WO2011157573A2 - Ein enzym zur herstellung von methylmalonatsemialdehyd - Google Patents

Ein enzym zur herstellung von methylmalonatsemialdehyd Download PDF

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WO2011157573A2 PCT/EP2011/059178 EP2011059178W WO2011157573A2 WO 2011157573 A2 WO2011157573 A2 WO 2011157573A2 EP 2011059178 W EP2011059178 W EP 2011059178W WO 2011157573 A2 WO2011157573 A2 WO 2011157573A2
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)

Definitions

  • the invention relates to an enzyme for the production of methylmalonate semialdehyde or malonate semialdehyde, nucleic acids containing coding sequences for this enzyme, cells which have been transformed with these nucleic acids, as well as the use of this enzyme.
  • DE102006025821 describes an enzyme from Sulfolobus tokodaii which is capable of producing S- or R-methylmalonyl-coenzyme A and malonyl-coenzyme A to the corresponding ones
  • This enzyme is used in processes for the preparation of (S) - or (R) - methylmalonate semialdehyde, (S) - or (R) -3-hydroxyisobutyric acid or (S) - or (R) -3-hydroxyisobutyric acid based polyhydroxyalkanoates and in processes for the preparation of malonate semialdehyde, of 3-hydroxypropionic acid or of
  • Hydroxypropionic acid based polyhydroxyalkanoates used. These process products are commercially valuable starting materials for chemical syntheses. This justifies, as in the present invention, the industrial applicability.
  • a disadvantage of the enzyme described lies in the relatively low activity of the enzyme, in particular with regard to the substrates S- and R-methylmalonyl-coenzyme A.
  • the object of the invention was to provide enzymes which have a greater specific activity in the reactions described above and thus in a shorter time more (S) - or (R) -Methylmalonatsemialdehyd or Malonatsemialdehyd from S- or R-methylmalonyl coenzyme A or Malonyl coenzyme A, in particular more (S) - or (R) -
  • Methylmalonatsemialdehyd from S- or R-methylmalonyl coenzyme A assets to make.
  • nucleic acids comprising nucleic acids encoding the polypeptides of the invention as well as cells containing the
  • the invention relates to the use of the substances according to the invention for the preparation of (S) - or (R) -methylmalonate semialdehyde, of (S) - or (R) -3-hydroxyisobutyric acid, of (S) - or (R) -3-hydroxyisobutyric acid-based Polyhydroxyalkanoates, malonate semialdehyde, 3-hydroxypropionic acid and 3-hydroxypropionic acid based polyhydroxyalkanoates.
  • polypeptides according to the invention are, in addition to the described activities, also the very high stability.
  • the increased stability leads to a long availability of the polypeptides according to the invention
  • Another advantage is that bioprocesses are made possible, which can be carried out at elevated temperatures and thus require less cooling.
  • SEQ. ID. NO. 2 SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 6, SEQ.ID.NO. 8, SEQ.ID.NO. 10, SEQ. ID. NO. 12, SEQ ID NO. 14, SEQ. ID. NO. 16 and SEQ ID NO. 18, in particular SEQ.-ID-No. 2,
  • Amino acid sequence is capable of producing S- or R-methylmalonyl coenzyme A and malonyl
  • V16T preferably V16T, L149K, L149M, L149R, Y203L, T207P, T207S, I330A, I330C and I330W.
  • Polypeptides having the polypeptide sequences of group A and the said amino acids having the polypeptide sequences of group A and the said amino acids
  • Amino acid exchanges are capable of forming S- or R-methylmalonyl coenzyme A to the corresponding semialdehyde ((S) - or (R) -methylmalonate semialdehyde) with preferably at least 1 10%, more preferably at least 150%, especially at least 200%, completely especially to convert at least 300% of the specific activity of the respective polypeptide with the polypeptide sequence of group A without said amino acid substitutions.
  • Preferred polypeptides according to the invention have at least one combination of
  • Amino acid substitution selected from the group consisting of A07S Y203F, V16T K38R, K38R L149M, K38R L149R, K38R T207P, K38R I208V, L149I T207P, L149M Y203M, L149M T207P, L149M R315K, L149M K317E and L149Q T207P, especially L149M T207P
  • preferred polypeptides have at least one combination of
  • Amino acid substitution selected from the group consisting of
  • nucleotide identity or "amino acid identity” is determined in the context of the present invention by known methods. In general, special computer programs are used with algorithms taking into account special requirements.
  • Determination of identity include, but are not limited to, the GCG program package, including GAP (Deveroy, J. et al., Nucleic Acid Research 12 (1984), page 387, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (Wi), and BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), pages 403-410
  • the BLAST program can be obtained from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and from other sources (BLAST Handbook, Altschul S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; Altschul S. et al., Supra).
  • the well-known Smith-Waterman algorithm can also be used to determine nucleotide identity.
  • the above parameters are the default parameters in nucleotide sequence comparison.
  • the GAP program is also suitable for use with the above parameters.
  • Preferred parameters for the determination of "amino acid identity” are when using the BLASTP program (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), pages 403-410:
  • compositional adjustments Conditional compositional score matrix adjustment
  • the above parameters are the default parameters in the amino acid sequence comparison.
  • the GAP program is also suitable for use with the above parameters.
  • the nomenclature for the amino acid substitutions defined above is well known to those skilled in the art.
  • V16T describes that the amino acid valine at position 16 has been replaced by a threonine.
  • the numbering of the amino acid position always refers to the corresponding position in the considered amino acid sequence with SEQ. ID. NO. 2 for reference.
  • the sequence to be considered with SEQ. ID no. 2 matched using the BlastP program using the above parameters; the numerical position indicated in the amino acid substitution is then found in the amino acid sequence under consideration in accordance with SEQ.ID.No. 2 assigned again.
  • amino acid sequence under consideration at the indicated numerical position has a different amino acid than in the first place given in the amino acid exchange, this other amino acid is the last in the amino acid exchange
  • Polypeptide sequence that do not lead to any significant changes in the properties and function of the given polypeptide are known in the art.
  • so-called conserved amino acids can be exchanged for each other;
  • suitable amino acid substitutions are: Ala versus Ser; Arg against Lys; Asn versus Gin or His; Asp against Glu; Cys versus Ser; Gin vs Asn; Glu vs Asp; Gly vs Pro; His against Asn or Gin; against Leu or Val; Leu vs Met or Val; Lys versus Arg or Gin or Glu; Mead against Leu or hell; Phe versus Met or Leu or Tyr; Ser against Thr; Thr against Ser; Trp against Tyr; Tyr against Trp or Phe; Val against hell or leu.
  • Example 3 To determine the specific activity of the protein under consideration with respect to the ability to convert S- or R-methylmalonyl-coenzyme A or malonyl-coenzyme A to the corresponding semialdehydes, the method described in Example 3 with correspondingly known enzyme concentrations can be used.
  • the polypeptide according to the invention is an enzyme which comprises both the conversion of (S) - or (R) -methylmalonyl-coenzyme A to (S) - or (R) - Methylmalonatsemialdehyd and the conversion of malonyl coenzyme A to Malonatsemialdehyd to catalyze.
  • a polypeptide can be synthesized, for example, starting from the DNA sequence of SEQ. ID. NO. 01, SEQ ID NO. 03, SEQ ID NO. 05, SEQ ID NO. 07, SEQ ID NO. 09, SEQ ID NO. 1 1, SEQ.ID.NO. 13, SEQ ID NO. 15 or SEQ ID NO. 17, or by transformation of a suitable cell with a
  • suitable vector comprising the abovementioned nucleic acid sequences, expression of the protein encoded by these nucleic acid sequences in the cell, lysis of the cell to obtain a cell extract and subsequent purification of the enzyme by means of purification techniques known to those skilled in the art, for example by HPLC or others
  • Purification of the polypeptide from cell extracts can also take advantage of the fact that the polypeptide of the invention is heat stable up to a temperature of at least 75 ° C. Therefore, one can heat the cell extract to a temperature of, for example, 75 ° C, thereby causing coagulation and thus precipitation of the non-heat stable
  • Polypeptides in the cell extract comes.
  • the polypeptide according to the invention remains in undenatured form in the cell extract.
  • nucleic acids in particular isolated nucleic acids encoding polypetide according to the invention.
  • coding for is meant here the genetic code having a codon usage, as found for example in E. coli, but also constellations are conceivable in which an unconventional codon usage is used, as in Tetrahymena, for example.
  • Plasmodium, Mycobacterium pneumoniae or Candida tropicalis can lead to polypeptides according to the invention. These nucleic acids are also considered to be "coding for
  • the invention further comprises the nucleotide sequences described
  • a vector preferably an expression vector, comprising a nucleic acid according to the invention, as defined above.
  • Suitable vectors are all vectors known to the person skilled in the art
  • Preferred vectors are selected from the group comprising plasmids, such as the E. coli plasmids pTrc99A, pBR345 and pBR322, viruses such as bacteriophages, adenoviruses, vaccinia viruses, baculoviruses, measles viruses and retroviruses, cosmids or YACs, with plasmids being vectors most are preferred.
  • plasmids such as the E. coli plasmids pTrc99A, pBR345 and pBR322
  • viruses such as bacteriophages, adenoviruses, vaccinia viruses, baculoviruses, measles viruses and retroviruses, cosmids or YACs, with plasmids being vectors most are preferred.
  • the nucleic acid according to the invention is under the control of a regulatable promoter which is used to express the polypeptide encoded by these DNA sequences in the cell of a
  • a microorganism preferably a bacterial, yeast or pilin cell, more preferably a bacterial cell, most preferably one pound. co // cell, is suitable.
  • promoters are, for example, the trp promoter or the tac promoter.
  • the vector according to the invention should, in addition to a promoter, preferably a
  • Ribosome binding site and a terminator include. It is particularly preferred that the DNA according to the invention is incorporated into an expression cassette of the vector comprising the promoter, the ribosome binding site and the terminator.
  • the vector may further comprise selection genes known to those skilled in the art.
  • Transformation cell obtained with this vector obtained with this vector.
  • the cells which can be transformed with the vector according to the invention can be any suitable transformation cell obtained with this vector.
  • Be prokaryotes or eukaryotes These may be mammalian cells (such as human cells), plant cells, or microorganisms such as yeasts, fungi or bacteria, with microorganisms being most preferred and bacteria and yeasts being most preferred.
  • yeasts or fungi especially those bacteria, yeasts or fungi are suitable, which in the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ), Braunschweig, Germany, as bacterial, yeast or fungal strains are deposited.
  • DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
  • Bacteria suitable according to the invention belong to the genera under
  • Yeasts which are suitable according to the invention belong to those genera which are listed under http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm
  • Particularly preferred cells according to the invention are those of the genera
  • Yarrowia lipolytica Methylobacterium extorquens, Ralstonia eutropha and Pichia pastoris are particularly preferred.
  • these are acetogenic microorganisms, such as, for example, species of the genus Acetobacterium, such as A. woodii and Clostridium aceticum.
  • the acetogenic cells are selected from the group comprising, in particular consisting of, Acetoanaerobium notera, Acetobacterium woodii, Archaeoglobus fulgidus, Butyribacterium methylotrophicum, Butyribacterium methyltrophicum, Carboxydibrachium pacificus, Carboxydocella sporoproducens, Carboxydocella
  • thermoautotrophica Carboxydothermus hydrogenoformans, Citrobacter sp. Y19, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium
  • Desulfotomaculum kuznetsovii Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp.
  • thermosyntrophicum Eubacterium limosum, Methanosarcina acetivorans C2A, Methanosarcina barkeri, Methanothermobacter thermoautotrophicus, Moorella AMP, Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Oxobacter pfennigii, Peptostreptococcus productus,
  • Rhodopseudomonas palustris P4 Rhodospirillum rubrum, Rubrivivax gelatinosus, Thermincola carboxydiphila, Thermincola ferriacetica, Thermococcus AM4, Thermolithobacter carboxydivorans and Thermoanaerobacter kivui.
  • a particularly suitable cell in this context is Clostridium carboxidivorans, in particular such strains as “P7” and "P1 1". Such cells are described, for example, in US 2007/0275447 and US 2008/0057554.
  • Another particularly suitable cell in this context is Clostridium ljungdahlii, in particular strains selected from the group comprising, in particular consisting of, Clostridium ljungdahlii PETC, Clostridium ljungdahlii ERI2, Clostridium IjungdahlW C0I and Clostridium ljungdahlii 0-52; these are described in WO 98/00558 and WO 00/68407.
  • polypeptides, nucleic acids, vectors and cells according to the invention can be advantageously used for the preparation of (S) - or (R) -methylmalonate semialdehyde, of (S) - or (R) -3-hydroxyisobutyric acid, of (S) - or (R) 3-hydroxyisobutyric acid based
  • Embodiments should be limited.
  • the Sulfolobus tokodaii mcr gene was isolated from the plasmid pTrc99A-mcr (Alber B et al., J. Bacteriol, 188: 8551-8559) with the two primers mcr_fwd_Ncol (5 ').
  • the pET-28a (+) - mcr expression construct was transformed into competent cells of the E. coli expression strain Rosetta TM 2 (DE3) (Merck KGaA, Darmstadt, Germany).
  • SeSaM mutant library was prepared by the SeSaM method described in EP1670914 and labeled with the primers SEQ.ID.NO. 19 and 20 cloned.
  • SDM mutant libraries were prepared using the Phusion TM site-directed mutagenesis kit (Finnzymes Oy, Espoo, Finland) according to the manufacturer's instructions in the pET-28a (+) - mcr plasmid.
  • Proteins were heat-precipitated by incubation for 15 min at 75 ° C and 15 min on ice. The denatured proteins and cell debris were spun down for 20 min at 16,000 g and 4 ° C. The clear supernatant was used in the MCR activity detection.
  • the proof of activity is based on the decrease of NADPH and is determined by measuring the
  • NADPH 0.3mM X-CoA.
  • the decrease in absorbance at 340 nm is monitored for 8 min in the cuvette heated to 55 ° C.
  • Amino acid mutation has a significant increase in specific activity on the substrate methylmalonyl-CoA found in such enzymes with amino acid substitutions of: Y203L, A07S Y203F, L149M, L149R, L149K, V16T, V16T, T207P, T207S, I330A, I330C and I330W.
  • Amino acid exchange was set to 100%.

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Enzym zur Herstellung von Methylmalonatsemialdehyd oder Malonatsemialdehyd, Nukleinsäuren beinhaltend kodierende Sequenzen für dieses Enzym, Zellen, welche mit diesen Nukleinsäuren transformiert wurden, so wie die Verwendung dieses Enzyms.

Description

Ein Enzym zur Herstellung von Methylmalonatsemialdehyd
Gebiet der Erfindung:
Gegenstand der Erfindung ist ein Enzym zur Herstellung von Methylmalonatsemialdehyd oder Malonatsemialdehyd, Nukleinsäuren beinhaltend kodierende Sequenzen für dieses Enzym, Zellen, welche mit diesen Nukleinsäuren transformiert wurden, so wie die Verwendung dieses Enzyms.
Stand der Technik:
Die DE102006025821 beschreibt ein Enzym aus Sulfolobus tokodaii, welches in der Lage ist, S- oder R-Methylmalonyl-Coenzym A und Malonyl-Coenzym A zu den entsprechenden
Semialdehyden umzusetzen. Dieses Enzym wird in Verfahren zur Herstellung von (S)- oder (R)- Methylmalonatsemialdehyd, von (S)- oder (R)-3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf (S)- oder (R)-3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten sowie in Verfahren zur Herstellung von Malonatsemialdehyd, von 3-Hydroxypropionsäure oder von auf 3-
Hydroxypropionsäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten genutzt. Diese Verfahrensprodukte stellen kommerziell wertvolle Edukte für chemische Synthesen dar. Dies begründet ebenfalls wie in der vorliegenden Erfindung die gewerbliche Anwendbarkeit.
Ein Nachteil des beschriebenen Enzyms liegt in der relativ geringen Aktivität des Enzyms, insbesondere hinsichtlich der Substrate S- und R-Methylmalonyl-Coenzym A.
Aufgabe der Erfindung war es, Enzyme bereitzustellen, die eine größere spezifische Aktivität bei den oben beschriebenen Umsetzungen aufweisen und somit in kürzerer Zeit mehr (S)- oder (R)-Methylmalonatsemialdehyd bzw. Malonatsemialdehyd aus S- oder R-Methylmalonyl- Coenzym A bzw. Malonyl-Coenzym A zu bilden vermögen, insbesondere mehr (S)- oder (R)-
Methylmalonatsemialdehyd aus S- oder R-Methylmalonyl-Coenzym A zu bilden vermögen.
Beschreibung der Erfindung:
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die im Folgenden beschriebenen Polypeptide die gestellte Aufgabe zu lösen vermögen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher die in Anspruch 1 beschriebenen
Polypeptide mit entsprechenden Aminosäuremutationen verglichen zu bekannten
Wildtypsequenzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Nukleinsäuren umfassend Nukleinsäuren kodierend für die erfindungsgemäßen Polypeptide sowie Zellen, die mit den
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren transformiert wurden. Ein weiterer Gegenstand der
Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Stoffe zur Herstellung von (S)- oder (R)- Methylmalonatsemialdehyd, von (S)- oder (R)-3-Hydroxyisobuttersäure, von auf (S)- oder (R)-3- Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten, von Malonatsemialdehyd, von 3- Hydroxypropionsäure und von auf 3-Hydroxypropionsäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten.
Vorteile der erfindungsgemäßen Polypetide sind neben den beschriebenen Aktivitäten ebenfalls die sehr hohe Stabilität. Die erhöhte Stabilität führt zu einer langen Verfügbarkeit des
Biokatalysators (lange Standzeit).
Ein weiterer Vorteil ist, dass Bioprozesse ermöglicht werden, die bei erhöhten Temperaturen durchgeführt werden können und somit weniger Kühlung erfordern.
Alle angegebenen Prozent (%) sind, wenn nicht anders angegeben, Massenprozent. Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet ein isoliertes Polypeptid mit einer der folgenden Aminosäuresequenzen:
A) eine Aminosäuresequenz mit der SEQ.-ID-Nr. 2, SEQ.-ID-Nr. 4, SEQ.-ID-Nr. 6, SEQ.-ID- Nr. 8, SEQ.-ID-Nr. 10, SEQ.-ID-Nr. 12, SEQ.-ID-Nr. 14, SEQ.-ID-Nr. 16 und SEQ.-ID-Nr. 18, insbesondere SEQ.-ID-Nr. 2,
B) eine Aminosäuresequenz, die erhalten wird, wenn höchstens 40 Aminosäuren,
vorzugsweise höchstens 20 Aminosäuren, darüber hinaus noch mehr bevorzugt höchstens 10 Aminosäuren und am meisten bevorzugt höchstens 5 Aminosäuren in einer Aminosäuresequenz der Gruppe A) deletiert, insertiert, substituiert oder aber an das C- und/oder N-terminale Ende einer Aminosäuresequenz der Gruppe A) angefügt sind, wobei ein Protein mit dieser Aminosäuresequenz in der Lage ist, S- oder R-
Methylmalonyl-Coenzym A und Malonyl-Coenzym A zu den entsprechenden
Semialdehyden ((S)- oder (R)-Methylmalonatsemialdehyd bzw. Malonatsemialdehyd), insbesondere S- oder R-Methylmalonyl-Coenzym A zu (S)- oder (R)- Methylmalonatsemialdehyd, mit bevorzugt mindestens 80% , besonders bevorzugt mindestens 90 %, insbesondere mindestens 95 %, ganz besonders mehr als 100 % der spezifischen Aktivität des Proteins der jeweiligen Bezugssequenz aus Gruppe A) umzusetzen,
C) eine Aminosäuresequenz, die mit einer Aminosäuresequenz nach einer der Gruppen A) und B), besonders bevorzugt nach Gruppe A), zu mindestens 80 %, besonders bevorzugt zu mindestens 90 %, darüber hinaus bevorzugt zu mindestens 95 % und am meisten bevorzugt zu mindestens 99 % identisch ist, wobei ein Protein mit dieser
Aminosäuresequenz in der Lage ist, S- oder R-Methylmalonyl-Coenzym A und Malonyl-
Coenzym A zu den entsprechenden Semialdehyden ((S)- oder (R)- Methylmalonatsemialdehyd bzw. Malonatsemialdehyd), insbesondere S- oder R- Methylmalonyl-Coenzym A zu (S)- oder (R)-Methylmalonatsemialdehyd, mit bevorzugt mindestens 80 % , besonders bevorzugt mindestens 90 %, insbesondere mindestens 95 %, ganz besonders mehr als 100 % der spezifischen Aktivität eines Proteins der jeweiligen Bezugssequenz aus Gruppe A) und B), insbesondere Gruppe A), umzusetzen, mit der Maßgabe, dass die Aminosäuresequenz der Gruppen A) bis C) mindestens einen Aminosäureaustausch ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
V16T, K38R, K67R, L149I, L149K, L149M, L149Q, L149R, Y203F, Y203H, Y203L, Y203M, T207P, T207S, I208V, 121 1 T, P282L, S310G, R315G, R315K, K317E, I330A, I330C, I330W und V334A,
bevorzugt V16T, L149K, L149M, L149R, Y203L, T207P, T207S, I330A, I330C und I330W aufweist.
Polypeptide mit den Polypeptidsequenzen der Gruppe A und den genannte
Aminosäureaustausche sind in der Lage, S- oder R-Methylmalonyl-Coenzym A zu dem entsprechenden Semialdehyden ((S)- oder (R)-Methylmalonatsemialdehyd) mit bevorzugt mindestens 1 10% , besonders bevorzugt mindestens 150 %, insbesondere mindestens 200 %, ganz besonders mindestens 300 % der spezifischen Aktivität des jeweiligen Polypeptides mit der Polypeptidsequenz der Gruppe A ohne die genannte Aminosäureaustausche umzusetzen.
Bevorzugte erfindungsgemäße Polypeptide weisen mindestens eine Kombination von
Aminosäureaustauschen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A07S Y203F, V16T K38R, K38R L149M, K38R L149R, K38R T207P, K38R I208V, L149I T207P, L149M Y203M, L149M T207P, L149M R315K, L149M K317E und L149Q T207P, insbesondere L149M T207P
auf.
Insbesondere weisen bevorzugte Polypeptide mindestens eine Kombination von
Aminosäureaustauschen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
P108L D201V N268S, K67R L149M T207S, V16T E139G L149M, L149M S310G V334A, V16T S310G V334A, L149M Y203M K284T, L149M Q153H D201 G, K67R L149M T207P, L149M T207P S310G,
V16T L149K T236A N268S, V16T I80V T207P R315G, K38R L149M T207P N221 S, K38R L149M T207P P282L, K38R L149M T207P Y298N, K38R L149M 121 1T V312F, L149Q T207P K284T K317E, L149R I 176T Y203H I208V,
V16T L149M Q153H T207P K261 E, K38R K98N L149M T207P K317E, K38R L149M T207P I239M G314C, K38R Y267M 121 1T S310G V334A, N 106S L149M I 162L T207P I239V,
K38R K67R F1 12Y L149M T207P P307S, V92L D109Y L149M T207P A260V R270G, L149M F163S I208V E217G K317E I330W,
K38R K136I L149M I21 1T V222A R315G V334A, N26K K38R E139G L149M G160V K261 E S310G V334A und V16T K38R R137G L149M M168I D169N T207P D329Y K254N S310G V334A
auf, wobei insbesondere die Kombinationen K38R K67R F1 12Y L149M T207P P307S, K38R L149M T207P P282L, K38R L149M T207P N221 S, K38R K98N L149M T207P K317E, K38R K67R F1 12Y L149M T207P P307S und N106S L149M I 162L T207P I239V bevorzugt sind. Die„Nukleotid-Identität" oder„Aminosäure-Identität" wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung mit Hilfe bekannter Verfahren bestimmt. Generell werden besondere Computerprogramme mit Algorithmen unter Berücksichtigung spezieller Erfordernisse verwendet.
Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Identität erzeugen zunächst die größte
Übereinstimmung zwischen den zu vergleichenden Sequenzen. Computer-Programme zur
Bestimmung der Identität umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, das GCG- Programmpaket, einschließlich GAP (Deveroy, J. et al., Nucleic Acid Research 12 (1984), Seite 387, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (Wi), und BLASTP, BLASTN und FASTA (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), Seiten 403-410. Das BLAST-Programm kann erhalten werden vom National Center For Biotechnology Information (NCBI) und aus weiteren Quellen (BLAST Handbuch, Altschul S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; Altschul S. et al., vorstehend).
Der bekannte Smith-Waterman Algorithmus kann ebenso zur Bestimmung der Nukleotid- Identität verwendet werden.
Bevorzugte Parameter für die Bestimmung der„Nukleotid-Identität" sind bei Verwendung des BLASTN-Programms (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), Seiten 403-
410:
Expect Threshold
Word size:
Match Score:
Mismatch Score:
Gap costs:
Die vorstehenden Parameter sind die default-Parameter im Nukleotidsequenzvergleich.
Das GAP-Programm ist ebenso zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeignet. Bevorzugte Parameter für die Bestimmung der„Aminosäure-Identität" sind bei Verwendung des BLASTP-Programms (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), Seiten 403- 410:
Expect Threshold: 10
Word size: 3
Matrix: BLOSUM62
Gap costs: Existence: 1 1 ; Extension: 1
Compositional adjustments: Conditional compositional score matrix adjustment
Die vorstehenden Parameter sind die default-Parameter im Aminosäuresequenzvergleich. Das GAP-Programm ist ebenso zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeignet. Die Nomenklatur zu den oben definierten Aminosäureaustauschen ist dem Fachmann hinlänglich bekannt. So beschreibt beispielsweise V16T, dass die Aminosäure Valin an der Position 16 gegen ein Threonin ausgetauscht worden ist. Die Nummerierung der Aminosäureposition bezieht sich immer auf die korrespondierende Position in der betrachteten Aminosäuresequenz mit SEQ.-ID-Nr. 2 als Referenz. Hierzu wird die zu betrachtende Sequenz mit SEQ.-ID-Nr. 2 mit Hilfe des BlastP-Prorgammes unter Benutzung der oben genannten Parameter abgeglichen; die in dem Aminosäureaustausch angegebene numerische Position findet sich dann in der betrachteten Aminosäuresequenz entsprechend der SEQ.-ID-Nr. 2 zugeordnet wieder.
Sollte die betrachtete Aminosäuresequenz an der angegebenen numerischen Position eine andere Aminosäure als in dem Aminosäureaustausch an erster Stelle angegebene aufweisen, so ist diese andere Aminosäure gegen die im Aminosäureaustausch an letzter Stelle
angegebene auszutauschen.
Im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden abgeleitet von der Gruppe B) oder C) sei angemerkt, dass Änderungen von Aminosäureresten einer gegebenen
Polypeptidsequenz, die zu keinen wesentlichen Änderungen der Eigenschaften und Funktion des gegebenen Polypeptides führen, dem Fachmann bekannt sind. So können beispielsweise sogenannte konservierte Aminosäuren gegeneinander ausgetauscht werden; Beispiele für solche geeigneten Aminosäuresubstitutionen sind: Ala gegen Ser; Arg gegen Lys; Asn gegen Gin oder His; Asp gegen Glu; Cys gegen Ser; Gin gegen Asn; Glu gegen Asp; Gly gegen Pro; His gegen Asn oder Gin; lle gegen Leu oder Val; Leu gegen Met oder Val; Lys gegen Arg oder Gin oder Glu; Met gegen Leu oder lle; Phe gegen Met oder Leu oder Tyr; Ser gegen Thr; Thr gegen Ser; Trp gegen Tyr; Tyr gegen Trp oder Phe; Val gegen lle oder Leu. Ebenso ist bekannt, dass Änderungen besonders am N- oder C-Terminus eines Polypeptides in Form von beispielsweise Aminosäureinsertionen oder -deletionen oft keinen wesentlichen Einfluss auf die Funktion des Polypeptides ausüben, so etwa ein Austausch R2G.
Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität des betrachteten Proteins bezüglich des Vermögens, S- oder R-Methylmalonyl-Coenzym A bzw. Malonyl-Coenzym A zu den entsprechenden Semialdehyden umzusetzen kann das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren mit entsprechend bekannten Enzymkonzentrationen eingesetzt werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Polypeptid handelt es sich um ein Enzym, welches sowohl die Umsetzung von (S)- oder (R)-Methylmalonyl-Coenzym A zur (S)- oder (R)- Methylmalonatsemialdehyd als auch die Umsetzung von Malonyl-Coenzym A zu Malonatsemialdehyd zu katalysieren vermag. Ein solches Polypeptid kann beispielsweise auf synthetischem Weg, ausgehend von der DNA-Sequenz mit der SEQ.-ID-Nr. 01 , SEQ.-ID-Nr. 03, SEQ.-ID-Nr. 05, SEQ.-ID-Nr. 07, SEQ.-ID-Nr. 09, SEQ.-ID-Nr. 1 1 , SEQ.-ID-Nr. 13, SEQ.-ID-Nr. 15 oder SEQ.-ID-Nr. 17, oder durch Transformation einer geeigneten Zelle mit einem
geeigneten Vektor umfassend die vorgenannten Nukleinsäure-Sequenzen, Expression des von diesen Nukleinsäure-Sequenzen kodierten Proteins in der Zelle, Lyse der Zelle unter Erhalt eines Zellextrakts und anschließende Aufreinigung des Enzyms mittels dem Fachmann bekannten Aufreinigungstechniken, beispielsweise mittels HPLC oder anderen
chromatographischen Verfahren, erhalten werden. Neben einer chromatographischen
Aufreinigung des Polypeptids aus Zellextrakten kann man sich auch den Vorteil zu Nutze machen, dass das erfindungsgemäße Polypeptid bis zu einer Temperatur von mindestens 75°C hitzestabil ist. Daher kann man den Zellextrakt auf eine Temperatur von beispielsweise 75°C erhitzen, wodurch es zur Koagulation und somit zum Ausfällen der nicht-hitzestabilen
Polypeptide im Zellextrakt kommt. Das erfindungsgemäße Polypeptid verbleibt in nichtdenaturierter Form im Zellextrakt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Nukleinsäuren, insbesondere isolierte Nukleinsäuren, kodierend für erfindungsgemäßes Polypetid.
Unter„kodierend für" wird hier der genetische Code mit einer Codon-Verwendung verstanden, wie er beispielsweise in E. coli vorzufinden ist; es sind aber auch Konstellationen denkbar, bei denen eine unkonventionelle Codon-Benutzung wie beispielsweise in Tetrahymena,
Plasmodium, Mycobacterium pneumoniae oder Candida tropicalis zu erfindungsgemäßen Polypeptiden führen kann. Auch diese Nukleinsäuren gelten als„kodierend für
erfindungsgemäßes Polypeptid".
Erfindungsgemäß bevorzugte Nukleinsäuren kodieren für erfindungsgemäß bevorzugte
Polypeptide.
Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den beschriebenen Nukleotidsequenzen
komplementären Nukleinsäuremoleküle. Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet weiterhin ein Vektor, vorzugsweise ein Expressionsvektor, umfassend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, wie vorstehend definiert. Als Vektoren kommen alle dem Fachmann bekannten Vektoren in
Betracht, die üblicherweise zum Einschleusen von DNA in eine Wirtzelle eingesetzt werden. Bevorzugte Vektoren sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Plasmide, wie etwa die E. coli-Plasmide pTrc99A, pBR345 und pBR322, Viren, wie etwa Bakteriophagen, Adenoviren, Vacciniaviren, Baculoviren, Masernviren und Retroviren, Cosmide oder YACs, wobei Plasmide als Vektoren am meisten bevorzugt sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Vektors liegt die erfindungsgemäße Nukleinsäure unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors, welcher zur Expression des von diesen DNA-Sequenzen kodierten Polypeptids in der Zelle eines
Mikroorganismus, vorzugsweise einer Bakterien-, Hefe- oder Pilzelle, besonders bevorzugt einer Bakterienzelle, am meisten bevorzugt einer £. co//-Zelle, geeignet ist. Beispiele für solche Promotoren sind etwa der trp-Promotor oder der tac-Promotor.
Der erfindungsgemäße Vektor sollte neben einem Promotor vorzugsweise eine
Ribosomenbindungsstelle sowie einen Terminator umfassen. Dabei ist es besonders bevorzugt, dass die erfindungsgemäße DNA in eine Expressionskassette des Vektors umfassend den Promotor, die Ribosomenbindungsstelle und den Terminator eingebaut ist. Neben den vorstehend genannten strukturellen Elementen kann der Vektor des Weiteren dem Fachmann bekannte Selektionsgene umfassen.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leisten weiterhin die Verwendung des vorstehend beschriebenen Vektors zur Transformation einer Zelle sowie die durch
Transformation mit diesem Vektor erhaltene Zelle. Die Zellen, welche mit dem erfindungsgemäßen Vektor transformiert werden können, können
Prokaryonten oder Eukaryonten sein. Dabei kann es sich um Säugetierzellen (wie etwa Zellen aus dem Menschen), um pflanzliche Zellen oder um Mikroorganismen wie Hefen, Pilze oder Bakterien handeln, wobei Mikroorganismen besonders bevorzugt und Bakterien und Hefen am meisten bevorzugt sind.
Als Bakterien, Hefen oder Pilze sind insbesondere diejenigen Bakterien, Hefen oder Pilze geeignet, die bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Deutschland, als Bakterien-, Hefe- oder Pilz-Stämme hinterlegt sind. Erfindungsgemäß geeignete Bakterien gehören zu den Gattungen, die unter
http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm
aufgeführt sind, erfindungsgemäß geeignete Hefen gehören zu denjenigen Gattungen, die unter http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm
aufgeführt sind und erfindungsgemäß geeignete Pilze sind diejenigen, die unter
http://www.dsmz.de/species/fungi.htm
aufgeführt sind.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Zellen sind diejenigen der Gattungen
Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Candida, Pichia, Kluveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia und Clostridium, wobei Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Kluveromyces lactis, Candida blankii, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zymonomas mobilis,
Yarrowia lipolytica, Methylobacterium extorquens, Ralstonia eutropha und Pichia pastoris besonders bevorzugt sind.
In einer alternativen Ausführungsform erfindungsgemäßer Zellen stellen diese acetogene Mikroorganismen dar, wie beispielsweise Arten der Gattung Acetobacterium wie A. woodii und Clostridium aceticum. Insbesondere sind die acetogenen Zellen ausgewählt aus der Gruppe umfassend, insbesondere bestehend aus, Acetoanaerobium notera, Acetobacterium woodii, Archaeoglobus fulgidus, Butyribacterium methylotrophicum, Butyribacterium methyltrophicum, Carboxydibrachium pacificus, Carboxydocella sporoproducens, Carboxydocella
thermoautotrophica, Carboxydothermus hydrogenoformans, Citrobacter sp. Y19, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium
carboxidivorans, Clostridium ljungdahlii, Desulfotomaculum carboxydivorans,
Desulfotomaculum kuznetsovii, Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp.
thermosyntrophicum, Eubacterium limosum, Methanosarcina acetivorans C2A, Methanosarcina barkeri, Methanothermobacter thermoautotrophicus, Moorella AMP, Moorella therm oacetica, Moorella thermoautotrophica, Oxobacter pfennigii, Peptostreptococcus productus,
Rhodopseudomonas palustris P4, Rhodospirillum rubrum, Rubrivivax gelatinosus, Thermincola carboxydiphila, Thermincola ferriacetica, Thermococcus AM4, Thermolithobacter carboxydivorans und Thermoanaerobacter kivui.
Eine besonders geeignete Zelle ist in diesem Zusammenhang Clostridium carboxidivorans, insbesondere solche Stämme wie "P7" und "P1 1 ". Solche Zellen sind beispielsweise in US 2007/0275447 und US 2008/0057554 beschrieben. Eine weitere, in diesem Zusammenhang besonders geeignete Zelle ist Clostridium ljungdahlii, insbesondere Stämme ausgewählt aus der Gruppe umfassend, insbesondere bestehend aus, Clostridium ljungdahlii PETC, Clostridium ljungdahlii ERI2, Clostridium IjungdahlW C0I und Clostridium ljungdahlii 0-52; diese werden in der WO 98/00558 und WO 00/68407 beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide, Nukleinsäuren, Vektoren und Zellen lassen sich vorteilhaft zur Herstellung von (S)- oder (R)-Methylmalonatsemialdehyd, von (S)- oder (R)-3- Hydroxyisobuttersäure, von auf (S)- oder (R)-3-Hydroxyisobuttersäure basierenden
Polyhydroxyalkanoaten, von Malonatsemialdehyd, von 3-Hydroxypropionsäure oder von auf 3- Hydroxypropionsäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten verwenden.
Anleitung für Verfahren zur erfindungsgemäßen Verwendung findet der Fachmann in der DE102006025821 .
In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten
Ausführungsformen beschränkt sein soll.
Beispiele:
Beispiel 1: Klonierung erfindungsgemäßer Enzyme
Das mcr Gen aus Sulfolobus tokodaii wurde aus dem Plasmid pTrc99A-mcr (Alber B et al., J. Bacteriol, 188: 8551 -8559) mit den beiden Primern mcr_fwd_Ncol (5'-
ATAC C ATG G G G AG AAC ATTAAAAG C-3 ' , SEQ.-ID-Nr. 19) und mcr_rev_Sall (5 - CTTGTCGACTTATTACTTTTCAATATATCC-3', SEQ.-ID-Nr. 20) PCR amplifiziert (Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Das 1088 bp PCR-Fragment wurde über die beiden
Restriktionsendonukleaseschnittstellen Ncol und Sali in einen pET-28a(+) E. coli l-
Expressionsvektor (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) kloniert (Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl. Cold Spring Harbor
Laboratory Press). Das pET-28a(+)-mcr Expressionskonstrukt wurde in kompetente Zellen des E. coli Expressionstamms Rosetta™ 2(DE3) (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) transformiert.
Es wurde ausgehend von dem mcr Gen eine SeSaM-Mutantenbibliotheken mittels des SeSaM- Verfahrens, beschrieben in EP1670914, hergestellt und mit den Primern SEQ.-ID-Nr. 19 und 20 kloniert. SDM-Mutantenbibliotheken wurden mittels Phusion™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Finnzymes Oy, Espoo, Finland) nach Anleitung des Herstellers im pET-28a(+)-mcr Plasmid hergestellt.
Beispiel 2: Expression erfindungsgemäßer Enzyme
Mit 250 μί aus einer gesättigten 3,5 mL ZYM-505 (Studier 2005, Protein Expr. Purif, 41 : 207- 234) über Nacht Vorkultur wurden 55 mL ZYM-5025 Hauptkultur in einem 300 mL
Erlenmeyerkolben angeimpft. Zur Selektion war allen Medien Cholramphenicol (25 g/mL) und Kanamycin (50 g/mL) zugesetzt. Die Proteinexpression erfolgte für 22 h bei 37°C und 250 rpm. Die Zellen wurden durch Zentrifugation für 15 min bei 3.220 g und 4°C geerntet. Die Zellpellets wurden in 10 mL Zellaufschlusspuffer (100 mM TrisHCI pH 7,4 bei 55°C; 5 mM MgCI2) resuspendiert und mit einem High-Pressure-Homogenizer aufgeschlossen. E. coli
Proteine wurden durch Inkubation für 15 min bei 75°C und 15 min auf Eis hitzegefällt. Die denaturierten Proteine und Zelltrümmer wurden für 20 min bei 16.000 g und 4°C abzentrifugiert. Der klare Überstand wurde im MCR-Aktivitätsnachweis eingesetzt.
Beispiel 3: Aktivitätsbestimmung erfindungsgemäßer Enzyme in Küvetten
Der Aktivitätsnachweis basiert auf der Abnahme von NADPH und wird durch Messung der
Absorption bei 340 nm im Photometer verfolgt. Ablauf: 1. 430 μΙ_ Puffer (100 mM TrisHCI pH 7,4 bei 55°C; 5,32 mM MgCI2; 5,86 mM DTT) werden in der beheizten Küvette auf 55°C
vorgewärmt; 2.
Zugabe von 10 μΙ_ 25 mM NADPH (in 100 mM TrisHCI pH 7,4 bei 55°C); 3. Zugabe von 50 μΙ_ Zellextrakt (in Zellaufschlusspuffer); 4. Starten der Reaktion durch Zugabe von 10 15 mM Malonyl-CoA oder Methylmalonyl-CoA (in 100 mM TrisHCI pH 7,4 bei 55°C).
Endkonzentrationen: 100 mM TrisHCI pH 7,4 bei 55°C; 5 mM MgCI2; 5mM DTT, 0,5 mM
NADPH; 0,3 mM X-CoA. Während der Messung wird die Abnahme der Absorption bei 340 nm für 8 min in der auf 55°C beheizten Küvette verfolgt.
Es wurde verglichen zu dem gemäß Beispiel 1 hergestellten Enzym ohne jegliche
Aminosäuremutation eine signifikante Erhöhung der spezifischen Aktivität auf das Substrat Methylmalonyl-CoA festgestellt bei solchen Enzymen mit Aminosäureaustauschen von: Y203L, A07S Y203F, L149M, L149R, L149K, V16T, V16T, T207P, T207S, I330A, I330C und I330W.
In der folgenden Tabelle sind weitere erfindungsgemäße Enzyme, charakterisiert durch ihre Aminsosäureaustausche verglichen zum Monierten Enzym gemäß Beispiel 1 ohne
Aminosäureaustausch gelistet. Die %-Aktivität stellt die spezifische Aktivität relativ zum
Monierten Enzym gemäß Beispiel 1 ohne Aminosäureaustausch bezogen auf Methylmalonyl- CoA dar, wobei die spezifische Aktivität des Monierten Enzym gemäß Beispiel 1 ohne
Aminosäureaustausch auf 100 % festgelegt wurde.
Aminosäure-Austausch % Aktivität
K38R K136I L149M I21 1 T V222A R315G V334A 607
K38R K67R F1 12Y L149M T207P P307S 1395
K38R K98N L149M T207P K317E 1489
K38R L149M 389 K38R L149M 121 "I T V312F 444
K38R L149M T207P I239M g314c 718
K38R L149M T207P N221 S 1320
K38R L149M T207P P282L 1557
K38R Y267M 121 1 T S310G V334A 171
K67R L149M T207S 226
L149M F163S I208V E217G K317E I330W 587
L149M Q153H D201 G 403
L149M S310G V334A 201
L149M T207P 651
N106S L149M I 162L T207P I239V 1227
V92L D109Y L149M T207P A260V R270G 534
Es konnten somit Enzyme charakterisiert werden, die bis zu einer fast 15-fach erhöhten Aktivität bezogen auf Methylmalonyl-CoA aufweisen.

Claims

Ansprüche:
1 . Isoliertes Polypeptid mit einer der folgenden Aminosäuresequenzen:
A) eine Aminosäuresequenz mit der SEQ.-ID-Nr. 2, SEQ.-ID-Nr. 4, SEQ.-ID-Nr. 6, SEQ.-ID-Nr. 8, SEQ.-ID-Nr. 10, SEQ.-ID-Nr. 12, SEQ.-ID-Nr. 14, SEQ.-ID-Nr. 16 und SEQ.-ID-Nr. 18, insbesondere SEQ.-ID-Nr. 2,
B) eine Aminosäuresequenz, die erhalten wird, wenn höchstens 40 Aminosäuren in einer Aminosäuresequenz der Gruppe A) deletiert, insertiert, substituiert oder aber an das C- und/oder N-terminale Ende einer Aminosäuresequenz der Gruppe A) angefügt sind, wobei ein Protein mit dieser Aminosäuresequenz in der Lage ist, S- oder R-Methylmalonyl-Coenzym A und Malonyl-Coenzym A zu den entsprechenden Semialdehyden ((S)- oder (R)-Methylmalonatsemialdehyd bzw.
Malonatsemialdehyd) umzusetzen,
C) eine Aminosäuresequenz, die mit einer Aminosäuresequenz nach einer der
Gruppen A) und B), zu mindestens 80 % identisch ist, wobei ein Protein mit dieser Aminosäuresequenz in der Lage ist, S- oder R-Methylmalonyl-Coenzym A und Malonyl-Coenzym A zu den entsprechenden Semialdehyden ((S)- oder (R)- Methylmalonatsemialdehyd bzw. Malonatsemialdehyd) umzusetzen.
mit der Maßgabe, dass die Aminosäuresequenz der Gruppen A) bis C) mindestens einen
Aminosäureaustausch ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
V16T, K38R, K67R, L149I, L149K, L149M, L149Q, L149R, Y203F, Y203H, Y203L,
Y203M, T207P, T207S, I208V, 121 1T, P282L, S310G, R315G, R315K, K317E, I330A,
I330C, I330W und V334A
aufweist.
2. Polypeptid gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine
Kombination von Aminosäureaustauschen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A07S Y203F, V16T K38R, K38R L149M, K38R L149R, K38R T207P, K38R I208V, L149I T207P, L149M Y203M, L149M T207P, L149M R315K, L149M K317E und L149Q T207P aufweist.
3. Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Kombination von Aminosäureaustauschen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus P108L D201V N268S, K67R L149M T207S, V16T E139G L149M, L149M S310G V334A, V16T S310G V334A, L149M Y203M K284T, L149M Q153H D201 G, K67R L149M T207P, L149M T207P S310G,
V16T L149K T236A N268S, V16T I80V T207P R315G, K38R L149M T207P N221 S, K38R L149M T207P P282L, K38R L149M T207P Y298N, K38R L149M I21 1 T V312F, L149Q T207P K284T K317E, L149R I 176T Y203H I208V,
V16T L149M Q153H T207P K261 E, K38R K98N L149M T207P K317E, K38R L149M T207P I239M G314C, K38R Y267M I21 1T S310G V334A, N106S L149M I 162L T207P I239V,
K38R K67R F1 12Y L149M T207P P307S, V92L D109Y L149M T207P A260V R270G, L149M F163S I208V E217G K317E I330W,
K38R K136I L149M I21 1 T V222A R315G V334A, N26K K38R E139G L149M G160V K261 E S310G V334A und V16T K38R R137G L149M M168I D169N T207P D329Y K254N S310G V334A
aufweist.
4. Isolierte Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid gemäß mindestens einem der
Ansprüche 1 bis 3.
5. Vektor umfassend eine Nukleinsäure nach Anspruch 4.
6. Zelle transformiert mit einer Nukleinsäure nach Anspruch 4 oder einem Vektor nach
Anspruch 5.
7. Verwendung eines Polypeptides nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, einer Nukleinsäure Anspruch 4, eines Vektors nach Anspruch 5 oder einer Zelle nach Anspruch 6 zur Herstellung von zur Herstellung von (S)- oder (R)-Methylmalonatsemialdehyd, von (S)- oder (R)-3-Hydroxyisobuttersäure, von auf (S)- oder (R)-3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten, von Malonatsemialdehyd, von 3- Hydroxypropionsäure oder von auf 3-Hydroxypropionsäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten.
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8980594B2 (en) 2009-11-11 2015-03-17 Evonik Roehm Gmbh Use of a protein homologous to a MeaB protein for increasing the enzymatic activity of a 3-hydroxycarboxylic acid-CoA mutase
US9249435B2 (en) 2011-12-22 2016-02-02 Evonik Degussa Gmbh Process for the improved separation of a hydrophobic organic solution from an aqueous culture medium
US9315443B2 (en) 2011-02-16 2016-04-19 Evonik Degussa Gmbh Liquid cation exchanger
US9765370B2 (en) 2012-04-02 2017-09-19 Evonik Degussa Gmbh Method for aerobically producing alanine or a compound produced using alanine
US10787688B2 (en) 2012-05-11 2020-09-29 Evonik Operations Gmbh Multi-stage synthesis method with synthesis gas
DE102016212497B4 (de) 2015-07-13 2024-04-25 Sk Innovation Co., Ltd. Mutanter Mikroorganismus, der ein Gen umfasst, das Methylmalonyl-CoA-Reductase codiert, und seine Verwendung

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998000558A1 (en) 1994-11-30 1998-01-08 Bioengineering Resources, Inc. Biological production of acetic acid from waste gases
WO2000068407A1 (en) 1999-05-07 2000-11-16 Bioengineering Resources, Inc. Clostridium strains which produce ethanol from substrate-containing gases
EP1670914A1 (de) 2003-10-02 2006-06-21 Basf Aktiengesellschaft Verfahren zur sequenz-saturations-mutagenese (sesam)
US20070275447A1 (en) 2006-05-25 2007-11-29 Lewis Randy S Indirect or direct fermentation of biomass to fuel alcohol
DE102006025821A1 (de) 2006-06-02 2007-12-06 Degussa Gmbh Ein Enzym zur Herstellung von Mehylmalonatsemialdehyd oder Malonatsemialdehyd
US20080057554A1 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Huhnke Raymond L Isolation and characterization of novel clostridial species

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102007015583A1 (de) * 2007-03-29 2008-10-02 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Ein Enzym zur Herstellung von Methylmalonyl-Coenzym A oder Ethylmalonyl-Coenzym A sowie dessen Verwendung

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998000558A1 (en) 1994-11-30 1998-01-08 Bioengineering Resources, Inc. Biological production of acetic acid from waste gases
WO2000068407A1 (en) 1999-05-07 2000-11-16 Bioengineering Resources, Inc. Clostridium strains which produce ethanol from substrate-containing gases
EP1670914A1 (de) 2003-10-02 2006-06-21 Basf Aktiengesellschaft Verfahren zur sequenz-saturations-mutagenese (sesam)
US20070275447A1 (en) 2006-05-25 2007-11-29 Lewis Randy S Indirect or direct fermentation of biomass to fuel alcohol
DE102006025821A1 (de) 2006-06-02 2007-12-06 Degussa Gmbh Ein Enzym zur Herstellung von Mehylmalonatsemialdehyd oder Malonatsemialdehyd
US20080057554A1 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Huhnke Raymond L Isolation and characterization of novel clostridial species

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALBER B ET AL., J. BACTERIOL, vol. 188, pages 8551 - 8559
ALTSCHUL S. ET AL.: "BLAST Handbuch", NIH
ALTSCHUL, S. ET AL., JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 215, 1990, pages 403 - 410
DEVEROY, J. ET AL.: "Nucleic Acid Research", vol. 12, 1984, GENETICS COMPUTER GROUP UNIVERSITY OF WISCONSIN, pages: 387
SAMBROOK J, FRITSCH E, MANIATIS T.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual.", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
STUDIER, PROTEIN EXPR. PURIF, vol. 41, 2005, pages 207 - 234

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8980594B2 (en) 2009-11-11 2015-03-17 Evonik Roehm Gmbh Use of a protein homologous to a MeaB protein for increasing the enzymatic activity of a 3-hydroxycarboxylic acid-CoA mutase
US9315443B2 (en) 2011-02-16 2016-04-19 Evonik Degussa Gmbh Liquid cation exchanger
US10071951B2 (en) 2011-02-16 2018-09-11 Evonik Degussa Gmbh Liquid cation exchanger
US9249435B2 (en) 2011-12-22 2016-02-02 Evonik Degussa Gmbh Process for the improved separation of a hydrophobic organic solution from an aqueous culture medium
US9765370B2 (en) 2012-04-02 2017-09-19 Evonik Degussa Gmbh Method for aerobically producing alanine or a compound produced using alanine
US10787688B2 (en) 2012-05-11 2020-09-29 Evonik Operations Gmbh Multi-stage synthesis method with synthesis gas
DE102016212497B4 (de) 2015-07-13 2024-04-25 Sk Innovation Co., Ltd. Mutanter Mikroorganismus, der ein Gen umfasst, das Methylmalonyl-CoA-Reductase codiert, und seine Verwendung

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Publication number Publication date
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