WO2012002460A1 - イオンチャネルに作用する化合物のスクリーニング用材料及びその利用 - Google Patents

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WO2012002460A1
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ion channel
screening
cells
channel
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今泉　祐治
将人 藤井
進 大矢
寿男 山村
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公立大学法人名古屋市立大学
有限会社チャネロサーチテクノロジー
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
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    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2510/00—Detection of programmed cell death, i.e. apoptosis

Definitions

  • the present invention relates to a material used for screening a compound that acts on an ion channel and its use, and more specifically, a material containing cells that can be used to screen for a compound that acts on an ion channel (including membrane transport proteins) and The present invention relates to a screening method using the material.
  • ⁇ ⁇ ⁇ Ion channels have physiologically important functions. It is expected to provide useful drugs by searching for agonists and inhibitors that act on the ion channel with the ion channel as a target.
  • As an evaluation method for screening systems for drugs that target such ion channels for example, voltage-gated ion channels, fluorescent membrane potential measurement methods that detect changes in membrane potential in cells with voltage-dependent fluorescent dyes are known ( Patent Document 1). Also known is a patch clamp method in which a glass electrode is brought into close contact (seal) with a cell membrane to electrically detect the membrane potential.
  • Non-Patent Document 1 An automated patch clamp that uses a multi-well patch plate with an opening corresponding to the tip of the glass electrode in each well and automatically seals the cell membrane and patch electrode in the well to detect the membrane potential.
  • the conventional fluorescent membrane potential measurement method is suitable for the evaluation of many specimens, the measurement accuracy and applicable ion channel range may be limited.
  • the patch clamp method has high measurement accuracy and a large amount of information obtained by measurement, but the number that can be measured at one time is small and the efficiency is low.
  • the automation patch clamp method has a structure in which a large number of specimens are simultaneously evaluated, the patch success rate is low and it is not suitable for high-throughput screening. Further, the automation patch clamp method has a problem that the apparatus and running cost are high.
  • the disclosure of this specification is aimed at the construction of a screening system excellent in efficiency targeting an ion channel.
  • the present inventors have to use an evaluation method for detecting a membrane potential of a living cell in a screening system targeting an ion channel, and the problem of such an evaluation method makes it difficult to construct a screening system. Focused on that.
  • Various studies were conducted with the aim of constructing a screening system to which a simpler evaluation method can be applied instead of such an evaluation method.
  • one or two or more first DNAs encoding voltage-dependent Na ion channels whose inactivation is suppressed are retained, and the resting membrane potential is deepened in the negative direction.
  • a screening material for a compound including cells that act on a target ion channel, in which a K channel is activated.
  • a screening method comprising a step of detecting an action of a test compound on the target ion channel using the cell of the screening material as an indicator of whether the cell is alive or dead.
  • an apparatus for screening a compound that acts on an ion channel the cell containing unit including one or more regions containing cells, and the 1 or 2 described above
  • an apparatus comprising a cell death measuring unit for the cells in the above region.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the outline
  • (A) shows the current-voltage relationship before and after administration of 100 ⁇ M Ba ions, which is a specific blocker of Kir2.1 channel, and
  • (b) shows changes in membrane potential before and after administration of 100 ⁇ M Ba ions.
  • (A) shows the result of the wild type, and (b) shows the result of the mutant type.
  • FIG. 3 is an action potential original diagram showing generation of an action potential by depolarizing energization stimulation by transiently expressing wild type and mutant Nav1.5 channels in HEK_Kir cells.
  • (A) shows the result of the wild type
  • (b) shows the result of the mutant type. It is a figure which shows the result of having electrically stimulated three types of cells of HEK, HEK_Kir, and HEK_Kir_mutated Nav and measuring the change in the number of cells by the MTT method.
  • the absorbance of the unstimulated control is shown as 1.
  • lidocaine Sigma which is the inhibitor of Na ion channel to HEK_Kir_mutated Nav cell, and performing electrical stimulation.
  • the absorbance of the unstimulated control is shown as 1.
  • the disclosure of the present specification relates to a screening system targeting an ion channel, specifically, a screening material containing cells that can be used for screening a compound that acts on an ion channel (membrane transport protein) and
  • the present invention relates to a screening method using a material, a screening apparatus, and the like.
  • an effect on a target ion channel in screening can be detected by cell death of cells constructed for screening. That is, the cell is given a cell death control mechanism in which cell death occurs because the action potential generated once depolarization is induced is extended. That is, the disclosure of this specification uses such a cell death control mechanism as a means for detecting the action of a test compound on a target ion channel.
  • the present screening material is a test compound in which a test compound comprises a target ion channel and a Na ion channel in which inactivation is suppressed in a cell membrane, and a K ion channel that activates a resting potential is activated.
  • the effect of the test compound on the target ion channel appears as a result of inducing or suppressing depolarization.
  • the switch of the cell death control mechanism by the Na ion channel and the K ion channel on the cell membrane of the screening material is turned “on”, This screening material leads to cell death.
  • the switch of the cell death control mechanism remains “off” instead of “on”, and the screening material survives.
  • this screening material detects the presence or absence of depolarization induced by the action of the test compound by turning on / off the cell death control mechanism, that is, the presence or absence of a continuous action potential that leads to cell death or death. To do. In this way, the action of the test compound on the target ion channel can be detected by viability of the cells, not simply by detecting changes in the membrane potential of the cell membrane.
  • Detecting cell viability is simpler or clearer than electrical detection, which is simply measuring the membrane potential or membrane current of a cell, and is suitable for simultaneous evaluation of multiple samples, so it has high throughput. Further, measurement accuracy can be ensured because of the simplicity of operation.
  • Such a screening method is also suitable for primary screening of compounds targeting ion channels.
  • the screening material disclosed in the present specification retains the first DNA encoding a voltage-gated Na ion channel in which inactivation is suppressed, and at the same time, the resting membrane potential is deepened in the negative direction.
  • Channels such as inwardly rectifying K ion channels, are activated and contain cells in which cell death due to intracellular entry of Na ions is avoided.
  • this cell is referred to as a screening cell.
  • the present screening material may contain only screening cells, or may contain culture materials or additives that allow or are suitable for survival of the screening cells in addition to the screening cells.
  • Examples of the culture material include a general medium, a buffer solution, an antibiotic and the like.
  • the cell for screening has the 1st DNA which codes the voltage-dependent Na ion channel by which inactivation was suppressed. And such Na ion channel is expressed.
  • the voltage-gated Na ion channel is a protein on the cell membrane that opens and mediates passive diffusion of Na ions depending on the membrane potential of the cell membrane.
  • the voltage-gated Na ion channel used in the present specification is not particularly limited, and various known voltage-gated Na ion channels can be used, but a Nav1.5 channel is preferable. Nav1.5 channels are distributed in cardiomyocytes and are thought to be involved in action potential generation and excitatory conduction.
  • the gate opens depending on the membrane potential and exhibits Na ion permeability, and then the inactivation mechanism works to lose Na ion permeability (inactivation).
  • the voltage-gated Na ion channel in which inactivation is suppressed suppresses (disappears) such an inactivation mechanism. That is, the voltage-dependent Na ion channel in which inactivation is suppressed means a Na ion channel in which such inactivation does not occur after the gate opens and exhibits ion permeability depending on the membrane potential.
  • the channel In the voltage-gated Na ion channel in which inactivation is suppressed, when depolarization is induced in the membrane and the ion channel itself is activated, the channel is opened and can take a state in which passive diffusion of Na ions can be mediated. However, since the inactivation of the ion channel itself is suppressed, the open state of the channel is maintained. As a result, in the voltage-dependent Na ion channel in which the inactivation is suppressed, once the action potential is generated by stimulation, the inactivation of the channel is delayed, and the action potential is delayed from the original voltage-dependent Na ion channel. Continue for a long time.
  • the Na ion channel in which inactivation is suppressed is likely to be activated even at a stationary or relatively deep resting membrane potential (so-called window current is increased). Therefore, in cells expressing a Na ion channel with suppressed inactivation, excessive Na ion inflow can be prevented only when the resting membrane potential is maintained at a sufficiently deep negative potential.
  • the Na ion channel activity is easily increased by depolarization, and it is 1 minute or more, preferably 2 minutes or more, more preferably 3 minutes. As described above, the action potential or depolarization is maintained for about 5 minutes or more. This causes excessive Na influx into the cell, leading to cell death.
  • Such suppression of inactivation can be appropriately realized by introducing an amino acid mutation into the amino acid sequence of the voltage-dependent Na ion channel.
  • Several specific approaches have been disclosed for inhibiting Nav1.5 channel inactivation. For example, modification of the IFM motif (A. O. Grant et al. Biophys. J. Vol.79, pp.3019-3035, 2000), mutating the 406th asparagine to glutamic acid, arginine, or lysine (M. M McNulty et al., Mol. Pharmacol. Vol.70, pp.1514-1523, 2006), deletion of the linker site containing the IFM part linking domain III-IV (D. E. Patton et al., Proc Natl. Acad.
  • the screening cell holds the first DNA encoding the mutant protein so that it can be expressed as the mutant.
  • the cell for screening may express the mutant, that is, the voltage-dependent Na ion channel in which inactivation is suppressed, steadily or transiently. That is, the first DNA may be integrated on the chromosome and transmitted to the daughter cell, or may be integrated into a plasmid that is autonomously amplified outside the chromosome but not necessarily transmitted to the daughter cell. Also good.
  • the first DNA is preferably linked under the control of a constitutively operating promoter (constitutive promoter).
  • an expression vector containing the first DNA based on well-known genetic engineering techniques and transformant preparation techniques, and use this as a host for screening cells.
  • By introducing into and transforming into the cells, steady expression or transient expression cells can be appropriately obtained.
  • the voltage-gated Na ion channel is composed of two or more subunits, and the subunits containing mutations effective for inactivation are a part of the whole, only the partial subunits Can be expressed in a screening cell as one or more first DNAs, and these subunits can be co-expressed simultaneously with other subunits constituting the Na ion channel.
  • Each of the DNAs encoding can be retained as the first DNA so that they can be expressed.
  • enzymes and other proteins necessary for functioning the voltage-gated Na ion channel in which inactivation is suppressed more effectively these proteins may be expressed appropriately. Good.
  • the K ion channel is activated so that the resting membrane potential becomes deeper in the negative direction, in other words, the negative potential becomes larger. That is, the inflow of K ions into the cell is promoted.
  • a Na ion channel mutant a membrane potential-dependent Na ion channel in which inactivation is suppressed
  • Na ions excessively flow into the cells, and eventually the Na ion concentration in the cells increases and the cells die.
  • the cell needs to be alive until such a cell death mechanism is induced.
  • the K ion channel is activated to promote the inflow of K ions into the cell.
  • the resting membrane potential can be set deeper in the negative direction than usual.
  • the resting membrane potential is deeper in the negative direction as long as it does not affect cell survival.
  • the membrane potential is preferably ⁇ 50 mV, more preferably ⁇ 60 mV, further preferably about ⁇ 70 mV, and more preferably about ⁇ 80 mV.
  • the state in which the K ion channel is activated so that the resting membrane potential is deepened in the negative direction is, for example, an inward rectifying K ion channel (Kir), a four-transmembrane type and a two-pore type K ion. Examples include a state where a channel, a serial pore domain type K ion channel, and the like are activated.
  • Kir inward rectifying K ion channel
  • 2-pore domain type K ion channel examples include a state where a channel, a serial pore domain type K ion channel, and the like are activated.
  • 4-transmembrane type and 2-pore type K ion channels having different properties, and are classified into TWIK, TERK, TASK, TALK, THIK, TRESK, and the like. These channels function as leakage channels because they have no potential and time dependency. Due to the nature of leakage channels, it works to fix the resting membrane potential of cells.
  • the inwardly rectifying K ion channel is not particularly limited, and examples thereof include various Kir.2.x ion channels such as Kir2.1, 2.2, 2.3, and 2.4 channels.
  • Kir2.1 channel is an inwardly rectifying K + channel with a two-transmembrane structure. It has no potential dependence and has the property of bringing the membrane potential closer to the equilibrium potential side of K + . It is expressed in nerves, heart, and skeletal muscle, and forms, stabilizes and maintains a resting membrane potential.
  • Kir2.2 is also mentioned. Kir2.2 is an inwardly rectifying K ion channel similar to Kir2.1, but is more inwardly rectifying than Kir2.1. It is expressed together with Kir2.1 in the heart, brain, and skeletal muscle, and plays a major role in other inwardly rectifying K ion channels in human vascular endothelial cells.
  • Kir.2.x ion channel is described in Circ. Res. 2004; 94; 1332-1339 and Am J Physiol Cell Physiol. 2005. 289: C1134-C1144.
  • the nucleotide sequences encoding human-derived Kir2.x channels are Kir2.1 (GenBank accession No.U12507, NM_000891.2), Kir2.2 (GenBank accession No.AB074970, NM_021012 (Human KCNJ12)), Kir2. 3 (GenBank accession No. U07364, U24056), Kir2.4 (GenBank accession No. AF081466.1), and the like.
  • GIRK GIRK
  • Kir3 is an inwardly rectifying K ion channel and is a K channel activated by G protein unlike Kir2.
  • These subunits are tissue specific and form heterotetramers composed of Kir3.1 / Kir3.4 in the heart and Kir3.1 / Kir3.2 in the central nervous system. It is not activated at normal times but activated by agonist stimulation. However, it has been reported in Xenopus oocytes experiments that the channel always opens by mutating the amino acid of the transmembrane helix that forms the channel pore (J Biol Chem, 2003, Vol.278, No.50). , Pp.50654-50663).
  • nucleotide sequences encoding human-derived Kir3.x channel are Kir3.1 (GenBank accessionNMNo.NM_002239.2), Kir3.2 (GenBank accession No.NM_002240.2), Kir3.3 (GenBank accession No. NM_004983.2), Kir3.4 (GenBank accession No. NM_000890.3).
  • KATP Kir6
  • the K ATP channel is an inwardly rectifying K ion channel that is inhibited by ATP and activated by ADP.
  • K ATP channels regulate cell excitability according to the metabolic state of the cell.
  • the KATP channel is a heterooctamer composed of 4 KATP channels and 4 sulfonylurea receptors (SUR).
  • SUR sulfonylurea receptors
  • a deep resting membrane potential can also be formed by using this mutant.
  • Examples of the base sequence encoding the human-derived Kir6.x channel include Kir6.1 (GenBank accession No. NM_004982.2) and Kir6.2 (GenBank accession No. NM_001166290.1).
  • THIK channel a membrane potential increases when expressed in HEK293 cells (V. (A. Campanucci et al., Neuroscience Vol.135, pp.1087-1094, 2005), TASK2 channel (C. Kindler et al., J Pharmacol Exp Ther.Vol.306, pp.84-) when expressed in Xenopus oocytes. 92, 2003)), Kv ion channel (Kv ion channel deepens resting membrane potential in smooth muscle tissue (S. S. McDaniel et al., J Appl Physiol Vol.91, pp.2322-2333, 2001) ) Etc. are known.
  • TWIK ⁇ 2-pore type K ion channels are classified into TWIK, TREK, TASK, TALK, THIK, and TRESK subfamilies.
  • the TWIK subfamily contains TWIK-1 and TWIK-2 channels (Cell Biochem Biophys (2007), 47: 209-256).
  • TWIK channels are present in many tissues in humans.
  • human-derived TWIK ion channels include TWIK-1 (GenBank accession No. NM_002245.3) and TWIK-2 (GenBank accession No. NM_004823.1).
  • the TREK subfamily includes TREK-1, TREK-2 and TRAAK channels.
  • human-derived TREK ion channels include TREK-1 (GenBank accession No. NM_014217.3), TREK-2 (GenBank accession No. NM_138317.2) and TRAAK (GenBank accession No. NM_033310.2).
  • the TASK subfamily includes TASK-1, TASK-3 and TASK-5 channels.
  • human-derived TASK ion channels include TASK-1 (GenBank accession No. NM_002246.2), TASK-3 (GenBank accession No. NM_016601.2) and TASK-5 (GenBank accession No. NM_022358.3). It is done.
  • TALK subfamily includes TALK-1, TALK-2 and TASK-2 channels.
  • TALK-1 GenBank accession No.NM_001135106.1
  • TALK-2 GenBank accession No.NM_001135111.1
  • TASK-2 GenBank accession No.NM_003740.3
  • THIK subfamily includes THIK-1 and THIK-2 channels.
  • human-derived THIK ion channels include THIK-1 (GenBank accession No. NM — 022054.2) and THIK-2 (GenBank accession No. NM — 022055.1).
  • TRESK subfamily includes TRESK (GenBank accession No. NM_181840.1).
  • one or more of these K ion channels can be used in appropriate combination for the purpose of increasing the resting membrane potential.
  • the screening cell may be one that constantly or transiently expresses the K ion channel. That is, the second DNA may be integrated on the chromosome and transmitted to the daughter cell, or may be integrated into a plasmid that is autonomously amplified outside the chromosome but not necessarily transmitted to the daughter cell. Also good.
  • the second DNA is preferably linked under the control of a constitutively acting promoter (constitutive promoter).
  • an expression vector containing the second DNA, etc. based on well-known genetic engineering techniques and transformant preparation techniques, and use them as host cells for screening cells. By introducing into and transforming into the cells, steady expression or transient expression cells can be appropriately obtained.
  • the K ion channel to be activated is composed of two or more different subunits (may be subunits of different K ion channels), one or two or more second DNAs encoding each of these subunits are used. It is preferable to be expressed in screening cells as the DNA of. Further, when there are enzymes and other proteins necessary for effectively functioning the K ion channel to be expressed, these proteins may be co-expressed. In that case, DNA encoding such other proteins may be retained so as to be expressed. Examples of other proteins include G protein when the K ion channel is a G protein-coupled K ion channel.
  • the screening cell has a voltage-dependent Na ion channel whose inactivation is suppressed on a biological membrane such as a cell membrane, and at the same time, the K ion channel operates so that the resting membrane potential decreases (becomes deeper).
  • the inward rectifying K ion channel or the like is operating on the cell membrane, and as a result, even if it has a mutant type voltage-dependent Na ion channel with suppressed inactivation.
  • the cell is prevented from cell death due to Na ion inflow into the cell. That is, the cell death inducing mechanism that operates after waiting for depolarization to occur in the cell membrane of the screening cell is in a standby state.
  • the screening cell can also be used as a host cell for newly introducing and expressing DNA encoding a target ion channel.
  • the target ion channel in the screening cell is not particularly limited, and one or more ion channels can be appropriately selected from known or new ion channels.
  • the ion channel means a protein that penetrates through biological membranes such as animal and plant cell membranes and inner membranes and passively permeates specific ions. Examples of ions include Na ions, K ions, Ca ions, and Cl ions.
  • Ion channels include voltage dependence, ligand dependence, mechanical stimulus dependence, temperature dependence, leakage channel, phosphorylation dependence, and the like, depending on the controllability of opening and closing.
  • the ion channel since the action (agonism and inhibitory activity) on the target ion channel can be detected by viability of the screening cell, the entire ion channel can be widely targeted. Note that in this specification, the ion channel does not ask the control mode of opening and closing, such as whether it is voltage-dependent or ligand-dependent.
  • ion channels transporters of biological membranes including cell membranes and nuclear membranes and other organelle membranes that perform potential-generated ion transport, ion exchangers (Na + -Ca 2+ exchangers, etc.), An ion pump (Na + -K + pump) is also included.
  • target ion channels include various ion channel-integrated drug receptors. Such receptors include nicotine-like acetylcholine receptor, ion channel ATP receptor (P2x receptor), ion channel glutamate receptor, ion channel GABA A receptor, ion channel glycine receptor, and type 3 serotonin receptor. Examples include the body. In addition, various TRP (Transient Receptor Potential) channels (non-selective cation channels) can be mentioned. Also, store-operated Ca ion channels such as the Orai channel and the Stim channel can be mentioned. Examples of the target ion channel include various potential-dependent ion channels.
  • TRP Transient Receptor Potential
  • all voltage-dependent Ca ion channels all voltage-dependent K ion channels (including HERG channels), all voltage-dependent Na ion channels, and all voltage-dependent Cl ion channels can be mentioned.
  • Other ligand-dependent Ca ion channels, Na ion channels, proton ion channels, K ion channels, and Cl ion channels can be used.
  • all the ion channels which open and close in response to stimuli such as potential, temperature, pH, and tension can be mentioned.
  • the target ion channel is preferably a target ion channel that is considered to be closely related to diseases and symptoms.
  • Nav channels include Nav 1.1-1.3 and 1.5-1.9. These are related to epilepsy, neuropathic pain, arrhythmia, pain and the like, and it becomes possible to screen for drugs for treating or preventing them.
  • Examples of the Ca ion channel include Cav1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 2.1, 2.2, 2.3, 3.1, 3.2, and 3.3. These are related to cardiovascular disease, Alzheimer's disease, pain, epilepsy, and hypertension, and it becomes possible to screen for drugs for treating or preventing them.
  • K ion channel examples include Kv1.1 to 1.5, 2.1, 3.2, 4.3, 7.1 to 7.5, 10.1, 11.1 (including hERG), and 12.1 to 12.3. These are related to multiple sclerosis, autoimmune diseases, pain, atrial fibrillation, diabetes, epilepsy, neuralgia, Alzheimer's disease, urinary incontinence, arrhythmia, cancer, etc., and screening for drugs to prevent or treat these It becomes possible.
  • Cl ion channels CLC-1 to 7 and -Ka and Kb are related to hypertension, and it is possible to screen for drugs for preventing or treating this.
  • the hERG ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ K ion channel is one of voltage-dependent K ion channels having a six-transmembrane structure and forming a tetramer.
  • a difference from other voltage-dependent K ion channels is that it exhibits inward rectification. This is due to the fact that type C inactivation occurs very quickly. It works strongly in the repolarization phase, the third phase of action potential in the heart. It is known as a channel that is strongly related to arrhythmia and cancer because it has the function of hyperpolarizing the potential in the repolarization phase.
  • Inhibiting hERG channels induces a highly lethal QT syndrome, and at present, it is required to examine proarrhythmic effects of all kinds of drug candidate compounds by inhibiting the action of HERG ⁇ K ion channels as cardiotoxicity. For this reason, the usefulness of the cell for a screening which uses a target ion channel as a hERG (K) ion channel is high.
  • the hERG K ion channel is expressed in the screening cell, for example, the action potential generated by electrical stimulation is shortened, so that cell death is less likely to occur.
  • hERG K ion channel inhibitory activity a compound that has hERG K ion channel inhibitory activity or suspected of causing it tends to cause cell death of the screening cell, so the inhibitory effect on hERGK ion channel is quantitative. Can be evaluated.
  • An example of hERG is GenBank accessionNMNo.NM_000238.2.
  • any screening cell expressing the target ion channel can be used for screening.
  • the screening cell used for screening specifically or highly expresses the target ion channel. This is for screening with higher accuracy and sensitivity. Since ion channels are often distributed in specific cells, it is also possible to select cells that highly express the target ion channel in advance as the parent cell line for screening cells. However, in order to stably express the target ion channel in the screening cell outside the test tube, the screening cell holds and expresses the DNA encoding the target ion channel (third DNA). Is preferred.
  • the screening cell may be one that constantly or transiently expresses the target ion channel. That is, the third DNA may be integrated on the chromosome and transmitted to the daughter cell, or may be integrated into a plasmid that is autonomously amplified outside the chromosome but not necessarily transmitted to the daughter cell. Also good.
  • the third DNA is preferably linked under the control of a constitutively acting promoter (constitutive promoter).
  • constitutively acting promoter those skilled in the art will construct an expression vector containing the third DNA based on well-known genetic engineering techniques and transformant preparation techniques, and use this as a host for screening cells. By introducing into and transforming into the cells, steady expression or transient expression cells can be appropriately obtained.
  • DNA encoding each of these subunits is used in one or two or more third units. It is preferably expressed as DNA in screening cells. Furthermore, when there are enzymes and other proteins necessary for effectively functioning the target ion channel to be expressed, these proteins may be co-expressed. In that case, DNA encoding such other proteins may be retained so as to be expressed. Examples of other proteins include various receptor proteins, GTP-binding proteins, and phosphorylating enzymes.
  • the host cell of the screening cell is not particularly limited as long as it can be used for screening, and various animal and plant cells can be used.
  • the type of animal cell is not particularly limited, such as mammals and insects.
  • the host cell is a cell such as bovine, pig, horse, bird, dog, cat, etc. in addition to a human, a cell for screening a drug for preventing or treating a disease in these animals can be obtained.
  • insect cells are used as hosts, screening cells for pesticides and the like targeting insects can be obtained.
  • a screening cell such as an agrochemical can be obtained.
  • Animal cells typically include human fetal kidney-derived cells (HEK cells), African green monkey kidney-derived cells (COS cells), Chinese hamster ovary cells (CHO cells), baby hamster kidney cells (BHK cells), and Xenopus laevis. Oocytes are used.
  • HEK cells human fetal kidney-derived cells
  • COS cells African green monkey kidney-derived cells
  • COS cells Chinese hamster ovary cells
  • BHK cells baby hamster kidney cells
  • Xenopus laevis Xenopus laevis. Oocytes are used.
  • the screening method disclosed in the present specification comprises a step of detecting the action of a test compound on a target channel using the screening cell of the screening material disclosed in the present specification using the life or death of the screening cell as an index. Can be provided.
  • this screening method by using the screening cells disclosed in the present specification, the effect of the test compound on the target ion channel can be detected using the life and death of the screening cells as an index. For this reason, it is possible to easily and simultaneously evaluate multiple samples with high efficiency. Further, since no special operation or apparatus is required, there is no decrease in accuracy resulting from the operation, and the screening cost can be reduced.
  • the screening method disclosed in the present specification screens a drug for preventing or treating a disease or symptom associated with the target ion channel by using a screening cell in which the various ion channels already described are target ion channels. be able to.
  • one or more test compounds can be supplied to the screening cells.
  • a single test compound may be used to detect the action of the compound, or two or more test compounds may be used to detect a combined action or synergistic action of these compounds.
  • the viability of the screening cell when no test compound is supplied can be used as a control.
  • a compound having a known action on the target ion channel may be used as a control. By comparison with such a control, the presence or absence of the action of the test compound on the target ion channel and the degree of the action can be detected.
  • test compound is not particularly limited.
  • nucleic acids such as proteins, peptides, oligonucleotides and polynucleotides, oligosaccharides, polysaccharides, lipids and the like may be used.
  • various stimuli may be applied to the screening cells as necessary. This is because the action may be promoted or suppressed in combination with these stimuli. It is also possible to evaluate the effect on target ion channels that are activated or deactivated in the presence of a stimulus. Examples of such stimulation include temperature change (high temperature and low temperature), pH change, O 2 / CO 2 concentration change, osmotic pressure change, and the like.
  • the detection step it may be necessary to induce depolarization of the cell membrane of the screening cell. In that case, it is preferable to use a stimulus that does not easily affect the test compound, such as an electrical stimulus.
  • the ratio of cell death (in other words, the ratio of living cells) is used as an index.
  • the ratio of cell death it is possible to evaluate the intensity and degree of action, sensitivity, and the like.
  • Various known techniques can be adopted as a method for detecting cell death (may be a living cell) of screening cells without any particular limitation. For example, various methods such as MTT method, cell staining, nuclear staining, enzyme activity and the like can be mentioned. It can be appropriately selected in consideration of accuracy and efficiency.
  • Cell death can also be detected by detecting a continuous action potential leading to cell death. That is, it may be detected by detecting the duration of action potential that leads to cell death. Such a sustained state of the action potential may be detected by a fluorescent membrane potential detection method or a membrane potential sensitive dye in addition to the conventional electrical detection of the membrane potential.
  • the mode of the screening method is appropriately selected according to the type of the target ion channel. More specifically, it is appropriately selected according to the control mode of the target ion channel and its function. For example, activation (or inactivation) of the target ion channel according to the control mode of the target ion channel (voltage dependence, ligand dependence, mechanical stimulus dependence, temperature dependence, leakage channel, phosphorylation dependence, etc.) The presence or absence of a stimulus and the type of stimulus are selected. In addition, depending on the function of the target ion channel, an evaluation mode using cell death as an index (whether it is operative or inhibitory with respect to the target ion channel) is selected.
  • the target ion channel is a voltage-gated ion channel
  • various functions are expressed by activation (activation by a predetermined membrane potential). Specifically, action potential generation, excitatory conduction (above, Na ion channel), neurotransmitter release, action potential generation in nerves and myocardium (above, Ca ion channel), maintenance of membrane potential, excitability Control, action potential repolarization (K ion channel), membrane potential repolarization, protein resorption, bone resorption, Cl transport (Cl ion channel).
  • the target ion channel is an ion channel that causes depolarization of a biological membrane such as a cell membrane of a screening cell by activation
  • screening modes in the following detection step can be mentioned. That is, (1) the step of detecting the action of the test compound on the target channel of the screening material in the presence of the test compound using the life or death of the screening cell as an index. More specifically, after giving the test compound to the screening cells, the viability of the screening cells is detected. When the promotion of cell death is detected, the test compound can be determined to be an agonist (activator) having an activity with respect to the target ion channel.
  • a step of detecting the action of the test compound in the presence of a stimulus for the test compound and the target ion channel using the viability of the cell as an index can be mentioned. More specifically, a test compound is previously given to the screening cell, and then a known agonist for the target ion channel is added, and then the viability of the screening cell is detected. When cell death is not detected or cell death is suppressed, the test compound can be determined to be an inhibitor (inactivation agent) having an inhibitory effect on the target ion channel.
  • the target ion channel is an ion channel that suppresses depolarization and / or action potential (promotes hyperpolarization) of the cell membrane of a screening cell, such as a leakage channel
  • the following aspects of the detection process include Can be mentioned. That is, in the presence of a stimulus that causes depolarization of the biological membrane of the test compound and the screening cell, the action of the test compound is detected using the viability of the screening cell as an index. In this case, in the absence of the test compound, the target ion channel operates constantly, suppressing depolarization or suppressing action potential (promoting repolarization).
  • a cell death control mechanism is activated by applying a stimulus that causes depolarization of the cell membrane of a screening cell, such as electrical stimulation, action potentials are not generated or prolonged. As a result, the screening cells survive. On the other hand, if the cell death of the screening cell is promoted when the test compound and the stimulus are applied to the screening cell, the test compound is used as an inhibitor having an inhibitory effect on the target ion channel. Can be judged.
  • the target ion channel is an ion channel that suppresses depolarization and / or action potential (promotes repolarization) of a biological membrane such as a cell membrane of a screening cell by activation, such as a HERG K ion channel
  • Examples of screening in the detection step are as follows. That is, in the presence of a test compound and a stimulus that causes depolarization of the biological membrane of the screening cell, the action of the test compound is detected using the life or death of the cell as an index. More specifically, if cell death of the screening cell is suppressed when the depolarization of the biological membrane is induced by electrical stimulation or the like at the same time or after application of the test compound to the screening cell, the test is performed.
  • a compound can be determined to be an agonist with activity against a target ion channel.
  • the cell death of the screening cell is promoted, it can be determined that the test compound is an inhibitor having an inhibitory effect on the target ion channel.
  • the screening method disclosed in the present specification it is possible to easily and efficiently detect the activity of a test compound on a target ion channel in various modes using the life and death of a screening cell as an index. it can.
  • This screening method is suitable not only for screening systems that require rapidity, but also for screening for drugs that target ion channels, for which structural design is difficult, especially primary screening that requires high throughput.
  • the method includes the step of detecting the action of the test compound on the target ion channel using the screening cell of the screening material disclosed in the present specification as an indicator of the viability of the screening cell.
  • test methods for test compounds According to this test method, it is possible to measure the action (operability and inhibitory activity) of the test compound on the target ion channel simply and quickly. Therefore, it is useful as a test method when a test compound is required to have a certain action or more.
  • various aspects of the screening method disclosed in the present specification that have already been described can be applied as they are.
  • the screening apparatus disclosed in the present specification is an apparatus for screening a compound that acts on an ion channel, and includes a cell accommodation unit including one or two or more areas (cell accommodation areas) for accommodating cells; A unit for measuring cell death of the cells in one or more regions. According to the screening apparatus disclosed in the present specification, since the cell death measurement unit is provided, cell death in the cell accommodation unit can be efficiently detected.
  • the screening device disclosed in this specification can be used for this screening apparatus. In detecting cell death, various methods can be adopted as already described in this screening method.
  • the cell accommodation unit only needs to accommodate the number of cells suitable for cell death measurement, and can include a well-known multi-well plate or a well having the same size as a cell accommodation region. These wells are usually capable of containing a medium so that the cells can be incubated. The wells are preferably arranged in an array.
  • the cell death measuring unit can take various modes according to the cell death detection method.
  • a drug supply unit capable of supplying such a drug in a cell accommodation region can be provided.
  • the drug supply unit typically includes a drug injection unit for supplying a drug to the cell accommodation region simultaneously or sequentially, a drug storage unit for storing the drug, and a drug injection unit for transporting the drug from the storage unit. And a control unit for controlling the supply amount of the medicine.
  • the drug injection part is preferably provided, but the other parts are provided as necessary.
  • the cell death measurement unit may include an optical detection unit for detecting cell death of cells in the cell storage unit electrically or optically, depending on the detection method.
  • the optical detection unit can usually include a scanner unit and a control unit that calculates a detected signal as light intensity with reference to a control or the like.
  • the cell death measuring unit or screening device can include a storage unit that controls the screening process and stores the results, and a control unit including the storage unit. Furthermore, a display unit for displaying such processes and results can be provided. Further, a printer unit for printing the result can be provided.
  • the screening apparatus may further include a voltage application unit that applies a voltage to one or two or more cell accommodation regions.
  • a voltage application unit that applies a voltage to one or two or more cell accommodation regions.
  • Such a voltage application unit can be used to apply electrical stimulation to the screening cells in the cell accommodation region to induce depolarization of the cell membrane and to activate the cell death control mechanism.
  • the voltage application unit can include an electrode applied to a part or the whole of the cell accommodation region and a power source for applying a voltage to the electrode. The applied voltage is preferably controlled by the control unit already described.
  • the screening kit disclosed in the present specification includes the screening material disclosed in the present specification. According to such a kit, the screening cell can be easily and efficiently screened for a compound that acts on an ion channel.
  • the kit may include a reagent for measuring cell death.
  • you may provide the culture medium suitable for the cell for a screening.
  • the screening kit can further include a screening device disclosed in the present specification. The screening cells, screening materials, and screening devices applied to the screening kit are appropriately selected and combined from the various aspects already described.
  • hNav1.5 amino acid sequence (displays only the region containing IFM to be mutated) (SEQ ID NO: 1) 1470-IDNFNQQKKKLGGQD IFM TEEQKKYYNAMKK-1500 (Underlined IFM is changed to QQQ)
  • HEK293 cells Human embryonic kidney-derived cells (HEK293 cells) were purchased from Human Science Research Resource Bank (HSRRB). Add 10% FBS (Gibco), 100U / ml penicillin (Wako Pure Chemical Industries), 100 ⁇ g / ml streptomycin (Meiji Seika Co.) in D-MEM medium (Wako Pure Chemical Industries) at 37 °C, 5% CO 2 Cultured.
  • PcDNA / Kir2.1 obtained by subcloning human-derived Kir2.1 (NM_000891.2) into pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) was introduced using Lipofectamine 2000 regent (Invitrogen), and the above-mentioned D-MEM medium was introduced.
  • the cells were cultured in a medium supplemented with 0.2 mg / ml Zeocin (Invitrogen), and Zeocin resistant cells were cloned to produce Kir2.1 constant expression cells (HEK_Kir).
  • HEK_Kir inactivation mutant Nav-QQQ
  • HEK_Kir_mutated Nav was introduced into Kir2.1 constant expression cells by the same method, and the experiment was conducted 24 to 72 hours later.
  • the composition of the external solution is (mM): 137 NaCl, 5.9 KCl, 2.2 CaCl 2 , 1.2 MgCl 2 , 14 glucose, 10 HEPES (pH 7.4 by NaOH).
  • the composition of the pipette solution is (mM): 140 KCl, 4 MgCl 2 , 5 ATP-2Na, 0.05 EGTA, 10 HEPES (pH 7.2 by KOH). All experiments were performed at room temperature (23 ⁇ 1 ° C). A cell microelectrode was pressed against the cells adhering to the glass piece using a hydraulic fine movement manipulator (MO-203: Narimo Kagaku), and recording was performed by the potential fixing method and the current fixing method.
  • MO-203 hydraulic fine movement manipulator
  • the measured current and potential were amplified using a microcurrent amplifier (EPC-7: HEKA Elektronik) and recorded on a computer using an AD converter (Digdata 1400A: Axon Instruments). Data analysis was performed using Clampfit 10.2 software (Axon Instruments) and Origin 6.0J (Microcal Software Inc.).
  • HEK, HEK_Kir, HEK_Kir_mutated Nav Three types of cells (HEK, HEK_Kir, HEK_Kir_mutated Nav) were seeded at 5 ⁇ 10 3 cells / well in a 96-well plate containing 100 ⁇ l of D-MEM medium and cultured at 37 ° C. with 5% CO 2 .
  • two stimulating silver wire electrodes with a diameter of 0.5 mm were inserted into the culture medium of each well, and the tip of the electrode was inserted about 2 mm, and four types of current intensity (strength 1 to 4): 40 mA, 80 mA, 120 mA, and 160 mA.
  • electrical stimulation with a rectangular wave having a stimulation width of 200 ms was performed three times at intervals of 3 minutes using an electrical stimulation device (Nihon Kohden).
  • the electrical stimulation condition does not necessarily need to be as described above, and a condition that can reliably generate an action potential may be selected.
  • the cells were cultured at 37 ° C. with 5% CO 2 , and one day later, 10 ⁇ l of MTT reagent (dissolved with phosphate buffered saline PBS ( ⁇ ) and adjusted to a final concentration of 5 mg / mL) was added for 4 hours, 5% CO 2.
  • a lysis solution (20% SDS / 50% DMF solution) was added to lyse the cells to dissolve the formazan salt. Furthermore, after incubating at 37 ° C. for 8 to 12 hours, the absorbance was measured at a measurement wavelength of 595 nm and a control wavelength of 650 nm using a multi-scan JX (ver1.1, Thermo Labsystems, USA). It was used as an index. However, the above 4 hours and 8 to 12 hours can be measured even if they are shortened to 2 hours and 3 hours, respectively.
  • HEK_Kir_mutated Nav cells are highly sensitive to depolarization stimuli.
  • electrical stimulation was performed by administering lidocaine (Sigma), an inhibitor of Na ion channel, with the same stimulation intensity.
  • the results inhibited cell death from occurring, as shown in FIG. This indicates that HEK_Kir_mutated Nav cells undergo cell death by generating very long action potentials, and cell death is suppressed by inhibiting Na ion channels.
  • human-derived hERG (NM_000238.2) was subcloned into pcDNA3.1 (+), introduced into native HEK cells and constant-expressed HEK_Kir_mutated Nav cells, and hERG-HEK cells and hERG_HEK_Kir_mutated Nav Cells were prepared and electrophysiological experiments were performed 24-72 hours later.
  • the electrophysiological experiment was carried out on native HEK cells, hERG-HEK cells, and hERG_HEK_Kir_mutatedirNav cells according to Example 2, and the hERG channel current and action potential were measured.
  • the hERGK ion channel exhibits inward rectification and acts to suppress cell death by shortening the action potential generated by electrical stimulation or the like when expressed in screening cells.
  • the hERG-HEK cells in which hERG channels were transiently expressed in native HEK cells were administered with nifekalant, an hERG channel inhibitor, and the potential at the cell membrane before and after administration was measured.
  • a current original diagram is shown in FIG. 7, and a current-voltage curve is shown in FIG. As shown in FIGS. 7 and 8, it was found that when nifekalant was administered, hERG channel current was inhibited.
  • FIG. 9 shows a current original diagram
  • FIG. 10 shows an action potential original diagram generated by depolarization energization stimulation
  • FIG. 11 shows an action potential time by depolarization energization stimulation.
  • hERG_HEK_Kir_mutatedmutNav cells in which hERG is expressed with a cell death control mechanism, when nifekalant is not administered, the duration of action potential is further reduced by hERG, and nifekalant is reduced.
  • hERG channels were inhibited and action potential duration was significantly prolonged. From the above results, it was considered that when hERG channel is expressed in HEK_Kir_mutated Nav cells, cell death by electrical stimulation is suppressed and cell death is induced by nifekalant administration.
  • hERG_HEK_Kir_mutated Nav cells are suitable as screening materials that target ion channels using hERG or the like as a target ion channel and targeting ion channels with cell death as an index. .
  • DiBAC 4 (3) has the property that the fluorescence intensity increases when the membrane potential is depolarized, and the membrane potential correlates with changes in fluorescence intensity.
  • HEK_Kir Two types of cells (HEK_Kir, HEK_Kir_mutated Nav) with 100 nM DiBAC 4 (3) (bis (1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol) for 30 minutes in normal HEPES buffer containing the dye, After loading at room temperature, the sample was excited at 488 nm, reflected by a 505 nm dichroic mirror, and measured for fluorescence at 520 nm or more. In addition, as a stimulus, the cell membrane is depolarized using High K + with increased K ions in the extracellular fluid. This is because K ions are mainly involved in the formation of the resting membrane potential.
  • DiBAC 4 (3) bis (1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol
  • Na-K pump keeps K ions in the cell higher than extracellular, but the leak channel discharges K ions out of the cell.
  • the potential that balances the inflow of K ions by the Na-K pump and the discharge of K ions by the leak channel is the resting membrane potential. Therefore, when the extracellular K ion concentration is increased, the difference between the K ions inside and outside the cell becomes smaller, and the resting membrane potential becomes shallower.
  • this depolarization stimulation was used to measure changes in fluorescence intensity of two types of cells.
  • the fluorescence intensity when the extracellular K ion concentration was 140 mM K + was measured with 1 as the standard.
  • the apparatus used for fluorescence measurement was a fast cooled CCD camera fluorescence imaging system ARGUS / HiSCA (Hamamatsu Photonics). The results are shown in FIGS.
  • FIGS. 14 and 15 are diagrams showing fluorescence changes (horizontal axis: time (extracellular K ion concentration), vertical axis: fluorescence intensity) by high K + stimulation in HEK_Kir cells and HEK_Kir_mutated Nav cells, respectively.
  • time extracellular K ion concentration
  • vertical axis fluorescence intensity
  • FIG. 16 is a diagram showing fluorescence intensities when HEK_Kir cells and HEK_Kir_mutated Nav cells were stimulated with extracellular K ions (15.3 mM) at the same concentration. As shown in FIG. 16, in HEK_Kir_mutated Nav cells, compared to HEK_Kir cells, it shows higher fluorescence intensity for the same K ion concentration stimulation, and it is clear that more sensitive or more depolarization is promoted. It was.
  • FIG. 17 is a diagram showing the influence of lidocaine administration on the fluorescence intensity when the extracellular K ion concentration is changed from 5.9 mM to 15.3 mM in HEK_Kir_mutated Nav cells.
  • Lidocaine is an inhibitor of Na ion channel.
  • the administration time of 1 mM lidocaine is a period indicated by an underline.
  • lidocaine inhibits the fluorescence change due to stimulation of extracellular K ion concentration.
  • HEK_Kir_mutated Nav cells and HEK_Kir cells show the same fluorescence change.
  • the Na ion channel contributes to a significant fluorescence change caused by stimulation of extracellular K ion concentration in HEK_Kir_mutated Nav cells. It was also found that this screening cell can be used in fluorescence measurement using DiBAC 4 (3), which is a membrane potential sensitive dye.

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Abstract

本発明は、イオンチャネルを標的とする効率性に優れたスクリーニング系を提供することを目的とする。本発明は、不活性化が抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネルをコードする１又は２以上の第１のＤＮＡを保持し、静止膜電位が負の方向に深くなるようにＫイオンチャネルが活性化された細胞を含む、標的イオンチャネルに作用する化合物のスクリーニング用材料を提供する。

Description

イオンチャネルに作用する化合物のスクリーニング用材料及びその利用
　（関連出願）
　本明細書の開示は、２０１０年６月２９日出願の日本国特許出願である特願２０１０－１４７２５５を優先権主張の基礎とするものであり、その全内容が引用によりここに組み込まれるものとする。
　本発明は、イオンチャネルに作用する化合物のスクリーニングに用いる材料及びその利用に関し、詳しくは、イオンチャネル(膜輸送タンパク質を含む)に作用する化合物をスクリーニングするのに用いることができる細胞を含む材料及び当該材料を利用したスクリーニング方法等に関する。
　イオンチャネルは生理的に重要な機能を有している。イオンチャネルを標的として、当該イオンチャネルに作用する作動剤や阻害剤を探索することで、有用な薬剤を提供することが期待されている。こうしたイオンチャネル、例えば、電位依存性イオンチャネルを標的とする薬剤のスクリーニング系の評価手法として、細胞における膜電位の変化を電位依存性蛍光色素で検出する蛍光膜電位測定法が知られている（特許文献１）。また、細胞膜に対してガラス電極を密着（シール）させて膜電位を電気的に検出するパッチクランプ法も知られている。さらに、近年、各ウェル中にガラス電極の先端に相当する開口部を有するマルチウェルパッチプレートを用い、細胞膜とパッチ電極とのシールをウェル中で自動的に行って膜電位を検出するオートメーションパッチクランプ法が開発されてきている（非特許文献１）。
　従来の蛍光膜電位測定法は、多検体の評価に適しているものの、測定精度や適用可能なイオンチャネルの範囲が限定される場合があった。また、パッチクランプ法は、測定精度が高く、測定により得られる情報量も多いが、一度に測定できる数が少なく効率が悪かった。さらに、オートメーションパッチクランプ法は、多数検体を同時に評価する構造となっているものの、パッチの成功率が低く、ハイスループットなスクリーニングには不向きであった。また、オートメーションパッチクランプ法は、装置及びランニングコストが高いことも問題であった。
特開２００６－１２６０７３号公報
Tim J. Daleら, Mol. Biosyst. 2007, 3, 714-722
　イオンチャネルを標的とするスクリーニングの場合、内在性のリガンドはイオンであるため、標的に対して結合性を有する構造を予測するのが困難である。このため、イオンチャネルを標的とするスクリーニング系を構築する際には、受容体など他のタンパク質を標的とする場合に比較して、多数の被験化合物を適用できるハイスループット性が一層要求される。また、イオンチャネルを標的とするスクリーニングの場合には、リガンドの最適化も困難を伴うことが多く、ハイスループット性と同時に測定精度も求められる。
　しかしながら、上記のとおり、従来のような細胞における微小な膜電位の変化を蛍光膜電位測定法では精度や適用範囲に問題があり、オートメーションパッチクランプ法では効率やコストに問題があった。したがって、現状において、イオンチャネルを標的とした、精度が良好で効率性に優れるスクリーニング系は構築されていない。
　本明細書の開示は、イオンチャネルを標的とする効率性に優れたスクリーニング系の構築を目的とする。
　本発明者らは、イオンチャネルを標的とするスクリーニング系では、生細胞の膜電位を検出するという評価手法を用いざるを得ず、かかる評価手法の問題点がスクリーニング系の構築を困難にしていることに着目した。そして、こうした評価手法でなく、より簡易な評価手法を適用できるスクリーニング系を構築することを目指して種々検討を行った。その結果、一旦細胞外部からの刺激により脱分極が惹起されると、細胞内外でのイオンの濃度差、典型的には、細胞内Naイオン濃度の増大により細胞死に至る細胞を、被験化合物のイオンチャネルへの作用の検出用媒体（スクリーニング材料）として用いることで、細胞死あるいは細胞死に至る若しくは細胞死に相当する持続的な活動電位を指標としてイオンチャネルに対する被験化合物の作動性／阻害性を検出できるという知見を得た。本明細書の開示によれば、以下の手段が提供される。
　本明細書の開示によれば、不活性化を抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネルをコードする１又は２以上の第１のＤＮＡを保持し、静止膜電位が負の方向に深くなるようにＫチャネルが活性化された、標的イオンチャネルに作用する細胞を含む、化合物のスクリーニング用材料が提供される。
　また、本明細書の他の開示によれば、上記スクリーニング用材料の前記細胞を用いて、前記標的イオンチャネルに対する被験化合物の作用を前記細胞の生死を指標として検出する工程を、備える、スクリーニング方法が提供される。
　さらに、本明細書の他の開示によれば、イオンチャネルに作用する化合物のスクリーニングのための装置であって、細胞を収容する１又は２以上の領域を備える細胞収容ユニットと、前記１又は２以上の領域内の前記細胞の細胞死の測定ユニットと、を備える、装置も提供される。
本明細書に開示されるスクリーニング方法の一例の概要を示す図である。 HEK_Kir細胞にボルテージクランプ法によりKirチャネル電流を測定した結果を示す図である。（ａ）は、Kir2.1チャネルの特異的ブロッカーである100μM Baイオン投与前後における電流電圧関係を示し、（ｂ）は、100μM Baイオン投与前後における膜電位変化を示す。 ＨEK_Kir細胞に野生型と変異型のNav1.5チャネルを一過性に発現させ、Naイオン電流の測定結果を示す電流原図である。（ａ）に野生型の結果を示し、（ｂ）に変異型の結果を示す。 ＨEK_Kir細胞に野生型と変異型のNav1.5チャネルを一過性に発現させ、脱分極通電刺激により活動電位の発生を示す活動電位原図である。（ａ）に野生型の結果を示し、（ｂ）に変異型の結果を示す。 HEK, HEK_Kir, HEK_Kir_mutated Navの３種類の細胞に電気刺激を行ない、MTT法により細胞数の変化を測定した結果を示す図である。刺激をしていないコントロールの吸光度を１として示す。 HEK_Kir_mutated Nav細胞にNaイオンチャネルの阻害薬であるリドカイン(Sigma)を投与し電気刺激を行なった結果を示す図である。刺激していないコントロールの吸光度を１として示す。 HEK細胞にhERGチャネルを一過性発現させた場合のニフェカラント投与前後における電流原図を示す図である。 hERGチャネルを一過性発現させたhERG-HEK細胞において、ニフェカラント投与前後における電流電圧曲線を示す図である。 Kir_mutated Nav細胞にhERGチャネルを一過性発現させたhERG_HEK_Kir_mutated Nav細胞におけるニフェカラント投与前後における電流原図を示す図である。 hERG_HEK_Kir_mutated Nav細胞におけるニフェカラント投与前後の脱分極刺激により誘発される活動電位原図を示す図である。 hERG_HEK_Kir_mutated Nav細胞におけるニフェカラント投与前後の活動電位時間を示す図である。 hERG_HEK_Kir_mutated Nav細胞において、ニフェカラント投与により脱分極刺激による細胞死が誘発されたことを示す図である。 hERG_HEK_Kir_mutated Nav細胞を用いた細胞死の割合によるニフェカラントの用量作用曲線を示す図である。 HEK_Kir細胞でのhigh K+刺激による蛍光変化を示す図である。 HEK_Kir_mutated Nav細胞でのhigh K+刺激による蛍光変化を示す図である。 HEK_Kir細胞及びHEK_Kir_mutated Nav細胞において細胞外のK+を15.3mMとしたときの蛍光強度の違いを示す図である。 HEK_Kir_mutated Nav細胞において、リドカインがhigh K+刺激による蛍光変化を阻害していることを示す図である。
　本明細書の開示は、イオンチャネルを標的とするスクリーニング系に関し、具体的には、イオンチャネル(膜輸送タンパク質)に作用する化合物をスクリーニングするのに用いることができる細胞を含むスクリーニング用材料及び当該材料を利用したスクリーニング方法、並びにスクリーニング用装置等に関する。本明細書の開示によれば、スクリーニングにおける標的イオンチャネルに対する作用を、スクリーニング用に構築した細胞の細胞死によって検出することができる。すなわち、この細胞は、一旦脱分極が惹起されて発生する活動電位が延長されているために細胞死に至るという細胞死制御機構が付与されている。すなわち、本明細書の開示は、このような細胞死制御機構を、被験化合物の標的イオンチャネルに対する作用の検出手段として用いている。
　かかる細胞死制御機構による被験化合物の標的イオンチャネルに対する作用の検出の概要の一例を、図１に示す。図１に示すように、被験化合物が、細胞膜に標的イオンチャネルと不活性化が抑制されたＮａイオンチャネルとを備え、静止電位を低下させるＫイオンチャネルが活性化された細胞である本スクリーニング材料に供給されると、標的イオンチャネルに対する被験化合物の作用は、脱分極の惹起あるいは抑制という結果で現れる。
　そして、被験化合物が標的イオンチャネルに作用して脱分極が惹起するものであるとき、本スクリーニング材料の細胞膜上の上記ＮａイオンチャネルとＫイオンチャネルによる細胞死制御機構のスイッチが「オン」となり、本スクリーニング材料は細胞死に至る。一方、被験化合物が標的イオンチャネルに作用して脱分極を抑制するものであるとき、上記細胞死制御機構のスイッチは「オン」されず「オフ」のままとなり、本スクリーニング材料は生存する。
　このように、本スクリーニング用材料は、被験化合物の作用による脱分極の惹起の有無を、細胞死制御機構のオン／オフ、すなわち、細胞の生死あるいは細胞死に至る持続的な活動電位の有無によって検出する。こうすることで、標的イオンチャネルに対する被験化合物の作用を、単に細胞膜の膜電位の変化を検出することによらないで、細胞の生死によって検出できるのである。
　細胞の生死の検出は、単なる細胞の膜電位あるいは膜電流測定という電気的検出に比較して簡易ないし明確であり、多検体同時評価に適しているため、ハイスループット性が高い。また、操作の簡便性ゆえに測定精度も確保することができる。このようなスクリーニング方法は、イオンチャネルを標的とする化合物の一次スクリーニングなどにも好適である。以下、本明細書の開示についての各種の実施形態を詳細に説明する。
（スクリーニング用材料）
　本明細書に開示されるスクリーニング用材料は、不活性化を抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネルをコードする第１のＤＮＡを保持し、同時に静止膜電位が負の方向に深くなるようにＫチャネル、例えば内向き整流性Ｋイオンチャネルが活性化され、Ｎａイオンの細胞内流入による細胞死が回避された細胞を含んでいる。以下、この細胞を、スクリーニング用細胞と称する。
　本スクリーニング材料は、スクリーニング用細胞のみを含んでいてもよいし、スクリーニング用細胞以外に、スクリーニング用細胞の生存を許容又は生存に適した培養材料や添加剤等を含んでいてもよい。かかる培養材料としては、一般的な培地のほか、緩衝液、抗生物質等が挙げられる。
（不活性化を抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネル）
　スクリーニング用細胞は、不活性化を抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネルをコードする第１のＤＮＡを保持している。そして、こうしたＮａイオンチャネルを発現している。ここで電位依存性Ｎａイオンチャネルとは、細胞膜の膜電位に依存して開口してＮａイオンの受動拡散を媒介する細胞膜上のタンパク質である。本明細書において用いる電位依存性Ｎａイオンチャネルは、特に限定しないで公知の各種電位依存性Ｎａイオンチャネルを用いることができるが、好ましくは、Nav1.5チャネルである。Nav1.5チャネルは、心筋細胞に分布しており、活動電位の発生と興奮伝導に関与していると考えられている。
　電位依存性Ｎａイオンチャネルは、膜電位に依存してゲートが開きＮａイオン透過性を発揮した後、不活性化機構が働いてＮａイオン透過性を失う（不活性化）。これに対して、不活性化を抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネルは、こうした不活性化機構を抑制（消失）させたものである。すなわち、不活性化を抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネルは、膜電位に依存してゲートが開きイオン透過性を発揮した後、こうした不活性化が生じないＮａイオンチャネルを意味している。不活性化を抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネルでは、膜において脱分極が惹起されて当該イオンチャネル自身が活性化されるとチャネルを開口してＮａイオンの受動拡散を媒介しうる状態をとるが、イオンチャネル自身の不活性化が抑制されているため、チャネルの開口した状態が維持される。この結果、不活性化が抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネルでは、刺激を受けて活動電位が一旦発生すると、チャネルの不活性化が遅延され、活動電位が本来の電位依存性Ｎａイオンチャネルより長く継続する。
　また、不活性化を抑制されたＮａイオンチャネルは、定常的若しくは比較的に深い静止膜電位でも活性化されやすくなっている（いわゆるウインド電流が大きくなっている）。従って不活性化を抑制されたＮａイオンチャネルを発現した細胞では、充分に深い負電位に静止膜電位を保持した場合にのみ、過剰なＮａイオン流入を防ぐことができる。不活性化を抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネルを充分に発現した細胞においては、脱分極により容易にＮａイオンチャネル活性が増大し、１分以上、好ましくは２分以上、より好ましくは３分以上、さらに好ましくは５分以上程度、活動電位あるいは脱分極が維持される。このため細胞内への過剰なＮａ流入が生じ細胞を死に至らしめる。
　かかる不活性化の抑制は、電位依存性Ｎａイオンチャネルのアミノ酸配列に対してアミノ酸変異を導入することによって適宜実現することができる。Nav1.5チャネルの不活性化を抑制するには、いくつかの具体的な手法が開示されている。たとえば、IFMモチーフの改変（A. O. Grant et al. Biophys. J. Vol.79, pp.3019-3035, 2000）、406番目のアスパラギンをグルタミン酸やアルギニン、リシンに変異させること(M. M. McNulty et al., Mol. Pharmacol. Vol.70, pp.1514-1523, 2006)、ドメインIII-IVをつなぐIFM部分を含むリンカー部位を欠損させること(D. E. Patton et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.89, pp.10905-10909, 1992、West JW, et., al, Proc Natl Acad Sci U S A. Vol.89, pp10910-4, 1992)、ドメインＩＶのセグメント４のアミノ酸を変異させること(L.-Q. Chen et al., J. Gen. Physiol. Vol. 108, pp.549-556, 1996)などが報告されている。アミノ酸配列に対する変異導入は、当業者であればこれらの文献や周知技術に基づいて適宜実施することができる。
　スクリーニング用細胞は、かかる変異体タンパク質をコードする第１のＤＮＡを当該変異体として発現可能に保持している。スクリーニング用細胞は、当該変異体、すなわち、不活性化が抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネルを定常的にあるいは一過性的に発現するものであってもよい。すなわち当該第１のＤＮＡは染色体上に組み込まれて娘細胞に伝達されるようになっていてもよいし、染色体外で自律的に増幅するが娘細胞には必ずしも伝達されないプラスミドに組み込まれていてもよい。第１のＤＮＡは、好ましくは、恒常的に作動するプロモーター（構成的プロモーター）の制御下に連結されている。このようなスクリーニング用細胞は、当業者であれば、周知の遺伝子工学技術及び形質転換体の作製技術に基づいて、第１のＤＮＡを含む発現ベクター等を構築し、これをスクリーニング用細胞の宿主に導入し形質転換することで、定常発現もしくは一過性発現細胞を適宜取得することができる。
　なお、電位依存性Ｎａイオンチャネルが２以上のサブユニットからなる場合であって、不活性化のために有効な変異を含むサブユニットが全体の一部であるとき、当該一部のサブユニットのみをそれぞれコードするＤＮＡを１又は２以上の第１のＤＮＡとしてスクリーニング用細胞に発現させることもできるし、当該Ｎａイオンチャネルを構成する他のサブユニットも同時に共発現させるように、これらのサブユニットをコードするＤＮＡを第１のＤＮＡとしてそれぞれ発現可能に保持させるようにしてもよい。さらに、発現される不活性化が抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネルを、より効果的に機能させるために必要な酵素や他のタンパク質があれば、これらのタンパク質を適宜発現させるようにしてもよい。
（Ｋイオンチャネルの活性化）
　スクリーニング用細胞は、静止膜電位が負の方向に深くなるように、換言すれば、より負の電位が大きくなるように、Ｋイオンチャネルが活性化されている。すなわち、Ｋイオンの細胞内への流入が促進されている。上記第１のＤＮＡを保持し、Ｎａイオンチャネル変異体（不活性化が抑制された膜電位依存性Ｎａイオンチャネル）が発現し活性化されていると、細胞内外におけるＮａイオンの濃度差により、Ｎａイオンが細胞内に過剰に流入する状態となり、最終的には細胞内のＮａイオン濃度が高まり細胞は死んでしまう。スクリーニング用細胞として機能させるためには、かかる細胞死機構が誘導されるまでは細胞が生存している必要がある。そこで、静止膜電位を深く（低く）するために、細胞内へのＫイオンの流入を促進するようＫイオンチャネルが活性化されている。このようにＫイオンチャネルが活性化されていると、通常よりも、静止膜電位を負の方向に深く設定することができる。
　細胞の生存に影響しない範囲で静止膜電位は、負の方向に深いほど好ましい。膜電位は、好ましくは、－５０ｍＶ、より好ましくは－６０ｍＶ、さらに好ましくは－７０ｍＶ程度、一層好ましくは－８０ｍＶ程度とすることが適している。
　静止膜電位が負の方向に深くなるようにＫイオンチャネルが活性化されている状態とは、たとえば、内向き整流性Ｋイオンチャネル（Kir）、４回膜貫通型及び２ポア型のＫイオンチャネル、直列ポアドメイン型のＫイオンチャネルなどが活性化されている状態が挙げられる。４回膜貫通型及び２ポア型のＫイオンチャネルは性質が異なる様々な種類が存在し、TWIK、TERK、TASK、TALK、THIK、TRESKなどに分類される。これらのチャネルは電位及び時間依存性がないことから漏洩チャネルとして機能している。漏洩チャネルの性質上、細胞の静止膜電位の固定に働いている。
　内向き整流性Ｋイオンチャネルは、特に限定しないが、例えば、Kir2.1、2.2、2.3及び2.4チャネルなどの各種Kir.2.xイオンチャネルが挙げられる。Kir2.1チャネルは、２回膜貫通型構造を持つ内向き整流性K+チャネルである。電位依存性を持たず、膜電位をK+の平衡電位側に近づける性質を持つ。神経や心臓、骨格筋に発現しており、静止膜電位の形成やその安定化及び維持を行なっている。Kir2.2も挙げられる。Kir2.2はKir2.1と同様の内向き整流性KイオンチャネルであるがKir2.1よりも内向き整流性が強い。心臓や脳、骨格筋にKir2.1とともに発現しており、ヒトの血管内皮細胞においては他の内向き整流性Kイオンチャネルの中で主要な働きをしている。
　Kir.2.xイオンチャネルについては、Circ. Res. 2004；94;1332-1339及びAm J Physiol Cell Physiol.2005. 289:C1134-C1144等に記載されている。例えば、ヒト由来のKir2.xチャネルをコードする塩基配列は、Kir2.1（GenBank accession No.U12507, NM_000891.2）、Kir2.2（GenBank accession No.AB074970、NM_021012（Human KCNJ12)）、Kir2.3（GenBank accession No.U07364、U24056）、Kir2.4（GenBank accession No.AF081466.1）等が挙げられる。
　同様に、GIRK(Kir3)が挙げられる。GIRK(Kir3)は、内向き整流性KイオンチャネルでありKir2と異なりGタンパク質によって活性化されるKチャネルである。これらのサブユニットは組織特異性があり心臓ではKir3.1/Kir3.4、中枢神経ではKir3.1/Kir3.2で構成させる異種四量体を形成している。通常時では活性化せず、アゴニスト刺激により活性化する。しかし、チャネルポアを形成する膜貫通ヘリックスのアミノ酸を変異させることで、常時チャネルが開くことがアフリカツメガエル卵母細胞の実験で報告されている（J Biol Chem, 2003,  Vol.278, No.50, pp.50654-50663)。このことからこの変異体を利用することでKir2.1と同様に深い静止膜電位を形成できると考えられる。例えば、ヒト由来のKir3.xチャネルをコードする塩基配列は、Kir3.1 (GenBank accession No.NM_002239.2)、Kir3.2 (GenBank accession No.NM_002240.2)、Kir3.3 (GenBank accession No.NM_004983.2)、Kir3.4 (GenBank accession No.NM_000890.3)が挙げられる。
　さらに、KATP(Kir6)チャネルが挙げられる。KATPチャネルはATPで抑制され、ADPで活性化される内向き整流性Kイオンチャネルである。KATPチャネルは細胞の代謝状態に応じて細胞の興奮性を制御している。KATPチャネルは４個のKATPチャネルと４個のスルフォニルウレア受容体(SUR)から構成される異種８量体である。KATPチャネルのみでは機能をもたないがKATPチャネルのC末端を欠損させることでKATPチャネルのみで機能をもつことが報告されている（EMBO J. Vol.17, NO.12, pp.3290-3296, 1998）。また、この欠損体にさらに変異をかけることでATP感受性を下げ、常時活性化させることができる。この変異体を用いることでも深い静止膜電位を形成できる。ヒト由来のKir6.xチャネルをコードする塩基配列は、Kir6.1(GenBank accession No.NM_004982.2)、Kir6.2(GenBank accession No.NM_001166290.1)が挙げられる。
　また、４回膜貫通型及び2ポア型のKイオンチャネルとしては、例えば、THIKチャネル（HEK293細胞に発現させると膜電位が深くなること(V. A. Campanucci et al., Neuroscience Vol.135, pp.1087-1094, 2005）)、TASK2チャネル（アフリカツメガエル卵母細胞に発現させると静止膜電位が深くなること(C. Kindler et al., J Pharmacol Exp Ther.Vol.306, pp.84-92, 2003)）、Kvイオンチャネル（平滑筋組織でKvイオンチャネルが静止膜電位を深くすること(S. S. McDaniel et al., J Appl Physiol Vol.91, pp.2322-2333, 2001)）などが知られている。
　２ポア型のKイオンチャネルは、TWIK、TREK、TASK、TALK、THIK及びTRESKの各サブファミリーに分類される。TWIKサブファミリーは、TWIK-1、TWIK-2チャネルを含んでいる（Cell Biochem Biophys (2007),47： 209-256）。TWIKチャネルは、ヒトでは多くの組織に存在している。例えば、ヒト由来のTWIKイオンチャネルは、TWIK-1（GenBank accession No.NM_002245.3）及びTWIK-2（GenBank accession No.NM_004823.1）が挙げられる。
　TREKサブファミリーは、TREK-1、TREK-2及びTRAAKチャネルを含んでいる。例えば、ヒト由来のTREKイオンチャネルは、TREK-1（GenBank accession No.NM_014217.3）、TREK-2（GenBank accession No. NM_138317.2）及びTRAAK（GenBank accession No.NM_033310.2）が挙げられる。
　TASKサブファミリーは、TASK-1、TASK-3及びTASK-5チャネルを含んでいる。例えば、ヒト由来のTASKイオンチャネルは、TASK-1（GenBank accession No.NM_002246.2）、TASK-3（GenBank accession No.NM_016601.2）及びTASK-5（GenBank accession No.NM_022358.3）が挙げられる。
　TALKサブファミリーは、TALK-1、TALK-2及びTASK-2チャネルを含んでいる。例えば、ヒト由来のTALKイオンチャネルは、TALK-1（GenBank accession No.NM_001135106.1）、TALK-2（GenBank accession No.NM_001135111.1）及びTASK-2（GenBank accession No.NM_003740.3）が挙げられる。
　THIKサブファミリーは、THIK-1、THIK-2チャネルを含んでいる。例えば、ヒト由来のTHIKイオンチャネルは、THIK-1（GenBank accession No.NM_022054.2）、THIK-2（GenBank accession No.NM_022055.1）が挙げられる。
　TRESKサブファミリーは、TRESK（GenBank accession No.NM_181840.1）が挙げられる。
　本スクリーニング用細胞においては、こうしたKイオンチャネルを静止膜電位を深くする目的で、１又は２以上適宜組み合わせて用いることができる。
　静止膜電位が負の方向に深くなるようにＫイオンチャネルが活性化されている状態のスクリーニング用細胞は、かかるＫイオンチャネルタンパク質をコードする第２のＤＮＡを外来性ＤＮＡとして、当該タンパク質を発現可能に保持していることが好ましい。スクリーニング用細胞は、Ｋイオンチャネルを定常的にあるいは一過性的に発現するものであってもよい。すなわち当該第２のＤＮＡは染色体上に組み込まれて娘細胞に伝達されるようになっていてもよいし、染色体外で自律的に増幅するが娘細胞には必ずしも伝達されないプラスミドに組み込まれていてもよい。第２のＤＮＡは、好ましくは、恒常的に作動するプロモーター（構成的プロモーター）の制御下に連結されている。このようなスクリーニング用細胞は、当業者であれば、周知の遺伝子工学技術及び形質転換体の作製技術に基づいて、第２のＤＮＡを含む発現ベクター等を構築し、これをスクリーニング用細胞の宿主に導入し形質転換することで、定常発現もしくは一過性発現細胞を適宜取得することができる。
　なお、活性化させるＫイオンチャネルが２以上の異なるサブユニット（異なるＫイオンチャネルのサブユニットであってもよい）からなる場合、これらのサブユニットをそれぞれコードするＤＮＡを１又は２以上の第２のＤＮＡとしてスクリーニング用細胞に発現させることが好ましい。さらに、発現させるＫイオンチャネルを、効果的に機能させるために必要な酵素や他のタンパク質がある場合、これらのタンパク質を共発現させてもよい。その場合、こうした他のタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持させるようにすればよい。なお、他のタンパク質としては、例えば、ＫイオンチャネルがＧタンパク質共役型Ｋイオンチャネルの場合にはＧタンパク質などが挙げられる。
　スクリーニング用細胞は、不活性化を抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネルを細胞膜などの生体膜上に有し、同時に、静止膜電位が低下する（深くなる）ようにＫイオンチャネルが作動していること、換言すれば、内向き整流性Ｋイオンチャネル等が細胞膜上で作動していることで、結果として、不活性化の抑制された変異型電位依存性Ｎａイオンチャネルを有していても、脱分極が惹起されるまでは、Ｎａイオンの細胞内流入による細胞死が回避された細胞となっている。すなわち、スクリーニング用細胞の細胞膜における脱分極の惹起を待って作動する細胞死誘導機構が待機した状態となっている。
　スクリーニング用細胞は、新たに標的イオンチャネルをコードするＤＮＡを遺伝子導入して発現させるための宿主細胞としても利用できる。
（標的イオンチャネル）
　スクリーニング用細胞における標的イオンチャネルは、特に限定しないで、公知のあるいは新たなイオンチャネルから１又は２以上を適宜選択することができる。なお、イオンチャネルとは、動植物の細胞膜や内膜などの生体膜を貫通して存在し、特定のイオンを受動的に透過させるタンパク質を意味している。イオンとしては、Ｎａイオン、Ｋイオン、Ｃａイオン、Ｃｌイオン等が挙げられる。イオンチャネルには、その開閉の制御性により、電位依存性、リガンド依存性、機械刺激依存性、温度依存性、漏洩チャネル、リン酸化依存性等が挙げられる。本明細書の開示によれば、スクリーニング用細胞の生死で、標的イオンチャネルに対する作用（作動性と阻害性）を検出できるため、広くイオンチャネル全般を標的とすることができる。なお、本明細書において、イオンチャネルとは、電位依存性であるかリガンド依存性であるかなどその開閉の制御形式を問うものではない。また、イオンチャネルとしては、電位発生的なイオン輸送を行う細胞膜および核膜やその他の細胞内小器官膜などを含む生体膜の輸送体、イオン交換体（Ｎａ＋－Ｃａ２＋交換体など）、イオンポンプ（Ｎａ＋－Ｋ＋ポンプ）も包含している。スクリーニング用細胞における標的イオンチャネルを選択することで、当該標的イオンチャネルが関連する疾患の予防又は治療のためのスクリーニング用細胞が提供されることになる。
　標的イオンチャネルとしては、まず、各種のイオンチャネル一体型薬物受容体が挙げられる。かかる受容体としては、ニコチン様アセチルコリン受容体、イオンチャネル型ATP受容体（P2x受容体）、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、イオンチャネル型GABAA 受容体、イオンチャネル型グリシン受容体、３型セロトニン受容体などが挙げられる。また、各種のTRP（Transient Receptor Potential）チャネル（非選択性陽イオンチャネル）が挙げられる。また、OraiチャネルおよびStimチャネルなどのストア作動性Ｃａイオンチャネルが挙げられる。また、標的イオンチャネルとしては、各種の電位依存性イオンチャネルが挙げられる。例えば、全ての電位依存性Ｃａイオンチャネル、全ての電位依存性Ｋイオンチャネル（HERGチャネルを含む）、全ての電位依存性Ｎａイオンチャネル、全ての電位依存性Ｃｌイオンチャネルが挙げられる。なお、その他のリガンド依存性のＣａイオンチャネル、Ｎａイオンチャネル、プロトンイオンチャネル、Ｋイオンチャネル、Ｃｌイオンチャネルが挙げられる。さらに、電位、温度、ｐＨや張力などの刺激を感受して開閉する全てのイオンチャネルが挙げられる。
　標的イオンチャネルとしては、なかでも、疾患や症状に関連深いとされている標的イオンチャネルが好ましい。例えば、Ｎａイオンチャネルとしては、Nav1.1～1.3及び1.5～1.9が挙げられる。これらは、てんかん、神経因性疼痛、不整脈、疼痛などに関連しており、これらを治療又は予防する薬剤のスクリーニングが可能となる。また、Ｃａイオンチャネルとしては、Cav1.1、1.2、1.3、1.4、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2及び3.3が挙げられる。これらは、循環器疾患、アルツハイマー病、疼痛、てんかん、高血圧に関連しており、これらを治療又は予防する薬剤のスクリーニングが可能となる。また、Ｋイオンチャネルとしては、Kv1.1～1.5、2.1、3.2、4.3、7.1～7.5、10.1、11.1（hERGを含む）、12.1～12.3が挙げられる。これらは、多発性硬化症、自己免疫疾患、疼痛、心房細動、糖尿病、てんかん、神経痛、アルツハイマー病、尿失禁、不整脈、ガン等に関連しており、これらを予防又は治療する薬剤のスクリーニングが可能となる。また、Ｃｌイオンチャネルとしては、CLC-1～7及び、－Ｋａ、Ｋｂは、高血圧に関連しており、これを予防又は治療する薬剤のスクリーニングが可能となる。
　特に、hERG Kイオンチャネルを標的イオンチャネルとすることが好ましい。このイオンチャネルは、6回膜貫通型構造を持ち4量体を形成する電位依存性Kイオンチャネルの１つである。他の電位依存性Kイオンチャネルとの違いとして内向き整流性を示すことが挙げられる。これはC型不活性化が非常に速く起こることに起因する。心臓における活動電位の第3相である再分極相で強く働いている。再分極相において電位を過分極させる働きを持つため不整脈と、また癌とも関わりが強いチャネルとして知られている。hERGチャネルを阻害すると致死性の高いQT延長症候群が誘発されるため、現在、全ての種類の薬剤の候補化合物において、心毒性としてのHERG Kイオンチャネル阻害作用による催不整脈作用の検討が求められる。このため、標的イオンチャネルをhERG Kイオンチャネルとするスクリーニング用細胞の有用性は高い。スクリーニング用細胞にhERG Kイオンチャネルを発現させた場合、例えば電気刺激により発生する活動電位が短縮されるため、細胞死が生じにくくなる。hERG Kイオンチャネル阻害作用を有する、もしくは有することを疑われる化合物を加えることにより、その阻害程度に依存してスクリーニング用細胞の細胞死が生じ易くなるため、hERGKイオンチャネルに対する阻害効果が定量的に評価できる。hERGとしては、例えば、GenBank accession No.NM_000238.2が挙げられる。
　標的イオンチャネルを発現しているスクリーニング用細胞であればスクリーニングに使用可能である。好ましくは、スクリーニングに用いるスクリーニング用細胞は、標的イオンチャネルを特異的発現あるいは高発現している。より精度及び感度の良好なスクリーニングのためである。イオンチャネルは特定の細胞に分布していることが多いため、スクリーニング用細胞の親株として、予め標的とするイオンチャネルを高発現している細胞を選択することもできる。しかし、試験管外で安定してスクリーニング用細胞において標的イオンチャネルを発現させるには、スクリーニング用細胞が、当該標的イオンチャネルをコードするＤＮＡ（第３のＤＮＡ）を保持し、発現していることが好ましい。また、スクリーニング用細胞は、標的イオンチャネルを定常的にあるいは一過性的に発現するものであってもよい。すなわち当該第３のＤＮＡは染色体上に組み込まれて娘細胞に伝達されるようになっていてもよいし、染色体外で自律的に増幅するが娘細胞には必ずしも伝達されないプラスミドに組み込まれていてもよい。
　第３のＤＮＡは、好ましくは、恒常的に作動するプロモーター（構成的プロモーター）の制御下に連結されている。このようなスクリーニング用細胞は、当業者であれば、周知の遺伝子工学技術及び形質転換体の作製技術に基づいて、第３のＤＮＡを含む発現ベクター等を構築し、これをスクリーニング用細胞の宿主に導入し形質転換することで、定常発現もしくは一過性発現細胞を適宜取得することができる。
　なお、発現させる標的イオンチャネルが２以上の異なるサブユニット（あるいは異なるイオンチャネルのサブユニットであってもよい）からなる場合、これらのサブユニットをそれぞれコードするＤＮＡを１又は２以上の第３のＤＮＡとしてスクリーニング用細胞に発現させることが好ましい。さらに、発現させる標的イオンチャネルを、効果的に機能させるために必要な酵素や他のタンパク質がある場合、これらのタンパク質を共発現させてもよい。その場合、こうした他のタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持させるようにすればよい。なお、他のタンパク質としては、例えば、各種受容体タンパク質、GTP結合タンパク質、リン酸化酵素等が挙げられる。
　スクリーニング用細胞の宿主細胞は、スクリーニング用として用いることができるものであれば特に限定しないで、各種の動植物細胞を用いることができる。動物細胞としては、哺乳動物や昆虫など特にその種類は限定されない。宿主細胞が、ヒトのほか、ウシ、ブタ、ウマ、トリ、イヌ、ネコ等の細胞の場合には、これらの動物における疾患の予防又は治療のための薬剤のスクリーニング用細胞を取得できる。また、昆虫細胞を宿主とする場合には、昆虫を対象とする農薬等のスクリーニング用細胞を取得できる。また、宿主細胞を植物細胞とするときは、農薬等のスクリーニング用細胞を取得できる。動物細胞としては、典型的には、ヒト胎児腎由来細胞（HEK細胞）、アフリカミドリザル腎由来細胞（COS細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、ベビーハムスター腎細胞（BHK細胞）及びアフリカツメガエル卵母細胞が用いられる。
（スクリーニング方法）
　本明細書に開示されるスクリーニング方法は、本明細書に開示されるスクリーニング用材料のスクリーニング用細胞を用いて、標的チャネルに対する被験化合物の作用をスクリーニング用細胞の生死を指標として検出する工程、を備えることができる。本スクリーニング方法によれば、本明細書に開示されるスクリーニング用細胞を用いることで、スクリーニング用細胞の生死を指標として、被験化合物の標的イオンチャネルへの作用を検出できる。このため、簡易に高効率に多検体を同時評価することが可能となっている。また、特別な操作や装置も必要としないため、操作に由来する精度低下もなく、スクリーニングコストも低下させることができる。
　本明細書に開示されるスクリーニング方法は、既に説明した各種のイオンチャネルを標的イオンチャネルとしたスクリーニング細胞を用いることで、当該標的イオンチャネルが関連する疾患や症状を予防又は治療する薬剤をスクリーニングすることができる。スクリーニングにあたっては、１又は２以上の被験化合物をスクリーニング細胞に供給することができる。単一の被験化合物を用いて当該化合物による作用を検出してもよいし、２以上の被験化合物を用いてこれらの化合物の複合作用あるいは相乗作用を検出してもよい。標的イオンチャネルに対する作用をスクリーニング用細胞の生死によって検出するにあたっては、被験化合物を供給しなかった場合のスクリーニング用細胞の生死をコントロールとすることができる。また、標的イオンチャネルに対する作用が既知である化合物をコントロールとしてもよい。こうしたコントロールとの比較によって、被験化合物の標的イオンチャネルに対する作用の有無やその作用の程度を検出することができる。
　被験化合物は、特に限定しない。低分子化合物であるほか、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどの核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、オリゴ糖、多糖類、脂質等であってもよい。
　スクリーニング用細胞には、必要に応じて、被験化合物のほか、各種刺激が付与されてもよい。これらの刺激との組み合わせで作用が促進又は抑制される場合もあるからである。また、刺激の存在下で活性化するあるいは不活性化する標的イオンチャネルへの作用を評価することもできる。こうした刺激としては、例えば、温度変化（高温、低温）、ｐＨ変化、Ｏ2/CO2濃度変化、浸透圧変化などが挙げられる。
　また、後述するように、検出工程において、スクリーニング用細胞の細胞膜の脱分極の惹起させる必要がある場合がある。その場合には、電気刺激など、被験化合物に影響が出にくい刺激を用いることが好ましい。
　スクリーニング用細胞の細胞死を指標として被験化合物の標的イオンチャネルへの作用を検出するのにあたっては、スクリーニング用細胞の死か生かといった二者択一的な結果を指標とすることに限定するものではなく、細胞死の比率（換言すれば、生細胞の比率でもある）を指標とすることも含まれる。細胞死の比率を指標とすることで、作用の強弱や程度を、感受性等も評価することができる。スクリーニング用細胞の細胞死（生細胞であってもよい）の検出方法を各種公知の手法を特に限定しないで採用できる。例えば、ＭＴＴ法をはじめ細胞染色、核染色、酵素活性によるものなど各種手法が挙げられる。精度や効率性を考慮して適宜選択できる。また、細胞死は、細胞死に至る持続的な活動電位を検出することでも検出できる。すなわち、細胞死に至るような活動電位の持続時間を検出することによってもよい。こうした活動電位の持続状態は、従来の膜電位の電気的な検出のほか、蛍光膜電位検出法や膜電位感受性色素によって検出してもよい。
　本明細書に開示されるスクリーニング方法では、標的イオンチャネルの種類に応じて適宜スクリーニング方法の態様が選択される。より具体的には、標的イオンチャネルの制御様式やその機能に応じて適宜選択される。例えば、標的イオンチャネルの制御様式（電位依存性、リガンド依存性、機械刺激依存性、温度依存性、漏洩チャネル、リン酸化依存性等）に応じ、標的イオンチャネルの活性化（又は不活性化）のための刺激の有無や刺激の種類が選択される。また、標的イオンチャネルの機能に応じて、細胞死を指標とした評価態様（標的イオンチャネルに対して作動性か阻害性か等）が選択される。例えば、標的イオンチャネルが電位依存性イオンチャネルの場合には、活性化（所定の膜電位による活性化）により各種の機能が発現されることが知られている。具体的には、活動電位の発生、興奮伝導(以上、Ｎａイオンチャネル)、神経伝達物質の遊離、神経及び心筋での活動電位の発生（以上、Ｃａイオンチャネル）、膜電位の維持、興奮性の制御、活動電位の再分極（以上、Ｋイオンチャネル）、膜電位再分極、タンパク質再吸収、骨器質吸収、Ｃｌ輸送（以上、Ｃｌイオンチャネル）が挙げられる。
　例えば、標的イオンチャネルが活性化によりスクリーニング用細胞の細胞膜などの生体膜の脱分極を惹起するイオンチャネルであるときには、以下のような検出工程におけるスクリーニング態様が挙げられる。
　すなわち、（１）被験化合物の存在下でスクリーニング用材料の標的チャネルに対する被験化合物の作用をスクリーニング用細胞の生死を指標として検出する工程が挙げられる。より具体的には、スクリーニング用細胞に被験化合物を付与後に、スクリーニング用細胞の生死を検出する。細胞死の促進を検出したとき、当該被験化合物は、標的イオンチャネルに対して作動性を有する作動剤（活性化剤）であると判定できる。
　また、同様のイオンチャネルを標的とするとき、（２）被験化合物及び標的イオンチャネルに対する刺激の存在下で、被験化合物の作用を前記細胞の生死を指標として検出する工程が挙げられる。より具体的には、スクリーニング用細胞に予め被験化合物を付与しておき、その後標的イオンチャネルに対する既知の作動剤を加え、その後にスクリーニング用細胞の生死を検出する。細胞死を検出しないかあるいは細胞死が抑制されている場合、被験化合物は、標的イオンチャネルに対する阻害性を有する阻害剤(不活性化剤)であると判定できる。
　また、標的イオンチャネルは、漏洩チャネルなど、スクリーニング用細胞の細胞膜などの脱分極及び／又は活動電位を抑制する（過分極を促進する）イオンチャネルであるときには、以下のような検出工程の態様が挙げられる。すなわち、被験化合物及びスクリーニング用細胞の生体膜の脱分極を惹起する刺激の存在下で、被験化合物の作用をスクリーニング用細胞の生死を指標として検出することが挙げられる。この場合、被験化合物の不存在下では、標的イオンチャネルは恒常的に作動して、脱分極を抑制しあるいは活動電位を抑制（再分極を促進）している。このため、電気刺激などのスクリーニング用細胞の細胞膜の脱分極を惹起する刺激を与えて細胞死制御機構を作動させても、活動電位が発生しない、あるいは延長しない。この結果、スクリーニング用細胞は生存する。一方、このスクリーニング細胞に、被験化合物と前記刺激とを付与したとき、スクリーニング用細胞の細胞死が促進されたのであれば、当該被験化合物は、標的イオンチャネルに対して阻害性を有する阻害剤として判定できる。
　また、標的イオンチャネルが、HERG Kイオンチャネルなど、活性化によりスクリーニング用細胞の細胞膜などの生体膜の脱分極及び／又は活動電位を抑制する（再分極を促進する）イオンチャネルであるときには、以下のような検出工程におけるスクリーニング態様が挙げられる。すなわち、被験化合物及び前記スクリーニング用細胞の生体膜の脱分極を惹起する刺激の存在下で、前記被験化合物の作用を前記細胞の生死を指標として検出することが挙げられる。より具体的には、被験化合物をスクリーニング用細胞に付与と同時又はその後に電気刺激等で生体膜の脱分極を惹起したときに、スクリーニング用細胞の細胞死が抑制されたのであれば、当該被験化合物は、標的イオンチャネルに対する作動性を有する作動剤であると判定できる。一方、スクリーニング用細胞の細胞死が促進されたときは、当該被験化合物は、標的イオンチャネルに対して阻害性を有する阻害剤であると判定できる。
　以上のように、本明細書に開示されるスクリーニング方法によれば、スクリーニング用細胞の生死を指標として、各種態様で標的イオンチャネルに対する被験化合物の作用性を簡易にかつ効率的に検出することができる。このスクリーニング方法は、迅速性が求められるスクリーニング系のほか、構造設計が困難な、イオンチャネルを標的とする薬剤のスクリーニング、特に、ハイスループット性が求められる一次スクリーニングなどにも適している。
（検査方法）
　本明細書の開示によれば、本明細書に開示されるスクリーニング用材料のスクリーニング用細胞を用いて、標的イオンチャネルに対する被験化合物の作用をスクリーニング用細胞の生死を指標として検出する工程、を備える、被験化合物の検査方法も提供される。この検査方法によれば、簡易かつ迅速に、被験化合物の標的イオンチャネルへの作用（作動性や阻害性）を測定できる。したがって、被験化合物に一定以上の作用が求められる場合における検査方法として有用である。本明細書に開示される検査方法においては、すでに説明した本明細書に開示されるスクリーニング方法における各種態様をそのまま適用することができる。
（スクリーニング装置）
　本明細書に開示されるスクリーニング装置は、イオンチャネルに作用する化合物のスクリーニングのための装置であって、細胞を収容する１又は２以上の領域（細胞収容領域）を備える細胞収容ユニットと、前記１又は２以上の領域内の前記細胞の細胞死の測定ユニットと、を備えることができる。本明細書に開示されるスクリーニング装置によれば、細胞死測定ユニットを備えているため、細胞収容ユニット内の細胞死を効率的に検出することができる。このスクリーニング装置には、本明細書に開示されるスクリーニング用細胞を用いることができる。なお、細胞死の検出にあたっては、本スクリーニング方法において既に説明したように各種方法を採用することができる。
　細胞収容ユニットは、細胞死の測定に適した細胞数の細胞が収容できればよく、公知のマルチウェルプレートあるいはそれと同等の大きさのウェルを細胞収容領域として備えることができる。こうしたウェルは、通常、細胞をインキュベーションすることができるように培地を収容することも可能となっている。ウェルは、アレイ状に配列されていることが好ましい。
　細胞死測定ユニットは、細胞死の検出方法に応じて各種態様を採ることができる。例えば、細胞に対して、１又は２以上の薬剤を供給して、生細胞又は死細胞を検出する場合には、そのような薬剤を細胞収容領域の供給可能な薬剤供給部を備えることができる。薬剤供給部は、典型的には、細胞収容領域に同時にあるいは順次薬剤を供給するための薬剤注入部のほか、薬剤を貯留しておく薬剤貯留部、薬剤を貯留部から搬送して薬剤注入部から吐出させるためのポンプ部、薬剤の供給量を制御する制御部等が挙げられる。これらの各部のうち、薬剤注入部は備えることが好ましいが、その他の各部は適宜必要に応じて設けられる。
　また、細胞死測定ユニットは、検出方法にもよるが、細胞収容部内の細胞の細胞死を電気的あるいは光学的に検出するための光学検出部を備えていてもよい。光学検出部は、光源のほか、通常は、スキャナー部、さらには、検出した信号をコントロール等を参照して光強度として算出する制御部等を備えることができる。
　さらに、細胞死測定ユニットないしスクリーニング装置は、スクリーニング工程を制御し、結果を記憶する記憶部及び当該記憶部を備える制御部を備えることができる。さらに、こうした工程や結果を表示する表示部を備えることもできる。さらに、結果を印刷するプリンタ部を備えることもできる。
　スクリーニング装置は、さらに、１又は２以上の細胞収容領域に電圧を印加する電圧印加ユニットを備えることもできる。細胞収容領域内の細胞に電気刺激を付与可能とすることで、スクリーニングの検出工程において、電機刺激付与操作を効率的に実施できる。かかる電圧印加ユニットは、細胞収容領域内の本スクリーニング用細胞に対して電気刺激を付与して細胞膜の脱分極を惹起し細胞死制御機構を作動させるために用いることができる。電圧印加ユニットは、細胞収容領域の一部又は全体に適用される電極と当該電極に電圧を印加する電源を備えることができる。また、印加される電圧は、既に説明した制御部によって制御されることが好ましい。
（スクリーニング用キット）
　本明細書に開示されるスクリーニング用キットは、本明細書に開示されるスクリーニング用材料を備えている。こうしたキットによれば、本スクリーニング用細胞を用いてイオンチャネルに作用する化合物のスクリーニングを容易にかつ効率的に行うことができる。本キットは、本スクリーニング用材料の他、細胞死の測定用の試薬を備えていてもよい。また、スクリーニング用細胞に適した培地を備えていてもよい。本スクリーニング用キットは、さらに、本明細書に開示されるスクリーニング装置を備えることができる。本スクリーニング用キットに適用されるスクリーニング用細胞及びスクリーニング用材料並びにスクリーニング装置は既に説明した各種態様から適宜選択され、組み合わされる。
　以下、本明細書の開示を具現化した実施例につき説明するが、本明細書の開示はこれに限定されるものではない。
（Nav1.5チャネル不活性化部位IFMモチーフ変異体の作製）
Nav1.5チャネルの不活性化を制御しているIII-IVリンカー領域中に存在する疎水性アミノ酸配列Ile-Phe-Met(IFMモチーフ)をすべてGlnに変異させることとした。変異後のアミノ酸配列（部分）を以下に示す。
hNav1.5アミノ酸配列（変異対象となるＩＦＭを含む領域のみ表示）（配列番号１）
1470-IDNFNQQKKKLGGQDIFMTEEQKKYYNAMKK-1500
（下線部のIFMをQQQに変異）
　ヒト由来のNav1.5 (GenBank Accession Number: NM_198056.2)をpcDNA3.1(+)(Invitrogen)にサブクローニングしたpcDNA3.1/Nav1.5を鋳型として、以下に示す特異的なPCRプライマー及びQuik change Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いて、不活性化変異体Nav-QQQを作製した。得られたクローンのDNA配列はBigDye Terminator ver 3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)、蛍光キャピラリーシークエンサー(ABI PRISM 3100-Avent Genetic Analyzer、Applied Biosystems)を用いて確認し、プラスミドDNAをHipure Plasmid Maxiprep Kit(Invitrogen)を用いて大量精製した。
プライマー
5’-gttagggggccaggaccaacaacagacagaggagcagaag-3’（配列番号２）
5’-cttctgctcctctgtctgttgttggtcctggccccctaac-3’（配列番号３）
（細胞培養及び遺伝子導入）
　ヒト胎児腎由来細胞(HEK293細胞)はヒューマンサイエンス研究資源バンク(HSRRB)から購入した。10%FBS(Gibco)を添加し、100U /ml ペニシリン(和光純薬)、100μｇ/ml ストレプトマイシン(明治製菓)を加えたD-MEM培地(和光純薬)中で37℃、5％CO2において培養した。ヒト由来のKir2.1(NM_000891.2)をpcDNA3.1(+)(Invitrogen)にサブクローニングしたpcDNA/Kir2.1をLipofectamine 2000 regent(Invitrogen)を用いて遺伝子導入し、上記のD-MEM培地に0.2mg/ml Zeocin(Invitrogen)を加えた培地で培養し、Zeocin耐性細胞をクローニングし、Kir2.1定常発現細胞(HEK_Kir)を作製した。また同様の方法でKir2.1定常発現細胞に不活性化変異体Nav-QQQ(HEK_Kir_mutated Nav)を遺伝子導入し、24～72時間後に実験を行なった。
（電気生理実験）
　Hamill等によって確立されたパッチクランプ法を用いて電流導出等を行なった。外径1.04~1.08μmの芯入りガラス管から2段式の電極作製機(PB-7, 成茂科学)により、先端の径がおよそ1μmのガラス微小電極を作製し、500倍の顕微鏡下で熱加工して先端を滑らかにした。本実験では電極内液を充填した時の電極抵抗が2～5MΩの電極を用いた。倒立顕微鏡(Nikon TMD)のステージ上に固定した容量約500μlのチャンバーに細胞を定着させたガラス片を固定し外液で灌流した。外液(正常HEPES緩衝液)の組成は(mM):137 NaCl, 5.9 KCl, 2.2 CaCl2, 1.2 MgCl2, 14 glucose, 10 HEPES (pH7.4 by NaOH)。ピペット内液の組成は(mM):140 KCl, 4 MgCl2, 5 ATP-2Na, 0.05 EGTA, 10 HEPES  (pH7.2 by KOH)。実験はすべて室温(23±1℃)で行なった。ガラス片に付着している細胞に対し、油圧式微動マニピュレータ(MO-203: 成茂科学)を用いてガラス微小電極を押し当てて、電位固定法及び電流固定法により記録を行なった。測定した電流及び電位は微小電流用増幅器(EPC-7: HEKA Elektronik)を用いて増幅し、A-D変換機(Digdata 1400A: Axon Instruments)を用いてコンピュータ上に記録した。データの解析はClampfit10.2ソフトウェア(Axon Instruments)とOrigin6.0J(Microcal Software Inc.)を用いて行なった。
（細胞死の測定）
　3種の細胞(HEK, HEK_Kir, HEK_Kir_mutated Nav)を100μlのD-MEM培地を入れた96ウェルプレートに5×103 cells/wellになるように蒔き5％CO2、37℃で培養した。1日後に径0.5mmの２本の刺激銀線電極を各ウェルの培養液内へ、その先端部分を2mm程度差し込み、40mA, 80mA, 120mA, 160mAの４種類の電流強度(強度１～４)で、刺激幅200msの矩形波による電気刺激を電気刺激装置（日本光電）を用いて３分間隔で３回行なった。電気刺激条件は必ずしもこの通りである必要はなく、確実に活動電位を発生させることができる条件を選べばよい。その後、5％CO2、37℃で培養し、一日後にMTT試薬(リン酸緩衝食塩水PBS(-)で溶かし最終濃度を5mg/mLに調製)を10μl加え、4時間、5％CO2、37℃で培養後、溶解溶液(20% SDS / 50% DMF溶液)を100μl入れて細胞を溶解し、ホルマザン塩を溶解させた。さらに、37℃で8～12時間インキュベート後、マルチスキャンJX(ver1.1, Thermo Labsystems, USA)を用いて測定波長: 595nm、対照波長: 650nmにおいて吸光度を測定し、生細胞数の間接的な指標とした。ただし、上記の４時間および８～１２時間はそれぞれ２時間、３時間に短縮しても測定できる。
（結果）
　　・　HEK_Kir細胞の発現解析
　HEK_Kir細胞にボルテージクランプ法を適用しKirチャネル電流を測定した。結果は、図２（ａ）に示すように、内向きに流れるKirチャネル電流の特徴が見られ、選択的阻害薬である100μMのＢａイオンを投与すると内向き電流が阻害された。また、カレントクランプ法により膜電位を測定すると、図２（ｂ）に示すように、約-70mVの深い静止膜電位であり、100μMのＢａイオン投与により静止膜電位が浅くなった。
2．野生型及び変異型Nav1.5チャネル電流の不活性化速度と活動電位発生時間の違い
　HEK_Kir細胞に野生型と変異型のNav1.5チャネルを一過性に発現させ、Ｎａイオンチャネル電流を測定した。結果は図３に示すように、変異型（図３（ｂ））においてＮａイオンチャネル電流の不活性化が非常に遅い電流が観測された。また同じ細胞を用いて脱分極通電刺激（野生型に対して300pA、10ms、変異型に対して200pA、100ms）により活動電位を発生させたところ、変異型（図４（ｂ）において活動電位の発生時間が有意に長いことが判明した。結果を図４に示す。
　　・　電気刺激による細胞死の変化
　先の2.に示した結果から変異型のNav1.5チャネルにおいて非常に長い活動電位が発生することが明らかとなった。電気刺激により活動電位を発生させると細胞死が起こる可能性が考えられたため、次に電気刺激による細胞死の変化を検討した。HEK, HEK_Kir, HEK_Kir_mutated Navの３種類の細胞に電気刺激を行ない、MTT法により細胞数の変化を測定した。図５に示すように、80mA、200ms、３発（３分間隔）の矩形波電気刺激でHEK_Kir_mutated Navの細胞数が有意に減少した。このことは、HEK_Kir_mutated Nav細胞が脱分極の刺激に対して感受性が高いことを示している。また同様の刺激強度でNaイオンチャネルの阻害薬であるlidocaine(Sigma)を投与し電気刺激を行なった。結果は、図６に示すように、細胞死が起こるのを阻害した。このことからHEK_Kir_mutated Nav細胞は非常に長い活動電位が発生することで細胞死が起き、Ｎａイオンチャネルを阻害すると細胞死が抑制されることが判明した。
　実施例２に準じて、ヒト由来のhERG(NM_000238.2)を、pcDNA3.1(+)にサブクローニングし、ネイティブHEK細胞及び定常発現したHEK_Kir_mutated Nav細胞に遺伝子導入してhERG-HEK細胞及びhERG_HEK_Kir_mutated Nav細胞を作製し、２４～７２時間後に電気生理実験を行なった。電気生理実験は、ネイティブHEK細胞、hERG-HEK細胞、hERG_HEK_Kir_mutated Nav細胞について、実施例２に準じて電気生理実験を行い、hERGチャネル電流及び活動電位について測定した。hERGＫイオンチャネルは、内向き整流性を示し、スクリーニング用細胞に発現させた場合には、電気刺激等により発生する活動電位を短縮して細胞死を抑制するように働く。
　　ネイティブHEK細胞にhERGチャネルを一過性発現させたhERG-HEK細胞にhERGチャネル阻害薬であるニフェカラント投与して投与前後における細胞膜における電位を測定した。電流原図を図７に示し、電流電圧曲線を図８に示す。図７及び図８に示すように、ニフェカラントが投与された場合には、hERGチャネル電流が阻害されたことがわかった。
　　また、HEK_Kir_mutated Nav細胞にhERGチャネルを一過性発現させたhERG_HEK_Kir_mutated Nav細胞にニフェカラントを投与して投与前後における細胞膜の電位を測定した。電流原図を図９に示し、脱分極通電刺激により発生した活動電位原図を図１０に示し、図１１に、脱分極通電刺激による活動電位時間を示す。
　　図９～図１１に示すように、細胞死制御機構を備えてhERGを発現させたhERG_HEK_Kir_mutated Nav細胞においては、ニフェカラントが投与されない場合には、hERGによってより活動電位の持続時間が短縮され、ニフェカラントが投与された場合には、hERGチャネルが阻害されて、活動電位の持続時間が有意に延長したことが判明した。以上の結果から、HEK_Kir_mutated Nav細胞にhERGチャネルを発現させると電気刺激による細胞死が抑制され、ニフェカラント投与により細胞死が誘発される可能性が考えられた。
　本実施例では、hERG_HEK_Kir_mutated Nav細胞における電気刺激とニフェカラントとによる細胞死の誘発化を検討した。細胞死の測定については実施例２に準じて行った。なお、電気刺激は、１５０ｍＡで、２００ｍｓで、３回（３分間隔）の矩形波電気刺激とした。ニフェカラント投与による細胞死の誘発結果を図１２に示し、細胞死を誘発するためのニフェカラントの用量作用曲線を図１３に示す。
　図１２に示すように、hERG_HEK_Kir_mutated Nav細胞に対して矩形波電気刺激を与えても、細胞死は誘発されなかったが、ニフェカラント投与により脱分極刺激による細胞死が誘発されたことがわかった。また、図１３に示すように、ニフェカラントの濃度依存的に細胞死が誘発されたことが判明した。以上のことから、hERG_HEK_Kir_mutated Nav細胞は、標的イオンチャネルとしてhERGなどを用いた場合の本スクリーニング用細胞を、細胞死などを指標としたイオンチャンネルを標的とするスクリーニング材料として好適であることがわかった。
　本実施例では、細胞外高濃度Ｋイオンを脱分極刺激として用いて、膜電位感受性色素DiBAC4(3)を用いた膜電位の測定について検討した。DiBAC4(3) は膜電位が脱分極すると蛍光強度が増加し、膜電位と蛍光強度変化が相関する性質を持っている。
　２種の細胞(HEK_Kir, HEK_Kir_mutated Nav)に100nMのDiBAC4(3)(ビス(1,3-ジブチルバルビツール酸)トリメチンオキソノール)を、当該色素を添加した正常HEPES緩衝液で30分間、室温で負荷後、488nmで励起し505nmのダイクロイックミラーで反射し520nm以上の蛍光を測定した。また刺激として、細胞外液のKイオンを上げたHigh K+を用い、細胞膜を脱分極させている。これは静止膜電位の形成には主にKイオンが関係しているためである。Na-Kポンプにより細胞内のKイオンは細胞外に比べて高く維持されているがリークチャネルによりKイオンを細胞外に排出する。このNa-KポンプによるKイオンの流入とリークチャネルによるKイオンの排出が釣り合う電位が静止膜電位となる。そこで細胞外のKイオン濃度を上げると細胞内外のKイオンの差が小さくなるため静止膜電位が浅くなる。本実施例ではこの脱分極刺激を用い、2種の細胞の蛍光強度変化を測定した。なお、細胞外のKイオン濃度を140mM K+にした場合の蛍光強度を１と規格として測定した。蛍光測定に用いた装置は高速冷却CCDカメラ蛍光イメージングシステム ARGUS / HiSCA(浜松ホトニクス)を使用した。結果を、図１４～図１７に示す。
　図１４及び図１５は、それぞれHEK_Kir細胞及びHEK_Kir_mutated Nav細胞でのhigh K+刺激による蛍光変化（横軸：時間（細胞外Ｋイオン濃度）、縦軸：蛍光強度）を示す図である。図１４及び図１５に示すように、細胞外Ｋイオン濃度が上昇するとともに、細胞から得られる蛍光強度が高まることがわかった。すなわち、細胞外Ｋイオン濃度が膜電位の脱分極を促進していることがわかった。
　図１６は、HEK_Kir細胞及びHEK_Kir_mutated Nav細胞のそれぞれの同一濃度の細胞外のＫイオン（15.3ｍＭ）刺激を与えたときの蛍光強度を示す図である。図１６に示すように、HEK_Kir_mutated Nav細胞においては、HEK_Kir細胞と比較して、同じＫイオン濃度刺激に対してより高い蛍光強度を呈し、より鋭敏なあるいはより脱分極が促進されていることがわかった。
　図１７は、HEK_Kir_mutated Nav細胞において、細胞外Ｋイオン濃度を5.9mMから15.3mMで変化させた場合におけるリドカイン投与による蛍光強度への影響を示す図である。リドカインはＮａイオンチャネルの阻害剤であり、図１７において、１ｍＭのリドカインの投与時間は下線で示す期間となる。図１７に示すように、リドカインにより細胞外Ｋイオン濃度刺激による蛍光変化を阻害することがわかった。なお、リドカイン存在下では、HEK_Kir_mutated Nav細胞とHEK_Kir細胞とは同じ蛍光変化を示すことを確認している。以上のことから、HEK_Kir_mutated Nav細胞における細胞外Ｋイオン濃度刺激による有意な蛍光変化に、Ｎａイオンチャネルが寄与していることがわかった。そして、膜電位感受性色素であるDiBAC4(3)を用いた蛍光測定においても本スクリーニング用細胞を利用できることがわかった。
配列番号２,３：プライマー

Claims (15)

  1. 　不活性化が抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネルをコードする１又は２以上の第１のＤＮＡを保持し、
    　静止膜電位が負の方向に深くなるようにＫイオンチャネルが活性化された細胞を含む、標的イオンチャネルに作用する化合物のスクリーニング用材料。
  2. 　前記１又は２以上の第１のＤＮＡは、Nav1.5チャネルの変異体をコードするＤＮＡを含む、請求項１に記載のスクリーニング用材料。
  3. 　前記Ｋイオンチャネルは、Kir2.1を含む、請求項１又は２に記載のスクリーニング材料。
  4. 　さらに、前記細胞は、前記Ｋイオンチャネルをコードする外来性の１又は２以上の第２のＤＮＡを保持する、請求項１～３のいずれかに記載のスクリーニング用材料。
  5. 　前記標的イオンチャネルは、hERGイオンチャネルを含む、請求項１～４のいずれかに記載のスクリーニング用材料。
  6. 　前記細胞は、前記標的イオンチャネルをコードする１又は２以上の第３のＤＮＡを保持する、請求項１～５のいずれかに記載のスクリーニング用材料。
  7. 　標的イオンチャネルに対する作用剤又は阻害剤をスクリーニングする方法であって、
    　請求項１～６のいずれかに記載のスクリーニング用材料であって、前記標的チャネルに対する被験化合物の作用を前記細胞の生死又は前記細胞死に相当する持続的な活動電位を指標として検出する工程、
    を備える、スクリーニング方法。
  8. 　前記標的イオンチャネルは、活性化により前記細胞で細胞膜の脱分極を惹起するイオンチャネルであり、
    　前記検出工程は、前記被験化合物の存在下でスクリーニング材料の前記標的チャネルに対する被験化合物の作用を検出する工程である、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記標的イオンチャネルは、活性化により前記細胞で細胞膜の脱分極を惹起するイオンチャネルであり、
    　前記検出工程は、前記被験化合物及び前記標的イオンチャネルに対する前記刺激の存在下で、前記被験化合物の作用を検出する工程である、請求項７に記載のスクリーニング方法。
  10. 　前記標的イオンチャネルは、前記細胞で細胞膜の脱分極及び／又は活動電位を抑制するイオンチャネルであり、
    　前記検出工程は、前記被験化合物及び前記細胞で細胞膜の脱分極を惹起する刺激の存在下で、前記被験化合物の作用を検出する工程である、請求項７に記載の方法。
  11. 　前記標的イオンチャネルは、活性化により前記細胞で細胞膜の脱分極を抑制するイオンチャネルであり、
    　前記検出工程は、前記被験化合物及び前記細胞で細胞膜の脱分極を惹起する刺激の存在下で、前記被験化合物の作用を検出する工程である、請求項７に記載の方法。
  12. 　イオンチャネルに作用する化合物のスクリーニングのための装置であって、
    　細胞を収容する１又は２以上の領域を備える細胞収容ユニットと、
    　前記１又は２以上の領域内の前記細胞の細胞死又は前記細胞死に相当する持続的な活動電位の測定ユニットと、
    を備える、装置。
  13. 　前記測定ユニットは、前記１又は２以上の領域内の前記細胞の細胞死又は前記細胞死に相当する持続的な活動電位を検出するための１又は２以上の薬剤の供給部と、前記１又は２以上の領域内の前記細胞の細胞死又は前記細胞死に相当する持続的な活動電位を光学的に検出するための光学検出部と、を備える、請求項１２に記載の装置。
  14. 　さらに、前記１又は２以上の領域に電圧を印加する電圧印加ユニットを備える、１２又は１３に記載の装置。
  15. 　請求項１～６のいずれかに記載のスクリーニング用材料を含む、イオンチャネルに作用する化合物のスクリーニング用キット。
PCT/JP2011/064967 2010-06-29 2011-06-29 イオンチャネルに作用する化合物のスクリーニング用材料及びその利用 WO2012002460A1 (ja)

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