WO2011154579A1 - Método de diagnóstico in vitro de pacientes con linfoma esplénico de la zona marginal - Google Patents

Método de diagnóstico in vitro de pacientes con linfoma esplénico de la zona marginal Download PDF

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WO2011154579A1
WO2011154579A1 PCT/ES2011/070406 ES2011070406W WO2011154579A1 WO 2011154579 A1 WO2011154579 A1 WO 2011154579A1 ES 2011070406 W ES2011070406 W ES 2011070406W WO 2011154579 A1 WO2011154579 A1 WO 2011154579A1
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Juan Luis GARCÍA HERNÁNDEZ
Cristina Robledo Montero
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention falls within the scope of biomedicine and in the pharmaceutical field, more specifically, it refers to an in vitro diagnostic method, for the diagnosis of patients suffering from neoplastic disease: splenic marginal zone lymphoma (LEZM) .
  • LEZM splenic marginal zone lymphoma
  • the present invention also refers to an in vitro diagnostic kit of patients with LEZM.
  • Splenic Marginal Zone Lymphoma is a tumor disease that can affect any organ, although the most common are the spleen and lymph nodes. It has been considered as a distinct clinical-pathological entity for years (Schmid C et al. Am J Surg Pathol 1992, 16: 455-466). More recently, the classification of hematological diseases of the World Health Organization (WHO) has designated LEZM as a different subtype of non-Hodgkin lymphomas (Harris NL, et al.
  • NHL Histopathology 2000, 36: 69-86
  • MALT mucous-associated lymphomas
  • LZMN lymphomas of the nodal marginal zone
  • lymphomas In the diagnosis of lymphomas, it is important to classify each one within the subtype to which it belongs in order to give the patient the appropriate treatment, since each type of lymphoma has a different treatment.
  • chemotherapy should not be applied in the first instance, the most appropriate treatment being the removal of the affected organ, usually the spleen, so it is very important to diagnose it correctly.
  • the diagnosis of NHL and the differentiation between each of them is based on morphological, immunohistochemical and molecular characteristics, being genetic alterations in general, and specific translocations in particular, one of the characteristics that is most helping to distinguish lymphomas. of others. Most NHLs are characterized by the presence of specific translocations, which They serve for diagnosis.
  • LEZMs lack a known molecular marker because, unlike other lymphomas, a translocation that is characteristic of them has not been identified, making diagnosis difficult.
  • cytogenetic analyzes show that in this type of tumors losses can be detected in which chromosomes 1, 3, 7 and 8 are involved (Dierlamm J, et al., Blood 1996, 87: 299-307; Solé F, et al., Br J Haematol 1997; 98: 446-449), there are few studies that demonstrate the existence of an alteration that was specific and characteristic of LEZM and that allowed the identification of a high proportion of those patients who suffer from it.
  • CGH comparative genomic hybridization
  • region 7q31-q36 in particular seems to be closely related to LEZM and deletions are often found in patients suffering from this disease.
  • This region comprises a very wide area of the genome, in which no candidate genes have been found that serve to diagnose the disease (Algara P, et al., Blood 2002, 99: 1299-1304; Leisure EM, et al. , Clinical Lymphoma 2005, 4: 241-245).
  • the CGH technique has a capacity to limited resolution: on the one hand, the changes that involve deletions of segments smaller than 7 Mb are not detectable (Bentz M, et al., Genes Chromosomes Cancer 1998; 21: 172-175) and on the other hand, the determination of points Exact chromosome between which the amplification is inserted or which suppose the limits of the deletion is difficult, since the minimum deleted region is too large to be analyzed with an in situ hybridization probe (Hernández JM, et al., Am J Pathol. 2001 May; 158: 1843-50).
  • FISH fluorescent in situ hybridization techniques
  • the large deleted regions found through these techniques have shown problems when defining them, since the probes used were large, not showing sufficient safety or specificity for use in the diagnosis of the disease.
  • CGH-arrays are a method to identify alterations in the genome, without being able to detect reciprocal translocations. It is a technique that combines the technology of micro-arrays with the technology of the CGH, in which hybridization is performed by replacing the metaphases of the chromosomes with mapped DNA segments, whose set represents all chromosomes or chromosome arms , divided into fragments cloned into artificial yeast chromosomes (YAC), artificial bacterial chromosomes (BAC), chromosomes based on the genome of bacteriophage P1 (PAC), cosmids or other cloning vectors.
  • YAC yeast chromosome
  • BAC artificial bacterial chromosomes
  • PAC bacteriophage P1
  • the Spanish patent ES2284408 discloses the use of a specific BAC / PAC-array of 3500 clones with a resolution of 1 Mb.
  • the results shown in said patent show that patients with LEZM have a deletion in the 7q22.1 region - q22.2, defined by the probe carrying the sequence corresponding to the fragment of human chromosome 7 contained in the BAC / PAC-array, called RP11-44M6.
  • This patent also discloses the optional use, in the same trial, of other different probes that recognize another region also deleted on chromosome 7, the 7q32-q33 region, thus increasing the percentage of patients with LEZM that can be diagnosed in The same test.
  • an in vitro diagnostic method of LEZM is described based on the identification of a specific deletion, located more specifically between bases 99925039-101754718, preferably between bases 99925039-101348479, of region 7q22.1 of the human chromosome 7. More preferably, the deleted regions in the 7q22.1 region are the regions between bases 100260234-100596921 and 101244026-101754718.
  • the deletion detected by the method of the invention has an approximate size of 1.4 Mb.
  • the two deleted regions, 100260234-100596921 and 101244026-101754718 have, between both, an approximate size of 0.84 Mb.
  • EPHB4 In the region whose deletion detects the method of the invention, the following genes are located: EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56, SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, MUC17, CUX1 and SH2B2 (See Table 1).
  • the present invention evidences the presence of genes that can function as proto-oncogenes repressors, tumor suppressors, growth regulators, and that are found in the deleted region in patients with LEZM.
  • the present invention describes the association between LEZMs and the presence of deletions in a very specific and defined region of the human chromosome 7.
  • the present invention relates to an in vitro diagnostic method of patients with LEZM based on the analysis of the expression of a series of genes located in a deleted region of said human chromosome 7.
  • the region deleted in LEZM patients has been defined by the use of high affinity CGH-arrays and LOH, and is located at 7q22.1 between bases 99925039-101754718, preferably between bases 99925039-101348479. More preferably, the deleted regions in the 7q22.1 region are the regions between bases 100260234-100596921 and 101244026-101754718.
  • EPHB4 EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56, SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, MUC17, CUX1 and SH2B2 (Table 1) can be used as candidate genes for the diagnosis of the disease.
  • the The present invention shows that patients with LEZM show a differential expression of at least one of the genes selected from: EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56, SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4, HRBL, LRCH4 , MUC3, MUC12, MUC17, CUX1 and SH2B2 regarding healthy controls or patients presenting with other types of lymphoma, analyzing samples from tumor tissues, bone marrow aspirate or blood.
  • the approximate size of the deleted region is 1 .4 Mb.
  • the two deleted regions, 100260234-100596921 and 101244026-101754718, have between them, an approximate size of 0.84 Mb.
  • TRIP6 100302885 100309012 BC004249, BC004999,
  • the term high-affinity CGH-array is defined as a method of molecular cytogenetics for the detection of chromosomal gains and losses that combines the technology of CGH with the technology of micro-arrays.
  • the high affinity genomic array is preferably a solid support to which clones and / or known DNA sequences have been adhered to in an ordered manner, in the form of a matrix of thousands of equally spaced points.
  • the affinity or resolution of genomic arrays is determined by the genomic distance between two consecutive clones. This technique is based on co-hybridization on the array of two DNAs, tumor and reference, labeled with different fluorochromes.
  • the high affinity CGH-arrays used in the present invention have been: BAC / PAC-array, which contains 3,523 clones from BACs and PACs that cover the entire genome with a resolution of 1 Mb. To corroborate the results obtained through said platform FISH trials have been used. Subsequently, to further ensure these results, another 2 commercial genomic array platforms were used: CGK-Agilent 44K array and NimbleGen 72K CGH-array. These techniques confirmed that patients with LEZM had a deletion in the 7q22.1 region of human chromosome 7.
  • the high resolution commercial array, NimbleGen Tiling-array, specific to chromosome 7 was used.
  • This array uses approximately 385,110 oligonucleotides or targets that they cover the entire chromosome 7 and leave an average distance between each oligonucleotide of approximately 355 bp.
  • another high affinity array was used, specific to the regions between the 7q22.1 to 7q33 cytogenetic bands, both inclusive (Chromosome 7: 99158137-137302483).
  • Said array includes 710953 probes with an average probe size of 54 oligonucleotides and an average distance between each oligonucleotide of -0.7 bp, allowing said array to map said region with very high precision.
  • LEZM diagnostic kits that comprise at least one probe that recognizes the deleted region in 7q22.1 or that hybridizes with at least one of the nucleotide sequences of the aforementioned genes, said probes being coupled. to a compound, preferably a fluorophore, which allows its detection.
  • the 7q22.1 deleted region is delimited with great precision, allowing a better differential diagnosis of patients with LEZM compared to patients with other chronic lymphoproliferative syndromes or lymphomas Non-Hodgkinians, since this specific deletion in the 7q region is very characteristic of LEZM and not the rest of chronic lymphoproliferative syndromes or non-Hodgkin lymphomas.
  • FIG. 1 Common genomic regions of losses or gains on chromosome 7 of 57 patients with LEZM.
  • the figure shows the genomic regions that show gains (G) expressed as a percentage or losses (L) expressed as a percentage, on chromosome 7 of patients with LEZM. For each region, the cytogenetic location and the percentage of gains (% G) or losses (% L) are shown.
  • FIG. 1 Genomic regions involved in LEZM patients who showed or not alterations in chromosome 7q. The figure shows the gains (G) expressed as a percentage, and the losses (L) expressed as a percentage, of patients with losses on chromosome 7q (black bars) and of patients who did not show losses on chromosome 7q (white bars) ).
  • Figure 3. Analysis of chromosome 7 using the high affinity array "tiling array" specific to chromosome 7 of NimbleGen (385K) in patients with LEZM. The figure shows the deletion of the 7q22.1 region in three of the four cases analyzed, shown as thick black lines.
  • C Controls
  • LEZM 1, LEZM 2 and LEZM 3 patients with LEZM.
  • Figure 4 Analysis of the commonly deleted area of chromosome 7, 7q22.1 in three LEZM patients, using the different CGH-arrays used in the invention.
  • FIG. 1 The figure shows the three clones that cover the 7q22.1 region of chromosome 7 analyzed by the BAC / PAC CGH-array.
  • the three patients with LEZM (LEZM 1, LEZM 2 and LEZM 3) show a loss (in black) in the 7q22.1 region and in the control (C) no change is observed.
  • the 7q22.1 region in this array is mapped by three clones with a resolution of 1 Mb.
  • B The figure shows the 53 oligonucleotides present in the 7q22.1 region that contains the NimbleGen 72K CGH-array.
  • FIG. 1 Representation of the heterozygosity loss (LOH) patterns obtained by analyzing microsatellite markers in LEZM patients.
  • LEZM heterozygosity loss
  • FIG. 6 Analysis of LOH within chromosome 7q, specifically in the 7q22.1 region in patients diagnosed with LEZM.
  • chromosome 7 On the left of the figure, chromosome 7 is represented, including cytogenetic bands. On the right, there is an enlargement of the 7q22.1 region and the microsatellite markers analyzed in that region.
  • White boxes represent heterozygosity.
  • Black boxes represent loss of heterozygosity and gray boxes represent non-informative samples.
  • the letters A, B, C, D, E and F represent the patients analyzed. It can be seen how 4 of the 6 patients analyzed (B, C, D and F) show LOH for any of the markers included in the 7q22.1 region (D7S662, D7S2536, D7S515).
  • CUX1 Gene expression of CUX1 in patients with LEZM. Analysis of CUX1 gene expression by RT-PCR in spleen, bone marrow (BM) and peripheral blood (PB) samples of patients with LEZM and healthy control individuals (Control). In A the gene expression of CUX1 (exons 2-4) is shown and in B the gene expression of CUX1 (exon 24) is shown. On the Y axis, the results of CUX1 gene expression are expressed in relative terms based on the expression of the ABL control gene.
  • FIG. 8 Gene expression of SH2B2 in patients with LEZM. Analysis of SH2B2 gene expression by RT-PCR in spleen and bone marrow (BM) samples of patients with LEZM and healthy control individuals (Control). On the Y axis, the results of SH2B2 gene expression are expressed in relative terms based on the expression of the ABL control gene
  • FIG. 9 Analysis of the 7q22.1 region of chromosome 7 comprised between bases 100260234-100596921 using the specific high affinity array of the 7q22.1-7q33 region of NimbleGen in patients with LEZM. The figure shows the deletion of the bases 100260234-100596921 from the 7q22.1 region in LEZM patients.
  • FIG. 10 Analysis of the 7q22.1 region of chromosome 7 comprised between bases 101244026-101754718 using the specific high affinity array of the 7q22.1-7q33 region of NimbleGen in patients with LEZM. The figure shows the deletion of the bases 101244026-101754718 from the 7q22.1 region in LEZM patients.
  • Figure 11 Alignment and comparison of the sequence of the CUX1 gene in patients with LEZM with respect to a consensus sequence of said gene obtained from the database (NCBI / HG18).
  • A) The alignment of both sequences shows that the sequence of intron 1 of the CUX1 gene in LEZM patients presents the insertion of a thymine and a cytosine at positions 101345904 and 101345905 (boxed) of the genome of reference HG18 of the NCBI database regarding the sequence of the CUX1 gene obtained from patients with LEZM.
  • the first object of the present invention relates to an in vitro diagnostic method of LEZM comprising a step of detecting the deletion between the bases 99925039-101754718 located in the region 7q22.1, in which I know where at least the CUX1 gene is located, through the use of high affinity genomic arrays.
  • the method of the invention is characterized in that the deletion is located between the bases 99925039-101348479.
  • the method of the invention is characterized in that the deletion is located between bases 100260234-100596921 and / or 101244026-101754718 of region 7q22.1.
  • the method of the invention is characterized in that in said deleted regions the CUX1 and SH2B2 genes are located.
  • the method of the invention is characterized in that, in said region, among others, the genes EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56, SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4, HRBL, LRCH4 are located among others , MUC3, MUC12 and MUCU.
  • the method of the invention is characterized in that it further comprises the detection of the deletion comprised between bases 102949624-145959694 in the region 7q22.2-q35 in which, among others, the genes are located: RELN, LHFPL3, PBEF1, THAP5, IMMP2L, FOXP2, TES, MET, ST7, PTPRZ1, GRM8, UBE2H, MLKN1, BPGM, CALD1, PTN, SVOPL, AGK, KEL, TPK1 and CNTNAP2, using high affinity genomic arrays.
  • the genes are located: RELN, LHFPL3, PBEF1, THAP5, IMMP2L, FOXP2, TES, MET, ST7, PTPRZ1, GRM8, UBE2H, MLKN1, BPGM, CALD1, PTN, SVOPL, AGK, KEL, TPK1 and CNTNAP2, using high affinity genomic arrays.
  • the method of the invention is characterized in that it is performed on a DNA sample selected from: a sample from a tissue infiltrated with lymphoma cells, a bone marrow aspirate or a whole blood sample.
  • the method of the invention is characterized in that the high affinity genomic arrays used are selected from: BAC / PAC CGH-array, CGH-array Agilent, CGH-array NimbleGen, Tiling-array of NimbleGen specific to the chromosome 7 and high density specific NimbleGen CGH-array from the 7q22.1- q33 region.
  • Another object of the present invention relates to an in vitro diagnostic method of LEZM that measures the level of expression of at least the CUX1 gene, located in the deletion of the 7q22.1 region comprised between bases 99925039-101754718.
  • the method of the invention is characterized by measuring the level of expression of the CUX1 gene located in the deletion of the 7q22.1 region between bases 99925039-101348479.
  • the method of the invention is characterized in that it measures the level of expression of the CUX1 gene located in the deletion of the 7q22.1 region between bases 101244026-101754718.
  • the method of the invention is characterized in that it measures the level of expression of at least one of the CUX1 and SH2B2 genes located in the 7q22.1 region comprised between bases 101244026-101754718.
  • the method of the invention is characterized in that it further comprises measuring the level of expression of at least one of the genes selected from the group EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56 SERPINE1, APIS1, VGF , TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, MUCU any of its combinations, located in the deletion of the 7q22.1 region between the bases 99925039-101348479.
  • the method of the invention is characterized in that it is performed on a sample of RNA selected from: a sample from a tissue infiltrated with lymphoma cells, a bone marrow aspirate or a whole blood sample.
  • Another object of the present invention relates to an in vitro diagnostic method of LEZM comprising a combination in any order, of a detection step of the deletion comprised between the bases 99925039-101754718 located in the 7q22.1 region, using high affinity genomic arrays and another step that measures the level of expression of at least the CUX1 gene.
  • the method of the invention is characterized in that the deletion is located between the bases 99925039-101348479.
  • the method of the invention is characterized in that the deletion is located between bases 100260234-100596921 and / or 101244026-101754718 of region 7q22.1.
  • the method of the invention is characterized in that in the other step the level of expression of the CUX1 and / or SH2B2 gene is measured.
  • the method of the invention is characterized in that it further comprises measuring the level of expression of at least one of the genes selected from: EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56, SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12 and MUC17 and / or any combination thereof.
  • the method of the invention is characterized in that it further comprises the detection of the deletion comprised between bases 102949624-145959694 in the region 7q22.2-q35 where, among others, the genes are located: RELN, LHFPL3, PBEF1, THAP5, IMMP2L, FOXP2, TES, MET, ST7, PTPRZ1, GRM8, UBE2H, MLKN1, BPGM, CALD1, PTN, SVOPL, AGK, KEL, TPK1 and CNTNAP2, using high affinity genomic arrays.
  • Another object of the present invention relates to an in vitro diagnostic kit of LEZM comprising a set of probes selected from those included in the group SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and / or any other probe that hybridizes totally or partially on the deletion between the bases 99925039-101754718 located in the 7q22.1 region, by means of high affinity genomic arrays.
  • the kit of the invention is characterized in that the set of selected probes hybridizes totally or partially on the deletion between the bases 99925039-101348479.
  • the kit of the invention is characterized in that the set of selected probes hybridizes totally or partially on the deletions between the bases 100260234-100596921 and / or 101244026-101754718 of the region 7q22.1.
  • the kit of the invention is characterized in that it also comprises at least one probe that hybridizes totally or partially on the deletion between the bases 102949624-145959694 in the region 7q22.2-q35, by means of high affinity genomic arrays , said probe being preferably defined as SEQ ID NO: 4.
  • the kit of the invention is characterized by the hybrid probe in the 7q33 region.
  • Another object of the present invention relates to an in vitro diagnostic kit of LEZM that detects the expression of at least the CUX1 gene, located in the deletion of the 7q22.1 region comprised between bases 99925039-101754718, located in the 7q22.1 region, by RT-PCR using the primers defined as SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • the kit of the invention is characterized in that the detection of the expression of the CUX1 gene by RT-PCR using the primers defined as SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 is performed in the deleted region comprised between the bases 99925039-101348479.
  • the kit of the invention is characterized in that the detection of the expression of the CUX1 gene by RT-PCR using the primers defined as SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 is performed in the deleted region between bases 100260234-100596921 and / or 101244026-101754718 of the 7q22.1 region.
  • the kit of the invention is characterized in that the detection of CUX1 gene expression by RT-PCR can also be performed by primers defined as SEQ ID NOs: 23-24.
  • the kit of the present invention detects the expression of the SH2B2 gene using the primers defined as SEQ ID NO: 25 to 28.
  • the kit of the invention is characterized in that it also detects the expression of at least one of the genes selected from EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56, SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4, HRBL , LRCH4, MUC3, MUC12 and MUC17 and / or any combination thereof using primers specific for the sequences of said genes.
  • Example 1 Obtaining DNA samples from LEZM patients.
  • genomic DNA can be obtained from spleen samples, lymph nodes, bone marrow aspirate or whole blood samples as long as there is infiltration by LEZM cells in any of the tissues described.
  • genomic DNA extracted from fresh frozen spleen samples from 53 patients has been used using the standard method of phenol-chloroform and peripheral blood and / or bone marrow samples from the same patients, as well as from the other 25 patients .
  • Control DNA samples were isolated from placenta samples from healthy donors. All DNA samples were quantified with the NanoDrop spectrophotometer (ND-1000, NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). DNA quality was evaluated by the 260: 280 ratio and its integrity by agarose gel visualization with ethidium bromide.
  • Example 2. Analysis of genomic alterations in LEZM patients by means of the high affinity genomic microarray BAC / PAC CGH-array.
  • the genomic alterations presented by LEZM patients against healthy controls were analyzed, using the technique of high affinity genomic microarray (CGH- array)
  • CGH- array the technique of high affinity genomic microarray
  • FISH fluorescent in situ hybridization
  • the high affinity genomic microarrays used in the present invention have been: BAC / PAC CGH-array, Agilent CGH-array, NimbleGen CGH-array and Tiling path CGH-array specific to chromosome 7.
  • the first analysis performed on the samples of LEZM patients was carried out using the BAC / PAC CGH-array platform, in which the changes in the number of copies of DNA of the LEZM patients were analyzed against healthy controls.
  • the BAC / PAC CGH-array used comprises 3523 clones from BACs (artificial bacterial chromosome) and PACs (artificial chromosome derived from bacteriophage P1), covering the entire genome with a resolution of 1 Mb.
  • Said high affinity microarray was obtained in the Cancer Research Center (Salamanca, Spain) as described (Robledo et al., 2009). Briefly, the genomic DNA of LEZM patients and healthy controls were first prepared to hybridize with the array.
  • the labeled DNA samples were mixed together with human competitor DNA Cot-1 (Life Technologies), mixed with hybridization solution (50% formamide, 10% dextran sulfate, 2X standard saline solution of citrate, 10 mM Tris pH 7.6, 2.7% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) and 10 ⁇ / ⁇ of yeast tRNA) in the apparatus for automated processing of GeneTAC (Microgen) arrays for 48 hours at 42 ° C according the protocol recommended by the manufacturer.
  • human competitor DNA Cot-1 Life Technologies
  • hybridization solution 50% formamide, 10% dextran sulfate, 2X standard saline solution of citrate, 10 mM Tris pH 7.6, 2.7% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) and 10 ⁇ / ⁇ of yeast tRNA
  • the array was scanned on the GenePix 4000B dual laser scanner (Axon Instruments) and the images were analyzed with the Pro4.0 GenePix software (Axon Instruments). The intensity of the fluorescence signals obtained for each point was calculated after subtraction of background noise. Fluorescence ratios were normalized using the median fluorescence ratios of each computed point as the log2 value.
  • Example 3 Validation of the lost regions identified by BAC / PAC CGH-array using the FISH technique.
  • FISH experiments were carried out in a total of 20 patients diagnosed with LEZM.
  • FISH technique it can be observed, by fluorescence microscopy, whether a region is deleted or not, since the chromosomal region with which each of the probes used hybridizes is duplicated in each of the cells, if said zone it is not deleted, two signals with the color corresponding to the fluorophore with which said probe has been marked must be observed in the cell.
  • deleted only a single color signal corresponding to the fluorophore with which said probe has been labeled will be observed.
  • the probes used for hybridization were the clones of the BACs: RP11-44M6 located in the band of chromosome 7q22.1 (99873610-100038722 bp), RP11-333G13 located in 7q22.1 (101175494-101390682 bp), RP11-36B6 located at the level of 7q31 .31 (130078078- 130270796 bp) and RP11-371 N6 located at 7q33 (134684519-134842787 bp) as previously described (González MB et al, Cancer Genet Cytogenet 2004; 150 (2): 136-43).
  • clones were selected from the collection of BAC / PAC clones CGH-array (Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, United Kingdom), and were marked by the procedure of "transfer of the notch” (nick translation), using the fluoroforos: Spectrum Green or Spectrum Orange, following the manufacturer's instructions (Abbot Laboratories).
  • the 7q22.1 region was analyzed by FISH.
  • Four of these patients showed a loss in that region, when analyzed using the BAC / PAC CGH-array technique, a result that was corroborated by the FISH technique, while the remaining three patients did not present a loss or by the BAC / PAC technique.
  • the Agilent platform contains 44,255 probes synthesized in situ and spaced at 43,000 bp intervals throughout the human genome, including 3,877 probes as a control.
  • the microarray was designed to study changes in the number of copies and represents most of the known human genes.
  • the probes are enriched with relevant genes in oncological pathologies, representing both the coding and non-coding sequences of the chromosomes.
  • Human genomic placental DNA has been used as a control and the protocol recommended by Agilent
  • the arrays were scanned using the Agilent scanner.
  • the extraction, filtering and normalization of the data obtained, was carried out using the Feature Extraction software (Agilent Technologies).
  • the Agilent CGH Analytics Software 3.4 (Agilent Technologies) software was used to export the array data and analyze them using the Nexus Copy Number Professional trial software (version 4, BioDiscovery Inc) (Baumbusch LO et al., BMC Genomics. 2008 ; 8; 9: 379).
  • the data was obtained through the NimbleScan v2.5 software (NimbleGen System, Inc), which allows the automatic alignment of the results, their extraction and the generation of useful data files for analysis (Selzer RR et al., Genes Chromosomes Cancer 2005 Nov; 44 (3): 305-19).
  • BAC-CGH array Agilent Human Genome CGH Microarray 44K and NimbleGen human CGH 4x72K Whole Genome v2.0 array, confirmed the existence of alterations in the genome of patients with LEZM. These alterations were mainly gains at the level of chromosomes 3, 6p22.1-p21.1, 8q, 17q, 18 and losses at the level of chromosomes 4q28.3-q31 .23, 10q24.33-q25.3 and 1 7p1 3.3-p13.1. In addition, these CGH-arrays showed the existence of a patient with trisomy on chromosomes 3, 12 and 18.
  • chromosome 7 was specifically designed at a high resolution and with a fine resolution analysis that included the bases 117.711-158.805.222 bp of the entire chromosome 7.
  • This "tiling-array" of chromosome 7 was designed using The maskless array synthesis technology (NimbleGen Systems, Inc.), with a maximum of 385,110 oligonucleotides or probes, with a median separation between probes of 311 bp, allowing a deep mapping of the entire region.
  • the high resolution design allows oligonucleotides to be designed that are often overlapping each other in order to obtain a high resolution of the area to be analyzed, in the present invention, of the entire chromosome 7.
  • the array was scanned at a resolution of 5 ⁇ using the NimbleGen MS 200 Microarray scanner (Roche NimbleGen Instruments).
  • the data was extracted from the scanned images using the NimbleScan v2.5 software (NimbleGen system, Inc), which allows the automatic alignment of the data and its extraction, generating a useful data files for analysis.
  • Figure 4A shows the result of the BAC / PAC CGH-array in samples from three patients, observing that in these patients there was a loss shown in black in the 7q22.1 region, while in the control no change is observed.
  • the 7q22.1 region in this array was mapped by 3 clones with a resolution of 1 Mb.
  • the result of the NimbleGen 72K array having a resolution of 42 kb is shown in Figure 4B, and the 7q22.1 region was covered by 53 oligos, in samples from 3 patients with LEZM. The results obtained show that the patients showed losses at this level, while the control showed no changes.
  • the results obtained by the NimbleGen 385K array are shown in Figure 4C, showing a zoom of the suppression area (7q22.1).
  • the 7q22.1 region was mapped by more than 3,500 oligos and the region commonly delegated at this level could be delimited between loci D7S2120E and D7S740. Therefore, the specific "tiling-array" of chromosome 7 makes it possible to detect more precisely the exact location of the deletion that occurs in the band of chromosome 7q22.1.
  • the deletion in a more distal region of chromosome 7, the 7q22-q35 region, between the bases 102949624-145959694 has also been revealed.
  • this region of 43.15 Mb in size located between the BACs RP4-672011 and RP4-558L10 are located several genes such as: RELN, LHFPL3, PBEF1, THAP5, IMMP2L, FOXP2, TES, MET, ST7, PTPRZ1, GRM8, UBE2H, MLKN1, BPGM, CALD1, PTN, SVOPL, AGK, KEL, TPK1 and CNTNAP2.
  • This region is detected by, among others, the clone or probe of the BAC / PAC CGH-array: BAC RP11-371 N6 (SEQ ID NO: 4) located at 7q33 (135034979-135191247).
  • the probes that recognize the specific deletion of the 7q22.1 region defined as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, together with the use of the probe that recognizes the deletion of the 7q33 region, defined as SEQ ID NO: 4, could increase the number of patients with diagnosed LZD.
  • LOH using microsatellite markers detects the relative loss of an allele in a tumor sample in relation to a non-tumor sample of the same patient that presents both alleles.
  • allelic loss was limited to informational markers. The markers were considered informative when heterozygosity is detected in normal control tissue samples, which results in the presence of two bands in the agarose gel corresponding to two different alleles.
  • the PCR product obtained will only show an amplification band, corresponding to one of the alleles, since the other one is deleted in the tumor sample, while in the non-tumor sample, the two alleles will be shown as two bands amplification (Figure 5).
  • the dinucleotide repeats were analyzed by means of the PCR technique in 6 patients diagnosed with LEZM, selecting 7 microsatellite markers located on chromosome 7.
  • the markers were selected from the Genethon databases, GDB and RHdb.
  • the location of the markers in the genome was performed by Electronic-PCR (e-PCR). (Schuler GD. Sequence Mapping by Electronic PCR. Genome Res. 1997; 7: 541-550).
  • the microsatellite markers used to define even more precisely the 7q22.1 deleted region of chromosome 7 in patients with LEZM are described in Table 2. Table 2. Selected markers for microsatellite amplification.
  • the PCR technique was carried out in a volume of 25 ⁇ containing 30-50 ng / ⁇ of template DNA, 5x PCR buffer (Promega, Madison Wl, USA), 25 mM gC (Promega, Madison Wl, USA), 2 , 5 mM of the nucleotide mixture (dNTPs: dATP, dGTP, dCTP and dTTP; Roche Diagnostics, Indianapolis IN, USA), 10 ⁇ each of the primers used for the identification of each microsatellite and 1 unit of Taq DNA polymerase ( Promega, Madison Wl, USA).
  • the PCR conditions were: 94 ° C for 5 minutes, 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 55-65 ° C (depending on the primer) for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds and finally 72 ° C for 5 minutes and finally the samples were kept at the temperature of 4 ° C.
  • the PCR products obtained were separated on a 3% agarose gel (MS6 Metagel, Conda, Madrid, Spain). The results obtained in the LOH analysis showed that of the 6 patients analyzed, 4 patients presented LOH in the 7q22.1 locus (67%).
  • the LOH technique showed that, for markers D7S662, D7S2536 and D7S515 located at positions 100,950,585, 101 .235,892 and 101,490,495, respectively, in region 7q22.1, the percentage of losses was 50%, 20% and 60% respectively (Figure 6).
  • the loss of heterozygosity was detected in the microsatellite markers D7S527 (7q21 .3), D7S662 (7q22.1), D7S2536 (7q22.1) and D7S515 ( 7q22.1) ( Figure 6).
  • two of the markers used in the present LOH analysis are located in the CUX1 gene located in the 7q22.1 deleted region of patients with LEZM, specifically the microsatellite markers D7S515 (at intron 3 of the CUX1 gene) and D7S6626 CUX1 ( in intron 6 of the CUX1 gene).
  • Example 7 Detailed analysis of the 7q22.1 to 7q33.1 region of chromosome 7 using a high density array.
  • Said CGH -array comprises probes that extend from the cytogenetic band 7q22.1 to the cytogenetic band 7q33 (both included) (Chr7: 99.158.389-137.302.483).
  • Said high density CGH-array includes 710,953 probes with an average probe size of 54 nucleotides (range: 49-74) and an average distance of -0.7 bp (range: (-51) - 59217 bp) between the probes. This CGH-array allows mapping said region of the genome with very high precision.
  • Said high density CGH-array was used for the analysis of a total of 15 samples of patients with LEZM, 2 patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) and a healthy control patient.
  • CLL chronic lymphocytic leukemia
  • Example 8 Analysis of the CUX1, SH2B2 and MUC3 gene expression in LEZM patients.
  • genes are located in the 7q22.1 region. Specifically, in the deleted region between bases 100,260,234-100,596,921 of region 7q22.1 of chromosome 7, the genes are located: EPHB4, SLC12A9, RIP6, SRRT, UFSP1, ACHE, MUC3A / B, MUC12, MUC17, TRIM56, SERPINE1, AP1S1 and VGF. On the other hand, in the second deleted region between bases 101.244026-101.754.718 of the same region, 7q22.1, the CUX1 and SH2B2 genes are located.
  • the protein encoding the CUX1 gene is a member of the family of DNA binding proteins. It can regulate genetic expression, morphogenesis and differentiation and may have a role in cell cycle progression. In patients with myeloid disease such as myelodysplastic syndromes or juvenile myelomonocytic leukemia, it was observed that chromosome 7 monosomy was frequent, with a loss of 7q22 region genes among which CUX1 is found, and however, mutational analyzes they did not reveal pathological mutations in any of the analyzed cases, so it was concluded that this gene was unlikely to have an important role in this type of neoplasms (Hindersin, S et al, Leuk. Res. 2007; 31: 1323-1324 ).
  • the SH2B2 gene codes for an adaptation protein of some members of the tyrosine-kinase receptor family and is involved in multiple cell signaling pathways, preferably B cells (Masanori Iseki et al. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2000: 272.45-54).
  • B cells preferably B cells
  • very high expression was observed in a wide variety of normal tissues. (Yokouchi et al. Oncogene. 1999: 18,759-767). Therefore, there is also no clear role for this gene in the genesis or development of LEZM.
  • the gene expression of the CUX1, SH2B2 and MUC3 genes was analyzed by means of RT-PCR in spleen samples, bone marrow aspirate and peripheral blood of 16 LEZM patients and in samples of 6 healthy control individuals.
  • RT-PCR technique also known as "Polymerase Chain Reaction”
  • it is intended to obtain a large number of copies of a particular DNA fragment, starting from a minimum ; in theory it is enough to start from a single copy of that original fragment, or mold.
  • the material from these patients was frozen in trizol (Invitrogen Life Technologies, Gaithersburg, MD) at -80 ° C to extract total RNA.
  • RNeasy® Mini Qiagen, Valencia, CA
  • the Superscript III commercial kit SuperScript® III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR, Invitrogen was used for cDNA synthesis. In all cases, 1 g of total RNA was split.
  • the primers used to obtain the cDNA were designed using the "Primer Express 3.0" (Applied Biosystems) program. In addition, with the “Oligoanalyzer” program it was observed that they did not form dimers and finally, their specificity was verified with the NCBI BLAST program.
  • Table 4 describes the primers selected for the analysis of the expression of the CUX1, SH2B2 and MUC3 genes, using the ABL gene expression as a control. As can be seen in said Table 4, the expression of each of the genes in different exonic regions thereof was analyzed.
  • a gradient test of them was carried out in the iCycler (Biorad) with a control cDNA from the Multiple Myeloma cell line (RPMI).
  • the control gene was used ABL that by means of fluorescence detection with the SYBR Green (Applied Biosystem) and the Pfaffl analysis method (Pfaffl MW, Nucleic Acids Res. 2001 May 1: e45) determined the relative quantification of the target probe compared to the reference gene .
  • the samples are analyzed in triplicate; 10 ng / well of each sample was used; a positive control (cDNA control) and a negative control (H2O) were used for each gene.
  • the reaction was performed at the optimum temperature of each primer determined by the gradient test.
  • the PCR reaction was prepared by adding the corresponding primers to each gene (sense and antisense), the cDNA, the 2xFast SYBR Green (Applied Biosystem) and H2O until a final volume of 25 ⁇ was completed. Once the plate was prepared, it was introduced into the thermal cycler to follow the PCR protocol and its subsequent analysis.
  • the results obtained show that the expression of the MUC3 gene is not modified in patients with LEZM compared to healthy controls.
  • the expression of the CUX1 and SH2B2 genes is differentially expressed in patients with LEZM compared to healthy control subjects.
  • the CUX1 gene shows that it is under-expressed in spleen, bone marrow and peripheral blood samples of LEZM patients with respect to control subjects ( Figure 7).
  • the expression analysis of the SH2B2 gene shows that it is overexpressed in spleen and bone marrow samples of LEZM patients with respect to control subjects.
  • Sequencing of each fragment was carried out using the primers with which the amplification was performed using the PCR technique.
  • Each of the DNAs in the samples were sequenced, both from the control subjects and from LEZM patients, using 40-60 ng of each fragment in a final volume of 8 ⁇ .
  • a sample was prepared with the sense primer and another with the antisense at a concentration of 3 pmol each in a volume of 2 ⁇ . Therefore, each isolated fragment was sequenced with each primer obtaining several sequences for each of the analyzed DNAs.
  • the sequencing reaction was carried out on an ABI 3130x / (Applied Biosystems) sequencer in the Sequencing Service of the Salamanca Cancer Research Center (CIC).
  • sequences were then analyzed using the DS GENE 1 .5 software package (Discovery Studio Gene v1.5, Accelrys Inc) and visualizing the electropherogram (graph of a DNA sequence obtained by electrophoresis). After the analysis of the electropherograms, the sequences obtained were aligned with the consensus sequences taken from the databases (NCBI / HG18). Alignment and similarity analysis of the sequences were performed with Clustal W and BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). The sequencing analysis of the region in 7q22.1 where the MUC3 gene (Chromosome 7: 100387324-100388418) is located has a total size of 1140 base pairs. The results showed that in that region there were 5 polymorphisms that were equally frequent in patients with LZM as in the healthy controls analyzed, and it can therefore be concluded that they are population polymorphisms and not due to the disease.

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Abstract

La presente invención describe un método de diagnóstico in vitro de LEZM basado en el análisis de la expresión de una serie de genes localizados en una región muy específica delecionada del cromosoma 7 humano. La región delecionada en pacientes LEZM ha sido definida mediante CGH arrays de alta afinidad y se localiza en 7q22.1 entre las bases 99925039-101754718, preferentemente entre 99925039-101348479 y más preferentemente entre 100260234-100596921 y/o 101244026-101754718, donde se encuentran los genes: CUX1, SH2B2, EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56, SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4,HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12 y MUC17. Además la presente invención describe kits de diagnóstico in vitro de LEZM, que comprenden al menos una sonda que reconozca la región delecionada en 7q22.1 o que hibride con al menos una de las secuencias nucleotídicas de los genes mencionados anteriormente.

Description

MÉTODO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO DE PACIENTES CON LINFOMA ESPLÉNICO DE
LA ZONA MARGINAL
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuadra en el ámbito de la biomedicina y en el campo farmacéutico, más específicamente, se refiere a un método de diagnosis in vitro, para el diagnóstico de pacientes que padecen la enfermedad neoplásica: linfoma esplénico de la zona marginal (LEZM). Además la presente invención también hace referencia a un kit de diagnóstico in vitro de pacientes con LEZM.
ANTECEDENTES
El Linfoma Esplénico de la Zona Marginal (LEZM), es una enfermedad tumoral que puede afectar a cualquier órgano, aunque los más comunes son el bazo y los ganglios linfáticos. Ha sido considerado como una entidad clínico-patológica distinta desde hace años (Schmid C et al. Am J Surg Pathol 1992, 16: 455-466). Más recientemente, la clasificación de enfermedades hematológicas de la Organización Mundial de la Salud (OMS), ha designado a los LEZM como un subtipo distinto de linfomas no-Hodgkin (Harris NL, et al. Histopathology 2000, 36: 69-86) (LNH), en base a su morfología, inmunofenotipo y características clínicas, junto con los linfomas asociados a mucosas (MALT) y los linfomas de la zona marginal nodal (LZMN). Estos tres subtipos de LNH: LEZM, linfomas MALT y LZMN, están incluidos en los linfomas de la zona marginal porque tienen su origen común en el compartimento marginal de las células B de los nodulos linfáticos y del bazo.
En el diagnóstico de los linfomas, es importante clasificar cada uno dentro del subtipo al que pertenece para poder dar al paciente el tratamiento adecuado, ya que cada tipo de linfoma tiene un tratamiento distinto. Así, por ejemplo, en el caso del LEZM no se debe aplicar quimioterapia en primera instancia, siendo el tratamiento más adecuado la extirpación del órgano afectado, generalmente el bazo, por lo que es muy importante diagnosticarlo correctamente. El diagnóstico de los LNH y la diferenciación entre cada uno de ellos se basa en las características morfológicas, inmunohistoquímicas y moleculares, siendo las alteraciones genéticas en general, y las traslocaciones específicas en particular, una de las características que más está ayudando para distinguir unos linfomas de otros. La mayoría de los LNH se caracterizan por la presencia de traslocaciones específicas, que sirven para su diagnóstico. Sin embargo, los LEZM carecen de un marcador molecular conocido pues, a diferencia de otros linfomas, no se ha identificado en ellos una traslocación que les sea característica, lo que dificulta su diagnóstico. Si bien los análisis citogenéticos muestran que en este tipo de tumores pueden detectarse pérdidas en las que están involucrados los cromosomas 1 , 3, 7 y 8 (Dierlamm J, et al., Blood 1996, 87: 299-307; Solé F, et al., Br J Haematol 1997; 98: 446-449), existen pocos estudios que demuestren la existencia de una alteración que fuera específica y característica de los LEZM y que permitiera la identificación de una alta proporción de aquellos pacientes que la padecen. Estudios de citogenética convencional pusieron de manifiesto que una de las alteraciones más frecuentes en los LEZM eran las pérdidas en el brazo largo del cromosoma 7 (del(7q)), lo que podía sugerir que la del(7q) está asociada con los LEZM (Brynes RK, et al., Mod Pathol 1996, 9: 995-1000; Hernández JM, et al., Leukemia 1995, 9: 2140-2146). En esos primeros estudios se estimaba que las deleciones en el brazo largo del cromosoma 7 no se presentaban en más de un 25% de los pacientes aquejados de LEZM (Franco V, et al., Blood 2003; 101 :2464-2472), por lo que no se consideraba que el desarrollo de métodos diagnósticos basados en su detección pudiera tener interés, al permitir identificar sólo una proporción muy baja del total de pacientes aquejados de LEZM. Posteriormente, estudios de pérdida de heterocigosidad demostraron que la presencia de una pérdida alélica en los LEZM (40%) es mayor que la observada en otros síndromes linfoproliferativos de células-B.
La técnica utilizada más habitualmente para realizar los estudios de los cambios producidos en los cromosomas asociados con los LEZM ha sido la hibridación genómica comparada (CGH), metodología que permite la determinación de ganancias y pérdidas en el número de copias entre dos muestras de ADN, mediante una hibridación competitiva de ADN normal y del ADN tumoral en estudio (cada uno de ellos marcados con un fluorocromo diferente) sobre metafases de individuos normales, evaluando después si existen zonas en las que se produzca un aumento de la señal correspondiente al fluorocromo con el que se haya marcado el ADN tumoral (lo que se considera indicativo de ganancias) o disminuciones de dicha señal, aumentando la señal correspondiente al otro fluorocromo, el del ADN normal (lo que se considera indicativo de pérdidas). Estudios de CGH confirmaron que hay distintas regiones del genoma implicadas en estos linfomas, tales como 5q, 7q, 9q, 12q y 20q, encontrando, además, que existe una correlación entre las pérdidas de material genómico y el acortamiento del período de supervivencia (Hernández J.M., et al Am J Pathol. 2001 May;158:1843-50).
Mediante la utilización de dichas técnicas se ha observado que la región 7q31-q36 en particular, parece estar estrechamente relacionada con los LEZM y en ella se encuentran a menudo deleciones en los pacientes aquejados de esta enfermedad. Dicha región comprende una zona muy amplia del genoma, en la que no se han encontrado genes candidatos que sirviesen para el diagnóstico de la enfermedad (Algara P, et al., Blood 2002, 99: 1299-1304; Ocio EM, et al., Clinical Lymphoma 2005, 4: 241-245). A pesar de haber sido de gran utilidad en el conocimiento de las alteraciones genómicas en los procesos tumorales y en especial en los linfomas, (para cuyo conocimiento, clasificación y pronóstico ha sido de gran utilidad), la técnica de la CGH tiene una capacidad de resolución limitada: por una parte, los cambios que impliquen deleciones de segmentos inferiores a 7 Mb no son detectables (Bentz M, et al., Genes Chromosomes Cáncer 1998; 21 :172-175) y por otra parte, la determinación de los puntos exactos del cromosoma entre los cuales se inserta la amplificación o que suponen los límites de la deleción es difícil, ya que la región mínima delecionada es demasiado extensa como para poder ser analizada con una sonda de hibridación in situ (Hernández J.M., et al., Am J Pathol. 2001 May;158:1843-50).
Las pérdidas del brazo largo del cromosoma 7, como ya se ha comentado, son una de las alteraciones que más se han detectado hasta ahora en los estudios realizados sobre LEZM, ya sea mediante las técnicas de CGH o mediante técnicas de hibridación fluorescente in situ (FISH). Sin embargo, las amplias regiones delecionadas encontradas mediante dichas técnicas, han mostrado problemas a la hora de definirlas, ya que las sondas utilizadas eran de gran tamaño, no mostrando la suficiente seguridad ni especificidad para su uso en el diagnóstico de la enfermedad.
En la patente española ES2284408 solucionan dicho problema mediante el uso de arrays genómicos, también llamados CGH-arrays o arrays de CGH. Los CGH-arrays son un método para identificar alteraciones en el genoma, sin ser capaz de detectar translocaciones recíprocas. Se trata de una técnica que combina la tecnología de los micro-arrays con la tecnología de la CGH, en la que la hibridación se realiza reemplazando las metafases de los cromosomas por segmentos de ADN mapeados, cuyo conjunto representa todos los cromosomas o brazos de cromosomas, divididos en fragmentos clonados en cromosomas artificiales de levadura (YAC), cromosomas artificiales de bacteria (BAC), cromosomas artificiales basados en el genoma del bacteriófago P1 (PAC), cósmidos u otros vectores de clonación. De esta manera, aumenta el nivel de resolución, que deja de ser cromosómico (distancias medidas en megabases) pasando a poder ser medido en kilobases. Las ventajas de esta metodología son la mayor resolución y la posibilidad de realizar un mapeo directo del clon o clones que se encuentran involucrados en el cambio genómico. La patente española ES2284408 divulga el uso de un BAC/PAC-array específico de 3500 clones con una resolución de 1 Mb. Los resultados mostrados en dicha patente, ponen de manifiesto que los pacientes con LEZM presentan una deleción en la región 7q22.1 -q22.2, definida por la sonda portadora de la secuencia correspondiente al fragmento del cromosoma 7 humano contenido en el BAC/PAC-array, denominada RP11-44M6. En dicha patente se divulga también, el uso opcional, en el mismo ensayo, de otras sondas diferentes que reconocen otra región delecionada también en el cromosoma 7, la región 7q32-q33, aumentando así el porcentaje de pacientes con LEZM que pueden ser diagnosticados en la misma prueba.
En la presente invención se describe un método de diagnóstico in vitro de LEZM basado en la identificación de una deleción específica, localizada de forma más concreta entre las bases 99925039-101754718, preferentemente entre las bases 99925039- 101348479, de la región 7q22.1 del cromosoma 7 humano. Más preferentemente, las regiones delecionadas en la región 7q22.1 son las regiones comprendidas entre las bases 100260234-100596921 y 101244026-101754718. La deleción detectada mediante el método de la invención, posee un tamaño aproximado de 1.4 Mb. Preferentemente, las dos regiones delecionadas, 100260234-100596921 y 101244026-101754718, poseen, entre ambas, un tamaño aproximado de 0.84 Mb. En la región cuya deleción detecta el método de la invención, se localizan los siguientes genes: EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56, SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, MUC17, CUX1 y SH2B2 (Ver Tabla 1). Para la obtención de los resultados mostrados en la presente invención se ha hecho uso de diferentes plataformas de CGH-array de alta afinidad y de técnicas de pérdidas de heterocigosidad (LOH), las cuales tienen un alto poder de resolución, permitiendo definir una región específica del cromosoma 7 localizada entre las bases 99925039-101754718, preferentemente entre las bases 99925039-101348479 y más preferentemente en las regiones comprendidas entre las bases 100260234-100596921 y 101244026-101754718 en la región 7q22.1 , que se encuentra delecionada en pacientes con LEZM. Por lo tanto, aunque en el estado de la técnica existía información sobre distintas regiones delecionadas del cromosoma 7 en pacientes con LEZM, mediante el método descrito en la invención, se ha definido, una región muy específica, que es características de dicho proceso tumoral y que además, se encuentra con suficiente frecuencia entre la población afectada de LEZM, garantizando el diagnóstico de una proporción significativa de pacientes. La obtención, de una manera tan exacta y definida, de la región específica delecionada, mediante el método de la invención, permite realizar un diagnóstico diferencial de pacientes con LEZM, frente a otros tipos de linfomas, preferentemente linfomas linfoproliferativos crónicos o linfomas no-Hodking, los cuales no se caracterizan por presentar la deleción definida en la presente invención. Por otro lado, cuanto más definidas sean las regiones delecionadas para el diagnóstico de los pacientes con LEZM, mejor se conocerán los genes implicados en el desarrollo de dichas patologías, favoreciendo el diseño de tratamientos específicos para frenar estas nuevas vías de señalización tumoral. En este sentido, la presente invención evidencia la presencia de genes que pueden funcionar como represores de proto-oncogenes, supresores de tumores, reguladores del crecimiento, y que se encuentran en la región delecionada en pacientes con LEZM.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Breve descripción de la invención
En la presente invención se describe la asociación entre los LEZM y la presencia de deleciones en una región muy específica y definida del cromosoma 7 humano. La presente invención se refiere a un método de diagnóstico in vitro de pacientes con LEZM basado en el análisis de la expresión de una serie de genes localizados en una región delecionada de dicho cromosoma 7 humano. La región delecionada en pacientes LEZM ha sido definida mediante la utilización de CGH-arrays de alta afinidad y LOH, y se localiza en 7q22.1 entre las bases 99925039-101754718, preferentemente entre las bases 99925039-101348479. Más preferentemente, las regiones delecionadas en la región 7q22.1 son las regiones comprendidas entre las bases 100260234-100596921 y 101244026-101754718. En la región cuya deleción detecta el método de la invención, se localizan los siguientes genes: EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56, SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, MUC17, CUX1 y SH2B2 (Tabla 1) pudiéndose utilizar como genes candidatos para el diagnóstico de la enfermedad. En este sentido, la presente invención pone de manifiesto que los pacientes con LEZM muestran una expresión diferencial de al menos uno de los genes seleccionados de entre: EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56, SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, MUC17, CUX1 y SH2B2 respecto a los controles sanos o respecto a pacientes que presentan otro tipo de linfoma, analizando muestras procedentes de tejidos tumorales, de aspirado de médula ósea o de sangre. El tamaño aproximado de la región delecionada es de 1 .4 Mb. Preferentemente, las dos regiones delecionadas, 100260234-100596921 y 101244026-101754718, poseen, entre ambas, un tamaño aproximado de 0.84 Mb. Mediante la utilización de CGH-arrays de alta afinidad según se describe en la invención, un 49% de los pacientes LEZM incluidos en el estudio mostraron la deleción de la región 7q22.1 .
Tablal . Genes localizados en la región delecionada 7q22.1 en pacientes LEZM
Gen Principio (pb) Fin (pb) N° GeneBank
BC010406.2
BC001486.2
TSC22D4 99902078 99914838 BC031622.1
BC001966.1
BC002972.1
HRBL 99974770 99979594 BC009393
LRCH4 100009570 100021712 BC018529
BC052804
EPHB4 100238122 100263079
BC000154
SLC12A9 100288293 100302570
BC028985, BC021540,
TRIP6 100302885 100309012 BC004249, BC004999,
BC002680
SRRT 100310636 100324221 BC109117
UFSP1 100324279 100325275 BC067904
BC143469, BC105060,
ACHE 100325550 100331477
BC105062
AF007194
AB038783
MUC3A/B 100388685 100397831
AF143372
AJ606308
MUC12 100434795 100448936 AK024856
MUC17 100450083 100488860 BC126315.1
TRIM56 100515505 100520609 BC005847, BC048194 Tablal (continuación)
Figure imgf000008_0001
En la presente invención se define el término de CGH-array de alta afinidad como un método de citogenética molecular para la detección de ganancias y pérdidas cromosómicas que combina la tecnología de los CGH con la tecnología de los micro-arrays. El array genómico de alta afinidad es preferentemente un soporte sólido al que se le han adherido de forma ordenada y mediante un biorobot clones y/o secuencias de ADN conocidas, en forma de matriz de miles de puntos equiespaciados. La afinidad o resolución de los arrays genómicos viene determinada por la distancia genómica que hay entre dos clones consecutivos. Esta técnica está basada en la co-hibridación sobre el array de dos ADNs, tumoral y de referencia, marcados con diferentes fluorocromos.
Los CGH-arrays de alta afinidad utilizados en la presente invención han sido: BAC/PAC-array, que contiene 3.523 clones procedentes de BACs y PACs que cubren todo el genoma con una resolución de 1 Mb. Para corroborar los resultados obtenidos mediante dicha plataforma se han utilizado ensayos de FISH. Posteriormente, para asegurar aún más dichos resultados se hizo uso de otras 2 plataformas comerciales de arrays genómicos: CGH-array Agilent de 44K y CGH-array NimbleGen de 72K. Mediante dichas técnicas se corroboró que los pacientes con LEZM presentaban una deleción en la región 7q22.1 del cromosoma 7 humano. Para redefinir la zona específica delecionada en la región 7q22.1 del cromosoma 7 humano en pacientes con LEZM, se utilizó el array comercial de alta resolución, Tiling-array de NimbleGen, específico del cromosoma 7. Dicho array utiliza aproximadamente 385.110 oligonucleótidos o dianas que cubren todo el cromosoma 7 y que dejan una distancia media entre cada oligonucleótido de aproximadamente 355 pb. Además de los arrays de alta afinidad mencionados anteriormente, se utilizó otro array de alta afinidad, específico de las regiones comprendidas entre las bandas citogenéticas 7q22.1 hasta 7q33, ambas inclusive (Cromosoma 7: 99158137-137302483). Dicho array incluye 710953 sondas con un tamaño medio de sonda de 54 oligonucleótidos y una distancia media entre cada oligonucleótido de -0.7 pb, permitiendo dicho array cartografiar dicha región con una precisión muy elevada.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a kits de diagnóstico de LEZM que comprenden al menos una sonda que reconozcan la región delecionada en 7q22.1 o que hibride con al menos una de las secuencias nucleotídicas de los genes mencionados anteriormente, estando acopladas dichas sondas a un compuesto, preferentemente un fluoróforo, que permite su detección.
Mediante el método de diagnóstico in vitro, descrito en la presente invención, se delimita con una gran precisión la región delecionada en 7q22.1 , permitiendo un mejor diagnóstico diferencial de los pacientes con LEZM frente a los pacientes con otros síndromes linfoproliferativos crónicos o los linfomas no-Hodgkinianos, ya que está deleción específica en la región 7q es muy característica de los LEZM y no del resto de síndromes linfoproliferativos crónicos o linfomas no-Hodgkin.
Descripción de las figuras.
Figura 1. Regiones genómicas comunes de pérdidas o ganancias en el cromosoma 7 de 57 pacientes con LEZM. La figura muestra las regiones genómicas que presentan ganancias (G) expresado como porcentaje o pérdidas (L) expresado como porcentaje, en el cromosoma 7 de pacientes con LEZM. Para cada región, se muestra la localización citogenética y el porcentaje de ganancias (%G) o pérdidas (%L).
Figura 2. Regiones genómicas implicadas en pacientes LEZM que mostraron o no alteraciones en el cromosoma 7q. La figura muestra las ganancias (G) expresadas como porcentaje, y las pérdidas (L) expresadas como porcentaje, de los pacientes con pérdidas en el cromosoma 7q (barras negras) y de los pacientes que no mostraron pérdidas en el cromosoma 7q (barras blancas). Figura 3. Análisis del cromosoma 7 mediante el array de alta afinidad "tiling array" específico del cromosoma 7 de NimbleGen (385K) en pacientes con LEZM. La figura muestra la deleción de la región de 7q22.1 en tres de los cuatro casos analizados, mostrado como líneas negras gruesas. C: Controles; LEZM 1 , LEZM 2 y LEZM 3: pacientes con LEZM.
Figure 4: Análisis de la zona comúnmente delecionada del cromosoma 7, 7q22.1 en tres pacientes LEZM, mediante los diferentes CGH-arrays utilizados en la invención.
(A) La figura muestra los tres clones que cubren la región 7q22.1 del cromosoma 7 analizado mediante el BAC/PAC CGH-array. Los tres pacientes con LEZM (LEZM 1 , LEZM 2 y LEZM 3) muestran una pérdida (en negro) en la región 7q22.1 y en el control (C) no se observa cambio. La región 7q22.1 en este array está mapeada por tres clones con una resolución de 1 Mb. (B) La figura muestra los 53 oligonucleótidos presentes en la región 7q22.1 que contiene el CGH-array NimbleGen 72K. Los tres pacientes con LEZM (LEZM 1 , LEZM 2 y LEZM 3) presentaron pérdidas en la región 7q22.1 (negro), mientras que el control (C) no mostró cambios en dicha región. (C) La figura muestra los 3.553 oligonucleótidos que recubren la región 7q22.1 en el "tiling-array" específico del cromosoma 7. Se observa que la región comúnmente delecionada en los tres pacientes con LEZM (LEZM 1 , LEZM 2 y LEZM 3) analizados se encuentra delimitada entre los locis D7S2120E y D7S740. C: control.
Figura 5. Representación de los patrones de la pérdida de heterocigosidad (LOH) obtenidos mediante el análisis de marcadores de microsatélites en pacientes LEZM.
Fotografía de geles de agarosa en las que se pone de manifiesto la pérdida o no de heterocigosidad de pacientes LEZM. A) No LOH y B) LOH. T: muestra tumoral (bazo), NT: muestra no tumoral (médula ósea o sangre periférica).
Figura 6. Análisis de LOH dentro del cromosoma 7q, específicamente en la región 7q22.1 en pacientes diagnosticados de LEZM. A la izquierda de la figura se representa el cromosoma 7 incluidas las bandas citogenéticas. A la derecha se observa una ampliación de la región 7q22.1 y de los marcadores microsatélites analizados en dicha región. Los recuadros blancos representan heterocigosidad. Los recuadros negros representan pérdida de heterocigosidad y los recuadros grises representan muestras no informativas. Las letras A, B, C, D, E y F representan los pacientes analizados. Se puede observar como 4 de los 6 pacientes analizados (B, C, D y F) muestran LOH para alguno de los marcadores incluidos en la región 7q22.1 (D7S662, D7S2536, D7S515). Figura 7. Expresión génica de CUX1 en pacientes con LEZM. Análisis de la expresión génica de CUX1 mediante RT-PCR en muestras de bazo, médula ósea (BM) y sangre periférica (PB) de pacientes con LEZM y de individuos controles sanos (Control). En A se muestra la expresión génica de CUX1 (exones 2-4) y en B se muestra la expresión génica de CUX1 (exón 24). En el eje Y se expresan los resultados de la expresión génica de CUX1 en términos relativos en función de la expresión del gen control ABL.
Figura 8. Expresión génica de SH2B2 en pacientes con LEZM. Análisis de la expresión génica de SH2B2 mediante RT-PCR en muestras de bazo y médula ósea (BM) de pacientes con LEZM y de individuos controles sanos (Control). En el eje Y se expresan los resultados de la expresión génica de SH2B2 en términos relativos en función de la expresión del gen control ABL
Figura 9. Análisis de la región 7q22.1 del cromosoma 7 comprendida entre la bases 100260234-100596921 mediante el array de alta afinidad específico de de la región 7q22.1-7q33 de NimbleGen en pacientes con LEZM. La figura muestra la deleción de las bases 100260234-100596921 de la región 7q22.1 en pacientes LEZM.
Figura 10. Análisis de la región 7q22.1 del cromosoma 7 comprendida entre la bases 101244026-101754718 mediante el array de alta afinidad específico de de la región 7q22.1-7q33 de NimbleGen en pacientes con LEZM. La figura muestra la deleción de las bases 101244026-101754718 de la región 7q22.1 en pacientes LEZM.
Figura 11. Alineamiento y comparación de la secuencia del gen CUX1 en pacientes con LEZM respecto a una secuencia consenso de dicho gen obtenida de la base de datos (NCBI/HG18). A) El alineamiento de ambas secuencias pone de manifiesto que la secuencia del intrón 1 del gen CUX1 en pacientes LEZM presenta la inserción de una timina y una citosina en las posiciones 101345904 y 101345905 (recuadrado) del genoma de referencia HG18 de la base de datos NCBI respecto a la secuencia del gen CUX1 obtenida de pacientes con LEZM. B) El alineamiento de ambas secuencias pone de manifiesto que la secuencia del exón 3 del gen CUX1 en pacientes LEZM presenta en posición 101458144 del genoma de referencia HG18 de la base de datos NCBI la sustitución de una guanina por una timina (G>T) (recuadrado), es decir, la letra "n" representa una timina, respecto a la secuencia del gen CUX1 obtenida de pacientes con LEZM.
Descripción detallada de la invención El primer objeto de la presente invención se refiere a un método de diagnóstico in vitro de LEZM que comprende un paso de detección de la deleción comprendida entre las bases 99925039-101754718 localizadas en la región 7q22.1 , en la que se en la que se localiza al menos el gen CUX1, mediante la utilización de arrays genómicos de alta afinidad.
En una realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que la deleción se localiza entre las bases 99925039-101348479.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que la deleción se localiza entre las bases 100260234-100596921 y/o 101244026-101754718 de la región 7q22.1.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que en dichas regiones delecionadas se localizan los genes CUX1 y SH2B2.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que además en dicha región se localizan entre otros, los genes EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56, SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12 y MUCU.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que comprende además la detección de la deleción comprendida entre las bases 102949624- 145959694 en la región 7q22.2-q35 en la que se localizan, entre otros, los genes: RELN, LHFPL3, PBEF1, THAP5, IMMP2L, FOXP2, TES, MET, ST7, PTPRZ1, GRM8, UBE2H, MLKN1, BPGM, CALD1, PTN, SVOPL, AGK, KEL, TPK1 y CNTNAP2, mediante la utilización de arrays genómicos de alta afinidad.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que se realiza sobre una muestra de ADN seleccionada de: una muestra procedente de un tejido infiltrado con células de linfoma, de un aspirado de médula ósea o de una muestra de sangre total.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que los arrays genómicos de alta afinidad utilizados se seleccionan entre: BAC/PAC CGH-array, CGH-array Agilent, CGH-array NimbleGen, Tiling-array de NimbleGen específico del cromosoma 7 y CGH-array de NimbleGen de alta densidad específico de la región 7q22.1- q33.
Otro de los objetos de la presente invención se refiere a un método de diagnóstico in vitro de LEZM que mide el nivel de expresión de al menos el gen CUX1, localizado en la deleción de la región 7q22.1 comprendida entre las bases 99925039-101754718.
En una realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que mide el nivel de expresión del gen CUX1 localizado en la deleción de la región 7q22.1 entre las bases 99925039-101348479.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que mide el nivel de expresión del gen CUX1 localizado en la deleción de la región 7q22.1 entre las bases 101244026-101754718.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que mide el nivel de expresión de al menos uno de los genes CUX1 y SH2B2 localizados en la región 7q22.1 comprendida entre las bases 101244026-101754718.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que comprende además la medición del nivel de expresión de al menos uno de los genes seleccionados del grupo EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56 SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, MUCU lo cualquiera de sus combinaciones, localizados en la deleción de la región 7q22.1 comprendida entre las bases 99925039-101348479.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que se realiza sobre una muestra de ARN seleccionada de: una muestra procedente de un tejido infiltrado con células de linfoma, de un aspirado de médula ósea o de una muestra de sangre total.
Otro de los objetos de la presente invención se refiere a un método de diagnóstico in vitro de LEZM que comprende una combinación en cualquier orden, de un paso de detección de la deleción comprendida entre las bases 99925039-101754718 localizada en la región 7q22.1 , mediante la utilización de arrays genómicos de alta afinidad y otro paso que mide el nivel de expresión de al menos el gen CUX1.
En una realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que la deleción se localiza entre las bases 99925039-101348479.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que la deleción se localiza entre las bases 100260234-100596921 y/o 101244026-101754718 de la región 7q22.1.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que en el otro paso se mide el nivel de expresión del gen CUX1 y/o SH2B2.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que además comprende la medición del nivel de expresión de al menos uno de los genes seleccionados entre: EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56, SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12 y MUC17 y/o cualquiera de sus combinaciones.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza por que además comprende la detección de la deleción comprendida entre las bases 102949624- 145959694 en la región 7q22.2-q35 donde se localizan, entre otros, los genes: RELN, LHFPL3, PBEF1, THAP5, IMMP2L, FOXP2, TES, MET, ST7, PTPRZ1, GRM8, UBE2H, MLKN1, BPGM, CALD1, PTN, SVOPL, AGK, KEL, TPK1 y CNTNAP2, mediante la utilización de arrays genómicos de alta afinidad.
Otro de los objetos de la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico in vitro de LEZM que comprende un conjunto de sondas seleccionadas entre las comprendidas en el grupo SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, y/o cualquier otra sonda que hibride total o parcialmente sobre la deleción comprendida entre las bases 99925039-101754718 localizadas en la región 7q22.1 , mediante arrays genómicos de alta afinidad.
En una realización preferida, el kit de la invención se caracteriza por que el conjunto de sondas seleccionadas hibridan total o parcialmente sobre la deleción comprendida entre las bases 99925039-101348479.
En otra realización preferida, el kit de la invención se caracteriza por que el conjunto de sondas seleccionadas hibridan total o parcialmente sobre las deleciones comprendidas entre las bases 100260234-100596921 y/o 101244026-101754718 de la región 7q22.1. En otra realización preferida, el kit de la invención se caracteriza por que además comprende al menos una sonda que hibride total o parcialmente sobre la deleción comprendida entre las bases 102949624-145959694 en la región 7q22.2-q35, mediante arrays genómicos de alta afinidad, siendo preferentemente dicha sonda la definida como SEQ ID NO:4.
En otra realización preferida, el kit de la invención se caracteriza por que la sonda híbrida en la región 7q33.
Otro de los objetos de la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico in vitro de LEZM que detecta la expresión de al menos el gen CUX1, localizado en la deleción de la región 7q22.1 comprendida entre las bases 99925039-101754718, localizadas en la región 7q22.1 , mediante RT-PCR utilizando los cebadores definidos como SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:6.
En una realización preferida, el kit de la invención se caracteriza por que la detección de la expresión del gen CUX1 mediante RT-PCR utilizando los cebadores definidos como SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:6 se realiza en la región delecionada comprendida entre las bases 99925039-101348479.
En otra realización preferida, el kit de la invención se caracteriza por que la detección de la expresión del gen CUX1 mediante RT-PCR utilizando los cebadores definidos como SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:6 se realiza en la región delecionada entre las bases 100260234-100596921 y/o 101244026-101754718 de la región 7q22.1.
En otra realización preferida, el kit de la invención se caracteriza por que la detección de la expresión del gen CUX1 mediante RT-PCR también puede realizarse mediante los cebadores definidos como SEQ ID NOs: 23-24. Además, el kit de la presente invención detecta la expresión del gen SH2B2 utilizando los cebadores definidos como SEQ ID NO: 25 a 28.
En otra realización preferida, el kit de la invención se caracteriza por que además detecta la expresión de al menos uno de los genes seleccionados entre EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56, SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12 y MUC17 y/o cualquiera de sus combinaciones mediante cebadores específicos para las secuencias de dichos genes. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar la invención y no pretenden limitar el alcance de la misma. Ejemplo 1. Obtención de muestras de ADN de pacientes LEZM.
Para la obtención de los resultados mostrados en la presente invención se estudiaron un total de 78 pacientes diagnosticados de LEZM de acuerdo con los criterios propuestos por la Organización Mundial de la Salud. Del total de 78 pacientes había treinta y seis pacientes (56%) que eran mujeres. Las edades de los pacientes incluidos en el estudio variaban de 44-86 años (mediana 69 años). Del total de 78 pacientes se obtuvieron muestras de bazo, aspirado de médula ósea y sangre. El estudio fue aprobado por el comité ético de investigación. Se obtuvo consentimiento informado de cada paciente antes de entrar a formar parte del estudio.
Todo el ADN genómico puede obtenerse de muestras de bazo, ganglios linfáticos, aspirado de médula ósea o muestras de sangre total siempre y cuando haya infiltración por células de LEZM en cualquiera de los tejidos descritos. En la presente invención se ha utilizado ADN genómico extraído de muestras frescas congeladas de bazo de 53 pacientes utilizando el método estándar de fenol-cloroformo y de muestras de sangre periférica y/o médula ósea de los mismos pacientes, así como de los otros 25 pacientes. Las muestras de ADN control fueron aisladas a partir de muestras de placenta de donantes sanos. Todas las muestras de ADN se cuantificaron con el espectrofotómetro NanoDrop (ND-1000, Tecnologías NanoDrop, Wilmington, DE, EE.UU.). La calidad del ADN fue evaluada por la relación 260:280 y su integridad por la visualización en gel de agarosa con bromuro de etidio.
Ejemplo 2.- Análisis de las alteraciones genómicas en pacientes LEZM mediante el microarray genómicos de alta afinidad BAC/PAC CGH-array.
Una vez obtenido el ADN tanto de pacientes LEZM, como de los controles sanos, se procedió al análisis de las alteraciones genómicas que presentan los pacientes LEZM frente a los controles sanos, haciendo uso de la técnica de los microarrays genómicos de alta afinidad (CGH-array). Como metodología de confirmación de los resultados obtenidos mediante los microarrays genómicos de alta afinidad, se ha utilizado la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH).
Los microarrays genómicos de alta afinidad utilizados en la presente invención han sido: BAC/PAC CGH-array, Agilent CGH-array, NimbleGen CGH-array y Tiling path CGH- array específico del cromosoma 7.
El primer análisis realizado en las muestras de pacientes LEZM se llevó a cabo mediante la plataforma BAC/PAC CGH-array, en la que se analizaron los cambios en el número de copias de ADN de los pacientes LEZM frente a los controles sanos. El BAC/PAC CGH-array utilizado comprende 3523 clones procedentes de BACs (cromosoma artificial bacteriano) y PACs (cromosoma artificial derivado del bacteriófago P1), cubriendo todo el genoma con una resolución de 1 Mb. Dicho microarray de alta afinidad fue obtenido en el Centro de Investigación del Cáncer (Salamanca, España) como se describe (Robledo et al., 2009). Brevemente, en primer lugar se procedió a la preparación de los ADN genómicos de pacientes LEZM y controles sanos, para hibridar con el array. Para ello se sometieron 2 g ADN tumoral y control a una fragmentación mediante la digestión con la endonucleasa de restricción Dpnll (New England Biolabs, Beverly, MA), para posteriormente proceder a su purificación mediante centrifugaciones en gradiente decreciente de etanol. Las muestras de ADN genómico (pacientes y controles) digerido y purificado se marcaron mediante la técnica de Ramdom-Prime con el Kit de Mareaje Bioprimer Labelling kit (Invitrogen). Para el mareaje se utilizaron dos fluorocromos diferentes, Cy3-dCTP (Amersham Biosciences) para los controles y Cy5-dCTP (Amersham Biosciences) para las muestras a testar. La incorporación de nucleótidos marcados se cuantificó con el espectrofotómetro NanoDrop (ND-1000, Tecnologías NanoDrop, Wilmington, DE, EE.UU.).
Para la hibridación sobre el array, se mezclaron las muestras de ADN marcado junto con ADN competidor humano Cot-1 (Life Technologies), se mezclaron con solución de hibridación (50% formamida, 10% de sulfato de dextrano, 2X solución estándar salina de citrato, 10 mM Tris pH 7.6, 2,7% de Dodecil Sulfato Sódico (SDS) y 10 μς/μΙ de tARN de levadura) en el aparato para el procesamiento automatizado de arrays GeneTAC (Microgen) durante 48 horas a 42°C según el protocolo recomendado por el fabricante.
Una vez concluido el proceso de hibridación, el array fue escaneado en el escáner láser dual GenePix 4000B (Axon Instruments) y las imágenes fueron analizadas con el software Pro4.0 GenePix (Axon Instruments). La intensidad de las señales de fluorescencia obtenidas para cada punto fue calculada después de la sustracción del ruido de fondo. Los ratios de fluorescencia se normalizaron usando la mediana de los ratios de fluorescencia de cada punto computado como el valor log2.
Para validar el array se realizaron una serie de hibridaciones hombre vs mujer controles y además marcando el ADN empleado como control en las hibridaciones con las muestras a testar con los distintos fluorocromos, para eliminar los clones que en estas hibridaciones se encuentran alterados porque se considerarán que no se ven afectados por la enfermedad a analizar. Las ganancias y pérdidas en el número de copias de las regiones del ADN genómico obtenidas mediante la plataforma BAC/PAC CGH-array, se identificaron mediante la creación de umbrales de muestreo específicos, determinándose un valor de corte de 0,4 (Robledo C et al, Cáncer. 2009;115(16):3728-37).
Para determinar que un clon está alterado se calcula el promedio de los valores de los logaritmos de los ratios de la señal correspondiente al Cy5 (ADN tumoral) frente a la correspondiente al Cy3 (ADN control) de cada triplicado del clon. Los clones con valores de logaritmo por encima o debajo del valor de corte obtenido en el ADN de los controles (0,4) se consideró como ganancias o pérdidas respectivamente. Al menos, dos clones BAC/PAC contiguos con un ratio de log2 de -0.4 o menos se definió como una región "perdida" y áquellos con un ratio de log2 de +0.4 o más se definió como una región "ganada". Del análisis de array genómico se excluyen los puntos que tienen una intensidad baja de fluorescencia de los fluorocromos Cy3 o Cy5 (por debajo de R2<0.2) y una desviación estándar mayor o igual a 0.3. Aproximadamente, un 10% de los clones fueron excluidos del análisis.
Cada clon del BAC/PAC CGH-array se comparó con las bases de datos "Datábase of Genomic Variants" (www.project.tcag.ca; Noviembre de 2009) y con la base de datos de desequilibrios cromosómicos y fenotipo de humanos "Ensembl Resources" (http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher/; noviembre de 2009).
Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que en 57 (84%) de los 68 pacientes con LEZM se identificaron alteraciones cromosómicas mediante el array genómico de alta afinidad BAC/PAC CGH-array. La mediana de cambios por paciente fue de 4 (con un rango de 0-12). Las alteraciones genómicas más frecuentes mostradas en los pacientes analizados fueron ganancias en los cromosomas 4q22.1 (14/57; 25%), 1q21.3-q22 (12/57; 21 %), 6q25.3, 20q13.33 (11/57; 19%), 3q28, 22q (10/57; 18%), 6p21.1 , 11q12.2 (8/57; 14%) y pérdidas a nivel de los cromosomas 7q22.1 (28/57; 49%), 2q23.3-q24.1 (20/57; 35%), 17p13.3-p13.1 (18/57; 32%), 4q31.3-q32.1 (17/57; 30%), 7q22.2-q35 (16/57; 30%), 3p26.1 (14/57; 25%), 3q13.1 1 (13/57; 23%) y 18q12.1 (9/57; 16%) (Figura 1). Sólo tres casos mostraron pérdidas en el cromosoma 14q y solamente un caso tenía trisomía del cromosoma 12. Además, se delimitó un segmento crítico delecionado en 18 pacientes (32%) en el cromosoma 17p13.1 , donde está localizado el gen TP53, que es un gen supresor tumoral, implicado en procesos de inducción de respuesta celular ante daños en el ADN, deteniendo incluso el ciclo celular en caso de mutaciones.
En los 19 pacientes que no mostraron alteraciones en el cromosoma 7q la mediana de cambios fue de 4 (rango 1-8) y las ganancias más frecuentes se localizaron a nivel de 1q21.3-q22, 20q13.33 (42%), 6q25.3, 22q (37%), 6p21.1 , 11q12.2 (26%) y 10q22.3 (21%) mientras que las pérdidas en 2q23.3-q24.1 (37%), 4q31.3-q32.1 (26%), 3p26.1 (21 %), 6q, 14q31.1-q32.11 (16%) y 8p23.2-p12 (10%) (Figura 2).
Ejemplo 3.- Validación de las regiones perdidas identificadas mediante BAC/PAC CGH-array mediante la técnica FISH.
Como metodología de confirmación de los resultados obtenidos mediante el microarray de alta afinidad BAC/PAC CGH-array, se llevaron a cabo experimentos de FISH en un total de 20 pacientes diagnosticados de LEZM. Mediante la técnica de FISH se puede observar, mediante microscopía de fluorescencia, si una región está o no delecionada, ya que la región cromosómica con la que híbrida cada una de las sondas utilizadas, está duplicada en cada una de las células, si dicha zona no está delecionada, debe observarse en la célula dos señales con el color correspondiente al fluoróforo con el que se haya marcado dicha sonda. En cambio, si está delecionada, únicamente se observará una única señal del color correspondiente al fluoróforo con el que se haya marcado dicha sonda.
En todos los casos el análisis mediante FISH confirmó los resultados obtenidos por
CGH-array: deleción en la región 7q. Para corroborar más específicamente dichos resultados, se eligieron 8 pacientes LEZM, tres de ellos que mostraron pérdidas en la región 7q mediante el BAC/PAC CGH-array y otros cinco que no mostraron cambios genéticos en dicha región. El único criterio de selección de los pacientes estaba basado en la disponibilidad de la muestra (secciones de bazo embebidos en bloques de parafina). Las sondas empleadas para la hibridación fueron los clones de los BACs: RP11-44M6 situado en la banda del cromosoma 7q22.1 (99873610-100038722 pb), RP11-333G13 situado en 7q22.1 (101175494-101390682 pb), RP11-36B6 localizado a nivel de 7q31 .31 (130078078- 130270796 pb) y RP11-371 N6 localizado en 7q33 (134684519-134842787 pb) como se describe previamente (González MB et al,. Cáncer Genet Cytogenet. 2004 ; 150(2) : 136-43) . Estos clones fueron seleccionados de la colección de clones BAC/PAC CGH-array (Wellcome Trust Sanger Institute, de Cambridge, Reino Unido), y se marcaron mediante el procedimiento de "traslado de la muesca" (nick translation), utilizando los fluoroforos: Spectrum Green o Spectrum Orange, siguiendo las instrucciones del fabricante (Abbot Laboratories).
En siete de los ocho pacientes se analizó la región 7q22.1 mediante FISH. Cuatro de dichos pacientes mostraron una pérdida en dicha región, cuando se les analizó mediante la técnica BAC/PAC CGH-array, resultado que se corroboró mediante la técnica FISH, mientras que los restantes tres pacientes no presentaron pérdida ni mediante la técnica BAC/PAC CGH-array ni mediante FISH.
Por otro lado, en otros cuatro pacientes se analizó la región 7q33.1 mediante FISH. Dos de los pacientes con LEZM, mostraron deleciones mediante ambas técnicas: BAC/PAC CGH-array y FISH. Los dos pacientes restantes no mostraron alteraciones en la región de 7q33.1 por ninguna de las dos técnicas empleadas, BAC/PAC CGH-array ni FISH.
Ejemplo 4.- Análisis de los LEZM mediante plataformas comerciales de CGH-array.
Para definir de una manera más precisa las zonas delecionadas en la región 7q de pacientes LEZM, se utilizaron dos plataformas de CGH-arrays comerciales que presentaban una mayor afinidad y resolución que la técnica BAC/PAC CGH-array. Estas plataformas son Agilent Human Genome CGH Microarray 44K y NimbleGen human CGH 4x72K Whole Genome v2.0 array.
Se hi bridaron muestras de ocho pacientes con LEZM en el microarray Agilent de 44
K. La plataforma de Agilent contiene 44.255 sondas sintetizadas in situ y espaciadas a intervalos de 43.000 pb en todo el genoma humano, incluyendo además, 3.877 sondas como control. El microarray se diseñó para estudiar los cambios en el número de copias y representa la mayor parte de los genes humanos conocidos. Las sondas, además, son enriquecidas con genes relevantes en las patologías oncológicas, representando tanto a las secuencias codificantes como a las no codificantes de los cromosomas. Se ha usado ADN genómico humano de placenta como control y se ha seguido el protocolo recomendado por Agilent. Los arrays fueron escaneados mediante el escáner de Agilent. La extracción, filtrado y normalización de los datos obtenidos, se llevó a cabo utilizando el software Feature Extraction software (Agilent Technologies). Posteriormente se utilizó el software Agilent CGH Analytics Software 3.4 (Agilent Technologies) para exportar los datos del array y poderlos analizar mediante el software Nexus Copy Number Professional trial software (versión 4, BioDiscovery Inc) (Baumbusch LO et al,. BMC Genomics. 2008;8;9:379).
Para llevar a cabo la técnica del microarray NimbleGen human de 72K, se seleccionaron once pacientes con LEZM. Como ADN genómico control, se utilizó ADN de placenta humano. Para llevar a cabo la obtención de los resultados se siguieron las instrucciones del fabricante. Brevemente, 500 ng de ADN tumoral de pacientes LEZM y de controles sanos, se marcó con los fluorocromos Cy3 y Cy5, respectivamente. El ADN marcado fluorescentemente se híbrido al microarray NimbleGen que posee 71.341 sondas de oligonucleótidos espaciadas aproximadamente a intervalos de 40.000 bp a lo largo de todo el genoma humano. Producida la hibridación, se procedió al lavado y escaneado del array a una resolución de 10 μΐη usando el escáner dual GenePix 4000B (Axon Instruments). Los datos fueron obtenidos mediante el software NimbleScan v2.5 (NimbleGen System, Inc), que permite la alineación automática de los resultados, su extracción y la generación de archivos de datos útiles para su análisis (Selzer RR et al,. Genes Chromosomes Cáncer. 2005 Nov;44(3):305-19).
Las metodologías de CGH-arrays empleadas hasta ahora en la presente invención,
BAC-CGH array, Agilent Human Genome CGH Microarray 44K y NimbleGen human CGH 4x72K Whole Genome v2.0 array, confirmaron la existencia de alteraciones en el genoma de pacientes con LEZM. Estas alteraciones fueron principalmente, ganancias a nivel de los cromosomas 3, 6p22.1-p21.1 , 8q, 17q, 18 y pérdidas a nivel de los cromosomas 4q28.3- q31 .23, 10q24.33-q25.3 y 1 7p1 3.3-p13.1. Además, estos CGH-arrays pusieron de manifiesto la existencia de un paciente con trisomía en los cromosomas 3, 12 y 18. Tanto los arrays genómicos con ADN de BACs como los que tienen oligonucleótidos como sondas diana de hibridación, Agilent 44K y NimbleGen 72K, mostraron alteraciones en el brazo largo del cromosoma 7, quedando demostrado por tanto, mediante tres técnicas diferentes, la existencia de deleciones en el brazo largo del cromosoma 7. Posteriormente se procedió al análisis pormenorizado de dicho cromosoma 7 mediante un array de alta afinidad específico del mismo. Ejemplo 5.- Análisis detallado del cromosoma 7.
El análisis detallado del cromosoma 7 mediante el "Tiling-array" de NimbleGen 385K, se realizó para redefinir la región específica delecionada en los pacientes con LEZM. El "Tiling-array" del cromosoma 7 se realizó con 4 muestras procedentes de pacientes con LEZM (tres de ellos con pérdidas confirmadas por los métodos anteriores en la región 7q22.1 , y el otro paciente LEZM sin anomalías en la región 7q22.1). Este "tiling-array" del cromosoma 7 se diseñó específicamente a una alta resolución y con un fino análisis resolutivo que comprendía las bases 117.711-158.805.222 pb de todo el cromosoma 7. Este "tiling-array" del cromosoma 7 fue diseñado mediante la tecnología de síntesis de array sin máscara (NimbleGen Systems, Inc.), con un máximo de 385.110 oligonucleótidos o sondas, con una mediana de separación entre sondas de 311 pb, lo que permite un profundo mapeo de toda la región. El diseño de alta resolución permite diseñar oligonucleótidos que estén colocados a menudo solapándose unos con otros para así obtener una elevada resolución de la zona a analizar, en la presente invención, de todo el cromosoma 7.
LLevado a cabo el procedimiento de hibridación, el array se escaneó a una resolución de 5 μΐη utilizando el escáner NimbleGen MS 200 Microarray (Roche NimbleGen Instruments). Los datos fueron extraídos de las imágenes escaneadas utilizando el software NimbleScan v2.5 (NimbleGen system, Inc), que permite la automática alineación de los datos y su extracción, generando un archivos de datos útiles para su análisis.
Mediante el análisis de los pacientes LEZM con el "tiling-array" específico del cromosoma 7 de NimbleGen, se detectaron que 3 de los 4 pacientes incluidos en este estudio mostraron pérdidas a nivel de 7q22.1 (Figura 3).
Analizando los resultados obtenidos de todos los ensayos CGH-array realizados en las muestras de los pacientes con LEZM, y específicamente teniendo en cuenta los datos obtenidos mediante el Tiling array específico del cromosoma 7, se pone de manifiesto que la deleción mayoritaria en los pacientes con LEZM -un 49% de los pacientes analizados la presentan (27 de 57 casos)- se localiza en la banda 7q22.1 y se encuentra mapeados por los clones o sondas de los BAC/PAC CGH-array: BAC RP11-44M6 (SEQ ID NO:1), PAC RP5-1059M17 (SEQ ID NO: 2) y BAC RP11-333G13 (SEQ ID NO:3), más específicamente entre las bases 99925039-101348479, dónde se localizan los genes EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56, SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, MUC17, CUX1 y SH2B2. Esta región tiene un tamaño aproximado de 1.4 Mb.
La precisa detección de la región delecionada en la banda 7q22.1 , que implica las bases 99925039-101348479, ha sido posible gracias a la diferencia existente entre los límites de resolución de las diferentes metodologías utilizadas: BAC/PAC CGH-array, Agilent 44K, NimbleGen 72K y "tiling-array" específico del cromosoma 7 de 385K. Como se puede apreciar en la Figura 3, mediante el "tiling-array" específico del cromosoma 7, la región queda mucho mejor cartografiada debido a que el número de oligonucleótidos que detectamos para dicha región, es mucho mayor que con los otros arrays, 3.553 oligonucleótidos (Figura 4C) frente a los 53 del NimbleGen 72K (Figura 4B) o los tres clones del BAC/PAC CGH-array (Figura 4A). Por lo tanto con el análisis del "tiling-array" específico del cromosoma 7 se puede detectar con mayor precisión la localización exacta de la deleción que se produce en la banda del cromosoma 7q22.1.
La Figura 4A muestra el resultado del BAC/PAC CGH-array en muestras de tres pacientes, observándose que en dichos pacientes había una pérdida mostrada en negro en la región 7q22.1 , mientras que en el control no se observa cambio. La región 7q22.1 en este array estaba mapeada por 3 clones con una resolución de 1 Mb. En la Figura 4B se muestra el resultado del array NimbleGen 72K que tiene una resolución de 42 kb, y la región 7q22.1 estaba cubierta por 53 oligos, en muestras de 3 pacientes con LEZM. Los resultados obtenidos muestran que los pacientes mostraban pérdidas a este nivel, mientras que el control no mostró cambios. En la Figura 4C se muestran los resultados obtenidos mediante el array NimbleGen 385K, mostrando un zoom del área de supresión (7q22.1). Como puede observarse, la región 7q22.1 estaba mapeada por más de 3.500 oligos y pudo delimitarse la región comúnmente delecionada a este nivel entre los locis D7S2120E y D7S740. Por lo tanto, el "tiling-array" específico del cromosoma 7 permite detectar con mayor precisión la localización exacta de la deleción que se produce en la banda del cromosoma 7q22.1.
Mediante el método de la invención, también se ha puesto de manifiesto la deleción en una región más distal del cromosoma 7, la región 7q22-q35, entre las bases 102949624- 145959694. En esta región de 43,15 Mb de tamaño localizada entre los BACs RP4-672011 y RP4-558L10 se localizan varios genes como por ejemplo: RELN, LHFPL3, PBEF1, THAP5, IMMP2L, FOXP2, TES, MET, ST7, PTPRZ1, GRM8, UBE2H, MLKN1, BPGM, CALD1, PTN, SVOPL, AGK, KEL, TPK1 y CNTNAP2. Dicha región se detecta mediante, entre otros, el clon o sonda del BAC/PAC CGH-array: BAC RP11-371 N6 (SEQ ID NO:4) localizada en 7q33 (135034979-135191247). Así, mediante el empleo conjunto de las sondas que reconocen la deleción específica de la región 7q22.1 , definidas como SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO:3, junto con el empleo de la sonda que reconoce la deleción de la región 7q33, definida como SEQ ID NO:4, se podría conseguir el aumento en el número de pacientes con LEZM diagnosticados.
Los resultados obtenidos mediante el empleo de plataformas comerciales, Nimblegen, Agilent, y los BAC/PAC CGH-array confirman la pérdida parcial del cromosoma 7 como el cambio más frecuente en los pacientes con LEZM. Además, ponen de manifiesto la existencia de una nueva región comúnmente delecionada en pacientes con LEZM, lo que le permite ser útil para su uso en clínica, situada a nivel de la banda 7q22.1 , en un 49% de los pacientes analizados. En esta región específica delecionada en pacientes LEZM, localizada entre las bases 99925039-101348479 de la región 7q22.1 , se localizan los genes: EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56, SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, MUC17, CUX1 y SH2B2. El análisis de expresión de dichos genes en pacientes LEZM frente a controles sanos o pacientes aquejados de otros tipos de linfomas, permitirá detectar si alguno de los mismos puede ser utilizado como marcador diagnóstico para dicha enfermedad. Ejemplo 6.- Análisis de la pérdida de heterocigosidad (LOH)
Para corroborar los resultados obtenidos mediante los arrays genómicos de alta afinidad, descritos en los ejemplos previos, se llevó a cabo un análisis de LOH en la región delecionada 7q22.1 en pacientes LEZM. La técnica de LOH constituye también uno de los métodos más ampliamente utilizados en el estado de la técnica, desde el punto de vista molecular, para determinar la pérdida de material genético (Mateo M, et al. Am J Pathol. 1999;154:1583-1589).
La LOH haciendo uso de marcadores microsatélites detecta la pérdida relativa de un alelo en una muestra tumoral en relación a una muestra no tumoral del mismo paciente que presenta ambos alelos. En la presente invención, la definición de la pérdida alélica se limitó a los marcadores informativos. Los marcadores fueron considerados informativos cuando se detecta heterocigosidad en muestras de tejido de control normal lo que se traduce en la presencia de dos bandas en el gel de agarosa correspondientes a dos alelos diferentes. Cuando un paciente presente LOH el producto de PCR obtenido solo mostrará una banda de amplificación, correspondiente a uno de los alelos, al estar el otro delecionado en la muestra tumoral, mientras que en la muestra no tumoral, se mostrarán los dos alelos como dos bandas de amplificación (Figura 5).
Para la determinación de la pérdida de heterocigosidad se analizaron las repeticiones de dinucleótidos mediante la técnica de PCR en 6 pacientes diagnosticados de LEZM, seleccionándose 7 marcadores de microsatélites localizados en el cromosoma 7. Los marcadores se seleccionaron a partir de las bases de datos Genethon, GDB y RHdb. La localización de los marcadores en el genoma (NCBI36/HG18) se realizó mediante Electronic- PCR (e-PCR). (Schuler GD. Sequence Mapping by Electronic PCR. Genome Res. 1997; 7:541- 550). Los marcadores microsatélites utilizados para definir con mayor precisión aún la región delecionada a nivel de 7q22.1 del cromosoma 7 en pacientes con LEZM se describen en la Tabla 2. Tabla 2. Marcadores seleccionados para la amplificación de los microsatélites.
Marcador Banda Tamaño Localización
Secuencias microsatélite cromosómica amplicones (pb) (Pb)
D7S527 7q21.3 273-297 95.453.048 SEQ ID NO 9-10
D7S2480 7q22.1 189-225 99.893.591 SEQ ID NO 11-12
D7S662 7q22.1 204-234 100.950.585 SEQ ID NO 13-14
D7S2536 7q22.1 118-141 101.235.892 SEQ ID NO 15-16
D7S515 7q22.1 128-190 101.490.495 SEQ ID NO 17-18
D7S500 7q33 188-210 134.759.259 SEQ ID NO 19-20
D7S550 7q36.3 177-200 155.210.270 SEQ ID NO 21-22
La técnica de PCR se llevó a cabo en un volumen de 25 μΙ conteniendo 30-50 ng/μΙ de ADN molde, 5x PCR buffer (Promega, Madison Wl, USA), 25 mM gC (Promega, Madison Wl, USA), 2,5 mM de la mezcla de nucleótidos (dNTPs: dATP, dGTP, dCTP y dTTP; Roche Diagnostics, Indianapolis IN, USA), 10 μΜ cada uno de los cebadores utilzados para la identificación de cada microsatélite y 1 unidad de Taq DNA polymerase (Promega, Madison Wl, USA). Las condiciones de la PCR fueron: 94°C durante 5 minutos, 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 55-65°C (dependiendo del cebador) durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos y finalmente 72°C durante 5 minutos y finalmente las muestras se mantuvieron a la temperatura de 4°C. Los productos de la PCR obtenidos se separaron en un gel de agarosa al 3% (MS6 Metagel, Conda, Madrid, España). Los resultados obtenidos en el análisis de LOH pusieron de manifiesto que de los 6 pacientes analizados, 4 pacientes presentaban LOH en el locus 7q22.1 (67%). Asimismo, la técnica de LOH puso de manifiesto que, para los marcadores D7S662, D7S2536 y D7S515 localizados en las posiciones 100.950.585, 101 .235.892 y 101 .490.495, respectivamente, de la región 7q22.1 , el porcentaje de pérdidas fue del 50%, 20% y 60% respectivamente (Figura 6).
Estudios previos en los que se analizaron 13 marcadores microsatélites que cubrían desde la región 7q21 hasta la región 7q36 del cromosoma 7, se detectó que el marcador D7S487 situado en 7q31 .3 fue el que se perdía con más frecuencia (45%) mientras que el marcador microsatélite D7S518 situado en la región 7q22.1 no mostró LOH en ninguno de los casos analizados (Mateo M, et al.. Am J Pathol. 1999;154:1583-1589). En la presente invención, al analizar con una mayor profundidad la región 7q22.1 , se detectó la pérdida de heterocigosidad en los marcadores microsatélites D7S527 (7q21 .3), D7S662 (7q22.1 ), D7S2536 (7q22.1 ) y D7S515 (7q22.1 ) (Figura 6). Destacar que dos de los marcadores utilizados en el presente análisis de LOH se localizan en el gen CUX1 situado en la región delecionada 7q22.1 de pacientes con LEZM, específicamente los marcadores microsatélites D7S515 (en el intrón 3 del gen CUX1) y D7S6626 CUX1 (en el intrón 6 del gen CUX1).
Ejemplo 7.- Análisis detallado de la región 7q22.1 a 7q33.1 del cromosoma 7 mediante un array de alta densidad.
En los ejemplos mostrados anteriormente se pone de manifiesto que los pacientes con LEZM presentan una deleción específica en la región 7q22.1 del cromosoma 7 humano, específicamente entre las bases 99925039-101348479 y además dichos pacientes también presentan LOH detectada mediante los marcadores microsatélites D7S662 (7q22.1 ), D7S2536 (7q22.1) y D7S515 (7q22.1 ). Para concretar con mayor exactitud la región específica delecionada en 7q22.1 que presentan dichos pacientes se procedió al análisis de la misma mediante el diseño de un CGH-array específico de alta afinidad y alta densidad encargado a la empresa NimbleGen System, Inc. Dicho CGH-array comprende sondas que se extienden desde la banda citogenética 7q22.1 hasta la banda citogenética 7q33 (ambas incluidas) (Chr7:99.158.389-137.302.483). Dicho CGH-array de alta densidad incluye 710.953 sondas con un tamaño medio de sonda de 54 nucleótidos (rango: 49-74) y una distancia media de -0.7 pb (rango: (-51) - 59217 pb) entre las sondas. Este CGH-array permite cartografiar dicha región del genoma con una precisión muy elevada. Dicho CGH-array de alta densidad se utilizó para el análisis de un total de 15 muestras de pacientes con LEZM, 2 pacientes con leucemia linfocítica crónica (LLC) y un paciente control sano. El 46% de los pacientes con LEZM analizados (7/15) mostraron pérdidas en la región 7q22.1 pudiéndose localizar dichas pérdidas más frecuentemente en dos regiones muy específicas. La primera de las regiones donde se localizaron más frecuentemente dichas pérdidas en los pacientes con LEZM comprende las bases 100.260.234-100.596.921. La segunda de las regiones en la que también se localizaron frecuentes pérdidas en los pacientes con LEZM se localiza entre las bases 101.244.026-101.754.718 (Tabla 3). Por tanto, mediante el presente CGH-array se ha conseguido localizar dos regiones específicas delecionadas en pacientes LEZM en la región 7q22.1 , reduciéndose además el tamaño de 1.4 Mb hasta un tamaño, entre ambas regiones de 0.,84 Mb.
Tabla 3. Localización de las regiones de pérdida genética determinadas por el array de alta densidad.
Región del Chr 7 Casos con pérdida
(n=15)
100.260.234-100.262.201 7 100.288.318-100.289.733 6 100.398.197-100.398.435 6 100.593.128-100.593.653 7 100.595.970-100.596.921 6 101.588.268-101.588.318 4 101.698.131-101.698.723 4 101.713.340-101.713.623 3
Ejemplo 8.- Análisis de la expresión génica de CUX1, SH2B2 y MUC3 en pacientes LEZM.
Como se ha mencionado anteriormente, en la región 7q22.1 se localizan gran número de genes. Específicamente, en la región delecionada comprendida entre las bases 100.260.234-100.596.921 de la región 7q22.1 del cromosoma 7, se localizan los genes: EPHB4, SLC12A9, RIP6, SRRT, UFSP1, ACHE, MUC3A/B, MUC12, MUC17, TRIM56, SERPINE1, AP1S1 y VGF. Por otro lado, en la segunda región delecionada comprendida entre las bases 101.244026-101.754.718 de la misma región, 7q22.1 , se localizan los genes CUX1 y SH2B2.
La proteína que codifica el gen CUX1 es un miembro de la familia de las proteínas de unión a ADN. Puede regular la expresión genética, la morfogénesis y la diferenciación y puede tener un papel en la progresión del ciclo celular. En pacientes con enfermedad mieloide como los síndromes mielodisplásicos o la leucemia mielomonocítica juvenil se observó que era frecuente la monosomía del cromosoma 7, con una pérdida de los genes de la región de 7q22 entre los que se encuentra CUX1, y sin embargo, los análisis mutacionales no revelaron mutaciones patológicas en ninguno de los casos analizados, por lo que se concluyó que era improbable que este gen tuviese un papel importante en este tipo de neoplasias.(Hindersin,S et al, Leuk.Res.2007; 31 :1323-1324). Hasta la fecha los estudios realizados en los LEZM no han podido relacionar la expresión del gen CUX1 con este tipo de neoplasia. Por otro lado, el gen SH2B2 codifica para una proteína de adaptación de algunos miembros de la familia de receptores tirosina-kinasa y está involucrada en múltiples vías de señalización celular, preferentemente de células B (Masanori Iseki et al. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2000:272,45-54). El análisis de la expresión de dicho gen en diferentes tipos de tumores sólidos como el cáncer de esófago, de pulmón y de riñon, puso de manifiesto que el gen SH2B2 no se expresó en la mayoría de las líneas celulares tumorales analizadas. Sin embargo, se observó una expresión muy elevada en una gran variedad de tejidos normales. (Yokouchi et al. Oncogene. 1999:18,759-767). Por lo tanto, tampoco existe un papel claro para dicho gen en la génesis o desarrollo de LEZM.
En la presente invención se procedió al análisis de la expresión génica de los genes CUX1, SH2B2 y MUC3 mediante RT-PCR en muestras de bazo, aspirado de médula ósea y sangre periférica de 16 pacientes LEZM y en muestras de 6 individuos control sanos. Mediante la técnica de RT-PCR, también conocida como "Reacción en cadena de la polimerasa", por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), se pretende obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. El material procedente de estos enfermos fue congelado en trizol (Invitrogen Life Technologies, Gaithersburg, MD) a -80°C para extraer el ARN total. Posteriormente se procedió a su purificación del ARN mediante las columnas RNeasy® Mini, (Qiagen, Valencia, CA) para eliminar los restos de ADN o de proteínas que hubieran podido quedar y que pudieran interferir en el paso de este ARN a ADNc. Una vez purificado es conveniente evaluar la integridad del ARN obtenido midiendo su cantidad y calidad utilizando el sistema de Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Palo Alto, CA) con el kit ARN 6000 Nano LabChip. Para la síntesis del ADNc se empleó el kit comercial Superscript III (SuperScript® III First-Strand Synthesis SuperMix para qRT-PCR, Invitrogen). En todos los casos se partió de 1 g de ARN total. Una vez obtenido el ADNc se purificó mediante el kit ADNc Cleanup (Affymetrix sample Cleanup Module Kit).
Los cebadores utilizados para obtener el ADNc se diseñaron mediante el programa "Primer Express 3.0" (Applied Biosystems). Además, con el programa "Oligoanalyzer" se observó que no formasen dímeros y finalmente, se comprobó su especificidad con el programa NCBI BLAST. En la Tabla 4 se describen los cebadores seleccionados para la realización del análisis de la expresión de los genes CUX1, SH2B2 y MUC3, utilizándose como control la expresión del gen ABL. Como se puede observar en dicha Tabla 4 se analizó la expresión de cada uno de los genes en diferentes regiones exónicas de los mismos.
Tabla 4. Cebadores diseñados para el análisis de RT-PCR
Figure imgf000029_0001
Para optimizar la temperatura de anillamiento de los cebadores diseñados, se realizó una prueba de gradiente de los mismos en el iCycler (Biorad) con un ADNc control procedente de la línea celular de Mieloma Múltiple (RPMI). Además, se utilizó el gen control ABL que mediante la detección de fluorescencia con el SYBR Green (Applied Biosystem) y el método de análisis Pfaffl (Pfaffl MW, Nucleic Acids Res. 2001 May 1 :e45) determinaron la cuantificación relativa de la sonda diana en comparación con el gen de referencia. Brevemente, en el método de análisis de Pfaffl las muestras se analizan por triplicado; se emplearon 10 ng/pocillo de cada muestra; se utilizó para cada gen un control positivo (ADNc control) y un control negativo (H2O). La reacción se realizó a la temperatura óptima de cada cebador determinada por la prueba de gradiente. La reacción de PCR se preparó añadiendo los cebadores correspondientes a cada gen (sentido y antisentido), el ADNc, el 2xFast SYBR Green (Applied Biosystem) y el H2O hasta completar un volumen final de 25 μΙ. Una vez preparada la placa se introdujo en el termociclador para seguir el protocolo de la PCR y su posterior análisis.
Los resultados obtenidos se expresaron en términos relativos (Ct, Threshold cycle) en función de la expresión del gen control ABL.
Los resultados obtenidos muestran que la expresión del gen MUC3 no se modifica en los pacientes con LEZM respecto a los controles sanos. En cambio, la expresión de los genes CUX1 y SH2B2 se encuentra diferencialmente expresada en pacientes con LEZM respecto a sujetos control sanos. El gen CUX1 muestra que se encuentra infra-expresado en muestras de bazo, de aspirado de médula ósea y de sangre periférica de pacientes LEZM respecto a los sujetos control (Figura 7). Por otro lado, el análisis de expresión del gen SH2B2 pone de manifiesto que se encuentra sobre-expresado en muestras de bazo y de médula ósea de pacientes LEZM respecto a sujetos control.
Una vez analizada la expresión de los genes mencionados anteriormente se procedió a la secuenciación automática de los mismos para analizar la presencia de posibles alteraciones en dichas secuencias que pudiesen dar lugar a un polimorfismo específico de pacientes con LEZM respecto a sujetos control sanos. Se analizaron un total de 23 muestras de ADN de pacientes diagnosticados de LEZM y 14 muestras de ADN de individuos control sanos. En primer lugar se procedió a la amplificación, mediante la técnica de PCR, del fragmento del ADN genómico correspondiente a las regiones específicas de los genes CUX1 y MUC3. Tomando como referencia las sondas de Nimblegen para dichos genes, cuya anotación corresponde a NCBI36/HG18hg18 identificamos la región específica donde se localizaban los genes mencionados anteriormente y se diseñaron varias parejas de cebadores específicos de la región 7q22.1 (Tabla 5) que se utilizaron para secuenciar y buscar alteraciones genéticas relacionadas con el desarrollo de los linfomas esplénicos.
Tabla 5. Cebadores diseñados para los estudios de secuenciación automática
Figure imgf000031_0001
Una vez llevada a cabo la PCR, se procedió a la separación de los productos obtenidos en un gel de agarosa al 1-2% y posteriormente se procedió a la purificación de cada fragmento aislado mediante el kit "High Puré Product Purification Kit" (Roche).
La secuenciación de cada fragmento se llevó a cabo utilizando los cebadores con los que se realizó la amplificación mediante la técnica de PCR. Se secuenciaron cada uno de los ADN de las muestras, tanto de los sujetos control como de pacientes LEZM, empleándose de 40-60 ng de cada fragmento en un volumen final de 8 μΙ. Se preparó una muestra con el cebador sentido y otra con el antisentido a una concentración de 3 pmol cada uno en un volumen de 2 μΙ. Por tanto, cada fragmento aislado se secuenció con cada cebador obteniéndose varias secuencias para cada uno de los ADNs analizados. La reacción de secuenciación se llevó a cabo en un secuenciador ABI 3130x/ (Applied Biosystems) en el Servicio de Secuenciación del Centro de Investigación del Cáncer de Salamanca (CIC). A continuación, las secuencias se analizaron utilizando el paquete informático DS GENE 1 .5 (Discovery Studio Gene v1.5, Accelrys Inc) y visualizando el electroferograma (gráfico de una secuencia de ADN obtenido por electroforesis). Tras el análisis de los electroferogramas se procedió al alineamiento de las secuencias obtenidas con las secuencias consenso tomadas de las bases de datos (NCBI/HG18). El alineamiento y el análisis de similitud de las secuencias se realizaron con Clustal W y BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). El análisis de secuenciación de la región en 7q22.1 en donde se localiza el gen MUC3 (Cromosoma 7:100387324-100388418) tiene un tamaño total de 1140 pares de bases. Los resultados pusieron de manifiesto que en dicha región existían 5 polimorfismos que eran igual de frecuentes en los pacientes con LEZM que en los controles sanos analizados, pudiéndose concluir por tanto, que son polimorfismos poblacionales y no debidos a la enfermedad.
En el análisis de secuenciación del gen CUX1 se localizaron alteraciones genéticas en la secuencia de las bases nucleotídicas no descritas previamente en el estado de la técnica, en la secuencia de dicho gen en pacientes LEZM y en sujetos control sanos. Una de dichas alteraciones genéticas se localizó en el intrón 1 de dicho gen y se corresponde con la inserción de una timina y una citosina en las posiciones 101345904 y 101345905 del genoma de referencia (Figura 11 A) y que no aparece en la secuencia consenso utilizada para su comparación tomada de la base de datos (NCBI/HG18). Además, en el exón 3 de este mismo gen se detectaron otras alteraciones genéticas tampoco referidas en el estado de la técnica hasta la presente invención. Dichas variaciones correspondieron a una mutación en la posición 101458144 del genoma de referencia de la secuencia de dicho gen en los pacientes LEZM respecto a la secuencia consenso utilizada para su comparación tomada de la base de datos (NCBI/HG18) (Figura 11 B).

Claims

REIVINDICACIONES
1. -Método de diagnóstico in vitro de LEZM que comprende un paso de detección de la delecion comprendida entre las bases 99925039-101754718 localizadas en la región 7q22.1 , en la que se localiza al menos el gen CUX1, mediante la utilización de arrays genómicos de alta afinidad.
2. - Método según la reivindicación 1 caracterizado por que la delecion se localiza entre las bases 99925039-101348479.
3. - Método según la reivindicación 1 caracterizado por que la delecion se localiza entre las bases 100260234-100596921 y/o 101244026-101754718 de la región 7q22.1.
4. - Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 caracterizado por que en dichas regiones delecionadas se localizan los genes CUX1 y SH2B2.
5. - Método según las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado por que además en dicha región se localizan entre otros, los genes EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56, SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12 y MUC17.
6. - Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende además la detección de la delecion comprendida entre las bases 102949624-145959694 en la región 7q22.2-q35 en la que se localizan, entre otros, los genes: RELN, LHFPL3, PBEF1, THAP5, IMMP2L, FOXP2, TES, MET, ST7, PTPRZ1, GRM8, UBE2H, MLKN1, BPGM, CALD1, PTN, SVOPL, AGK, KEL, TPK1 y CNTNAP2 mediante la utilización de arrays genómicos de alta afinidad.
7. - Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado por que se realiza sobre una muestra de ADN seleccionada de: una muestra procedente de un tejido infiltrado con células de linfoma, de un aspirado de médula ósea o de una muestra de sangre total.
8. - Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado por que los arrays genómicos de alta afinidad utilizados se seleccionan entre: BAC/PAC CGH-array, CGH- array Agilent, CGH-array NimbleGen, Tiling-array de NimbleGen específico del cromosoma 7 y CGH-array de NimbleGen de alta densidad específico de la región 7q22.1-q33.
9. - Método de diagnóstico in vitro de LEZM que mide el nivel de expresión de al menos el gen CUX1, localizado en la deleción de la región 7q22.1 comprendida entre las bases 99925039-101754718.
10.- Método según la reivindicación 9 caracterizado por que mide el nivel de expresión del gen CUX1 localizado en la deleción de la región 7q22.1 entre las bases 99925039- 101348479.
11. - Método según la reivindicación 10 caracterizado por que mide el nivel de expresión del gen CUX1 localizado en la deleción de la región 7q22.1 entre las bases 101244026-
101754718.
12. - Método según la reivindicación 9 caracterizado por que mide el nivel de expresión de al menos uno de los genes CUX1 y SH2B2 localizados en la región 7q22.1 comprendida entre las bases 101244026-101754718.
13. - Método según las reivindicaciones 9 a 12 que comprende además la medición del nivel de expresión de al menos uno de los genes seleccionados del grupo EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56, SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, MUC17 y/o cualquiera de sus combinaciones, localizados en la deleción de la región 7q22.1 comprendida entre las bases 99925039-101348479.
14. - Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 caracterizado porque se realiza sobre una muestra de ARN seleccionada de: una muestra procedente de un tejido infiltrado con células de linfoma, de un aspirado de médula ósea o de una muestra de sangre total.
15. - Método de diagnóstico in vitro de LEZM que comprende una combinación en cualquier orden, de un primer paso de detección de la deleción comprendida entre las bases 99925039-101754718 localizada en la región 7q22.1 , mediante la utilización de arrays genómicos de alta afinidad y otro segundo paso que mide el nivel de expresión de al menos el gen CUX1.
16. - Método de diagnóstico según la reivindicación 15 caracterizado por que la deleción se localiza entre las bases 99925039-101348479.
17.- Método de diagnóstico según la reivindicación 15 caracterizado por que la deleción se localiza entre las bases 100260234-100596921 y/o 101244026-101754718 de la región 7q22.1.
18. - Método de diagnóstico según las reivindicaciones 15 o 17 caracterizado por que en el segundo paso se mide el nivel de expresión del gen CUX1 y/o SH2B2.
19. - Método según las reivindicaciones 15 a 18 caracterizado por que además comprende la medición del nivel de expresión de al menos uno de los genes seleccionados entre: EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56, SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12 y MUC17 y/o cualquiera de sus combinaciones.
20. - Método según las reivindicaciones 15 o 19 que además comprende la detección de la deleción comprendida entre las bases 102949624-145959694 en la región 7q22.2-q35 donde se localizan, entre otros, los genes: RELN, LHFPL3, PBEF1, THAP5, IMMP2L, FOXP2, TES, MET, ST7, PTPRZ1, GRM8, UBE2H, MLKN1, BPGM, CALD1, PTN, SVOPL, AGK, KEL, TPK1 y CNTNAP2, mediante la utilización de arrays genómicos de alta afinidad.
21. - Kit de diagnóstico in vitro de LEZM que comprende un conjunto de sondas seleccionadas entre las comprendidas en el grupo SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, y/o cualquier otra sonda que hibride total o parcialmente sobre la deleción comprendida entre las bases 99925039-101754718 localizadas en la región 7q22.1 , mediante arrays genómicos de alta afinidad.
22. - Kit según la reivindicación 21 caracterizado por que el conjunto de sondas seleccionadas hibridan total o parcialmente sobre la deleción comprendida entre las bases 99925039-101348479.
23. Kit según la reivindicación 21 caracterizado por que el conjunto de sondas seleccionadas hibridan total o parcialmente sobre las deleciones comprendidas entre las bases 100260234-100596921 y/o 101244026-101754718 de la región 7q22.1.
24.- Kit según la reivindicación 21 a 23 que además comprende al menos una sonda que hibride total o parcialmente sobre la deleción comprendida entre las bases 102949624- 145959694 en la región 7q22.2-q35, mediante arrays genómicos de alta afinidad, siendo, preferentemente, dicha sonda la definida como SEQ ID NO:4.
25.- Kit según la reivindicación 24 caracterizado porque la sonda híbrida en la región 7q33.
26. - Kit de diagnóstico in vitro de LEZM que detecta la expresión de al menos el gen CUX1, localizado en la deleción de la región 7q22.1 comprendida entre las bases 99925039- 101754718, localizadas en la región 7q22.1 , mediante RT-PCR utilizando los cebadores definidos como SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:6.
27. - Kit según la reivindicación 26 caracterizado por que la detección de la expresión del gen CUX1 mediante RT-PCR utilizando los cebadores definidos como SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:6 se realiza en la región delecionada comprendida entre las bases 99925039- 101348479.
28. - Kit según la reivindicación 26 caracterizado por que la detección de la expresión del gen CUX1 mediante RT-PCR utilizando los cebadores definidos como SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:6 se realiza en la región delecionada entre las bases 100260234-100596921 y/o 101244026-101754718 de la región 7q22.1.
29.- Kit según la reivindicación 26 caracterizado por que la detección de la expresión del gen CUX1 puede además realizarse mediante los cebadores definidos como SEQ ID NOs: 23- 24.
30.- Kit según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29 que además detecta la expresión del gen SH2B2 mediante los cebadores definidos como SEQ ID NO: 25 a 28.
31- Kit según las reivindicaciones 26 a 30 caracterizado por que además detecta la expresión de al menos uno de los genes seleccionados entre EPHB4, SLC12A9, TRIP6, SRRT, ACHE, UFSP1, TRIM56, SERPINE1, APIS1, VGF, TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12 y MUC17 y/o cualquiera de sus combinaciones mediante cebadores específicos para las secuencias de dichos genes.
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