WO2019026302A1 - ６７ｋＤａラミニンレセプターアゴニスト及びその使用 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a 67 kDa laminin receptor (hereinafter sometimes referred to as "67 LR") agonist and use thereof. More specifically, the present invention relates to a 67LR agonist, a 67LR agonist composition, a food composition for preventing or ameliorating a 67LR related disease, and a method for preventing or ameliorating a 67LR related disease.
  • 67 LR 67 kDa laminin receptor
  • EGCG Epigallocatechin gallate
  • Patent Document 1 A phase II clinical trial has been conducted in a chronic lymphoid leukemia patient who is a type of hematologic cancer (see, for example, Non-patent Document 2).
  • EGCG exerts an anti-cancer effect by binding to 67LR on the cell membrane (see, for example, Non-Patent Document 3).
  • the expression of 67LR is abnormally enhanced in cancer cells.
  • EGCG binds to 67LR, it activates Akt, activates endothelial nitric oxide synthase (eNOS), induces the production of nitric oxide (NO) and cyclic guanosine monophosphate (cGMP), and proteins
  • eNOS endothelial nitric oxide synthase
  • cGMP cyclic guanosine monophosphate
  • PKC ⁇ production sphingomyelinase
  • ASM production sphingomyelinase
  • the action of EGCG via 67LR includes not only anti-cancer action but also anti-allergic action, anti-obesity action, anti-atherogenic action, anti-inflammatory action, muscle atrophy inhibition action, cholesterol lowering action, antithrombotic action, immune enhancement
  • the action, the nerve cell protective action and the like are known (see, for example, Patent Documents 1 and 2).
  • the present invention aims to provide a more potent 67LR agonist than EGCG.
  • a 67LR agonist comprising oolong tea-polymerized polyphenol or a derivative thereof as an active ingredient.
  • each R 1 independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or -OR 2 (wherein R 2 represents a hydrogen atom from glucose, mannose, xylose, galactose or maltose And R 3 independently represents a halogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and R 4 independently represents a hydrogen atom or a group represented by the following formula (1A): Represents a group represented by).
  • formula (1A) the definition of R 1 and R 3 is the same as the definition in said Formula (1).
  • a 67LR agonist composition comprising the 67LR agonist according to any one of [1] to [3] and a phosphodiesterase inhibitor or flavanone or a glycoside thereof.
  • the 67LR agonist composition according to [6] which is for the prevention or treatment of a 67LR related disease.
  • the 67LR agonist composition according to [7] wherein the 67LR related disease is cancer, allergy, obesity, arteriosclerosis, inflammation, muscle atrophy, hypercholesterolemia, thrombosis or immunodeficiency.
  • a food composition for preventing or ameliorating a 67LR-related disease comprising the 67LR agonist according to any one of [1] to [3].
  • a method for preventing or ameliorating a 67LR-related disease comprising a step of allowing a human or an animal to ingest the food composition according to [9] or [10] (excluding medical practice for human beings).
  • a 67LR agonist stronger than EGCG can be provided.
  • (A) to (n) are graphs showing the survival rate of each cancer cell line in Experimental Example 1.
  • Experimental Example 1 it is a graph plotting an IC 50 and EGCG an IC 50 of oolong homobisflavan B for each cancer cell line (OHBFB).
  • (A) And (b) is a fluorescence-microscope photograph in Experimental example 2. It is a graph which shows the measurement result of the cell survival rate in Experimental example 3. It is a graph which shows the measurement result of intracellular cGMP in Experimental example 4. It is a graph which shows the measurement result of the cell survival rate in Experimental example 5.
  • (A) is a photograph showing the results of detection of phosphorylated eNOS Ser 1177 and eNOS by Western blotting in Experimental Example 6.
  • (B) is a graph showing the result of digitizing the result of (a) and calculating the abundance of phosphorylated eNOS Ser 1177 relative to the abundance of eNOS. It is a graph which shows the measurement result of the cell survival rate in Experimental example 7. It is a graph which shows the measurement result of Akt activity in Experimental example 8. It is a graph which shows the measurement result of the cell survival rate in Experimental example 9. It is a graph which shows the measurement result of the cell survival rate in Experimental example 10. It is a graph which shows the result of the isobologram analysis in Experimental example 11. It is a graph which shows the result of the isobologram analysis in Experimental example 12. It is a graph which shows the measurement result of the cell survival rate in Experimental example 13.
  • (A) and (b) are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining of CV-caspase-3 in Experimental Example 14.
  • (C) is a graph showing the results of counting the number of CV-caspase-3 positive cells in (a) and (b).
  • (A) and (b) are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining phosphorylated eNOS Ser 1177 in Experimental Example 14.
  • (A) and (b) are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining phosphorylated PKC ⁇ Ser 662 in Experimental Example 14.
  • Experimental example 14 it is a graph which shows the measurement result of ASM activity in the tumor tissue of OHBFB non-administration group (control) and an administration group.
  • FIG. 7 shows a schematic of the eNOS / PKC ⁇ / ASM pathway activated by OHBFB. It is a graph which shows the measurement result of intracellular cGMP in Experimental example 16.
  • (A) to (c) are graphs showing the results of real-time PCR in Experimental Example 17. It is a graph which shows the result of real-time PCR in example 18 of an experiment. It is a graph which shows the result of real-time PCR in Experimental example 19. It is a graph which shows the calculation result of the amount of TNF- ⁇ in Experimental example 20.
  • FIG. 21 is a graph showing the calculation results of the liberation rate of ⁇ -hexosaminidase in Experimental Example 21.
  • the present invention provides a 67LR agonist comprising oolong tea-polymerized polyphenol or a derivative thereof as an active ingredient.
  • the 67LR agonist of the present embodiment more strongly activates the 67LR downstream signal transduction pathway than EGCG.
  • being more potent than EGCG means, for example, that the 50% inhibitory concentration (IC 50 ) is lower as compared to EGCG.
  • the IC 50 can be measured, for example, by adding a serially diluted 67LR agonist to a culture medium for cancer cells and measuring cell viability after 96 hours of culture.
  • Oolong tea polymerization polyphenol is a generic term for compounds in which catechins are complexly bound, which are formed by enzyme reaction and thermal polymerization reaction in a unique production method of oolong tea called semi-fermentation, for example, dimers of catechins, catechins And the like.
  • oolong homobisflavans such as oolong homobisflavan A described later, monodesgaloyl ooron homobisflavan A, oolon homobisflavan B, oolon homobisflavan C and the like can be mentioned. .
  • the molecular weight of the 67LR agonist of the present embodiment may be, for example, 800 or more, for example, 900 or more, and may be, for example, 1000 or more.
  • the upper limit of the molecular weight of the 67LR agonist is not particularly limited, but may be about 3,000.
  • the inventors reach the cancer tissue in vivo by oral administration despite the relatively large molecular weight of the 67LR agonist of the present embodiment, and the downstream of the 67LR Revealed that it can activate the signal transduction pathway of
  • the 67LR agonist of this embodiment may be a solvate of oolong tea-polymerized polyphenol or a derivative thereof, or a pharmaceutically acceptable salt of oolong tea-polymerized polyphenol or a derivative thereof, and is pharmaceutically acceptable. It may be a solvate of a salt.
  • inorganic acid salts for example, inorganic acid salts, alkali metal salts, alkaline earth metal salts, metal salts, ammonium salts, organic amine addition salts, amino acid addition salts and the like can be mentioned. More specifically, for example, inorganic acid salts such as hydrochlorides, sulfates, hydrobromides, nitrates, phosphates, etc .; acetates, mesylates, succinates, succinates, maleates, fumarates, Organic acid salts such as citrate and tartrate; alkali metal salts such as sodium and potassium; alkaline earth metal salts such as magnesium and calcium; metal salts such as aluminum and zinc; ammonium and tetra Ammonium salts such as methyl ammonium salts; organic amine addition salts such as morpholine and piperidine; amino acid addition salts such as glycine, phenylalanine, lysine, aspartic acid, glutamic acid and the like
  • a solvate of oolong tea-polymerized polyphenol or a derivative thereof and a solvate of a salt of oolong tea-polymerized polyphenol or a derivative thereof, it is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable solvate, for example, hydrate And organic solvates and the like.
  • 67LR agonist of the present embodiment include a compound represented by the following formula (1) or (2).
  • each R 1 independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or -OR 2 (wherein R 2 represents a hydrogen atom from glucose, mannose, xylose, galactose or maltose And R 3 independently represents a halogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and R 4 independently represents a hydrogen atom or a group represented by the following formula (1A): Represents a group represented by).
  • the compound represented by the said Formula (1) contains the compound or its derivative (s) called oolong homobisflavans.
  • the compound represented by the above formula (1) can be said to be a compound having a dimer of catechins as a skeleton.
  • the compound represented by the said Formula (2) is a compound which makes the trimer of catechins a frame.
  • the 67LR agonist of the present embodiment may be a derivative of oolong tea-polymerized polyphenol as long as it has an agonist activity of 67LR.
  • a derivative of oolong tea polymerization polyphenol the compound which changed a one part functional group etc. is mentioned, for example with oolong tea polymerization polyphenol as a basic skeleton.
  • oolong tea-polymerized polyphenol for example, physical properties such as water solubility and lipid solubility, and biological activities such as 67LR agonist activity, retention in blood, biotoxicity and the like are adjusted within a desired range. can do.
  • R 1 independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or -OR 2 (wherein R 2 represents glucose, mannose, xylose, galactose or a group obtained by removing one hydrogen atom from maltose), and R 3 is not independently present or has a halogen atom or a carbon number of 1 to The compound etc. which are 3 alkyl groups are mentioned.
  • examples of the alkyl group having 1 to 3 carbon atoms represented by R 1 or R 3 include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group and an isopropyl group.
  • the alkyl group having 1 to 3 carbon atoms may be substituted.
  • examples of the substituent of the alkyl group having 1 to 3 carbon atoms include a halogen atom.
  • the halogen atom fluorine, fluorine, chlorine, bromine, iodine and the like can be mentioned.
  • 67LR agonist of the present embodiment include a compound represented by any one of the following formulas (3) to (6).
  • R 1 is a hydroxyl group, there is no R 3
  • R 4 is represented by the above formula (1A), wherein (1A), R 1 is The compound which is a hydroxyl group and in the absence of R 3 is a compound known as oolong homobisflavan A. That is, the 67LR agonist of the present embodiment may be oolong homobisflavan A or a derivative thereof.
  • oolong homobisflavan A a compound in which one of the groups represented by R 4 is a hydrogen atom is a compound known as monodesgaloyl oolong homobisflavan A. That is, the 67LR agonist of the present embodiment may be monodesgaloyl oolong homobisflavan A or a derivative thereof.
  • R 1 is a hydroxyl group, R 3 does not exist, R 4 is represented by said Formula (1A), R 1 is represented in Formula (1A)
  • the compound which is a hydroxyl group and in the absence of R 3 is a compound known as oolong homobisflavan B. That is, the 67LR agonist of the present embodiment may be oolong homobisflavan B or a derivative thereof.
  • R 1 is a hydroxyl group, there is no R 3
  • R 4 is represented by the above formula (1A), wherein (1A), R 1 is The compound which is a hydroxyl group and R 3 is not present is a compound known as oolong homobisflavan C. That is, the 67LR agonist of the present embodiment may be oolong homobisflavan C or a derivative thereof.
  • the compound represented by Formula (6) can be manufactured with the following manufacturing methods, for example. That is, it is produced by reacting flavan-3-ols such as epigallocatechin-3-O-gallate with formaldehyde in a solvent such as methanol and ethanol in the presence of an acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid. Can.
  • the concentration of formaldehyde in the reaction solution is preferably 3 to 37 w / v%.
  • the resulting product may be subjected to derivatization such as esterification or hydrolysis, if necessary.
  • 67LR agonist of the present embodiment can be suitably used for the prevention or treatment of a 67LR related disease.
  • 67LR-related diseases include cancer, allergy, obesity, arteriosclerosis, inflammation, muscle atrophy, hypercholesterolemia, thrombosis, immunodeficiency and the like.
  • cancer cell lethal activity that is, anticancer activity
  • the cancer is not particularly limited as long as it is a cancer in which the expression of 67LR is enhanced.
  • multiple myeloma, chronic lymphocytic leukemia, acute myeloid leukemia, chronic myelogenous leukemia, prostate cancer, melanoma, breast cancer, Lung cancer, cervical cancer, colon cancer etc. are mentioned.
  • the action mechanism of the 67LR agonist of the present embodiment is the same as that of EGCG.
  • the 67LR agonists of this embodiment can be used in applications similar to those found in EGCG.
  • the present invention provides a 67LR agonist composition
  • a 67LR agonist composition comprising the 67LR agonist described above and a phosphodiesterase (PDE) inhibitor or flavanone or glycoside thereof.
  • PDE phosphodiesterase
  • the 67LR agonist one type may be used alone, or two or more types may be mixed and used.
  • the 67LR agonist composition of the present embodiment may contain the 67LR agonist described above and a PDE inhibitor.
  • the activity of the 67LR agonist can be synergistically enhanced by combining the above-described 67LR agonist with a PDE inhibitor.
  • PDE inhibitors are substances that inhibit enzymes that hydrolyze cyclic phosphodiesters such as cAMP and cGMP, and nonselective PDE inhibitors and selective PDE inhibitors are known.
  • the PDE inhibitor contained in the 67LR agonist composition of the present embodiment may be a nonselective PDE inhibitor or a selective PDE inhibitor.
  • Non-selective PDE inhibitors include, for example, caffeine, theophylline, theobromine, 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), pentoxifylline and the like.
  • PDE 1 inhibitors such as 8-methoxy-3-isobutyl-1-methylxanthine
  • PDE 2 inhibitors such as erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) adenine hydrochloride
  • PDE3 inhibitors such as cilostamide, milrinone and trexin
  • PDE4 inhibitors such as etazolate hydrochloride and denbufilin
  • vardenafil sildenafil, zaprinast, tadalafil, dipyridamole
  • PDE5 inhibitors such as amino ⁇ -6-methoxyquinazoline, 1- (3-chloroanilino) -4-phenylphthalazine (MY-5445), hydrogen sulfide and the like.
  • PDE3 inhibitors or PDE5 inhibitors are preferred.
  • polysulfides are administered to a living body, they are metabolized to produce hydrogen sulfide. For this reason, it can be said that polysulfides are PDE5 inhibitors.
  • polysulfides include diallyl disulfide, diallyl trisulfide and the like.
  • one type of PDE inhibitor may be used alone, or two or more types may be mixed and used.
  • one type of 67LR agonist may be used alone, or two or more types may be mixed and used.
  • the blending ratio of the 67LR agonist per 100 parts by mass of the PDE inhibitor may be, for example, 1 to 1000 parts by mass, for example, 1 to 500 parts by mass. It may be 10 to 100 parts by mass, for example, 10 to 80 parts by mass.
  • the 67LR agonist composition of this embodiment may contain the 67LR agonist described above and a flavanone or a glycoside thereof.
  • the activity of the 67LR agonist can be synergistically enhanced by using the 67LR agonist described above in combination with a flavanone or a glycoside thereof.
  • flavanone or its glycoside examples include eriodicthiol, naringenin, hesperetin, eriodictyol glycoside, naringenin glycoside, hesperetin glycoside and the like.
  • one of flavanones or glycosides thereof may be used alone, or two or more thereof may be mixed and used.
  • one type of 67LR agonist may be used alone, or two or more types may be mixed and used.
  • the blending ratio of the 67LR agonist per 100 parts by mass of flavanone or glycoside thereof may be, for example, 1 to 100 parts by mass, for example, 10 to 100 parts by mass. It may be, for example, 20 to 100 parts by mass.
  • the 67LR agonist composition of this embodiment may contain the 67LR agonist described above, a PDE inhibitor, and a flavanone or a glycoside thereof.
  • the 67LR agonist composition of the present embodiment may be for the prevention or treatment of a 67LR related disease.
  • a 67LR related disease examples include those described above.
  • the 67LR agonist or 67LR agonist composition described above may be formulated as a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the above pharmaceutical composition may be orally administered, for example, in the form of tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc. or parenterally in the form of injections, suppositories, external preparations for skin, etc.
  • the skin external preparation include dosage forms such as ointments and patches.
  • those generally used for the preparation of pharmaceutical compositions can be used without particular limitation. More specifically, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum and gum arabic; excipients such as starch and crystalline cellulose; swelling agents such as alginic acid; solvents for injection such as water, ethanol and glycerin;
  • the pressure-sensitive adhesive include rubber-based pressure-sensitive adhesives and silicone-based pressure-sensitive adhesives.
  • the pharmaceutical composition may contain an additive.
  • additives such as calcium stearate and magnesium stearate; sweeteners such as sucrose, lactose, saccharin and maltitol; flavoring agents such as peppermint and red mono oil; stabilizers such as benzyl alcohol and phenol; phosphoric acid Salts, buffers such as sodium acetate; solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol; antioxidants; preservatives and the like.
  • the pharmaceutical composition should be mixed in an appropriate unit dose form required for generally accepted pharmaceutical practice, combining the above-described 67LR agonist or 67LR agonist composition with the above-mentioned pharmaceutically acceptable carrier and additive as appropriate. It can be formulated by
  • the dose of the pharmaceutical composition varies depending on the patient's condition, body weight, age, sex, etc. and can not be generally determined, but in the case of oral administration, for example, 0.1 to 100 mg / kg body weight per dosage unit form
  • the active ingredient (67LR agonist) may be administered. In the case of injection, for example, 0.01 to 50 mg of the active ingredient may be administered per dosage unit form.
  • the daily dose of the pharmaceutical composition varies depending on the patient's condition, body weight, age, sex, etc., and can not be determined indiscriminately, but for example, 0.1 to 100 mg / kg body weight effective per adult day
  • the components may be administered once or twice to four times a day.
  • the present invention provides a food composition for preventing or ameliorating a 67LR-related disease, which comprises the 67LR agonist described above.
  • the food composition of the present embodiment may further contain a PDE inhibitor or flavanone or a glycoside thereof.
  • 67LR related diseases can be prevented or ameliorated by ingesting the food composition of the present embodiment into a living body.
  • the 67LR-related diseases include those described above.
  • the 67LR agonist among the above-described ones, those which are recognized to be added to food can be appropriately used.
  • More specific 67LR agonists include, for example, oolong tea-polymerized polyphenol extracted from oolong tea, oolong homobisflavan A, monodesgaloyl oolong homobisflavan A, oolong homobisflavan B, oolong homobisflavan C, etc. .
  • the 67LR agonist may be added chemically synthesized or purified from natural products, and may be contained by using a food containing the 67LR agonist as a raw material of the food composition.
  • a food containing the 67LR agonist include oolong tea, oolong tea extract, black tea, black tea extract and the like.
  • the PDE inhibitor is preferably a component recognized to be added to food, and examples thereof include caffeine, theophylline, theobromine, polysulfides and the like.
  • polysulfides include diallyl disulfide, diallyl trisulfide and the like.
  • These PDE inhibitors may be added chemically synthesized or purified from natural products, and the foods containing these PDE inhibitors can be contained by using them as raw materials of food compositions. It is also good.
  • Examples of foods containing caffeine include coffee, green tea, oolong tea, black tea, cocoa and the like.
  • Examples of the food containing theophylline include tea leaves and the like.
  • the food containing theobromine include cocoa and the like.
  • foods containing polysulfides include garlic, leek, leek, onion, leek vegetables such as larch and the like.
  • the flavanone or its glycoside is preferably a component recognized to be added to the food, for example, eriodicthiol, naringenin, hesperetin, eriodictyol glycoside, Naringenin glycoside, hesperetin glycoside etc. are mentioned.
  • flavanones or their glycosides may be added chemically synthesized or purified from natural products, and food products containing these flavanones or their glycosides are used as raw materials of food compositions. You may make it contain by using. Examples of foods containing these flavanones or their glycosides include citrus fruits.
  • Citrus fruits are, for example, orange, grapefruit, yuzu, daibou, kabosu, sudachi, yuko, yuko, shiekushisa, lemon, lime, natsukan, hasukan, yoyokan, buntan, mandarin orange, pungkan, ponkan, tachibana, kishu mankan, Valencia Citrus citrus fruits such as orange, navel orange, blood orange, jaffa orange, bergamot, kinot, etc .;
  • the 67LR agonist, the PDE inhibitor, the flavanone or the glycoside thereof may be added singly or in combination of two or more.
  • the food composition of the present embodiment may be used to ingest a 0.1 to 100 mg / kg body weight 67LR agonist per day.
  • the food composition may be used to be taken once or twice or four times a day.
  • the food composition of the present embodiment may be, for example, in the form of a supplement, may be in the form of a beverage, or may be in the form of a solid, semi-solid or gel food. It may be in the form of any prepared food or the like.
  • Examples of the form of the supplement include the forms of capsules and the like used in the examples.
  • the food composition of the present embodiment may be a functional display food.
  • "Functionally labeled food” means a food notified to the Consumer Agency as displaying functionality on a product package based on scientific evidence. Examples of the indication include, but are not limited to, “lower blood cholesterol”, “improve innate immunity and contribute to protection from infectious agents”, and the like. Moreover, even if it is a food composition without a functional indication, it is also considered to display and display functional by a flyer, an advertisement etc., or an audio
  • the food composition of the present embodiment may be a special purpose food.
  • Special-purpose food means food labeled with permission from the government for the special purpose of being suitable for the growth, maintenance and recovery of health, etc. of infants, infants, pregnant women, sick people, etc.
  • the food composition of the present embodiment may be a food for the sick among special purpose food.
  • the food composition of the present embodiment may be a food for specific health among special purpose food.
  • Food for specified health use means food that is recognized based on scientific evidence to help maintain and promote health, and labeling of its effects is permitted. The State reviews the effects and safety displayed and is approved by the Secretary of the Consumer Office for each food item.
  • the present invention provides a method for preventing or ameliorating a 67LR-related disease (excluding medical treatment for humans), which comprises the step of causing a human or an animal to ingest the food composition described above.
  • a 67LR-related disease excluding medical treatment for humans
  • examples of the 67LR-related diseases include those described above.
  • the medical action means an action in which a doctor (including a person instructed by a doctor) performs treatment on a human.
  • the amount of the food composition to be ingested by a human or an animal includes an amount to ingest 0.1 to 100 mg / kg body weight of 67LR agonist per day.
  • the food composition may be ingested once a day or in 2-4 divided doses.
  • the present invention provides a method of treating 67LR related diseases, comprising administering an effective amount of oolong tea-polymerized polyphenol or derivative thereof to a patient in need thereof.
  • the 67LR agonist mentioned above is mentioned as an oolong tea polymerization polyphenol or its derivative (s).
  • the 67LR-related diseases include those described above.
  • the invention includes administering a composition comprising oolong tea polymerized polyphenol or derivative thereof and a phosphodiesterase inhibitor or flavanone or glycoside thereof to a patient in need thereof.
  • a composition comprising oolong tea polymerized polyphenol or derivative thereof and a phosphodiesterase inhibitor or flavanone or glycoside thereof to a patient in need thereof.
  • oolong tea-polymerized polyphenols or derivatives thereof phosphodiesterase inhibitors, flavanones or glycosides thereof, those mentioned above can be mentioned.
  • the present invention is a method of activating the signal transduction pathway downstream of 67LR more strongly than when EGCG is brought into contact with 67LR-expressing cells, wherein 67LR-expressing cells contain oolon tea polymerized polyphenol or a derivative thereof.
  • a method comprising the step of contacting.
  • the present invention is a method of activating the signal transduction pathway downstream of 67LR more strongly than when EGCG is brought into contact with 67LR-expressing cells, wherein the 67LR-expressing cells are treated with oolong tea polymerized polyphenol or a derivative thereof And a method comprising the step of contacting a phosphodiesterase inhibitor or flavanone or a glycoside thereof.
  • a phosphodiesterase inhibitor or flavanone or a glycoside thereof those mentioned above can be mentioned.
  • the present invention provides oolong tea-polymerized polyphenols or derivatives thereof for the treatment of 67LR related diseases.
  • the 67LR agonist mentioned above is mentioned as an oolong tea polymerization polyphenol or its derivative (s).
  • the 67LR-related diseases include those described above.
  • the present invention is a pharmaceutical composition for the treatment of 67LR related diseases, which comprises oolong tea-polymerized polyphenol or derivative thereof and a phosphodiesterase inhibitor or flavanone or glycoside thereof.
  • 67LR related diseases oolong tea-polymerized polyphenols or derivatives thereof, phosphodiesterase inhibitors, flavanones or glycosides thereof, those mentioned above can be mentioned.
  • the present invention provides the use of oolong tea-polymerized polyphenol or a derivative thereof for producing a preventive or therapeutic agent for 67LR-related diseases.
  • the 67LR agonist mentioned above is mentioned as an oolong tea polymerization polyphenol or its derivative (s).
  • the 67LR-related diseases include those described above.
  • the present invention provides use of oolong tea-polymerized polyphenol or a derivative thereof, and a phosphodiesterase inhibitor or flavanone or a glycoside thereof for producing a pharmaceutical composition for preventing or treating 67LR-related diseases .
  • a phosphodiesterase inhibitor or flavanone or a glycoside thereof for producing a pharmaceutical composition for preventing or treating 67LR-related diseases.
  • oolong tea-polymerized polyphenols or derivatives thereof phosphodiesterase inhibitors, flavanones or glycosides thereof, those mentioned above can be mentioned.
  • Example 1 Anticancer activity of oolong homobisflavan B
  • OHBFB oolong homobisflavan B
  • EGCG epigallocatechin gallate
  • cancer cell lines include U266, a human multiple myeloma cell line, ARH77, a human multiple myeloma cell line, RPMI8226, a human multiple myeloma cell line, and Mec-, a human chronic lymphocytic leukemia cell line.
  • HL60 which is a human acute myeloid leukemia cell line
  • Kasumi-1 which is a human acute myeloid leukemia cell line
  • KU812 which is a human chronic myelogenous leukemia cell line were used.
  • Each cancer cell line was passaged under 37 ° C., steam saturated 5% CO 2 conditions using RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), and cultured in logarithmic growth phase used.
  • FCS fetal calf serum
  • EGCG manufactured by Sigma-Aldrich Co.
  • OHBFB manufactured by Nagara Biosciences Co., Ltd.
  • Each cancer cell line was suspended at 5 ⁇ 10 4 cells / mL in RPMI 1640 medium supplemented with 1% FCS, superoxide dismutase (SOD) (5 U / mL), and catalase (200 U / mL). 100 ⁇ L of each well was seeded in a 96-well plate, and final concentrations of 0, 5, 10 or 25 ⁇ M of OHBFB or EGCG were respectively added and cultured for 96 hours. Thereafter, the number of viable cells was measured using a commercially available kit (trade name "ATPlite", Perkin Elmer).
  • FIG. 1 (a) to (n) are graphs showing the survival rate of each cancer cell line.
  • FIGS. 1 (a)-(g) show the results of adding OHBFB to the culture medium
  • FIGS. 1 (h)-(n) show the results of adding EGCG to the culture medium.
  • Figures 1 (a) and (h) show the results for U266 cells
  • Figure 1 (b) and (i) show the results for ARH 77 cells
  • Figures 1 (c) and (j) show the results for RPMI 8226 cells.
  • 1 (d) and 1 (k) show the results of Mec-1 cells
  • FIGS. 1 (e) and 1 (l) show the results of HL60 cells
  • FIGS. 1 (f) and 1 (m) show Kasumi-1
  • the results of cells are shown
  • FIGS. 1 (g) and (n) show the results of KU812 cells.
  • OHBFB has at least about 3 times stronger anticancer activity than EGCG.
  • FIG. 2 is a graph plotting the IC 50 of OHBFB and the IC 50 of EGCG against each cancer cell line. As a result, it became clear that there is a positive correlation between the sensitivity of each cancer cell line to OHBFB and the sensitivity to EGCG.
  • Tukey's test was used for the statistical processing of an experimental result, and P value made less than 0.05 significant. The same applies to the following experimental examples.
  • PBS phosphate buffer
  • FIG. 3 (a) and (b) are fluorescence micrographs.
  • FIG. 3 (a) is a photograph showing the result of the control sample
  • FIG. 3 (b) is a photograph showing the result of adding OHBFB.
  • OHBFB exhibits a lipid raft association action like EGCG.
  • human multiple myeloma cell line U266 is adjusted to 5 ⁇ 10 4 cells / mL in RPMI 1640 medium supplemented with 1% FCS, SOD (5 U / mL), and catalase (200 U / mL).
  • the suspension was seeded and seeded at 1 mL per well in a 24-well plate, and the acid sphingomyelinase inhibitor desipramine (manufactured by Sigma Aldrich) was added to a final concentration of 5 ⁇ M and incubated for 3 hours. Thereafter, OHBFB was added to a final concentration of 5 ⁇ M, and the cells were further cultured for 96 hours. Subsequently, cell viability was measured by trypan blue staining.
  • Desipramine manufactured by Sigma-Aldrich Co.
  • FIG. 4 is a graph showing the measurement results of cell viability. As a result, it became clear that the cancer cell lethal activity of OHBFB was inhibited by the addition of desipramine. From this result, it is clear that OHBFB exhibits an anticancer activity depending on acid sphingomyelinase in a manner similar to EGCG.
  • Example 4 (Inducing ability 1 of cGMP production of OHBFB) The cGMP production-inducing action of OHBFB on cancer cells was evaluated. Specifically, a human multiple myeloma cell line U266 was added to a 96-well plate at a cell density of 5.0 ⁇ 10 5 cells / well in RPMI 1640 medium containing OHPFB at a final concentration of 5 ⁇ M and 1% FCS. The cells were seeded and incubated for 3 hours. Thereafter, the amount of cGMP in cells was measured using a commercially available kit (trade name "cGMP EIA kit", manufactured by Cayman Chemical Co., Ltd.).
  • FIG. 5 is a graph showing the results of measurement of intracellular cGMP.
  • OHBFB like EGCG, has a cGMP production-inducing action in cancer cells.
  • Example 5 (Inhibition of anti-cancer action of OHBFB by inhibitor of soluble guanylate cyclase (sGC) which is cGMP synthetase)
  • sGC soluble guanylate cyclase
  • human multiple myeloma cell line U266 will be 5 ⁇ 10 4 cells / mL in RPMI 1640 medium supplemented with 1% FCS, SOD (5 U / mL) and catalase (200 U / mL). The cells were suspended as described above and seeded at 1 mL per well in a 24-well plate.
  • sGC inhibitor NS2028 manufactured by Sigma-Aldrich Co.
  • sGC inhibitor NS2028 manufactured by Sigma-Aldrich Co.
  • the cell culture medium was replaced with a medium containing OHBFB at a final concentration of 5 ⁇ M, and culture was further continued for 96 hours. Thereafter, cell viability was measured by trypan blue staining.
  • NS2028 (manufactured by Sigma-Aldrich Co.) was dissolved in ultrapure water to a concentration of 5 mM, stored at -30 ° C., and appropriately thawed before use.
  • FIG. 6 is a graph showing the measurement results of cell viability.
  • the phosphorylation level of eNOS Ser 1177 which is an index of eNOS activation, was measured by Western blotting using anti-phosphorylated eNOS ser 1177 antibody.
  • FIG. 7 (a) is a photograph showing the results of detection of phosphorylated eNOS Ser 1177 and eNOS by Western blotting.
  • FIG.7 (b) is a graph which digitizes the result of Fig.7 (a), and shows the result of having calculated the abundance of phosphorylated eNOS Ser1177 with respect to the abundance of eNOS. The results are shown as a percentage (%) with the value in the control being 100.
  • OHBFB like EGCG, was found to induce eNOS ser 1177 phosphorylation in cancer cells, ie, to activate eNOS.
  • human multiple myeloma cell line U266 will be 5 ⁇ 10 4 cells / mL in RPMI 1640 medium supplemented with 1% FCS, SOD (5 U / mL) and catalase (200 U / mL). The cells were suspended as described above and seeded at 1 mL per well in a 24-well plate.
  • an eNOS inhibitor L-NAME (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to a final concentration of 10 mM and incubated for 3 hours. Subsequently, OHBFB was added to a final concentration of 5 ⁇ M and cultured for further 96 hours. Thereafter, cell viability was measured by trypan blue staining.
  • L-NAME (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in ultrapure water so as to be 1 M, stored at -30 ° C., and appropriately thawed before use.
  • FIG. 8 is a graph showing the measurement results of cell viability.
  • the cancer cell lethal activity of OHBFB was inhibited by the addition of the eNOS inhibitor.
  • OHBFB like EGCG, exhibits an anticancer effect in an eNOS-dependent manner.
  • Example 8 (Examination of OHBFB's ability to activate Akt) The ability of OHBFB to activate Akt in cancer cells was evaluated. Specifically, U266, a human multiple myeloma cell line, is suspended at 1 ⁇ 10 7 cells / mL in RPMI 1640 medium supplemented with 1% FCS, and 1 mL per well is added to a 24-well plate. Sowed. Subsequently, OHBFB was added to a final concentration of 5 ⁇ M and incubated for 1 hour. As a control, cells to which OHBFB was not added were used. Subsequently, cell lysis buffer was added to lyse and recover the cells.
  • Akt activity of the collected sample was measured using a commercially available kit (trade name “K-LISATM Akt Activity Kit”, model “CBA019”, manufactured by Merck Millipore).
  • FIG. 9 is a graph showing the measurement results of Akt activity. The results are shown as a percentage (%) with the value in the control being 100. As a result, it became clear that OHBFB, like EGCG, exhibits an Akt activation effect on cancer cells.
  • human multiple myeloma cell line U266 will be 5 ⁇ 10 4 cells / mL in RPMI 1640 medium supplemented with 1% FCS, SOD (5 U / mL) and catalase (200 U / mL). The cells were suspended as described above and seeded in 96-well plates in 100 ⁇ l / well.
  • an anti-67 LR monoclonal antibody (type “MLuc5”, manufactured by Abcam) or a control antibody was added to a final concentration of 20 ⁇ g / mL and incubated for 3 hours.
  • OHBFB was added to a final concentration of 5 ⁇ M and cultured for further 96 hours. Thereafter, cell viability was measured by trypan blue staining.
  • FIG. 10 is a graph showing the measurement results of cell viability. As a result, it was revealed that in cells pretreated with the anti-67 LR monoclonal antibody, the addition of OHBFB significantly reduced the viable cell number reducing effect. That is, it became clear that OHBFB, like EGCG, exhibits anticancer activity in a 67LR-dependent manner.
  • Example 10 (Inhibition of anti-cancer action of OHBFB by suppression of 67LR expression) The involvement of 67LR in the anti-cancer action of OHBFB was evaluated. Specifically, mouse melanoma cell line B16 was suspended to 1 ⁇ 10 4 cells / mL in DMEM medium supplemented with 5% FCS, and 1 mL per well was seeded in a 24-well plate. Subsequently, 67LR siRNA (manufactured by Life Technologies) or control siRNA (manufactured by Life Technologies) was introduced and cultured for 72 hours. A commercially available kit (trade name “RNAiMAX”, manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) was used for introduction of the siRNA.
  • each cell was replated at 100 ⁇ l per well in a 96-well plate at a cell density of 1 ⁇ 10 4 cells / mL and incubated for 24 hours.
  • As the medium DMEM medium supplemented with 5% FCS was used.
  • OHBFB was added to a final concentration of 5 ⁇ M, and culture was further performed for 72 hours. Thereafter, cell viability was measured by trypan blue staining.
  • FIG. 11 is a graph showing the measurement results of cell viability. As a result, it was revealed that the addition of OHBFB significantly reduced the cancer cell growth inhibitory activity in cancer cells in which the expression of 67LR was reduced. This result further supports that OHBFB, like EGCG, exhibits anticancer activity in a 67LR-dependent manner.
  • the PDE5 inhibitor vardenafil (manufactured by Cayman Chemical Co., Ltd.) was added to a final concentration of 5 ⁇ M and incubated for 3 hours. Subsequently, final concentrations of 0, 0.5, 1.0 and 2.5 ⁇ M OHBFB were added, and the cells were further cultured for 96 hours. Thereafter, cell viability was measured using a commercially available kit (trade name "ATPlite", Perkin Elmer).
  • the IC 50 of OHBFB was calculated to be 1.07 ⁇ M when OHBFB and vardenafil were used in combination.
  • FIG. 12 is a graph showing the results of isobologram analysis.
  • the IC 50 (4.0 ⁇ M) of OHBFB is plotted on the x-axis, and the IC 50 (92.68 ⁇ M) of vardenafil is plotted on the y-axis, I drew
  • the IC 50 (1.07 ⁇ M) of OHBFB in combination with vardenafil (final concentration 5 ⁇ M) was plotted.
  • Example 12 Anti-cancer activity enhancing action of OHBFB by eriodictyol
  • the anti-cancer activity enhancing effect of OHBFB by eriodictyol was evaluated.
  • the human multiple myeloma cell line U266 will be 5 ⁇ 10 4 cells / mL in RPMI 1640 medium supplemented with 1% FCS, SOD (5 U / mL), catalase (200 U / mL) The cells were suspended as described above and seeded in 96-well plates in 100 ⁇ l / well.
  • the IC 50 of OHBFB was calculated to be 1.16 ⁇ M when OHBFB and eriodictyol were used in combination.
  • FIG. 13 is a graph showing the results of isobologram analysis.
  • the IC 50 (4.0 ⁇ M) of OHBFB is plotted on the x axis, and the IC 50 (89.4 ⁇ M) of eriodicthiol is plotted on the y axis, and their values are connected. I drew a straight line.
  • the IC 50 (1.16 ⁇ M) of OHBFB in combination with eriodictyol (final concentration 5 ⁇ M) was plotted.
  • the anti-cancer activity enhancing effect of OHBFB by flavanone was evaluated.
  • the human multiple myeloma cell line U266 will be 5 ⁇ 10 4 cells / mL in RPMI 1640 medium supplemented with 1% FCS, SOD (5 U / mL), catalase (200 U / mL)
  • FCS fetal bovine serum
  • SOD SOD
  • catalase 200 U / mL
  • the cells were suspended as described above and seeded in 96-well plates in 100 ⁇ l / well.
  • a final concentration of 5 ⁇ M flavanone and a final concentration of 0 ⁇ M or 2.5 ⁇ M OHBFB were added, respectively, and the cells were cultured for 96 hours.
  • a sample to which the same volume of PBS was added instead of flavanone was used.
  • eriodictyol manufactured by EXTRASYNTHESE
  • naringenin manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • hesperetin manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • FIG. 14 is a graph showing the measurement results of cell viability. As a result, it became clear that all of eriodictyol, naringenin and hesperetin enhance the anti-cancer activity of OHBFB.
  • mice were preliminarily bred for 2 weeks. Subsequently, 200 ⁇ L of a mouse multiple myeloma cell line, MPC-11 suspended in RPMI 1640 medium to a concentration of 5 ⁇ 10 6 cells / mL, was subcutaneously injected and implanted in the right back of the above mouse. Subsequently, OHBFB was orally administered at a dose of 10 mg / kg 5 days after transplantation. Subsequently, after 5 hours, the mice were sacrificed to remove the tumor and make tissue sections. As a control, a tumor tissue section prepared as described above except that OHBFB was not administered was used.
  • a tumor tissue section prepared as described above except that OHBFB was not administered was used.
  • tumor tissue sections were immunostained to detect the presence of Cleaved (CV) -caspase-3 (CV-caspase-3), phosphorylated eNOS Ser1177 , and phosphorylated PKC ⁇ Ser662 .
  • FIGS. 15 (a) and (b) are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining CV-caspase-3.
  • FIG. 15 (a) is a photograph showing staining results of control tumor tissue sections
  • FIG. 15 (b) is a photograph showing staining results of tumor tissue sections of OHBFB-administered mice.
  • FIG. 15 (c) is a graph showing the results of counting the number of CV-caspase-3 positive cells in FIGS. 15 (a) and 15 (b).
  • FIGS. 16 (a) and (b) are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining phosphorylated eNOS Ser 1177 .
  • FIG. 16 (a) is a photograph showing staining results of control tumor tissue sections
  • FIG. 16 (b) is a photograph showing staining results of tumor tissue sections of OHBFB-administered mice.
  • FIGS. 17 (a) and (b) are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining phosphorylated PKC ⁇ Ser 662 .
  • FIG. 17 (a) is a photograph showing the staining result of a control tumor tissue section
  • FIG. 17 (b) is a photograph showing the staining result of a tumor tissue section of an OHBFB-administered mouse.
  • ASM activity was measured as follows. The mice described above, to which OHBFB was orally administered at a dose of 10 mg / kg, were sacrificed 6 hours after the administration of OHBFB to remove tumor tissue. As a control, a tumor tissue excised from a mouse without OHBFB was used.
  • each excised tumor tissue was crushed and centrifuged, and the supernatant was adjusted to 2 mg protein / mL with PBS, and then 20 ⁇ L was dispensed into a tube.
  • 8 ⁇ L of a substrate mixture (2 ⁇ L of BODIPY-C12-sphingomyelin (manufactured by Thermo Fisher Scientific), 10 ⁇ L of 10% Triton X-100, 20 ⁇ L of 1 M sodium acetate (pH 4.5), 78 ⁇ L of water) in this tube Add, mix and incubate at 37 ° C. for 8 hours.
  • BODIPY-labeled ceramide is produced from BODIPY-C12-sphingomyelin by the activity of ASM.
  • the thin layer chromatography plate is irradiated with ultraviolet light, and the fluorescence signal of BODIPY-labeled ceramide is detected using a fluorescence image analyzer (trade name "Fusion System”, manufactured by Bilber Lumat Co., Ltd.), and analysis software (trade name) It analyzed and quantified using "kyplot” (Kaiens).
  • a fluorescence image analyzer trade name "Fusion System”, manufactured by Bilber Lumat Co., Ltd.
  • analysis software trade name It analyzed and quantified using "kyplot” (Kaiens).
  • FIG. 18 is a graph showing the measurement results of ASM activity in tumor tissues of the OHBFB non-administration group (control) and the administration group. The results are shown as a percentage (%) of the measured value of ASM activity in the control being 100.
  • FIG. 19 shows a schematic of the eNOS / PKC ⁇ / ASM pathway activated by OHBFB.
  • mice 5-week old females
  • the mouse plasmacytoma cell line MPC-11 was subcutaneously injected and implanted in the right back so as to be 1 ⁇ 10 6 / mouse.
  • OHBFB (10 mg / kg) was orally administered (ig) to mice in which tumor formation was confirmed, and 5 hours after administration, sacrifice was performed by cardiac blood sampling under isoflurane anesthesia to remove tumor tissue.
  • LCMS-IT-TOF Shimadzu Corporation
  • the sample was subjected to LCMS-IT-TOF (Shimadzu Corporation) at an injection volume of 5 ⁇ L.
  • the mobile phase As the mobile phase, (A) ultrapure water containing 0.05% formic acid and (B) acetonitrile containing 0.05% formic acid were used. The flow rate is 0.15 mL / min, and the concentration of mobile phase B is 0 to 2 minutes: 5%, 2 to 3.5 minutes: 5 to 20%, 3.5 to 10 minutes: 20 to 40%, 10 to The measurement was performed under the gradient conditions of 13 minutes: 40 to 100%, 13 to 15.5 minutes: 100%, 15.5 to 16 minutes: 100 to 5%, and 16 to 20 minutes: 5%.
  • L-column 2 ODS (2.1 ⁇ 150 mm, 3 ⁇ m, CERI) was used (column oven: 40 ° C.).
  • the ionization was performed by the Electrospray Ionization (ESI) method (negative ion mode), the CDL and heat block temperature were set to 200 ° C., and data were acquired in the scan mode (m / z 350 to 1,400).
  • ESI Electrospray Ionization
  • Example 16 (Inducing ability 2 of cGMP production of OHBFB) The cGMP production-inducing action of OHBFB on cells was evaluated. Specifically, first, HUVEC which is human umbilical vein endothelial cells were suspended in EGM-2 medium and adjusted to 5 ⁇ 10 6 cells / mL. Subsequently, OHBFB was added to a final concentration of 5 ⁇ M and seeded at 50 ⁇ l / well in a 96-well plate. Subsequently, after incubating at 37 ° C. for 1 hour, the amount of intracellular cGMP was measured by the RT-FRET method (cGMP assay, cisbio).
  • FIG. 20 is a graph showing the results of measurement of intracellular cGMP.
  • ** indicates that there is a statistically significant difference at p ⁇ 0.01 by Student's t-test.
  • Example 17 (Immune function enhancing action of OHBFB) The immune function enhancing effect of OHBFB was examined. Specifically, first, mononuclear cells were collected from the spleen of Balb / c mice (6 weeks old, female), and 2 mL / well was seeded in a 12-well plate so as to be 2 ⁇ 10 6 / mL. .
  • TLR5 Toll-like receptor 5
  • TLR7 which is a receptor that recognizes single-stranded RNA of virus
  • the amount of CCR5 mRNA expression was measured by real-time PCR.
  • the expression levels of TLR5, TLR7 and CCR5 were normalized using the expression level of the housekeeping gene ⁇ -actin gene.
  • a sense primer showing a nucleotide sequence in SEQ ID NO: 1 and an antisense primer showing a nucleotide sequence in SEQ ID NO: 2 were used.
  • a sense primer showing a nucleotide sequence in SEQ ID NO: 3 and an antisense primer showing a nucleotide sequence in SEQ ID NO: 4 were used.
  • a sense primer showing a nucleotide sequence in SEQ ID NO: 5 and an antisense primer showing a nucleotide sequence in SEQ ID NO: 6 were used.
  • a sense primer having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and an antisense primer having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 were used.
  • FIGS. 21 (a) to (c) are graphs showing the results of real-time PCR.
  • FIG. 21 (a) is a graph showing the measurement results of the expression level of TLR5.
  • FIG. 21 (b) is a graph showing the measurement results of the expression level of TLR7.
  • FIG. 21 (c) is a graph showing the measurement results of the expression level of CCR5.
  • “*” indicates that there is a statistically significant difference at p ⁇ 0.05 with respect to the result of OHBFB 0 ⁇ M by Dunnett's test.
  • "**" indicates that there is a statistically significant difference at p ⁇ 0.01 with respect to the result of OHBFB 0 ⁇ M by Dunnett's test.
  • OHBFB promotes the expression of TLR5, TLR7 and CCR5 to spleen mononuclear cells.
  • OHBFB acts to enhance the ability to prevent bacterial and viral infections by promoting the expression of these molecules. Therefore, OHBFB can be said to have an immune function enhancing action.
  • HUVEC which is human umbilical vein endothelial cells are suspended in 10% fetal bovine serum (FBS) -EGM-2 medium and prepared to be 1.5 ⁇ 10 5 cells / mL, The 12-well plate was seeded at 2 mL per well. Subsequently, after 24 hours of pre-incubation, the medium was replaced with 10% FBS-EGM-2 medium containing OHBFB at a final concentration of 0, 1 or 5 ⁇ M and cultured for further 24 hours.
  • FBS fetal bovine serum
  • TFPI Tissue factor pathway inhibitor
  • the expression level of TFPI was normalized using the expression level of the housekeeping gene ⁇ -actin gene.
  • a sense primer showing a nucleotide sequence in SEQ ID NO: 9 and an antisense primer showing a nucleotide sequence in SEQ ID NO: 10 were used.
  • a sense primer showing a nucleotide sequence in SEQ ID NO: 11 and an antisense primer showing a nucleotide sequence in SEQ ID NO: 12 were used.
  • FIG. 22 is a graph showing the results of real-time PCR.
  • ** indicates that there is a statistically significant difference at p ⁇ 0.01 with respect to the result of OHBFB 0 ⁇ M by Dunnett's test.
  • OHBFB was found to promote TFPI expression to human umbilical vein endothelial cell HUVEC. That is, it became clear that OHBFB has an arteriosclerosis preventive action and a thrombosis preventive action.
  • the expression level of MuRF1 was normalized using the expression level of the housekeeping gene glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene.
  • GPDH glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • a sense primer showing a nucleotide sequence in SEQ ID NO: 13 and an antisense primer showing a nucleotide sequence in SEQ ID NO: 14 were used.
  • a sense primer showing a nucleotide sequence in SEQ ID NO: 15 and an antisense primer showing a nucleotide sequence in SEQ ID NO: 16 were used.
  • FIG. 23 is a graph showing the results of real-time PCR.
  • ns indicates that there is no statistically significant difference to the OHBFB 0 ⁇ M result by Dunnett's test
  • “*” indicates p to the OHBFB 0 ⁇ M result by Dunnett's test. It represents that a statistical significant difference exists by ⁇ 0.05.
  • OHBFB suppresses the expression of MuRF1 in skeletal muscle cells. That is, it became clear that OHBFB has a muscle atrophy inhibitory effect.
  • the medium was exchanged with 5% FBS-DMEM containing OHBFB at a final concentration of 1 ⁇ M, and culture was further performed for 1 hour. Moreover, the group which did not add OHBFB was prepared for comparison. Subsequently, lipopolysaccharide (LPS) at a final concentration of 50 ng / mL was added, and culture was further continued for 24 hours. Moreover, the group which did not add LPS was prepared for comparison.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the culture supernatant was collected, and the concentration of the inflammatory cytokine TNF- ⁇ was quantified by ELISA. Also, the amount of protein in the culture supernatant was measured, and the amount of TNF- ⁇ per unit amount of protein was calculated.
  • FIG. 24 is a graph showing the results of calculation of the amount of TNF- ⁇ .
  • OHBFB suppresses LPS-induced TNF- ⁇ expression induction in macrophages. That is, it became clear that OHBFB has anti-inflammatory use.
  • the resultant was centrifuged at 200 ⁇ g for 5 minutes at 4 ° C., and the supernatant was recovered.
  • 50 mL of a substrate solution 0.5 mM p-nitrophenyl-N-acetyl-bD-glucosaminide
  • reaction termination solution 0.1 M sodium bicarbonate buffer, pH 10.
  • FIG. 25 is a graph showing the calculation results of the liberation rate of ⁇ -hexosaminidase.
  • ** indicates that there is a statistically significant difference at p ⁇ 0.01 with respect to the result of OHBFB 0 ⁇ M by Dunnett's test.
  • OHBFB inhibits degranulation on basophil cells. That is, it became clear that OHBFB has antiallergic activity.
  • a 67LR agonist stronger than EGCG can be provided.

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Abstract

ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体を有効成分として含有する、６７ｋＤａラミニンレセプターアゴニスト。

Description

６７ｋＤａラミニンレセプターアゴニスト及びその使用
　本発明は、６７ｋＤａラミニンレセプター（以下、「６７ＬＲ」という場合がある。）アゴニスト及びその使用に関する。より具体的には、６７ＬＲアゴニスト、６７ＬＲアゴニスト組成物、６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善用食品組成物及び６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善方法に関する。本願は、２０１７年８月４日に、日本に出願された特願２０１７－１５１７０８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　緑茶に含まれる主要なカテキンの一種であるエピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ－Ｏ－ｇａｌｌａｔｅ、以下、「ＥＧＣＧ」という場合がある。）は、抗癌作用を有することが報告されており（例えば、非特許文献１を参照。）、血液癌の一種である慢性リンパ性白血病患者において第二相臨床試験が行われている（例えば、非特許文献２を参照。）。
　発明者らは、これまでにＥＧＣＧが細胞膜上の６７ＬＲに結合することで抗癌作用を発揮することを明らかにした（例えば、非特許文献３を参照。）。６７ＬＲの発現は癌細胞において異常に亢進している。ＥＧＣＧが６７ＬＲに結合すると、Ａｋｔが活性化され、内皮性一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）を活性化され、一酸化窒素（ＮＯ）及び環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の産生が誘導され、タンパク質キナーゼＣδ（ＰＫＣδ）が活性化され、産生スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）が活性化され、その結果、細胞死が誘導される。すなわち、ＥＧＣＧは、６７ＬＲを介してｅＮＯＳ／ＰＫＣδ／ＡＳＭ経路を活性化し、細胞致死活性を示す。
　６７ＬＲを介したＥＧＣＧの作用には、抗癌作用だけでなく、抗アレルギー作用、抗肥満作用、抗動脈硬化作用、抗炎症作用、筋萎縮阻害作用、コレステロール低下作用、抗血栓性作用、免疫増強作用、神経細胞保護作用等が知られている（例えば、特許文献１、２を参照。）。
国際公開第２０１１／１６２３２０号 国際公開第２０１５／１９９１６９号
Khan N, et al., Targeting multiple signaling pathways by green tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate., Cancer res., 66 (5), 2500-2505, 2006. Shanafelt TD, et al., Phase I trial of daily oral Polyphenon E in patients with asymptomatic Rai stage 0 to II chronic lymphocytic leukemia., J. Clin. Oncol., 27 (23), 3808-3814, 2009. Tachibana H, et al., A receptor for green tea polyphenol EGCG., Nat. Struct. Mol. Biol., 11 (4), 380-381, 2004.
　このような状況のもと、ＥＧＣＧの作用増強が強く望まれている。本発明は、ＥＧＣＧよりも強力な６７ＬＲアゴニストを提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体を有効成分として含有する、６７ＬＲアゴニスト。
［２］前記ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体が、下記式（１）又は（２）で表される化合物である、［１］に記載の６７ＬＲアゴニスト。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［式（１）中、Ｒ１はそれぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基、炭素数１～３のアルキル基又は－ＯＲ２（ここで、Ｒ２はグルコース、マンノース、キシロース、ガラクトース又はマルトースから水素原子を１個除いた基を表す。）を表し、Ｒ３はそれぞれ独立に存在しないか又はハロゲン原子若しくは炭素数１～３のアルキル基を表し、Ｒ４はそれぞれ独立に水素原子又は下記式（１Ａ）で表される基を表す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ［式（１Ａ）中、Ｒ１及びＲ３の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 ［式（２）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
［３］前記ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体が、下記式（３）～（６）のいずれかで表される化合物である、［１］又は［２］に記載の６７ＬＲアゴニスト。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 ［式（３）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 ［式（４）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 ［式（５）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 ［式（６）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
［４］６７ＬＲ関連疾患の予防又は治療用である、［１］～［３］のいずれかに記載の６７ＬＲアゴニスト。
［５］前記６７ＬＲ関連疾患が、癌、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症、筋委縮、高コレステロール血症、血栓症又は免疫不全である、［４］に記載の６７ＬＲアゴニスト。
［６］［１］～［３］のいずれかに記載の６７ＬＲアゴニストと、ホスホジエステラーゼ阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体とを含有する、６７ＬＲアゴニスト組成物。
［７］６７ＬＲ関連疾患の予防又は治療用である、［６］に記載の６７ＬＲアゴニスト組成物。
［８］前記６７ＬＲ関連疾患が、癌、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症、筋委縮、高コレステロール血症、血栓症又は免疫不全である、［７］に記載の６７ＬＲアゴニスト組成物。
［９］［１］～［３］のいずれかに記載の６７ＬＲアゴニストを含有する、６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善用食品組成物。
［１０］ホスホジエステラーゼ阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体を更に含有する、［９］に記載の６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善用食品組成物。
［１１］［９］又は［１０］に記載の食品組成物をヒト又は動物に摂取させる工程を備える、６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善方法（ヒトに対する医療行為を除く。）。
［１２］前記６７ＬＲ関連疾患が、癌、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症、筋委縮、高コレステロール血症、血栓症又は免疫不全である、［１１］に記載の予防又は改善方法。
　本発明によれば、ＥＧＣＧよりも強力な６７ＬＲアゴニストを提供することができる。
（ａ）～（ｎ）は、実験例１における各癌細胞株の生存率を示すグラフである。 実験例１において、各癌細胞株に対するウーロンホモビスフラバンＢ（ＯＨＢＦＢ）のＩＣ５０とＥＧＣＧのＩＣ５０をプロットしたグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例２における蛍光顕微鏡写真である。 実験例３における細胞生存率の測定結果を示すグラフである。 実験例４における細胞内ｃＧＭＰの測定結果を示すグラフである。 実験例５における細胞生存率の測定結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例６において、リン酸化ｅＮＯＳＳｅｒ１１７７及びｅＮＯＳをウエスタンブロット法により検出した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）の結果を数値化し、ｅＮＯＳの存在量に対するリン酸化ｅＮＯＳＳｅｒ１１７７の存在量を算出した結果を示すグラフである。 実験例７における細胞生存率の測定結果を示すグラフである。 実験例８におけるＡｋｔ活性の測定結果を示すグラフである。 実験例９における細胞生存率の測定結果を示すグラフである。 実験例１０における細胞生存率の測定結果を示すグラフである。 実験例１１におけるアイソボログラム解析の結果を示すグラフである。 実験例１２におけるアイソボログラム解析の結果を示すグラフである。 実験例１３における細胞生存率の測定結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例１４において、ＣＶ－ｃａｓｐａｓｅ－３を免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ｃ）は、（ａ）及び（ｂ）における、ＣＶ－ｃａｓｐａｓｅ－３陽性細胞数を計測した結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例１４において、リン酸化ｅＮＯＳＳｅｒ１１７７を免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例１４において、リン酸化ＰＫＣδＳｅｒ６６２を免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 実験例１４において、ＯＨＢＦＢ非投与群（対照）及び投与群の腫瘍組織におけるＡＳＭ活性の測定結果を示すグラフである。 ＯＨＢＦＢにより活性化される、ｅＮＯＳ／ＰＫＣδ／ＡＳＭ経路の模式図を示す。 実験例１６における細胞内ｃＧＭＰの測定結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｃ）は、実験例１７におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。 実験例１８におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。 実験例１９におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。 実験例２０におけるＴＮＦ－α量の算出結果を示すグラフである。 実験例２１におけるβ－ヘキソサミニダーゼの遊離率の算出結果を示すグラフである。
［６７ＬＲアゴニスト］
　１実施形態において、本発明は、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体を有効成分として含有する、６７ＬＲアゴニストを提供する。
　実施例において後述するように、本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、ＥＧＣＧよりも強力に６７ＬＲの下流のシグナル伝達経路を活性化する。ここで、ＥＧＣＧよりも強力であるとは、例えば、ＥＧＣＧと比較して５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が低いことを意味する。ＩＣ５０は、例えば、癌細胞の培地に段階希釈した６７ＬＲアゴニストを添加し、９６時間培養後の細胞生存率を測定すること等により測定することができる。
　ウーロン茶重合ポリフェノールとは、半発酵というウーロン茶の独特の製造方法において、酵素反応や熱重合反応により形成される、カテキン類が複雑に結合した化合物の総称であり、例えばカテキン類の２量体、カテキン類の３量体等が挙げられる。カテキン類の２量体としては、例えば、後述するウーロンホモビスフラバンＡ、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ、ウーロンホモビスフラバンＢ、ウーロンホモビスフラバンＣ等のウーロンホモビスフラバン類等が挙げられる。
　本実施形態の６７ＬＲアゴニストの分子量は、例えば８００以上であってもよく、例えば９００以上であってもよく、例えば１０００以上であってもよい。６７ＬＲアゴニストの分子量の上限は特に制限されないが、概ね３０００程度であってもよい。
　一般的に、分子量が５００以上の化合物は、経口投与した場合に生体内への吸収が悪いと考えられている。このため、ウーロン茶重合ポリフェノールは、経口投与しても生体内に吸収されにくいと考えられている。
　これに対し、発明者らは、実施例において後述するように、本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、分子量が比較的大きいにもかかわらず、経口投与により生体内の癌組織に到達し、６７ＬＲの下流のシグナル伝達経路を活性化することができることを明らかにした。
　本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体の溶媒和物であってもよく、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体の薬学的に許容される塩であってもよく、薬学的に許容される塩の溶媒和物であってもよい。
　薬学的に許容される塩としては、例えば、無機酸塩、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等が挙げられる。より具体的には、例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、メシル酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、亜鉛塩等の金属塩；アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアンモニウム塩；モルホリン、ピペリジン等の有機アミン付加塩；グリシン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸付加塩等が挙げられる。
　また、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体の溶媒和物、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体の塩の溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物であれば特に制限されず、例えば、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。
　より具体的な本実施形態の６７ＬＲアゴニストとしては、例えば、下記式（１）又は（２）で表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 ［式（１）中、Ｒ１はそれぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基、炭素数１～３のアルキル基又は－ＯＲ２（ここで、Ｒ２はグルコース、マンノース、キシロース、ガラクトース又はマルトースから水素原子を１個除いた基を表す。）を表し、Ｒ３はそれぞれ独立に存在しないか又はハロゲン原子若しくは炭素数１～３のアルキル基を表し、Ｒ４はそれぞれ独立に水素原子又は下記式（１Ａ）で表される基を表す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 ［式（１Ａ）中、Ｒ１及びＲ３の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 ［式（２）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
　上記式（１）で表される化合物は、ウーロンホモビスフラバン類と呼ばれる化合物又はその誘導体を含む。いいかえると、上記式（１）で表される化合物は、カテキン類の２量体を骨格とする化合物であるということができる。また、上記式（２）で表される化合物は、カテキン類の３量体を骨格とする化合物であるということができる。
　本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、６７ＬＲのアゴニスト活性を有している限り、ウーロン茶重合ポリフェノールの誘導体であってもよい。ウーロン茶重合ポリフェノールの誘導体としては、例えばウーロン茶重合ポリフェノールを基本骨格として、一部の官能基を変更する等した化合物が挙げられる。
　ウーロン茶重合ポリフェノールを誘導体化することにより、例えば、水溶性、脂溶性等の物理的な性質や、６７ＬＲアゴニスト活性、血中滞留性、生体毒性等の生物学的な活性等を所望の範囲に調節することができる。
　ウーロン茶重合ポリフェノールの誘導体としては、上記式（１）、上記式（１Ａ）又は上記式（２）において、Ｒ１がそれぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基、炭素数１～３のアルキル基又は－ＯＲ２（ここで、Ｒ２はグルコース、マンノース、キシロース、ガラクトース又はマルトースから水素原子を１個除いた基を表す。）であり、Ｒ３がそれぞれ独立に存在しないか又はハロゲン原子若しくは炭素数１～３のアルキル基である化合物等が挙げられる。
　ここで、Ｒ１又はＲ３で表される炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基等が挙げられる。炭素数１～３のアルキル基は置換されていてもよい。炭素数１～３のアルキル基の置換基としては、例えばハロゲン原子が挙げられる。ハロゲン原子としては、フッ素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられる。また、Ｒ３で表されるハロゲン原子としては、フッ素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられる。
　更に具体的な本実施形態の６７ＬＲアゴニストとしては、例えば、下記式（３）～（６）のいずれかで表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 ［式（３）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
　式（３）で表され、式（３）中、Ｒ１がヒドロキシル基であり、Ｒ３が存在せず、Ｒ４が上記式（１Ａ）で表され、式（１Ａ）中、Ｒ１がヒドロキシル基であり、Ｒ３が存在しない化合物は、ウーロンホモビスフラバンＡとして知られる化合物である。すなわち、本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、ウーロンホモビスフラバンＡ又はその誘導体であってもよい。
　また、上記のウーロンホモビスフラバンＡにおいて、Ｒ４で表される基の一方が水素原子である化合物は、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡとして知られる化合物である。すなわち、本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ又はその誘導体であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 ［式（４）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
　式（４）で表され、式（４）中、Ｒ１がヒドロキシル基であり、Ｒ３が存在せず、Ｒ４が上記式（１Ａ）で表され、式（１Ａ）中、Ｒ１がヒドロキシル基であり、Ｒ３が存在しない化合物は、ウーロンホモビスフラバンＢとして知られる化合物である。すなわち、本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、ウーロンホモビスフラバンＢ又はその誘導体であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 ［式（５）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
　式（５）で表され、式（５）中、Ｒ１がヒドロキシル基であり、Ｒ３が存在せず、Ｒ４が上記式（１Ａ）で表され、式（１Ａ）中、Ｒ１がヒドロキシル基であり、Ｒ３が存在しない化合物は、ウーロンホモビスフラバンＣとして知られる化合物である。すなわち、本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、ウーロンホモビスフラバンＣ又はその誘導体であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 ［式（６）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
　式（６）で表される化合物は、例えば、次のような製造方法により製造することができる。すなわち、エピガロカテキン－３－Ｏ－ガレート等のフラバン－３－オール類を、メタノール、エタノール等の溶媒中で、塩酸、硫酸等の酸の存在下、ホルムアルデヒドと反応させること等により製造することができる。反応溶液中のホルムアルデヒドの濃度は、３～３７ｗ／ｖ％が好ましい。生じた生成物は、必要に応じてエステル化、加水分解等の誘導化を行ってもよい。
　本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、６７ＬＲ関連疾患の予防又は治療用に好適に用いることができる。本明細書において、６７ＬＲ関連疾患としては、癌、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症、筋委縮、高コレステロール血症、血栓症、免疫不全等が挙げられる。
　実施例において後述するように、本実施形態の６７ＬＲアゴニストを生体に投与することにより、例えば癌細胞致死活性、すなわち抗癌活性を発揮することができる。癌としては、６７ＬＲの発現が亢進している癌であれば特に制限されず、例えば、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、前立腺癌、メラノーマ、乳癌、肺癌、子宮頸癌、結腸癌等が挙げられる。
　また、実施例において後述するように、本実施形態の６７ＬＲアゴニストの作用機序はＥＧＣＧの作用機序と同様である。したがって、本実施形態の６７ＬＲアゴニストは、ＥＧＣＧにおいて見出されているものと同様の用途に用いることができる。
［６７ＬＲアゴニスト組成物］
　１実施形態において、本発明は、上述した６７ＬＲアゴニストと、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体とを含有する、６７ＬＲアゴニスト組成物を提供する。６７ＬＲアゴニストとしては、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
　本実施形態の６７ＬＲアゴニスト組成物は、上述した６７ＬＲアゴニストと、ＰＤＥ阻害剤とを含有するものであってもよい。
　実施例において後述するように、上述した６７ＬＲアゴニストと、ＰＤＥ阻害剤とを併用することにより、６７ＬＲアゴニストの活性を相乗的に増強することができる。
　ＰＤＥ阻害剤は、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ等の環状リン酸ジエステルを加水分解する酵素を阻害する物質であり、非選択的なＰＤＥ阻害剤と選択的なＰＤＥ阻害剤とが知られている。本実施形態の６７ＬＲアゴニスト組成物が含有するＰＤＥ阻害剤は、非選択的なＰＤＥ阻害剤であってもよく、選択的なＰＤＥ阻害剤であってもよい。
　非選択的なＰＤＥ阻害剤としては、例えば、カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、ペントキシフィリン等が挙げられる。
　選択的なＰＤＥ阻害剤としては、例えば、８－メトキシ－３－イソブチル－１－メチルキサンチン等のＰＤＥ１阻害剤；エリスロ－９－（２－ヒドロキシ－３－ノニル）アデニン塩酸塩等のＰＤＥ２阻害剤；シロスタミド、ミルリノン、トレキシン等のＰＤＥ３阻害剤；エタゾラート塩酸塩、デンブフィリン等のＰＤＥ４阻害剤；バルデナフィル、シルデナフィル、ザプリナスト、タダラフィル、ジピリダモール、４－｛［３’，４’－（メチレンジオキシ）ベンジル］アミノ｝－６－メトキシキナゾリン、１－（３－クロロアニリノ）－４－フェニルフタラジン（ＭＹ－５４４５）、硫化水素等のＰＤＥ５阻害剤が挙げられる。中でも、ＰＤＥ３阻害剤又はＰＤＥ５阻害剤が好ましい。
　ところで、生体にポリスルフィド類を投与すると、代謝されて硫化水素が生成される。このため、ポリスルフィド類はＰＤＥ５阻害剤であるということができる。ポリスルフィド類としては、例えばジアリルジスルフィド、ジアリルトリスルフィド等が挙げられる。
　本実施形態の６７ＬＲアゴニスト組成物において、ＰＤＥ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。また、６７ＬＲアゴニストも、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
　本実施形態の６７ＬＲアゴニスト組成物において、ＰＤＥ阻害剤１００質量部あたりの６７ＬＲアゴニストの配合割合は、例えば１～１０００質量部であってもよく、例えば１～５００質量部であってもよく、例えば１０～１００質量部であってもよく、例えば１０～８０質量部であってもよい。
　本実施形態の６７ＬＲアゴニスト組成物は、上述した６７ＬＲアゴニストと、フラバノン若しくはその配糖体とを含有するものであってもよい。
　実施例において後述するように、上述した６７ＬＲアゴニストと、フラバノン若しくはその配糖体とを併用することにより、６７ＬＲアゴニストの活性を相乗的に増強することができる。
　フラバノン若しくはその配糖体（フラバノン又はフラバノンの配糖体）としては、エリオジクチオール、ナリンゲニン、ヘスペレチン、エリオジクチオール配糖体、ナリンゲニン配糖体、ヘスペレチン配糖体等が挙げられる。
　本実施形態の６７ＬＲアゴニスト組成物において、フラバノン若しくはその配糖体は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。また、６７ＬＲアゴニストについても、１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
　本実施形態の６７ＬＲアゴニスト組成物において、フラバノン若しくはその配糖体１００質量部あたりの６７ＬＲアゴニストの配合割合は、例えば１～１００質量部であってもよく、例えば１０～１００質量部であってもよく、例えば２０～１００質量部であってもよい。
　本実施形態の６７ＬＲアゴニスト組成物は、上述した６７ＬＲアゴニストと、ＰＤＥ阻害剤と、フラバノン若しくはその配糖体とを含有するものであってもよい。
　本実施形態の６７ＬＲアゴニスト組成物は、６７ＬＲ関連疾患の予防又は治療用であってもよい。６７ＬＲ関連疾患としては、上述したものと同様のものが挙げられる。
［医薬組成物］
　上述した６７ＬＲアゴニスト又は６７ＬＲアゴニスト組成物は、薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物として製剤化されていてもよい。
　上記の医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の形態で非経口的に投与することができる。皮膚外用剤としては、より具体的には、軟膏剤、貼付剤等の剤型が挙げられる。
　薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。
　医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。
　医薬組成物は、上述した６７ＬＲアゴニスト又は６７ＬＲアゴニスト組成物と、上述した薬学的に許容される担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
　医薬組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、例えば、投与単位形態あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分（６７ＬＲアゴニスト）を投与すればよい。また、注射剤の場合には、例えば、投与単位形態あたり０．０１～５０ｍｇの有効成分を投与すればよい。
　また、医薬組成物の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、例えば、成人１日あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の有効成分を１日１回又は２～４回程度に分けて投与すればよい。
［食品組成物］
　１実施形態において、本発明は、上述した６７ＬＲアゴニストを含有する、６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善用食品組成物を提供する。本実施形態の食品組成物は、ＰＤＥ阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体を更に含有していてもよい。
　実施例において後述するように、本実施形態の食品組成物を生体に摂取させることにより、６７ＬＲ関連疾患を予防又は改善することができる。６７ＬＲ関連疾患としては、上述したものが挙げられる。
　本実施形態の食品組成物において、６７ＬＲアゴニストとしては、上述したもののうち、食品への添加が認められたものを適宜使用することができる。
　より具体的な６７ＬＲアゴニストとしては、例えば、ウーロン茶から抽出されたウーロン茶重合ポリフェノール、ウーロンホモビスフラバンＡ、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ、ウーロンホモビスフラバンＢ、ウーロンホモビスフラバンＣ等が挙げられる。
　６７ＬＲアゴニストは、化学的に合成されたもの又は天然物から精製されたものを添加してもよく、６７ＬＲアゴニストを含む食品を食品組成物の原料に用いることにより含有させてもよい。６７ＬＲアゴニストを含有する食品としては、例えば、ウーロン茶、ウーロン茶抽出物、紅茶、紅茶抽出物等が挙げられる。
　本実施形態の食品組成物において、ＰＤＥ阻害剤は、食品への添加が認められた成分であることが好ましく、例えば、カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、ポリスルフィド類等が挙げられる。ポリスルフィド類としては、例えばジアリルジスルフィド、ジアリルトリスルフィド等が挙げられる。これらのＰＤＥ阻害剤は、化学的に合成されたもの又は天然物から精製されたものを添加してもよく、これらのＰＤＥ阻害剤を含む食品を食品組成物の原料に用いることにより含有させてもよい。カフェインを含有する食品としては、例えば、コーヒー、緑茶、ウーロン茶、紅茶、ココア等が挙げられる。テオフィリンを含有する食品としては、例えば、茶葉等が挙げられる。テオブロミンを含有する食品としては、例えば、カカオ等が挙げられる。ポリスルフィド類を含有する食品としては、ニンニク、ネギ、ニラ、タマネギ、ラッキョウ等のネギ属野菜等が挙げられる。
　本実施形態の食品組成物において、フラバノン若しくはその配糖体としては、食品への添加が認められた成分であることが好ましく、例えば、エリオジクチオール、ナリンゲニン、ヘスペレチン、エリオジクチオール配糖体、ナリンゲニン配糖体、ヘスペレチン配糖体等が挙げられる。
　これらのフラバノン若しくはその配糖体は、化学的に合成されたもの又は天然物から精製されたものを添加してもよく、これらのフラバノン若しくはその配糖体を含む食品を食品組成物の原料に用いることにより含有させてもよい。これらのフラバノン若しくはその配糖体を含有する食品としては、例えば、柑橘類が挙げられる。柑橘類としては、例えば、オレンジ、グレープフルーツ、ユズ、ダイダイ、カボス、スダチ、ユコウ、ゆうこう、シークヮーサー、レモン、ライム、ナツミカン、ハッサク、イヨカン、ブンタン、マンダリンオレンジ、ウンシュウミカン、ポンカン、タチバナ、紀州ミカン、バレンシアオレンジ、ネーブルオレンジ、ブラッドオレンジ、ジャッファ・オレンジ、ベルガモット、キノット等のミカン属柑橘類、カラタチ属柑橘類、キンカン属柑橘類等が挙げられる。
　本実施形態の食品組成物において、６７ＬＲアゴニスト、ＰＤＥ阻害剤、フラバノン若しくはその配糖体は、それぞれ１種を単独で添加してもよく、２種以上を混合して添加してもよい。
　本実施形態の食品組成物は、１日あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の６７ＬＲアゴニストを摂取するように用いられてもよい。また、食品組成物は、１日１回又は２～４回程度に分けて摂取するように用いられてもよい。
　本実施形態の食品組成物は、例えば、サプリメントの形態であってもよいし、飲料の形態であってもよいし、固形状、半固形状又はゲル状食品の形態であってもよいし、任意の調理済み食品の形態等であってもよい。サプリメントの形状としては、例えば、実施例において使用したカプセル等の形状が挙げられる。
　本実施形態の食品組成物は、機能性表示食品であってもよい。「機能性表示食品」とは、科学的根拠を基に商品パッケージに機能性を表示するものとして、消費者庁に届け出られた食品を意味する。当該表示として、例えば、「血中コレステロールを低下させる」、「自然免疫力を向上させ、感染因子からの保護に寄与する」等が挙げられるが、これらに限定されない。また、機能性表示のない食品組成物であっても、機能性をチラシ、広告等に記載又は音声等で表示して製造、販売することも考えらえる。
　本実施形態の食品組成物は、特別用途食品であってもよい。特別用途食品とは、国の許可を受けて、乳児、幼児、妊産婦、病者等の発育、健康の保持・回復等に適するという特別の用途について表示する食品を意味する。本実施形態の食品組成物は、特別用途食品のうちの病者用食品であってもよい。あるいは、本実施形態の食品組成物は、特別用途食品のうちの特定保健用食品であってもよい。特定保健用食品とは、健康の維持増進に役立つことが科学的根拠に基づいて認められ、その効果の表示が許可されている食品を意味する。表示されている効果や安全性については国が審査を行い、食品ごとに消費者庁長官により許可される。
［６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善方法］
　１実施形態において、本発明は、上述した食品組成物をヒト又は動物に摂取させる工程を備える、６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善方法（ヒトに対する医療行為を除く。）を提供する。ここで、６７ＬＲ関連疾患としては上述したものが挙げられる。本実施形態の６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善方法において、医療行為とは、医師（医師の指示を受けた者を含む。）がヒトに対して治療を実施する行為を意味する。
　本実施形態の６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善方法において、ヒト又は動物に摂取させる食品組成物の量としては、１日あたり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の６７ＬＲアゴニストを摂取する量が挙げられる。食品組成物は、１日１回又は２～４回程度に分けて摂取させてもよい。
［その他の実施形態］
　１実施形態において、本発明は、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、６７ＬＲ関連疾患の治療方法を提供する。ここで、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体としては、上述した６７ＬＲアゴニストが挙げられる。また、６７ＬＲ関連疾患としては上述したものが挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体と、ホスホジエステラーゼ阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体とを含有する組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含む、６７ＬＲ関連疾患の治療方法を提供する。ここで、６７ＬＲ関連疾患、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤、フラバノン若しくはその配糖体としては、上述したものが挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、６７ＬＲ発現細胞にＥＧＣＧを接触させた場合よりも強力に６７ＬＲの下流のシグナル伝達経路を活性化する方法であって、６７ＬＲ発現細胞にウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体を接触させる工程を備える方法を提供する。ここで、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体としては、上述したものが挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、６７ＬＲ発現細胞にＥＧＣＧを接触させた場合よりも強力に６７ＬＲの下流のシグナル伝達経路を活性化する方法であって、６７ＬＲ発現細胞に、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体、及び、ホスホジエステラーゼ阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体を接触させる工程を備える方法を提供する。ここで、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤、フラバノン若しくはその配糖体としては、上述したものが挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、６７ＬＲ関連疾患の治療のためのウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体を提供する。ここで、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体としては、上述した６７ＬＲアゴニストが挙げられる。また、６７ＬＲ関連疾患としては上述したものが挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、６７ＬＲ関連疾患の治療のための医薬組成物であって、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体と、ホスホジエステラーゼ阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体とを含有する医薬組成物を提供する。ここで、６７ＬＲ関連疾患、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤、フラバノン若しくはその配糖体としては、上述したものが挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、６７ＬＲ関連疾患の予防又は治療薬を製造するためのウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体の使用を提供する。ここで、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体としては、上述した６７ＬＲアゴニストが挙げられる。また、６７ＬＲ関連疾患としては上述したものが挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、６７ＬＲ関連疾患の予防又は治療用医薬組成物を製造するための、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体、及び、ホスホジエステラーゼ阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体の使用を提供する。ここで、６７ＬＲ関連疾患、ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤、フラバノン若しくはその配糖体としては、上述したものが挙げられる。
　次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
［実験例１］
（ウーロンホモビスフラバンＢの抗癌作用）
　ウーロンホモビスフラバンＢ（Ｏｏｌｏｎｇ　ｈｏｍｏ　ｂｉｓ　ｆｌａｖａｎ　Ｂ、以下、「ＯＨＢＦＢ」という場合がある。）の抗癌作用を検討した。具体的には、各種の癌細胞株の培地にＯＨＢＦＢを添加し、生細胞数を測定した。比較のために、エピガロカテキンガレート（以下、「ＥＧＣＧ」という場合がある。）の抗癌作用についても同様に検討した。
　癌細胞株としては、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＡＲＨ７７、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＲＰＭＩ８２２６、ヒト慢性リンパ性白血病細胞株であるＭｅｃ－１、ヒト急性骨髄性白血病細胞株であるＨＬ６０、ヒト急性骨髄性白血病細胞株であるＫａｓｕｍｉ－１、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株であるＫＵ８１２を用いた。
　各癌細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ　１６４０培地を用いて、３７℃、水蒸気飽和した５％ＣＯ２条件下で継代し、対数増殖期で培養維持したものを使用した。
　ＥＧＣＧ（シグマアルドリッチ社製）は、５ｍＭとなるように超純水に溶解して－３０℃で保存し、適宜解凍して用いた。ＯＨＢＦＢ（長良バイオサイエンス社製）は、５ｍＭとなるように超純水に溶解して－３０℃で保存し、適宜解凍して用いた。
　各癌細胞株を、１％ＦＣＳ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ　１６４０培地に５×１０４個／ｍＬになるようにそれぞれ懸濁して９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、終濃度０、５、１０又は２５μＭのＯＨＢＦＢ又はＥＧＣＧをそれぞれ添加して９６時間培養した。その後、市販のキット（商品名「ＡＴＰｌｉｔｅ」、パーキンエルマー社）を用いて生細胞数を測定した。
　図１（ａ）～（ｎ）は、各癌細胞株の生存率を示すグラフである。図１（ａ）～（ｇ）は培地にＯＨＢＦＢを添加した結果を示し、図１（ｈ）～（ｎ）は培地にＥＧＣＧを添加した結果を示す。図１（ａ）及び（ｈ）はＵ２６６細胞の結果を示し、図１（ｂ）及び（ｉ）はＡＲＨ７７細胞の結果を示し、図１（ｃ）及び（ｊ）はＲＰＭＩ８２２６細胞の結果を示し、図１（ｄ）及び（ｋ）はＭｅｃ－１細胞の結果を示し、図１（ｅ）及び（ｌ）はＨＬ６０細胞の結果を示し、図１（ｆ）及び（ｍ）はＫａｓｕｍｉ－１細胞の結果を示し、図１（ｇ）及び（ｎ）はＫＵ８１２細胞の結果を示す。
　その結果、ＯＨＢＦＢは、Ｕ２６６（ＩＣ５０＝４．０μＭ）、ＡＲＨ７７（ＩＣ５０＝０．２μＭ）、ＲＰＭＩ８２２６（ＩＣ５０＝４．４μＭ）、Ｍｅｃ－１（ＩＣ５０＝１．４μＭ）、ＨＬ６０（ＩＣ５０＝２．５μＭ）、Ｋａｓｕｍｉ－１（ＩＣ５０＝３．０μＭ）、ＫＵ８１２（ＩＣ５０＝０．２μＭ）の各癌細胞株に対して抗癌作用を示すことが明らかとなった。
　また、ＥＧＣＧも、Ｕ２６６（ＩＣ５０＝１１．８μＭ）、ＡＲＨ７７（ＩＣ５０＝４．０μＭ）、ＲＰＭＩ８２２６（ＩＣ５０＝１１．１μＭ）、Ｍｅｃ－１（ＩＣ５０＝８．３μＭ）、ＨＬ６０（ＩＣ５０＝９．５μＭ）、Ｋａｓｕｍｉ－１（ＩＣ５０＝９．６μＭ）、ＫＵ８１２（ＩＣ５０＝６．２μＭ）の各癌細胞株に対して抗癌作用を示すことが確認された。
　また、ＯＨＢＦＢとＥＧＣＧのＩＣ５０の比較から、ＯＨＢＦＢはＥＧＣＧよりも少なくとも３倍程度強い抗癌作用を有することが明らかとなった。
　また、図２は、各癌細胞株に対するＯＨＢＦＢのＩＣ５０とＥＧＣＧのＩＣ５０をプロットしたグラフである。その結果、各癌細胞株のＯＨＢＦＢに対する感受性とＥＧＣＧに対する感受性との間に正の相関があることが明らかとなった。
　なお、実験結果の統計処理にはＴｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔを用い、Ｐ値は０．０５未満を有意とした。以下の実験例においても同様である。
［実験例２］
（ＯＨＢＦＢは脂質ラフトの局在変化を誘導する）
　癌細胞の脂質ラフトに対するＯＨＢＦＢの影響を評価した。具体的には、まず、ヒト多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６を、１％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ　１６４０培地に１×１０７個／ｍＬになるように懸濁し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり２００μＬずつ添加した。
　続いて、アレクサフルオロ（登録商標）５５５標識コレラトキシンＢサブユニット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）（１ｍｇ／ｍＬ）を１ウェルあたり３μＬ添加し、氷上で１５分間染色した。染色後、遠心して上清を除去し、終濃度５μＭのＯＨＢＦＢを含有するＲＰＭＩ　１６４０培地を添加して３時間インキュベートした。続いて、油浸レンズ（６０倍）を用いて蛍光顕微鏡で観察した。
　対照には、ＯＨＢＦＢの代わりに同容量のリン酸バッファー（ＰＢＳ）を添加した以外は上記と同様の操作を行った試料を用いた。ＰＢＳは、超純水１Ｌに対し、ＮａＣｌ　８．０ｇ、ＫＣｌ　０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４　１．１５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４　０．２ｇを溶解し、オートクレーブ滅菌して調製した。
　図３（ａ）及び（ｂ）は、蛍光顕微鏡写真である。図３（ａ）は対照試料の結果を示す写真であり、図３（ｂ）はＯＨＢＦＢを添加した結果を示す写真である。その結果、ＯＨＢＦＢはＥＧＣＧと同様に脂質ラフト会合作用を示すことが明らかとなった。
［実験例３］
（酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）阻害剤によるＯＨＢＦＢの抗癌作用の阻害）
　ＯＨＢＦＢの癌細胞に対する生細胞数低下作用における酸性スフィンゴミエリナーゼの関与を評価した。
　具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ　１６４０培地に５×１０４個／ｍＬとなるように懸濁して２４ウェルプレートに１ウェルあたり１ｍＬずつ播種し、酸性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤であるデシプラミン（シグマアルドリッチ社製）を終濃度５μＭとなるように添加して３時間インキュベートした。その後、ＯＨＢＦＢを終濃度が５μＭとなるように添加し、更に９６時間培養した。続いて、トリパンブルー染色により細胞生存率を測定した。
　デシプラミン（シグマアルドリッチ社製）は、５ｍＭとなるように超純水に溶解して－３０℃で保存し、適宜解凍して用いた。
　図４は、細胞生存率の測定結果を示すグラフである。その結果、ＯＨＢＦＢの癌細胞致死活性はデシプラミンの添加により阻害されることが明らかとなった。この結果から、ＯＨＢＦＢが、ＥＧＣＧと同様に、酸性スフィンゴミエリナーゼ依存的に抗癌作用を示すことが明らかとなった。
［実験例４］
（ＯＨＢＦＢのｃＧＭＰ産生誘導能１）
　ＯＨＢＦＢの癌細胞に対するｃＧＭＰ産生誘導作用を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、終濃度５μＭのＯＨＢＦＢ及び１％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ　１６４０培地に５．０×１０５個／ウェルの細胞密度で９６ウェルプレートに播種して３時間インキュベートした。その後、市販のキット（商品名「ｃＧＭＰ　ＥＩＡ　ｋｉｔ」、ケイマンケミカル社製）を用いて細胞内のｃＧＭＰ量を測定した。
　図５は、細胞内ｃＧＭＰの測定結果を示すグラフである。その結果、ＯＨＢＦＢが、ＥＧＣＧと同様に、癌細胞におけるｃＧＭＰ産生誘導作用を有することが明らかとなった。
［実験例５］
（ｃＧＭＰ合成酵素である可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の阻害剤によるＯＨＢＦＢの抗癌作用の阻害）
　ＯＨＢＦＢの癌細胞に対する生細胞数低下作用における可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の関与を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ　１６４０培地に５×１０４個／ｍＬとなるように懸濁して２４ウェルプレートに１ウェルあたり１ｍＬずつ播種した。
　続いて、ｓＧＣ阻害剤であるＮＳ２０２８（シグマアルドリッチ社製）を終濃度５μＭとなるように添加して３時間インキュベートした。続いて、細胞の培地を、ＯＨＢＦＢを終濃度５μＭ含有する培地に交換し、更に９６時間培養した。その後、トリパンブルー染色により細胞生存率を測定した。
　ＮＳ２０２８（シグマアルドリッチ社製）は、５ｍＭとなるように超純水に溶解して－３０℃で保存し、適宜解凍して用いた。
　図６は、細胞生存率の測定結果を示すグラフである。その結果、ＯＨＢＦＢの癌細胞致死活性はｓＧＣ阻害剤の添加によって消失することが明らかとなった。つまり、ＯＨＢＦＢは、ＥＧＣＧと同様に、ｓＧＣ依存的に抗癌作用を示すことが明らかとなった。
［実験例６］
（ＯＨＢＦＢによる内皮型一酸化合成酵素（ｅＮＯＳ）の活性化）
　癌細胞のｅＮＯＳに対するＯＨＢＦＢの影響を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ　１６４０培地に１×１０６個／ｍＬとなるように懸濁し、２４ウェルプレートに１ウェルあたり１ｍＬずつ播種した。続いて、ＯＨＢＦＢを終濃度が５μＭとなるように添加して１時間培養した。対照として、ＯＨＢＦＢを添加しなかった細胞を用いた。
　続いて、ｅＮＯＳ活性化の指標であるｅＮＯＳＳｅｒ１１７７のリン酸化レベルを、抗リン酸化ｅＮＯＳｓｅｒ１１７７抗体を用いたウエスタンブロット法により測定した。
　図７（ａ）は、リン酸化ｅＮＯＳＳｅｒ１１７７及びｅＮＯＳをウエスタンブロット法により検出した結果を示す写真である。図７（ｂ）は、図７（ａ）の結果を数値化し、ｅＮＯＳの存在量に対するリン酸化ｅＮＯＳＳｅｒ１１７７の存在量を算出した結果を示すグラフである。対照における値を１００とした割合（％）で結果を示す。
　その結果、ＯＨＢＦＢは、ＥＧＣＧと同様に、癌細胞のｅＮＯＳｓｅｒ１１７７リン酸化を誘導する、すなわち、ｅＮＯＳを活性化することが明らかとなった。
［実験例７］
（ｅＮＯＳ阻害剤によるＯＨＢＦＢの抗癌作用の阻害）
　ＯＨＢＦＢの癌細胞に対する生細胞数低下作用におけるｅＮＯＳの関与を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ　１６４０培地に５×１０４個／ｍＬとなるように懸濁して２４ウェルプレートに１ウェルあたり１ｍＬずつ播種した。
　続いて、ｅＮＯＳ阻害剤であるＬ－ＮＡＭＥ（和光純薬工業社製）を終濃度１０ｍＭとなるように添加して３時間インキュベートした。続いて、ＯＨＢＦＢを終濃度が５μＭとなるように添加して更に９６時間培養した。その後、トリパンブルー染色により細胞生存率を測定した。
　Ｌ－ＮＡＭＥ（和光純薬工業社製）は、１Ｍとなるように超純水に溶解して－３０℃で保存し、適宜解凍して用いた。
　図８は、細胞生存率の測定結果を示すグラフである。その結果、ＯＨＢＦＢの癌細胞致死活性は、ｅＮＯＳ阻害剤の添加により阻害された。つまり、ＯＨＢＦＢは、ＥＧＣＧと同様に、ｅＮＯＳ依存的に抗癌作用を示すことが明らかとなった。
［実験例８］
（ＯＨＢＦＢのＡｋｔ活性化能の検討）
　ＯＨＢＦＢの癌細胞におけるＡｋｔ活性化能を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ　１６４０培地に１×１０７個／ｍＬとなるように懸濁し、２４ウェルプレートに１ウェルあたり１ｍＬずつ播種した。続いて、ＯＨＢＦＢを終濃度が５μＭとなるように添加して１時間インキュベートした。対照として、ＯＨＢＦＢを添加しなかった細胞を用いた。続いて、細胞溶解バッファーを添加して細胞を溶解し回収した。
　続いて、市販のキット（商品名「Ｋ－ＬＩＳＡ（商標）Ａｋｔ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ｋｉｔ」、型式「ＣＢＡ０１９」、メルクミリポア社製）を用いて回収したサンプルのＡｋｔ活性を測定した。
　図９は、Ａｋｔ活性の測定結果を示すグラフである。対照における値を１００とした割合（％）で結果を示す。その結果、ＯＨＢＦＢは、ＥＧＣＧと同様に、癌細胞のＡｋｔ活性化作用を示すことが明らかとなった。
［実験例９］
（抗６７ＬＲモノクローナル抗体によるＯＨＢＦＢの抗癌作用の阻害）
　ＯＨＢＦＢの癌細胞に対する生細胞数低下作用における６７ＬＲの関与を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ　１６４０培地に５×１０４個／ｍＬとなるように懸濁し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種した。
　続いて、抗６７ＬＲモノクローナル抗体（型式「ＭＬｕｃ５」、アブカム社製）又はコントロール抗体を終濃度２０μｇ／ｍＬとなるように添加し、３時間インキュベートした。続いて、ＯＨＢＦＢを終濃度が５μＭとなるよう添加し、更に９６時間培養した。その後、トリパンブルー染色により細胞生存率を測定した。
　図１０は、細胞生存率の測定結果を示すグラフである。その結果、抗６７ＬＲモノクローナル抗体で前処理した細胞では、ＯＨＢＦＢの添加による生細胞数低下作用が著しく低下することが明らかとなった。すなわち、ＯＨＢＦＢは、ＥＧＣＧと同様に、６７ＬＲ依存的に抗癌作用を示すことが明らかとなった。
［実験例１０］
（６７ＬＲの発現抑制によるＯＨＢＦＢの抗癌作用の阻害）
　ＯＨＢＦＢの抗癌作用における６７ＬＲの関与を評価した。具体的には、マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６を、５％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ培地で１×１０４個／ｍＬとなるように懸濁し、２４ウェルプレートに１ウェルあたり１ｍＬずつ播種した。続いて、６７ＬＲ　ｓｉＲＮＡ（ライフテクノロジーズ社製）又はコントロールｓｉＲＮＡ（ライフテクノロジーズ社製）を導入し、７２時間培養した。ｓｉＲＮＡの導入には、市販のキット（商品名「ＲＮＡｉＭＡＸ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を使用した。
　その後、各細胞を１×１０４個／ｍＬの細胞密度で９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種しなおし、２４時間インキュベートした。培地には５％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ培地を用いた。続いて、ＯＨＢＦＢを終濃度が５μＭとなるよう添加して、更に７２時間培養した。その後、トリパンブルー染色により細胞生存率を測定した。
　図１１は、細胞生存率の測定結果を示すグラフである。その結果、６７ＬＲの発現を低下させた癌細胞では、ＯＨＢＦＢの添加による癌細胞増殖抑制活性が著しく低下することが明らかとなった。この結果は、ＯＨＢＦＢが、ＥＧＣＧと同様に、６７ＬＲ依存的に抗癌作用を示すことを更に支持するものである。
［実験例１１］
（ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）５阻害剤によるＯＨＢＦＢの抗癌活性増強作用）
　ＰＤＥ５阻害剤によるＯＨＢＦＢの抗癌活性増強作用を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ　１６４０培地に５×１０４個／ｍＬになるように懸濁し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種した。
　続いて、ＰＤＥ５阻害剤であるバルデナフィル（ケイマンケミカル社製）を終濃度５μＭとなるように添加し、３時間インキュベートした。続いて、終濃度０、０．５、１．０及び２．５μＭのＯＨＢＦＢを添加し、更に９６時間培養した。その後、市販のキット（商品名「ＡＴＰｌｉｔｅ」、パーキンエルマー社）を用いて細胞生存率を測定した。
　その結果、ＯＨＢＦＢ及びバルデナフィルの併用時におけるＯＨＢＦＢのＩＣ５０は１．０７μＭと算出された。
　また、上記と同様の検討を、終濃度０、５、１０、２５、５０及び１００μＭのバルデナフィル単独の存在下においても行った。その結果、バルデナフィルのＩＣ５０は９２．６８μＭと算出された。
　続いて、アイソボログラム解析により、ＯＨＢＦＢ及びバルデナフィルの併用による抗癌活性が拮抗的であるか、相加的であるか、相乗的であるかについて検討した。図１２は、アイソボログラム解析の結果を示すグラフである。
　具体的には、図１２に示すように、ＯＨＢＦＢのＩＣ５０（４．０μＭ）をｘ軸に、バルデナフィルのＩＣ５０（９２．６８μＭ）をｙ軸にそれぞれプロットし、それらの値を結んだ直線を引いた。また、バルデナフィル（終濃度５μＭ）との併用時におけるＯＨＢＦＢのＩＣ５０（１．０７μＭ）をプロットした。
　その結果、ＯＨＢＦＢ及びバルデナフィルの併用時のプロットが、上記の直線よりも原点側にあったことから、ＰＤＥ５阻害剤はＯＨＢＦＢの抗癌活性を相乗的に増強することが明らかとなった。
［実験例１２］
（エリオジクチオールによるＯＨＢＦＢの抗癌活性増強作用）
　エリオジクチオールによるＯＨＢＦＢの抗癌活性増強作用を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ　１６４０培地に５×１０４個／ｍＬになるように懸濁し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種した。
　続いて、エリオジクチオール（ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ社製）の非存在下又は終濃度５μＭの存在下において、終濃度０、１．０、２．５及び５．０μＭのＯＨＢＦＢを添加し、９６時間培養した。その後、市販のキット（商品名「ＡＴＰｌｉｔｅ」、パーキンエルマー社）を用いて細胞生存率を測定した。
　その結果、ＯＨＢＦＢ及びエリオジクチオールの併用時におけるＯＨＢＦＢのＩＣ５０は１．１６μＭと算出された。
　また、上記と同様の検討を、終濃度０、５、１０、２５及び５０μＭのエリオジクチオール単独の存在下においても行った。その結果、エリオジクチオールのＩＣ５０は８９．４μＭと算出された。
　続いて、アイソボログラム解析により、ＯＨＢＦＢ及びエリオジクチオールの併用による抗癌活性が拮抗的であるか、相加的であるか、相乗的であるかについて検討した。図１３は、アイソボログラム解析の結果を示すグラフである。
　具体的には、図１３に示すように、ＯＨＢＦＢのＩＣ５０（４．０μＭ）をｘ軸に、エリオジクチオールのＩＣ５０（８９．４μＭ）をｙ軸にそれぞれプロットし、それらの値を結んだ直線を引いた。また、エリオジクチオール（終濃度５μＭ）との併用時におけるＯＨＢＦＢのＩＣ５０（１．１６μＭ）をプロットした。
　その結果、ＯＨＢＦＢ及びエリオジクチオールの併用時のプロットが、上記の直線よりも原点側にあったことから、エリオジクチオールはＯＨＢＦＢの抗癌活性を相乗的に増強することが明らかとなった。
［実験例１３］
（フラバノンによるＯＨＢＦＢの抗癌活性増強作用）
　フラバノンによるＯＨＢＦＢの抗癌活性増強作用を評価した。具体的には、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＵ２６６を、１％ＦＣＳ、ＳＯＤ（５Ｕ／ｍＬ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ　１６４０培地に５×１０４個／ｍＬになるように懸濁し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種した。続いて、終濃度５μＭのフラバノン及び終濃度０μＭ又は２.５μＭのＯＨＢＦＢをそれぞれ添加し、９６時間培養した。対照としては、フラバノンの代わりに同容量のＰＢＳを添加した試料を使用した。
　フラバノンとしては、エリオジクチオール（ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ社製）、ナリンゲニン（東京化成工業社製）及びヘスペレチン（和光純薬工業社製）を使用した。
　続いて、市販のキット（商品名「ＡＴＰｌｉｔｅ」、パーキンエルマー社）を用いて細胞生存率を測定した。
　図１４は、細胞生存率の測定結果を示すグラフである。その結果、エリオジクチオール、ナリンゲニン及びヘスペレチンは、いずれもＯＨＢＦＢの抗癌活性を増強することが明らかとなった。
［実験例１４］
（経口投与したＯＨＢＦＢの腫瘍組織に対する６７ＬＲ依存的癌細胞致死活性誘導能）
　マウスにＯＨＢＦＢを経口投与し、６７ＬＲ依存的な癌細胞致死活性誘導能を評価した。
　具体的には、まず、５週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを２週間予備飼育した。続いて、マウス多発性骨髄腫細胞株であるＭＰＣ－１１を５×１０６個／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ　１６４０培地に懸濁したもの２００μＬを、上記のマウスの右背部に皮下注射移植した。続いて、移植５日後に、ＯＨＢＦＢを１０ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与した。続いて、５時間後にマウスを屠殺して腫瘍を摘出し、組織切片を作製した。対照には、ＯＨＢＦＢを投与しなかった点以外は上記と同様にして作製した腫瘍組織切片を使用した。
　続いて、腫瘍組織切片を免疫染色し、Ｃｌｅａｖｅｄ（ＣＶ）－ｃａｓｐａｓｅ－３（ＣＶ－ｃａｓｐａｓｅ－３）、リン酸化ｅＮＯＳＳｅｒ１１７７、及びリン酸化ＰＫＣδＳｅｒ６６２の存在を検出した。
《ＣＶ－ｃａｓｐａｓｅ－３の検出》
　図１５（ａ）及び（ｂ）は、ＣＶ－ｃａｓｐａｓｅ－３を免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１５（ａ）は対照の腫瘍組織切片の染色結果を示す写真であり、図１５（ｂ）はＯＨＢＦＢを投与したマウスの腫瘍組織切片の染色結果を示す写真である。また、図１５（ｃ）は、図１５（ａ）及び図１５（ｂ）における、ＣＶ－ｃａｓｐａｓｅ－３陽性細胞数を計測した結果を示すグラフである。
　その結果、ＯＨＢＦＢを経口投与したマウスの腫瘍組織において、アポトーシスの指標であるＣＶ－ｃａｓｐａｓｅ－３陽性細胞数が増加したことが明らかとなった。
《リン酸化ｅＮＯＳＳｅｒ１１７７》
　図１６（ａ）及び（ｂ）は、リン酸化ｅＮＯＳＳｅｒ１１７７を免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１６（ａ）は対照の腫瘍組織切片の染色結果を示す写真であり、図１６（ｂ）はＯＨＢＦＢを投与したマウスの腫瘍組織切片の染色結果を示す写真である。
　その結果、ＯＨＢＦＢを経口投与したマウスの腫瘍組織において、リン酸化ｅＮＯＳＳｅｒ１１７７が顕著に増加したことが明らかとなった。
《リン酸化ＰＫＣδＳｅｒ６６２の検出》
　図１７（ａ）及び（ｂ）は、リン酸化ＰＫＣδＳｅｒ６６２を免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１７（ａ）は対照の腫瘍組織切片の染色結果を示す写真であり、図１７（ｂ）はＯＨＢＦＢを投与したマウスの腫瘍組織切片の染色結果を示す写真である。
　その結果、ＯＨＢＦＢを経口投与したマウスの腫瘍組織において、リン酸化ＰＫＣδＳｅｒ６６２が顕著に増加したことが明らかとなった。
《ＡＳＭ活性の測定》
　また、腫瘍組織の酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）活性を測定した。ＡＳＭ活性は次のようにして測定した。ＯＨＢＦＢを１０ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与した上記のマウスを、ＯＨＢＦＢの投与から６時間後に屠殺して腫瘍組織を摘出した。対照には、ＯＨＢＦＢ非投与群のマウスから摘出した腫瘍組織を使用した。
　続いて、摘出した各腫瘍組織を破砕して遠心し、上清をＰＢＳで２ｍｇタンパク質／ｍＬとなるように調整した後、チューブに２０μＬ分注した。続いて、このチューブに基質混合液（ＢＯＤＩＰＹ－Ｃ１２－スフィンゴミエリン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）２μＬ、１０％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００　１０μＬ、１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）２０μＬ、水７８μＬ）を８μＬ添加して混合し、３７℃で８時間インキュベートした。この反応の結果、ＡＳＭの活性により、ＢＯＤＩＰＹ－Ｃ１２－スフィンゴミエリンからＢＯＤＩＰＹ標識セラミドが生成される。
　続いて、停止液（クロロホルム：メタノール＝２：１）を６０μＬ添加し、あらかじめ乾燥器で活性化させた薄層クロマトグラフィープレートに１０μＬずつスポットし、展開溶媒（水：メタノール：クロロホルム＝８：３５：６０）で展開した。
　続いて、薄層クロマトグラフィープレートに紫外光を照射し、蛍光イメージアナライザー（商品名「Ｆｕｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ」、ビルバー・ルーマット社製）を用いてＢＯＤＩＰＹ標識セラミドの蛍光シグナルを検出し、解析ソフト（商品名「ｋｙｐｌｏｔ」、カイエンス社）を用いて解析し、数値化した。
　図１８は、ＯＨＢＦＢ非投与群（対照）及び投与群の腫瘍組織におけるＡＳＭ活性の測定結果を示すグラフである。対照におけるＡＳＭ活性の測定値を１００とした割合（％）で結果を示す。
　その結果、ＯＨＢＦＢを経口投与したマウスの腫瘍組織において、ＡＳＭ活性が顕著に増加したことが明らかとなった。
　以上の結果から、ＯＨＢＦＢは、ＥＧＣＧと同様に、生体内においてｅＮＯＳ／ＰＫＣδ／ＡＳＭ経路の活性化を特徴とする６７ＬＲ依存的な癌細胞致死活性を示すことが明らかとなった。図１９に、ＯＨＢＦＢにより活性化される、ｅＮＯＳ／ＰＫＣδ／ＡＳＭ経路の模式図を示す。
［実験例１５］
（経口投与したＯＨＢＦＢは腫瘍組織に送達される）
　一般的に、分子量が５００以上の化合物は、経口投与した場合に生体内への吸収が悪いと考えられている。このため、ウーロン茶重合ポリフェノールは、経口投与しても生体内に吸収されにくいと考えられている。そこで、経口投与したＯＨＢＦＢが腫瘍組織に到達するか否かを検討した。
《ＯＨＢＦＢの経口投与と腫瘍組織の摘出》
　まず、Ｂａｌｂ／ｃマウス（５週齢雌性）を２週間予備飼育した。続いて、マウス形質細胞腫細胞株であるＭＰＣ－１１を１×１０６個／マウスとなるように右背部に皮下注射移植した。
　続いて、腫瘍形成が確認されたマウスにＯＨＢＦＢ（１０ｍｇ／ｋｇ）を経口投与（ｉ．ｇ．）し、投与から５時間後にイソフルラン麻酔下で心臓採血により屠殺を行って腫瘍組織を摘出した。
　続いて、摘出した腫瘍組織に２％アスコルビン酸含有ＰＢＳを４００ｍＬ、内部標準の１００ｍＭプロピルガレートを５ｍＬ加えて、ビーズショッカーにて組織破砕を行なった。続いて、破砕した組織を遠心分離し、上清をチューブに回収し、酢酸エチル抽出を行った。抽出サンプルは乾固させた後、内部標準である４－ヒドロキシベンゾフェノン（４ＨＢ）（１０ｍＭ）含有５０％アセトニトリル溶液１００ｍＬに再溶解させ、０．２２ｍｍのＰＶＤＦフィルターに通した後にＬＣ－ＭＳ分析に供した。
《ＬＣ－ＭＳ分析》
　サンプルを５μＬの注入量でＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ（島津製作所）に供した。移動相には（Ａ）０．０５％ギ酸含有超純水及び（Ｂ）０．０５％ギ酸含有アセトニトリルを用いた。流速は０．１５ｍＬ／分とし、移動相Ｂの濃度が、０～２分：５％、２～３．５分：５～２０％、３．５～１０分：２０～４０％、１０～１３分：４０～１００％、１３～１５．５分：１００％、１５．５～１６分：１００～５％、１６～２０分：５％となるグラジエント条件下で測定を行なった。カラムにはＬ－ｃｏｌｕｍｎ２　ＯＤＳ（２．１×１５０ｍｍ、３μｍ、ＣＥＲＩ）を用いた（カラムオーブン：４０℃）。なお、イオン化はＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）法（ネガティブイオンモード）により行い、ＣＤＬ及びヒートブロック温度を２００℃に設定し、スキャンモード（ｍ／ｚ　３５０～１，４００）にてデータを取得した。
　ＯＨＢＦＢ（Ｃ４５Ｈ３６Ｏ２２）の精密質量はｍ／ｚ　９２８．１６９であり、標準品のＬＣ－ＭＳ分析（ネガティブイオンモード）では、水素が脱離したイオンｍ／ｚ　９２７．１５８［Ｍ－Ｈ］－（理論値：９２７．１６９）としてＭＳピークが認められた。
　そこで、腫瘍サンプルのＭＳスペクトルを確認したところ、ＯＨＢＦＢ未投与群では、そのようなイオンピークは観察されなかったが、ＯＨＢＦＢ投与群ではｍ／ｚ　９２７．１５７のピークが認められた。また、本ピークのＭＳ／ＭＳ分析では、ｍ／ｚ　７５８．１３２、６０８．１１３、４７０．０７１が主要なプロダクトイオンとして検出された。
　これらの検出ピークは、ＯＨＢＦＢの標準品のＭＳ／ＭＳ分析によるプロダクトイオン（ｍ／ｚ　７５８．１３９、６０８．１０６、４７０．０８１）と一致したことから、ＯＨＢＦＢが経口投与後に腫瘍組織に存在することが明らかとなった。
［実験例１６］
（ＯＨＢＦＢのｃＧＭＰ産生誘導能２）
　ＯＨＢＦＢの細胞に対するｃＧＭＰ産生誘導作用を評価した。具体的には、まず、ヒト臍帯静脈内皮細胞であるＨＵＶＥＣをＥＧＭ－２培地に懸濁し、５×１０６個／ｍＬとなるように調製した。続いて、ＯＨＢＦＢを終濃度５μＭとなるように添加し、９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェルで播種した。続いて、３７℃で１時間インキュベートした後、ＲＴ－ＦＲＥＴ法（ｃＧＭＰ　ａｓｓａｙ、ｃｉｓｂｉｏ社）により、細胞内のｃＧＭＰ量を測定した。
　図２０は、細胞内ｃＧＭＰの測定結果を示すグラフである。図２０中、データは平均値±標準偏差で表す（ｎ＝３）。また、「＊＊」はスチューデントのｔ検定によりｐ＜０．０１で統計的有意差が存在することを表す。
　その結果、ＯＨＢＦＢが、ヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣに対して細胞内ｃＧＭＰの産生を促進することが明らかとなった。この結果は、ＯＨＢＦＢが、ＥＧＣＧと同様に、ｃＧＭＰが関与する生理作用を有することを更に支持するものである。
［実験例１７］
（ＯＨＢＦＢの免疫機能増強作用）
　ＯＨＢＦＢの免疫機能増強作用を検討した。具体的には、まず、Ｂａｌｂ／ｃマウス（６週齢、雌性）の脾臓から単核球を採取し、２×１０６個／ｍＬとなるように１２ウェルプレートに１ウェルあたり２ｍＬずつ播種した。
　続いて、単核球を、終濃度０、０．５又は１μＭのＯＨＢＦＢを含む１０％ＦＢＳ－ＲＰＭＩ培地にて２４時間培養後、ＴＲＩ　Ｒｅａｇｅｎｔ（コスモバイオ社）によりＲＮＡを回収した。続いて、ｃＤＮＡを合成後、細菌の鞭毛タンパク質を認識する受容体であるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）５、ウイルスの一本鎖ＲＮＡを認識する受容体であるＴＬＲ７、ＣＤ８陽性Ｔ細胞増殖に関与するＣＣＲ５のｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲ法により測定した。ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＣＣＲ５の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるβ－アクチン遺伝子の発現量を用いて標準化した。
　ＴＬＲ５のＰＣＲには、配列番号１に塩基配列を示すセンスプライマー及び配列番号２に塩基配列を示すアンチセンスプライマーを使用した。また、ＴＬＲ７のＰＣＲには、配列番号３に塩基配列を示すセンスプライマー及び配列番号４に塩基配列を示すアンチセンスプライマーを使用した。また、ＣＣＲ５のＰＣＲには、配列番号５に塩基配列を示すセンスプライマー及び配列番号６に塩基配列を示すアンチセンスプライマーを使用した。また、β－アクチン遺伝子のＰＣＲには、配列番号７に塩基配列を示すセンスプライマー及び配列番号８に塩基配列を示すアンチセンスプライマーを使用した。
　図２１（ａ）～（ｃ）は、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。図２１（ａ）は、ＴＬＲ５の発現量の測定結果を示すグラフである。また、図２１（ｂ）は、ＴＬＲ７の発現量の測定結果を示すグラフである。また、図２１（ｃ）は、ＣＣＲ５の発現量の測定結果を示すグラフである。図２１（ａ）～（ｃ）中、データは平均値±標準偏差で表す（ｎ＝３～４）。また、「＊」は、ダネットの検定により、ＯＨＢＦＢ　０μＭの結果に対してｐ＜０．０５で統計的有意差が存在することを表す。また、「＊＊」は、ダネットの検定により、ＯＨＢＦＢ　０μＭの結果に対してｐ＜０．０１で統計的有意差が存在することを表す。
　その結果、ＯＨＢＦＢは脾臓単核球に対してＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＣＣＲ５の発現を促進することが明らかとなった。つまり、ＯＨＢＦＢは、これらの分子の発現を促進することにより、細菌感染やウイルス感染を予防する能力を高める作用を有することが明らかとなった。したがって、ＯＨＢＦＢは免疫機能増強作用を有するということができる。
［実験例１８］
（ＯＨＢＦＢの動脈硬化予防作用・血栓症予防作用）
　ＯＨＢＦＢの動脈硬化予防作用・血栓症予防作用を検討した。具体的には、まず、ヒト臍帯静脈内皮細胞であるＨＵＶＥＣを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）－ＥＧＭ－２培地に懸濁して１．５×１０５個／ｍＬとなるように調製し、１２ウェルプレートに１ウェルあたり２ｍＬずつ播種した。続いて、２４時間の前培養後、培地を、終濃度０、１、５μＭのＯＨＢＦＢを含む１０％ＦＢＳ－ＥＧＭ－２培地に置換し、更に２４時間培養した。
　その後、細胞の回収、ＲＮＡの精製、ｃＤＮＡの合成を行い、リアルタイムＰＣＲ法にて動脈硬化予防作用や血栓予防作用を示すＴｉｓｓｕｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＦＰＩ）のｍＲＮＡの発現量を測定した。
　ＴＦＰＩの発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるβ－アクチン遺伝子の発現量を用いて標準化した。ＴＦＰＩのＰＣＲには、配列番号９に塩基配列を示すセンスプライマー及び配列番号１０に塩基配列を示すアンチセンスプライマーを使用した。また、β－アクチン遺伝子のＰＣＲには、配列番号１１に塩基配列を示すセンスプライマー及び配列番号１２に塩基配列を示すアンチセンスプライマーを使用した。
　図２２は、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。図２２中、データは平均値±標準偏差で表す（ｎ＝３）。また、「＊＊」は、ダネットの検定により、ＯＨＢＦＢ　０μＭの結果に対してｐ＜０．０１で統計的有意差が存在することを表す。
　その結果、ＯＨＢＦＢは、ヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣに対してＴＦＰＩの発現を促進することが明らかとなった。すなわち、ＯＨＢＦＢは、動脈硬化予防作用・血栓症予防作用を有することが明らかとなった。
［実験例１９］
（ＯＨＢＦＢの筋委縮予防作用）
　ＯＨＢＦＢの筋委縮予防作用を検討した。具体的には、まず、マウス筋芽細胞株であるＣ２Ｃ１２を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）－ＤＭＥＭ培地に懸濁して２×１０４個／ｍＬとなるように調製し、１２ウェルプレートに１ウェルあたり２ｍＬずつ播種し、２４時間前培養を行った。続いて０．５％ＦＣＳ－ＤＭＥＭの分化誘導培地に置換し、更に７２時間培養した。筋管細胞に分化後、終濃度０、１又は２．５μＭのＯＨＢＦＢを含む分化誘導培地に置換し、更に４８時間培養した。
　その後、細胞からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲによって筋萎縮関連遺伝子の一種であるＭｕｓｃｌｅ　ＲＩＮＧ－Ｆｉｎｇｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ－１（ＭｕＲＦ１）のｍＲＮＡの発現量を測定した。ＭｕＲＦ１の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の発現量を用いて標準化した。
　ＭｕＲＦ１のＰＣＲには、配列番号１３に塩基配列を示すセンスプライマー及び配列番号１４に塩基配列を示すアンチセンスプライマーを使用した。また、ＧＡＰＤＨ遺伝子のＰＣＲには、配列番号１５に塩基配列を示すセンスプライマー及び配列番号１６に塩基配列を示すアンチセンスプライマーを使用した。
　図２３は、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。図２３中、データは平均値±標準偏差で表す（ｎ＝３）。また、「ｎ．ｓ．」は、ダネットの検定により、ＯＨＢＦＢ　０μＭの結果に対して統計的有意差がないことを表し、「＊」は、ダネットの検定により、ＯＨＢＦＢ　０μＭの結果に対してｐ＜０．０５で統計的有意差が存在することを表す。
　その結果、ＯＨＢＦＢは骨格筋細胞におけるＭｕＲＦ１の発現を抑制することが明らかとなった。すなわち、ＯＨＢＦＢは筋萎縮抑制作用を有することが明らかとなった。
［実験例２０］
（ＯＨＢＦＢの抗炎症作用）
　ＯＨＢＦＢの抗炎症作用を検討した。具体的には、まず、マウスマクロファージ様細胞株であるＲＡＷ２６４．７を５％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に懸濁して１×１０４個／ｍＬとなるように調製し、２４ウェルプレートに１ウェルあたり１ｍＬずつ播種して２４時間前培養を行った。
　続いて、終濃度１μＭのＯＨＢＦＢを含む５％ＦＢＳ－ＤＭＥＭと培地交換を行い、更に１時間培養した。また、比較のために、ＯＨＢＦＢを添加しなかった群も用意した。続いて、終濃度５０ｎｇ／ｍＬのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を添加し、更に２４時間培養した。また、比較のために、ＬＰＳを添加しなかった群も用意した。
　その後、培養上清を回収し、炎症性のサイトカインであるＴＮＦ－αの濃度をＥＬＩＳＡ法により定量した。また、培養上清中のタンパク質量を測定し、単位タンパク質量あたりのＴＮＦ－α量を算出した。
　図２４は、ＴＮＦ－α量の算出結果を示すグラフである。図２４中、データは平均値±標準偏差で表す（ｎ＝３）。また、「＊＊＊」は、テューキーの検定により、ｐ＜０．００１で統計的有意差が存在することを表す。
　その結果、ＯＨＢＦＢはマクロファージにおいて、ＬＰＳ誘導性のＴＮＦ－α発現誘導を抑制することが明らかとなった。すなわち、ＯＨＢＦＢは抗炎症用を有することが明らかとなった。
［実験例２１］
（ＯＨＢＦＢの抗アレルギー作用）
　ＯＨＢＦＢの抗アレルギー作用を検討した。具体的には、好塩基球性細胞からのβ－ヘキソサミニダーゼの遊離に与えるＯＨＢＦＢの影響を検討した。
　まず、２×１０５個のヒト好塩基球性細胞であるＫＵ８１２を、タイロード液１００ｍＬに懸濁した。続いて、この細胞懸濁液１００ｍＬと、終濃度１ｍＭのＣａＣｌ２、終濃度５０ｍＭのカルシウムイオノファＡ２３１８７、終濃度０、５又は２５μＭのＯＨＢＦＢを含むタイロード液１００ｍＬとを混合し、３７℃で２０分恒温した。その後、氷上で５分間静置し反応を停止させた。
　続いて、４℃、２００×ｇで５分間遠心し、上清を回収した。回収した上清５０ｍＬに基質溶液（０．５ｍＭ　ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－ｂ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ）５０ｍＬを添加し、３７℃で６０分間反応させた。
　続いて、反応停止液（０．１Ｍ　ｓｏｄｉｕｍ　ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ１０）２００ｍＬを添加し、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、上清中のβ－ヘキソサミニダーゼ活性を測定した。
　また、細胞懸濁液に終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘを添加して上記と同様の操作を行い、細胞内のβ－ヘキソサミニダーゼ活性を測定した。続いて、下記式（Ｆ１）により、β－ヘキソサミニダーゼの遊離率を算出した。
　β－ヘキソサミニダーゼの遊離率（％）＝上清中のβ－ヘキソサミニダーゼ活性（波長４０５ｎｍにおける吸光度）／細胞内のβ－ヘキソサミニダーゼ活性（波長４０５ｎｍにおける吸光度）×１００　…（Ｆ１）
　図２５は、β－ヘキソサミニダーゼの遊離率の算出結果を示すグラフである。図２５中、データは平均値±標準偏差で表す（ｎ＝３）。また、「＊＊」は、ダネットの検定により、ＯＨＢＦＢ　０μＭの結果に対してｐ＜０．０１で統計的有意差が存在することを表す。
　その結果、ＯＨＢＦＢは好塩基球性細胞に対して脱顆粒を阻害することが明らかとなった。すなわち、ＯＨＢＦＢは抗アレルギー作用を有することが明らかとなった。
　本発明によれば、ＥＧＣＧよりも強力な６７ＬＲアゴニストを提供することができる。

Claims (12)

  1. 　ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体を有効成分として含有する、６７ｋＤａラミニンレセプター（６７ＬＲ）アゴニスト。
  2. 　前記ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体が、下記式（１）又は（２）で表される化合物である、請求項１に記載の６７ＬＲアゴニスト。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（１）中、Ｒ１はそれぞれ独立に水素原子、ヒドロキシル基、炭素数１～３のアルキル基又は－ＯＲ２（ここで、Ｒ２はグルコース、マンノース、キシロース、ガラクトース又はマルトースから水素原子を１個除いた基を表す。）を表し、Ｒ３はそれぞれ独立に存在しないか又はハロゲン原子若しくは炭素数１～３のアルキル基を表し、Ｒ４はそれぞれ独立に水素原子又は下記式（１Ａ）で表される基を表す。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式（１Ａ）中、Ｒ１及びＲ３の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式（２）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
  3. 　前記ウーロン茶重合ポリフェノール又はその誘導体が、下記式（３）～（６）のいずれかで表される化合物である、請求項１又は２に記載の６７ＬＲアゴニスト。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［式（３）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     ［式（４）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     ［式（５）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     ［式（６）中、Ｒ１、Ｒ３、及びＲ４の定義は前記式（１）における定義に同じである。］
  4. 　６７ＬＲ関連疾患の予防又は治療用である、請求項１～３のいずれか一項に記載の６７ＬＲアゴニスト。
  5. 　前記６７ＬＲ関連疾患が、癌、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症、筋委縮、高コレステロール血症、血栓症又は免疫不全である、請求項４に記載の６７ＬＲアゴニスト。
  6. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の６７ＬＲアゴニストと、ホスホジエステラーゼ阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体とを含有する、６７ＬＲアゴニスト組成物。
  7. 　６７ＬＲ関連疾患の予防又は治療用である、請求項６に記載の６７ＬＲアゴニスト組成物。
  8. 　前記６７ＬＲ関連疾患が、癌、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症、筋委縮、高コレステロール血症、血栓症又は免疫不全である、請求項７に記載の６７ＬＲアゴニスト組成物。
  9. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の６７ＬＲアゴニストを含有する、６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善用食品組成物。
  10. 　ホスホジエステラーゼ阻害剤又はフラバノン若しくはその配糖体を更に含有する、請求項９に記載の６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善用食品組成物。
  11. 　請求項９又は１０に記載の食品組成物をヒト又は動物に摂取させる工程を備える、６７ＬＲ関連疾患の予防又は改善方法（ヒトに対する医療行為を除く。）。
  12. 　前記６７ＬＲ関連疾患が、癌、アレルギー、肥満、動脈硬化、炎症、筋委縮、高コレステロール血症、血栓症又は免疫不全である、請求項１１に記載の予防又は改善方法。
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