WO2012001191A1 - Método de diagnóstico de la enfermedad de farber - Google Patents

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Gemma Fabrias Domingo
José Luis ABAD SAIZ
Josefina Casas Brugulat
Antonio Delgado Cirilo
Thierry Levade
Carmen Bedia
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universitat de Barcelona UB
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Universitat de Barcelona UB
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/06—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2
    • C07D311/08—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring
    • C07D311/16—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring substituted in position 7

Definitions

  • the present invention relates to a family of compounds with a structural nucleus of amino alcohol derivatives and their use for the detection of Farber's disease by applying a diagnostic method outside the human body in which said compounds bound to a fluorophore are used, chromophore or luminoforo as substrates of the enzyme ceramidase acid, whose functionality is diminished in patients with said disease. Therefore the present invention is encompassed within the chemistry and more specifically of the chemistry applied to the diagnosis of diseases and the determination of enzymatic activities.
  • Farber's disease also called lipogranulomatosis
  • This disease has a triad of common symptoms: inflammation of the joints, subcutaneous nodules and hoarseness. Sometimes hepatosplenomegaly and malfunction of the nervous system may occur. It is a very serious disease in which patients usually die before two years of age (Levade T, Sandhoff K, Schulze H, Medin JA. Acid ceramidase deficiency: Farber lipogranulomatosis (2009) in D. Valle et al. (eds): Scriver's OMMBID (Online Metabolic and Molecular Bases of Inherited), New York, McGraw-Hill).
  • Loading tests or load tests consist of the direct addition of radioactively labeled sphingolipids to the cell culture medium, for the subsequent analysis of their metabolism.
  • the molecules used in these tests have been ceramide, cerebroside sulfate and sphingomyelin. The latter has proven to be the most suitable for this purpose since the other molecules are partially or almost completely metabolized by non-lysosomal enzymes, while sphingomyelin is primarily directed at the lysosome. Thus, in this compartment, sphingomyelin is degraded to ceramide and through the study of lipid profiles a potential accumulation of this lipid can be observed in cells of Farber patients.
  • ceramide derivatization present in body fluids or tissues, to give rise to molecules that can be detected, separated and quantified by liquid chromatography (HPLC) or gas (GCL) coupled to mass detector (MS) .
  • HPLC liquid chromatography
  • GCL gas
  • MS mass detector
  • DAGk diacylglycerol kinase
  • the ceramide present in the lipid extract is reacted with the DAGk in the presence of [ 32 ⁇ ] - ⁇ - ⁇ , to give rise to ceramide-1-phosphate.
  • the organic phase of this reaction is migrated by TLC and the plate is exposed to a photographic film or directly displayed on a scanner that detects [ 32 P].
  • the ceramide-1-phosphate produced reflects the amount of ceramide accumulated in the lysosomes of the cells.
  • the advantage of this method is that both radioactive ATP and enzyme are commercially available, but the assay is long and laborious.
  • the present invention describes a series of compounds and a method for determining whether an individual suffers from Farber's disease that is based on the enzymatic hydrolysis of these compounds that are a substrate for the acidic ceramidase enzyme, an enzyme involved in the dysfunctions that cause the symptoms of said disease
  • the present invention relates to a compound of formula (I)
  • Ri is selected from C r C 24 alkyl, alkenyl , C 2 -C 24 alkynyl, C 2 -C 24 group or -R 2 -Y 3 wherein Y is selected from S, O, N, NH, S (O), S (0 2 ), C (O), NHC (O), C (0) NH, C (0) 0, OC (O),
  • R 2 is selected from CrC to alkyl, alkenyl C 2 -C a alkynyl , C 2 -C a,
  • R 3 is selected from alkyl CICB, alkenyl C 2 -Cb, alkynyl C 2 -Cb, where a + b ⁇ 24, m is a value between 1 and 10,
  • X is a fluorophore, chromophore or luminophore
  • R 1 is different from - (CH 2 ) 14 CH 3 .
  • alkyl refers, in the present invention, to hydrocarbon, linear or branched chain radicals, having 1 to 24 carbon atoms, preferably 10 to 12, and which are attached to the rest of the molecule by a single bond, for example, methyl, ethyl, n-propyl, Apropyl, n-butyl, tere-butyl, sec-butyl, n-pentyl, n-hexyl, decyl, dodecyl etc.
  • the alkyl groups may be optionally substituted by one or more substituents such as halogen, hydroxyl, azido, alkoxy, carboxyl, carbonyl, cyano, acyl, alkoxycarbonyl, amino, nitro, mercapto and alkylthio.
  • substituents such as halogen, hydroxyl, azido, alkoxy, carboxyl, carbonyl, cyano, acyl, alkoxycarbonyl, amino, nitro, mercapto and alkylthio.
  • alkenyl refers to radicals of hydrocarbon chains, linear or branched, containing one or more double carbon-carbon bonds, for example, vinyl, 1-propyl, allyl, isoprenyl, 2-butenyl, 1, 3-butadienyl etc.
  • Alkenyl radicals may be optionally substituted by one or more substituents such as halogen, hydroxy, azido, alkoxy, carboxyl, cyano, carbonyl, acyl, alkoxycarbonyl, amino, nitro, mercapto and alkylthio.
  • alkynyl refers to hydrocarbon chain radicals, linear or branched, which has one or more triple carbon-carbon bonds and is linked to the rest of the molecule by a single bond eg, ethynyl, 1-propyl, etc. .
  • the alkynyl group may be optionally substituted by one or more substituents such as halogen, hydroxyl, azido, alkoxy, carboxyl, cyano, carbonyl, acyl, alkoxycarbonyl, amino, nitro, mercapto and alkylthio.
  • Fluorophore refers to a small chemical group that is part of a larger molecule, which can be excited by light to emit fluorescence.
  • fluorophores produce fluorescence efficiently by excitation with light. of wavelength from about 200 nanometers to about 800 nanometers. The intensity and wavelength of the emitted radiation depend on the fluorophore and its chemical environment.
  • Tluorophore can be selected, without limitation, from acridine, anthracene, allophycocyanin, BODIPY, harmful, coumarin, fluorescamine, tluorescein, FAM (carboxyfluorescein), HEX (hexachlorofluorescein), JOE (6-carboxy-4 ', 5'-dichloro -2 ', 7'-dimethoxy-fluorescein), Oregon Green, phycocyanin, phycoerythyrine, rhodamine, ROX (carboxy-X-rhodamine), TAMRA (carboxytetramethylrodamine), TET (tetrachloro-fluorescein), Texas red, tetramethylrodamine and xanthines.
  • FAM carboxyfluorescein
  • HEX hexachlorofluorescein
  • JOE 6-carboxy-4 ', 5'-dichloro -2 ', 7
  • Luminophore refers to an atom or chemical group that emits light that is not derived from the rise in temperature, and may be caused by chemical, biochemical or crystallographic changes.
  • the luminophore can be selected, without limitation, from among rhodo !, rhodamine, resorufin or derivatives thereof.
  • Chrophore refers to a chemical group that absorbs excitation energy and emits it in a range of wavelengths that produces color.
  • the chromophore can be selected, without being limited to, anthocyanins, carotenes, lycopenes, azo dyes, foichromes etc.
  • m is a value between 2 and 4. More preferably m is 2.
  • Ri is an alkyl - (CH 2 ) n CH 3 , where n is a value between 1 and 24. More preferably n is 10.
  • X is umbelliferone.
  • Umbeliferone or 7-hydroxycoumarin is an organic compound derived from coumarin by replacing its hydrogen atom in position 7 with a hydroxyl group, which has the following structure:
  • Another aspect of the present invention relates to a diagnostic method to determine if an individual suffers from Farber's disease comprising: a) obtaining an isolated biological sample from the individual,
  • Ri is selected from C 1 -C 24 alkyl , C 2 -C 24 alkynyl, C 2 -C 4 February or -R2-Y-R3 group, where Y is selected from S, O, N, NH, S ( O), S (0 2 ), C (O), NHC (O), C (0) NH, C (0) 0, OC (O), R 2 , is selected from CC a alkyl, C 2 alkenyl - C, alkynyl , C 2 -C a, Re is selected from alkyl C Cb, alkenyl C 2 -Cb, alkynyl C 2 - Cb, where a + b ⁇ 24,
  • m is a value between 1 and 10
  • X is a fluorogenic, chromogenic or luminogenic group to the sample obtained in
  • R- is an alkyl - ⁇ CH 2 ) n CH 3 , where n is a value between 1 and 24. In a more preferred embodiment, n is 10.
  • n is a value between 2 and 4. In a more preferred embodiment, m is 2.
  • X is umbelliferone.
  • step (c) of incubation can be stopped by adding methanol followed by an oxidation that can be performed by adding mixtures.
  • known oxidants such as, but not limited to, Nal0 4 dissolved in glycine / NaOH buffer solution of pH 10.6.
  • the sample obtained in step (a) is a body fluid and more preferably, the fluid is blood.
  • Leukocytes and lymphocytes can be extracted from the blood by known techniques and make the modifications required to use these extracts to perform the described method.
  • the sample obtained in step (a) is epithelial tissue.
  • Obtaining the tissue sample and the cells is performed by standard methods known to any person skilled in the art.
  • the incubation time in step (c) is between 0.5 and 5 hours.
  • the present invention relates to a method of obtaining useful data for the diagnosis of Farber's disease which comprises comparing the data obtained by the method as described above with a control sample.
  • the method of detection of Farber's disease described in the present invention is based on an enzymatic hydrolysis reaction on a compound of formula (I) as described above.
  • These compounds are substrates of the enzyme ceramidase acid, which is mutated in individuals suffering from this disease, so that its functionality in cells is minimal or zero.
  • a biological sample of the individual blood, tissue, etc.
  • This cell extract is contacted with the substrate of formula (I) and the mixture is incubated for a variable time of between 1 to 5 hours.
  • ceramidase enzyme is functional
  • hydrolysis of the N-acyl chain present in the compound of formula (I) will occur.
  • This structural change causes, after an oxidation reaction, the fluorophore emits fluorescence, which can be measured by known methods, such as a suitable spectrophotometer. If the ceramidase is mutated and is not functional, the sample will not show fluorescence or it will be minimal. Based on this relationship between ceramidase activity and the fluorescence data obtained, a person skilled in the art can proceed to determine if the problem individual suffers from Farber's disease.
  • the ceramidase activity in at least one control sample which can be a cell extract of the same type of cells from a normal individual for the same experiment and on the same day.
  • the probability that an individual suffers from Farber's disease increases when the ceramidase activity in the test sample is approximately 25% less than the ceramidase activity determined in the control sample.
  • the substrate used is not radioactive, therefore, no specific facilities or equipment or special authorizations are required.
  • the substrate used is soluble in aqueous solutions at the necessary concentrations, which does not require the use of detergents for solubilization.
  • the substrate used is stable under adequate storage conditions.
  • the substrate used is specific for acid ceramidase and, therefore, for the diagnosis of Farber's disease by not interfering with other amido hydrolases.
  • ⁇ Detection is based on the measurement of fluorescence, color or luminescence through common and affordable instruments in laboratories.
  • the assay is very sensitive, with a detection limit of 50 pmoles of product formed, and requires very little protein (10-20 ⁇ g) ⁇
  • the assay can be miniaturized and used for mass screening of samples and for performing multiple measurements simultaneously.
  • the assay can be applied to various types of biological samples, such as blood lymphocytes and skin fibroblasts
  • the test is rapid, requiring less than 4 hours from sample preparation to results.
  • the present invention relates to the use of a compound of formula (I):
  • Ri is selected from C1-C24 alkyl, C-2-C24 alkenyl, C-2-C24 alkynyl or a group -R2-Y- R3, where Y is selected from S, O, N, NH, S (O), S (O 2 ), C (O), NHC (O), C (O) NH, C (O) O, OC (O), R 2 , is selected from CrC a alkyl, C 2 -C alkenyl to , C 2 -C alkynyl a , R 3 is selected from CC alkyl, C-2-Cb alkenyl, C-2-Cb alkynyl, a + b ⁇ 24,
  • m is a value between 1 and 10
  • X is a fluorogenic, chromogenic or luminogenic group
  • R is an alkyl - (CH2) n CH 3) where n is a value between 1 and 24. More preferably, n is 10.
  • m is 2.
  • X is umbelliferone.
  • the present invention relates to a kit useful for determining if an individual suffers from Farber's disease from an isolated sample of said individual, which comprises the compound of formula (I) and the use of this kit for the diagnosis of Farber's disease in an isolated biological sample of an individual.
  • Other components of the kit can be buffer solutions, preservatives, oxidants and, in general, components that contribute to the proper preservation of the reagents and that the base reaction of the test is carried out in the most efficient way possible.
  • Fig. 1 Shows the enzymatic activity on compounds 2-7, after 3 hours of incubation of the cells in culture (line FD1 AcCerl OX) with 40 ⁇ of substrate. The results are representative of two independent experiments with triplicates. S refers to the substrate described in Bedia et al., Chembiochem. 2007, 8, 642-8.
  • Fig. 2 It shows the enzymatic activity on compounds 2-7, after 3 hours of incubation of the cells in culture (FD1 AcCerl OX line) with different concentrations of each substrate. The results are representative of two independent experiments with triplicates.
  • Flg. 3 It shows the effect of protein concentration on the hydrolysis of substrate 5, after 3 hours of incubation at 37 ° C in the presence of 20 ⁇ of substrate and different amounts of cell homogenate supernatant (FD1 AcCerl OX line).
  • FD1 AcCerl OX line cell homogenate supernatant
  • Fig. 4 It shows the hydrolysis of the substrate 5 as a function of the incubation time, in the presence of 20 ⁇ of substrate and 25 of protein of the cell homogenate (FD1 AcCerl Ox line). The data are representative of two independent experiments.
  • Fig. 5 It shows the hydrolysis of the substrate 5 as a function of the pH of the reaction mixture, in the cell homogenates of three cell lines with different degree of acid ceramidase activity: FD1 AcCerl OX (overexpress acid ceramidase), normal lymphoblasts and FD1 fibroblasts (Farber ). The tests were carried out at 37 e C for 3 hours in the presence of 20 ⁇ of substrate and 10-25 ⁇ g of protein.
  • glycine-HCI buffer solution pH 2.5 to 3
  • acetate buffer solution pH 3.5 to 5.5
  • sodium phosphate buffer solution pH 6 to 8.1
  • glycine-NaOH buffer solution pH 8.9 to 9.8
  • Fig. 6. Shows the kinetic analysis of substrate hydrolysis 5. Different substrate concentrations of 2.5 to 80 ⁇ were incubated in the presence of 10-25 ⁇ g of cell homogenate protein (FD1 AcCerl Ox line), in the breast of a buffer solution of acetate pH 4.5 for 3 hours at 37 e C. The figure shows the representation of Lineweaver-Burk and the resulting kinetic parameters, which are the average of five independent experiments.
  • FD1 AcCerl Ox line cell homogenate protein
  • Fig. 7 Shows the measurement of the acid ceramidase activity in different lines of Farber fibroblasts and control fibroblasts. All measurements have been made with substrate 5 and a fixed amount of protein, under the standard conditions described. The results are the average of 3 independent experiments.
  • Fig. 8. Shows the measurement of lysosomal ⁇ -galactosidase activity in different lines of Farber fibroblasts and control fibroblasts. All measurements have been made with substrate 5 and a fixed amount of protein, under the standard conditions described. The results are the average of 3 independent experiments.
  • Fig. 9. Shows the measurement of the acid ceramidase activity in different lines of Farber lymphoblasts and control lymphoblasts. All measurements have been made with substrate 5 and a fixed amount of protein, under the standard conditions described. The results are the average of 3 independent experiments.
  • Fig. 10 Shows the measurement of lysosomal ⁇ -galactosidase activity in different lines of Farber lymphoblasts and control lymphoblasts. All measurements have been made with a fixed amount of protein, under the standard conditions described. The results are the average of 3 independent experiments.
  • the reaction is monitored by thin layer chromatography eluting with CH 2 Cl 2 / MeOH 9: 1), observing after 1 h the total disappearance of the starting product.
  • the reaction mixture is washed with 2 mL of a saturated aqueous solution of NaHC0 3 , the CH 2 CI 2 is evaporated and the resulting crude is purified by flash column chromatography using a gradient of 0 to 10% MeOH in CH 2 CI 2 to obtain the products in the form of white solids (yields 74-80%).
  • An outline of this procedure is shown below:
  • This activity can be measured in vitro with cell homogenates and on intact living cells.
  • the cells are collected and washed twice with PBS. 100 ⁇ of a 0.2 M aqueous sucrose solution is added to the cell precipitates and sonic. The cell homogenates are centrifuged for 3 minutes at 15000 g and the supernatants are stored. These are used to quantify the proteins in each sample, and after calculations, the acid ceramidase activity assay is performed at equal amounts of protein. The test is carried out in 96-well plates.
  • Each well contains 74 ⁇ of sodium acetate / acetic acid buffer solution, 0.5 ⁇ of the 4 mM acid ceramidase substrate solution in ethanol (final substrate concentration 20 ⁇ ; final ethanol concentration 0.5%) , and a fixed amount of protein (between 10 and 25 g) in a volume of 25 ⁇ of 0.2 M sucrose.
  • the plate is incubated at 37 9 C for 3 hours without stirring. After this time, the reaction is stopped by adding 50 ⁇ of methanol in each well and then 100 ⁇ of a 2.5 mg / ml Nal0 4 solution in a glycine / NaOH buffer solution of pH 10.6.
  • the plate is kept at 37 e C protected from light for two hours and the fluorescence is then measured in a plate fluorimeter (excitation wavelength 340 nm, emission 460 nm).
  • the cell lines used to characterize the substrate are FD1 (Farber cell line with zero acidic ceramidase activity) and FD1 AcCerl OX (Farber line corrected to overexpress the acidic ceramidase).
  • the other Farber cell lines and control lines whether fibroblasts such as lymphoblasts (Epstein-Barr virus-transformed lymphoid cell lines), come from the Laboratoire de Bioch ⁇ mie Métabol ⁇ que, Institu ⁇ Fédératif de Biolog ⁇ e, CHU Purpan, Toulouse, France.
  • the cells are seeded at a density of 200,000 cells / ml (0.1 ml / well).
  • the substrate dissolved in ethanol or in DMSO (0.1 ⁇ , 40 mM) is added to have a final concentration of 40 ⁇ .
  • the plate is kept at 37 S C protected from light for two hours and the fluorescence is then measured in a plate fluorimeter (excitation wavelength 340 nm, emission 460 nm).
  • the white samples are prepared by adding the substrate immediately before the addition of MeOH and NalO4.
  • the plate is kept at 37 ° C protected from light for two hours and the fluorescence is then measured in a plate fluorimeter (excitation wavelength 340 nm, emission 460 nm).
  • the white samples are prepared by adding the substrate immediately before the addition of MeOH and NalO 4 .
  • cells in culture of the FD1 AcCerl OX line are collected and washed twice with PBS. 100 ⁇ of a 0.2 M aqueous sucrose solution is added to the cell precipitates and sonic. The cell homogenates are centrifuged for 3 minutes at 15000 g and the supernatants are stored. These are used to quantify the proteins of each sample, and the acid ceramidase activity assay is performed at different amounts of cell homogenate supernatant. The test is carried out in 96-well plates.
  • Each well contains 74 ⁇ of sodium acetate / acetic acid buffer solution, 0.5 ⁇ of the 4 mM acid ceramidase substrate solution in ethanol (final substrate concentration 20 ⁇ ; final ethanol concentration 0.5%), and different amounts of protein between 2.5 and 180 Mg in a volume of 25 ⁇ of 0.2 M sucrose.
  • the plate is maintained at 37 S C for 3 hours without stirring. After this time, the reaction is stopped by adding 50 ⁇ of methanol and 100 ⁇ of a solution of 2.5 mg / ml of Nal0 4 in glycine / NaOH buffer solution of pH 10.6 in each well.
  • the plate is protected from light for two hours and subsequently read on a plate fluorimeter (excitation wavelength 340 nm, emission 460 nm).
  • the cells in culture are collected and washed twice with PBS. 100 ⁇ of a 0.2 M aqueous sucrose solution are added to the cell precipitates and sonicated. The cell homogenates are centrifuged for 3 minutes at 15000 g and we store the supernatants. These are used to quantify the proteins in each sample, and after calculations, the acid ceramidase activity assay is performed at equal amounts of protein.
  • the incubation mixture of the assay is carried out in 96-well plates.
  • Each well contains 74 ⁇ of sodium acetate / acetic acid buffer solution, 0.5 ⁇ of the 4 mM acid ceramidase substrate solution in ethanol (final substrate concentration 20 ⁇ ; final ethanol concentration 0.5%), and 25 g of protein in a volume of 25 ⁇ sucrose 0.2M plate is incubated at 37 C for different Q timepos without agitation. After this time, the reaction is stopped by adding 50 ⁇ of methanol and 100 ⁇ of a solution of 2.5 mg / ml of Nal0 4 in glycine / NaOH buffer solution of pH 10.6 in each well. The plate is protected from light for two hours and the fluorescence is then measured in a plate fluorimeter (excitation wavelength 340 nm, emission 460 nm). Substrate hydrolysis based on pH.
  • FD1 AcCerl OX overexpress acid ceramidase
  • normal lymphoblasts normal lymphoblasts
  • FD1 fibroblasts FD1 fibroblasts (Farber).
  • Cultured cells are collected and washed twice with PBS. 100 ⁇ of a 0.2 M aqueous sucrose solution is added to the cell precipitates and sonic. The cell homogenates are centrifuged for 3 minutes at 15000 g and we store the supernatants. These are used to quantify the proteins in each sample, and after calculations, the acid ceramidase activity assay is performed at equal amounts of protein.
  • the incubation mixture of the assay is carried out in 96-well plates. Each well contains 74 ⁇ of different buffer solutions without detergents: glycine-HCI buffer solution (pH 2.5 to 3), acetate buffer solution (pH 3.5 to 5.5), sodium phosphate buffer solution (pH 6 at 8.1) and glycine-NaOH buffer solution ⁇ pH 8.9 to 9.8), 0.5 ⁇ of the 4 mM acid ceramidase substrate solution in ethanol (final substrate concentration 20 ⁇ ; final concentration of 0.5% ethanol), and a fixed amount of protein (between 10 and 25 ⁇ g) in a volume of 25 ⁇ of 0.2 M sucrose. The plate is incubated at 37 S C for 3 hours without stirring.
  • reaction is stopped by adding 50 ⁇ of methanol and 100 ⁇ of a solution of 2.5 mg / ml of Nal0 4 in glycine / NaOH buffer solution of pH 10.6 in each well.
  • the plate is protected from light for two hours and the fluorescence is then measured in a plate fluorimeter (excitation wavelength 340 nm, emission 460 nm).
  • the cells in culture (FD1 AcCeM Ox line) are collected and washed twice with PBS. 100 ⁇ of a 0.2 M aqueous sucrose solution is added to the cell precipitates and sonic. The cell homogenates are centrifuged for 3 minutes at 15000 g and the supernatants are stored. These are used to quantify the proteins in each sample, and after calculations, the acid ceramidase activity test is performed at equal amounts of protein. The test is carried out in 96-well plates.
  • Each well contains 74 ⁇ of sodium acetate / acetic acid buffer solution, 0.5 ⁇ of the acid ceramidase substrate solution at different concentrations in ethanol (final substrate concentration of 2.5 to 80 ⁇ ); final concentration of ethanol 0.5%), and a fixed amount of protein (between 10 and 25 ⁇ ) in a volume of 25 ⁇ of 0.2 M sucrose.
  • the plate is incubated at 37 e C for 3 hours without stirring. After this time, the reaction is stopped by adding 50 ⁇ of methanol and 100 ⁇ of a solution of 2.5 mg / ml of Nal0 4 in glycine / NaOH buffer solution of pH 10.6 in each well. The plate is protected from light for two hours and the fluorescence is then measured in a plate fluorimeter (excitation wavelength 340 nm, emission 460 nm).
  • Cultured cells are collected and washed twice with PBS. 100 ⁇ of a 0.2 M aqueous sucrose solution is added to the cell precipitates and sonic. The cell homogenates are centrifuged for 3 minutes at 5000 g and the supernatants are stored. These are used to quantify the proteins in each sample, and after calculations, the acid ceramidase activity assay is performed at equal amounts of protein. The test is carried out in 96-well plates.
  • Each well contains 74 ⁇ of sodium acetate / acetic acid buffer solution, 0.5 ⁇ of the 4 mM acid ceramidase substrate solution in ethanol (final substrate concentration 20 ⁇ ; final ethanol concentration 0.5%), and a fixed amount of protein (between 10 and 25 ⁇ g) in a volume of 25 ⁇ of 0.2 M sucrose.
  • the plate is incubated at 37 S C for 3 hours without stirring. After this time, the reaction is stopped by adding 50 ⁇ of methanol and 100 ⁇ of a solution of 2.5 mg / ml of Nal0 4 in glycine / NaOH buffer solution of pH 10.6 in each well.
  • the plate is protected from light for two hours and the fluorescence is then measured in a plate fluorimeter (excitation wavelength 340 nm, emission 460 nm).
  • the activity, lysosomal ⁇ -galactosidase is measured with the same protein extracts used for the measurement of the acid ceramidase activity.
  • the essay is based on the Fluorogenic method already published in the literature 2 with some modifications in order to adapt it to the 96-well plate format.
  • a fixed amount of protein (between 5 and 10 pg) in a volume of 10 ⁇ , is mixed in a well together with 20 ⁇ of 0.5 M acetic acid / sodium acetate buffer solution pH 4.5, 20 ⁇ of 20 mM EDTA, 40 ⁇ of the 3 mM 4-methylumbelliferil-pD-galactopyranoside substrate (final concentration 400 ⁇ ) and 10 ⁇ of ultrapure water.
  • This mixture is incubated at 37 Q C for 30 minutes and then add 100 ⁇ of glycine buffer / NaOH at pH 10.6. Subsequently the fluorescence is measured in a plate fluorimeter (excitation wavelength 340 nm, emission 460 nm).

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Abstract

La presente invención se refiere a una familia de compuestos con un núcleo estructural de derivados de aminoalcohol y a su uso para la detección de la enfermedad de Farber aplicando un método de diagnóstico fuera del cuerpo humano en el que se emplean dichos compuestos unidos a un fluoroforo, cromóforo o luminoforo como sustratos de la enzima ceramidasa ácida, cuya funcionalidad se encuentra disminuida en pacientes con dicha enfermedad. Además la presente invención se refiere a un kit que comprende al menos uno de estos compuestos para utilizar en el diagnóstico de la enfermedad a partir de una muestra biológica aislada de un individuo.

Description

i
Método de diagnóstico de la enfermedad de Farber
La presente invención se refiere a una familia de compuestos con un núcleo estructural de derivados de aminoalcohol y a su uso para la detección de la enfermedad de Farber aplicando un método de diagnóstico fuera del cuerpo humano en el que se emplean dichos compuestos unidos a un fluoroforo, cromóforo o luminoforo como sustratos de la enzima ceramidasa ácida, cuya funcionalidad se encuentra disminuida en pacientes con dicha enfermedad. Por tanto la presente invención se engloba dentro de la química y más específicamente de la química aplicada al diagnóstico de enfermedades y la determinación de actividades enzímáticas.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La enfermedad de Farber, también llamada lipogranulomatosis, es un desorden hereditario de almacenamiento de lípidos caracterizado por una acumulación de ceramidas en los lisosomas, debido a una carencia de la actividad enzímátíca que la degrada, la ceramidasa ácida. Esta enfermedad presenta una tríada de síntomas comunes: inflamación de las articulaciones, nodulos subcutáneos y ronquera. Algunas veces pueden aparecer hepatoesplenomegalia y malfuncionamiento del sistema nervioso. Se trata de una enfermedad muy grave en la que los pacientes mueren generalmente antes de los dos años de edad (Levade T, Sandhoff K, Schulze H, Medin JA. Acid ceramidase deficíency: Farber lipogranulomatosis (2009) in D. Valle et al. (eds): Scriver's OMMBID (Online Metabolic and Molecular Bases of Inherited Dísease), New York, McGraw-Hill).
Actualmente, el diagnóstico de la enfermedad de Farber se realiza básicamente por tres tipos de métodos: i) Determinación de la actividad ceramidasa ácida. Esto se ha realizado principalmente utilizando A/-oleoíl o A/-lauroíl esfíngosínas marcadas radioactivamente sobre homogeneizados celulares. Estos sustratos se caracterizan por ser muy poco solubles y los ensayos deben realizarse en el seno de mezclas complejas de detergentes. Además, la separación y cuantifícación de productos suponen un proceso largo y tedioso: extracción de lípidos, migración por cromatografía de capa fina (CCF), lectura de las placas en un radiochromatoscanner para la identificación de los productos y posterior separación de la sílice del soporte y cuantifícación por centelleo líquido. Otro inconveniente de estos ensayos es que estas ceramidas pueden ser degradadas por otras ceramídasas no lisosomales, que no son deficientes en la enfermedad de Farber.
Loading tests o tests de carga. Estos consisten en la adición directa de esfingolípidos marcados radioactivamente al medio de cultivo celular, para el posterior análisis de su metabolismo. Las moléculas utilizadas en estos tests han sido la ceramida, el cerebrósído sulfato y la esfíngomíelina. Esta última ha demostrado ser la más adecuada para este fin puesto que las otras moléculas son metabolizadas parcialmente o casi totalmente por enzimas no lisosomales, mientras que la esfingomielina se dirige principalmente al lisosoma. Así pues, en este compartimento la esfingomielina es degradada a ceramida y mediante el estudio de los perfiles lipidíeos se puede observar una potencial acumulación de este lípido en células de enfermos de Farber. El análisis de estos perfiles requiere el mismo proceso de separación y cuantifícación que el método anterior, pero este test presenta la ventaja de necesitar menos cantidad de material biológico. Los inconvenientes de estos test son que estas moléculas radioactivas no están disponibles comercialmente y que las moléculas pueden ser degradadas parcialmente por enzimas no lisosomales.
Cuantifícación de los niveles de ceramida. Estos métodos tienen como objetivo medir la acumulación de ceramida que se produce en los lisosomas de las células de enfermos de Farber. Algunos autores han utilizado la derivatízación de la ceramida, presente en fluidos corporales o tejidos, para dar lugar a moléculas que pueden ser detectadas, separadas y cuantificadas por cromatografía líquida (HPLC) o de gases (GCL) acoplada a detector de masas (MS). Otro método conocido para medir el almacenamiento de ceramida utiliza el enzima diacilglicerol quinasa (DAGk). Este enzima, además de fosforilar el diacilglicerol, tiene una gran afinidad por la ceramida. Aprovechando esto, la ceramida presente en el extracto lipídico se hace reaccionar con la DAGk en presencia de [32Ρ]-γ-ΑΤΡ, para dar lugar a ceramida-1 -fosfato. La fase orgánica de esta reacción se hace migrar por CCF y la placa se expone a una película fotográfica o directamente se visualiza en un escáner que detecta el [32P]. La ceramida-1 -fosfato producida refleja la cantidad de ceramida acumulada en los lisosomas de las células. La ventaja de este método es que tanto el ATP radioactivo como el enzima están disponibles comercialmente, pero el ensayo es largo y laborioso.
Así pues, los métodos existentes para el diagnóstico de la enfermedad de Farber utilizan en su mayoría moléculas radioactivas y tienen en común la complejidad de la extracción y separación de lípidos para su análisis, ya sea por CCF, HPLC o GLC. Todas estas desventajas hacen que el diagnóstico de la enfermedad de Farber esté reservado a un número limitado de laboratorios especializados.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe una serie de compuestos y un método para determinar si un individuo padece la enfermedad de Farber que está basado en la hidrólisis enzimática de estos compuestos que son sustrato de la enzima ceramidasa ácida, enzima implicada en las disfunciones que provocan los síntomas de dicha enfermedad.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I)
Figure imgf000004_0001
donde
Ri se selecciona entre alquilo CrC24, alquenilo C2-C24, alquinilo C2-C24 o un grupo -R2-Y-R3, donde Y se selecciona entre S, O, N, NH, S(O), S(02), C(O), NHC(O), C(0)NH, C(0)0, OC(O),
R2, se selecciona entre alquilo CrCa, alquenilo C2-Ca, alquinilo C2-Ca,
R3 se selecciona entre alquilo C-i-C-b, alquenilo C2-Cb, alquinilo C2-Cb, siendo a+b≤24, m es un valor entre 1 y 10,
X es un fluoróforo, cromóforo o luminóforo,
con la condición de que cuando X es umbeliferona y m es 2, R1 es distinto de -(CH2)14CH3.
El término "alquilo" se refiere, en la presente invención, a radicales de cadenas hidrocarbonadas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 24 átomos de carbono, preferiblemente de 10 a 12, y que se unen al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, Apropilo, n-butilo, tere-butilo, sec-butilo, n- pentilo, n-hexilo, decilo, dodeciloetc. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, azido, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, ciano, acilo, alcoxicarbonil, amino, nitro, mercapto y alquiltio.
El término "alquenilo" se refiere a radicales de cadenas hidrocarbonadas, lineales o ramificadas, que contienen uno o más enlaces carbono-carbono dobles, por ejemplo, vinilo, 1 -propenílo, alílo, isoprenilo, 2-butenílo, 1 ,3-butadienilo etc. Los radicales alquenilos pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, azido, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alquiltio.
El término "alquinilo" se refiere a radicales de cadenas hídrocarbonada, lineal o ramificada, que tiene uno o más triples enlaces carbono-carbono y que está unido al resto de la molécula por un enlace simple por ejemplo, etinilo, 1 -propinilo, etc. El grupo alquinilo puede estar opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, azido, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alquiltio.
"Fluoróforo" se refiere a un grupo químico de pequeño tamaño que forma parte de una molécula mayor, el cual puede ser excitado por la luz para emitir fluorescencia. En algunas realizaciones, los fluoróforos producen fluorescencia eficientemente por excitación con luz de longitud de onda desde unos 200 nanometros a unos 800 nanometros. La intensidad y la longitud de onda de la radiación emitida dependen del fluoróíoro y del entorno químico del mismo. El tluoróforo puede ser seleccionado, sin limitación, de entre acridina, antracenos, aloficocianina, BODIPY, dañinas, cumarinas, fluorescamina, tluoresceina, FAM (carboxifluoresceina), HEX (hexaclorofluoresceina), JOE (6-carboxí-4',5'-dícloro-2',7'- dimetoxi-fluoresceina), Oregon Green, ficocianina, ficoeritirina, rodamina, ROX (carboxi-X- rodamina), TAMRA (carboxitetrametilrodamína), TET (tetracloro-fluoresceina), Texas red, tetrametilrodamina y xanthinas.
"Luminóforo" se refiere a un átomo o grupo químico que emite luz que no deriva del aumento de temperatura, y puede estar causada por cambios químicos, bioquímicos o cristalográficos. El luminóforo puede ser seleccionado, sin limitación, de entre rodo!, rodamina, resorufína o derivados de los mismos.
"Cromóforo" se refiere a un grupo químico que absorbe energía de excitación y la emite en un rango de longitudes de onda que produce color. Eí cromóforo puede ser seleccionado, sin limitarse a, antocianinas, carotenos, licopenos, colorantes azoicos, foíocromos etc.
Preferiblemente, m es un valor entre 2 y 4. Más preferiblemente m es 2.
Preferiblemente, R-i es un alquilo -(CH2)nCH3, donde n es un valor entre 1 y 24. Más preferiblemente n es 10.
Preferiblemente X es umbeliferona. La umbeliferona o 7-hidroxicumarina es un compuesto orgánico derivado de la cumarina por sustitución de su átomo de hidrógeno en posición 7 por un grupo hidroxilo, que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000006_0001
Otro aspecto de la presente invención, se refiere a un método de diagnóstico para determinar si un individuo padece la enfermedad de Farber que comprende: a) obtención de una muestra biológica aislada del individuo,
b) adición de un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000007_0001
(I)
donde
Ri se selecciona entre alquilo C1-C24, alquenilo C2-C24, alquinilo C2-C24 o un grupo -R2-Y-R3, donde Y se selecciona entre S, O, N, NH, S(O), S(02), C(O), NHC(O), C(0)NH, C(0)0, OC(O), R2, se selecciona entre alquilo C Ca, alquenilo C2-Ca, alquinilo C2-Ca, Re sé selecciona entre alquilo C Cb, alquenilo C2-Cb, alquinilo C2- Cb, siendo a+b<24,
m es un valor entre 1 y 10,
X es un grupo fluorogénico, cromogénico o luminogénico a la muestra obtenida en
(a),
c) incubación de la mezcla obtenida en (b)
d) oxidación de la mezcla obtenida en (c)
e) detección de la señal (fluorescencia, color o luminiscencia) emitida en la mezcla obtenida en (d).
En una realización preferida, R-, es un alquilo -{CH2)nCH3, donde n es un valor entre 1 y 24. En una realización más preferida, n es 10.
En otra realización preferida, m es un valor entre 2 y 4. En una realización más preferida, m es 2.
En una realización preferida, X es umbeliferona.
En una realización preferida, la etapa (c) de incubación se puede detener mediante la adición de metanol seguida de una oxidación que puede ser realizada añadiendo mezclas oxidantes conocidas, tal como, pero sin limitarse a, Nal04 disuelto en disolución amortiguadora de glícina/NaOH de pH 10,6.
Preferiblemente, la muestra obtenida en la etapa (a) es un fluido corporal y más preferiblemente, el fluido es sangre. De la sangre se pueden extraer leucocitos y linfocitos mediante técnicas conocidas y realizar las modificaciones requeridas para utilizar estos extractos para la realización del método descrito.
Preferiblemente, la muestra obtenida en la etapa (a) es tejido epitelial. La obtención de la muestra de tejido y de las células se realiza por métodos estándar conocidos por cualquier experto en la materia.
En una realización preferida, el tiempo de incubación en el paso (c) es entre 0,5 y 5 horas.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de la enfermedad de Farber que comprende la comparación de los datos obtenidos mediante el método según se ha descrito anteriormente con una muestra control.
El método de detección de la enfermedad de Farber descrito en la presente invención se basa en una reacción enzimática de hidrólisis sobre un compuesto de fórmula (I) como se ha descrito anteriormente. Estos compuestos son sustratos de la enzima ceramidasa ácida, que se encuentra mutada en individuos que padecen esta enfermedad, por lo que su funcionalidad en las células es mínima o nula. En un primer paso del método, se obtiene una muestra biológica del individuo (sangre, tejido etc.) de la que se han extraído las células adecuadas para determinar la actividad de la ceramidasa por los métodos habituales. Este extracto celular se pone en contacto con el sustrato de fórmula (I) y se incuba la mezcla durante un tiempo variable de entre 1 a 5 horas. En caso de que la enzima ceramidasa sea funcional, se producirá la hidrólisis de la cadena N-acilo presente en el compuesto de fórmula (I). Este cambio estructural hace que, después de una reacción de oxidación, el fluoróforo emita fluorescencia, que puede ser medida por los métodos conocidos, tal como un espectrofotómetro adecuado. En caso de que la ceramidasa esté mutada y no sea funcional, la muestra no presentará fluorescencia o ésta será mínima. En base a está relación entre la actividad ceramidasa y los datos de fluorescencia obtenidos, un experto en la materia puede proceder a determinar sí el individuo problema padece la enfermedad de Farber.
Preferiblemente, es recomendable determinar también la actividad ceramidasa en al menos una muestra control que puede ser un extracto celular del mismo tipo de células procedente de un individuo normal para el mismo experimento y el mismo día. Así, la probabilidad de que un individuo padezca la enfermedad de Farber aumenta cuando la actividad de ceramidasa en la muestra problema es aproximadamente un 25% menor a la actividad ceramidasa determinada en la muestra control.
El método descrito en la presente invención posee una serie de ventajas respecto a los métodos conocidos en la actualidad:
■ El sustrato utilizado no es radioactivo, por lo tanto, no se requieren instalaciones ni equipos específicos ni autorizaciones especiales.
■ El sustrato utilizado es soluble en disoluciones acuosas a las concentraciones necesarias, con lo que no se requiere el uso de detergentes para su solubilización.
■ El sustrato utilizado es estable en condiciones adecuadas de almacenamiento.
■ El sustrato utilizado es específico para la ceramidasa ácida y, por lo tanto, para el diagnóstico de la enfermedad de Farber al no presentar interferencias con otras amido hidrolasas.
■ La detección se basa en la medida de fluorescencia, color o luminiscencia mediante instrumental común y asequible en los laboratorios.
• No se necesita separar el producto del sustrato, con lo que se evitan procedimientos tediosos de extracción y de separación (CCF, HPLC, GCL)
■ Se evita el uso de disolventes orgánicos halogenados, con lo que el método genera menos residuos contaminantes que los otros descritos y suponen un menor riesgo ocupacional
■ El ensayo es muy sensible, con un límite de detección de 50 pmoles de producto formado, y requiere muy poca cantidad de proteína (10-20 μg) ■ El ensayo puede ser miniaturizado y utilizado para el cribado masivo de muestras y para la realización de múltiples medidas de forma simultánea.
■ El ensayo puede aplicarse a varios tipos de muestras biológicas, como por ejemplo linfocitos de sangre y fibroblastos de piel
■ El ensayo es rápido, requiriéndose menos de 4 horas desde la preparación de la muestra hasta la obtención de los resultados.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (I):
(I)
Figure imgf000010_0001
donde
Ri se selecciona entre alquilo C1-C24, alquenilo C-2-C24, alquinilo C-2-C24 o un grupo -R2-Y- R3, donde Y se selecciona entre S, O, N, NH, S(O), S(O2), C(O), NHC(O), C(O)NH, C(O)O, OC(O), R2, se selecciona entre alquilo CrCa, alquenilo C2-Ca, alquinilo C2-Ca, R3 se selecciona entre alquilo C C , alquenilo C-2-C-b, alquinilo C-2-Cb, siendo a+b<24,
m es un valor entre 1 y 10,
X es un grupo fluorogénico, cromogénico o luminogénico,
para el diagnóstico de la enfermedad de Farber en una muestra biológica aislada de un individuo.
Preferiblemente, R es un alquilo -(CH2)nCH3) donde n es un valor entre 1 y 24. Más preferiblemente, n es 10.
Preferiblemente, m es 2.
En una realización preferida, X es umbeliferona. En un último aspecto, la presente invención se refiere a un kit útil para determinar si un individuo padece la enfermedad de Farber a partir de una muestra aislada de dicho individuo, que comprende el compuesto de fórmula (I) y al uso de este kit para el diagnóstico de la enfermedad de Farber en una muestra biológica aislada de un individuo. Otros componentes del kit pueden ser disoluciones amortiguadoras, conservantes, oxidantes y en general, componentes que contribuyan a la adecuada conservación de los reactivos y a que la reacción base del ensayo se realice de la forma más eficiente posible.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fíg. 1. Muestra la actividad enzímática sobre los compuestos 2-7, después de 3 horas de incubación de las células en cultivo (línea FD1 AcCerl OX) con 40 μΜ de sustrato. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes con triplicados. S se refiere al sustrato descrito en Bedia et al., Chembiochem. 2007, 8, 642-8.
Fíg. 2. Muestra la actividad enzímática sobre los compuestos 2-7, después de 3 horas de incubación de las células en cultivo (línea FD1 AcCerl OX) con distintas concentraciones de cada sustrato. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes con triplicados.
Flg. 3. Muestra el efecto de la concentración de proteína en la hidrólisis del sustrato 5, después de 3 horas de incubación a 37°C en presencia de 20 μΜ de sustrato y diferentes cantidades de sobrenadante de homogeneizados celulares (línea FD1 AcCerl OX). Los resultados son representativos de dos experimentos independientes Fíg. 4. Muestra la hidrólisis del sustrato 5 en función del tiempo de incubación, en presencia de 20 μΜ de sustrato y de 25 de proteína del homogeneízado celular (línea FD1 AcCerl Ox). Los datos son representativos de dos experimentos independientes.
Fíg. 5. Muestra la hidrólisis del sustrato 5 en función del pH de la mezcla de reacción, en los homogeneizados celulares de tres líneas celulares con diferente grado de actividad ceramidasa ácida: FD1 AcCerl OX (sobreexpresan ceramidasa ácida), línfoblastos normales y fibroblastos FD1 (Farber). Los ensayos se realizaron a 37eC durante 3 horas en presencia de 20 μΜ de sustrato y de 10-25 μg de proteína. Para la incubación se utilizaron diferentes disoluciones amortiguadoras sin detergentes: disolución amortiguadora de glicina-HCI (pH 2,5 a 3), disolución amortiguadora de acetato (pH 3,5 a 5,5), disolución amortiguadora de fosfato sódico (pH 6 a 8,1 ) y disolución amortiguadora de glicina-NaOH (pH 8,9 a 9,8). Los resultados son representativos de 4 experimentos independientes.
Fig. 6. Muestra el análisis cinético de la hidrólisis del sustrato 5. Diferentes concentraciones del sustrato de 2,5 a 80 μΜ fueron incubadas en presencia de 10-25 μg de proteína del homogeneízado celular (línea FD1 AcCerl Ox), en el seno de una disolución amortiguadora de acetato pH 4,5 durante 3 horas a 37eC. En la figura se muestra la representación de Lineweaver-Burk y los parámetros cinéticos resultantes, los cuales son el promedio de cinco experimentos independientes.
Fig. 7. Muestra la medición de la actividad ceramidasa ácida en diferentes líneas de fibroblastos Farber y fibroblastos control. Todas las mediciones han sido realizadas con el sustrato 5 y una cantidad fija de proteína, en las condiciones estándar descritas. Los resultados son el promedio de 3 experimentos independientes.
Fig. 8. Muestra la medición de la actividad β-galactosidasa lisosomal en diferentes líneas de fibroblastos Farber y fibroblastos control. Todas las mediciones han sido realizadas con el sustrato 5 y una cantidad fija de proteína, en las condiciones estándar descritas. Los resultados son el promedio de 3 experimentos independientes. Fíg. 9. Muestra la medición de la actividad ceramidasa ácida en diferentes líneas de linfoblastos Farber y linfoblastos control. Todas las mediciones han sido realizadas con el sustrato 5 y una cantidad fija de proteína, en las condiciones estándar descritas. Los resultados son el promedio de 3 experimentos independientes.
Fig. 10. Muestra la medición de la actividad β-galactosidasa lisosomal en diferentes líneas de linfoblastos Farber y linfoblastos control. Todas las mediciones han sido realizadas con una cantidad fija de proteína, en las condiciones estándar descritas. Los resultados son el promedio de 3 experimentos independientes.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante ejemplos y ensayos realizados por los inventores, sin ser limitativos, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad del método de la presente invención.
A. Preparación de ios compuestos de fórmula (I).
Metodología general: A una disolución del amínodíol cumaríníco 1 (56 mg, 0.2 mmol), obtenido tal como de describe en la literatura [Bedia et al., Chembiochem. 2007, 8, 642-8.], y NEt3 (60 pL / 0.4 mmol), en 4 mL de CH2CI2 bajo atmósfera de argón a temperatura ambiente, se adiciona una disolución del correspondiente ácido activado en 4 mL de CH2CI2 . Dicho ácido activado se prepara previamente disolviendo en CH2CI2 ECD/HOBt/ácido en proporciones 0.32 mmol:0.25 mmol:0.25 mmol). La reacción se controla por cromatografía en capa fina eluyendo con CH2Cl2/MeOH 9:1 ) observándose tras 1 h la desaparición total del producto partida. La mezcla de reacción se lava con 2 mL de una disolución acuosa saturada de NaHC03, el CH2CI2 se evapora y el crudo resultante se purifica por cromatografía en columna flash utilizando un gradiente de 0 a 10% de MeOH en CH2CI2 para obtener los productos en forma de sólidos blancos (rendimientos 74-80%). Un esquema de este procedimiento se muestra a continuación:
Figure imgf000014_0001
(1'S,2' ¾A^[1-hidroximetil-2-hidroxi-4-(2-oxo-2H-cromen-7-iioxi)butil]buta
(compuesto 2, n=2).
1H RMN (400 MHz; CDCI3) δ 7.62 (d, 1H, J= 9.5 Hz), 7.35 (d, 1H, J= 7.5 Hz), 6.85-6.82 (m, 2H), 6.48 (d, 1H, J= 8 Hz), 6.24 (d, 1H, J= 9.5 Hz), 4.34-4.16 (m, 2H), 4.06 (dd, 2H, J,=3.3 y Js= 8.0 Hz), 3.92 (m, 1H), 3.86-3.72 (m, 2H), 3.18 {brs, 1H), 2.22 (t, 2H, J= 7.0 Hz), 2.04 (m, 2H), 1.68 (sext, J= 7.5, 2H), 0.95 (t, 3H, J= 7.5 Hz)
13C RMN (75 MHz; CDCI3) δ 174.2, 162.2, 161.7, 155.7, 143.9, 128.9, 113.1, 112.9, 112.6, 101.5, 70.0, 65.8, 62.2, 54.7, 38.7, 33.5, 19.3, 13.8.
(1'S,2' ¾W-[1-hidroximetil-2-hidroxi-4-(2-oxo-2H-cromen-7-iioxi) butil]octanoilamida (compuesto 3, n=6).
1H RMN (400 MHz; CDCI3) δ 7.63 (d, 1H, J= 9.5 Hz), 7.34 (d, 1H, J= 7.5 Hz), 6.85-6.76 (m, 2H), 6.53 (d, 1H, J= 8 Hz), 6.22 (d, 1H, J= 9.5 Hz), 4.30-4.14 (m, 2H), 4.06 (brd, 2H, J= 9.6 Hz), 3.93 (m, 2H), 3.84-3.76 (m, 1H), 3.41 (brs, 1H), 2.24 (t, 2H, J= 7.0 Hz), 2.04 (m, 2H), 1.68 (quint, J= 7.5, 2H), 1.38-1.16 (br, 8H), 0.86 (t, 3H, J=7.5 Hz)
13C RMN (75 MHz; CDCI3) δ 174.4, 162.2, 161.7, 155.7, 143.9, 128.9, 113.1, 112.8, 112.6,
101.4, 69.9, 65.7, 62.2, 54.7, 36.9, 33.5, 31.7, 29.3, 29.1, 25.9, 22.7, 14.2.
(1'S,2'f Af-[1-hidroximetil-2-hidroxi-4-(2-oxo-2H-cromen-7-iioxi) butH]decanoilamida (compuesto 4, n=8).
1H RMN (400 MHz; CDCI3) δ 7.64 (d, 1H, J= 9.0 Hz), 7.37 (d, 1H, J= 8.0 Hz), 6.84-6.82 (m, 1H), 6.83 (s, 1H), 6.36 (d, 1H, J= 8 Hz), 6.25 (d, 1H, J= 9.5 Hz), 4.32-4.14 (m, 2H), 4.06 (brd, 2H, J= 9.6 Hz), 3.92 (sext, 1H, J= 3.5 Hz), 3.82 (brd, 1H), 3.43 (brd, 1H, J= 5.5 Hz), 2.75 (brs, 1H), 2.25 (t, 2H, J= 8.0 Hz), 2.05 (m, 2H), 1.70-1.52 (4H), 1.38-1.16 (br, 12H), 0.87 (t, 3H, J=7.0 Hz)
13C RMN (75 MHz; CDCI3) δ 174.4, 162.2, 161.7, 155.7, 143.8, 128.9, 113.1, 112.9, 112.6,
101.5, 70.0, 65.8, 62.3, 54.7, 36.9, 33.5, 31.9, 29.6, 29.5, 29.4, 29.4, 25.9, 22.8, 14.2. (1'S,2' ?)/\^[1-hidrox»metil-2-hidrox»-4-(2-oxo-2H-cromen-7-iloxi) butil]dodecanoílamida (compuesto 5, n=10).
H RMN (400 MHz; CDCI3) δ 7.63 (d, 1H, J= 9.0 Hz), 7.36 (d, 1H, J= 8.0 Hz), 6.84-6.82 (m, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.41 (d, 1H, J= 8 Hz), 6.24 (d, 1H, J= 9.0 Hz), 4.32-4.14 (m, 2H), 4.07 (m, 2H), 3.92 (sext, 1H, J= 3.5 Hz), 3.82 (dd, 1H, J,= 11.5 Hz, J¿= 3.5 Hz), 2.24 (t, 2H, J= 8.0 Hz), 2.05 (m, 2H), 1.64 (quint, 2H, J= 7 Hz), 1.38-1.18 (br, 16H), 0.87 (t, 3H, J= 7.0 Hz) 13C RMN (75 MHz; CDCI3) δ 174.4, 162.2, 161.7, 155.7, 143.8, 128.9, 113.1, 112.9, 112.6, 101.5, 70.0, 65.8, 62.2, 54.7, 36.9, 33.5, 32.0, 29.7, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 25.9, 22.8, 14.2.
(1'S,2'/?)/\í-[1-hidrox«metil-2-hidrox«-4-(2-oxo-2H-cromen-7-iloxi)
butiljtetradecanoilamida (compuesto 6, n=12).
1H RMN (400 MHz; CDCI3) δ 7.63 (d, 1H, J= 9.0 Hz), 7.37 (d, 1H, J= 8.0 Hz), 6.84-6.82 (m, 1H), 6.83 (s, 1H), 6.34 (d, 1H, J= 8 Hz), 6.26 (d, 1H, J= 9.0 Hz), 4.32-4.14 (m, 2H), 4.07 (m, 2H), 3.92 (sext, 1H, J= 3.5 Hz), 3.82 (m, 1H), 3.40 (t, 1H, 6.0 Hz), 2.70 (brs, 1H), 2.24 (t, 2H, J= 7.5 Hz), 2.06 (m, 2H), 1.65 (quint, 2H, J= 7 Hz), 1.38-1.18 (br, 20H), 0.88 (t, 3H, J= 7.0 Hz)
13C RMN (75 MHz; CDCI3) δ 174.3, 162.2, 161.7, 155.7, 143.8, 128.9, 113.1, 112.9, 112.6, 101.5, 70.1, 65.8, 62.3, 54.7, 36.9, 33.5, 32.0, 29.8, 29.7, 29.6, 29.5, 29.5, 29.4, 25.9, 22.8, 14.2.
(1'S,2'fí)/V-[1-hidroximetil-2-hidroxi-4-(2-oxo-2H-cromen-7-«loxi)
butil]tetracosanoilamida (compuesto 7, n=22).
1H RMN (400 MHz; CDCI3) δ 7.63 (d, 1H, J= 9.6 Hz), 7.37 (d, 1H, J= 8.0 Hz), 6.84-6.82 (m, 1H), 6.83 (s, 1H), 6.34 (d, 1H, J= 7.2 Hz), 6.26 (d, 1H, J= 9.6 Hz), 4.34-4.15 (m, 2H), 4.07 (m, 2H), 3.92 (sext, 1H, J= 3.5 Hz), 3.81 (m, 1H), 3.41 (d, 1H, J= 6 Hz), 2.81 (m, 1H), 2.73 (m, 1H), 2.25 (t, 2H, J= 7.5 Hz), 2.06 (m, 2H), 1.65 (quint, 2H, J= 7 Hz), 1.38-1.18 (br, 40H), 0.88 (t, 3H, J=7.0 Hz)
13C RMN (75 MHz; DMSO) δ 172.2, 161.9, 160.1, 155.3, 144.1, 129.3, 112.5, 112.2, 112.1, 101.1, 67.0, 65.6, 60.6, 55.0, 35.4, 32.8, 31.1, 29.8, 29.8, 29.6, 29.5, 25.2, 21.9, 13.7. B. Ensayos biológicos.
Medición de la actividad ceramidasa ácida
Esta actividad se puede medir in vitro con homogeneizados celulares y sobre células vivas intactas.
Para la medición de la actividad ceramidasa ácida in vitro, las células son recolectadas y se lavan dos veces con PBS. Sobre los precipitados celulares se añaden 100 μΙ de una disolución acuosa de sacarosa 0,2 M y se sónica. Los homogeneizados celulares se centrifugan durante 3 minutos a 15000 g y se guardan los sobrenadantes. Estos se utilizan para cuantificar las proteínas de cada muestra, y después de los cálculos, el ensayo de actividad ceramidasa ácida se realiza a cantidades iguales de proteína. El ensayo se lleva a cabo en placas de 96 pocilios. Cada pocilio contiene 74 μΙ de disolución amortiguadora de acetato de sodio/ácido acético, 0,5 μΙ de la disolución de sustrato de la ceramidasa ácida 4 mM en etanol (concentración final de sustrato 20 μΜ; concentración final de etanol 0,5%), y una cantidad de proteína fija (entre 10 y 25 g) en un volumen de 25 μΙ de sacarosa 0,2 M. La placa se incuba a 379C durante 3 horas sin agitación. Pasado este tiempo, la reacción se para mediante la adición en cada pocilio de 50 μΙ de metanol y después 100 μΙ de una disolución de Nal04 de 2,5 mg/ml en disolución amortiguadora de glicina/NaOH de pH 10,6. La placa se mantiene a 37 eC protegida de la luz durante dos horas y posteriormente se mide la fluorescencia en un fluorímetro de placas (longitud de onda de excitación 340 nm, emisión 460 nm).
Las líneas celulares utilizadas para caracterizar el sustrato son FD1 (línea celular Farber con actividad ceramidasa ácida nula) y FD1 AcCerl OX (línea Farber corregida para sobreexpresar la ceramidasa ácida). Las demás líneas celulares Farber y líneas control, ya sean fibroblastos como linfoblastos (Epstein-Barr virus-transformed lymphoid cell lines), proceden del Laboratoire de Biochímie Métabolíque, Instituí Fédératif de Biologíe, CHU Purpan, Toulouse, France. Para la medición de la actividad ceramidasa ácida en células en cultivo, las células se siembran a una densidad de 200000 células/ml (0.1 ml/pocillo). Después de 24 h, se añade el sustrato disuelto en etanol o en DMSO (0.1 μΙ, 40 mM) para tener una concentración final de 40 μΜ. Se incuba a 37 eC durante 3 h en el incubador de C02 y luego se añaden secuencialmente 25 μΙ de MeOH y 100 μΙ de una disolución de Nal04 de 2,5 mg/ml en disolución amortiguadora de glicina/NaOH de pH 10,6. La placa se mantiene a 37 SC protegida de la luz durante dos horas y posteriormente se mide la fluorescencia en un fluorímetro de placas (longitud de onda de excitación 340 nm, emisión 460 nm). Las muestras blanco se preparan añadiendo el sustrato inmediatamente antes de la adición de MeOH y NalO4.
Hidrólisis de los compuestos en función del grupo /V-acilo.
Estos experimentos se pueden realizar en células en cultivo. Para ello, las células se siembran a una densidad de 200000 células/ml (0.1 ml/pocillo). Después de 24 h, se añaden los sustratos disueltos en etanol o en DMSO (0.1 μΙ, 40 mM). El experimento se puede realizar a una concentración fija final de sustrato (por ejemplo, 40 μΜ) o variable, entre 1 y 100 μΜ. Se incuba a 37 9C durante 3 h en el incubador de CO2 y luego se añaden secuencialmente 25 μΙ de MeOH y 100 μΙ de una disolución de NalO4 2,5 mg/ml en disolución amortiguadora de glicina/NaOH de pH 10,6. La placa se mantiene a 37 °C protegida de la luz durante dos horas y posteriormente se mide la fluorescencia en un fluorímetro de placas (longitud de onda de excitación 340 nm, emisión 460 nm). Las muestras blanco se preparan añadiendo el sustrato inmediatamente antes de la adición de MeOH y NalO4.
Hidrólisis del sustrato en función de la concentración de proteína.
Para determinar el efecto de la concentración de proteína sobre la hidrólisis del sustrato, las células en cultivo de la línea FD1 AcCerl OX son recolectadas y se lavan dos veces con PBS. Sobre los precipitados celulares se añaden 100 μΙ de una disolución acuosa de sacarosa 0,2 M y se sónica. Los homogeneizados celulares se centrifugan durante 3 minutos a 15000 g y se guardan los sobrenadantes. Estos se utilizan para cuantificar las proteínas de cada muestra, y el ensayo de actividad ceramidasa ácida se realiza a diferentes cantidades de sobrenadante de homogeneizados celulares. El ensayo se lleva a cabo en placas de 96 pocilios. Cada pocilio contiene 74 μΙ de disolución amortiguadora de acetato de sodio/ácido acético, 0,5 μΙ de la disolución de sustrato de ceramidasa ácida 4 mM en etanol (concentración final de sustrato 20 μΜ; concentración final de etanol 0,5%), y distintas cantidades de proteína entre 2.5 y 180 Mg en un volumen de 25 μΙ de sacarosa 0,2 M. La placa se mantiene a 37SC durante 3 horas sin agitación. Pasado este tiempo, la reacción se para mediante la adición de 50 μΙ de metanol y 100 μΙ de una disolución de 2,5 mg/ml de Nal04 en disolución amortiguadora de glicina/NaOH de pH 10,6 en cada pocilio. La placa se protege de la luz durante dos horas y posteriormente se lee en un fluorímetro de placas (longitud de onda de excitación 340 nm, emisión 460 nm).
Hidrólisis del sustrato en función del tiempo de incubación
Para determinar la hidrólisis del sustrato en función del tiempo de incubación, las células en cultivo son recolectadas y se lavan dos veces con PBS. Sobre los precipitados celulares se añaden 100 μΙ de una disolución acuosa de sacarosa 0,2 M y se sonican. Los homogeneizados celulares se centrifugan durante 3 minutos a 15000 g y guardamos los sobrenadantes. Estos se utilizan para cuantificar las proteínas de cada muestra, y después de los cálculos, el ensayo de actividad ceramidasa ácida se realiza a cantidades iguales de proteína. La mezcla de incubación del ensayo se lleva a cabo en placas de 96 pocilios. Cada pocilio contiene 74 μΙ de disolución amortiguadora de acetato de sodio/ácido acético, 0,5 μΙ de la disolución de sustrato de ceramidasa ácida 4 mM en etanol (concentración final de sustrato 20 μΜ; concentración final de etanol 0,5%), y 25 g de proteína en un volumen de 25 μΙ de sacarosa 0,2 M. La placa se incuba a 37QC durante distintos timepos sin agitación. Pasado este tiempo, la reacción se para mediante la adición de 50 μΙ de metanol y 100 μΙ de una disolución de 2,5 mg/ml de Nal04 en disolución amortiguadora de glicina/NaOH de pH 10,6 en cada pocilio. La placa se protege de la luz durante dos horas y posteriormente se se mide la fluorescencia en un fluorímetro de placas (longitud de onda de excitación 340 nm, emisión 460 nm). Hidrólisis del sustrato en función del pH.
Para determinar la hidrólisis del sustrato en función del pH de la disolución amortiguadora de reacción, se utilizan tres líneas celulares con diferente grado de actividad ceramidasa ácida: FD1 AcCerl OX (sobreexpresan ceramidasa ácida), línfoblastos normales y fibroblastos FD1 (Farber). Las células en cultivo son recolectadas y se lavan dos veces con PBS. Sobre los precipitados celulares se añaden 100 μΙ de una disolución acuosa de sacarosa 0,2 M y se sónica. Los homogeneizados celulares se centrifugan durante 3 minutos a 15000 g y guardamos los sobrenadantes. Estos se utilizan para cuantificar las proteínas de cada muestra, y después de los cálculos, el ensayo de actividad ceramidasa ácida se realiza a cantidades iguales de proteína. La mezcla de incubación del ensayo se lleva a cabo en placas de 96 pocilios. Cada pocilio contiene 74 μΙ de diferentes disoluciones amortiguadoras sin detergentes: disolución amortiguadora de glícina-HCI (pH 2,5 a 3), disolución amortiguadora de acetato (pH 3,5 a 5,5), disolución amortiguadora de fosfato sódico (pH 6 a 8,1 ) y disolución amortiguadora de glicina-NaOH {pH 8,9 a 9,8), 0,5 μΙ de la disolución de sustrato de ceramidasa ácida 4 mM en etanol (concentración final de sustrato 20 μΜ; concentración final de etanol 0,5%), y una cantidad de proteína fija (entre 10 y 25 μg) en un volumen de 25 μΙ de sacarosa 0,2 M. La placa se incuba a 37SC durante 3 horas sin agitación. Pasado este tiempo, la reacción se para mediante la adición de 50 μΙ de metanol y 100 μΙ de una disolución de 2,5 mg/ml de Nal04 en disolución amortiguadora de glicina/NaOH de pH 10,6 en cada pocilio. La placa se protege de la luz durante dos horas y posteriormente se mide la fluorescencia en un fluorímetro de placas (longitud de onda de excitación 340 nm, emisión 460 nm).
Análisis cinético de la hidrólisis del sustrato.
Para efectuar el análisis cinético de la hidrólisis del sustrato, las células en cultivo (línea FD1 AcCeM Ox) son recolectadas y se lavan dos veces con PBS. Sobre los precipitados celulares se añaden 100 μΙ de una disolución acuosa de sacarosa 0,2 M y se sónica. Los homogeneizados celulares se centrifugan durante 3 minutos a 15000 g y se guardan los sobrenadantes. Estos se utilizan para cuantificar las proteínas de cada muestra, y después de los cálculos, el ensayo de actividad ceramidasa ácida se realiza a cantidades iguales de proteína. El ensayo se lleva a cabo en placas de 96 pocilios. Cada pocilio contiene 74 μΙ de disolución amortiguadora de acetato de sodio/ácido acético, 0,5 μΙ de la disolución de sustrato de ceramidasa ácida a distintas concentraciones en etanol (concentración final de sustrato de 2.5 a 80 μΜ); concentración final de etanol 0,5%), y una cantidad de proteína fija (entre 10 y 25 μς) en un volumen de 25 μΙ de sacarosa 0,2 M. La placa se incuba a 37eC durante 3 horas sin agitación. Pasado este tiempo, la reacción se para mediante la adición de 50 μΙ de metanol y 100 μΙ de una disolución de 2,5 mg/ml de Nal04 en disolución amortiguadora de glicina/NaOH de pH 10,6 en cada pocilio. La placa se protege de la luz durante dos horas y posteriormente se mide la fluorescencia en un fluorímetro de placas (longitud de onda de excitación 340 nm, emisión 460 nm).
Medición de la actividad ceramidasa ácida y la actividad 3-qalactosidasa lisosomal en diferentes líneas de células Farber y células control.
Las células en cultivo son recolectadas y se lavan dos veces con PBS. Sobre los precipitados celulares se añaden 100 μΙ de una disolución acuosa de sacarosa 0,2 M y se sónica. Los homogeneizados celulares se centrifugan durante 3 minutos a 5000 g y se guardan los sobrenadantes. Estos se utilizan para cuantificar las proteínas de cada muestra, y después de los cálculos, el ensayo de actividad ceramidasa ácida se realiza a cantidades iguales de proteína. El ensayo se lleva a cabo en placas de 96 pocilios. Cada pocilio contiene 74 μΙ de disolución amortiguadora de acetato de sodio/ácido acético, 0,5 μΙ de la disolución de sustrato de ceramidasa ácida 4 mM en etanol (concentración final de sustrato 20 μΜ; concentración final de etanol 0,5%), y una cantidad de proteína fija (entre 10 y 25 μg) en un volumen de 25 μΙ de sacarosa 0,2 M. La placa se incuba a 37SC durante 3 horas sin agitación. Pasado este tiempo, la reacción se para medíante la adición de 50 μΙ de metanol y 100 μΙ de una disolución de 2,5 mg/ml de Nal04 en disolución amortiguadora de glicina/NaOH de pH 10,6 en cada pocilio. La placa se protege de la luz durante dos horas y posteriormente se mide la fluorescencia en un fluorímetro de placas (longitud de onda de excitación 340 nm, emisión 460 nm).
La actividad, β-galactosidasa lisosomal se mide con los mismos extractos proteicos utilizados para la medición de la actividad ceramidasa ácida. El ensayo se basa en el método fluorogénico ya publicado en la literatura2 con algunas modificaciones con el fin de adaptarlo al formato de placas de 96 pocilios. Así pues, una cantidad fija de proteína (entre 5 y 10 pg) en un volumen de 10 μΙ, se mezcla en un pocilio junto con 20 μΙ de disolución amortiguadora de ácido acético/acetato de sodio 0,5 M pH 4,5, 20 μΙ de EDTA 20 mM, 40 μΙ del sustrato 4-metilumbelliferíl-p-D-galactopiranósido 3 mM (concentración final 400 μΜ) y 10 μΙ de agua ultra pura. Esta mezcla se incuba a 37QC durante 30 minutos y seguidamente se añaden 100 μΙ de disolución amortiguadora de glicína/NaOH a pH 10,6. Posteriormente la fluorescencia se mide en un fluorímetro de placas (longitud de onda de excitación 340 nm, emisión 460 nm).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Compuesto de fórmula
Figure imgf000022_0001
(I)
donde
Ri se selecciona entre alquilo C1-C24, alquenilo C2-C24, alquinilo C2-C24 o un grupo -F½-Y-
R3, donde Y se selecciona entre S, O, N, NH, S(O), S(O2), C(O), NHC(O), C(0)NH,
C(O)O, OC(O), R2, se selecciona entre alquilo CrCa, alquenilo C2-Ca, alquinilo C2-Ca, 3 se selecciona entre alquilo C Cb, alquenilo C-2-Cb, alquinilo C2-Cb, siendo a+b<24, m es un valor entre 1 y 10,
X es un fluoróforo, cromóforo o luminóforo,
con la condición de que cuando X es umbeliferona y m es 2, R-i es distinto de -
Figure imgf000022_0002
2. Compuesto según la reivindicación 1 donde m es un valor entre 2 y 4.
3. Compuesto según la reivindicación 2 donde m es 2.
4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde R1 es un alquilo - (CH2)nCH3, donde n es un valor entre 1 y 24.
5. Compuesto según la reivindicación 4 donde n es 10.
6. Compuesto según las reivindicaciones anteriores donde X es umbeliferona.
7. Método de diagnóstico para determinar si un individuo padece la enfermedad de Farber que comprende: a) Obtención de una muestra biológica aislada de un individuo
b) adición de un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000023_0001
(
donde
R se selecciona entre alquilo CrC24, alquenilo C2-C24, alquinilo C-2-C-24 o un grupo
-R2-Y-R3, donde Y se selecciona entre S, O, N, NH, S(O), S(O2), C(O), NHC(O),
C(O)NH, C(O)O, OC{O), R2, se selecciona entre alquilo CrCa, alquenilo C2-Ca, alquinilo C2-Ca, R3 se selecciona entre alquilo d-Cb, alquenilo C2-Gb, alquinilo C2-
Cb, siendo a+b<24,
m es un valor entre 1 y 10,
X es un fluoróforo, cromóforo o luminóforo
a una muestra biológica aislada de un individuo, c) incubación de la mezcla obtenida en (b)
d) oxidación de la mezcla obtenida en (c)
e) detección de la fluorescencia producida en la mezcla obtenida en (d).
8. Método según la reivindicación 7 donde m es un valor entre 2 y 4.
9. Método según la reivindicación 8 donde m es 2.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 donde R1 es un alquilo - (CH2)nCH3, donde n es un valor entre 1 y 24.
11. Método según la reivindicación 10 donde n es 10.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 donde X es umbeliferona.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 donde la muestra biológica aislada es un fluido corporal.
14. Método según la reivindicación 13 donde el fluido corporal es sangre.
15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 donde la muestra biológica aislada es tejido epitelial.
16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15 donde el tiempo de incubación en el paso (b) es entre 0,5 y 5 horas.
17. Uso de un compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000024_0001
(I)
donde
R se selecciona entre alquilo CrC24, alquenilo C2-C24, alquinilo C2-C24 o un grupo -Ffe-Y-
R3, donde Y se selecciona entre S, O, N, NH, S(O), S(02), C(O), NHC(O), C<0)NH,
C(0)0, OC(O), R2, se selecciona entre alquilo CrCa, alquenilo C2-Ca, alquinilo C2-Ca, R3 se selecciona entre alquilo CrCb, alquenilo C2-Cb, alquinilo C2-Cb, siendo a+b<24, m es un valor entre 1 y 10,
X es fluoróforo, cromóforo o luminóforo,
para el diagnóstico de la enfermedad de Farber en una muestra biológica aislada de un individuo.
18. Uso según la reivindicación 17 donde m es un valor entre 2 y 4.
19. Uso según la reivindicación 18 donde m es 2.
20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 donde Ri es un alquilo -(CH2)nCH3, donde n es un valor entre 1 y 24.
21. Uso según la reivindicación 20 donde n es 10.
22. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21 donde X es umbeliferona.
23. Un kit útil para determinar si un individuo padece la enfermedad de Farber a partir de una muestra aislada de dicho individuo, que comprende el compuesto de fórmula (I).
24. Uso de un kit según la reivindicación 23 para el diagnóstico de la enfermedad de Farber en una muestra biológica aislada de un individuo.
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EP3925949A1 (en) * 2020-06-19 2021-12-22 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Azido compounds and method for monitoring acid ceramidase activity in intact cells using them

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