WO2011162320A1 - Egcgまたはメチル化egcgとpde阻害剤との組み合わせ - Google Patents

Egcgまたはメチル化egcgとpde阻害剤との組み合わせ Download PDF

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Abstract

　エピガロカテキンガレートまたはメチル化エピガロカテキンガレート、またはその医薬的に許容される塩と、ホスホジエステラーゼ阻害剤と、を組み合わせたことを特徴とする薬剤。

Description

EGCGまたはメチル化EGCGとPDE阻害剤との組み合わせ
　本発明は、疾患、特に悪性腫瘍、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症及び筋萎縮等の疾患の予防または治療において有用な、エピガロカテキンガレート（Epigallocatechin gallate、以下「EGCG」と称することもある）またはメチル化エピガロカテキンガレート（以下「メチル化EGCG」と称することもある）とホスホジエステラーゼ（以下「PDE」と称することもある）阻害剤との組み合わせに関する。
　がんは国民の死因の三分の一を占める病であり、適切な治療手段の確立が強く求められている。血液のがんとして知られている白血病において、オールトランスレチノイン酸（ATRA）を用いた分化誘導療法やフィラデルフィア染色体を起因とするBCR/ABLタンパクに対する分子標的薬の導入により治療業績が改善しつつある。しかしながらこれらの薬剤に対して腫瘍が抵抗性を獲得し、治療が困難となるケースが非常に多く、未だ問題点が多い。よって従来とは全く異なった作用機作を持つ抗がん剤を開発することは従来の抗がん剤が効奏しなくなった患者に新たな選択肢を提供する。さらに、その用量規定毒性が異なったものであれば、従来の治療と組み合わせることが可能であり、より有効な治療戦略の立案が可能となる。
　緑茶に含まれる主要なカテキンの一種であるEGCGは抗がん作用を持つことが報告されており、現在慢性リンパ性白血病患者において臨床試験が行われている（非特許文献１及び２）。発明者らはこれまでにEGCGの抗がん作用を担う細胞膜上の標的分子として67 kDa Laminin Receptor（67LR）を同定した（非特許文献３～６）。この67LRは当初、基底膜の主要な構成成分であるラミニンと結合する細胞膜タンパク質として発見されたが（非特許文献７）、近年の研究において、67LRはがん細胞において発現が異常に亢進しており（非特許文献８）、その発現と増殖、浸潤、転移の間に強い相関が認められている（非特許文献９から１５）。リンパ球においても、67LRは正常リンパ球にはほとんど発現せず、白血病細胞において高発現しているという報告が数多くなされている（非特許文献１６及び１７）。最近、EGCGは67LRを介して選択的に白血病細胞のみを死滅させることが報告され（非特許文献１６及び１７）、EGCGが67LR陽性の白血病細胞に対する分子標的剤となりうることが示された。しかしながらEGCGの白血病細胞に対する致死作用は限定的であり（非特許文献２）、EGCGを抗がん剤として利用する上でその作用増強が強く望まれている。
　EGCGは67LRを介して、さらに、抗アレルギー作用（非特許文献１８～２０）、抗肥満作用（非特許文献２１及び２２）、抗動脈硬化作用（非特許文献２３）、抗炎症作用（非特許文献２４）及び筋萎縮阻害作用（非特許文献２５）等の作用を奏することが知られているが、その臨床への適用という点から、その作用増強が強く望まれている。
　また、メチル化EGCGも抗がん作用（特許文献１）及び抗アレルギー作用（非特許文献２６）等を奏することが知られているが、やはりその作用増強が強く望まれている。
国際公開第２００９／１０７２６２号
Cancer res, 2006;66:2500-2505 J Clin Oncol, 2009;27:3808-3814 Nat Struct Mol Biol, 2004;11:380-381 Biochem Biophys Res Commun, 2005;333:628-635 Biochem Biophys Res Commun, 2008;371:172-176 J Biol Chem, 2008;283:3050-3058 Biosci Rep, 2008;28:33-48 J Natl Cancer Inst, 1991;83:29-36 J Cell Biochem, 1997;67:155-165 Breast Cancer Res Treat, 1998;52:137-145 Cancer, 1993;72:455-461 J Pathol, 1996;179:376-380 Brain Res Bull, 2009;79:402-408 Clin Cancer Res, 1997;3:227-231 Clin Cancer Res, 1996;2:1777-1780 Br J Haematol, 2010;149:55-64 Blood, 2006;108:2804-2810 Biochem. Biophys. Res. Commun. 336, 674-681 (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 524-531 (2006) Arch. Biochem. Biophys. 76, 133-138 (2008) Am J Physiol Cell Physiol. 297, C121-132 (2009) Mol Nutr Food Res. 53, 349-360 (2009) J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 1138-1145 (2010) J. Immunol., 185, 33-45 (2010) Biofactors. 35, 279-29 (2009) Biochem. Biophys. Res. Commun. 364, 79-85 (2007)
　本発明者らは最近、EGCGの多発性骨髄腫細胞株に対する致死作用において、67LRを介したNO産生が重要であることを見出した(後記参考文献18)。そこで、NOに起因するシグナル伝達経路を促進することにより、EGCGの抗がん作用を増強できるのではないかと考えた。cGMPはNOのシグナル伝達において重要な役割を果たすメディエーターであり(後記参考文献19)、cGMPの分解酵素であるホスホジエステラーゼを阻害することで、NOのシグナル伝達が促進されることが知られている。
　ホスホジエステラーゼは生体内において重要なセカンドメッセンジャーであるcGMPやcAMPの分解に関与する酵素であり、循環器疾患(後記参考文献20)や男性の性機能障害である勃起不全症(後記参考文献21及び22)の創薬ターゲットとして注目されている。また、ホスホジエステラーゼ５（PDE5）が腫瘍において高発現していることも明らかになっている(後記参考文献23)。
　そこで、PDE阻害剤とEGCGを組み合わせることで、EGCGの抗がん作用が増強できるのではないかとの考えに至った。
　そして本発明者らは、PDE阻害剤とEGCGを組み合わせることでEGCGのがん細胞致死作用が増強されることを見つけ、本発明に至った。
　これまでにEGCGの抗がん作用を増強しようとする研究は数多くあるものの、PDE阻害と組み合わせることに着目した研究はなく、本発明により、それらの併用により抗がん作用が顕著に増強されることが示された。
　また、EGCGの抗がん作用には67LRが関係していることから、がんのみならず、EGCGが67LRを介して作用を発揮することが知られている疾患等に対しても、PDE阻害剤との組み合わせが有効であると考えられる。
　本発明の要旨は以下の通りである。
［１］エピガロカテキンガレートまたはメチル化エピガロカテキンガレート、またはその医薬的に許容される塩と、ホスホジエステラーゼ阻害剤と、を組み合わせたことを特徴とする薬剤；
［２］がん、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症または筋萎縮の治療で使用するための［１］に記載の薬剤；
［３］67LR陽性の疾患の治療で使用するための［１］または［２］に記載の薬剤；
［４］前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がホスホジエステラーゼ３阻害剤またはホスホジエステラーゼ５阻害剤である［１］～［３］のいずれか一つに記載の薬剤；
［５］前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がバルデナフィルである、［１］～［３］のいずれか一つに記載の薬剤；
［６］エピガロカテキンガレートまたはメチル化エピガロカテキンガレート、またはその医薬的に許容される塩と、とホスホジエステラーゼ阻害剤との組み合わせを患者に投与することを含む、がん、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症または筋萎縮の治療方法；
［７］ａ）エピガロカテキンガレートまたはメチル化エピガロカテキンガレート、またはその医薬的に許容される塩を含有する第一の単位剤形；
　ｂ）ホスホジエステラーゼ阻害剤を含有する第二の単位剤形；及び
　ｃ）前記第一の単位剤形及び第二の単位剤形を収容するための容器手段；
を含んでなる、がん、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症または筋萎縮の治療で使用するためのキット。
図１は、多発性骨髄腫細胞に対するEGCGの細胞致死作用(A)及び細胞増殖抑制作用(B)におけるPDE5阻害剤との組み合わせの効果を示す。 図２は、急性骨髄腫性白血病細胞に対するEGCGの細胞致死作用(A)及び細胞増殖抑制作用(B)におけるPDE5阻害剤との組み合わせの効果を示す。 図３は、多発性骨髄腫細胞に対するEGCGとPDE5阻害剤の細胞致死作用(A)及び細胞増殖抑制作用(B)における67LRの影響を示す。 図４は、急性骨髄性白血病細胞に対するEGCGとPDE5阻害剤の細胞致死作用(A)及び細胞増殖抑制作用(B)における67LRの影響を示す。 図５は、多発性骨髄腫細胞に対するEGCGとPDE5阻害剤のアポトーシス誘導活性における67LRの影響を示す。 図６は、急性骨髄性白血病細胞に対するEGCGとPDE5阻害剤のアポトーシス誘導活性における67LRの影響を示す。 図７は、ヒト前立腺がん細胞株PC3に対するEGCGの細胞致死作用(A)及び細胞増殖抑制作用(B)におけるPDE5阻害剤との組み合わせの効果を示す。 図８は、ヒト多発性骨髄腫細胞株RPMI8226に対するEGCGの細胞致死作用及び細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤との組み合わせの効果を示す。 図９は、患者由来多発性骨髄腫に対するEGCGの細胞致死作用及び細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤との組み合わせの効果を示す。 図１０は、ヒト形質細胞腫ARH77に対するEGCGの細胞致死作用及び細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤との組み合わせの効果を示す。 図１１は、慢性骨髄性白血病細胞株K562に対するEGCGの細胞致死作用及び細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤との組み合わせの効果を示す。 図１２は、ヒト乳がん細胞株MCF-7に対するEGCGの細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤との組み合わせの効果を示す。 図１３は、ヒト胃がん細胞株MKN45に対するEGCGの細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤との組み合わせの効果を示す。 図１４は、ヒト膵臓がん細胞株PANC-1に対するEGCGの細胞致死作用及び細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤との組み合わせの効果を示す。 図１５は、ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECの生存率および細胞増殖に対するEGCGとPDE5阻害剤との組み合わせの効果を示す。 図１６は、健常者由来末梢血リンパ球の生存率および細胞増殖に対するEGCGとPDE5阻害剤との組み合わせの効果を示す。 図１７は、Balb/cマウスに移植したマウス形質細胞腫細胞株MPC11の腫瘍形成に対するEGCGとPDE5阻害剤との組み合わせの効果を示す。 図１８は、ヒト多発性骨髄腫細胞株U266に対するメチル化EGCGとPDE5阻害剤との組み合わせの効果を示す。 図１９は、前立腺がん細胞株PC-3および膵臓がん細胞株PANC-1に対するメチル化EGCGとPDE5阻害剤との組み合わせの効果を示す。 図２０は、慢性骨髄性白血病細胞株K562に対するEGCGの細胞増殖抑制作用におけるPDE3阻害剤との組み合わせの効果を示す。
　本発明によれば、エピガロカテキンガレート又はその医薬的に許容される塩、又はメチル化エピガロカテキンガレート又はその医薬的に許容される塩と、ホスホジエステラーゼ阻害剤とを組み合わせたことを特徴とする、疾患の治療での使用に適した薬剤が提供される。また、本発明によれば、EGCG又はその医薬的に許容される塩、又はメチル化EGCG又はその医薬的に許容される塩と、PDE阻害剤との組み合わせを患者に投与することを含む、疾患の治療方法が提供される。本発明は特に、がん、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症及び筋萎縮等の疾患、又は、67LR陽性の疾患の治療に有用である。
　本明細書において、「組み合わせ」という用語は、組み合わせの各成分が、同時に、連続的に、または個別に、患者に投与されることを想定している。したがって、本発明のEGCG又はメチル化EGCG、又はその医薬的に許容される塩と、PDE阻害剤とを組み合わせた薬剤は、一つの単位剤形中にその二つの成分が含有されている形態の薬剤であってもよく、または、EGCG又はメチル化EGCG、又はその医薬的に許容される塩を含有する第一の単位剤形と、PDE阻害剤を含有する第二の単位剤形とを組み合わせた形態の薬剤であってもよい。
　本明細書において、「67LR陽性の疾患」とは、白血病細胞において67LRが高発現しているというような、その疾患の部位（細胞）において67LRの発現が異常に亢進している疾患をいう。
　EGCG（（－）－エピガロカテキン－３－Ｏ－ガレート）は緑茶葉等に含有されるポリフェノール化合物の一種である。
　メチル化EGCGは、下記の式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 （式中、Ｒ１～Ｒ６はそれぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基又はメトキシ基を表し、且つ、Ｒ１～Ｒ６の少なくとも一つはメトキシ基を表す）の化合物である。例えば、Ｒ１～Ｒ６の一つがメトキシ基であり、他がヒドロキシル基である化合物、または、Ｒ１～Ｒ６の二つがメトキシ基であり、他がヒドロキシル基である化合物が挙げられる。具体的には、３”－Ｏ－メチル－エピガロカテキン－３－ガレート、４”－Ｏ－メチル－エピガロカテキン－３－ガレート、３”，４”－Ｏ－ジメチル－エピガロカテキン－３－ガレート、３”，５”－Ｏ－ジメチル－エピガロカテキン－３－ガレート、４’－Ｏ－メチル－エピガロカテキン－３－ガレート、４’，４”－Ｏ－ジメチル－エピガロカテキン－３－ガレート、４’，３”，４”－Ｏ－トリメチル－エピガロカテキン－３－ガレート、４’，３”，５”－Ｏ－トリメチル－エピガロカテキン－３－ガレート、３’，５’－Ｏ－ジメチル－エピガロカテキン－３－ガレート、３’，５’，４”－Ｏ－トリメチル－エピガロカテキン－３－ガレート、３’，５’，３”，４”－Ｏ－テトラメチル－エピガロカテキン－３－ガレート、３’，５’，３”，５”－Ｏ－テトラメチル－エピガロカテキン－３－ガレート、３’，４’，５’－Ｏ－トリメチル－エピガロカテキン－３－ガレート、３’，４’，５’，４”－Ｏ－テトラメチル－エピガロカテキン－３－ガレート、３’，４’，５’，３”，４”－Ｏ－ペンタメチル－エピガロカテキン－３－ガレート、及び３’，４’，５’，３”，５”－Ｏ－ペンタメチル－エピガロカテキン－３－ガレート等である。メチル化EGCGは、EGCGと同様に、67LRを介してその各種作用を奏する。メチル化EGCGとしては、３”－Ｏ－メチル－エピガロカテキン－３－ガレート及び４”－Ｏ－メチル－エピガロカテキン－３－ガレートが好ましい。
　メチル化EGCGとしては、また、下記の式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （式中、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ独立にヒドロキシル基又はメトキシ基を表し、且つ、Ｒ７及びＲ８の少なくとも一つはメトキシ基を表す）の化合物が挙げられる。具体的には、７－Ｏ－メチル－エピガロカテキン－３－ガレート等である。
　EGCG及びメチル化EGCGは、例えば、緑茶葉の抽出液から、ＨＰＬＣ、合成吸着剤クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びゲルろ過等の手法により単離することができる。また、EGCG及びメチル化EGCGは公知の方法で合成することもできる。
　本発明において、EGCG及びメチル化EGCGは、その医薬的に許容される塩として用いることもできる。医薬的に許容される塩としては、例えば、アルカリ金属（ナトリウム、カリウム及びリチウム等）との塩、及びアルカリ土類金属（カルシウム及びマグネシウム等）との塩が挙げられる。塩は、例えば、EGCG又はメチル化EGCGとアルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物又は水素化物とを反応させて製造することができる。
　ホスホジエステラーゼ阻害剤は、cAMP及びcGMP等の環状リン酸ジエステルを加水分解する酵素を阻害する物質であり、非選択的なPDE阻害剤と選択的なPDE阻害剤とが知られている。本発明では、非選択的なPDE阻害剤及び選択的なPDE阻害剤のいずれも用いることができる。
　非選択的なPDE阻害剤としては、例えば、カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、３－イソブチル－１－メチルキサンチン（IBMX）及びペントキシフィリン（pentoxifylline）等が挙げられる。
　選択的なPDE阻害剤としては、例えば、８－メトキシ－３－イソブチル－１－メチルキサンチン等のPDE1阻害剤、エリスロ－９－（２－ヒドロキシ－３－ノニル）アデニン塩酸塩（EHNA hydrochloride）等のPDE2阻害剤、シロスタミド（cilostamide）、ミルリノン（milrinone）及びトレキシン（trequisin）等のPDE3阻害剤、エタゾラート塩酸塩（etazolate hydrochloride）及びデンブフィリン（denbufylline）等のPDE4阻害剤、及び、バルデナフィル（vardenafil）、シルデナフィル（sildenafil）、ザプリナスト（zaprinast）、タダラフィル（tadalafil）、ジピリダモール（dipyridamole）、４－｛［３’，４’－（メチレンジオキシ）ベンジル］アミノ｝－６－メトキシキナゾリン、及び１－（３－クロロアニリノ）－４－フェニルフタラジン（ＭＹ－５４４５）等のPDE5阻害剤が挙げられる。本発明では、PDE3阻害剤またはPDE5阻害剤が好ましく、そして、EGCG又はその医薬的に許容される塩とPDE5阻害剤との組み合わせ、または、EGCG又はその医薬的に許容される塩とPDE3阻害剤との組み合わせ、が好ましい。
　本発明は、EGCG又はその医薬的に許容される塩、又はメチル化EGCG又はその医薬的に許容される塩と、PDE阻害剤とを組み合わせることを特徴とする。そして、以下の実施例より理解されるように、これら二つの成分を組み合わせて用いることにより、それぞれ単独で用いた場合に比して、顕著に増強されたがん細胞に対する致死作用が示される。また、EGCGとPDE5阻害剤との併用による抗がん作用は完全に67LR依存的であり、67LR陰性の正常細胞に重大な副作用を及ぼすことなく67LR陽性のがん細胞に対して選択的に抗がん作用を発揮することが判った。
　したがって、本発明のEGCG又はその医薬的に許容される塩、又はメチル化EGCG又はその医薬的に許容される塩と、PDE阻害剤と、を組み合わせた薬剤はがんの治療に有用である。本発明の薬剤は、EGCGが67LRを介して抗がん作用を発揮するがん（例えば、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、前立腺がん、メラノーマ、乳がん、肺がん、子宮頸がん及び結腸がん）の治療に特に有用である。
　また、本発明は、PDE阻害剤を組み合わせることにより、EGCGまたはメチル化EGCGの作用が増強されるということに基づく。そのため、本発明の薬剤は、がんだけではなく、67LR陽性の疾患、または、EGCG又はメチル化EGCGがそれぞれ単独でも治療に有効な作用を奏する疾患、または、EGCG又はメチル化EGCGが67LRを介して治療に有効な作用を奏する疾患、例えば、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症及び筋萎縮等の疾患の治療に有用である。
　本発明の薬剤は、活性成分（EGCGまたはメチル化EGCG、またはその医薬的に許容される塩、またはPDE阻害剤）に医薬的に許容できる希釈剤又は担体を適用して製剤化し、投与に適した剤形として提供することができる。希釈剤又は担体としては、医薬的に許容されるものであれば特に制限はなく、例えば、結合剤、崩壊剤、酸味料、発泡剤、人工甘味料、香料、滑沢剤、着色剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤及び界面活性剤等が挙げられる。剤形には特に制限はなく、例えば、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤及び錠剤等の固形製剤、及び、水剤、懸濁剤及び乳剤等の液剤、等の形態で提供することができる。そして、これら製剤は、希釈剤又は担体を使用し、慣用的方法で製造することができる。
　投与されるEGCG又はメチル化EGCG、又はその医薬的に許容される塩の量、及びPDE阻害剤の量は、対象とする疾患に対して所望の治療効果を奏するに有効な量、例えば所望の抗がん作用を提供するために有効な量、である。
　EGCG又はメチル化EGCG、又はその医薬的に許容される塩の一日投与量としては、例えば、０．０１ｍｇ～５０００ｍｇであり、または０．１ｍｇ～５０ｍｇであり、または、０．５ｍｇ～２０ｍｇであり、または１．０ｍｇ～１０ｍｇである。
　PDE阻害剤の一日投与量としては、例えば、０．０１ｍｇ～２０００ｍｇであり、または０．１ｍｇ～５０ｍｇであり、または、０．５ｍｇ～２０ｍｇであり、または１．０ｍｇ～１０ｍｇである。
　また、PDE阻害剤の一日投与量は、EGCG又はメチル化EGCG、又はその医薬的に許容される塩の一日投与量１質量部について、例えば０．０１～１００質量部、又は０．１～１０質量部、又は０．５～５質量部、とすることができる。
　本発明のEGCG又はメチル化EGCG、又はその医薬的に許容される塩とPDE阻害剤とを組み合わせた薬剤は、がんの治療のために単独で用いてもよいし、または他の抗がん剤と組み合わせて用いてもよく、また、外科手術又は放射線治療と組み合わせてもよい。
　以下、実施例および比較例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［材料及び方法］
　（１）EGCGとPDE5阻害剤の組み合わせによる細胞増殖抑制作用及び細胞致死作用の検討
　ヒト多発性骨髄腫細胞株U266は10% ウシ胎児血清(FCS) (BIOLOGICAL INDUSTRIES)添加RPMI RPMI1640培地(NISSUI PHARMACEUTICAL Co. LTD.、東京)にて37℃、水蒸気飽和した5% CO2条件下で継代、維持した。細胞は対数増殖期で培養維持した。ヒト急性骨髄性白血病細胞株HL60は10% ウシ胎児血清(FCS)添加RPMI 1640培地にて37℃、水蒸気飽和した5% CO2 条件下で継代、維持した。細胞は対数増殖期で培養維持した。培養に使用したRPMI 1640培地は、超純水1LあたりRPMI 1640培地(コスモ・バイオ株式会社、東京)10.4g、HEPES(和光純薬工業株式会社、大阪)2.38g、注射用ペニシリンG カリウム 20万単位(明治製菓株式会社、東京) 0.5vial、硫酸ストレプトマイシン注射用 1g(明治製菓株式会社、東京) 0.1vial、NaHCO3(Nacalai tesque, Inc. Kyoto)2.0gを懸濁した後、フィルター滅菌した。その後、ウシ胎児血清(FCS)をRPMI 1640培地に添加し、細胞培養に使用した。
　トリパンブルー法によるEGCGとバルデナフィルの組み合わせによる抗がん作用の検討において用いたトリパンブルー(和光純薬)は、1%の濃度となるようにPBSに懸濁したものをトリパンブルー染色液とした。用いるPBSは超純水1Lに対し、NaCl(Nacalai tesque, Inc. 京都)8.0g、KCl(Nacalai tesque, Inc.、京都)0.2g、Na2HPO4(Nacalai tesque, Inc.、京都)1.15g、KH2PO(Nacalai tesque, Inc.、京都)0.2gを溶解し調製しオートクレーブ滅菌した。
　U266及びHL60を1% FCS含有RPMI 1640に5x104cells/mL(U266)及び1x104 cells/mL (HL60)となるようそれぞれ調整して24 well plate(FALCON社)に播種し、バルデナフィルが終濃度で5μMとなるよう添加した。用いたバルデナフィル(Toronto Research Chemicals Inc.)は10%ジメチルスルホキシド(DMSO)(Nacalai tesque, Inc.、京都)添加超純水にて5mMとなるように調整し、-30℃にて保存した。使用に際しては適宜解凍して用いた。
　バルデナフィルの添加後直ちにインキュベーターに戻し、3時間経過後、EGCG(Sigma)を終濃度で5μMとなるように添加した。用いたEGCGは10%ジメチルスルホキシド(DMSO)(Nacalai tesque, Inc.、京都)添加超純水にて5mMとなるように調整し、-30℃にて保存した。使用に際しては適宜解凍して用いた。
　EGCG添加後、直ちにインキュベーターにもどし、96時間培養した。その後、充分に懸濁した細胞培養液に、終濃度が0.1%となるようトリパンブルー染色液を添加し10分経過後、細胞数を血球計算盤(BECTON DICKINSON)により計測した。染色されないものを生細胞とみなし、細胞生存率はトリパンブルー染色を行い、その全細胞数に対する染色されない細胞の割合で求めた。その後顕微鏡(KEYENCE)による細胞の写真の撮影を行った。実験結果の統計処理にはTukey’s testを用いた。
　（２）EGCGとPDE5阻害剤の組み合わせによる細胞増殖抑制作用及び細胞致死作用における67LR関与の検討
　トリパンブルー法によるEGCGとバルデナフィルの組み合わせによる抗がん作用の検討において用いたトリパンブルーは1%の濃度となるようにPBSに懸濁したものをトリパンブルー染色液とした。用いるPBSは超純水1Lに対し、NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2HPO4 1.15g、KH2PO40.2gを溶解し調製しオートクレーブ滅菌した。
　ヒト多発性骨髄腫細胞株U266及びヒト急性骨髄性白血病細胞株HL60を1%FCS含有RPMI 1640に5x104 cells/mL(U266)及び1x104 cells/mL(HL60)となるよう調整して96 well plate(FALCON社)に播種し、バルデナフィルが終濃度で5μMとなるよう添加した。その後直ちに、終濃度が20μg/mLとなるように抗67LRモノクローナル抗体であるMLuc5(Abcam)を添加した。アイソタイプ対照抗体添加群ではMouse IgM(コスモ・バイオ株式会社、東京)が終濃度で20μg/mLとなるように添加した。用いたバルデナフィルは10%ジメチルスルホキシド(DMSO)添加超純水にて5mMとなるように調整し、-30℃にて保存した。使用に際しては適宜解凍して用いた。
　各種抗体の添加後直ちにインキュベーターに戻し、3時間経過後、EGCGを終濃度で5μMとなるように添加した。用いたEGCGは10%ジメチルスルホキシド(DMSO)添加超純水にて5mMとなるように調整し、-30℃にて保存した。使用に際しては適宜解凍して用いた。
　EGCG添加後、直ちにインキュベーターにもどし、96時間培養した。その後、充分に懸濁した細胞培養液に終濃度が0.1%となるようトリパンブルー染色液を添加し10分経過後、細胞数を血球計算盤により計測した。染色されないものを生細胞とみなし、細胞生存率はトリパンブルー染色を行い、その全細胞数に対する染色されない細胞の割合で求めた。実験結果の統計処理にはTukey’s testを用いた。
　（３）EGCGとPDE5阻害剤（バルデナフィル）の組み合わせによるアポトーシス誘導作用における67LR関与の検討
　Annexin V PI重染色法によるEGCGとバルデナフィルの組み合わせによる抗がん作用の検討において用いたヨウ化プロピジウム（PI）染色液はPI(Sigma)を50μg/mLの濃度となるようにPBSに懸濁したものをPI染色液とした。用いたPBSは超純水1Lに対し、NaCl 8.0g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 1.15g、KH2PO4 0.2gを溶解し調製しオートクレーブ滅菌した。用いたAnnexin V Binding Bufferは10mM HEPES, 140mM NaCl; 2.5mM CaCl2(Wako); pH 7.4となるよう調整しフィルター滅菌に供した。
　U266及びHL60を1%FCS含有RPMI 1640に5x104cells/mL(U266)及び1x104 cells/mL (HL60)になるよう調整して96 well plateに播種し、バルデナフィルが終濃度で5μMとなるよう添加した。その後直ちに、終濃度が20μg/mLとなるように抗67LRモノクローナル抗体であるMLuc5を添加した。アイソタイプ対照抗体添加群ではMouse IgMの終濃度が20μg/mLとなるように添加した。
　用いたバルデナフィルは10%ジメチルスルホキシド(DMSO)添加超純水にて5mMとなるように調整し、-30℃にて保存した。使用に際しては適宜解凍して用いた。各種抗体の添加後直ちにインキュベーターに戻し、3時間経過後、EGCGを終濃度で5μMとなるように添加した。用いたEGCGは10%ジメチルスルホキシド(DMSO)添加超純水にて5mMとなるように調整し、-30℃にて保存した。使用に際しては適宜解凍して用いた。
　EGCG添加後、直ちにインキュベーターにもどし、96 時間培養した。その後、充分に懸濁した細胞培養液を300×g 5分にて遠心し、上清を除去した後、Annexin V Binding Bufferにて懸濁し、細胞数を血球計算盤により計測し再び300×g 5分にて遠心し、1×106cells/mLとなるようAnnexin V Binding Bufferにて懸濁した。この細胞懸濁液100μLに対しAnnexin V Alexa Fluor 488 Conjugateを5μL(Invitrogen)添加しさらに事前に調製したPI染色液2μLを上から添加し、室温にて15分放置した。その後、Annexin V Binding Buffer 400μLを上から添加し、フローサイトメーターであるFACS Caliber(Becton, Dickinson and Company)を用いて測定を行った。コンペンセーションをかけたのちAnnexin V Alexa Fluor 488 ConjugateはFL 1にて測定し、陽性とみなされた細胞をアポトーシス細胞とした。解析はCell Quest (Becton, Dickinson and Company)にておこなった。実験結果の統計処理にはTukey’s testを用いた。
　（４）ヒト前立腺がんに対するEGCGとPDE5阻害剤の組み合わせによる細胞増殖抑制作用及び細胞致死作用の検討
　ヒト前立腺がん細胞株PC3は10%ウシ胎児血清(FCS)添加RPMI RPMI1640培地にて37℃、水蒸気飽和した5% CO2条件下で継代、維持した。細胞は対数増殖期で培養維持した。培養に使用したRPMI 1640培地は、超純水1LあたりRPMI 1640培地 10.4g、HEPES 2.38g、注射用ペニシリンG カリウム 20万単位 0.5 vial、硫酸ストレプトマイシン注射用 1g 0.1 vial、NaHCO32.0gを懸濁した後、フィルター滅菌した。その後、ウシ胎児血清(FCS)をRPMI 1640培地に添加し、細胞培養に使用した。
　トリパンブルー法によるEGCGとバルデナフィルの組み合わせによる抗がん作用の検討において用いたトリパンブルーは、1%の濃度となるようにPBSに懸濁したものをトリパンブルー染色液とした。用いるPBSは超純水1Lに対し、NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 1.15g、KH2PO40.2gを溶解し調製しオートクレーブ滅菌した。
　PC3は10%FCS含有RPMI 1640に1x104 cells/mLとなるようそれぞれ調整して24 well plate(NUNC社)に播種し、24時間前培養後バルデナフィルが終濃度で5μMとなるよう添加した2%FCS RPMIに置換した。用いたバルデナフィルは10%ジメチルスルホキシド(DMSO)添加超純水にて5mMとなるように調整し、-30℃にて保存した。使用に際しては適宜解凍して用いた。バルデナフィルの添加後直ちにインキュベーターに戻し、2時間経過後、EGCGを終濃度で10μMとなるように添加した。用いたEGCGは10%ジメチルスルホキシド(DMSO)添加超純水にて5mMとなるように調整し、-30℃にて保存した。使用に際しては適宜解凍して用いた。
　EGCG添加後、直ちにインキュベーターにもどし、72時間培養した。その後、充分に懸濁した細胞培養液に終濃度が0.1%となるようトリパンブルー染色液を添加し10分経過後、細胞数を血球計算盤により計測した。染色されないものを生細胞とみなし、細胞生存率はトリパンブルー染色を行い、その全細胞数に対する染色されない細胞の割合で求めた。顕微鏡による細胞の写真の撮影を行った。実験結果の統計処理にはTukey’s testを用いた。
［結果］
　（１）多発性骨髄腫細胞に対するEGCGの細胞致死作用（Ａ）及び細胞増殖抑制作用（Ｂ）におけるPDE5阻害剤の組み合わせ効果
　EGCG抵抗性因子であると考えられるcGMP特異的分解酵素であるPDE5に対する選択的阻害剤（バルデナフィル）によるEGCGの多発性骨髄腫に対する作用の増強について検討を行った。
　ヒト多発性骨髄腫細胞株U266を24 well plateに5x104 cells/mLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、血球計算板を用いてトリパンブルー染色法による細胞生存率測定及び生細胞数測定を実施した。結果を図１に示す（n=3，Tukey’s test，***:P<0.001）。
　図１に示されるように、EGCGおよびバルデナフィルはそれぞれ単独では細胞に対して何ら毒性を示さなかったものの、EGCGとバルデナフィルを組み合わせた場合、極めて強力にがん細胞の生存率の低下を引き起こした（Ａ）。また生細胞数に対するEGCGの作用もバルデナフィルの存在によって顕著に増強した（Ｂ）。さらに顕微鏡写真においても同様の結果が得られた（Ｃ）。これらことからPDE5選択的阻害剤であるバルデナフィルは多発性骨髄腫細胞に対するEGCGの作用を顕著に増強することが明らかになった。
　（２）急性骨髄腫性白血病細胞に対するEGCGの細胞致死作用（Ａ）及び細胞増殖抑制作用（Ｂ）におけるPDE5阻害剤の組み合わせ効果
　EGCG抵抗性因子であると考えられるcGMP特異的分解酵素であるPDE5に対する選択的阻害剤（バルデナフィル）によるEGCGの急性骨髄性白血病細胞に対する作用の増強について検討を行った。
　ヒト急性骨髄性白血病細胞HL60を24 well plateに1x104 cells/mLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、血球計算板を用いてトリパンブルー染色法による細胞生存率測定及び生細胞数測定を実施した。結果を図２に示す（n=3，Tukey’s test，***:P<0.001）。
　図２に示されるように、EGCGおよびバルデナフィルはそれぞれ単独では細胞に対して何ら毒性を示さなかったものの、EGCGとバルデナフィルを組み合わせた場合、極めて強力にがん細胞の生存率の低下を引き起こした（Ａ）。また生細胞数に対するEGCGの作用もバルデナフィルの存在によって顕著に増強した（Ｂ）。さらに顕微鏡写真においても同様の結果が得られた（Ｃ）。これらことからPDE5選択的阻害剤であるバルデナフィルは急性骨髄性白血病細胞に対するEGCGの作用を顕著に増強することが明らかになった。
　（３）多発性骨髄腫細胞に対するEGCGとPDE5阻害剤の細胞致死作用（Ａ）及び細胞増殖抑制作用（Ｂ）における67LR関与の検討
　EGCG抵抗性因子であると考えられるcGMP特異的分解酵素であるPDE5に対する選択的阻害剤（バルデナフィル）によるEGCGの多発性骨髄腫細胞に対する作用の増強について検討を行った。
　ヒト多発性骨髄腫細胞株U266を96 well plateに5x104 cells/mLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、その後直ちに、終濃度が20μg/mLとなるように抗67LRモノクローナル抗体であるMLuc5を添加した。アイソタイプ対照抗体添加群ではMouse IgMが終濃度で20μg/mLとなるように添加した。3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、血球計算板を用いてトリパンブルー染色法による細胞生存率測定及び生細胞数測定を実施した。結果を図３に示す（n=3，Tukey’s test，***:P<0.001）。
　図３に示されるように、EGCGおよびバルデナフィルはそれぞれ単独では細胞に対して何ら毒性を示さなかったものの、EGCGとバルデナフィルを組み合わせた場合、極めて強力にがん細胞の生存率の低下を引き起こした（Ａ）。また生細胞数に対するEGCGの作用もバルデナフィルの存在によって顕著に増強した（Ｂ）。さらに、EGCGとバルデナフィルの組み合わせによる両作用は抗67LR抗体処理によって完全にキャンセルされた（Ａ）及び（Ｂ）。以上の結果から、EGCGとバルデナフィルの組み合わせによるがん細胞致死作用は67LR依存的であることが明らかになった。
　（４）急性骨髄性白血病細胞に対するEGCGとPDE5阻害剤の細胞致死作用（Ａ）及び細胞増殖抑制作用（Ｂ）における67LR関与の検討
　EGCG抵抗性因子であると考えられるcGMP特異的分解酵素であるPDE5に対する選択的阻害剤（バルデナフィル）によるEGCGの急性骨髄性白血病細胞に対する作用の増強について検討を行った。
　急性骨髄性白血病細胞株HL60を96 well plateに1x104 cells/mLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、その後直ちに、終濃度が20μg/mLとなるように抗67LRモノクローナル抗体であるMLuc5を添加した。アイソタイプ対照抗体添加群ではMouse IgMが終濃度で20μg/mLとなるように添加した。3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、血球計算板を用いてトリパンブルー染色法による細胞生存率測定及び生細胞数測定を実施した。結果を図４に示す（n=3，Tukey’s test，***:P<0.001）。
　図４に示されるように、EGCGおよびバルデナフィルはそれぞれ単独では細胞に対して何ら毒性を示さなかったものの、EGCGとバルデナフィルを組み合わせた場合、極めて強力にがん細胞の生存率の低下を引き起こした（Ａ）。また生細胞数に対するEGCGの作用もバルデナフィルの存在によって顕著に増強した（Ｂ）。さらに、EGCGとバルデナフィルの組み合わせによる両作用は抗67LR抗体処理によって完全にキャンセルされた（Ａ）及び（Ｂ）。以上の結果から、EGCGとバルデナフィルの組み合わせによるがん細胞致死作用は67LR依存的であることが明らかになった。
　（５）多発性骨髄腫細胞に対するEGCGとPDE5阻害剤のアポトーシス誘導活性における67LR関与の検討
　EGCG抵抗性因子であると考えられるcGMP特異的分解酵素であるPDE5に対する選択的阻害剤（バルデナフィル）によるEGCGの多発性骨髄腫細胞に対する作用の増強について検討を行った。
　ヒト多発性骨髄腫細胞株U266を96 well plateに5x104 cells/mLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、その後直ちに、終濃度が20μg/mLとなるように抗67LRモノクローナル抗体であるMLuc5を添加した。アイソタイプ対照抗体添加群ではMouse IgMが終濃度で20μg/mLとなるように添加した。3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、Annexin V PI重染色法によるアポトーシス細胞率測定を実施した。結果を図５に示す（n=3，Tukey’s test，***:P<0.001）。
　図５に示されるように、バルデナフィル単独では細胞に対して何ら毒性を示さないものの、EGCGは単独でアポトーシスを誘導した。さらに、EGCGのアポトーシス誘導作用はバルデナフィルと併用することで顕著に増強された。また、EGCG単独、およびEGCGとバルデナフィルの組み合わせ、によるアポーシス誘導作用は抗67LR抗体処理によって完全に消失した。以上の結果から、バルデナフィルは67LRを介したEGCGのがん細胞に対するアポトーシス誘導作用を顕著に増強することが明らかになった。
　（６）急性骨髄性白血病細胞に対するEGCGとPDE5阻害剤のアポトーシス誘導活性における67LR関与の検討
　EGCG抵抗性因子であると考えられるcGMP特異的分解酵素であるPDE5に対する選択的阻害剤（バルデナフィル）によるEGCGの急性骨髄性白血病細胞に対する作用の増強について検討を行った。
　急性骨髄性白血病細胞株HL60を96 well plateに1 x104 cells/mLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、その後直ちに、終濃度が20μg/mLとなるように抗67LRモノクローナル抗体であるMLuc5を添加した。アイソタイプ対照抗体添加群ではMouse IgMが終濃度で20μg/mLとなるように添加した。3時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。96時間後、Annexin V PI重染色法によるアポトーシス細胞率測定を実施した。結果を図６に示す（n=3，Tukey’s test，***:P<0.001，**:P<0.01）。
　図６に示されるように、バルデナフィル単独では細胞に対して何ら毒性を示さないものの、EGCGは単独でアポトーシスを誘導した。さらに、EGCGのアポトーシス誘導作用はバルデナフィルと併用することで顕著に増強された。また、EGCG単独、およびEGCGとバルデナフィルの組み合わせ、によるアポーシス誘導作用は抗67LR抗体処理によって完全に消失した。以上の結果から、バルデナフィルは67LRを介したEGCGのがん細胞に対するアポトーシス誘導作用を顕著に増強することが明らかになった。
　（７）ヒト前立腺がん細胞株PC3に対するEGCGの細胞致死作用（Ａ）及び細胞増殖抑制作用（Ｂ）におけるPDE5阻害剤の組み合わせ効果
　EGCG抵抗性因子であると考えられるcGMP特異的分解酵素であるPDE5に対する選択的阻害剤（バルデナフィル）によるEGCGの前立腺がんに対する作用の増強について検討を行った。
　ヒト前立腺がん細胞株PC3を24 well plateに1x104 cells/mLとなるように播種し、24時間前培養後、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルが添加された培地に置換し、2時間経過後、EGCGを終濃度が10μMとなるよう添加した。96時間後、血球計算板を用いてトリパンブルー染色法による細胞生存率測定及び生細胞数測定を実施した。結果を図７に示す（n=3，Tukey’s test，***:P<0.001）。
　図７に示されるように、EGCGおよびバルデナフィルはそれぞれ単独では細胞に対して何ら毒性を示さなかったものの、EGCGとバルデナフィルを組み合わせた場合、極めて強力にがん細胞の生存率の低下を引き起こした（Ａ）。また生細胞数に対するEGCGの作用もバルデナフィルの存在によって顕著に増強した（Ｂ）。さらに顕微鏡写真においても同様の結果が得られた（Ｃ）。これらことからPDE5選択的阻害剤であるバルデナフィルは前立腺がんに対するEGCGの作用を顕著に増強することが明らかになった。
　（８）ヒト多発性骨髄腫細胞株RPMI8226に対するEGCGの細胞致死作用及び細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤の併用効果
　バルデナフィルによるEGCGの多発性骨髄腫細胞に対する作用の増強について検討を行った。ヒト多発性骨髄腫細胞株RPMI8226を24 well plateに5x104cells/mLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、３時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。９６時間後、トリパンブルー染色法により細胞生存率（Ａ）及び生細胞数（Ｂ）を測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100%とした。結果を図８に示す（n=3，Tukey’s test，*:P<0.05，***:P<0.001）。
　図８に示されるように、EGCGおよびバルデナフィルはそれぞれ単独では細胞に対して何ら毒性を示さなかったものの、EGCGとバルデナフィルを組み合わせた場合、極めて強力にがん細胞の生存率の低下を引き起こした（Ａ）。また生細胞数に対するEGCGの作用もバルデナフィルの存在によって顕著に増強した（Ｂ）。
　（９）患者由来多発性骨髄腫に対するEGCGの細胞致死作用及び細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤の併用効果
　バルデナフィルによるEGCGの患者由来多発性骨髄腫細胞に対する作用の増強について検討を行った。患者由来多発性骨髄腫細胞を24 well plateに5x104cells/mLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、３時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。９６時間後、トリパンブルー染色法により細胞生存率（Ａ）及び生細胞数（Ｂ）を測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100%とした。結果を図９に示す（n=3，Tukey’s test，***:P<0.001）。
　図９に示されるように、EGCGはバルデナフィルと併用することで多発性骨髄腫患者由来リンパ球に対する顕著な細胞増殖抑制作用を示した。
　（１０）ヒト形質細胞腫ARH77に対するEGCGの細胞致死作用及び細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤の併用効果
　バルデナフィルによるEGCGの形質細胞腫に対する作用の増強について検討を行った。ヒト形質細胞腫ARH77を24 well plateに5x104cells/mLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、３時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。９６時間後、トリパンブルー染色法により細胞生存率（Ａ）及び生細胞数（Ｂ）を測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100%とした。結果を図１０に示す（n=3，Tukey’s test，**:P<0.01，***:P<0.001）。
　図１０に示されるように、EGCGはバルデナフィルと併用することでヒト形質細胞腫細胞株に対する顕著な細胞増殖抑制作用を示した。
　（１１）慢性骨髄性白血病細胞株K562に対するEGCGの細胞致死作用及び細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤の併用効果
　バルデナフィルによるEGCGの慢性骨髄性白血病細胞に対する作用の増強について検討を行った。ヒト慢性骨髄性白血病細胞株K562を24 well plateに5x104cells/mLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、３時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。９６時間後、トリパンブルー染色法により細胞生存率（Ａ）及び生細胞数（Ｂ）を測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100%とした。結果を図１１に示す（n=3，Tukey’s test，**:P<0.01，***:P<0.001）。
　図１１に示されるように、EGCGはバルデナフィルと併用することでヒト慢性骨髄性白血病細胞株に対する顕著な細胞増殖抑制作用を示した。
　（１２）ヒト乳がん細胞株MCF-7に対するEGCGの細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤の併用効果
　バルデナフィルによるEGCGの乳がん細胞に対する作用の増強について検討を行った。ヒト乳がん細胞株MCF-7を24 well plateに1x104cells/mLとなるように播種し２４時間前培養した。その後、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、３時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。９６時間後、トリパンブルー染色法により生細胞数を測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100%とした。結果を図１２に示す（n=3，Tukey’s test，***:P<0.001）。
　図１２に示されるように、EGCGはバルデナフィルと併用することでヒト乳がん細胞株に対する顕著な細胞増殖抑制作用を示した。
　（１３）ヒト胃がん細胞株MKN45に対するEGCGの細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤の併用効果
　バルデナフィルによるEGCGの胃がん細胞に対する作用の増強について検討を行った。ヒト胃がん細胞株MKN45を24 well plateに1x104cells/mLとなるように播種し２４時間前培養した。その後、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、３時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。９６時間後、トリパンブルー染色法により生細胞数を測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100%とした。結果を図１３に示す（n=3，Tukey’s test，***:P<0.001）。
　図１３に示されるように、EGCGはバルデナフィルと併用することでヒト胃がん細胞株に対する顕著な細胞増殖抑制作用を示した。
　（１４）ヒト膵臓がん細胞株PANC-1に対するEGCGの細胞致死作用及び細胞増殖抑制作用におけるPDE5阻害剤の併用効果
　バルデナフィルによるEGCGの膵臓がん細胞に対する作用の増強について検討を行った。ヒト膵臓がん細胞株PANC-1を24 well plateに1x104cells/mLとなるように播種し２４時間前培養した。その後、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、３時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。９６時間後、トリパンブルー染色法により細胞生存率（Ａ）及び生細胞数（Ｂ）を測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100%とした。結果を図１４に示す（n=3，Tukey’s test，**:P<0.01，***:P<0.001）。
　図１４に示されるように、EGCGはバルデナフィルと併用することでヒト膵臓がん細胞株に対する顕著な細胞増殖抑制作用を示した。
　（１５）ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECの生存率および細胞増殖に対するEGCGとPDE5阻害剤の併用効果
　バルデナフィルによるEGCGの臍帯静脈内皮細胞に対する作用の増強について検討を行った。ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECを24 well plateで5%FCS含有EGM-2培地に2x104cells /mLにて播種し、２４時間前培養後した。その後各濃度（0～5μM）のバルデナフィルを添加したSOD(5U/mL)、Catalase(200U/mL)含有1%FCS RPMI1640培地に置換し、３時間処理した。その後、EGCGを終濃度5μMとなるように添加した。９６時間後、トリパンブルー染色法により細胞生存率（Ａ）及び生細胞数（Ｂ）を測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100%とした。結果を図１５に示す（n=3，Tukey’s test）。
　図１５に示されるように、EGCGとバルデナフィルの併用は正常細胞（HUVEC）に対して毒性を示さなかった。
　（１６）健常者由来末梢血リンパ球の生存率および細胞増殖に対するEGCGとPDE5阻害剤の併用効果
　バルデナフィルによるEGCGの健常者由来末梢血リンパ球に対する作用の増強について検討を行った。健常者由来末梢血リンパ球PBMCを24 well plateに5x104cells/mLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、３時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。９６時間後、トリパンブルー染色法により細胞生存率（Ａ）及び生細胞数（Ｂ）を測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100%とした。結果を図１６に示す（n=3，Tukey’s test）。
　図１６に示されるように、EGCGとバルデナフィルの併用は正常細胞（末梢血リンパ球）に対して毒性を示さなかった。
　（１７）Balb/cマウスに移植したマウス形質細胞腫細胞株MPC11の腫瘍形成に対するEGCGとPDE5阻害剤の併用効果
　バルデナフィルによるEGCGの形質細胞腫に対する作用の増強について検討を行った。マウス形質細胞腫細胞株MPC11を24 well plateに5x 104cells/mLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、３時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。９６時間後、トリパンブルー染色法により生細胞数を測定した。EGCG、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100%とした。結果を図１７（Ａ）に示す（n=3，Tukey’s test，**:P<0.01）。
　図１７（Ａ）に示されるように、EGCGはバルデナフィルと併用することでマウス形質細胞腫細胞株に対する顕著な細胞増殖抑制作用を示した。
　また、５週齢メスbalb/cマウスを１週間予備飼育したのち、マウス多発性骨髄腫細胞株MPC11を5X107 cells/mLとなるようにRPMI培地に懸濁した懸濁物100mLを、右背部に皮下注射移植した。移植４日後、EGCG(15mg/kg i.p.)及びバルデナフィル(5 mg/kg i.p.)の投与を二日に一回実施し、ノギスにて腫瘍体積の測定を実施した。結果を図１７（Ｂ）に示す。図中、EGCG及びVDNはそれぞれ、EGCG及びバルデナフィルの単独投与を、EGCG/VardenafilはEGCGとバルデナフィルとの併用を示す。
　図１７（Ｂ）に示されるように、EGCG及びバルデナフィルをそれぞれ単独に投与した群ではマウス形質細胞腫細胞株の腫瘍形成に対する阻害作用は全く観察されなかったが、EGCGとバルデナフィルを併用した群では顕著な抗腫瘍作用が観察された。
　（１８）ヒト多発性骨髄腫細胞株U266に対するメチル化EGCGとPDE5阻害剤の併用効果
　ヒト多発性骨髄腫細胞株U266を24 well plateに5x104 cells/mLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、３時間後、EGCG 3”メチルまたはEGCG 7メチルを終濃度が5μMとなるよう添加した。９６時間後、トリパンブルー染色法により生細胞数を測定した。未添加群をコントロールとし、100%とした。EGCG 3”メチル、EGCG 7メチル、バルデナフィル未添加群をコントロールとし、100%とした。結果を図１８に示す（n=3，Tukey’s test，***:P<0.001）。
　図１８に示されるように、EGCG 3”メチル及びEGCG 7メチルはいずれも、バルデナフィルと併用することで多発性骨髄腫細胞に対する顕著な細胞増殖抑制作用を示した。
　（１９）前立腺がん細胞株PC-3および膵臓がん細胞株PANC-1に対するメチル化EGCGとPDE5阻害剤の併用効果
　ヒト前立腺がん細胞株PC3またはヒト膵臓がん細胞株PANC-1を24 well plateに1x104 cells/mLとなるように播種し、２４時間前培養した。その後、終濃度が5μMとなるようバルデナフィルを添加し、３時間経過後、EGCG 7メチルを終濃度が5μMとなるよう添加した。９６時間後、トリパンブルー染色法により生細胞数を測定した。未添加群をコントロールとし、100%とした。結果を図１９に示す（n=3，Tukey’s test，**:P<0.01，***:P<0.001）。
　図１９に示されるように、EGCG 7メチルはバルデナフィルと併用することで前立腺がん細胞株および膵臓がん細胞株の細胞増殖を顕著に抑制した。
　（２０）慢性骨髄性白血病細胞株K562に対するEGCGの細胞増殖抑制作用におけるPDE3阻害剤の併用効果
　Phosphodiesterase IIIに対する選択的阻害薬であるトレキシンによるEGCGの慢性骨髄性白血病細胞に対する作用の増強について検討を行った。ヒト慢性骨髄性白血病細胞株K562を24 well plateに5x104 cells/mLとなるように播種し、終濃度が5μMとなるようトレキシンを添加し、３時間経過後、EGCGを終濃度が5μMとなるよう添加した。９６時間後、トリパンブルー染色法により生細胞数を測定した。EGCG、トレキシン未添加群をコントロールとし、100%とした。結果を図２０に示す（n=3，Tukey’s test，***:P<0.001）。
　図２０に示されるように、EGCGはトレキシンと併用することで慢性骨髄性白血病細胞株の細胞増殖を顕著に抑制した。
　（２１）バルデナフィルとの併用によるEGCGの抗炎症作用（Toll-like receptor (TLR)2及びTLR 4発現低下作用）の増強
　マウスマクロファージ細胞株RAW 264.7を5 mL dishに1×105 cells/mLとなるように播種し、1% FCS-DMEMにて２４時間前培養を行った。次にバルデナフィルを5μMとなるように添加し、さらにその３時間後、EGCGをそれぞれ0μM及び10μMとなるように添加した。２４時間後に細胞を回収し、Toll-like receptor (TLR)2及びTLR 4発現をウエスタンブロット法を用いて測定した。結果を表１に示す。EGCGはバルデナフィルと併用することでTLR2及びTLR4の発現量を顕著に低下させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［考察］
　以上の結果から、PDE3阻害剤及びPDE5阻害剤がEGCGの抗がん作用の増強剤として有効で有ることが判明した。また、EGCGとPDE5阻害剤の併用が67LR陽性がんに対する分子標的薬として極めて有効であることが示された。また、EGCGとPDE5阻害剤の併用が正常細胞に対して毒性を示さないことが判明した。
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Claims (6)

  1. 　エピガロカテキンガレートまたはメチル化エピガロカテキンガレート、またはその医薬的に許容される塩と、ホスホジエステラーゼ阻害剤と、を組み合わせたことを特徴とする薬剤。
  2. 　がん、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症または筋萎縮の治療で使用するための、請求項１に記載の薬剤。
  3. 　67LR陽性の疾患の治療で使用するための、請求項１または請求項２に記載の薬剤。
  4. 　前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がホスホジエステラーゼ３阻害剤またはホスホジエステラーゼ５阻害剤である、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の薬剤。
  5. 　前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がバルデナフィルである、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の薬剤。
  6. 　ａ）エピガロカテキンガレートまたはメチル化エピガロカテキンガレート、またはその医薬的に許容される塩を含有する第一の単位剤形；
    　ｂ）ホスホジエステラーゼ阻害剤を含有する第二の単位剤形；及び
    　ｃ）前記第一の単位剤形及び第二の単位剤形を収容するための容器手段；
    を含んでなる、がん、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症または筋萎縮の治療で使用するためのキット。
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