WO2012000151A1

WO2012000151A1 - 基于solexa测序法的检测人类乳头瘤病毒的方法

Info

Publication number: WO2012000151A1
Application number: PCT/CN2010/001833
Authority: WO
Inventors: 易鑫; 徐佳佳; 聂喜芳; 赵美茹
Original assignee: 深圳华大基因科技有限公司
Priority date: 2010-06-30
Filing date: 2010-11-15
Publication date: 2012-01-05
Also published as: AU2010356776A1; EP2481818B1; US20130123114A1; US9593387B2; PL2481818T3; JP2013529471A; HK1148789A1; CN101921874A; SI2481818T1; JP5923497B2; CN101921874B; AU2010356776B2; EP2481818A4; EP2481818A1

Description

基于 So l exa测序法的检测人类乳头瘤病毒的方法技术领域

本发明涉及人类乳头瘤病毒（Human Papi l l oma Vi rus , HPV ) 的检测方法，特别是基于 So lexa测序法的 HPV检测方法。背景技术

宫颈癌是世界上女性癌症的第二号杀手，仅次于乳腺癌。每年全世界约有 50万新发病例， 25 万死亡病例，其中发展中国家占 2/ 3。我国是宫颈癌的高发区，占全球宫颈癌总数的 10%。研究表明，人乳头瘤病毒（HPV)与宫颈癌有着密切关系，是重要的致癌因子，同时也是引发宫颈癌的必要奈件之一。已经表明，超过 100 种的 HPV能够感染皮肤（皮肤类型）或呼吸道和肛门生殖道的粘膜（粘膜类型），超过 40种的 HPV能够感染子宫颈。基于诱导的良性的，恶化前的或恶性的病变，将 HPV分别分为低危型（例如 HPV6 , 11， 42 , 43 和 44 ) 和高危型（例如 ΗΡ 6 , 18， 31， 33 和 45 ) 。因此，对 HPV感染的及早发现和正确分型对宫颈癌防治显得至关重要。

目前 HPV的检测方法主要有以下几种： ①细胞学检查，其利用宫颈刮片细胞学检查或液基薄层细胞学检查，藉由细胞外观形态的转变来加以诊断。对于 HPV感染，镜下可见挖空细胞、角化不良以及湿疣外底层细胞。其局限性在于， HPV感染的诊断的灵敏性和特异性较低。 ②免疫组化方法，其通过检测 HPV的衣壳抗原来进一步明确 HPV感染，其所得的阳性反应定位明确，判断可靠。但是，衣壳抗原仅在 HPV-DM复制成熟后才产生，因此，诊断为阴性的受试者并不能被确定为不被 HPV感染，该方法灵敏性较低。 ③实时荧光定量 PCR法（FQ— PCR) , 其主要是应用荧光检测 PCR仪，在 PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累对 PCR过程中每一个循环产生的扩增产物进行实时监测，从而对模板的初始浓度进行定量。此方法通量较低。 ④杂交捕获法（主要为 HC- II系统），其是目前唯一获得美国 FDA认证的可用于临床的 HP V DNA检测方法，并且其已获得欧洲 CE及中国 SDA认证。该方法使用专用的标本采集保存器；已获得专利保护的全长 8000bp的 RM探针以及已获得专利保护的特异性第一抗体。其原理是将核酸探针杂交到受测检体的 HPV DN A上，再通过化学荧光或酶反应借助增幅的信号进行检测。该方法所使用的核酸探针主要分为两种：针对低危险型 HPV的核酸探针和针对高危险型 HPV的核酸探针。该方法可用于 HPV的初步筛检，但是不能确定 HPV的特定类型，也不能确定多重感染的情况。

将上述检测方法联合使用，可以提高 HPV检测的灵敏性并降低检测的假阴性率。然而，这些方法的组合成本相对较高，一般只适用于经济发达地区的 HPV检测和宫颈癌筛查。对于经济较不发达地区，特别是在山区和广大农村地区，上述检测方法的联合使用存在着较大的局限性。因此，开发适合的、低成本的 HPV检测方法，是亟待解决的问题。

另一方面，目前已知的 HPV检测方法，例如上文描述的那些检测方法，通量都较低。当对大规模的样品进行 HPV检测时，应用上述方法是耗时耗力的，并且成本高昂。因此，本领域迫切需要新的高通量的、低成本的 HPV检测方法。发明内容

本发明基于 Solexa测序法以及 PCR标签（PCR index ) , 开发了新型的 HPV检测方法以及用于此的试剂盒。根据本发明的方法和试剂盒不仅可以实现 HPV的高通量、低成本检测，而且可以实现 HPV的精确分型。定义

为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。如本文中所使用的，术语 "PCR" 是指聚合酶链式反应。

如本文中所使用的，术语 "Solexa测序法" 是指近几年开发的新一代 DNA测序法，也称为第二代测序法。 Solexa测序法与传统测序法（例如， Sanger测序法）的不同之处在于，其釆用边合成边测序的原理进行 DNA序列分析。 Solexa测序法具有下述优点： 1 )成本低，仅为传统测序成本的 1%; 2 )通量高，可以同时对多个样品进行测序，并且进行一次的 Solexa 测序法可以产生大约 500亿（50G)个碱基的数据； 3)精确性高（高于 98.4%) ，有效的解决了多聚重复序列的读取问题。另一方面，高测序通量在进行测序的序列的数目确定的情况下，又反过来提高了序列的测序深度（例如，针对每个序列，可以进行多次测序），从而确保了测序结果的可靠性。如本文所使用的，术语 "测序深度" 是指一段 DNA序列在测序数据中集中出现的次数。测序深度可以通过将测序量除以基因组长度来计算，例如测序深度为 10，表示测了 10 次的整个基因组。

Solexa测序法的应用十分广泛。其可以用于基因组测序，基因分型，基因多态性研究等等。本发明的方法将 Solexa测序法用于检测 HPV: 通过对待分析的样品进行针对 HPV的测序，然后使用本领域已知的比对程序，例如 BLAST和 S0AP，将所得的测序结果与 HPV数据库中的参考序列进行比对，从而实现对样品所感染的 HPV的精确分型。本文中使用的 HPV数据库包含本领域已知的 HPV类型的序列，所述序列可见于例如公共数据库，例如 NCBI数据库 ( ht tp: //www. ncb i . nlm. nih. gov/ ) 。

如本文中可互换使用的，术语 "PCR标签（PCR index ) " 、 "标签（ index ) " 或 "引物标签（pr imer i ndex ) " 是指添加在 PCR引物 5'末端的一小段碱基序列，其通过 PCR扩增可以用于标记 PCR产物，从而辨别不同模板来源的 PCR产物的混合物中各个 PCR产物的模板来源。通过在引物的 5'末端添加标签，可以对 PCR 产物进行标记，从而可以将多个不同的 PCR产物混合成一个文库，用于进一步的分析和处理。文库中各个不同的 PCR产物各自具有独特的标签，从而根据各个 PCR产物中独特的标签，可以将各个不同的 PCR产物互相区分开来，并将其与 PCR模板——对应。

例如，当需要对多个样品进行测序时，可以在用于各个样品的引物的 5'末端添加不同的标签，然后用添加了标签的引物分别对各个样品进行 PCR反应，从而对各个样品（即， PCR产物 ) 进行标记。 PCR反应后，可以将来自各个样品的带有不同标签的 PCR 产物混合在一起组成一个文库，然后应用高通量的 So l exa测序法同时对文库中的各个 PCR产物进行测序。最终，在所得的测序数据中，通过独特的标签，可以将测序结果与各个 PCR产物（从而样品模板）一一对应。

可以仅在用于 PCR扩增的引物对的一条引物中引入标签，也可以在引物对的两条引物中都引入标签。当在引物对的两条引物中都引入标签时，每个 PCR引物对与一对标签组合成一对标签引物，其中正向和反向 PCR引物的 5'端分别具有正向标签和反向标签，并且正反标签和正反引物序列是对应的，且正向标签和反向标签可以是相同的，或不同的。

设计标签时需要考虑多种因素，包括： 1 )标签序列中应当避免 3个或 3个以上的单碱基重复序列； 2 )所有标签的同一位点中碱基 Α和碱基 C的总含量应在所有碱基含量的 30%-70%之间，例如，当设计 100条不同的标签序列时，每一条标签序列的第二个碱基（即，所谓的同一位点）中 A和 C占该 100条序列第二个碱基总量的 30%-70%； 3 )标签序列本身的 GC含量应在 40-60%之间; 4 ) 标签之间的序列差异应大于 4个碱基； 5 )标签序列中应避免出现与用于测序的引物相似度高的序列； 6 ) 当标签序列添加到 PCR扩增引物上后，应避免 PCR扩增引物形成发卡结构和二聚体等二级结构。

如本文中所使用的，术语 "标签引物（ index pr imer ) " 是指带有标签的引物，其包含 2个部分，标签部分和引物部分，其中标签部分用于在 PCR扩增反应中标记 PCR产物，而引物部分与模板碱基互补配对，用于扩增模板，并且其中标签部分，任选地通过连接序列，连接至引物部分的 5'端。

如本文中所使用的，术语 "接头（adapter ) " 或 "文库接头 ( l i brary adap t er ) " 是指经设计的一段碱基序列，其可以连接至文库中的扩增后的 PCR产物上，从而文库中的所有扩增后的 PCR 产物都可以借助该接头进行测序，例如，使用针对该接头设计的测序引物（而无需使用针对各 PCR产物设计的特异性测序引物）进行测序。优选地，本发明的接头可以通过 "PCR-FREE" 方法连接至 PCR产物上。

如本文中所使用的，术语 "PCR-FREE" 是指不进行 PCR反应而直接将接头连接至 PCR产物上，例如通过使用 DNA连接酶将接头连接至 PCR产物上。利用 PCR-Free方法来构建测序文库是本领域技术人员已知的，参见例如， Na ture Me thods 6， 291-295 (2009)。 "PCR-FREE" 方法由于整个过程无需进行 PCR而具有以下有利方面： 1 )减少了纯化步骤，降低了花费的时间和成本； 2 ) 减少了非特异性扩增； 3 )在含有许多序列高度相似的 PCR产物的文库的构建过程中，避免由 PCR引入错误，从而提高最后的测序结果的准确性。

如本文中所使用的，本发明的方法和试剂盒可以使用至少 1 种接头。不同的接头可以共有相同的一段序列（在本文中称为 "测序序列" ），并且可进一步包含不同的特征序列，从而，不同的接头可以共用相同的引物（其针对相同的测序序列进行设计）进行测序，并且利用独特的特征序列可以辨别多个文库的混合物中各个 PCR产物的文库来源，即，对不同文库来源的 PCR产物进行进一步的标记。

将标签与具有不同特征序列的接头组合，可以大大提高标记的效率（参见图 1 ) 。例如，使用 100种标签可以标记 100个样品，而使用 100种标签和 200种具有不同特征序列的接头，可以标己 100*200=20000个样品。因此，本发明的一个方面提供了一组标签，其包含至少 10 种，优选至少 20种、至少 30种、至少 40种、至少 50种、至少 60种、至少 70种、至少 80种、至少 90种或 95种标签，并且所述标签具有选自 SEQ ID NO: 1-95的序列。在一个优选实施方案中，该组标签至少包括 SEQ ID NO: 1-10 , 或 SEQ ID NO: 11-20，或 SEQ ID NO: 21-20 , 或 SEQ ID NO: 31-40 , 或 SEQ ID NO: 41-50 , 或 SEQ ID NO: 51-60 , 或 SEQ ID NO: 61-70, 或 SEQ ID NO: 71-80，或 SEQ ID NO: 81-90 , 或 SEQ ID NO: 91-95所示的标签，或者其任何两个或者多个的组合，例如 SEQ ID N0: 1-95所示的标签。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明的标签用于标记 SEQ ID NO: 96-106所示的 PCR 引物，从而用于进行高通量 HPV 测序、检测或分型。

本发明的一个方面提供了一种标签引物组，其包含 11种标签引物，所述标签引物的序列包含标签序列和 PCR引物序列，并且所述标签序列，任选地通过连接序列，连接至所述 PCR引物序列的 5'端，其中

1 ) 所述标签序列选自 SEQ ID NO: 1-95，且标签引物组中的 11种标签引物的每一种的标签序列都相同，和

2 ) 所述 11种标签引物的 PCR引物序列分别如 SEQ ID NO: 96-106所示。

本发明的标签引物组可扩增出至少 16种大约 170bp的产物，其对应于 HPV基因组中最为保守的基因区（L1区）中的一段高度保守的 DNA序列。因此，本发明的标签引物组可用于 HPV的精确分型。

在一个优选实施方案中，本发明的标签引物组可用于 HPV测序、检测或分型，从而其可用于医疗用途，例如诊断 HPV的存在和确定 HPV的类型等，以及非医疗用途，例如构建 HPV数据库，鉴定 HPV的新的类型和亚型，研究 HPV类型分布的地域性特点，流行病学研究和疫苗研制等。在另一个优选实施方案中，本发明的标签引物組可用于制备试剂盒，所述试剂盒可用于 HPV测序、检测或分型。

本发明的另一个方面提供了一种标签引物套组，其包含至少 10个，优选至少 20个、至少 30个、至少 40个、至少 50个、至少 60个、至少 70个、至少 80个、至少 90个或 95个上文描述的标签引物组。优选地，标签引物套组中，各个标签引物组所使用的标签序列互不相同。更优选，标签引物套组中所使用的标签序列至少包括 SEQ ID NO: 1-10，或 SEQ ID NO: 11-20，或 SEQ ID NO: 21-20 , 或 SEQ ID NO: 31-40, 或 SEQ ID NO: 41-50 , 或 SEQ ID NO: 51-60 , 或 SEQ ID NO: 61-70, 或 SEQ ID NO: 71-80，或 SEQ ID NO: 81-90 , 或 SEQ ID NO: 91-95所示的标签序列，或者它们任何两个或者多个的组合，例如 SEQ ID NO: 1-95所示的标签序列。

在一个优选实施方案中，本发明的标签引物套组可用于高通量 HPV测序、检测或分型，从而其可用于医疗用途，例如大规模的 HPV相关疾病的诊断和 HPV的精确分型（为临床诊断和治疗方案选择提供依据）等，以及非医疗用途，例如构建 HPV数据库，鉴定 HPV的新的类型和亚型，研究 HPV类型分布的地域性特点，流行病学研究和疫苗研制等。在另一个优选实施方案中，本发明的标签引物套组可用于制备试剂盒，所述试剂盒可用于高通量 HPV测序、检测或分型。

本发明的另一个方面提供了一种试剂盒，其包含上文描述的标签引物组或标签引物套组。优选，本发明的试剂盒还包含至少 1种，优选至少 2种、至少 10种、至少 20种、至少 30种、至少 40种、至少 50种、至少 100种或至少 200种接头。在一个优选实施方案中，所述接头适用于 So lexa测序法，例如其可用于构建测序文库，例如所述接头可具有选自 SEQ ID N0: 121-132的序列。在一个优选实施方案中，通过 PCR-FREE方法，例如 DNA连接酶法，使用接头来构建测序文库。

在一个优选实施方案中，本发明的试剂盒可用于高通量 HPV 测序、检测或分型，并且如上所述，其可用于医疗用途和非医疗用途。本发明的另一个方面提供了用于对一个或多个样品进行 HPV 测序、检测或分型的方法。所述方法包括使用上文描述的标签引物组或标签引物套组或试剂盒对各个样品的 DNA进行扩增，然后进行测序以获得样品的序列的步骤。

本明的另一个方面提供了用于对一个或多个样品进行 HPV 测序、检测或分型的方法，其包括下列步骤：

提供 n个样品， n为大于等于 1的整数，所述样品优选地来自哺乳动物，更优选是人，且优选是脱落细胞；可选地，将待分析的 n个样品分成 m个小组， m为整数且 n > m > l ;

1 )对于每一个样品，使用一个标签引物组对样品的 DNA进行扩增，其中

所述标签引物组包含 11种标签引物，所述标签引物的序列包含标签序列和 PCR引物序列，并且所述标签序列，任选地通过连接序列，连接至所述 PCR引物序列的 5'端，其中

i ) 所述标签序列选自 SEQ ID NO: 1-95 , 并且所述 11 种标签引物的每一种的标签序列都相同，和

ϋ ) 所述 11种标签引物的 PCR引物序列分别如 SEQ ID NO: 96-1 06所示，

其中，不同的样品使用的标签引物组可以相同或者不同，并且不同的标签引物组使用不同的标签序列；

2 )将步骤 1 ) 中的使用不同标签引物组进行扩增所获得的扩增产物混合在一起，得到一个或多个 PCR产物文库；

3 ) 通过 PCR- FREE方法，例如 DNA连接酶法给步骤 2 ) 中获得的一个或多个 PCR产物文库分别添加接头，从而构建一个或多个测序文库，其中不同的测序文库所使用的接头可以相同或者不同，且不同的接头共有相同的测序序列，但具有不同的特征序列； 4 )任选地，将步骤 3 ) 中获得的使用不同接头的测序文库混合在一起，得到一个或多个文库混合物；

5 )对步骤 3 ) 中获得的一个或多个测序文库或步骤 4 ) 中获得的一个或多个文库混合物分别进行测序，其中利用二代测序技术，优选 Pair-End技术 (例如 Solexa、 Illumina Hiseq 2000 )进行测序；

6 )根据标签引物组的标签引物序列，或者根据标签引物组的标签引物序列以及接头的特征序列，将测序结果与样品一一对应；其中所述样品优选是脱落细胞，且优选来源于动物，例如人。在优选的实施方案中，本发明的方法使用至少 10个，优选至少 20个、至少 30个、至少 40个、至少 50个、至少 60个、至少 70个、至少 80个、至少 90个或 95个上文描述的标签引物组。进一步优选地，所使用的标签序列至少包括 SEQ ID NO: 1-10，或 SEQ ID NO: 11-20 , 或 SEQ ID NO: 21-20 , 或 SEQ ID NO: 31-40 , 或 SEQ ID NO: 41-50 , 或 SEQ ID NO: 51-60 , 或 SEQ ID NO: 61-70 , 或 SEQ ID NO: 71-80 , 或 SEQ ID NO: 81-90 , 或 SEQ ID NO: 91-95 所示的标签序列，或者它们任何两个或者多个的组合，例如 SEQ ID NO: 1-95所示的标签序列。

在本发明的方法的一个优选实施方案中，本发明的方法使用至少 1种，优选至少 2种、至少 10种、至少 20种、至少 30种、至少 40种、至少 50种、至少 100种或至少 200种接头，例如所述接头可具有选自 SEQ ID NO: 121-132的序列。

在本发明的方法的一个优选实施方案中，在测序后，将获得的样品序列与上文描述的 HPV数据库中的序列进行对比，从而对样品进行 HPV精确分型。

在本发明的另一个方面，本发明基于 So lexa测序法提供了用于对多个样品进行高通量 HPV测序、检测或分型的方法，所述样品优选是脱落细胞，且优选来源于动物，例如人，所述方法包括下列步骤：

1 ) 将待分析的样品分成 m个小组， m为 > 1的整数；

2 ) 对每个样品小组进行如下步骤：

2a )从待分析的样品中提取 DM;

2b )根据用于扩增 HPV DNA的引物组中的所有引物的序列，设计一套标签，标签的个数 n等于该样品小组的样品数目；

2c )将 2b ) 中设计的每一个标签分别添加至引物组的所有正向引物或所有反向引物或所有引物的序列的 5'末端，从而提供 n 个标签引物组；

2d )使用 2c ) 中提供的标签引物组对 2a ) 中获得的样品 DNA 进行 PCR扩增，从而提供 PCR产物，其中针对每个样品 DNA，使用不同的标签引物组；和

2e )将 2d ) 中的所有 PCR产物混合在一起，获得 PCR产物文库；

3 )给 2 ) 中得到的 PCR产物文库加上接头，其中各个 PCR产物文库使用不同的接头，从而构建 m个测序文库，其中各个接头共有相同的测序序列，而具有互不相同的特征序列；

4 ) 将 m 个测序文库混合在一起，利用二代测序技术，优选 Pair-End技术 (例如 Solexa、 Illumina Hiseq 2000 )进行测序；得到所有样品的测序结果；

5 )根据测序结果中的接头的特征序列、标签的序列以及引物的序列，将获得的测序结果与样品——对应；和任选地，将每个样品的测序结果与 HPV数据库进行比对，从而实现 HPV测序、检测或分型。在一个优选实施方案中，使用本领域技术人员熟知的方法进行 DNA提取。例如，可以使用自动化的 DNA提取仪和 DNA提取试剂盒进行 DNA提取，例如可商购获得的 KingFi sher 自动提取仪，例如美国 Thermo Scientific Kingfisher Flex全自动磁珠提取纯化系统。

在一个优选的实施方案中， 2b)中的引物组包含 11条引物，其序列分别如 SEQ ID NO: 96-106所示。这 11条引物组成的引物组可扩增出至少 16种大约 170bp的产物，其对应于 HPV基因组中最为保守的基因区（L1区）中的一段高度保守的 DNA序列。因此，通过对该扩增产物进行精确测序，可以实现 HPV的精确分型。

在又一个优选的实施方案中， 2b ) 中设计的标签的个数为至少 10个，优选至少 20个，至少 30个，至少 40个，至少 50个，至少 60个，至少 70个，至少 80个，至少 90个，或至少 100个。优选，标签可具有选自 SEQ ID NO: 1-95的序列。在优选的实施方案中，不同样品小组之间的所使用的标签可以相同或者不同。在优选的实施方案中，引入正向引物的标签与引入反向引物的标签可以相同或者不同。在特别优选的实施方案中， 2b ) 中设计的标签至少包括 SEQ ID NO: 1-10，或 SEQ ID NO: 11-20 , 或 SEQ ID NO: 21-20 , 或 SEQ ID NO: 31-40 , 或 SEQ ID NO: 41-50 , 或 SEQ ID NO: 51-60 , 或 SEQ ID NO: 61-70 , 或 SEQ ID NO: 71-80 , 或 SEQ ID NO: 81-90 , 或 SEQ ID NO: 91-95所示的标签，或者它们任何两个或者多个的组合。在特别优选的实施方案中， 2b ) 中设计的标签如 SEQ ID NO: 1-95所示。

在一个优选的实施方案中，使用 PCR-FREE方法，给 PCR产物文库加上接头，例如使用 DNA连接酶。特别地，在本发明的方法中，由于不同 HPV类型之间的 DNA序列高度相似，因此，本发明的测序文库的构建必须通过 PCR-FREE方法来完成。相反，如果通过采用常规的 pool ing PCR将接头连接至 PCR产物上来构建测序文库，那么所得到的文库中将含有大量的与原模板不一致的产物，导致不能对原模板进行准确测序。在一个优选的实施方案中，使用的接头的数目为至少 1种，优选至少 2种、至少 10种、至少 20种、至少 30种、至少 40种、至少 50种、至少 100种或至少 200种，例如所述接头可具有选自 SEQ ID NO: 121-132的序列。

在本发明的方法的优选实施方案中，接头是可商购获得的接头，例如可购自 I l lumina公司的 PCR- free Index Adapter 01 igo Mix。在另外的实施方案中，本发明也可使用下列 PCR- free接头 (下划线部分为接头的特征序列）。

PCR-free接头 1 ( SEQ ID NO: 121 ) ： ATCACG

TTG

PCR-free接头 2 ( SEQ ID NO: 122 ) ： CGATGT

TTG

PCR-free接头 3 ( SEQ ID NO :123 ) ： TTAGGC

TTG

PCR-free接头 4 ( SEQ ID NO:124 ) ： TGACCA

TTG

PCR-free接头 5 ( SEQ ID NO: 125 ) ： ACAGTG TTG

PCR-free接头 6 ( SEQ ID NO: 126 ) ： GCCAAT

TTG

PCR-free接头 7 ( SEQ ID NO: 127 ) ： CAGATC

TTG

PCR-free接头 8 ( SEQ ID NO: 128 ) ： ACTTGA

TTG

PCR-free接头 9 ( SEQ ID NO: 129 ) ： GATCAG

TTG

PCR-free接头 10 ( SEQ ID NO:130 ) ： TAGCTT

TTG

PCR-free接头 11 ( SEQ ID NO: 131 ) ： GGCTAC

TTG

PCR-free接头 12 ( SEQ ID NO: 132 ) ： CTTGTA

5-F

TG 在一个优选的实施方案中，本发明的方法使用 Solexa测序仪 (例: ί (口， Illumina Genome Analyzer II x '测序仪）进行 Solexa测序法。在另外的优选的实施方案中， HPV 数据库包含本领域已知的 HPV类型的序列，所述序列例如可见于例如公共数据库，例如 NCBI数据库 ( ht tp: //www. ncbi. nlra. nih. gov/ ) 。

在本发明的方法的一个优选实施方案中，样品可以是脱落细胞。在另一个优选实施方案中，样品可以来源于动物，优选哺乳动物，更优选人。发明的有益效果

本发明的新型的 HPV检测方法和用于此的试剂盒相对于现有技术具有以下有利方面。

1 )高通量。通过使用标签与具有不同特征序列的接头，进行一次本发明的方法，可检测甚至 10000份样品，从而本发明的方法可以广泛用于疾病普查工作，成为早期诊断疾病的有效手段。

2 )低成本。本发明采用 So lexa测序法进行测序，测序成本大大降低（仅为常规测序法的 1% )，从而 HPV检测成本大大降低。

3 )可对 HPV进行精确分型。通过使用多条引物（例如本发明的 6条正向引物和 5条反向引物）进行扩增，并将扩增产物的序列信息与 HPV数据库进行比对，可以精确地确定 HPV的类型，从而为临床诊断和治疗方案选择提供依据。

另外，使用本发明的方法还有利于发现新的 HPV类型，包括已有的类型中的新的亚型和变异体，为科学研究提供更有效和方便的工具。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。附图说明

图 1为经标签和具有独特的特征序列的接头标记后的 PCR产物的示意图。在本发明的示例性方法中，通过 PCR在每个样品的 PCR产物两端同时引入标签；把多个带有不同标签的 PCR产物混合在一起，用于构建测序文库。在测序文库的构建过程中，当需要时，可以构建多个测序文库时，其中通过使用具有不同特征序列的接头，来标记各个测序文库。文库构建完毕后，经具有不同特征序列的接头标记的多个测序文库可以混合在一起，并用 So l exa测序法进行同时测序（不同的测序文库之间所使用的标签可以相同或不同）。最后，根据测序结果中的接头的特征序列和标签的序列信息，可将测序结果与每个样品对应。

图 2为部分 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。从电泳图上可观察到， PCR产物条带的大小为约 17 Obp。其中，泳道 M是 50bp DNA 分子梯，泳道 1-14为随机挑选的 HPV阳性样本的 PCR产物。具体实施方式

釆用本发明的方法，对 190份已知 HC- II结果的样品进行 HPV 基因分型，结果发现：采用本发明的方法所得的结果不仅与已知的 HC- II结果一致，而且实现了对 HPV的精确分型。

实施例 1 : 样品提取

根据厂商的说明书，使用 KingF i sher 自动提取仪（美国 Thermo Scientific Kingfisher Flex全自动磁珠提取纯化系统）从

190 份已知 HC- Π结果的脱落细胞中提取 DNA。使用程序 "Bioeasy— 200μ1 Blood DNA_ F. msz" , 进行核酸提取。程序结束后，获得 Ι ΟΟμΙ左右的洗脱产物（提取的 DNA ) ，用作下一步 PCR扩增中的模板。

实施例 2: PCR扩增

把实施例 1 中获得的 190份 DNA依次编号为 1-190，并平均分为 2组（HPV-1组：编号 1-95; HPV-2组：编号 96-190 ) 。才艮据用于扩增 HPV DNA的引物组（包括 6条正向引物和 5条反向引物）的各条引物的序列（表 2， SEQ ID NO: 96-107 ) ，设计一套标签，共 95个（表 1， SEQ ID NO: 1-95 ) 。将设计的每一个标签分别添加至引物组的各条引物的序列的 5'末端，从而获得 95 个标签引物组，其中每个标签引物组包括相应的 6条正向标签引物和 5条反向标签引物，并且不同的标签引物组使用不同的标签 (即， 95个标签引物组与 95个标签——对应）。

在 96孔板中对所有样品进行 PCR反应，共使用 2块板（HPV-1 组和 HPV- 2组各 1块板）。使用实施例 1中获得的 DNA作为模板，并且在 HPV-1组和 HPV-2组（各 95个样品）中，针对每个样品，使用不同的标签引物组进行 PCR扩增（即， 95个样品与 95个标签引物组一一对应）。记录下每一个标签引物组（每一个标签）对应的样品的编号信息。每块板中还设置一个不添加模板的阴性对照。 2块板中的阴性对照所用的引物分别与样品 1和样品 96所用的引物相同。表 1: 标签与样品的相关信息。

PI-21 TATGTGTACT B9 21 116 21

TGACTCAGAC BI O 22 117 22

PI-23 TCGTAGCTCA Bl l 23 118 23

PI-24 GAGACTCGTA B12 24 119 24

PI-25 CTAGATGTCA CI 25 120 25

PI- 26 GATGACTCTC C2 26 121 26

PI-27 TCAGTCGCAC C3 27 122 27

PI-28 TGTAGTGAGT C4 28 123 28

PI- 29 TCATCGTAGA C5 29 124 29

PI-30 TAGCATCTGT C6 30 125 30

PI-31 TAGTAGTCGT C7 31 126 31

PI-32 CTATACGTGC C8 32 127 32

PI-33 CGACTGTAGA C9 33 128 33

PI- 34 GATGTCATGT CI O 34 129 34

PI- 35 GTCTCGACTG Cl l 35 130 35

PI-36 AGCTGACGAT C12 36 131 36

PI- 37 ATGATATAGT Dl 37 132 37

PI-38 ATGTGCTCTA D2 38 133 38

PI-39 CTCACTCGAT D3 39 134 39

PI- 40 GCTGCGACTC D4 40 135 40

PI-41 GAGTCATGTC D5 41 136 41

PI-42 CATACGCTCA D6 42 137 42 PI - 43 CACTCTCGTC D7 43 138 43

PI-44 GCACTAGATG D8 44 139 44

PI-45 AGTACGCATG D9 45 140 45

PI-46 TCTGTGACGT D10 46 141 46

PI-47 TAGCTCATCT Dl l 47 142 47

PI-48 AGCATACACT D12 48 143 48

PI-49 GCTATAGTCA El 49 144 49

PI-50 CGTCTCATGC E2 50 145 50

PI- 51 GCTACTACGT E3 51 146 51

PI-52 GAGTGTACTA E4 52 147 52

PI-53 GTCATACGTG E5 53 148 53

PI- 54 TATGAGAGAT E6 54 149 54

PI-55 ATCTGAGTAC E7 55 150 55

PI- 56 CGATAGCATC E8 56 151 56

PI-57 ACTGATCTCA E9 57 152 57

PI- 58 CTCGATACTA E10 58 153 58

PI-59 CATGTGACTG El l 59 154 59

PI-60 CGCATCACTA E12 60 155 60

PI - 61 GCATATATCT Fl 61 156 61

PI-62 CTGATGCGAC F2 62 157 62

PI- 63 TCTCAGAGTC F3 63 158 63

PI-64 CAGTGCGAGT F4 64 159 64 - \z -

CC8lOO/OTOZN3/X3d TSIOOO/ZIOZ O/A PI-87 CGCTAGACAT H3 87 182 87

PI- 88 CGTAGATATG H4 88 183 88

PI-89 TGAGTCTGCT H5 89 184 89

PI-90 TAGTCGTATG H6 90 185 90

PI-91 CATACACGAC H7 91 186 91

PI- 92 CGCTCAGAGA H8 92 187 92

PI- 93 GTGAGTCTCA H9 93 188 93

PI-94 GACAGATGAT H10 94 189 94

PI-95 GCTGTGCGAC Hl l 95 190 95

表 2 : 未添加标签的用于扩增 HPV DNA的引物组的各条引物的序列信息。

注： F表示正向引物， R表示反向引物。

使用下列 PCR参数进行扩增：

95°C 30秒 " 48°C 30秒 30秒（40个循环）

72°C 10分钟 12°C oo

PCR反应体系为 25μ1,其组成是（所有试剂均购自 Enzymatics 公司）：

PCR反应在 Bio-Rad公司的 PTC- 200 PCR仪上运行。 PCR完成后，取 3μ1 PCR产物在 2.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测（图 2)。实施例 3: PCR产物的混合和纯化

把 HPV-1组与 HPV-2组中剩余的 PCR产物各混合在一个 3ml 的 EP管中（同样标记为 HPV-1组和 HPV-2组），并震荡混勾。从 2 管混合物中各取出 500μ1 DNA, 并根据厂商的说明书，使用 Qiagen DNA Purification试剂盒进行过柱纯化，得到 200μ1 DNA_D 使用 Nanodrop 8000 (Thermo Fisher Scientific 公司），测定纯化后的混合物的 DNA浓度分别为 98 ng/μΐ ( HPV-1组）和 102 ng/μΐ ( HPV-2组）。实施例 4: Solexa测序文库的构建

4.1: 末端修复反应

使用 Thermomixer(Eppendorf 公司），对实施例 3中获得的经纯化的两管 DNA混合物分别进行 DNA末端修复反应。修复反应的反应体系为 ΙΟΟμΙ，其组成是（所有试剂均购自 Enzymatics公司）:

反应奈件为： 20°C， 30分钟。

才艮据厂商的说明书，使用 QIAquick PCR Pur if icat ion试剂盒纯化并回收 DNA末端修复反应的产物。回收的产物溶于 34 μΐ ΕΒ (QIAGEN Elution Buffer ) 中。

4.2: 3'末端加 A反应

使用 Thermomixer (Eppendorf 公司），对回收的 D 进行 V 末端加 A 反应。反应体系为 50ul，其组成是（所有试剂均购自 Enzymat ics公司 ) ：试剂体积 /反应

上一步所得的 DM 32μ1

dATP (ImM, GE公司） ΙΟμΙ

10x Blue缓冲液 5μ1

3μ1

o 总体积 50μ1

1

反应条件为： 37'C， 30O分钟。

才艮据厂商的说明书，使用 o

1 MiniElute PCR Purification Kit (QIAGEN公司）纯化并回收 3'末端加 A反应的产物。回收的产物溶于 20 μΐ的 EB中。

4.3: 添加 Solexa接头

使用 Thermomixer(Eppendorf 公司），对上一步获得的 2种产物分别添加不同的接头以构建 2个测序文库。记录下接头和文库的对应关系。

添加 Solexa接头的反应体系为 50ul，其组成是（所有试剂均购自 Illumina公司）：

反应条件为： 20°C， 15分钟。根据厂商的说明书，使用 Ampure Beads (Beckman Coulter Genomics)纯化反应产物并将产物溶于 17μ1 去离子水。使用 Agilent Bioanalyzer 2100( Agilent公司）和荧光定量 PCR( QPCR ) 测定产物的 DNA浓度，结果如下：

实施例 5: Solexa测序

以 Agilent Bioanalyzer 2100所测浓度为准，将上一步所得的 2种产物等摩尔混合在一起（各取 lOpmol DNA) 。根据厂商的说明书，使用 Solexa ϋ则序仪 ( Illumina Genome Analyzer II x 序仪），用 Solexa PE-75程序进行测序。实施例 6: 结果分析

根据测序结果中的接头的特征序列以及标签引物（标签部分和引物部分）的序列的信息，将测序结果与每个样品——对应。然后，使用本领域已知的比对程序，例如 BLAST和 S0AP，将每个样品的测序结果与 HPV数据库进行比对，从而实现 HPV检测，并对 HPV进行精确分型。

所得到的检测结果与已知的结果完全一致（参见表 3) ，表明本发明方法可以用于精确检测样品中的 HPV。表 3: 190个样品的检测结果。

- 83 -

CC8T00/010ZN3/X3d ISIOOO/ZIO OAV

〇/_}ίAV ϊ£ϊοοοπ:3/£/οϊοίζ1 εε8ϊοο

76 602. 79 HPV45 171 126. 47 HPV51

77 276 HPV16 172 86. 62 HPV44 , HPV11

78 243. 6 173 879. 37 HPV18 , HPV58

79 229. 44 HPV35 174 119. 39 HPV56

80 1384. 92 HPV52 , HPV56 , HPV11 175 0. 61 阴性

81 172. 64 HPV26 , HPV42 176 18. 02 HPV16

82 855. 24 HPV35 , HPV6 177 16. 06 HPV18

83 620. 69 HPV52 178 60. 69 HPV56 , HPV 11

Q.-

84 128. 02 HPV 11 - 179 2. 45 HPV11

85 514. 84 HPV33 180 94. 93 HPV39

86 68. 3 HPV58 181 1635. 3 HPV16 , HPV35 , HPV51

87 402. 15 HPV59 , HPV16 182 754. 64 HPV33 , candHPV89

88 51. 72 HPV 33 183 0. 23 HPV11

89 1. 78 HPV6 184 20. 28 HPV18

90 56. 7 HPV11 , HPV31 185 0. 16 阴性

91 186. 06 HPV16 186 0. 13 阴性

92 0. 02 阴性 187 60. 18 HPV59

93 386. 06 HPV18 , HPV16 188 0. 15 阴性

94 28. 09 HPV6 , HPV44 189 1. 36 HPV43

95 186. 06 HPV68, 190 0. 28 阴性此外，本发明的方法还可以对样品中的 HPV进行精确分型。

表 4中提供了图 2所示的泳道 1-14所对应的样品的测序序列和型结果。图 2所示的泳道 1-14所对应的样品的测序序列和分型结果。

的的详详细细内内容容的的专专利利、、出出版版物物和和其其他他材材料料通通过过引引用用合合并并入入本本文文，，并并且且为为方方便便起起见见按按下下列列文文献献目目录录提提供供。。

[[11]] .. PPeeccttaass iiddeess DD,, KKaannppooss iioorraass KK，， PPaappaaxxooiinniiss GG eett aall.. CChheemmootthheerraappyy ffoorr rreeccuurrrreenntt cceerrvviiccaall ccaanncceerr.. CCaanncceerr TTrreeaattmmeenntt RReevviieewwss,, 22000088,, 3344((77)):: 660033--661133..

[[22]] .. BBrriinnkk,, AA.. AA.. ,, PP.. JJ.. SSnnii jjddeerrss,, aanndd CC.. JJ.. MMeeii jjeerr.. HHPPVV ddeetteeccttiioonn mmeetthhooddss.. DDiiss.. MMaarrkkeerrss 22000077，， 2233:: 227733--228811..

[[33]] .. IIAARRCC.. HHaannddbbooookkss ooff ccaanncceerr pprreevveenntt iioonn.. CCeerrvviixx ccaanncceerr ssccrreeeenniinngg [[RR]] .. LLyyoonn:: IIAARRCC PPrreessss,, 22000055..

MMoolleeccuullaarr bbiioollooggyy ooff hhuummaann papillomavirus infection and cervical cancer. Clin. Sci.2006, 110: 525-541.

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Lab Med, 2003, 127: 991-994.

Claims

权利要求

1. 用于对一个或多个样品进行 HP V测序、检测或分型的方法，其包括下列步骤：

1 ) 对于每一个样品，使用一个标签引物组对样品的 DNA进行扩增，其中

i )所述标签序列选自 SEQ ID NO: 1-95, 并且所述 11种标签引物的每一种的标签序列都相同，和 ii ) 所述 11种标签引物的 PCR引物序列分别如 SEQ ID NO: 96-106所示，

3 )通过 PCR-FREE方法，例如 DNA连接酶法给步骤 2 ) 中获得的一个或多个 PCR产物文库分别添加接头，从而构建一个或多个测序文库，其中不同的测序文库所使用的接头可以相同或者不同，且不同的接头共有相同的测序序列，但具有不同的特征序列；

4 )任选地，将步骤 3 ) 中获得的使用不同接头的测序文库混合在一起，得到一个或多个文库混合物；

5 )对步骤 3 )中获得的一个或多个测序文库或步骤 4 )中获得的一个或多个文库混合物分别利用二代测序技术，优选 Pair-End 技术列: ¾。Solexa、 Illumina Hiseq 2000 )进行泖】序；； 6 )根据标签引物组的标签引物序列，或者根据标签引物组的标签引物序列以及接头的特征序列，将测序结果与样品一一对应; 其中所述样品优选是脱落细胞，且优选来源于动物，例如人。

2. 权利要求 1的方法，其中步骤 1 ) 中使用至少 10个，优选至少 20个、至少 30个、至少 40个、至少 50个、至少 60个、至少 70个、至少 80个、至少 90个或 95个标签引物组，优选所使用的标签序列至少包括 SEQ ID NO: 1-10，或 SEQ ID NO: 11-20，或 SEQ ID NO: 21-20，或 SEQ ID NO: 31-40, 或 SEQ ID NO: 41-50, 或 SEQ ID NO: 51-60, 或 SEQ ID NO: 61-70，或 SEQ ID NO: 71-80, 或 SEQ ID NO: 81-90，或 SEQ ID NO: 91-95所示的标签序列，或者它们任何两个或者多个的组合。

3. 权利要求 1或 2的方法，其中步骤 3 ) 中使用至少 1种，优选至少 2种、至少 10种、至少 20种、至少 30种、至少 40种、至少 50 种、至少 100种或至少 200种接头，例如所述接头可具有选自 SEQ ID NO: 121-132的序列。

4. 权利要求 1的方法，其还包括将所述样品的测序结果与 HPV 数据库的序列进行对比，以对样品进行 HPV精确分型。

5. 用于对多个样品进行高通量 HP V测序、 ^：测或分型的方法，所述样品优选是脱落细胞，且优选来源于动物，例如人，所述方法包括下列步骤：

1 )将待分析的样品分成 m个小组， ^1为 > 1的整数；

2 ) 对每个样品小组进行如下步骤： 2a )从待分析的样品中提取 DNA;

2b )根据用于扩增 HPV DNA的引物组中的所有引物的序列，设计一套标签，标签的个数 _n等于该样品小组的样品数目；

2e ) 将 2b ) 中设计的每一个标签分别添加至引物组的所有正向引物或所有反向引物或所有引物的序列的 5'末端，从而提供 n 个标签引物组；

2d )使用 2c ) 中提供的标签引物组对 2a ) 中获得的样品 DNA 进行 PCR扩增，从而提供 PCR产物，其中针对每个样品 DNA, 使用不同的标签引物组；和

2e ) 将 2d ) 中的所有 PCR产物混合在一起，获得 PCR产物文库；

3 ) 给 2 ) 中得到的 PCR产物文库加上接头，其中各个 PCR产物文库使用不同的接头，从而构建 m个测序文库，其中各个接头共有相同的测序序列，而具有互不相同的特征序列；

4 )将 m个测序文库混合在一起，利用 Solexa或 Illumina Hiseq 2000测序法进行测序，得到所有样品的测序结果；

5 )根据测序结果中的接头的特征序列、标签的序列以及引物的序列，将获得的测序结果与样品——对应；和任选地，将每个样品的测序结果与 HPV数据库进行比对，从而实现 HPV测序、检测或分型。

6. 权利要求 5的方法，其中 2b)中的引物组包含 11条引物，其序列分别如 SEQ ID NO: 96-106所示。

7. 权利要求 6的方法，其中 2b)中设计的标签可具有选自 SEQ ID NO: 1-95的序列，且优选至少包括 SEQ ID NO: 1-10，或 SEQ ID NO: 11-20, 或 SEQ ID NO: 21-20, 或 SEQ ID NO: 31-40, 或 SEQ ID NO: 41-50，或 SEQ ID NO: 51-60, 或 SEQ ID NO: 61-70, 或 SEQ ID NO: 71-80, 或 SEQ ID NO: 81-90，或 SEQ ID NO: 91-95所示的标签，或者它们任何两个或者多个的组合。

8. 权利要求 7的方法，其中 3 ) 中可使用至少 2种、优选至少 10 种、至少 20种、至少 30种、至少 40种、至少 50种、至少 100种或至少 200种接头，例如所述接头可具有选自 SEQ ID NO: 121-132的序列。