正丁氨基 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮，
3-硫吗啉基 -9-0苯基丙氨基) -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮，
3-(4-异丙基苯氧基 )-9-正丁氨基 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮，
3-(4-异丙基苯氧基 )-9-(3-苯基丙氨基) -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -8-酮。
8. 权利要求 1所述的苊并杂环类化合物的制备方法，是式 i的化合物与 NH2CHR2R3在常 温下反应 0.5〜8小时，
Figure imgf000030_0001
其中化合物 i与 NH2CHR2R3的投料摩尔比为 1 : 5， 反应溶剂为乙腈。
9. 一类苊并杂环类化合物， 具有通式 II的结构：
Figure imgf000030_0002
II
通式 II中：
R5、 R6和 R7各自独立地选自 X R9和 H;
R8选自 CN、 COOH、 COO R10禾口 CONH R10;
当所述的 X是 0、 羰基、 酯基、 酰胺基或磺酰胺基时；
所述的 R9选自 (CH2)nY和 (CH2)nPh -(o, m, p)Y, 所述的 Υ选自直链或支链的 C2-C8烷基、 取代的直链或支链的 crc8烷基， 所述的取代基选自卤素、 氨基、 羟基、 酯基和羧基； 所述的 R1Q选自取代或未取代的直链或支链的 d-C6烷基，所述的取代基选自卤素、氨基、 羟基、 酯基、羧基或 (CH2)n Ph - (o, m, p) Z， 其中 Z 选自 -CH3、 -C2H5、 -N02、 -Ph、 -F、 -CK -Br、 -CF3、 -OCH3、 -SCH3、 -NH2和 -N(CH3)2;
当所述的 x是 s时；
所述的 R9选自 （CH2)nPh -( m,/ )Y， 所述的 Y选自直链或支链的 C2-C8烷基、 取代的直 链或支链的 CrC8烷基， 所述的取代基选自卤素、 氨基、 羟基、 酯基和羧基；
所述的 R1Q选自取代或未取代的直链或支链的 d-C6烷基，所述的取代基选自卤素、氨基、 羟基、 酯基、羧基或 (CH2)n Ph - (o, m, p) Z， 其中 Z 选自 -CH3、 -C2H5、 -N02、 -Ph、 -F、 -CK -Br、 -CF3、 -OCH3、 -SCH3、 -NH2和 -N(CH3)2;
上述的 为0〜4的整数。
10. 权利要求 9所述的化合物， 其特征在于所述的 R5和 R6分别是 1 9和11。
11. 权利要求 9或 10所述的化合物， 其特征在于所述的 R8是 CN。
12. 权利要求 11所述的化合物， 其特征在于所述的 R9是 (CH2)nPh -( m,/ )Y。
13. 权利要求 12所述的化合物，其特征在于所述的 X是 0或 S， Y是直链或支链的 C3-C5 焼基。
14. 权利要求 13所述的化合物， 其特征在于所述的 Y是异丙基、 异丁基或仲丁基。
15. 权利要求 8所述的化合物， 选自：
3- (4-仲丁基苯氧基） —8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈；
4- (4-仲丁基苯氧基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈；
3- (4-异丁基苯氧基） —8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈；
4- (4-异丁基苯氧基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈；
3- (4-异丙基苯氧基） —8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈；
3- (4-异丁基苯硫基） —8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈；
4- (4-异丁基苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈；
3- (4-异丙基苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈；
3- (4-仲丁基苯硫基） -8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈。
16. 权利要求 9所述的苊并杂环类化合物的制备方法， 经下述 a或 b途径：
a. 以 8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈为原料， 与亲核试剂醇， 酚， 酯， 酰胺发生反应， 温 度为 20〜100 °C， 反应时间 0.5〜24小时， 反应完成后蒸出溶剂， 柱层析得到 3-取代、 6-取代 或者 3，6-位双取代的 8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈， 腈基再经过水解， 酯化或酰胺化得到权 利要求 9所述的化合物；
b. 以苊醌为原料， 加入液溴回流 2小时， 得到溴代苊醌； 再与醇， 酚， 酯， 酰胺反应得 到相应的取代苊醌；取代苊醌与乙腈在硅胶弱酸性催化的条件下反应得到通式为 ii或 iii的化 合物，
Figure imgf000032_0001
化合物 ii或 iii在 K2C03催化， 乙腈回流 0.5〜6 h冷却后减压蒸除部分溶剂后， 过滤或 柱层析制得 3位或 4位取代的 8-氧 -8H-苊并 [l，2-b]吡咯 -9-腈； 再经过水解， 酯化或酰胺化得 到权利要求 9所述的化合物。
17. 权利要求 1或 9所述的苊并杂环类化合物在制备 ΒΗ3类似物 Bcl-2家族蛋白抑制剂 中的应用。
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