WO2011154640A2 - Modulateurs de trmp1, mmp2, mia ou ptgs1 dans le traitement du melasma - Google Patents

Modulateurs de trmp1, mmp2, mia ou ptgs1 dans le traitement du melasma Download PDF

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    • G01N2800/20—Dermatological disorders
    • G01N2800/207—Pigmentation disorders

Definitions

  • the invention relates to the identification and use of modulating compounds of TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1, for the treatment of melasma. It also relates to methods of in vitro diagnosis or prognosis in vitro of this pathology.
  • pigmentation results from the synthesis and distribution of melanin pigments in the skin, hair follicles or eyes. Pigmentation is genetically predefined but it is regulated by many internal or external factors.
  • the melanins produced by melanocytes as well as the number of melanocytes, their tyrosinasic activity and their ability to export melanins to keratinocytes, the size of melanosomes that contain melanin grains, will condition the color of human skin.
  • pathologies related to excessive pigmentation include melasma.
  • Melasma is an acquired hyperpigmentation that is generally symmetrical with the photo-exposed areas of the face (forehead, cheeks, temples) and sometimes the neck. Elemental lesions are small, irregularly-shaped macules, ranging in color from light brown to black, and increasing after sun exposure.
  • Melasma affects mainly women (90% of cases), especially during pregnancy. Some consider it to be a physiological change in the pregnant woman as well as the hyperpigmentation of the areoles, genital mucosa and the white line, or linea fusca, whose treatment is similar to that of melasma.
  • the clinical and pathological features are identical in both sexes. There are three different clinical presentations: the most common centrofacial melasma, the malar melasma and the mandibular.
  • melanic origin may be at the epidermal and / or dermal level. The number of melanocytes is not modified, but melanin production by the basal cell melanocytes is increased.
  • Wood The light examination of Wood is very useful, it allows to distinguish three types of melasma according to the pigment distribution: - the epidermal type (70% of the cases) where the hyperpigmentation is accentuated;
  • Hydroquinone, tretinoin and azelaic acid are the three agents with scientifically recognized activity in melasma.
  • compositions for treating melasma have been sought, and in particular for modulating the amount of melanin in the skin.
  • TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1 was expressed in YYY (cells in which TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1 are expressed preferentially) and that its expression was induced TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1. She therefore proposes to target this gene or its expression product, to treat melasma.
  • the protein encoded by this gene is similar to the transient receptor potential (Trp) members of the calcium channel family. Expression of this protein is inversely correlated with melanoma aggressiveness, suggesting that it suppresses melanoma metastases.
  • Trp transient receptor potential
  • MMP matrix metalloproteinase
  • the matrix metalloproteinase (MMP) proteins of the family are involved in the degradation of the extracellular matrix in normal physiological processes, such as embryonic development, reproduction, and tissue remodeling, as well as in the processes of the disease, such as arthritis and metastases. Most MMPs are secreted under inactive proproteins that are activated when cleaved by extracellular proteases.
  • This gene encodes an enzyme that degrades type IV collagen, the main structural component of basement membranes. The enzyme plays a role in fragmentation endometrial rules, regulation of vascularization and inflammatory response. Mutations of this gene have been associated with Winchester syndrome and Nodulitis-Arthropathy-osteolysis (NAO) syndrome. Two transcription variants encoding different isoforms were found for this gene.
  • MIA is expressed in melanoma and inversely correlated with the state of metastatic melanoma. Description of the PTGS1 gene
  • Prostaglandin synthase endoperoxide also known as cyclooxygenase, is the key enzyme in the biosynthesis of prostaglandins, and acts both as a dioxygenase and as a peroxidase.
  • PTGS Prostaglandin synthase endoperoxide
  • This gene codes PTGS1, which regulates angiogenesis in endothelial cells, and is inhibited by anti-inflammatory drugs such as aspirin.
  • PTGS1 is presumed to be involved in cell-signaling cell and maintaining tissue homeostasis.
  • the alternative splicing of this gene generates two variants of transcription. The expression of these two transcripts differentially is regulated by the relevant cytokines and growth factors.
  • TRPM1 The human and protein DNA sequences of TRPM1 are reproduced in the appendix, respectively SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 1.
  • the human and protein DNA sequences of MMP2 are reproduced in the appendix, respectively SEQ ID No.4 and SEQ ID No.3.
  • An object of the invention relates to an in vitro method for diagnosing or monitoring the evolution of melasma in a subject, comprising comparing the expression or the activity of the protein TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1, of the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters in a biological sample of a subject relative to a control subject.
  • the expression of the protein can be determined by an assay of this TRMP1 protein, MMP2, MIA or PTGS1 by an immunohistochemical test, for example by ELISA assay. Another method, in particular for measuring the expression of the gene, is to measure the corresponding quantity of mRNA, by any method as described above. An assay of the activity of TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1 can also be envisaged.
  • control is a "healthy” subject.
  • control subject refers to the same subject at a different time, which preferably corresponds to the beginning of treatment (To).
  • This measurement of the difference in the expression or activity of TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters makes it possible in particular to monitor the efficacy of a treatment, in particular treatment with a modulator of TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1, as envisaged above or by another treatment of melasma.
  • follow-up can reassure the patient as to the appropriateness, or necessity, of continuing this treatment.
  • Another aspect of the present invention relates to an in vitro method for determining a susceptibility of a subject to develop melasma, comprising comparing the expression or activity of TRMP1, MMP2, MIA, or PTGS1, of the expressing its gene or the activity of at least one of its promoters in a biological sample of a subject relative to a control subject.
  • the expression of the protein can be determined by a TRMP1, MMP2, MIA or PTGS 1 assay, by an immunohistochemical assay or immunoassay, for example by ELISA assay.
  • Another method, especially for measuring the expression of the gene is to measure the amount of corresponding mRNA by any method as described above.
  • An assay of TRMP1, MMP2, MIA, or PTGS1 factor activity may also be considered.
  • the tested subject is here an asymptomatic subject, having no hair disorder related to alopecia.
  • the subject "control” in this method means a "healthy" reference subject or population. The detection of this susceptibility allows the establishment of a preventive treatment and / or increased monitoring of the signs related to alopecia.
  • the biological sample tested may be any sample of biological fluid or a sample of a biopsy.
  • the sample may be a preparation of skin cells, obtained for example by hair removal or biopsy.
  • Another subject of the invention is an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of melasma, comprising determining the ability of a compound to modulate TRMP1 expression or activity, MMP2, MIA or PTGS1 or the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, said modulation indicating the utility of the compound for the preventive or curative treatment of melasma.
  • the method therefore makes it possible to select the compounds capable of modulating the expression or the activity of TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1, or the expression of its gene, or the activity of at least one of its promoters.
  • the invention relates to an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of melasma, comprising the following steps: at. preparation of at least two biological samples or reaction mixtures;
  • the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters in the biological samples or reaction mixtures; d. selection of compounds for which a modulation of the expression or activity of TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters is measured in the sample or mixture treated in (b), relative to the untreated sample or mixture.
  • Modulation means any effect on the level of expression or activity of TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, possibly to know an inhibition, but preferably a stimulation, partial or complete.
  • the compounds tested in step d) above preferably induce the expression or the activity of TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters.
  • expression of a protein means the amount of that protein;
  • protein activity is meant its biological activity
  • promoter activity is meant the ability of this promoter to trigger the transcription of the coded DNA sequence downstream of this promoter (and thus indirectly the synthesis of the corresponding protein).
  • the compounds tested can be of any type. They can be of natural origin or have been produced by chemical synthesis. It can be a library of structurally defined chemical compounds, compounds or uncharacterized substances, or a mixture of compounds.
  • the biological samples are cells transfected with a reporter gene operably linked to all or part of the promoter of the DE TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1 gene, and the step c) described above consists of measuring the expression of said reporter gene.
  • the reporter gene may in particular code for an enzyme which, in the presence of a given substrate, leads to the formation of colored products, such as CAT (chloramphenicol acetyltransferase), GAL (beta galactosidase), or GUS (beta glucuronidase). It may also be the gene for luciferase or GFP (Green Fluorescent Protein).
  • the assay of the protein encoded by the reporter gene, or of its activity is carried out conventionally, by colorimetric, fluorometric or chemiluminescence techniques, among others.
  • the biological samples are cells expressing the gene coding for the transcription factor DE TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1, and the step c) described above consists in measuring the expression of said gene.
  • the cell used here can be of any type. It may be a cell expressing the TRMP1 gene, MMP2, MIA or PTGS1 endogenously, such as for example a liver cell, a prostate cell, or more preferably a skin cell. Organs of human or animal origin can also be used.
  • a heterologous nucleic acid encoding the TRMP1 gene, MMP2, MIA or PTGS1, preferably human or mammalian.
  • a wide variety of host cell systems can be used, such as, for example, Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells.
  • the nucleic acid can be stably or transiently transfected by any method known to those skilled in the art, for example by calcium phosphate, DEAE-dextran, liposome, virus, electroporation, or microinjection.
  • the expression of the TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1 gene can be determined by measuring the transcription rate of said gene, or its translation rate.
  • transcription rate of a gene is meant the amount of corresponding mRNA produced.
  • translation rate of a gene is meant the amount of corresponding protein produced.
  • the expression of the gene can be measured by real-time PCR or by RNase protection.
  • RNase protection is meant the detection of a known mRNA from the poly (A) RNAs of a tissue that can be done by means of specific hybridization with a labeled probe.
  • the probe is a labeled complementary RNA (for example radioactive or enzymatic) of the messenger to look for. It can be constructed from a known mRNA whose cDNA, after RT-PCR, has been cloned into a phage.
  • RNA-poly (A) of the tissue where the sequence is to be searched is incubated with this probe under slow hybridization conditions in a liquid medium.
  • RNA hybrids are formed between the desired mRNA and the probe antisense.
  • the hybrid medium is then incubated with a mixture of ribonucleases specific for single-stranded RNA, so that only the hybrids formed with the probe can resist this digestion.
  • the digestion product is then deproteinized and repurified, before being analyzed by electrophoresis.
  • the labeled hybrid RNAs are detected for example by autoradiography or chemiluminescence.
  • the translation rate of the gene is evaluated for example by immunological assay of the product of said gene.
  • the antibodies used for this purpose may be of polyclonal or monoclonal type. Their production is based on conventional techniques.
  • a polyclonal anti-Early growth response antibody 1 can, inter alia, be obtained by immunizing an animal such as a rabbit or a mouse, using the entire protein. The antiserum is removed and then exhausted according to methods known to those skilled in the art.
  • a monoclonal antibody can, inter alia, be obtained by the conventional method of Kohler and Milstein (Nature (London), 256: 495-497 (1975)). Other methods of preparing monoclonal antibodies are also known.
  • monoclonal antibodies can be produced by expression of a cloned nucleic acid from a hybridoma.
  • Antibodies can also be produced by the phage display technique, by introducing antibody cDNAs into vectors, which are typically filamentous phages that have V gene libraries on the surface of the phage. (for example, ÎUSE5 for E. coli).
  • the immunoassay can be carried out in solid phase or in homogeneous phase; in a time or in two stages; sandwich method or competitive method, by way of non-limiting examples.
  • the capture antibody is immobilized on a solid phase.
  • solid phase it is possible to use microplates, in particular polystyrene microplates, or particles or solid beads, paramagnetic beads.
  • ELISA assays immunoassays, or any other detection technique can be used to reveal the presence of the antigen-antibody complexes formed.
  • the characterization of antigen / antibody complexes, and more generally isolated or purified but also recombinant proteins (obtained in vitro and in vivo) can be performed by mass spectrometry analysis. This identification is made possible thanks to the analysis (determination of the mass) of the peptides generated by the enzymatic hydrolysis of the proteins (trypsin in general).
  • the proteins are isolated according to methods known to those skilled in the art, prior to enzymatic digestion.
  • Peptide analysis in the form of a hydrolyzate
  • HPLC nano-HPLC
  • the determination of the mass of the peptides thus separated is carried out by ionization of the peptides and either by direct coupling to the mass spectrometer (electrospray mode ESI) or after deposition and crystallization in the presence of a matrix known to those skilled in the art ( analysis in MALDI mode).
  • the proteins are then identified through the use of appropriate software (eg Mascot).
  • the TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1 gene can be produced according to standard techniques using Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells. It can also be produced using microorganisms such as bacteria (e.g. E. coli or B. subtilis), yeasts (e.g. Saccharomyces, Pichia) or insect cells, such as Sf9 or Sf21.
  • the subject of the invention is also the use of a modulator of TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1 obtainable according to one of the methods described above for the preparation of a medicinal product intended for preventive treatment and / or or curative of melasma.
  • a method of preventive and / or curative treatment of melasma comprising administering a therapeutically effective amount of a TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1 modulator to a patient in need of such treatment.
  • modulators are activators (or inducers) of TRMP1, MMP2, MIA or PTGS 1.
  • the invention comprises the use of TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1-inducing compounds, such as those identified by the screening method described above, for the preventive and / or curative treatment of melasma.
  • the modulator compounds are formulated in pharmaceutical compositions, in association with a pharmaceutically acceptable carrier. These compositions may be administered, for example, enterally, parenterally, or topically. Preferably, the pharmaceutical composition is applied topically. Orally, the pharmaceutical composition can be in the form of tablets, capsules, dragees, syrups, suspensions, solutions, powders, granules, emulsions, suspensions of microspheres or nanospheres or lipid vesicles or polymers for controlled release. Parenterally, the pharmaceutical composition may be in the form of solutions or suspensions for infusion or for injection.
  • the pharmaceutical composition is more particularly intended for the treatment of the skin, the mucous membranes and the scalp and may be in the form of ointments, creams, milks, ointments, powders, soaked swabs, solutions, gels, sprays, lotions or suspensions. It may also be in the form of suspensions of microspheres or nanospheres or lipid or polymeric vesicles or polymeric patches or hydrogels allowing controlled release.
  • This composition for topical application may be in anhydrous form, in aqueous form or in the form of an emulsion.
  • the pharmaceutical composition is in the form of a gel, a cream or a lotion.
  • the composition may comprise a modulator content of TRMP1, MMP2, MIA or PTGS1 ranging from 0.001 to 10% by weight, especially from 0.01 to 5% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition may further contain inert additives or combinations of these additives, such as:
  • UV-A and UV-B filters are UV-A and UV-B filters
  • antioxidants such as alpha-tocopherol, butylhydroxyanisole or butylhydroxytoluene, superoxide dismutase, ubiquinol or certain metal chelators.

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Abstract

L'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif ou curatif du melasma, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1, ainsi que l'utilisation de modulateurs de l'expression ou de l'activité de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 pour le traitement du melasma. L'invention concerne aussi des méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro de cette pathologie.

Description

Modulateurs de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGSl dans le traitement du melasma
L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGSl , pour le traitement du melasma. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro de cette pathologie.
Art antérieur et description de la situation
Chez l'homme, la pigmentation résulte de la synthèse et de la distribution des pigments mélaniques dans la peau, les follicules pileux ou les yeux. La pigmentation est génétiquement prédéfinie mais elle est régulée par de nombreux facteurs internes ou externes. Les mélanines produites par les mélanocytes ainsi que le nombre de mélanocytes, leur activité tyrosinasique et leur capacité à exporter les mélanines vers les kératinocytes, la taille des mélanosomes qui contiennent des grains de mélanine, vont conditionner la couleur de la peau humaine. Parmis les pathologies liées à une pigmentation excessive, on peut citer le melasma.
Le mélasma est une hyperpigmentation acquise généralement symétrique des zones photo- exposées de la face (front, joues, tempes) et parfois du cou. Les lésions élémentaires sont de petites macules au contour irrégulier, dont la couleur va du brun clair au noir et s'accentue après exposition solaire.
Le mélasma touche principalement les femmes (90 p. 100 des cas), surtout durant la grossesse. Certains le considère d'ailleurs comme une modification physiologique chez la femme enceinte au même titre que l'hyperpigmentation des aréoles, des muqueuses génitales et de la ligne blanche abdominale, ou linea fusca, dont le traitement est similaire à celui du mélasma. Les caractéristiques cliniques et anatomopathologiques sont identiques dans les deux sexes. On distingue trois présentations cliniques différentes : le mélasma centrofacial le plus fréquent, le mélasma malaire et le mandibulaire. A l'examen anatomopathologique, on retrouve une hyperpigmentation d'origine mélanique pouvant se situer au niveau épidermique et/ou dermique. Le nombre de mélanocytes n'est pas modifié, mais la production de mélanine par les mélanocytes des assises basales est augmentée.
L'examen en lumière de Wood est très utile, il permet de distinguer trois types de mélasma en fonction de la distribution pigmentaire : — le type épidermique (70 p. 100 des cas) où l'hyperpigmentation est accentuée ;
— le type dermique (10 p. 100 des cas) où l'hyperpigmentation est estompée ; — le type mixte (20 p. 100 des cas) où l'on retrouve un mélange des deux images.
Chez les patients de phototype VI, cet examen est non contributif. Cette distinction a toute son importance dans la décision thérapeutique car le pigment dermique résiste à tous les traitements dépigmentants classiques.
L'hydroquinone, la trétinoïne et l'acide azélaïque sont les trois agents ayant une activité scientifiquement reconnue dans le mélasma.
Cet arsenal thérapeutique est limité , par conséquent on recherche ainsi depuis de nombreuses années, dans l'industrie cosmétique ou pharmaceutique, des compositions permettant traiter le melasma, et notamment de moduler la quantité de mélanine dans la peau.
La demanderesse a maintenant trouvé que le gène TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 était exprimé dans YYY (cellules où est exprimé TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 de manière préférentielle) et que son expression était induite TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 ,. Elle propose dès lors de cibler ce gène ou son produit d'expression, pour traiter le melasma.
Descriptif du gène TRMP1
La protéine codée par ce gène est similaire au potentiel de récepteur transitoire (Trp) membres de la famille des canaux calciques. L'expression de cette protéine est inversement corrélé à l'agressivité de mélanome, ce qui suggère qu'il supprime les métastases du mélanome.
Descriptif du gène MMP2
Les protéines de la matrice métalloprotéinase (MMP) de la famille sont impliqués dans la dégradation de la matrice extracellulaire dans les processus physiologiques normaux, comme le développement embryonnaire, la reproduction, et le remodelage des tissus, ainsi que dans les processus de la maladie, telles que l'arthrite et les métastases. La plupart des MMP sont sécrétées sous proprotéines inactifs qui sont activés lorsque clivée par des protéases extracellulaires. Ce gène code pour une enzyme qui dégrade le collagène de type IV, le principal composant structurel des membranes basales. L'enzyme joue un rôle dans la fragmentation règles de l'endomètre, la réglementation de la vascularisation et la réponse inflammatoire. Des mutations de ce gène ont été associées au syndrome de Winchester et Nodulite-Arthropathie-ostéolyse (NAO) du syndrome. Deux variantes de transcription codant pour différentes isoformes ont été trouvés pour ce gène.
Descriptif du gène MIA
MIA est exprimée dans le mélanome et inversement corrélée à l'état de mélanome métastatique. Descriptif du gène PTGS1
La prostaglandine synthase-endoperoxyde (PTGS), également connu comme la cyclo- oxygénase, est l'enzyme clé dans la biosynthèse des prostaglandines, et agit à la fois comme une dioxygénase et comme une peroxydase. Il existe deux isozymes de PTGS: un PTGS1 constitutive et une PTGS2 inductible, qui diffèrent dans leur régulation de l'expression et la distribution tissulaire. Ce gène code PTGS1, qui réglemente l'angiogenèse dans les cellules endothéliales, et est inhibée par les anti- inflammatoires comme l'aspirine. PTGS1 est présumée être impliquée dans la cellule-signalisation cellulaire et le maintien de l'homéostasie tissulaire. L'épissage alternatif de ce gène génère deux variantes de transcription. L'expression de ces deux transcrits différentiellement est réglementé par les cytokines pertinentes et facteurs de croissance.
Les séquences ADN humain et protéiques de TRPM1 sont reproduites en annexe, respectivement SEQ ID No.2 et SEQ ID No. l .
Les séquences ADN humain et protéiques de MMP2 sont reproduites en annexe, respectivement SEQ ID No.4 et SEQ ID No.3.
Les séquences ADN humain et protéiques de MIA sont reproduites en annexe, respectivement SEQ ID No.6 et SEQ ID No.5.
Les séquences ADN humain et protéiques de PTGS 1 sont reproduites en annexe, respectivement SEQ ID No.8 et SEQ ID No.7.
Applications diagnostiques
Un objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution du melasma chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 , de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un sujet contrôle.
L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de cette protéine TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 par un test immunohistochimique, par exemple par dosage ELIS A. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 peut être également envisagé.
Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet « contrôle » est un sujet « sain ».
Dans le cadre d'un suivi de l'évolution du melasma, le « sujet contrôle » fait référence au même sujet à un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette mesure de la différence de l'expression ou d'activité de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 , de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, permet notamment de suivre l'efficacité d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGSl , tel qu'envisagé plus haut ou par un autre traitement du melasma. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce traitement.
Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer le melasma, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activitéde TRMP1, MMP2, MIA OU PTGSl , de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un sujet contrôle.
Là encore, l'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS 1 , par un test immunohistochimique ou immunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du facteur de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGSl peut être également envisagé.
Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble capillaire lié à une alopécie. Le sujet « contrôle », dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de référence « saine ». La détection de cette susceptibilité permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes liés à l'alopécie.
Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon biologique testé peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie. De préférence l'échantillon peut être néanmoins une préparation de cellules de la peau, obtenues par exemple par épilation de cheveux ou biopsie.
Méthodes de criblage
Un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif du melasma, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGSl ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif du melasma. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de moduler l'expression ou l'activité de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGSl , ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif du melasma, comprenant les étapes suivantes : a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ;
b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ;
c. mesure de l'expression ou de l'activité de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1
, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 , de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b), par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.
Par « modulation », on entend tout effet sur le niveau d'expression ou d'activité de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 , de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, à savoir éventuellement une inhibition, mais de préférence une stimulation, partielle ou complète.
Ainsi, les composés testés à l'étape d) ci-dessus induisent de préférence l'expression ou l'activité de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 , l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par « expression d'une protéine », on entend la quantité de cette protéine ;
Par « activité d'une protéine », on entend son activité biologique ;
Par « activité d'un promoteur », on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la protéine correspondante).
Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou d'un mélange de composés.
Différentes techniques peuvent être mises en œuvre pour tester ces composés et identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 .
Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène DE TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 , et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT (chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codé par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, ou de chimioluminescence, entre autres.
Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour le facteur de transcription DE TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 , et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène.
La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gène TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule de prostate, ou encore mieux une cellule de la peau,. On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale.
Il peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour le gene TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 , de préférence humaine ou de mammifère. Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou microinjection.
Dans ces méthodes, l'expression du gène TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 peut être déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction.
Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm correspondant produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine correspondante produite.
L'homme du métier est familier avec les techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RT- PCR, protection à la Rnase). Il peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques or autres ligands (par exemple, avidine/biotine).
En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué (par exemple radioactif ou enzymatique) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été cloné dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm recherché et la sonde antisens. Le milieu hybride est alors incubé avec un mélange de ribonucléases spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéïnisé et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par exemple par autoradiographie ou chimioluminescence.
Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal anti-Early growth response 1 peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de la protéine entière. L'antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi connues par l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple ÎUSE5 pour E.coli).
Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques.
Des dosages ELISA, des immunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés.
La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leurs propriétés physico-chimique (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI) soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot). Le gene TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 peut être produit selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Il peut également être produit à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21.
Modulateurs du facteur de transcription
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 susceptible d'être obtenu selon l'une des méthodes décrites ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif du melasma.
Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif du melasma, méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 , à un patient nécessitant un tel traitement. De préférence, de tels modulateurs sont des activateurs (ou inducteurs) de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS 1 .
L'invention comprend l'utilisation de composés inducteurs de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS 1 , tels que ceux identifiés par la méthode de criblage décrite plus haut, pour le traitement préventif et/ou curatif du melasma.
Les composés modulateurs sont formulés au sein de compositions pharmaceutiques, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent être administrées par exemple par voie entérale, parentérale, ou topique. De préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection.
Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau, des muqueuses et du cuir chevelu et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion. La composition peut comprendre une teneur en modulateur de TRMPl, MMP2, MIA OU PTGSl allant de 0,001 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition.
La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que :
- des agents mouillants;
- des agents d'amélioration de la saveur;
- des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque;
- des agents stabilisants;
- des agents régulateurs d'humidité;
- des agents régulateurs de pH;
- des agents modificateurs de pression osmotique;
- des agents émulsionnants;
- des filtres UV-A et UV-B ;
- et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, I'Ubiquinol ou certains chélatants de métaux.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
Données expérimentales
ProbeSet 237070_at 201069_at 206560_s_at 215813_s_at 205128_x_at
GENE SYMBOL TRPM1 MMP2 Ml A PTGS1 PTGS1
UNIGENE Hs.155942 Hs.5 3617 Hs.646364 Hs.201978 Hs.201978 patient 1 (fold
1,52215543 0,822066553 0,450477354 2,444911996 2,327399151 induction)
patient 3 (fold
1,052216312 2,018513328 0,7599789 2,328764513 1,817952209 induction)
patient 4 (fold
1,587934114 1,670057561 0,612459683 1,185778999 1,155675496 induction)
patient 5 (fold
1,595569777 1,380992278 0,925424951 1,437373103 1,281994606 induction)
patient 10 (fold
1,578088327 1 ,37969543 0,670432708 1,313481717 1,470561226 induction) patient 12 (fold
1,824801905 1,826864188 1,128034764 1,053192103 1,138111938 induction) géométrie mean
of
6 1,506410118 1,459010654 0,726265054 1,541637562 1,479587276 patients (fold
induction)

Claims

REVENDICATIONS
Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif du melasma, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de TRMPl, MMP2, MIA OU PTGS1 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif du melasma selon la revendication 1 , comprenant les étapes suivantes :
a. Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ;
b. Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ;
c. Mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine TRMPl, MMP2, MIA OU PTGS1 , de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ;
d. Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine TRMPl, MMP2, MIA OU PTGS1 , ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.
Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) activent l'expression ou l'activité de la protéine TRMPl, MMP2, MIA OU PTGS1 , ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène TRMPl, MMP2, MIA OU PTGS1 , et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur.
Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène TRMPl, MMP2, MIA OU PTGS1 , et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène.
Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des cellules transformées par un acide nucléique hétérologue codant pour TRMPl , MMP2, MIA OU PTGS1 .
7. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène.
8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène.
9. Utilisation d'un modulateur de TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 susceptible d'être obtenu selon l'une des revendications 1 à 9 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif du melasma.
10. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que le modulateur est un activateur du gène TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 .
11. Méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution du melasma chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 , ou de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle.
12. Méthode selon la revendication 13, dans laquelle l'expression de la protéine est déterminée par un dosage de cette protéine par un immunoessai.
13. Méthode selon la revendication 14, dans laquelle l'immunoessai est un dosage ELISA.
14. Méthode selon la revendication 13, dans laquelle l'expression du gène est déterminée par mesure de la quantité d'ARNm correspondant.
15. Méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer une alopécie, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine
TRMP1, MMP2, MIA OU PTGS1 , de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle.
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