JP5188498B2 - インスリン分泌のtrpm4モジュレーターをスクリーニングする方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2006年5月25日に出願したU.S.S.N. 60/808,767に対して、合衆国法典第35巻§119(e)のもとでの利益を主張し、それは、その全体を引用により本明細書の一部とする。
本発明は、本明細書で“TRPM4”と呼ぶ、カルシウム活性化非選択的(“CAN”)膜貫通チャネルポリペプチドの新規ファミリーのインスリンに影響を与えるTRPM4モジュレーターをスクリーニングする方法に関する。
Transient Receptor Potential (TRP)タンパク質は、イオンチャネルのファミリーであり、3個の主なサブファミリーに分類される: TRPC “Canonical”、TRPV “Vanilloid”、およびTRPM “Melastatin”(Clapham DE. Nature, 426, 517-24 (2003) Harteneck C et al. Trends Neurosci, 23, 159-66.(2000), Montell C, et al. Mol Cell, 9, 229-31(2002)を参照のこと)。TRPMサブファミリーは、8個のメンバーからなり、それらの生理学的な機能に関する情報は、現れ始めたばかりである。TRPM4は、Ca2+に対する感知され得る透過なしに、主に、Na+およびK+を伝導する広く発現したカルシウム活性化非選択的カチオン(CAN)チャネルである。それは、〜25 pSの単一チャネル伝導性を有し、[Ca2+]iにより直接活性化される。下記の2つのスプライシングバリアントが記載されている; N末端で174アミノ酸残基を欠いた短型(Xu XZ, et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 98, 10692-7 (2001))および長(完全長)型(Launay P, et al. Cell, 109, 397-407 (2002))。Tリンパ球のような非興奮性細胞では、TRPM4仲介脱分極は、Ca2+放出活性化Ca2+チャネル(CRAC)を介したCa2+エントリーのための駆動力を減らし、Ca2+振動およびサイトカイン産生にかなりの影響を与える(Launay P, et al. Science, 306, 1374-7 (2004))。TRPM4は、筋原性収縮および心臓機能に関与し(Earley S, et al. Circ Res, 95, 922-9 (2004); Guinamard R, et al. J Physiol, 558, 75-83 (2004))、それがまた、電気的興奮細胞でCa2+エントリー機構をかなり制御し得ることを示す。
1つの局面では、インスリン分泌細胞を候補薬剤と接触させ、TRPM4チャネル活性の調節を検出する工程を含む、インスリン分泌のモジュレーターをスクリーニングする方法を提供する。好ましい局面では、TRPM4チャネル活性の調節は、候補薬剤がインスリン分泌のモジュレーターであることの指標である。
TRPM4は、β細胞で豊富に発現しているだけでなく、グルコース誘導インスリン分泌をかなり制御しており、TRPM4のドミナントネガティブ構築体によるTRPM4の抑制は、インスリン分泌の正常なパルス様式を抑制する(Cheng et al., Cell Calcium 41(1):51-61 (2007))。Ca2+依存性エキソサイトーシスによるTRPM4包含小胞のトランスロケーションは、また、β細胞が、細胞膜でTRPM4チャネルプールを制御するメカニズムを示す。
表1
本明細書で使用する“候補薬剤”なる用語は、TRPM4に結合し、TRPM4イオンチャネルの活性を調節し、細胞内のTRPM4の発現を変え、および/または細胞でのインスリン分泌を調節することが可能な多くの分子を記載する。上記したとおり、TRPM4イオンチャネルの活性は、その一価カチオン透過性、そのトランスロケーション、およびその電気伝導度の動態を含む。
上記したとおり、TRPM4活性は、非限定的に、カチオン透過性、伝導性の動態、開閉、およびチャネルタンパク質自身のトランスロケーションを含む。好ましい態様では、本発明は、TRPM4チャネル活性を測定し、検出する方法を利用するアッセイを提供する。
上記に記載したとおり、TRPM4は、インスリン分泌細胞の膜電位を制御するのに重要な役割を果たす。結果として、TRPM4活性および発現を調節する候補薬剤を同定するアッセイは、また、インスリン分泌を調節する候補薬剤を同定する。インスリン分泌の調節はまた、当業者に既知の方法を用いて、直接検出し、測定し得る。
実施例で言及した市販で購入可能な試薬は、他に記載がなければ、製造者の指示にしたがって使用した。
RT-PCRおよび免疫沈降: 全RNAを、製造者のプロトコール(ISO-TEX Diagnostics, Friendswood, Texas)にしたがい、RNAzolを用いて抽出した。DNAse I処理したRNAを、RETROscript Kit (Ambion, Austin, Texas)を用いた逆転写のために使用した。PCRを、Advantage Polymerase PCR Kit (Clonetch, Palo Alto, California)を用いて、標準的な方法により行った。免疫沈降のために、細胞を、1% Triton X-100 (Bio-Rad, Hercules, California)およびプロテアーゼ阻害剤を含むTrisバッファーpH 7.5で、4℃で30分間、溶解させた。免疫沈降が、6% SDS-PAGEで分離し、ヒトTRPM4のC末端領域に対するウサギポリクローナル抗血清でブロットし、Enhanced Chemiluminescence (Amersham Pharmacia Biotech)により視覚化した。
インスリン分泌の測定: TRPM4 cDNAの切断型を、N末端V5エピトープタグと共に、pCDNA4/TOベクターの修飾版にクローン化した。V5−ΔN-TRPM4発現構築体の正しい配列を、DNAシークエンシングにより確認した。細胞をプレートした24時間後、構築体を、Lipofectamine 2000(商標)およびPlus Reagent(商標)(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてINS-1細胞にトランスフェトし、実験は、トランスフェクション後、48-72 hrsで行った。コントロール細胞は、ΔN-TRPM4 DNAなしの試薬でトランスフェクトした。p47-p55のI NS-1細胞を、これらの実験で使用した。
電気生理学: ガラスカバースリップ上で増殖させたHEK293細胞を、記録チャンバーに移し、下記の組成の標準修飾リンガー溶液(mM)で維持した: NaCl 140、KCl 2.8、CaCl2 1、MgCl2 2、グルコース10、Hepes・NaOH 10、pH 7.2(浸透圧は、約300 mOsmに調節する)。INS-1細胞での実験のために、外部溶液を、さらに、300 nM TTX、100 μM 4,4'-ジイソチオシアノ-2,2'-スチルベンジスルホン酸(DIDS)および10 mM テトラエチルアンモニウム(TEA)で補充した。HEK293細胞の細胞内ピペット充填(pipette-filling)用溶液は、K-グルタミン酸140、NaCl 8、MgCl2 1、K-BAPTA 10、HEPES・KOHを含んだ(mM)(KOHでpH 7.2に調節した)。INS-1細胞のための内部溶液は、Cs-グルタミン酸140、NaCl 8、MgCl2 1、Cs-BAPTA 10、HEPES・CsOHを含んだ(mM)(CsOHでpH 7.2に調節した)。[Ca2+]iを高められたレベルまで緩衝化した実験では、CaCl2を、所望により、加えた(WebMaxChttp://www.stanford.edu/~cpatton/webmaxcS.htmで計算した)。溶液変換は、カルシウム画像化実験のために、バスパーフュージョン(bath perfusion)により行った。
第2相がエキソサイトーシスによるものであるか否かを試験するために、細胞内小胞に膜マーカースチリル色素FM1-43を載せ、膜トラフィッキングのための蛍光プローブとして使用した(Cochilla AJ. et al. (1999) Annu Rev Neurosci, 22, 1-10; Smith CB. et al. (1996) Nature, 380, 531-4.)。細胞に、培養培地中、10 μM FM1-43を、24時間入れ、実験前に洗浄し、標準バッファー溶液で15分間、平衡化した。FM1-43の蛍光は、480 nmで励起し、535 nmで収集した。Ca2+測定実験からのデータ獲得は、二重励起蛍光分析イメージングシステム(TILL-Photonics, Graefelfingen, Germany)で取得し、TILLvisIONソフトウェアにより制御した。Fura-2 AM搭載細胞(5 μM/30分/37℃)を、340および380 nmの波長で励起させた。いくつかの細胞の蛍光放射を、1 Hzでサンプリングし、異なる波長の蛍光強度の相対比率ユニットに計算した。データ解析、統計学的解析およびイメージデータの図示を、Igor Pro 5ソフトウェアプログラム(Wavemetrics)を用いて行った。
TRPM4トランスロケーションを視覚化するために、TRPM4のFlagタグ化型を有するHEK-293細胞を、1 μMイオノマイシンで刺激する前に、cytotracker緑色染料を載せた。
TRPM4が、グルコースおよびAVP刺激に対する応答でインスリン分泌をかなり減らしたという事実により、アゴニスト刺激を用いた電流動員(current recruitment)の第2相を調べた。図9Aは、TRPM4を過剰発現するTrexHEK293からのカルシウム測定を示す。細胞を、カルシウム測定実験で使用したプロトコールにしたがって、カルバコールで2回処理した(n = 5)。最初、TRPM4含有小胞のエキソサイトーシスを誘導し、第2に、細胞膜に存在するTRPM4の新規プールを活性化した。Ca2+イメージング技術を用いて、fura-2-AM搭載細胞を、200 s の間、1 mM カルバコールで刺激し、その後、洗浄し、第2の刺激を行った(図9A)。第1カルバコール適用は、[Ca2+]iの鋭いピークを誘導し、その後、エキソサイトーシスのために必要とされるCa2+流入による持続した第2相があり、TRPM4電流は、増幅が1 nA未満であった。洗浄期間後、第2カルバコール適用は、より小さいCa2+シグナルを生じたが、現在、TRPM4により生じる電流は、増幅が、約10 nAであった。図9Bは、非バッファーCa2+条件下、−80 mVで、TRPM4により生じる平均内部電流(平均 ± s.e.m.)である。カルバコールに対するCa2+応答は、第2適用の間、より小さいが、細胞膜で、増加したTRPM4により生じた電流は、ずっと大きい。コントロール細胞を、70 s (n = 3)または750 s (n = 3)で、カルバコールを用いて処理した。単一カルバコール刺激を受けたコントロール細胞は、第2相を開発できなかった(図9B)。
スルホニル尿素グリベンクラミドを、本明細書に記載した方法を用いて、TRPM4チャネルの活性に関して試験した。グリベンクラミドを、DMSO中、100mMストック溶液から外部生理食塩水に加え、圧力を、INS(図10)およびHEK293(図11)細胞に適用した。グリベンクラミドは、インスリン分泌ラットベータ細胞株INS-1でATP依存性Kチャネルを妨害し(図10A)、TRPM4チャネルを活性化する(図10B)。INS細胞は、膵臓β細胞のモデルである。同様の結果は、HEK293細胞で発現させたTRPM4チャネルで見られた(図11)。
Claims (12)
- インスリン分泌のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、
a) インスリン分泌細胞を候補薬剤と接触させ;そして、
b) 該インスリン分泌細胞におけるTRPM4チャネル活性の調節を検出し、該TRPM4チャネル活性の調節を、該候補薬剤がインスリン分泌のモジュレーターであることの指標とすること
を含む、方法。 - 該調節が、該TRPM4チャネルのカチオン透過性の変化を含む、請求項1に記載の方法。
- 該調節が、該TRPM4チャネルを介した電流の動態の変化を含む、請求項1に記載の方法。
- 該調節が、該TRPM4チャネルの発現の変化を含む、請求項1に記載の方法。
- 該方法が、さらに、該候補薬剤による該細胞のインスリン分泌の調節を検出することを含む、請求項1に記載の方法。
- インスリン分泌のモジュレーターをスクリーニングする方法であって:
a) TRPM4チャネルを発現する第1細胞を提供し;
b) 該第1細胞において、該TRPM4チャネルを調節する候補薬剤を同定し;
c) 該TRPM4チャネルを調節する候補薬剤を、インスリンを分泌する第2細胞と接触させ;そして、
d) 該候補薬剤の存在および非存在下で、該第2細胞のインスリン分泌を測定すること
を含む、方法。 - 該第1細胞が組換え細胞である、請求項6に記載の方法。
- インスリン分泌のモジュレーターをスクリーニングする方法であって:
a) TRPM4チャネルに結合可能な候補薬剤を同定し;
b) 該TRPM4チャネルに結合可能な候補薬剤をインスリン分泌細胞と接触させ;
c) 該候補薬剤の存在および非存在下で、該インスリン分泌細胞によるインスリン分泌を測定すること
を含む、方法。 - インスリン分泌のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、
a) インスリン分泌細胞を候補薬剤と接触させ;
b) 該インスリン分泌細胞において、TRPM4チャネル活性の調節を検出し;そして、
c) 該インスリン分泌細胞において、インスリン分泌の調節を検出すること
を含む、方法。 - 該候補薬剤が、スルホニルウレア、ビグアニド、アルファ-グルコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン、メグリチナイド、アミノ酸D-フェニルアラニン誘導体、アミリン模倣剤(amylinomimetic)、インクレチン模倣剤、DPP-4阻害剤、インスリン類似体、およびその組合せからなる群から選択されるメンバーを含む、請求項1、6、8または9に記載の方法。
- TRPM4チャネル活性の該調節が、該TRPM4チャネルの一価カチオン透過性の調節、該TRPM4チャネルのトランスロケーションの調節、該TRPM4チャネルの発現の調節、およびそれらの組合せからなる群から選択されるメンバーを含む、請求項9に記載の方法。
- インスリン分泌のモジュレーターを同定する方法であって:
a) 第1プールの候補薬剤を提供し;
b) TRPM4チャネルを発現する第1細胞を提供し;
c) 該第1細胞を該第1プールの候補薬剤の1個またはそれ以上のメンバーと接触させ;
d) 該第1細胞において、TRPM4チャネル活性を調節する該第1プールの候補薬剤のメンバーを同定し(ここで、TRPM4チャネル活性を調節する該第1プールの候補薬剤のメンバーは、第2プールの候補薬剤を形成する);
e) インスリン分泌細胞である第2細胞を提供し;
f) 該第2細胞を該第2プールの候補薬剤の1個またはそれ以上のメンバーと接触させ;そして、
g) 該第2細胞のインスリン分泌を調節する該第2プールの候補薬剤のメンバーを同定すること
を含む、方法。
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