CA2656842A1 - Modulateurs de la udp-glucose ceramide glucosyltransferase dans le traitement de l'acne ou de l'hyperkeratinisation - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne une m‚thode in vitro de criblage de compos‚s candida ts pour le traitement pr‚ventif ou curatif de l'acn‚, comprenant la d‚termin ation de la capacit‚ d'un compos‚ … moduler l'expression ou l'activit‚ de la UDP-glucose c‚ramide glucosyltransf‚rase (UGCG), ainsi que l'utilisation de modulateurs de l'expression ou de l'activit‚ de cette enzyme pour le traite ment de l'acn‚ ou des d‚sordres cutan‚s associ‚s … une hyperk‚ratinisation. L'invention concerne aussi des m‚thodes de diagnostic ou pronostic in vitro de ces pathologies.
Description
Modulateurs de la UDP-glucose céramide glucosyltransférase dans le traitement de l'acné ou de l'hyperkératinisation L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs de la UDP-glucose céramide glucosyltransférase pour le traitement de l'acné, ainsi que des désordres cutanés associés à une hyperkératinisation. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro de ces pathologies.
L'acné est généralement due à l'implication de trois facteurs - une production excessive de sébum (l'hyperséborrhée), sous l'effet des hormones et de la puberté, - un épaississement de la peau (l'hyperkératinisation) dont les pores et plus particulièrement les glandes sébacées se bouchent entraînant la formation des points noirs et comédons, et - le développement des bactéries, provoquant une inflammation et l'apparition des boutons rouges ou blancs souvent douloureux.
La cornification des kératinocytes est un processus complexe qui implique la dégradation d'un grand nombre de composants intracellulaires. Ce processus constitue l'étape finale de la différentiation épidermique et est associé à la formation de bicouches lamellaires organisées enrichies en céramides, cholestérol et acides gras. La formation des céramides est un point clé menant à la formation d'un stratum corneum normal et permettant de réguler la fonction barrière de la peau et la desquamation (Holleran WM et al., J. Lipid Res., 1994, 35, 905-912). La réduction du taux de céramides du stratum corneum et de la fonction barrière est observée chez les patients acnéiques (Yamamoto A
et al., Arch. Dermatol. Res., 1995, 187, 214-218). II a été montré que l'application topique de rétinoïdes ou l'administration orale d'isotrétinoïne augmente le taux de céramides chez les patients acnéiques. L'augmentation de céramides est corrélée avec une diminution des comédons après traitement avec des rétinoïdes appliqués par voie topique (Melnic B
et al., Arch. Dermatol. Res., 1988, 280, 97-102 ; Thielnitz A, Br. J.
Dermatol., 2001, 1995, 95, 2903-2909). Les rétinoïdes sont généralement des composés fortement irritants et décapants, provoquant des rougeurs au niveau du visage peu esthétiques.
Il existe donc un besoin d'identifier de nouveaux composés actifs, dont le profil thérapeutique sera similaire, mais avec des effets secondaires réduits.
L'acné est généralement due à l'implication de trois facteurs - une production excessive de sébum (l'hyperséborrhée), sous l'effet des hormones et de la puberté, - un épaississement de la peau (l'hyperkératinisation) dont les pores et plus particulièrement les glandes sébacées se bouchent entraînant la formation des points noirs et comédons, et - le développement des bactéries, provoquant une inflammation et l'apparition des boutons rouges ou blancs souvent douloureux.
La cornification des kératinocytes est un processus complexe qui implique la dégradation d'un grand nombre de composants intracellulaires. Ce processus constitue l'étape finale de la différentiation épidermique et est associé à la formation de bicouches lamellaires organisées enrichies en céramides, cholestérol et acides gras. La formation des céramides est un point clé menant à la formation d'un stratum corneum normal et permettant de réguler la fonction barrière de la peau et la desquamation (Holleran WM et al., J. Lipid Res., 1994, 35, 905-912). La réduction du taux de céramides du stratum corneum et de la fonction barrière est observée chez les patients acnéiques (Yamamoto A
et al., Arch. Dermatol. Res., 1995, 187, 214-218). II a été montré que l'application topique de rétinoïdes ou l'administration orale d'isotrétinoïne augmente le taux de céramides chez les patients acnéiques. L'augmentation de céramides est corrélée avec une diminution des comédons après traitement avec des rétinoïdes appliqués par voie topique (Melnic B
et al., Arch. Dermatol. Res., 1988, 280, 97-102 ; Thielnitz A, Br. J.
Dermatol., 2001, 1995, 95, 2903-2909). Les rétinoïdes sont généralement des composés fortement irritants et décapants, provoquant des rougeurs au niveau du visage peu esthétiques.
Il existe donc un besoin d'identifier de nouveaux composés actifs, dont le profil thérapeutique sera similaire, mais avec des effets secondaires réduits.
2 La demanderesse a maintenant découvert que le gène codant pour la UDP-glucose céramide glucosyltransférase (UGCG) était exprimé dans l'épiderme et dans les glandes sébacées humaines, et que son expression était régulée par les androgènes, in vivo, dans un modèle de glande préputiale de souris. Elle propose dès lors de cibler le gène UGCG ou son produit d'expression, pour prévenir et/ou améliorer l'acné et/ou tout désordre cutané associé à une hyperkératinisation.
Par acné, on entend toutes les formes d'acné, à savoir notamment les acnés vulgaires, comédoniennes, polymorphes, les acnés nodulokystiques, conglobata, ou encore les acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou professionnelle.
La demanderesse propose également des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro, basées sur la détection de l'expression ou de l'activité de UGCG.
UGCG
L'enzyme UGCG désigne la UDP-glucose céramide glucosyltransférase. Cette enzyme est impliquée dans le processus de kératinisation. Ce processus constitue la dernière étape de la différenciation épidermique, et est associé à la formation d'une double couche lamellaire très organisée enrichie en céramides, cholestérols et en acides gras libres. Ces lipides sont dérivés du corps lamellaire épidermique, des organites sécrétoires contenant des phospholipides, des glucosylcéramides et aussi des enzymes hydrolytiques.
La UDP-glucose céramide glucosyltransférase est l'enzyme responsable de la formation de céramides à partir du pool cellulaire de glucosylcéramides. Il a été démontré
que la production de céramides est une étape critique permettant la formation de stratum corneum normal, et de ce fait régule la barrière perméable et la desquamation de la peau (Hollerman WM et aL, J Lipid Res 1994,35:905-912). Un défaut de UDP-glucose céramide glucosyltransférase provoque des anomalies de la peau décrites chez les patients atteints de la maladie de Gaucher. Récemment, un nouveau protocole thérapeutique a été proposé pour la gestion de la maladie de Gaucher. Cette approche a comme but de réduire la biosynthèse de glucosylcéramide en utilisant des inhibiteurs de la glucosylcéramide synthase. Un de ces inhibiteurs, le N-butyldeoxynojirimycin (Miglustat), a été récemment approuvé par la FDA pour le traitement de la maladie de Gaucher. L'effet du traitement avec le miglustat sur l'acné n'a pas été étudié
jusqu'à
présent.
En plus de leurs propriétés structurales, les glycosylcéramides et les céramides apparaissent comme régulateurs de la prolifération et de la différenciation cellulaire. Des études In vitro ont montré que des changements dans le niveau de glucosylcéramides
Par acné, on entend toutes les formes d'acné, à savoir notamment les acnés vulgaires, comédoniennes, polymorphes, les acnés nodulokystiques, conglobata, ou encore les acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou professionnelle.
La demanderesse propose également des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro, basées sur la détection de l'expression ou de l'activité de UGCG.
UGCG
L'enzyme UGCG désigne la UDP-glucose céramide glucosyltransférase. Cette enzyme est impliquée dans le processus de kératinisation. Ce processus constitue la dernière étape de la différenciation épidermique, et est associé à la formation d'une double couche lamellaire très organisée enrichie en céramides, cholestérols et en acides gras libres. Ces lipides sont dérivés du corps lamellaire épidermique, des organites sécrétoires contenant des phospholipides, des glucosylcéramides et aussi des enzymes hydrolytiques.
La UDP-glucose céramide glucosyltransférase est l'enzyme responsable de la formation de céramides à partir du pool cellulaire de glucosylcéramides. Il a été démontré
que la production de céramides est une étape critique permettant la formation de stratum corneum normal, et de ce fait régule la barrière perméable et la desquamation de la peau (Hollerman WM et aL, J Lipid Res 1994,35:905-912). Un défaut de UDP-glucose céramide glucosyltransférase provoque des anomalies de la peau décrites chez les patients atteints de la maladie de Gaucher. Récemment, un nouveau protocole thérapeutique a été proposé pour la gestion de la maladie de Gaucher. Cette approche a comme but de réduire la biosynthèse de glucosylcéramide en utilisant des inhibiteurs de la glucosylcéramide synthase. Un de ces inhibiteurs, le N-butyldeoxynojirimycin (Miglustat), a été récemment approuvé par la FDA pour le traitement de la maladie de Gaucher. L'effet du traitement avec le miglustat sur l'acné n'a pas été étudié
jusqu'à
présent.
En plus de leurs propriétés structurales, les glycosylcéramides et les céramides apparaissent comme régulateurs de la prolifération et de la différenciation cellulaire. Des études In vitro ont montré que des changements dans le niveau de glucosylcéramides
3 stimulaient la prolifération kératinocytaire (Uchida Y et al., J lnvest Dermatol, 1994, 102 :
594a ; Marsh NL et ai, J Clin lnvest, 1995, 95 :2903-2909).
Dans le contexte de l'invention, le terme gène UGCG ou acide nucléique UGCG
signifie le gène ou la séquence d'acide nucléique qui code pour la UDP-glucose céramide glucosyltransférase. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou son produit d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules exprimant une UDP-glucose céramide glucosyltransférase hétérologue, par intégration génomique ou expression transitoire d'un acide nucléique exogène codant pour l'enzyme.
Une séquence d'ADNc humain de UGCG est reproduite en annexe (SEQ ID No.1). Il s'agit de la séquence NM003358.1 dont la partie codante se situe de l'acide 291 à 1475.
Applications diagnostiques Un autre objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de lésions acnéiques ou d'un désordre cutané associé à une hyperkératinisation chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine UDP glucose céramide glucosyltransférase (UGCG), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle.
L'expression de la protéine UGCG peut être déterminée par un dosage de cette protéine par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène UGCG, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité de la protéine UGCG peut être également envisagé.
Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet contrôle est un sujet sain .
Dans le cadre d'un suivi de l'évolution des lésions acnéiques ou d'un désordre cutané lié
à une hyperkératinisation, le sujet contrôle fait référence au même sujet à un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette mesure de la différence d'expression ou de l'activité de la protéine UGCG, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, permet notamment de suivre l'efficacité
d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur de la UGCG, tel qu'envisagé
plus haut ou par un autre traitement contre l'acné ou un désordre cutané
associé à une hyperkératinisation. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce traitement.
594a ; Marsh NL et ai, J Clin lnvest, 1995, 95 :2903-2909).
Dans le contexte de l'invention, le terme gène UGCG ou acide nucléique UGCG
signifie le gène ou la séquence d'acide nucléique qui code pour la UDP-glucose céramide glucosyltransférase. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou son produit d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules exprimant une UDP-glucose céramide glucosyltransférase hétérologue, par intégration génomique ou expression transitoire d'un acide nucléique exogène codant pour l'enzyme.
Une séquence d'ADNc humain de UGCG est reproduite en annexe (SEQ ID No.1). Il s'agit de la séquence NM003358.1 dont la partie codante se situe de l'acide 291 à 1475.
Applications diagnostiques Un autre objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de lésions acnéiques ou d'un désordre cutané associé à une hyperkératinisation chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine UDP glucose céramide glucosyltransférase (UGCG), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle.
L'expression de la protéine UGCG peut être déterminée par un dosage de cette protéine par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène UGCG, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité de la protéine UGCG peut être également envisagé.
Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet contrôle est un sujet sain .
Dans le cadre d'un suivi de l'évolution des lésions acnéiques ou d'un désordre cutané lié
à une hyperkératinisation, le sujet contrôle fait référence au même sujet à un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette mesure de la différence d'expression ou de l'activité de la protéine UGCG, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, permet notamment de suivre l'efficacité
d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur de la UGCG, tel qu'envisagé
plus haut ou par un autre traitement contre l'acné ou un désordre cutané
associé à une hyperkératinisation. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce traitement.
4 Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer des lésions acnéiques ou un désordre cutané
associé à une hyperkératinisation, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine UGCG, de l'expression de son gène ou de l'activité
d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle.
Là encore, l'expression de la protéine UGCG peut être déterminée par un dosage de cette protéine par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène UGCG, est de mesurer la quantité
d'ARNm correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité de la UGCG peut être également envisagé.
Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble cutané lié à
une hyperkératinisation ou une acné. Le sujet contrôle , dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de référence saine . La détection de cette susceptibilité
permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes liés à l'acné ou à un désordre cutané associé à une hyperkératinisation.
Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon biologique testé peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie. De préférence l'échantillon peut être une préparation de cellules de la peau, obtenues par exemple par desquamation ou biopsie. Il peut également s'agir de sébum.
Méthodes de criblage Un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à
une hyperkératinisation, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à
moduler l'expression ou l'activité de l'UDP-glucose céramide glucosyltransférase ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperkératinisation. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de moduler l'expression ou l'activité de l'UDP-glucose céramide glucosyltransférase, ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperkératinisation, comprenant les étapes suivantes :
a) Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges
associé à une hyperkératinisation, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine UGCG, de l'expression de son gène ou de l'activité
d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle.
Là encore, l'expression de la protéine UGCG peut être déterminée par un dosage de cette protéine par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène UGCG, est de mesurer la quantité
d'ARNm correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité de la UGCG peut être également envisagé.
Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble cutané lié à
une hyperkératinisation ou une acné. Le sujet contrôle , dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de référence saine . La détection de cette susceptibilité
permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes liés à l'acné ou à un désordre cutané associé à une hyperkératinisation.
Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon biologique testé peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie. De préférence l'échantillon peut être une préparation de cellules de la peau, obtenues par exemple par desquamation ou biopsie. Il peut également s'agir de sébum.
Méthodes de criblage Un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à
une hyperkératinisation, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à
moduler l'expression ou l'activité de l'UDP-glucose céramide glucosyltransférase ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperkératinisation. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de moduler l'expression ou l'activité de l'UDP-glucose céramide glucosyltransférase, ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperkératinisation, comprenant les étapes suivantes :
a) Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges
5 réactionnels ;
b) Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ;
c) Mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine UDP-glucose céramide glucosyltransférase, de l'expression de son gène ou de l'activité
d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ;
d) Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la UDP-glucose céramide glucosyltransférase, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité
d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.
Par modulation , on entend tout effet sur l'expression ou l'activité de l'enzyme, à savoir éventuellement une stimulation, mais de préférence une inhibition, partielle ou complète.
Ainsi, les composés testés à l'étape d) ci-dessus inhibent de préférence l'expression ou l'activité de la protéine UGCG, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. La différence d'expression obtenue avec le composé testé par rapport à un contrôle réalisé en l'absence du composé est significative à partir de 25% ou plus.
Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par expression d'une protéine , on entend la quantité de cette protéine Par activité d'une protéine , on entend son activité biologique ;
Par activité d'un promoteur , on entend la capacité de ce promoteur à
déclencher la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la protéine correspondante).
Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou d'un mélange de composés.
b) Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ;
c) Mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine UDP-glucose céramide glucosyltransférase, de l'expression de son gène ou de l'activité
d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ;
d) Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la UDP-glucose céramide glucosyltransférase, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité
d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.
Par modulation , on entend tout effet sur l'expression ou l'activité de l'enzyme, à savoir éventuellement une stimulation, mais de préférence une inhibition, partielle ou complète.
Ainsi, les composés testés à l'étape d) ci-dessus inhibent de préférence l'expression ou l'activité de la protéine UGCG, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. La différence d'expression obtenue avec le composé testé par rapport à un contrôle réalisé en l'absence du composé est significative à partir de 25% ou plus.
Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par expression d'une protéine , on entend la quantité de cette protéine Par activité d'une protéine , on entend son activité biologique ;
Par activité d'un promoteur , on entend la capacité de ce promoteur à
déclencher la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la protéine correspondante).
Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou d'un mélange de composés.
6 Différentes techniques peuvent être mises en ceuvre pour tester ces composés et identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité de l'UDP-glucose céramide glucosyltransférase.
Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène UGCG, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer le niveau d'expression dudit gène rapporteur.
Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT
(chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP
(Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codée par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, ou de chimioluminescence, entre autres.
Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène UGCG codant pour l'UDP-glucose céramide glucosyltransférase, et l'étape c) ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène.
La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gène UGCG de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule ovarienne, ou encore mieux un kératinocyte ou un sébocyte. On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple la glande préputiale, clitoridienne, ou encore la glande sébacée de la peau.
II peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour une UDP-glucose céramide glucosyltransférase, de préférence humaine, ou de mammifère.
Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou microinjection.
Dans ces méthodes, l'expression du gène UGCG ou du gène rapporteur peut être déterminée en évaluant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction.
Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène UGCG, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer le niveau d'expression dudit gène rapporteur.
Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT
(chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP
(Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codée par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, ou de chimioluminescence, entre autres.
Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène UGCG codant pour l'UDP-glucose céramide glucosyltransférase, et l'étape c) ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène.
La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gène UGCG de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule ovarienne, ou encore mieux un kératinocyte ou un sébocyte. On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple la glande préputiale, clitoridienne, ou encore la glande sébacée de la peau.
II peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour une UDP-glucose céramide glucosyltransférase, de préférence humaine, ou de mammifère.
Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou microinjection.
Dans ces méthodes, l'expression du gène UGCG ou du gène rapporteur peut être déterminée en évaluant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction.
7 PCT/FR2007/051684 Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm produite.
Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine produite.
L'homme du métier est familier des techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RT-PCR, protection à la Rnase). Il peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques or autres ligands (par exemple, avidine/biotine).
En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué
(radioactif) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été cloné dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm recherché et la sonde antisens. Le milieu hybridé est alors incubé avec un mélange de ribonucléases spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéinisé
et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par autoradiographie.
Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal anti-UDP-glucose céramide glucosyltransférase peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de l'enzyme entière.
L'antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi connues de l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à
partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V
à la surface du phage (par exemple fUSE5 pour E.coli).
Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine produite.
L'homme du métier est familier des techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RT-PCR, protection à la Rnase). Il peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques or autres ligands (par exemple, avidine/biotine).
En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué
(radioactif) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été cloné dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm recherché et la sonde antisens. Le milieu hybridé est alors incubé avec un mélange de ribonucléases spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéinisé
et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par autoradiographie.
Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal anti-UDP-glucose céramide glucosyltransférase peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de l'enzyme entière.
L'antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi connues de l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à
partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V
à la surface du phage (par exemple fUSE5 pour E.coli).
8 Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à
titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques.
Des dosages ELISA, des radioimmunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés.
La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leurs propriétés physico-chimiques (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI), soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot).
Selon un troisième mode de réalisation, l'étape a) décrite ci-dessus consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun une enzyme UDP-glucose céramide glucosyltransférase et un substrat de l'enzyme, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à
mesurer l'activité enzymatique.
L'enzyme peut être produite selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Elle peut également être produite à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21.
La détermination de l'activité enzymatique comprend de préférence la détermination de l'activité
transférase, par extraction des lipides produits et analyse chromatographique.
Des dosages de l'activité enzymatique de la UGCG sont décrits dans la littérature (voir par exemple Futerman et al., 1991, Biochem J, 280, 295-302)
titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques.
Des dosages ELISA, des radioimmunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés.
La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leurs propriétés physico-chimiques (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI), soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot).
Selon un troisième mode de réalisation, l'étape a) décrite ci-dessus consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun une enzyme UDP-glucose céramide glucosyltransférase et un substrat de l'enzyme, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à
mesurer l'activité enzymatique.
L'enzyme peut être produite selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Elle peut également être produite à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21.
La détermination de l'activité enzymatique comprend de préférence la détermination de l'activité
transférase, par extraction des lipides produits et analyse chromatographique.
Des dosages de l'activité enzymatique de la UGCG sont décrits dans la littérature (voir par exemple Futerman et al., 1991, Biochem J, 280, 295-302)
9 Ainsi l'activité de l'UDP-glucose céramide glucosyltransférase peut être évaluée de la manière suivante : des fractions de foie sont incubées avec un complexe BSA(sérumalbumine bovine)-[14C]hexanoyl-céramide en présence de UDP-glucose , puis on analyse la quantité de [14C]héxanoyl glucose-céramides produits. Les lipides sont séparés par chromatographie sur couche mince (TLC) et récupérés de la plaque par frottement. La radioactivité est déterminée par mesure de la scintillation liée à l'incubation des lipides dans du scintillant. La mesure du bruit de fond est faite par incubation de [14C]hexanoyl -céramides dans une solution 25mM KCL/50mMTris pH 7.4 à 37 C en absence d'extrait de foie.
Modulateurs de l'enzyme L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur de l'enzyme humaine UDP-glucose céramide glucosyltransférase susceptible d'être obtenu par l'une des méthodes ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperkératinisation.
Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperkératinisation, méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur de l'enzyme humaine UDP-glucose céramide glucosyltransférase, à un patient nécessitant un tel traitement.
L'invention vise enfin l'utilisation cosmétique d'un modulateur de l'enzyme humaine UDP-glucose céramide glucosyltransférase, pour le traitement esthétique des problèmes de desquamation.
De manière préférentielle, le modulateur est un inhibiteur de l'enzyme. Le terme inhibiteur se réfère à un composé ou une substance chimique qui élimine ou réduit substantiellement l'activité enzymatique de la UDP-glucose céramide glucosyltransférase.
Le terme substantiellement signifie une réduction d'au moins 25%, de préférence d'au moins 35%, de préférence encore d'au moins 50%, et de manière plus préférée d'au moins 70% ou 90%. Plus particulièrement il peut s'agir d'un composé qui interagit avec, et bloque, le site catalytique de l'enzyme, comme des composés de type inhibiteur compétitif.
Un inhibiteur préféré interagit avec l'enzyme en solution à des concentrations en inhibiteur de moins de 1 M, de préférence moins de 0,1 M, de préférence encore moins de 0,01 M.
Le composé modulateur peut être un anticorps inhibiteur anti-UDP-glucose céramide glucosyltransférase, de préférence un anticorps monoclonal. De manière avantageuse, un tel anticorps inhibiteur est administré en une quantité suffisante pour obtenir une concentration plasmatique d'environ 0.01 g par ml à environ 100 g/ml, de préférence d'environ 1 g par ml à environ 5 g/ml.
Le composé modulateur peut également être un polypeptide, un polynucleotide antisens 5 d'ADN OU d'ARN, un si-ARN, ou un PNA ("Peptide nucleic acid", chaîne polypeptidique substituée par des bases puriques et pyrimidiques, dont la structure spatiale mime celle de l'ADN et permet l'hybridation à celui-ci).
Plusieurs inhibiteurs de la UDP-glucose céramide glucosyltransférase sont connus, et
Modulateurs de l'enzyme L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur de l'enzyme humaine UDP-glucose céramide glucosyltransférase susceptible d'être obtenu par l'une des méthodes ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperkératinisation.
Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperkératinisation, méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur de l'enzyme humaine UDP-glucose céramide glucosyltransférase, à un patient nécessitant un tel traitement.
L'invention vise enfin l'utilisation cosmétique d'un modulateur de l'enzyme humaine UDP-glucose céramide glucosyltransférase, pour le traitement esthétique des problèmes de desquamation.
De manière préférentielle, le modulateur est un inhibiteur de l'enzyme. Le terme inhibiteur se réfère à un composé ou une substance chimique qui élimine ou réduit substantiellement l'activité enzymatique de la UDP-glucose céramide glucosyltransférase.
Le terme substantiellement signifie une réduction d'au moins 25%, de préférence d'au moins 35%, de préférence encore d'au moins 50%, et de manière plus préférée d'au moins 70% ou 90%. Plus particulièrement il peut s'agir d'un composé qui interagit avec, et bloque, le site catalytique de l'enzyme, comme des composés de type inhibiteur compétitif.
Un inhibiteur préféré interagit avec l'enzyme en solution à des concentrations en inhibiteur de moins de 1 M, de préférence moins de 0,1 M, de préférence encore moins de 0,01 M.
Le composé modulateur peut être un anticorps inhibiteur anti-UDP-glucose céramide glucosyltransférase, de préférence un anticorps monoclonal. De manière avantageuse, un tel anticorps inhibiteur est administré en une quantité suffisante pour obtenir une concentration plasmatique d'environ 0.01 g par ml à environ 100 g/ml, de préférence d'environ 1 g par ml à environ 5 g/ml.
Le composé modulateur peut également être un polypeptide, un polynucleotide antisens 5 d'ADN OU d'ARN, un si-ARN, ou un PNA ("Peptide nucleic acid", chaîne polypeptidique substituée par des bases puriques et pyrimidiques, dont la structure spatiale mime celle de l'ADN et permet l'hybridation à celui-ci).
Plusieurs inhibiteurs de la UDP-glucose céramide glucosyltransférase sont connus, et
10 proposés notamment pour le traitement de la maladie de Gaucher. L'invention comprend l'utilisation de tels composés inhibiteurs de la UDP-glucose céramide glucosyltransférase pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à
une hyperkératinisation.
Plus particulièrement, à titre non limitatif, on peut citer comme exemples d'inhibiteurs de la UDP-glucose céramide glucosyltransférase, les composés suivants N-butyldeoxynojirimycine (Miglustat) D-threo-1-(3',4'-ethylenedioxy) phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1 -propanol 1-Threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol (PDMP) D-threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol (D-PDMP), D-threo-1-phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1-propanol (P4), D-threo-1-phenyl-2-benzyloxycarbonylamino-3-pyrrolidino-1-propanol (PBPP) D-threo-4'-hydroxy- D-threo-1 -phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1 -propanol (D-threo-4'-hydroxy-P4) D-threo-1-(3',4'-methylenedioxy) phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1 -propanol D-threo-1-(3',4'-ethylenedioxy) phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1 -propanol D-threo-1 - (3',4'-trimethylenedioxy) phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1 -propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-hexanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-heptanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-octanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-nonanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-undecanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-dodecanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-tridecanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-tetradecanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-pentadecanoylamino-3-morpholino-1 -propanol
une hyperkératinisation.
Plus particulièrement, à titre non limitatif, on peut citer comme exemples d'inhibiteurs de la UDP-glucose céramide glucosyltransférase, les composés suivants N-butyldeoxynojirimycine (Miglustat) D-threo-1-(3',4'-ethylenedioxy) phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1 -propanol 1-Threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol (PDMP) D-threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol (D-PDMP), D-threo-1-phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1-propanol (P4), D-threo-1-phenyl-2-benzyloxycarbonylamino-3-pyrrolidino-1-propanol (PBPP) D-threo-4'-hydroxy- D-threo-1 -phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1 -propanol (D-threo-4'-hydroxy-P4) D-threo-1-(3',4'-methylenedioxy) phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1 -propanol D-threo-1-(3',4'-ethylenedioxy) phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1 -propanol D-threo-1 - (3',4'-trimethylenedioxy) phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1 -propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-hexanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-heptanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-octanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-nonanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-undecanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-dodecanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-tridecanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-tetradecanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-pentadecanoylamino-3-morpholino-1 -propanol
11 1-Threo-1-phenyl-2-hexadecanoylamino-3-morpholino-1-propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-heptadecanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 1 -Threo-1 -phenyl-2-octadecanoylamino-3-morpholino-1 -propanol D'autres composés modulateurs identifiés par la méthode de criblage décrite plus haut sont également utiles.
Les composés modulateurs sont formulés au sein de composition pharmaceutique, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent être administrées par exemple par voie orale, entérale, parentérale, ou topique. De préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection.
Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau et des muqueuses et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée.
Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion.
La composition peut comprendre une teneur en modulateur de l'UGCG allant de 0,001 à
10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition.
La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que - des agents mouillants;
- des agents d'amélioration de la saveur;
- des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque;
Les composés modulateurs sont formulés au sein de composition pharmaceutique, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent être administrées par exemple par voie orale, entérale, parentérale, ou topique. De préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection.
Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau et des muqueuses et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée.
Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion.
La composition peut comprendre une teneur en modulateur de l'UGCG allant de 0,001 à
10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition.
La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que - des agents mouillants;
- des agents d'amélioration de la saveur;
- des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque;
12 - des agents stabilisants;
- des agents régulateurs d'humidité;
- des agents régulateurs de pH;
- des agents modificateurs de pression osmotique;
- des agents émulsionnants;
- des filtres UV-A et UV-B
- et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, l'Ubiquinol ou certains chelatants de métaux.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
Légende des figures :
Les Figures 1A et 1 B sont des graphes qui montrent la mesure de l'expression du gène UGCG chez des souris mâles gonadectomisées et traitées avec le véhicule, le DHT, le DHEA ou la combinaison de DHEA-Flutamide pendant une période de 7 jours une fois par jour (traitement long terme). Les résultats obtenus par la technique Affymetrix (Figure 1A) ont été confirmés par la technique de RT-PCR en temps réel (Figure 1 B).
GDX: souris gonadectomisées et traitées avec le véhicule DHT: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydrotestosterone (agoniste du récepteur aux androgènes) DHEA: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydroepiandrosterone (précurseur des hormones stéroïdiennes; dans les glandes préputiales métabolisé en androgène actif) DHEA-Flu: souris gonadectomisées et traitées avec une combinaison de Dihydroepiandrosterone et Flutamide (antagoniste du récepteur aux Androgènes;
qui bloque les effets des agonistes DHT et DHEA).
Niveau d'expression : niveau d'expression de l'ARNm La figure 2 est un graphe rapportant une étude cinétique de 15 minutes à 96 heures.
Dans la Figure 2, les points 124a et 124b montrent le niveau d'expression d'UGCG de souris contrôles (= souris non gonadectomisées; duplicat) au point 24 heures.
Les points suivants proviennent de souris gonadectomisées et indiquent les temps successifs (en heures) de l'étude cinétique.
Niveau d'expression : niveau d'expression de l'ARNm Carré: expression dans les souris gonadectomisées suite au traitement avec le DHT à
temps zéro.
- des agents régulateurs d'humidité;
- des agents régulateurs de pH;
- des agents modificateurs de pression osmotique;
- des agents émulsionnants;
- des filtres UV-A et UV-B
- et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, l'Ubiquinol ou certains chelatants de métaux.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
Légende des figures :
Les Figures 1A et 1 B sont des graphes qui montrent la mesure de l'expression du gène UGCG chez des souris mâles gonadectomisées et traitées avec le véhicule, le DHT, le DHEA ou la combinaison de DHEA-Flutamide pendant une période de 7 jours une fois par jour (traitement long terme). Les résultats obtenus par la technique Affymetrix (Figure 1A) ont été confirmés par la technique de RT-PCR en temps réel (Figure 1 B).
GDX: souris gonadectomisées et traitées avec le véhicule DHT: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydrotestosterone (agoniste du récepteur aux androgènes) DHEA: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydroepiandrosterone (précurseur des hormones stéroïdiennes; dans les glandes préputiales métabolisé en androgène actif) DHEA-Flu: souris gonadectomisées et traitées avec une combinaison de Dihydroepiandrosterone et Flutamide (antagoniste du récepteur aux Androgènes;
qui bloque les effets des agonistes DHT et DHEA).
Niveau d'expression : niveau d'expression de l'ARNm La figure 2 est un graphe rapportant une étude cinétique de 15 minutes à 96 heures.
Dans la Figure 2, les points 124a et 124b montrent le niveau d'expression d'UGCG de souris contrôles (= souris non gonadectomisées; duplicat) au point 24 heures.
Les points suivants proviennent de souris gonadectomisées et indiquent les temps successifs (en heures) de l'étude cinétique.
Niveau d'expression : niveau d'expression de l'ARNm Carré: expression dans les souris gonadectomisées suite au traitement avec le DHT à
temps zéro.
13 Losange: expression dans les souris gonadectomisées sans traitement DHT.
Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES
Exemple 1 : Expression de l'UDP-glucose céramide glucosyltransférase (UGCG) dans la glande sébacée humaine et dans l'épiderme humain.
Des glandes sébacées humaines ont été séparées de l'épiderme humain par traitement à
la dispase et dissection sous une loupe binoculaire. Des échantillons d'ARN
totaux ont été
préparés à partir des glandes sébacées et à partir de l'épiderme.
L'expression des gènes a été analysée sur une station d'Affymetrix (module microfluidic;
four à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les protocoles fournis par la société. En bref, l'ARN total isolé des tissus est transcrit en ADNc. A partir de l'ADNc double brin, on synthétise un ARNc marqué à la biotine en utilisant la polymérase T7 et un NTP
précurseur conjugué à la biotine. Les ARNc sont ensuite fragmentés en fragments de petites tailles. Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en utilisant le système lab on a chip d'Agilent pour confirmer les bonnes efficacités des réactions enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec l'ARNc biotinylé, rincée et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un fluorophore conjugué à la Streptavidine. Après des lavages, la puce est scannée et les résultats sont calculés en utilisant le logiciel MAS5 fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi que l'indication de la significativité de la valeur obtenue. Le calcul de la significativité de l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à
l'hybridation de l'ARNc d'un gène donné avec un oligonucléotide hybridant parfaitement ( perfect match ) versus un oligonucléotide qui contient une mutation ( single mismatch ) dans la région centrale de l'oligonucléotide (voir tableau 1).
Tableau 1 : mesure de l'expression de la UDP-glucose céramide glycosyltransférase dans l'épiderme et dans la glande sébacée humaine via l'utilisation de la technologie des puces Affymetrix.
Identifiant Nom du Expression Expression Significativité Significativité
Affymetrix gène dans la dans de de glande l'épiderme l'expression* l'expression*
sébacée humain dans la dans humaine glande épiderme
Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES
Exemple 1 : Expression de l'UDP-glucose céramide glucosyltransférase (UGCG) dans la glande sébacée humaine et dans l'épiderme humain.
Des glandes sébacées humaines ont été séparées de l'épiderme humain par traitement à
la dispase et dissection sous une loupe binoculaire. Des échantillons d'ARN
totaux ont été
préparés à partir des glandes sébacées et à partir de l'épiderme.
L'expression des gènes a été analysée sur une station d'Affymetrix (module microfluidic;
four à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les protocoles fournis par la société. En bref, l'ARN total isolé des tissus est transcrit en ADNc. A partir de l'ADNc double brin, on synthétise un ARNc marqué à la biotine en utilisant la polymérase T7 et un NTP
précurseur conjugué à la biotine. Les ARNc sont ensuite fragmentés en fragments de petites tailles. Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en utilisant le système lab on a chip d'Agilent pour confirmer les bonnes efficacités des réactions enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec l'ARNc biotinylé, rincée et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un fluorophore conjugué à la Streptavidine. Après des lavages, la puce est scannée et les résultats sont calculés en utilisant le logiciel MAS5 fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi que l'indication de la significativité de la valeur obtenue. Le calcul de la significativité de l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à
l'hybridation de l'ARNc d'un gène donné avec un oligonucléotide hybridant parfaitement ( perfect match ) versus un oligonucléotide qui contient une mutation ( single mismatch ) dans la région centrale de l'oligonucléotide (voir tableau 1).
Tableau 1 : mesure de l'expression de la UDP-glucose céramide glycosyltransférase dans l'épiderme et dans la glande sébacée humaine via l'utilisation de la technologie des puces Affymetrix.
Identifiant Nom du Expression Expression Significativité Significativité
Affymetrix gène dans la dans de de glande l'épiderme l'expression* l'expression*
sébacée humain dans la dans humaine glande épiderme
14 sébacée humain humaine 204881 s at UDP- 299 695 1 1 glucose céramide glycosyltra nsférase *Indicateur de la significativité de l'expression du gène analysé dans l'échantillon indiqué
présence (=1) ou absence (=0).
Résultats:
La UGCG est bien exprimée dans les deux tissus (glande sébacée, épiderme).
L'analyse différentielle entre l'expression dans la glande sébacée humaine et l'épiderme humain montre que l'expression est significativement plus forte dans l'épiderme (tableau 1).
Exemple 2: Expression de la UDP-glucose céramide alycosyltransférase dans la glande préputiale de souris A. Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type sébocytaire et sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée. Elles ont une taille suffisante pour permettre l'isolement d'ARN sans avoir recours à des technologies de microdissection.
L'analyse de l'expression de la UGCG dans les glandes préputiales de souris a été
réalisée dans des conditions de déficiences en hormones stéroïdiennes (notamment en hormones androgéniques) suite à une gonadectomie. Les animaux gonadectomisés ont ensuite été traités avec des quantités physiologiques de Dihydrotestosterone (DHT) ou de Dihydroepiandrosterone (DHEA) pour restituer un niveau physiologique des hormones androgéniques, ou bien comme expérience de contrôle avec une combinaison de DHEA-Flutamide dans laquelle le Flutamide, un antagoniste du récepteur aux Androgènes bloque l'effet de la DHEA. La comparaison de l'expression génique dans ces conditions expérimentales permet d'identifier de façon non ambiguë la modulation ou non de l'expression génique d'un gène en question par les hormones androgéniques.
L'expression génique a été analysée en utilisant la technologie Affymetrix décrite ci-dessus (Figure 1A) et les résultats ont ensuite été confirmés par la technique de PCR en temps réel (Figure 1 B).
La PCR en temps réel a été menée en suivant les protocoles fournis par la société
5 Applied Biosystems en utilisant le 7900HT Sequence Detection System .
L'ARN total isolé des tissus est transcrit (RT) en ADNc et celui-ci est amplifié par PCR
(Réaction en Chaine par Polymérase). La progression de la PCR est suivie en temps réel en utilisant des sondes TaqMan fluorescentes, permettant une quantification précise de la quantité
d'ARNm d'un gène donné, présent dans l'échantillon biologique au départ.
Résultat: La quantité d'ARNm de l'UGCG est diminuée suite à un traitement chronique pendant 7 jours aux androgènes dans la glande préputiale.
B. Des souris males ont été gonadectomisées et traitées avec le véhicule, ou le DHT. Les glandes preputiales ont été prélevées pendant une période allant jusqu'à 4 jours (traitement androgénique unique - observation d'une cinétique de court terme).
L'ARN a été isolé et l'expression des gènes a été analysée par la technique Affymetrix. La Figure 2 représente le niveau d'expression relative de l'ARNm en fonction du temps.
Résultats:
La gonadectomie (qui provoque une déficience d'hormones stéroïdiennes) induit une légère induction de l'expression de l'UGCG dans la glande préputiale de la souris.
L'ARNm de l'UGCG dans la glande préputiale de la souris est diminué par un traitement moyen terme avec le DHT (effet visible à 96 heures).
Exemple 3 : Formulations A- VOIE ORALE
Comprimé de 0,2 g - D-threo-1 -phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1 -propanol 0,001 g - Amidon 0,114 g - Phosphate bicalcique 0,020 g - Silice 0,020 g - Lactose 0,030 g - Talc 0,010 g - Stéarate de magnésium 0,005 g B- VOIE TOPIQUE
(a) Onguent -1 -Threo-1 -phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 0,300 g - Vaseline blanche codex qsp 100 g (b) Lotion - N-butyldeoxynojirimycine 0,100 g - Polyéthylène glycol (PEG 400) 69,900 g - Ethanol à 95% 30,000 g
présence (=1) ou absence (=0).
Résultats:
La UGCG est bien exprimée dans les deux tissus (glande sébacée, épiderme).
L'analyse différentielle entre l'expression dans la glande sébacée humaine et l'épiderme humain montre que l'expression est significativement plus forte dans l'épiderme (tableau 1).
Exemple 2: Expression de la UDP-glucose céramide alycosyltransférase dans la glande préputiale de souris A. Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type sébocytaire et sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée. Elles ont une taille suffisante pour permettre l'isolement d'ARN sans avoir recours à des technologies de microdissection.
L'analyse de l'expression de la UGCG dans les glandes préputiales de souris a été
réalisée dans des conditions de déficiences en hormones stéroïdiennes (notamment en hormones androgéniques) suite à une gonadectomie. Les animaux gonadectomisés ont ensuite été traités avec des quantités physiologiques de Dihydrotestosterone (DHT) ou de Dihydroepiandrosterone (DHEA) pour restituer un niveau physiologique des hormones androgéniques, ou bien comme expérience de contrôle avec une combinaison de DHEA-Flutamide dans laquelle le Flutamide, un antagoniste du récepteur aux Androgènes bloque l'effet de la DHEA. La comparaison de l'expression génique dans ces conditions expérimentales permet d'identifier de façon non ambiguë la modulation ou non de l'expression génique d'un gène en question par les hormones androgéniques.
L'expression génique a été analysée en utilisant la technologie Affymetrix décrite ci-dessus (Figure 1A) et les résultats ont ensuite été confirmés par la technique de PCR en temps réel (Figure 1 B).
La PCR en temps réel a été menée en suivant les protocoles fournis par la société
5 Applied Biosystems en utilisant le 7900HT Sequence Detection System .
L'ARN total isolé des tissus est transcrit (RT) en ADNc et celui-ci est amplifié par PCR
(Réaction en Chaine par Polymérase). La progression de la PCR est suivie en temps réel en utilisant des sondes TaqMan fluorescentes, permettant une quantification précise de la quantité
d'ARNm d'un gène donné, présent dans l'échantillon biologique au départ.
Résultat: La quantité d'ARNm de l'UGCG est diminuée suite à un traitement chronique pendant 7 jours aux androgènes dans la glande préputiale.
B. Des souris males ont été gonadectomisées et traitées avec le véhicule, ou le DHT. Les glandes preputiales ont été prélevées pendant une période allant jusqu'à 4 jours (traitement androgénique unique - observation d'une cinétique de court terme).
L'ARN a été isolé et l'expression des gènes a été analysée par la technique Affymetrix. La Figure 2 représente le niveau d'expression relative de l'ARNm en fonction du temps.
Résultats:
La gonadectomie (qui provoque une déficience d'hormones stéroïdiennes) induit une légère induction de l'expression de l'UGCG dans la glande préputiale de la souris.
L'ARNm de l'UGCG dans la glande préputiale de la souris est diminué par un traitement moyen terme avec le DHT (effet visible à 96 heures).
Exemple 3 : Formulations A- VOIE ORALE
Comprimé de 0,2 g - D-threo-1 -phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1 -propanol 0,001 g - Amidon 0,114 g - Phosphate bicalcique 0,020 g - Silice 0,020 g - Lactose 0,030 g - Talc 0,010 g - Stéarate de magnésium 0,005 g B- VOIE TOPIQUE
(a) Onguent -1 -Threo-1 -phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 0,300 g - Vaseline blanche codex qsp 100 g (b) Lotion - N-butyldeoxynojirimycine 0,100 g - Polyéthylène glycol (PEG 400) 69,900 g - Ethanol à 95% 30,000 g
Claims (10)
1. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperkératinisation, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à
moduler l'expression ou l'activité de l'UDP-glucose céramide glucosyltransférase ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
moduler l'expression ou l'activité de l'UDP-glucose céramide glucosyltransférase ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperkératinisation selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes :
a) Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ;
b) Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ;
c) Mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine UDP-glucose céramide glucosyltransférase, de l'expression de son gène ou de l'activité
d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ;
d) Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la UDP-glucose céramide glucosyltransférase, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité
d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.
a) Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ;
b) Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ;
c) Mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine UDP-glucose céramide glucosyltransférase, de l'expression de son gène ou de l'activité
d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ;
d) Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la UDP-glucose céramide glucosyltransférase, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité
d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.
3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) inhibent l'expression ou l'activité de la protéine UDP-glucose céramide glucosyltransférase, l'expression de son gène ou l'activité
d'au moins un de ses promoteurs.
d'au moins un de ses promoteurs.
4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant pour la protéine UDP-glucose céramide glucosyltransférase, et en ce que l'étape c) consiste à
mesurer l'expression dudit gène rapporteur.
mesurer l'expression dudit gène rapporteur.
5. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour la protéine UDP-glucose céramide glucosyltransférase, et en ce que l'étape c) consiste à
mesurer l'expression dudit gène.
mesurer l'expression dudit gène.
6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des kératinocytes ou des sébocytes.
7. Méthode selon la revendication 5, dans laquelle les cellules sont des cellules transformées par un acide nucléique hétérologue codant pour la UDP-glucose céramide glucosyltransférase.
8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène.
9. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène.
10. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que l'étape a) consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun une enzyme UDP-glucose céramide glucosyltransférase et un substrat de l'enzyme, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'activité enzymatique.
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| FR0653030 | 2006-07-19 | ||
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| FR (1) | FR2904001A1 (fr) |
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| WO2013079580A1 (fr) * | 2011-11-29 | 2013-06-06 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Procédés et compositions pharmaceutiques pour le traitement de la maladie de darier |
| WO2019236722A1 (fr) * | 2018-06-05 | 2019-12-12 | Chatterjee Subroto B | Inhibiteurs de synthèse de glycosphingolipides et méthodes d'utilisation |
| CN112912503A (zh) * | 2018-10-25 | 2021-06-04 | 学校法人麻布兽医学园 | 葡萄糖神经酰胺合成酶基因缺失t细胞的用途和其治疗应用 |
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| US20050259483A1 (en) * | 2002-09-30 | 2005-11-24 | Oncotherapy Science, Inc. | Genes and polypeptides relating to prostate cancers |
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2006
- 2006-07-19 FR FR0653030A patent/FR2904001A1/fr active Pending
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- 2007-07-18 CA CA002656842A patent/CA2656842A1/fr not_active Abandoned
- 2007-07-18 WO PCT/FR2007/051684 patent/WO2008009857A2/fr active Application Filing
- 2007-07-18 EP EP07823603A patent/EP2046978A2/fr not_active Withdrawn
-
2009
- 2009-01-21 US US12/320,168 patent/US20100028878A1/en not_active Abandoned
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|---|---|
| EP2046978A2 (fr) | 2009-04-15 |
| WO2008009857A3 (fr) | 2008-04-24 |
| US20100028878A1 (en) | 2010-02-04 |
| WO2008009857A2 (fr) | 2008-01-24 |
| FR2904001A1 (fr) | 2008-01-25 |
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| Date | Code | Title | Description |
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