WO2012011396A1 - ナノ抗体を発現するトランスジェニックイネ - Google Patents

ナノ抗体を発現するトランスジェニックイネ Download PDF

Info

Publication number
WO2012011396A1
WO2012011396A1 PCT/JP2011/065670 JP2011065670W WO2012011396A1 WO 2012011396 A1 WO2012011396 A1 WO 2012011396A1 JP 2011065670 W JP2011065670 W JP 2011065670W WO 2012011396 A1 WO2012011396 A1 WO 2012011396A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
rice
vhh1
mucorice
mtnfαvhh
nanoantibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2011/065670
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
義和 幸
大介 徳原
宏 清野
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
Original Assignee
University of Tokyo NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tokyo NUC filed Critical University of Tokyo NUC
Priority to JP2012525370A priority Critical patent/JP5616449B2/ja
Publication of WO2012011396A1 publication Critical patent/WO2012011396A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain

Definitions

  • the present invention relates to transgenic rice expressing nanoantibodies, and more particularly to transgenic rice accumulating nanoantibodies in rice in a water-soluble form.
  • Non-patent Documents 1 and 2 when protein is produced in rice, there is a problem that the protein is mainly accumulated in the protein reservoir-I and the accumulated protein becomes hardly soluble.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and an object thereof is to provide transgenic rice in which antibodies are accumulated in a water-soluble form in rice.
  • a further object of the present invention is to provide a method for efficiently producing an antibody using such transgenic rice.
  • Non-patent Document 3 When only the variable region of this double-chain antibody (variable domain of llama heavy-chain; VHH) was fragmented and taken out, it was also found that it has the same binding affinity to the antigen as a normal antibody. This VHH is currently called the “nanoantibody” because it is the smallest antibody with binding affinity for antigen. Nanoantibodies are small, resistant to acid and heat and highly stable (Non-patent Document 4), and are produced as recombinant proteins in various hosts because of their low molecular weight ( Non-patent document 5).
  • the present inventors applied a nanoantibody to a rice expression system that has not succeeded in accumulating proteins in rice in a water-soluble form until now.
  • the present inventors have found that the solubilized nanoantibody retains its original performance of heat resistance and stability.
  • the nanoantibody has a higher neutralizing effect on the antigen than the monomer.
  • the present inventors apply the antibody as a nanoantibody to a rice expression system, thereby allowing the antibody to accumulate in rice in a water-soluble form and without losing the original characteristics of the antibody. It was the first time in the world that the present invention was completed.
  • the present invention provides the following inventions.
  • a composition comprising the rice according to (3), the water-soluble fraction according to (4), or the processed product according to (5).
  • a method for producing a nanoantibody (A) introducing DNA encoding a nanoantibody into rice to produce transgenic rice in which the nanoantibody is expressed in rice; (B) obtaining a water-soluble fraction from the rice of the transgenic rice produced in step (a), Including methods.
  • the present invention makes it possible to accumulate nanoantibodies in rice in a water-soluble form without losing their original characteristics. According to the present invention, a large amount of nanoantibodies can be produced in an inexpensive and stable form.
  • the rice in which nanoantibodies are accumulated, the water-soluble fraction thereof, or the processed product thereof can be applied as a safe composition to medicines, foods and drinks, and the like.
  • MocoRice-VHH1 is a photograph showing the results of detection of VHH1 expression in rice seeds into which VHH1 gene was introduced (hereinafter abbreviated as “MucoRice-VHH1”).
  • A is a photograph of SDS-PAGE and Western blot
  • (b) is a photograph of immunostaining seeds on the 14th day after flowering. It is a figure which shows the result of having analyzed the amino acid sequence of MucoRice-VHH1 using two types of mass spectrometers (QSTAR Elite and LTQ Orbitrap). It is a photograph which shows the result of having examined the VHH1 extraction conditions from MucoRice-VHH1.
  • Lane 1 rVHH1
  • Lane 2 8M Extract from MucoRice-VHH1 using urea-containing PBS
  • Lane 3 Extract from MucoRice-VHH1 using PBS. It is a photograph of a Western blot using SDS-PAGE and an antibody (NKM-16-2-4) having specificity for mouse M cells showing the results of examining scFv extraction conditions from MucoRice-scFv.
  • Lane 1 Extract from MucoRice-scFv using PBS
  • Lane 2 Extract from urea-containing SDS solution from precipitate in PBS extraction of MucoRice-scFv
  • Lane 3 From wild seeds using PBS
  • Lane 4 extract from urea-containing SDS solution from precipitates in PBS extraction of wild-type seeds
  • Lane 5 NKM-16-2-4 antibody
  • Lane 6 MucoRice-scFv using urea-containing SDS solution Extract from lane 7
  • Lane 7 Extract from wild seeds with urea-containing SDS solution.
  • the dotted arrow in FIG. 4 indicates the scFv protein band.
  • (I) shows the small intestine tissue of a non-infected young mouse
  • (II) shows the small intestine tissue of a young mouse infected with rotavirus
  • (III) shows the infection with rotavirus and administered MucoRice-VHH1
  • (IV) shows the small intestine tissue of a young mouse infected with rotavirus and administered with WT-Rice (Japan fine). It is a graph which shows the result of having evaluated the amount of rotavirus in the small intestine tissue of a young mouse by real-time PCR.
  • Control shows the VP7 RNA copy number in the small intestine tissue of the uninfected young mouse
  • RRV infection only shows the VP7 RNA copy number in the small intestine tissue of the young mouse infected with rotavirus
  • WTrice administration "Indicates VP7 RNA copy number in the small intestine tissue of young mice infected with rotavirus and administered WT-Rice (Japan sunny)”
  • MocoRice VHH1 administration indicates VP7 in the small intestine tissue of young mice administered MucoRice-VHH1 RNA copy number is indicated.
  • the leftmost photo shows the result of analyzing MucoRice-mTNF ⁇ VHH monomer by SDS-PAGE
  • the second photo from the left shows the result of analyzing MucoRice-mTNF ⁇ VHH monomer by Western blot using anti-mTNF ⁇ VHH polyclonal antibody
  • the third photo from the left shows the result of analyzing MucoRice-mTNF ⁇ VHH dimer by SDS-PAGE
  • the rightmost photo shows the result of analyzing MucoRice-mTNF ⁇ VHH dimer by Western blot using anti-mTNF ⁇ VHH polyclonal antibody.
  • Show. “Lane 1” indicates the analysis result of rmTNF ⁇ VHH (recombinant mTNF ⁇ VHH derived from E.
  • “Lane 2” indicates the analysis result of the PBS extract of MucoRice-mTNF ⁇ VHH monomer
  • “Lane 3” indicates MucoRiceVmHNTNH
  • the analysis result of the precipitate after the extraction of the monomer with PBS is shown
  • “Lane 4” shows the analysis result of the PBS extract of MucoRice-mTNF ⁇ VHH dimer
  • “Lane 5” shows the precipitate after the extraction of MucoRice-mTNF ⁇ VHH dimer with PBS The analysis result of a thing is shown.
  • the band surrounded by a square indicates mTNF ⁇ VHH monomer (13.8 kDa) or mTNF ⁇ VHH dimer (28.4 kDa).
  • the photograph on the left shows the result of analyzing MucoRice-mTNF ⁇ VHH etc. by SDS-PAGE, and the photograph on the right shows the result of analyzing MucoRice-mTNF ⁇ VHH etc. in Western blot.
  • rmTNF ⁇ VHH indicates the result of analysis of rmTNF ⁇ VHH
  • MocoRice-mTNF ⁇ VHH indicates the analysis result of the PBS extract of MucoRice-mTNF ⁇ VHH monomer
  • MocoRice-mTNF ⁇ VHHDmMVVHHDmFmMVDHFD The analysis result of the solution is shown
  • WT-Rice shows the analysis result of the PBS extract of WT-Rice (Nipponbare).
  • the band indicated by an arrow indicates mTNF ⁇ VHH monomer (denoted as “VHH (13.8 kDa) in the figure) or mTNF ⁇ VHH dimer (denoted as“ VHH Dimer (28.4 kDa) in the figure) ”. It is a graph which shows the result of having evaluated the inhibition rate of mTNF (alpha) VHH with respect to mTNF (alpha).
  • the rightmost line shows the relationship between the amount of rmTNF ⁇ VHH added and the inhibition rate against mTNF ⁇
  • the middle line shows the amount of added muTRice-mTNF ⁇ VHH monomer-derived PBS extract and mTNF ⁇ of rmTNF ⁇ VHH.
  • the leftmost line “dimer” shows the relationship between the added amount of MucoRice-mTNF ⁇ VHH dimer-derived PBS extract and the inhibition rate of rmTNF ⁇ VHH to mTNF ⁇ .
  • FIG. 1 It is a photograph which shows the result of having analyzed the localization of mTNF (alpha) VHH monomer in a rice seed by the immunoelectron microscope method.
  • A shows mTNF ⁇ VHH rice (MucoRice-mTNF ⁇ VHH monomer) localization of mTNF ⁇ VHH monomer (type I protein reservoir (PB-I) and cytoplasm) detected with anti-mTNF ⁇ VHH antibody
  • B shows mTNF ⁇ VHH rice. Shows the results of detecting and observing the localization of mTNF ⁇ VHH monomer (type II protein reservoir (PB-II), cytoplasm, starch (St: Starch), cell wall (CW: Cell Wall)) using anti-mTNF ⁇ VHH antibody .
  • PB-II type II protein reservoir
  • St Starch
  • CW Cell Wall
  • C shows the result of observing PB-I, PB-II and cytoplasm by reacting mTNF ⁇ VHH rice with normal rabbit IgG (“ ⁇ -Rabbit IgG”, negative control), and D shows Nihonsei rice (WT-Rice).
  • A shows the results of detection and observation of mTNF ⁇ VHH dimer localization (PB-I, PB-II, cytoplasm) in mTNF ⁇ VHH dimer rice (MucoRice-mTNF ⁇ VHH dimer) using anti-mTNF ⁇ VHH antibody
  • B shows the results in mTNF ⁇ VHH dimer rice
  • the localization of mTNF ⁇ VHH dimer (PB-I, PB-II, cytoplasm, cell wall) was detected using an anti-mTNF ⁇ VHH antibody, and the observation results are shown.
  • C shows the result of observing PB-I, PB-II, St and cytoplasm after reacting mTNF ⁇ VHH dimer rice with normal rabbit IgG
  • D shows the result of reacting Nippon Harimai (WT-Rice) with anti-mTNF ⁇ VHH antibody.
  • the results of observation of PB-I, PB-II and cytoplasm (“WT Nipponbare”, negative control) are shown.
  • the present invention provides transgenic rice in which a DNA encoding a nanoantibody is introduced and the nanoantibody is expressed in rice.
  • “rice” means a plant belonging to Oryza sativa , and the variety of rice to be genetically modified is not particularly limited as long as it belongs to Oryza sativa .
  • nanoantibody means an antibody that is composed of a variable region of an antibody heavy chain (also referred to as variable domain of a heavy-chain antibody or VHH) and can recognize an antigen.
  • Nanoantibodies are typically antibodies derived from camelids (eg, dromedaries, bactrian camels, llamas, alpaca, vicuna).
  • the nanoantibody in the present invention can use VHH as a monomer, but can also be used as a multiple antibody of dimer or higher.
  • the dimer or higher multi-antibody may be one in which the same VHH is linked (for example, a homodimer in the case of a dimer), and two or more recognize different molecules or different epitopes within the same molecule. (For example, a heterodimer in the case of a dimer) may be used.
  • Such a VHH connection method is not particularly limited, and a known method can be used. For example, a method comprising constructing a vector containing DNA encoding an antibody in which VHHs are linked via a spacer sequence and expressing the vector in rice of transgenic rice can be mentioned.
  • a single VHH can be expressed in rice, purified from a water-soluble fraction, and then the purified VHHs can be bound to each other to produce multiple antibodies of dimers or higher.
  • a nanoantibody against a desired antigen can be used.
  • the antigen include (1) pathogenic viruses (for example, rotavirus, hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, noo Oak virus, rabies virus, RS virus, cytomegalovirus, Foot-and-mouth disease virus, contagious gastroenteritis virus, rubella virus, ATL virus, adenovirus, mumps virus, coxsackie virus, enterovirus, herpes virus, smallpox virus, poliovirus, measles virus, Japanese encephalitis virus, proboscis fever Virus, Yellow fever virus, West Nile virus, SARS (coronavirus), Influenza virus, HIV (AIDS virus), Ebola virus (Firovirus), Marburg virus (Firovirus), Lassa fever Will (2) Pathogenic bacteria (eg, Vibrio cholerae, Pathogenic Escherichia coli, Haemophilus), a virus, and viruses,
  • Colon cancer tumor antigens breast cancer tumor antigens such as Her2, prostates such as PSA (prostate specific antigen) N such as a tumor antigen), (9) such as cell antigen (e.g. CD3, CD25, RANKL), (10) Others (eg von Willebrand factor (von Willebrand factor: vWF platelet aggregating factor), and the like).
  • PSA prostate specific antigen
  • N such as a tumor antigen
  • cell antigen e.g. CD3, CD25, RANKL
  • Others eg von Willebrand factor (von Willebrand factor: vWF platelet aggregating factor), and the like).
  • the codon contained in the DNA encoding the nanoantibody is preferably modified to a plant codon.
  • a plant-type codon By changing to a plant-type codon, the expression efficiency of the nano antibody in rice (in rice endosperm cells) can be improved.
  • a promoter and terminator that function specifically in rice endosperm.
  • the promoter is linked upstream of the DNA encoding the nanoantibody
  • the terminator is linked downstream of the DNA encoding the nanoantibody.
  • promoters and terminators that function specifically in rice endosperm include promoters and terminators of genes that encode rice endosperm storage proteins.
  • rice endosperm storage protein means a protein that is specifically expressed in rice endosperm cells and accumulated in rice endosperm cells, and the type thereof is not particularly limited.
  • rice endosperm storage protein include glutelin, prolamin, globulin, and the like.
  • the promoter of the gene encoding rice endosperm storage protein is preferably the promoter of the glutelin GluB-1 gene or the prolamin 13K gene.
  • the promoters of these genes are advantageous in that their promoter activities are higher than those of genes encoding other rice endosperm storage proteins.
  • the rice endosperm-specific promoter may be either a natural promoter or a mutant promoter as long as it has rice endosperm-specific promoter activity.
  • the “mutant promoter” means a promoter having a rice endosperm-specific promoter activity, comprising a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted or added in the base sequence of the natural promoter. The same applies to the rice endosperm-specific terminator.
  • an expression suppression cassette that suppresses either 13K prolamin or glutelin expression by RNAi method or suppresses both 13K prolamin and glutelin expression (double suppression) is introduced into rice. To do.
  • the method for introducing a vector into rice cells is not particularly limited.
  • Transgenic rice can be produced, for example, by introducing a vector for expressing a DNA encoding a nanoantibody into rice cells, and then culturing the transformed rice cells to regenerate the rice plant body.
  • the form of the rice cell into which the vector is introduced is not particularly limited as long as it can be regenerated into a plant body, and examples thereof include cultured cells, protoplasts, shoot primordia, polyblasts, hairy roots, and callus. .
  • a plasmid is used as a vector, it is preferable to contain a drug resistance gene such as hygromycin, tetracycline, ampicillin so that rice cells into which the vector has been introduced can be efficiently selected.
  • hygromycin when used as an oral agent for a pharmaceutical product without being purified from the expressed rice, hygromycin that is not particularly safe must be removed by a known method such as a cotransfection method.
  • the present invention is a method for producing a nanoantibody, wherein (a) DNA encoding the nanoantibody is introduced into rice to produce transgenic rice in which the nanoantibody is expressed in rice; and (b) And (a) obtaining a water-soluble fraction from the rice of the transgenic rice produced in step (a). Furthermore, the present invention also provides a water-soluble fraction containing rice and its nanoantibodies collected from the transgenic rice of the present invention.
  • rice means a tissue containing endosperm or a portion thereof, and includes rice bran, brown rice, seeds, white rice, and these portions.
  • the “water-soluble fraction” means a rice fraction that can be eluted with water or a buffer solution that does not contain a drug for solubilizing proteins such as a surfactant and a reducing agent. Accumulating proteins, including antibodies, in rice in a water-soluble form has never been possible, and is the first in the world to succeed in the present invention. This water-soluble characteristic is considered to be caused by the accumulation of nanoantibodies mainly other than the rice protein reservoir (PB) (ie, cytoplasm).
  • PB rice protein reservoir
  • the present invention also provides a processed product of the rice and water-soluble fraction.
  • the “processed product” includes any processed product as long as it contains nanoantibodies. Examples of the processing to be applied include threshing, powdering, extraction of a desired fraction containing nanoantibodies, purification of the extracted fraction, and the like.
  • the rice thus prepared, its water-soluble fraction, or a processed product thereof can be used as a highly safe composition.
  • a pharmaceutical composition for example, as an oral composition.
  • the water-soluble fraction of rice and its processed product can be used as, for example, an injectable composition.
  • animals to be administered or ingested with the composition of the present invention include humans and other vertebrates (for example, mammals, birds, amphibians, fish, reptiles) and the like.
  • composition in the present invention can also be formulated by a known pharmaceutical method.
  • pharmacologically or carriers that are acceptable as foods and drinks and animal feeds, specifically, sterile water and physiological saline, vegetable oils, solvents, bases, emulsifiers, suspensions, surfactants, Stabilizer, flavor, fragrance, excipient, vehicle, preservative, binder, diluent, tonicity agent, soothing agent, extender, disintegrant, buffer, coating agent, lubricant, coloring It can be appropriately combined with agents, sweeteners, thickeners, flavoring agents, solubilizers or other additives.
  • the dose or intake is appropriately selected according to the age, weight, type of composition (pharmaceuticals, food and drink, animal feed, etc.) of the subject.
  • the dose or intake per dose is generally from 0.001 mg / kg body weight to 100 mg / kg body weight.
  • VHH1-expressing rice (MucoRice-VHH1) Nano-antibody against rotavirus (VHH1) gene information used publicly known public information (http://igture-archive.libry.uu.nl/dissertations/2004-0419- 094105 / c4.pdf).
  • VHH1 is an antigen-binding site of an antibody having only a heavy chain obtained by immunizing rhesus monkey rotavirus (RRV) serotype G3 with a camelid llama. The gene encoding VHH1 was reconstructed and artificially synthesized based on codons that are readily available to rice.
  • the selection marker cassette As shown in the published patent information (WO 2004/056993 A1), the selection marker cassette, the overexpression cassette of the foreign gene, and the expression suppression cassette for the seed endogenous storage protein gene.
  • the method of ligation onto a single T-DNA binary vector (pZH2B / 35SNos) and simultaneous introduction was referred to. That is, first, the selection marker cassette was obtained by linking a hygromycin resistance gene (mHPT) to a CaMV35S promoter and a Nos terminator. Next, a gene encoding VHH1 was inserted between the endosperm cell-specific prolamin 13K promoter / 10K prolamin signal and the prolamin 13K prolamin terminator in the foreign gene cassette.
  • mHPT hygromycin resistance gene
  • the expression suppression cassette for the storage protein gene was constructed to double suppress the expression of 13K prolamin and glutelin by RNAi method. Specifically, a 45-bp portion of 13K prolamin cDNA and a 129-bp portion of glutelin A cDNA were ligated to both ends of a rice aspartic protease (RAP) intron in the sense and antisense directions, and the ubiquitin promoter and Nos terminator were ligated. It was set as the structure which expresses hairpin type RNA by inserting between.
  • RAP rice aspartic protease
  • a T-DNA binary vector for VHH1 gene expression in which all of these were ligated was introduced into rice (Nipponbare) by a conventional method using Agrobacterium to produce VHH1-expressing rice.
  • Example 2 Analysis of VHH1 expression in MucoRice-VHH1 Regarding whether or not rice seeds into which VHH1 gene has been introduced (hereinafter also referred to as “MucoRice-VHH1”) express VHH1, SDS-PAGE, Western blot, and immunostaining techniques were used. And analyzed. The seeds after threshing (MucoRice-VHH1 and wild type) are pulverized, and the rice powder is suspended in a sample buffer (2% SDS, 5% ⁇ -mercaptoethanol, 50 mM Tris-HCl, 20% glycerol, pH 6.8). As an extract and a positive control, recombinant VHH1 derived from E.
  • a sample buffer 2% SDS, 5% ⁇ -mercaptoethanol, 50 mM Tris-HCl, 20% glycerol, pH 6.8.
  • rVHH1 coli coli
  • CBB Clusterassie Brilliant Blue
  • the separated gel was transferred to a PVDF membrane, and Western blot analysis was performed using an anti-VHH1 polyclonal antibody prepared by immunizing a rabbit with rVHH1.
  • VHH1 expression in seeds was analyzed by immunostaining using an anti-VHH1 polyclonal antibody. Specifically, seeds on the 14th day after flowering were collected and cut, immersed and fixed in a 4% paraformaldehyde solution (PFA), frozen and embedded after sucrose soaking, and 3 ⁇ m frozen sections were prepared, anti-VHH1 A polyclonal antibody was reacted, and then an HRP-labeled donkey anti-rabbit IgG antibody was reacted, and color was developed with 3,3′-diaminobenzidine (DAB) and counterstained with hematoxylin. As a result, no wild-type seed-specific staining image was observed, but in MucoRice-VHH1, an anti-VHH1 antibody-specific staining image was observed throughout the seed (b in FIG. 1).
  • PFA paraformaldehyde solution
  • DAB 3,3′-diaminobenzidine
  • Example 3 Structural analysis of VHH1 derived from MucoRice-VHH1
  • sample buffer 2% SDS, 5% ⁇ -mercaptoethanol, 50 mM Tris-HCl, 20% glycerol, pH 6.8
  • polyacrylamide of rVHH1 as a positive control. Separation by electrophoresis using gel. The separated gel was subjected to CBB staining, a band corresponding to VHH1 was cut out, and after CBB decolorization / dehydration, gel digestion with trypsin was performed to extract peptides.
  • the extracted peptides were separated by nanoLC and analyzed using two types of mass spectrometers (QSTAR Elite and LTQ Orbitrap).
  • QSTAR Elite is shown in SEQ ID NO: 1
  • the analysis result of LTQ Orbitrap is shown in SEQ ID NO: 2, and these are collectively shown in FIG.
  • FIG. 2 the complete amino acid sequence could be decoded by combining the results of the two types of mass spectrometers.
  • SR serine + arginine
  • Example 4 Examination of VHH1 extraction conditions from MucoRice-VHH1 VHH1 extraction conditions from MucoRice-VHH1 were examined. Add 1 mL of phosphate buffer (hereinafter abbreviated as PBS) or 1 mL of PBS containing 8M urea to 100 mg of MucoRice-VHH1 rice powder, and after suspension, immediately centrifuge, and add rVHH1 as sample control (2% It was suspended in SDS, 5% ⁇ -mercaptoethanol, 50 mM Tris-HCl, 20% glycerol, pH 6.8), and separated by electrophoresis using 12% polyacrylamide gel. The separated gel was subjected to CBB staining. As a result, as shown in FIG. 3, it was clarified that VHH1 of the same level as PBS containing 8M urea was extracted from MucoRice-VHH1 with PBS alone. This indicates that VHH1 in the rice powder is water-soluble.
  • PBS phosphate buffer
  • PBS phosphat
  • Example 5 Localization of VHH1 in MucoRice-VHH1 Localization of VHH1 in seeds was examined by immunoelectron microscopy.
  • the seeds on the 14th day after flowering were collected, sections of about 0.5 to 1.0 ⁇ m were prepared, fixed with 4% PFA, and then immersed in LR-white resin. Thereafter, an ultrathin section of 100 ⁇ m was prepared and placed on a grid, reacted with an anti-VHH1 polyclonal antibody, washed and reacted with an 18 nm gold colloid-labeled anti-rabbit IgG antibody.
  • VHH1 was remarkably observed in PB-II and lightly observed in the vicinity of the outer surface of PB-I, but a large amount of VHH1 was accumulated in the cytoplasm other than PB (FIG. 5). It was considered that the water solubility of VHH1 observed in the extraction study of MucoRice-VHH1 was particularly dependent on the localization to the cytoplasm showing high water solubility.
  • Example 6 Evaluation of neutralization effect of MucoRice-VHH1 against rotavirus (cell infection experiment)
  • MA104 cells rhesus monkey kidney-derived cell line
  • RRV rhesus monkey rotavirus
  • MucoRice-VHH1 stored at room temperature for 1 year has a neutralizing effect comparable to that of MucoRice-VHH1 immediately after harvest, and the long-term room temperature storage of MucoRice-VHH1 was proved.
  • Example 7 Evaluation of stability and distribution of MucoRice-VHH1 in the digestive tract After centrifuging a suspension of MucoRice-VHH1 powder and pure water, the supernatant was collected, and 40 ⁇ l of a 100 ⁇ g / mL concentration of VHH1 solution was applied to the Administration into the stomach of Balb / c mice. The contents of stomach, jejunum, ileum, and large intestine were collected after 1, 3, 4, and 9 hours and suspended in 500 uL of PBS.
  • VHH1 derived from rice was found in the entire digestive tract from the stomach to the large intestine until 4 hours after administration. In addition, 9 hours after administration, about 50% of mice had rice-derived VHH1 from the jejunum to the large intestine.
  • Example 8 Evaluation of neutralization effect of MucoRice-VHH1 against rotavirus (infection experiment 1 using juvenile animals)
  • RRV 2 ⁇ 10 7 ffu obtained in MEM 20 ul
  • trypsin 37 ° C., 30 minutes
  • RRV 2 ⁇ 10 7 ffu obtained in MEM 20 ul
  • trypsin 37 ° C., 30 minutes
  • Fig. 8 watery diarrhea was observed after about 24 hours.
  • Fig. 8 spontaneously improves after 3 to 4 days.
  • mucoRice-VHH1 was tested for its neutralizing effect and diarrhea-suppressing effect on RRV.
  • Example 9 Evaluation of neutralization effect of MucoRice-VHH1 against rotavirus (infection experiment 2 using juvenile animals)
  • a rotavirus infection model was prepared using young mice, and instead of the diarrhea state used in Example 8, the state of the small intestine tissue section and the increase in the amount of rotavirus were used as indicators.
  • the neutralizing effect of MucoRice-VHH1 against rotavirus was evaluated.
  • the amount of rotavirus was obtained by extracting total RNA from small intestine tissue, preparing cDNA by a conventional method, and using the method of Pant et al. (Pant, N. et al., J. Infect. Dis., 2006, 194, 1580-1588).
  • the amount of rotavirus increase / decrease was evaluated by quantifying mRNA encoding VP7 of rotavirus by real-time PCR using the method described in the page. The obtained results are shown in FIG.
  • rotavirus infection (2 ⁇ 10 7 ffu RRV) was performed under the same conditions as in Example 8, and in the small intestine tissue of young mice administered with MucoRice-VHH1, epithelium No abnormality was found in the cells (intestinal epithelial cells) (see III in FIG. 11).
  • the small intestine tissue of young mice infected with rotavirus see II in FIG. 11
  • the small intestine tissue of young mice infected with rotavirus and administered WT-Rice (Nipponbare) (see IV in FIG. 11).
  • numerous vacuoles were observed in the epithelial cells of these mice.
  • Example 10 Evaluation of neutralization effect of MucoRice-VHH1 against rotavirus (infection experiment using immunodeficient animals)
  • the effect of MucoRice VHH1 on anti-RRV-VHH1 was evaluated using SCID mice which are immunodeficient mice. That is, SCID mice were infected with rotavirus (2 ⁇ 10 7 ffu RRV), and then 200 mg of MucoRice-VHH1 (containing 1.7 mg VHH1) was orally administered twice daily for 7 days. The amount of virus was evaluated by the amount of VP7 RNA by real-time PCR. The obtained results are shown in FIGS.
  • the “diarrhea score” in FIG. 13 is based on the result of evaluation as “0” when diarrhea is not observed, “1” when weak diarrhea is observed, and “2” when diarrhea is observed. .
  • MucoRice-VHH1 is effective for rotavirus infection not only in children as shown in Examples 8 and 9, but also in immunocompromised patients who cannot be administered a vaccine.
  • TNF- ⁇ VHH-expressing rice (MucoRice-mTNF ⁇ VHH)
  • VHH nanoantibodies
  • a gene encoding mouse TNF ⁇ VHH monomer (mTNF ⁇ VHH monomer) was reconstructed and artificially synthesized based on codons that can be easily used by rice.
  • a gene encoding TNF ⁇ VHH dimer (mTNF ⁇ VHH dimer) was prepared by combining the VHH monomers with each other via an appropriate linker (a spacer sequence consisting of an amino acid sequence [GGGGSGGGGSGGGS]).
  • T-DNA binary vector pZH2B / 35SNos
  • Agrobacterium Rice Nipponbare was transformed through um and TNF- ⁇ VHH-expressing rice (MucoRice-mTNF ⁇ VHH: MucoRice-mTNF ⁇ VHH monomer and MucoRice-mTNF ⁇ VHH dimer) was produced by a conventional method.
  • Example 12 Extraction of mTNF ⁇ VHH from MucoRice-mTNF ⁇ VHH For extraction of each of mTNF ⁇ VHH monomer and mTNF ⁇ VHH dimer from MucoRice-mTNF ⁇ VHH dimer and SDS-PAGE using tSter-PAGE.
  • mTNF ⁇ VHH contained in MucoRice-mTNF ⁇ VHH reached an average of 0.82% per rice powder weight in VHH monomers and an average of 0.47% in VHH dimers, and VHH was highly expressed not only in monomers but also in dimers. It was found that the accumulation was high (FIG. 16).
  • Example 14 Evaluation of inhibitory effect of MucoRice-mTNF ⁇ VHH on mTNF ⁇ (cell death suppression test)
  • WEHI164 cells mouse fibroblasts
  • RPMI164 medium containing 10% FCS in a 96-well plate at 2 ⁇ 10 4 cells / well and cultured in a 5% CO 2 incubator (37 ° C.) for 24 hours.
  • the medium is removed, and the medium alone (negative control), the medium added with only 2 ng / mL rmTNF ⁇ (manufactured by R & D systems) (positive control), or 2 ng / mL rmTNF ⁇ and the MucoRice-mTNF ⁇ VHH-derived PBS extract are mixed.
  • the amount of rmTNF ⁇ added (2 ng / mL) was such that the survival rate of WEHI164 cells was 50%. That is, as described above, WEHI164 cells were cultured in a medium supplemented with a predetermined amount (0.5 to 4 ng / mL) of rmTNF ⁇ and subjected to WST-8 assay. From the number of viable cells obtained, the survival rate was 50. % Of rmTNF ⁇ was calculated (see FIG. 18).
  • Example 15 Localization of mTNF ⁇ VHH in MucoRice-mTNF ⁇ VHH (observation by immunoelectron microscope) The localization of mTNF ⁇ VHH monomer and dimer in seeds was analyzed by immunoelectron microscopy. That is, seeds on the 14th day after flowering of the second generation MucoRice-mTNF ⁇ VHH monomer and dimer were collected, and sections of about 0.5 to 1.0 ⁇ m were prepared. Subsequently, these sections were immersed and fixed in 4% PFA while shaking at 4 ° C. for 4 hours.
  • the LR-White resin was gradually infiltrated over 2 days at 4 ° C, and finally immersed and embedded in 100% LR-White resin at 50 ° C overnight. Polymerized. From the polymer block after polymerization, an ultrathin section having a thickness of 80 to 100 nm was prepared by an ultramicrotome, and collected on a nickel grid (mounting net) with a form bar support film attached thereto to obtain a sample for immunostaining.
  • Immunostaining was performed by blocking with 10% goat serum (Goat Serum) for 30 minutes at room temperature, and then reacting with an anti-mTNF ⁇ VHH antibody (rabbit) purified by affinity using a protein G column at a concentration of 5 ⁇ g / ml for 1 hour at room temperature. . Subsequently, after washing, an 18 nm gold colloid-labeled anti-rabbit IgG antibody was reacted. Then, after reacting the secondary antibody, it was washed again, fixed with 1% glutaraldehyde for 5 minutes at room temperature, and then subjected to double electron staining with 2% uranyl acetate for 5 minutes and then with a lead salt for 5 minutes. The sample immunostained in this way was observed with a transmission electron microscope.
  • the water-soluble nature of mTNF ⁇ VHH shown in FIGS. 15 and 16 is mainly due to the fact that both the nanoantibody monomer and dimer accumulate in other than the rice protein reservoir (PB) (ie, cytoplasm). As one of them.
  • PB rice protein reservoir
  • nano-antibodies VHH1 having binding affinity for rotavirus VP4 and VP7 (Dolk E, et al., Proteins. 2005; 59: 555-64.) And TNF- ⁇ nanoantibodies (Pant N, et al., J Infect Dis. 2006; 194: 1580-8.) are expressed in lactic acid bacteria, so that rotavirus infection occurs orally. ⁇ Successful attempts to prevent enteritis such as diarrhea and Crohn's disease.
  • lactic acid bacteria which are often administered to the human body as an intestinal adjuster, it can be an oral drug with less burden on the human body, but when administered to a person with reduced immunity or a premature infant, sepsis and myocarditis caused by lactic acid bacteria There is a risk (Vandenbrooke K, et al., 2010; 3: 49-56., Land MH, et al., Pediatrics. 2005; 115: 178-81., Schlegel L, et al., Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1998; 17: 887-8.0).
  • oral antibody preparations using nano-antibodies are preferably preparations that do not require refrigerated storage and can be stored at room temperature for a long period of time.
  • Rice that has been developed according to the present invention and in which nanoantibodies are accumulated in a water-soluble form can be prepared as an oral antibody preparation capable of storing the nanoantibodies for a long period of time without adding a purification step.
  • the water-soluble fraction extracted from rice and its processed product can also be used as an injection preparation. Therefore, the present invention can greatly contribute to the development of a pharmaceutical preparation such as an oral preparation or an injection preparation which is inexpensive and can be stored at room temperature, which comprises an antibody as an active ingredient.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　コメにおいて抗体が水溶性の形態で蓄積しているトランスジェニックイネを提供すること、および、このようなトランスジェニックイネを利用して効率的に抗体を製造する方法を提供することを目的とし、ナノ抗体をイネ発現系に適用して発現させたところ、意外にも、ナノ抗体が、水溶性の形態でコメにおいて蓄積されることを見出した。さらに、可溶化したナノ抗体が耐熱性と安定性を保持していることを見出した。

Description

ナノ抗体を発現するトランスジェニックイネ
　本発明は、ナノ抗体を発現するトランスジェニックイネに関し、より詳しくは、ナノ抗体を水溶性の形態でコメに蓄積しているトランスジェニックイネに関する。
　近年、抗体は、遺伝子組換え医薬品として広く用いられるようになってきたが、抗体医薬品の開発においては、その製造コストの低減や安定性の向上などが大きな課題となっている。このため、大量の抗体を安価かつ安定な形態で製造しうる方法の開発が期待されている。このような状況の下、イネ発現系が注目され、２本鎖抗体や１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体やサイトカインなどの蛋白質をコメに大量かつ安定な形態で発現させようとする試みもなされてきた。
　しかしながら、コメにおいて蛋白質を生産する場合、主として蛋白貯蔵体－Ｉに蓄積してしまい、蓄積させた蛋白質が難可溶性となってしまうという問題があった（非特許文献１、２）。
Ｙｏｓｈｉｈｉｒｏ　Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　２０１０；７２：１２５－１３０ Ｔｏｍｏｎｏｒｉ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．，ＰＮＡＳ　２００７；１０４：１０９８６－１０９９１ Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ　Ｃ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９３；３６３：４４６－８． ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｌｉｎｄｅｎ　ＲＨ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ．１９９９；１４３１：３７－４６． Ｆｒｅｎｋｅｎ　ＬＧ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００；７８：１１－２１．
　本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、コメにおいて抗体が水溶性の形態で蓄積しているトランスジェニックイネを提供することにある。さらなる本発明の目的は、このようなトランスジェニックイネを利用して効率的に抗体を製造する方法を提供することにある。
　通常、ヒトの抗体は重鎖２本と軽鎖２本から構成されているが、ラマやラクダなどのラクダ科の動物には、重鎖と軽鎖からなる４本鎖抗体だけでなく、重鎖のみからなる２本鎖抗体が存在し、４本鎖抗体同様に標的抗原を認識・結合できることが１９９３年に報告された（非特許文献３）。さらに、この２本鎖抗体の可変領域のみ（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ｌｌａｍａ　ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ；ＶＨＨ）を断片化して取り出したところ、正常な抗体同様の抗原への結合親和力を有していることも判明した。このＶＨＨは、現在、抗原への結合親和力を持つ最小の抗体であることから、「ナノ抗体」と呼ばれている。ナノ抗体は、小型で、酸や熱に対して耐性で高い安定性を有しており（非特許文献４）、また、分子量が小さいことから様々な宿主において組換え蛋白質として生産されている（非特許文献５）。
　本発明者らは、これまで水溶性の形態で蛋白質をコメに蓄積させることに成功していないイネ発現系にナノ抗体を適用して発現させたところ、意外にも、ナノ抗体が、水溶性の形態でコメにおいて蓄積されることを見出した。ナノ抗体のコメにおける局在の解析により、この水溶性の特質においては、コメの蛋白質貯蔵体以外（細胞質）へのナノ抗体の局在が、主要な要因の一つとなっていると考えられた。さらに、本発明者らは、可溶化したナノ抗体が、その本来の性能である耐熱性と安定性を保持していることを見出した。また、ナノ抗体は単量体よりも多量体の方が抗原に対する中和効果が高いことも見出した。このように、本発明者らは、抗体をナノ抗体としてイネ発現系に適用することにより、抗体を水溶性の形態で、かつ、抗体の本来の特性を失わせることなく、コメに蓄積させることに世界で初めて成功し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）ナノ抗体をコードするＤＮＡが導入され、ナノ抗体がコメに発現しているトランスジェニックイネ。
（２）ナノ抗体が水溶性の形態でコメに蓄積している、（１）に記載のトランスジェニックイネ。
（３）（１）または（２）に記載のトランスジェニックイネから採取されたコメ。
（４）（３）に記載のコメの、ナノ抗体を含有する水溶性画分。
（５）（３）に記載のコメまたは（４）に記載の水溶性画分の、ナノ抗体を含有する加工物。
（６）（３）に記載のコメ、（４）に記載の水溶性画分、または（５）に記載の加工物を含有する、組成物。
（７）ナノ抗体の製造方法であって、
（ａ）ナノ抗体をコードするＤＮＡをイネに導入し、ナノ抗体がコメに発現しているトランスジェニックイネを作出する工程、
（ｂ）工程（ａ）で作出されたトランスジェニックイネのコメから水溶性画分を得る工程、
を含む方法。
　本発明により、ナノ抗体を、その本来の特性を失わせることなく、水溶性の形態でコメに蓄積させることが可能となった。本発明によれば、大量のナノ抗体を安価かつ安定な形態で製造することができる。ナノ抗体を蓄積させたコメやその水溶性画分、あるいはそれらの加工物は、安全な組成物として、医薬や飲食品などに応用することができる。
ＶＨＨ１遺伝子の導入を行ったイネの種子（以下、「ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１」と略す）におけるＶＨＨ１の発現を検出した結果を示す写真である。（ａ）は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットの写真であり、（ｂ）は、開花後１４日目の種子を免疫染色した写真である。 ２種類の質量分析計（ＱＳＴＡＲ　ＥｌｉｔｅおよびＬＴＱ　Ｏｒｂｉｔｒａｐ）を用いて、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１のアミノ酸配列を分析した結果を示す図である。 ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１からのＶＨＨ１抽出条件を検討した結果を示す写真である。Ｌａｎｅ　１：ｒＶＨＨ１，Ｌａｎｅ　２：８Ｍ　尿素入りＰＢＳを用いたＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１からの抽出液，Ｌａｎｅ　３：ＰＢＳを用いたＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１からの抽出液。 ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｓｃＦｖからのｓｃＦｖ抽出条件を検討した結果を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびマウスＭ細胞に特異性をもつ抗体（ＮＫＭ－１６－２－４）を用いたウェスタンブロットの写真である。Ｌａｎｅ　１：ＰＢＳを用いたＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｓｃＦｖからの抽出液，Ｌａｎｅ　２：ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｓｃＦｖのＰＢＳ抽出処理における沈殿物からの尿素入りＳＤＳ溶液による抽出液，Ｌａｎｅ　３：ＰＢＳを用いた野生株の種子からの抽出液，Ｌａｎｅ　４：野生株種子のＰＢＳ抽出処理における沈殿物からの尿素入りＳＤＳ溶液による抽出液，Ｌａｎｅ　５：ＮＫＭ－１６－２－４抗体，Ｌａｎｅ　６：尿素入りＳＤＳ溶液によるＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｓｃＦｖからの抽出液，Ｌａｎｅ　７：尿素入りＳＤＳ溶液による野生株の種子からの抽出液。また、図４中の点線の矢印はｓｃＦｖ蛋白質のバンドを示す。 免疫電顕により種子胚乳細胞内におけるＶＨＨ１の局在を分析した結果を示す写真である。 ロタウィルスに対するＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１の中和効果を評価した結果を示す写真（左）およびグラフ（右）である。 消化管内におけるＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１の安定性・分布をウエスタンブロットで評価した結果を示す写真である。 ロタウィルスを感染させたマウスにおけるＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１の中和効果を評価した結果を示す写真である。 ロタウィルスを感染させる前からＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１の投与を開始したマウスにおける、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１の中和効果を評価した結果を示すグラフである。 ロタウィルスを感染させた後にＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１の投与を開始したマウスにおける、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１の中和効果を評価した結果を示すグラフである。 幼若マウスの小腸組織をヘマトキシリン／エオシン染色し、顕微鏡観察した結果を示す写真である。（Ｉ）は非感染の幼若マウスの小腸組織を示し、（II）はロタウィルスを感染させた幼若マウスの小腸組織を示し、（III）はロタウィルスを感染させ、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１を投与した幼若マウスの小腸組織を示し、（IＶ）はロタウィルスを感染させ、ＷＴ－Ｒｉｃｅ（日本晴れ）を投与した幼若マウスの小腸組織を示す。 幼若マウスの小腸組織におけるロタウィルス量をリアルタイムＰＣＲにて評価した結果を示すグラフである。「コントロール」は非感染の幼若マウスの小腸組織におけるＶＰ７　ＲＮＡコピー数を示し、「ＲＲＶ感染のみ」はロタウィルスを感染させた幼若マウスの小腸組織におけるＶＰ７　ＲＮＡコピー数を示し、「ＷＴｒｉｃｅ投与」はロタウィルスを感染させ、ＷＴ－Ｒｉｃｅ（日本晴れ）を投与した幼若マウスの小腸組織におけるＶＰ７　ＲＮＡコピー数を示し、「ＭｕｃｏＲｉｃｅＶＨＨ１投与」はＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１を投与した幼若マウスの小腸組織におけるＶＰ７　ＲＮＡコピー数を示す。 ロタウィルスを感染させたＳＣＩＤマウスの下痢の状況（下痢スコア）に対する、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１投与による改善効果を評価した結果を示すグラフである。 ロタウィルスを感染させたＳＣＩＤマウスにおけるロタウィルスＶＰ７　ＲＮＡ量に対する、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１投与による影響を評価した結果を示すグラフである。 ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨのＰＢＳ抽出液及び沈殿物におけるｍＴＮＦαＶＨＨの発現を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔにて分析した結果を示す写真である。一番左の写真はＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨモノマーをＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分析した結果を示し、左から２番目の写真はＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨモノマーを抗ｍＴＮＦαＶＨＨポリクローナル抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔにて分析した結果を示し、左から３番目の写真はＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨダイマーをＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分析した結果を示し、一番右の写真はＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨダイマーを抗ｍＴＮＦαＶＨＨポリクローナル抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔにて分析した結果を示す。また「Ｌａｎｅ　１」はｒｍＴＮＦαＶＨＨ（大腸菌由来のリコンビナントｍＴＮＦαＶＨＨ、陽性コントロール）の分析結果を示し、「Ｌａｎｅ　２」はＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨモノマーのＰＢＳ抽出液の分析結果を示し、「Ｌａｎｅ　３」はＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨモノマーのＰＢＳ抽出処理後の沈殿物の分析結果を示し、「Ｌａｎｅ　４」はＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨダイマーのＰＢＳ抽出液の分析結果を示し、「Ｌａｎｅ　５」はＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨダイマーのＰＢＳ抽出処理後の沈殿物の分析結果を示す。さらに図中、四角で囲んだバンドは、ｍＴＮＦαＶＨＨモノマー（１３．８ｋＤａ）又はｍＴＮＦαＶＨＨダイマー（２８．４ｋＤａ）であることを示す。 ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨのＰＢＳ抽出液におけるｍＴＮＦαＶＨＨの発現を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔにて分析した結果を示す写真である。左側の写真はＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨ等をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分析した結果を示し、右側の写真はＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨ等をＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔにて分析した結果を示す。また図中、「ｒｍＴＮＦαＶＨＨ」はｒｍＴＮＦαＶＨＨを分析した結果を示し、「ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨ」はＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨモノマーのＰＢＳ抽出液の分析結果を示し、「ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨ　Ｄｉｍｍｅｒ」はＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨダイマーのＰＢＳ抽出液の分析結果を示し、「ＷＴ－Ｒｉｃｅ」はＷＴ－Ｒｉｃｅ（日本晴）のＰＢＳ抽出液の分析結果を示す。さらに図中、矢印で示したバンドは、ｍＴＮＦαＶＨＨモノマー（図中「ＶＨＨ（１３．８ｋＤａ）と表記）又はｍＴＮＦαＶＨＨダイマー（図中「ＶＨＨ　Ｄｉｍｅｒ（２８．４ｋＤａ）と表記）であることを示す。 ｍＴＮＦαに対するｍＴＮＦαＶＨＨの阻害率を評価した結果を示すグラフである。なお図中、一番右側の折れ線（ｒＶＨＨ）はｒｍＴＮＦαＶＨＨの添加量とｍＴＮＦαに対する阻害率との関係を示し、真ん中の折れ線（モノマー）はＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨモノマー由来ＰＢＳ抽出液の添加量とｒｍＴＮＦαＶＨＨのｍＴＮＦαに対する阻害率との関係を示し、一番左側の折れ線「ダイマー」はＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨダイマー由来ＰＢＳ抽出液の添加量とｒｍＴＮＦαＶＨＨのｍＴＮＦαに対する阻害率との関係を示す。 ｍＴＮＦαの添加量とＷＥＨＩ１６４細胞（マウス線維芽細胞）の生存率との関係を示すグラフである。 コメ種子におけるｍＴＮＦαＶＨＨモノマーの局在を免疫電顕法にて解析した結果を示す写真である。ＡはｍＴＮＦαＶＨＨ米（ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨモノマー）におけるｍＴＮＦαＶＨＨモノマーの局在（Ｉ型蛋白貯蔵体（ＰＢ－I）と細胞質）を抗ｍＴＮＦαＶＨＨ抗体を用いて検出し、観察した結果を示し、ＢはｍＴＮＦαＶＨＨ米におけるｍＴＮＦαＶＨＨモノマーの局在（II型蛋白貯蔵体（ＰＢ－II）、細胞質、澱粉（Ｓｔ：Ｓｔａｒｃｈ）、細胞壁（ＣＷ：Ｃｅｌｌ　Ｗａｌｌ））を抗ｍＴＮＦαＶＨＨ抗体を用いて検出し、観察した結果を示す。また、ＣはｍＴＮＦαＶＨＨ米を通常ウサギＩｇＧと反応させて、ＰＢ－Ｉ、ＰＢ－IIおよび細胞質を観察した結果（「α－Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ」、陰性コントロール）を示し、Ｄは日本晴米（ＷＴ－Ｒｉｃｅ）を抗ｍＴＮＦαＶＨＨ抗体と反応させて、ＰＢ－Ｉ、ＰＢ－IIおよび細胞質を観察した結果（「ＷＴ日本晴」、陰性コントロール）を示す。 コメ種子におけるｍＴＮＦαＶＨＨダイマーの局在を免疫電顕法にて解析した結果を示す写真である。ＡはｍＴＮＦαＶＨＨダイマー米（ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨダイマー）におけるｍＴＮＦαＶＨＨダイマーの局在（ＰＢ－Ｉ、ＰＢ－II、細胞質）を抗ｍＴＮＦαＶＨＨ抗体を用いて検出し、観察した結果を示し、ＢはｍＴＮＦαＶＨＨダイマー米におけるｍＴＮＦαＶＨＨダイマーの局在（ＰＢ－Ｉ、ＰＢ－II、細胞質、細胞壁）を抗ｍＴＮＦαＶＨＨ抗体を用いて検出し、観察した結果を示す。また、ＣはｍＴＮＦαＶＨＨダイマー米を通常ウサギＩｇＧと反応させて、ＰＢ－Ｉ、ＰＢ－II、Ｓｔおよび細胞質を観察した結果を示し、Ｄは日本晴米（ＷＴ－Ｒｉｃｅ）を抗ｍＴＮＦαＶＨＨ抗体と反応させて、ＰＢ－Ｉ、ＰＢ－IIおよび細胞質を観察した結果（「ＷＴ日本晴」、陰性コントロール）を示す。
　本発明は、ナノ抗体をコードするＤＮＡが導入され、ナノ抗体がコメに発現しているトランスジェニックイネを提供する。
　本発明において「イネ」とは、Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａに属する植物を意味し、遺伝子組換えの対象となるイネの品種は、Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａに属する限り、特に限定されるものではない。
　本発明において「ナノ抗体」とは、抗体重鎖の可変領域（Ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ａ　ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ又はＶＨＨとも称す）からなり、抗原を認識することができる抗体を意味する。ナノ抗体は、典型的には、ラクダ科の動物（例えば、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーニャ）に由来する抗体である。
　本発明におけるナノ抗体は、ＶＨＨをモノマーとして用いることができるが、ダイマー以上の多重抗体としても用いることができる。ダイマー以上の多重抗体としては、同一のＶＨＨを連結したもの（例えば、二量体である場合はホモダイマー）であってもよく、異なる分子や同じ分子内の異なるエピト―プを認識する二つ以上のＶＨＨが連結されているもの（例えば、二量体である場合はヘテロダイマー）であってもよい。かかるＶＨＨの連結方法としては特に制限されることなく、公知の手法を用いることができる。例えば、スぺーサー配列を介してＶＨＨ間が連結されている抗体をコードするＤＮＡを含むベクターを構築し、トランスジェニックイネのコメにおいて発現させる方法が挙げられる。また、コメにおいて単一のＶＨＨを発現させ、水溶性画分から精製し、その後、精製されたＶＨＨ同士を結合することにより、ダイマー以上の多重抗体を作製することもできる。
　本発明におけるナノ抗体は、所望の抗原に対するナノ抗体を用いることができる。抗原としては、例えば、（１）病原性ウィルス（例えば、ロタウィルス、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ノーウオーク（ノロ）ウィルス、狂犬病ウィルス、ＲＳウィルス、サイトメガロウィルス、口蹄疫ウィルス、伝染性胃腸炎ウィルス、風疹ウィルス、ＡＴＬウィルス、アデノウィルス、マンプス（おたふく風邪）ウィルス、コクサッキーウィルス、エンテロウィルス、ヘルペスウィルス、天然痘ウィルス、ポリオウィルス、麻疹ウィルス、日本脳炎ウィルス、テング熱ウィルス、黄熱ウィルス、西ナイルウィルス、ＳＡＲＳ（コロナウィルス）、インフルエンザウィルス、ＨＩＶ（ＡＩＤＳウィルス）、エボラ出血熱ウィルス（フィロウィルス）、マールブルグウィルス（フィロウィルス）、ラッサ熱ウィルス、ハンタウィルス、ニパウィルス等）に由来する蛋白質などの抗原、（２）病原性細菌（例えば、コレラ菌、病原性大腸菌、インフルエンザ菌、肺炎球菌、百日咳菌、ジフテリア菌、ペスト菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、炭ソ菌、野兎病菌、大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ菌、ＭＲＳＡ（黄色ブドウ球菌）、ＶＲＥ（腸球菌）、結核菌、赤痢菌、腸チフス菌、パラチフス菌、クラミジア菌、アメーバ赤痢、レジオネラ菌、ライム病ボレリア菌、ブルセラ病（波状熱）菌等）に由来する蛋白質などの抗原、（３）リケッチャ（例えば、Ｑ熱リケッチャ、クラミジア等）に由来する蛋白質などの抗原、（４）原虫（マラリア原虫、トリパノソーマ等）に由来する蛋白質などの抗原、（５）サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＮＦ－γ、及びそれらのレセプターなど）、（６）ケモカイン（例えば、ＣＣＬ１７とそのレセプターＣＣＲ４、ＣＸＣＬ１０とそのレセプターＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４など）、（７）成長因子及びホルモン（例えば、ＥＧＦ　（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ｈＣＧ（　ｈｕｍａｎ　Ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ　ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）、およびそれらのレセプターなど）、（８）腫瘍抗原（例えば、ＣＥＡ　ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ等の大腸がん腫瘍抗原、Ｈｅｒ２等の乳がん腫瘍抗原、ＰＳＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ）等の前立腺がん腫瘍抗原など）、（９）細胞抗原（例えばＣＤ３、ＣＤ２５、ＲＡＮＫＬなど）、（１０）その他（例えばフォン・ヴィレブランド因子（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　ｆａｃｔｏｒ：ｖＷＦ血小板凝集因子）など）が挙げられる。
　ナノ抗体をコードするＤＮＡに含まれるコドンは、植物型コドンに改変されていることが好ましい。植物型コドンに改変されることにより、コメ（イネ胚乳細胞内）におけるナノ抗体の発現効率を向上させることができる。
　ナノ抗体をコメにおいて発現させるための、ナノ抗体をコードするＤＮＡを含むベクターにおいては、イネ胚乳特異的に機能するプロモーターおよびターミネーターを利用することが好ましい。ベクターにおいては、ナノ抗体をコードするＤＮＡの上流に当該プロモーターが連結され、ナノ抗体をコードするＤＮＡの下流に当該ターミネーターが連結される。イネ胚乳特異的に機能するプロモーターおよびターミネーターとしては、例えば、イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターおよびターミネーターが挙げられる。イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター及びターミネーターを利用することにより、コメにおいてナノ抗体を効率よく発現させることができる。ここで「イネ胚乳貯蔵タンパク質」とは、イネ胚乳細胞内で特異的に発現し、イネ胚乳細胞内に蓄積されるタンパク質を意味し、その種類は特に限定されるものではない。イネ胚乳貯蔵タンパク質としては、例えば、グルテリン、プロラミン、グロブリン等が挙げられる。
　イネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターは、グルテリンＧｌｕＢ－１遺伝子又はプロラミン１３Ｋ遺伝子のプロモーターであることが好ましい。これら遺伝子のプロモーターは、その他のイネ胚乳貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターよりもプロモーター活性が高い点で有利である。イネ胚乳特異的プロモーターは、イネ胚乳特異的プロモーター活性を有する限り、天然型プロモーター及び変異型プロモーターのいずれであってもよい。「変異型プロモーター」とは、天然型プロモーターの塩基配列において１若しくは複数個の塩基が置換、欠失又は付加した塩基配列からなり、イネ胚乳特異的プロモーター活性を有するプロモーターを意味する。イネ胚乳特異的ターミネーターについても同様である。
　また、コメにおいてナノ抗体を効率的に蓄積させるために、コメの貯蔵タンパク質の発現を抑制する処理を行うことが好ましい。このような処理としては、例えば、ＲＮＡｉ法により１３Ｋプロラミン又はグルテリンの発現のどちらか一方を抑制する、または１３Ｋプロラミン及びグルテリンの発現を両方とも抑制（２重抑制）する発現抑制カセットをイネに導入することが挙げられる。
　イネ細胞へのベクターの導入方法は特に限定されるものではないが、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・リゾゲネス等を利用した間接導入法（Ｈｉｅｉ，Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｊ．，６，２７１－２８２，１９９４；Ｔａｋａｉｗａ，Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ．１１１，３９－４９，１９９５；日本特許第３１４１０８４号）、エレクトロポレーション法（Ｔａｄａ，Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ，８０，４７５，１９９０）、ポリエチレングリコール法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　ＭｏｌＢｉｏｌ．，２０，６１９－６２９，１９９２）、パーティクルガン法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｊ．２，２７５－２８１，１９９２、Ｆｒｏｍｍ，Ｍ．Ｅ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，８３３－８３９，１９９０）等の直接導入法が挙げられる。イネ細胞を培養してイネ植物体を再生させる方法は特に限定されるものではなく、公知の方法に従えばよい。
　トランスジェニックイネは、例えば、イネ細胞に、ナノ抗体をコードするＤＮＡを発現させるためのベクターを導入した後、形質転換イネ細胞を培養してイネ植物体を再生させることにより作出することができる。ベクターを導入するイネ細胞の形態は、植物体に再生可能である限り特に限定されるものではなく、例えば、培養細胞、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根、カルス等が挙げられる。ベクターとしてプラスミドを用いる場合は、ベクターが導入されたイネ細胞を効率よく選択することができるように、ハイグロマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を含有させておくことが好ましい。なお、経口剤として、発現米から精製することなしに医薬品に用いる場合は、特に安全性が確保されてないハイグロマイシンは、コトランスフェクション法等の公知の方法で除く必要がある。
　こうして作出されたトランスジェニックイネのコメにおいては、ナノ抗体が、水溶性の形態で、かつ、その本来の特性（例えば、抗原への結合性、ナノ抗体の耐熱性や安定性）を失うことなく蓄積されている。従って、本発明は、ナノ抗体の製造方法であって、（ａ）ナノ抗体をコードするＤＮＡをイネに導入し、ナノ抗体がコメに発現しているトランスジェニックイネを作出する工程、および（ｂ）工程（ａ）で作出されたトランスジェニックイネのコメから水溶性画分を得る工程、を含む方法をも提供するものである。さらに、本発明は、本発明のトランスジェニックイネから採取したコメおよびそのナノ抗体を含有する水溶性画分をも提供するものである。ここで「コメ」とは、胚乳を含有する組織又はその部分を意味し、籾、玄米、種子、白米、これらの部分等が含まれる。また、「水溶性画分」とは、界面活性剤や還元剤など蛋白質を可溶化するための薬剤を含まない水や緩衝液で溶出しうるコメの画分を意味する。抗体を含め蛋白質を水溶性の形態でコメに蓄積させることは、これまで不可能であり、本発明において世界で初めて成功したことである。この水溶性の特質は、ナノ抗体が、主としてコメの蛋白質貯蔵体（ＰＢ）以外（すなわち、細胞質）に蓄積することが原因の一つになっていると考えらえる。
　また、本発明は、上記コメや水溶性画分の加工物をも提供するものである。ここで「加工物」には、ナノ抗体を含有する限りいかなる加工物も含まれる。施す加工としては、例えば、脱穀、粉末化、ナノ抗体を含む所望の画分の抽出、抽出された画分の精製等が挙げられる。
　こうして調製されたコメ、その水溶性画分、あるいはそれらの加工物は、安全性の高い組成物として利用することができる。組成物の形態は特に制限はなく、医薬組成物、飲食品、動物用飼料などが含まれる。医薬組成物は、例えば、経口用組成物として利用することができる。コメの水溶性画分やその加工物は、例えば、注射用組成物などとしても利用することができる。本発明の組成物を投与もしくは摂取させる動物としては、例えば、ヒト及びその他の脊椎動物（例えば、哺乳類、鳥類、両性類、魚類、爬虫類）等が挙げられる。
　本発明における組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することもできる。これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品や動物飼料として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。本発明の組成物を投与もしくは摂取する場合、その投与量または摂取量は、対象の年齢、体重、組成物の種類（医薬品、飲食品、動物飼料など）などに応じて、適宜選択される。例えば、１回当たりの投与量または摂取量は、一般に、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
　以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　（実施例１）
　ＶＨＨ１発現米（ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１）の作出
　ロタウィルスに対するナノ抗体（ＶＨＨ１）の遺伝子情報は公知の公開情報を用いた（ｈｔｔｐ：／／ｉｇｉｔｕｒ－ａｒｃｈｉｖｅ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｕｕ．ｎｌ／ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｓ／２００４－０４１９－０９４１０５／ｃ４．ｐｄｆ）。ＶＨＨ１は、アカゲザル・ロタウィルス（ＲＲＶ）血清型Ｇ３をラクダ科のラマに免疫して得られたＨ鎖のみの抗体の抗原結合部位である。ＶＨＨ１をコードする遺伝子を、イネが利用しやすいコドンをもとに再構築し人工合成した。
　導入遺伝子の設計については、公開された特許情報（ＷＯ２００４／０５６９９３　Ａ１）で示されたように、選抜マーカーカセット、外来遺伝子の過剰発現カセット、種子内在性貯蔵タンパク質遺伝子に対する発現抑制カセット、の３者を１つのＴ－ＤＮＡバイナリーベクター（ｐＺＨ２Ｂ／３５ＳＮｏｓ）上に連結して同時に導入する方法を参考にした。すなわち、まず選抜マーカーカセットは、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｍＨＰＴ）をＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＮｏｓターミネターに連結した。次に、外来遺伝子カセットは胚乳細胞特異的プロラミン１３Ｋプロモーター・１０Ｋプロラミンシグナルとプロラミン１３Ｋプロラミンターミネターとの間にＶＨＨ１をコードする遺伝子を挿入した。さらに、貯蔵タンパク質遺伝子に対する発現抑制カセットは、ＲＮＡｉ法により１３Ｋプロラミン及びグルテリンの発現を２重抑制するものを構築した。具体的には、イネアスパラギン酸プロテアーゼ（ＲＡＰ）イントロンの両端に、１３ＫプロラミンｃＤＮＡの一部４５ｂｐとグルテリンＡのｃＤＮＡの一部１２９ｂｐをセンスおよびアンチセンス方向に連結し、これをユビキチンプロモーターとＮｏｓターミネターの間に挿入することで、ヘアピン型ＲＮＡを発現する構造とした。これらすべてを連結したＶＨＨ１遺伝子発現用Ｔ－ＤＮＡバイナリーベクターを、アグロバクテリウムを介した定法によってイネ（日本晴）に導入し、ＶＨＨ１発現米を作出した。
　（実施例２）
　ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１におけるＶＨＨ１発現解析
　ＶＨＨ１遺伝子の導入を行ったイネの種子（以下、「ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１」とも称する）がＶＨＨ１を発現しているかどうかに関して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔおよび免疫染色の手法を用いて解析した。脱穀後の種子（ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１および野生株）を粉砕化し、米粉末をサンプルバッファー（２％　ＳＤＳ、５％　β－メルカプトエタノール、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０％　グリセロール、ｐＨ　６．８）に懸濁し、抽出液ならびに陽性コントロールとして大腸菌由来のリコンビナントＶＨＨ１（以下、ｒＶＨＨ１と略す）を１２％　ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動により分離した。分離後のゲルはＣＢＢ（クーマシー・ブリリアント・ブルー）染色を行った。その結果、野生株の種子にはｒＶＨＨ１と同サイズの蛋白を認めなかったのに対して、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１にはｒＶＨＨ１と同サイズの蛋白が発現していることが確認された（図１中ａ）。また、分離後のゲルをＰＶＤＦメンブレンに転写し、ｒＶＨＨ１をウサギに免疫して作製した抗ＶＨＨ１ポリクローナル抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ解析を行った。その結果、抗体特異的なバンドをリコンビナント蛋白と同位置に認めた（図１中ａ）。さらに、種子におけるＶＨＨ１の発現を抗ＶＨＨ１ポリクローナル抗体を用いた免疫染色により解析を行った。具体的には、開花後１４日目の種子を採取・切断し、４％　パラフォルムアルデヒド溶液（ＰＦＡ）に浸漬固定し、スクロース浸漬後に凍結包埋を行い、３μｍの凍結切片を作成、抗ＶＨＨ１ポリクローナル抗体を反応させ、その後ＨＲＰ標識ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体を反応させ、３，３’－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）により発色、ヘマトキシリンによるカウンター染色を行った。その結果、野生株の種子には抗ＶＨＨ１抗体特異的な染色像は見られなかったが、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１においては抗ＶＨＨ１抗体特異的染色像が種子全域に認められた（図１中ｂ）。
　（実施例３）
　ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１由来のＶＨＨ１の構造解析
　米に発現したＶＨＨ１の構造を明らかにするため、構造解析を行った。ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１米粉末をサンプルバッファー（２％　ＳＤＳ、５％　β－メルカプトエタノール、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０％　グリセロール、ｐＨ　６．８）に懸濁し、抽出液ならびに陽性コントロールとしてｒＶＨＨ１を１２％　ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動により分離した。分離後のゲルはＣＢＢ染色を行い、ＶＨＨ１に該当するバンドを切り出し、ＣＢＢ脱色・脱水後にトリプシンによるゲル消化を行い、ペプチドを抽出した。抽出したペプチドはｎａｎｏＬＣによる分離を行い、２種類の質量分析計（ＱＳＴＡＲ　ＥｌｉｔｅおよびＬＴＱ　Ｏｒｂｉｔｒａｐ）を用いて解析した。なお、ＱＳＴＡＲ　Ｅｌｉｔｅの解析結果を配列番号：１に示し、ＬＴＱ　Ｏｒｂｉｔｒａｐの解析結果を配列番号：２に示し、また、これらをまとめて図２に示す。その結果、図２に示すように、２種類の質量分析計の結果を合わせて完全なアミノ酸配列を解読することができた。またこの結果から、ＶＨＨ１の完全な配列に加え、Ｎ末端に米特有の配列であるＳＲ（セリン＋アルギニン）を持つことが示されたが、米の発現系を用いたことによるアスパラギンやセリン等への糖鎖付加のような修飾は認められなかった。
　（実施例４）
　ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１からのＶＨＨ１抽出条件検討
　ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１からのＶＨＨ１抽出条件を検討した。１００ｍｇのＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１米粉末にリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと略す）１ｍＬあるいは８Ｍ尿素入りＰＢＳ　１ｍＬを加え、懸濁後すみやかに遠心し、上清および陽性コントロールとしてｒＶＨＨ１をサンプルバッファー（２％　ＳＤＳ、５％　β－メルカプトエタノール、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０％　グリセロール、ｐＨ　６．８）に懸濁し、１２％　ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動により分離した。分離後のゲルはＣＢＢ染色を行った。その結果、図３に示すように、ＰＢＳ単独で８Ｍ　尿素入りＰＢＳと同程度のＶＨＨ１がＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１から抽出されることが明らかとなった。このことは米粉末中のＶＨＨ１が水溶性であることを示している。
　（比較例１）
　１本鎖抗体を発現するＭｕｃｏＲｉｃｅと可溶化
　マウスＭ細胞に特異性をもつモノクローナル抗体ＮＫＭ－１６－２－４（Ｔ．Ｎｏｃｈｉ　ｅｔ．ａｌ．Ｊ．　Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０４．２７８９－２７９６（２００７））から抗体遺伝子をクローニングし、その１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子を、イネが利用しやすいコドンをもとに再構築し人工合成した。米発現用に改変したｓｃＦｖ遺伝子は、実施例１において用いたＴ－ＤＮＡバイナリーベクターの胚乳細胞特異的プロモーター下に挿入し、最終的にアグロバクテリウムを介してイネ（日本晴）の形質転換を行い、定法によりｓｃＦｖ発現米を作出した。このｓｃＦｖを発現する米粉末は実施例４の条件で、図４に示すように、ＰＢＳではまったく可溶化できず、尿素ＳＤＳでのみ可溶化された。
　（実施例５）
　ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１におけるＶＨＨ１の局在
　免疫電子顕微鏡により種子におけるＶＨＨ１の局在を調べた。開花後１４日目の種子を採取し、０．５～１．０μｍ程度の切片を作製し、４％　ＰＦＡで固定後、ＬＲ－ホワイト樹脂に浸漬包埋した。その後１００μｍの超薄切片を作製しグリッドに載せ、抗ＶＨＨ１ポリクローナル抗体を反応させ、洗浄後１８ｎｍ金コロイド標識抗ウサギＩｇＧ抗体を反応させた。その後、洗浄し、１％グルタルアルデヒドで固定し、２％酢酸ウラニルと鉛溶液による電子２重染色を行い、電子顕微鏡による観察を行った。その結果、ＶＨＨ１は、ＰＢ－ＩＩに顕著に観察され、ＰＢ－Ｉには外表付近に軽度観察されたが、これらＰＢ以外の細胞質に多くのＶＨＨ１の蓄積が見られた（図５）。ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１の抽出検討でみられたＶＨＨ１の水溶性は、特に、高い水溶性を示す細胞質への局在に依存していることが考えられた。
　（実施例６）
　ロタウィルスに対するＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１の中和効果の評価（細胞感染実験）
　ＭＡ１０４細胞（アカゲザル腎臓由来株化細胞）を９６穴プレートに播種し、約２日後、ウェル内に十分増殖した上で、無血清ＭＥＭ培地で洗浄を行った。トリプシン処理（３７℃、３０分）を行ったアカゲザル・ロタウィルス（以下、ＲＲＶと略す）液（無血清ＭＥＭ培地使用）を準備した。また、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１粉末および野生米粉末１００ｍｇに無血清ＭＥＭ　１ｍＬを加え懸濁し、遠心後の上清を０．２２ｕｍ　フィルターを通して無菌化したものを段階希釈した。様々な濃度の米抽出液に２００ｆｆｕ（ｆｏｃｕｓ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔｓ、フォーカス形成単位）のトリプシン処理されたＲＲＶを加え、さらにその混合液を９６穴プレートのＭＡ１０４細胞上に加えた。陰性コントロールとして無血清ＭＥＭ培地のみ、陽性コントロールとしてＲＲＶのみを各ウェルに加えた。約１時間３７℃でＣＯ２インキュベーターで反応させた後、無血清ＭＥＭ培地で洗浄を繰り返し、１０％　ＦＣＳ入りＭＥＭ培地を加えて、ＣＯ２インキュベーター（３７℃）で１２時間培養を行った。その後、無血清ＭＥＭ培地で洗浄、さらにＰＢＳで洗浄し、４％　ＰＦＡで固定を行った。洗浄後、感染細胞内で増殖することの知られているＶＰ６（ＲＲＶの構成蛋白の一種）に対するマウスモノクローナル抗体を反応させた。洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体を反応させ、洗浄後発色させた。感染細胞は赤茶色に発色することから、顕微鏡下で感染細胞数を測定し、ＲＲＶのみを反応させたウェルの感染細胞数を１００％とした。その結果、図６に示すように、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１由来のＶＨＨ１は、ＲＲＶ単独あるいはＲＲＶと野生米抽出液の混合液と比較して有意に感染率を減少させ、ＲＲＶに対する中和効果を証明している（ＶＨＨ１濃度は１ｕｇ／ｍＬ）。また１年間室温で保存したＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１は収穫直後のＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１と同程度の中和効果を持つことが明らかとなり、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１の長期室温保存性が証明された。
　（実施例７）
　消化管内におけるＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１の安定性・分布の評価
　ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１粉末と純水との懸濁液を遠心した後、上清を回収し、１００μｇ／ｍＬ濃度のＶＨＨ１溶液４０μｌを日齢４日のＢａｌｂ／ｃマウスの胃内に投与した。１、３、４、９時間後に胃・空腸・回腸・大腸の内容物を回収し、ＰＢＳ　５００ｕＬに懸濁した。その後、同液をサンプルバッファー（２％　ＳＤＳ、５％　β－メルカプトエタノール、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０％　グリセロール、ｐＨ　６．８）に懸濁し、１２％　ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動により分離し、抗ＶＨＨ１ポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロット解析を行った。その結果、図７に示すように米由来のＶＨＨ１は投与４時間後までは胃から大腸までの全消化管に認められた。また、投与９時間後では約５０％のマウスに空腸から大腸にかけて米由来ＶＨＨ１が認められた。
　（実施例８）
　ロタウィルスに対するＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１の中和効果の評価（幼若動物を用いた感染実験１）
　日齢４日目のＢａｌｂ／ｃマウスに、トリプシン処理（３７℃、３０分）を行ったＲＲＶ　２ｘ１０７ｆｆｕ（ＭＥＭ　２０ｕｌに含有）を胃内に投与すると、約２４時間後から水様性下痢が認められ（図８）、３～４日後に自然軽快する。この感染モデルを用い、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１のＲＲＶに対する中和効果・下痢抑制効果を検証した。ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１とＰＢＳを懸濁して遠心後に得られた上清（ＶＨＨ１濃度２００ｕｇ／ｍＬ）をＲＲＶ投与６時間前あるいは６時間後に２０μＬ（ＶＨＨ１量４μｇ）投与し、以後１２時間毎に胃内投与を投与４日目（ＲＲＶ投与日を０日とする）まで繰り返した。投与４日目までの下痢の発症頻度を計測した。その結果、ＲＲＶ投与前および投与後に米由来ＶＨＨ１を投与した両群で、下痢の発症率は有意に低値であった（図９、１０）。このことから、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１はＲＲＶに対する中和効果・下痢抑制効果を有し、その効果は予防的投与だけでなく、ＲＲＶ暴露後でも認められることが分かった。
　（実施例９）
　ロタウィルスに対するＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１の中和効果の評価（幼若動物を用いた感染実験２）
　実施例８と同様にして、幼若マウスを用いてロタウィルス感染モデルを調製し、実施例８において指標とした下痢の状態の代わりに、小腸組織の切片の状態及びロタウィルス量の増加を指標としてロタウィルスに対するＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１の中和効果を評価した。
　すなわち、小腸組織切片を定法にてＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ／Ｅｏｓｉｎ染色して観察した。得られた結果は図１１に示す。
　また、ロタウィルス量は小腸組織からの全ＲＮＡを抽出し、定法でｃＤＮＡを調製し、Ｐａｎｔらの方法（Ｐａｎｔ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２００６年、１９４巻、１５８０～１５８８ページに記載の方法）にてロタウィルスのＶＰ７をコードするｍＲＮＡをリアルタイムＰＣＲで定量することによって、ロタウィルスの増減を評価した。得られた結果は図１２に示す。
　図１１に示した結果から明らかなように、実施例８と同様の条件にて、ロタウイルスを感染（２ｘ１０７ｆｆｕ　ＲＲＶ）させ、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１を投与した幼若マウスの小腸組織においては、上皮細胞（腸管上皮細胞）に異常は認められなかった（図１１のIII　参照）。一方、ロタウイルスを感染させた幼若マウスの小腸組織（図１１のII　参照）及びロタウイルスを感染させ、ＷＴ－Ｒｉｃｅ（日本晴）を投与した幼若マウスの小腸組織（図１１のIV　参照）において、これらのマウスの上皮細胞には多数の空胞が観察された。
　また、図１２に示した結果から明らかなように、ウイルス感染のみのマウス小腸及びロタウイルスに感染し、ＷＴ－Ｒｉｃｅ（日本晴）を投与したマウス小腸に比して、ロタウイルスに感染し、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１を投与した幼若マウスの小腸におけるロタウイルス（ＲＲＡ）のＶＰ７　ＲＮＡのコピー数は有意に低下していた。
　（実施例１０）
　ロタウィルスに対するＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１の中和効果の評価（免疫不全動物を用いた感染実験）
　免疫不全マウスであるＳＣＩＤマウスを用いてＭｕｃｏＲｉｃｅＶＨＨ１の抗ＲＲＶ－ＶＨＨ１の効果を評価した。すなわち、ＳＣＩＤマウスにロタウイルス（２ｘ１０７ｆｆｕ　ＲＲＶ）を感染させた後、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１　２００ｍｇ（１．７ｍｇＶＨＨ１含有）を７日間毎日２回経口投与し、継時的に下痢の臨床状況と小腸のウイルス量をリアルタイムＰＣＲによるＶＰ７　ＲＮＡ量で評価した。得られた結果を図１３及び１４に示す。なお、図１３の「下痢スコア」は、下痢が認められない場合は「０」とし、弱い下痢が認められる場合は「１」とし、下痢が認められる場合は「２」として評価した結果に基づく。
　図１３及び１４に示した結果から明らかなように、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１投与により免疫不全マウスにおいても下痢の状況は有意の好転し、同時にウイルス量は有意に低下した。
　従って、実施例８及び９に示したような小児のみならず、ワクチンを投与できない免疫不全患者にも、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ１はロタウイルス感染に効果があることが示された。
　（実施例１１）
　ＴＮＦ－αＶＨＨ発現米（ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨ）の作出
　ＴＮＦ－αに対するナノ抗体（ＶＨＨ）の遺伝子情報は公知の情報を用いた（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．５４，１８５６－１８６６（２００６）、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４２：１７０－１７８（２００９））。マウスＴＮＦαＶＨＨモノマー（ｍＴＮＦαＶＨＨモノマー）をコードする遺伝子を、イネが利用しやすいコドンをもとに再構築し人工合成した。また、ＴＮＦαＶＨＨダイマー（ｍＴＮＦαＶＨＨダイマー）をコードする遺伝子は、当該ＶＨＨモノマーどうしを適当なリンカー（アミノ酸配列［ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ］からなるスぺーサー配列）を介して結合させダイマーとし、調製した。
　そして、実施例１において用いたＴ－ＤＮＡバイナリーベクター（ｐＺＨ２Ｂ／３５ＳＮｏｓ）の胚乳細胞特異的プロモーター下に、米発現用に改変したｍＴＮＦαＶＨＨモノマー又はダイマーをコードする遺伝子を挿入し、最終的にアグロバクテリウムを介してイネ（日本晴）の形質転換を行い、定法によりＴＮＦ－αＶＨＨ発現米（ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨ：ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨモノマー及びＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨダイマー）を作出した。
　（実施例１２）
　ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨからのｍＴＮＦαＶＨＨ抽出
　ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨモノマー及びＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨダイマーからのｍＴＮＦαＶＨＨモノマー及びｍＴＮＦαＶＨＨダイマーの各々の抽出について、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを用いて調べた。
　すなわち、先ず１００ｍｇのＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨ米粉末にＰＢＳ１ｍＬを加えて懸濁した後、１時間４℃で撹拌して遠心を行った。次いで、上清及び陽性コントロールのｒｍＴＮＦαＶＨＨはサンプルバッファー（２％　ＳＤＳ、５％　β－メルカプトエタノール、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０％　グリセロール、ｐＨ　６．８）に懸濁した。また、沈殿は尿素入りサンプルバッファー（２％　ＳＤＳ、５％　β－メルカプトエタノール、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０％　グリセロール、８Ｍ　Ｕｒｅａ、ｐＨ　６．８）に懸濁した。このようにして得られた、それぞれのサンプルを１２％　ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動により分離し、分離後のゲルはＣＢＢ染色に供した。また、電気泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンに転写し、ｒｍＴＮＦαＶＨＨをマウスに免疫して得られた抗ｍＴＮＦαＶＨＨポリクローナル抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを行った。その結果、ＶＨＨモノマー及びＶＨＨダイマー共に、抗体特異的なバンドが上清サンプルにおいて認められたことから、米で発現するｍＴＮＦαＶＨＨはモノマーに限らずダイマーにおいてもＰＢＳで可溶化できることがわかった（図１５）。
　（実施例１３）
　ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨにおけるｍＴＮＦαＶＨＨタンパク量の定量
　ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨにおいて発現しているｍＴＮＦαＶＨＨタンパク質量を算出するため、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて調べた。すなわち、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨ米粉末をＰＢＳで可溶化し、得られた上清及びｒｍＴＮＦαＶＨＨ標準品は、サンプルバッファー（２％　ＳＤＳ、５％　β－メルカプトエタノール、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０％　グリセロール、ｐＨ６．８）に懸濁し、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動により分離した。次いで、分離後のゲルはＣＢＢ染色に供した。さらに、ＣＢＢ染色後のゲルはデンシトメーター（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）により定量を行った。その結果、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨに含まれるｍＴＮＦαＶＨＨは、ＶＨＨモノマーにおいて米粉末重量あたり平均０．８２％、ＶＨＨダイマーにおいて平均０．４７％に達しており、ＶＨＨはモノマーのみならずダイマーにおいても高発現・高蓄積していることが判明した（図１６）。
　（実施例１４）
　ｍＴＮＦαに対するＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨの阻害効果の評価（細胞死抑制試験）
　ＷＥＨＩ１６４細胞（マウス線維芽細胞）を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４培地で９６穴プレートに２×１０４個／ウェルに播種し、５％ＣＯ２インキュベーター（３７℃）で２４時間培養した。培養後、培地を除去し、培地のみ（陰性コントロール）、２ｎｇ／ｍＬ　ｒｍＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製）のみを添加した培地（陽性コントロール）又は２ｎｇ／ｍＬ　ｒｍＴＮＦαとＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨ由来ＰＢＳ抽出液とを混合した培地を１００μＬ添加し、２４時間培養した。そして、培養終了の２時間前にＷＳＴ－８（同仁化学研究所製）１０μＬを加えて培養し、４５０ｎｍで吸光度を測定して生細胞数を評価した。また、得られた測定値を用いて、ｍＴＮＦαに対するｍＴＮＦαＶＨＨの阻害率を、陽性コントロールの阻害率を０％、陰性コントロールの阻害率を１００％として評価した。得られた結果を図１７に示す。
　なお、ｒｍＴＮＦαの添加量（２ｎｇ／ｍＬ）は、ＷＥＨＩ１６４細胞の生存率が５０％となる量とした。すなわち、前記同様に、ＷＥＨＩ１６４細胞を所定量（０．５～４ｎｇ／ｍＬ）のｒｍＴＮＦαを添加した培地にて培養し、ＷＳＴ－８アッセイに供し、得られた生細胞数から、生存率が５０％になるｒｍＴＮＦαの添加量を算出した（図１８　参照）。
　図１７に示した結果から明らかなように、ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨ由来のｍＴＮＦαＶＨＨは、ｍＴＮＦαを著しく阻害した。また、その阻害効果はＶＨＨダイマーの方がＶＨＨモノマーより５０～１００倍高いことが明らかになった。
　（実施例１５）
　ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨにおけるｍＴＮＦαＶＨＨの局在（免疫電顕による観察）
　種子におけるｍＴＮＦαＶＨＨモノマー及びダイマーの局在を免疫電顕法にて解析した。すなわち、第二世代目にあたるＭｕｃｏＲｉｃｅ－ｍＴＮＦαＶＨＨモノマー及びダイマーの開花後１４日目の種子を採取し、およそ０．５～１．０μｍの切片を作製した。次いで、これらの切片を４％　ＰＦＡに４℃で４時間振とうさせながら浸漬固定した。エタノール（ＥｔＯＨ）系列での脱水後、４℃で２日間かけて段階的にＬＲ－Ｗｈｉｔｅ樹脂を浸透させていき、最終的に１００％　ＬＲ－Ｗｈｉｔｅ樹脂に浸漬包埋し、５０℃で二晩重合させた。重合後の樹脂ブロックから、ウルトラミクロトームにより８０～１００ｎｍの超薄切片を作製し、フォルムバール支持膜を貼ったニッケルグリッド（載物網）に回収して免疫染色用のサンプルとした。免疫染色は、１０％　ヤギ血清（Ｇｏａｔ　Ｓｅｒｕｍ）で室温３０分のブロッキングを施した後、プロテインＧカラムによってアフィニティー精製した抗ｍＴＮＦαＶＨＨ抗体（家兎）を５μｇ／ｍｌ濃度にて室温１時間反応させた。次いで、洗浄後１８ｎｍ金コロイド標識抗ウサギＩｇＧ抗体を反応させた。そして、二次抗体を反応させた後に再び洗浄し、１％グルタルアルデヒドで室温５分間固定を行った後、２％酢酸ウラニルで５分間次いで鉛塩で５分間の二重電子染色を行った。そして、透過電子顕微鏡により、このようにして免疫染色したサンプルを観察した。
　その結果、ｍＴＮＦα－ＶＨＨ米においては、ｍＴＮＦαＶＨＨモノマー及びダイマー共に、細胞質に顕著に局在しており、イネ蛋白質貯蔵体であるＰＢ－II（Ｐｒｏｔｅｉｎｂｏｄｙ－II）内部にもこれらの局在は観察された（図１９のＡ及びＢ、並びに及び図２０のＡ及びＢ）。一方、対照の家兎ＩｇＧを反応させたｍＴＮＦα－ＶＨＨ米（図１９のＣ、図２０のＣ）及びｍＴＮＦαＶＨＨ抗体を反応させたＷＴ日本晴米（図１９のＤ、図２０のＤ）では、細胞質及びＰＢ－IIのいずれにもｍＴＮＦαＶＨＨは観察されなかった。
　従って、図１５及び１６において示されたｍＴＮＦαＶＨＨの水溶性の特質は、ナノ抗体のモノマー及びダイマーともに、主としてコメの蛋白質貯蔵体（ＰＢ）以外（すなわち、細胞質）に蓄積することに依ることが要因の一つとして推測される。
　ナノ抗体を用いた経口抗体製剤の開発は、従来から行われており、例えば、ロタウィルスのＶＰ４およびＶＰ７に対する結合親和性を持つナノ抗体（ＶＨＨ１）（Ｄｏｌｋ　Ｅ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．２００５；５９：５５５－６４．）やＴＮＦ－αのナノ抗体（Ｐａｎｔ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ．２００６；１９４：１５８０－８．）を乳酸菌に発現させることで、経口でのロタウィルスの感染・下痢症やクローン病等の腸炎を予防する試みに成功している。人体にとって整腸剤として投与されることの多い乳酸菌を用いることにより人体に負担の少ない経口医薬品となりうるが、免疫能の低下した者や未熟児に投与する場合には乳酸菌に起因した敗血症や心筋炎のリスクがある（Ｖａｎｄｅｎｂｒｏｕｃｋｅ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．，２０１０；３：４９－５６．、Ｌａｎｄ　ＭＨ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２００５；１１５：１７８－８１．、Ｓｃｈｌｅｇｅｌ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ．１９９８；１７：８８７－８．０）。また、アウトブレイクへの対策や製造コストの観点をも考慮すると、ナノ抗体を用いた経口抗体製剤は、冷蔵保存が不要で長期に常温保存可能な製剤であることが望ましい。本発明により開発された、ナノ抗体が水溶性の形態で蓄積したコメは、精製工程をほとんど加えることなく、ナノ抗体を長期保存可能な経口抗体製剤として調製できる。また、コメから抽出した水溶性画分やその加工物は、注射製剤としても利用しうる。したがって、本発明は、抗体を有効成分とする安価でかつ常温保存可能な経口製剤や注射製剤などの医薬製剤の開発に大きく貢献しうるものである。
配列番号１
＜２２３＞　ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ1（Ｑ－ＳＴＡＲ　Ｅｌｉｔｅによる分析）
配列番号２
＜２２３＞　ＭｕｃｏＲｉｃｅ－ＶＨＨ1（Ｏｒｂｉｔｒａｐによる分析）

Claims (7)

  1. 　ナノ抗体をコードするＤＮＡが導入され、ナノ抗体がコメに発現しているトランスジェニックイネ。
  2. 　ナノ抗体が水溶性の形態でコメに蓄積している、請求項１に記載のトランスジェニックイネ。
  3. 　請求項１または２に記載のトランスジェニックイネから採取されたコメ。
  4. 　請求項３に記載のコメの、ナノ抗体を含有する水溶性画分。
  5. 　請求項３に記載のコメまたは請求項４に記載の水溶性画分の、ナノ抗体を含有する加工物。
  6. 　請求項３に記載のコメ、請求項４に記載の水溶性画分、または請求項５に記載の加工物を含有する、組成物。
  7. 　ナノ抗体の製造方法であって、
    （ａ）ナノ抗体をコードするＤＮＡをイネに導入し、ナノ抗体がコメに発現しているトランスジェニックイネを作出する工程、
    （ｂ）工程（ａ）で作出されたトランスジェニックイネのコメから水溶性画分を得る工程、
    を含む方法。
PCT/JP2011/065670 2010-07-20 2011-07-08 ナノ抗体を発現するトランスジェニックイネ Ceased WO2012011396A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012525370A JP5616449B2 (ja) 2010-07-20 2011-07-08 ナノ抗体を発現するトランスジェニックイネ

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010162630 2010-07-20
JP2010-162630 2010-07-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012011396A1 true WO2012011396A1 (ja) 2012-01-26

Family

ID=45496823

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/065670 Ceased WO2012011396A1 (ja) 2010-07-20 2011-07-08 ナノ抗体を発現するトランスジェニックイネ

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP5616449B2 (ja)
WO (1) WO2012011396A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018181866A1 (ja) * 2017-03-31 2018-10-04 国立大学法人東京大学 ノロウイルス抗体
EP3597758A1 (en) * 2013-04-29 2020-01-22 AgroSavfe nv Agrochemical compositions comprising polypeptides
US10858666B2 (en) 2014-11-05 2020-12-08 Biotalys Transgenic plants expressing a variable domain of a heavy chain antibody (VHH) that binds to a sphingolipid of a fungus

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004074491A2 (en) * 2003-02-18 2004-09-02 Syngeta Participations Ag Expression in plants of antibodies against enterotoxigenic escherichia coli
WO2010079149A1 (de) * 2009-01-09 2010-07-15 Ipk Gatersleben Fusionsantikörper

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004074491A2 (en) * 2003-02-18 2004-09-02 Syngeta Participations Ag Expression in plants of antibodies against enterotoxigenic escherichia coli
WO2010079149A1 (de) * 2009-01-09 2010-07-15 Ipk Gatersleben Fusionsantikörper

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ISMAILI, A. ET AL.: "Production and characterization of anti-(mucin MUCI) single- domain antibody in tobacco (Nicotiana tabacum cultivar Xanthi)", BIOTECHNOL. APPL. BIOCHEM., vol. 47, no. 1, 2007, pages 11 - 19, XP009096298, DOI: doi:10.1042/BA20060071 *
JOBLING, S.A. ET AL.: "Immunomodulation of enzyme function in plants by single-domain antibody fragments.", NAT. BIOTECHNOL., vol. 21, no. 1, pages 77 - 80 *
MUYLDERMANS, S. ET AL.: "Single domain camel anitibodies: current status.", REV. MOL. BIOTECHNOL., vol. 74, no. 4, 2001, pages 277 - 302 *
RAJABI-MEMARI, H. ET AL.: "Expression and Characterization of a Recombinant Single-Domain Monoclonal Antibody Against MUC1 Mucin in Tobacco Plants", HYBRIDOMA, vol. 25, no. ISS.4, 2006, pages 209 - 215 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3597758A1 (en) * 2013-04-29 2020-01-22 AgroSavfe nv Agrochemical compositions comprising polypeptides
US11028154B2 (en) 2013-04-29 2021-06-08 Biotalys NV Agrochemical compositions comprising antibodies binding to sphingolipids
US10858666B2 (en) 2014-11-05 2020-12-08 Biotalys Transgenic plants expressing a variable domain of a heavy chain antibody (VHH) that binds to a sphingolipid of a fungus
WO2018181866A1 (ja) * 2017-03-31 2018-10-04 国立大学法人東京大学 ノロウイルス抗体
JPWO2018181866A1 (ja) * 2017-03-31 2020-02-13 国立大学法人 東京大学 ノロウイルス抗体
TWI743346B (zh) * 2017-03-31 2021-10-21 國立大學法人東京大學 諾羅病毒抗體
US11530254B2 (en) 2017-03-31 2022-12-20 The University Of Tokyo Norovirus antibody

Also Published As

Publication number Publication date
JP5616449B2 (ja) 2014-10-29
JPWO2012011396A1 (ja) 2013-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2001500487A (ja) 植物ウイルスコートタンパク質と融合したポリペプチド
US20150166649A1 (en) Compounds and methods for treating inflammatory diseases
CN103059133B (zh) 一种中和犬瘟热病毒的单克隆抗体及抗体组合物
WO2014180306A1 (zh) 编码gpc3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达gpc3嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞
EP4471151A1 (en) Viral vector and application thereof
CN117126271A (zh) 靶向发热伴血小板减少综合征病毒囊膜蛋白的人源中和抗体及双特异性抗体
JP5616449B2 (ja) ナノ抗体を発現するトランスジェニックイネ
CN118853524B (zh) 共表达猪β-防御素2与PEDV S1蛋白的重组猪源干酪乳杆菌及其构建方法和应用
JP2017055773A (ja) 植物内のタンパク質産生
JP7233662B2 (ja) グリコシル化したａｇ８５ａタンパク質を含む結核予防用ワクチン組成物およびその製造方法
CN115298315A (zh) 用于体内基因治疗的聚合物封装病毒载体
JP4769977B2 (ja) ワクチン遺伝子導入イネ
CN118440214A (zh) 一种靶向PDGFRβ的嵌合抗原受体、CAR-T细胞及应用
WO2023154734A2 (en) Mrna expression and delivery systems
JP6633002B2 (ja) 免疫原性複合タンパク質を生産する形質転換植物体の製造方法及びこれより収得された免疫原性複合タンパク質
CN111849917B (zh) 一种融合表达ⅰ型il-10受体的第四代car-t细胞及其制备方法与应用
CN117025648A (zh) 一种二联亚单位疫苗、重组表达载体及制备方法和应用
TWI599654B (zh) 日本腦炎病毒類病毒顆粒表現質體及日本腦炎ｄｎａ疫苗
KR20170022705A (ko) 돼지 유행성 설사병 바이러스의 pAPN을 발현하는 재조합 벡터, 형질전환 마우스 및 이의 용도
US12371476B2 (en) Canine parvovirus (CPV) nanobody CPV-VHH-H1 and use thereof
CN120485280B (zh) 一种重组牛轮状病毒毒株及其制备方法与应用
JPWO2006095749A1 (ja) 植物でのペプチドの発現・集積方法
CN100387719C (zh) 编码大肠杆菌热敏毒素基因及其表达载体和用途
CN117925726A (zh) 基于多价多肽识别的car-nk细胞的构建方法及应用
KR20240135414A (ko) 아동의 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-COV-2에 대한 특이 면역(specific immunity) 유도제의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11809570

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012525370

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11809570

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1