WO2011153602A2 - E-ntpdases recombinantes, uso na produção de kit de diagnósticos para detecção de anticorpos nas leishmanioses causadas por espécies do gênero leishmania - Google Patents

E-ntpdases recombinantes, uso na produção de kit de diagnósticos para detecção de anticorpos nas leishmanioses causadas por espécies do gênero leishmania Download PDF

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WO2011153602A2
WO2011153602A2 PCT/BR2011/000176 BR2011000176W WO2011153602A2 WO 2011153602 A2 WO2011153602 A2 WO 2011153602A2 BR 2011000176 W BR2011000176 W BR 2011000176W WO 2011153602 A2 WO2011153602 A2 WO 2011153602A2
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Juliana Lopes Rangel Fietto
Márcia Rogèria de Almeida LAMÊGO
Ronny Francisco De Souza
Antonio Phelipe Carlette ZÓBOLI
Maria Terezinha Bahia
Luís Carlos Crocco AFONSO
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Universidade Federal de Viçosa
Universidade Federal De Ouro Preto
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y306/01—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) in phosphorus-containing anhydrides (3.6.1)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y306/01—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) in phosphorus-containing anhydrides (3.6.1)
    • C12Y306/01006—Nucleoside-diphosphatase (3.6.1.6)

Definitions

  • the proteins from the family of recombinant E-NTPDases obtained, subject to patent application, will be used in the production of diagnostic kits for the detection of antibodies in leishmaniasis, immunological tests. These tests can be applied to detect seropositive individuals in leishmaniasis field epidemiological control programs or in the laboratory diagnosis of leishmaniasis. These proteins may also be used in prognostic assays, vaccines, monoclonal antibody production and rational drug design for leishmaniasis chemotherapy.
  • Leishmaniasis are known to comprise a set of diseases whose etiological agents are species of the genus Leishmania, which are protists belonging to the Trypanosomatidae family. Transmission occurs through the bite of the female sand fly.
  • leishmaniasis can be classically divided into two clinical forms: visceral and cutaneous or cutaneous.
  • the untreated visceral form is usually fatal, while the cutaneous forms, although rarely evolving into fatality, are mutilating and unpleasant especially when there are multiple lesions.
  • WHO World Health Organization
  • Leishmaniasis is a zoonotic disease that affects man, a variety of wild and domestic animals. It is an endemic disease in 88 countries on four continents. More than 90% of cutaneous leishmaniasis cases occur in Iran, Afghanistan, Republic, Saudi Arabia, Brazil and Peru, and more than 90% of visceral cases occur in Bangladesh, Brazil, India and Sudan. 2009, http://whqlibdoc.who.int/hq/2007/WHO CDS NTD IDM 2007.3 enq.
  • Canine leishmaniasis has become the focus of several studies considering the importance of the dog as a domestic animal and its relevance as a reservoir of the disease. However, the dog is not simply a reservoir of parasites, as it also presents the pathology associated with infection in both cutaneous and visceral form.
  • E-NTPDases are a specific family of ectonucleotidases, proteins that are described general, as localized or soluble (secreted) ecto membrane proteins whose primary function is the degradation of nucleotides, mainly extracellular, tri and diphosphates (Zimmermann, H., Beaudoin, AR, Bollen,., Belgium, Shaker Publishing; 1- 9. 1999.)
  • PI 9807332 deals with "LEISHMANIA ANTIGENS FOR USE IN LEISHMANIASIS THERAPY AND DIAGNOSIS" where compositions and processes for preventing, treating and detecting ' leishmaniasis and stimulating immune responses in patients are demonstrated.
  • the present invention has no overlap with this patent, although both aim for common applications.
  • the antigens disclosed in PI 9807332 are distinct from the antigenic proteins of this patent.
  • the application in the same area is justified as described in the previous item, in addition, the patent itself emphasizes the need to develop alternatives in the diagnosis, treatment and prophylaxis of leishmaniasis that are caused by more than 20 different species of Leishmania.
  • the first object of the present invention is achieved by recombinantly expressed E-NTPDase family proteins, the sequences being SEQ. ID No. 1, SEQ. ID No. 2, SEQ. ID No. 3, SEQ. ID No. 4, SEQ. ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ. ID No. 7, SEQ. ID No. 8, SEQ. ID No. 9, SEQ. ID No. 10, SEQ. ID No. 11 and SEQ. ID No. 12 used as antigen.
  • the second object of the present invention is to use said proteins and variants thereof, modified in their amino acid sequences, which retain their antigenic properties, for diagnostic use, vaccine compounds, prognostic marker, monoclonal antibody production and development of chemotherapeutic agents. the leishmaniases.
  • Figure 1.1 illustrates the schema of the pET 21b expression vector for Escherichia coli expression system and the DNA expression cassette.
  • Figure 1.2 - illustrates the DNA insert, in this case the gene gi_
  • Figure 2.1 illustrates the comparison of E-NTPDase sequences of species of the genus Leishmania.
  • the regions marked with yellow frames represent the conserved regions of the E-NTPDases.
  • Figure 3 - Part A illustrates a 10% polyacrylamide gel (SDS-PAGE) photo showing proteins from a plasmid transfected E. coli BL21 (DE3) lysate containing the Leishmania major GDPase gene expressed at different times.
  • the first column shows a recombinant Trypanosome cruzi NTPDase protein.
  • the next 8 lines show bacterial lysate products after 2 to 4 h of IPTG induction at concentrations of 1 mM, 0.8 mM, 0.6 mM, 0.4 mM, 0.3 mM, 0.2 mM 0.1 mM and without induction respectively.
  • the numbers correspond to those shown by molecular mass marker (kDa).
  • Part B illustrates a Western blot result showing the E. coli lysate major Leishmania GDPase protein reacting with rabbit antibodies immunized with recombinant T. cruzi NTPDase.
  • Lines 1 to 8 show the reaction of GDPase protein with serum from T. cruzi NTPDase immunized rabbits.
  • Line 9 shows no bands when there was no induction of recombinant GDPase protein.
  • the arrow indicates the reaction of the protein with the antibodies showing a band of approximately 78 kDa.
  • Figure 4 Illustrates a 10% polyacrylamide gel (SDS-PAGE) photo showing the Leishmania major GDPase protein expressed in E. coli BL21 (DE3) after nickel agarose affinity chromatography purification.
  • the recombinant Leishmania major GDPase protein can be observed in lanes 10 and 11 after being recovered in buffer containing 80 mM and 160 mM imidazole respectively.
  • the numbers correspond to those shown by molecular mass marker (kDa).
  • the recombinant Leishmania major GDPase protein has 78.2 kDa.
  • FIG. 5 Graphic illustrating the ELISA immunological diagnosis results using the purified Leishmania major recombinant GDPase protein at 1.5, 3, 4.5 and 30 pg / ml as antigen and as a control the total Leishmania extract was used.
  • sp. lysate at a concentration of 3 g / ml, referenced by numbers 1, 2, 3, 4 and 5 respectively.
  • Eight domestic dog sera (Canis familiaris) were tested at a 1:80 dilution.
  • FIG. 6 Graph illustrating the result of immunoassay by ELISA using Leishmania major recombinant GDPase protein as antigen at concentration 1.5 g / ml. A total of 169 dog sera samples were used, being 117 known to be positive and 52 known to be negative.
  • the present invention relates to proteins of the family
  • Recombinant E-NTPDase from Leishmania major, Leishmania braziliensis and Leishmania infantu obtained from the nucleotide sequence of the coding genes of these proteins with modifications intended for antigenic applications, which, after primer preparation steps for amplification of the target genes, amplification of the coding genes of these proteins and expression vector cloning is finally expressed and further purified by Nickel affinity chromatography.
  • Said recombinant proteins thus purified can be used satisfactorily in ELISA and Western blot immunodiagnosis, as demonstrated by the use of the recombinant L. major GDPase isoform applied to the diagnosis of Canine Leishmaniasis.
  • the present invention relates to proteins of the family
  • SEQ. ID No. 1 Recombinant E-NTPDases identified as SEQ. ID No. 1, SEQ. ID No. 2, SEQ. ID No. 3, SEQ. ID No. 4, SEQ. ID No. 5, SEQ. ID No. 6, SEQ. ID No. 7, SEQ. ID No. 8, SEQ. ID No. 9, SEQ. ID No. 10, SEQ. ID No. 11 and SEQ. ID No. 12 which may be used as antigens in the diagnosis of leishmaniasis.
  • SEQ. ID No. 2 derived from the L. major GDPase coding gene, has an amino acid identity of 93.74% relative to the natural Leishmania major GDPase protein when compared to the 690 amino acid portions available in GenBank predicted by gi_ access
  • infantum's GDPase SEQ ID NO: 6
  • L. braziliensis SEQ ID NO: 4
  • NTPDases nucleoside diphosphatases
  • recombinant NTPDases are also the subject of this patent application and may be used in the same applications, namely, diagnosis, prognosis, vaccination, monoclonal development and chemotherapy for leishmaniasis.
  • Numbers from 1 to 7 horizontally represent the respective vertical proteins. Where the numbers intersect provides the identity in the upper quadrant and similarity in the lower quadrant.
  • the natural GDPase gene from Leishmania major, Leishmania braziliensis and Leishmania infantum are available from GenBank under the links gi_
  • the major Leishmania gene has a 2073 nucleotide sequence that encodes a 690 amino acid protein.
  • the Leishmania braziliensis gene has a 2076 nucleotide sequence that encodes a 691 amino acid protein.
  • the Leishmania infantum gene has a 2034 nucleotide sequence that encodes a 677 amino acid protein. Recombinant to natural nucleotide sequences show modifications in the aminoterminal and carboxiterminal moieties.
  • NTPDase gene of Leishmania major, Leishmania braziliensis and L. infantum are available in GenBank under 'accesses the XP_001681917, XP_001562178, XM_001464304 respectively. Both species have a sequence of 1278 nucleotides encoding 425 amino acids.
  • the sequence of recombinant nucleotides relative to the natural shows modifications in the aminoterminal and carboxiterminal portion. To the aminoterminal portion was added 42 base pairs. In the carboxiterminal portion the last three nucleotides (stop codon) were removed and 45 base pairs were added, except in Leishmania major that only 39 base pairs were added.
  • Predicted recombinant proteins from Leishmania major, Leishmania braziliensis and Leishmania infantum have 452, 454 and 454 amino acids respectively (SEQ. ID No. 8, SEQ. ID No. 10 and SEQ. ID No. 12).
  • the present invention further relates to the use of recombinant GDPase protein in a diagnostic kit for leishmaniasis caused by species of the genus Leishmania, comprising recombinant E-NTPDases, as mentioned above, which are capable of interacting with specific antibodies in serum samples. or blood or other liquids or specimens from individuals being able to indicate infection in these human or animal individuals.
  • the strain used for genomic extraction was MHOM / IL / 80 / Friedlin from Leishmania major.
  • genomic DNA gDNA
  • approximately 1x10 8 cells were harvested by centrifugation at 13,000 xg for 2 to 3 min, discarding the supernatant was added 500 to 700 pL of balanced phenol to the pellet and left at room temperature (RT). for 5 to 10 min.
  • RT room temperature
  • sterile 10 mM Tris pH 8.0
  • the homogenate was allowed to precipitate for 2 to 3 h in the -80 ° C freezer and then centrifuged at 13,000 xg for 20 to 30 min at 4 ° C. The supernatant was discarded by adding 250 to 500 ⁇ to the precipitate. 70% ice cold ethanol and the sample was centrifuged at 13,000 xg for 5 to 10 min at 4 ° C. The supernatant was discarded and the pellet placed to dry with the vial lid open. Subsequently the dried DNA pellet was suspended in 50 to 60 L of 10 mM Sterile Tris (pH 8.0). Genomic DNA was stored at -20 ° C and used to isolate the coding region of the GDPase gene (gi_
  • PCR polymerase chain reaction
  • the 5 'CGGGATCCCATGCCAATGACTGACG3' direct oligonucleotide annealing to the Leishman ⁇ a major genome was used and inserts a restriction site for BamH I at the 5 'end for later insertion into the bacterial expression vector pET-21b and reverse oligonucleotide 5' GCGTCGACGGAGAGAGAGGAGAGAGAGAG ' , which creates a site for Sal I at the end of the coding region.
  • a thermal cycler Programmable Thermal Controller-PTC-100 TM
  • the reaction was performed in a total volume of approximately 50 pL using 4 pL of gDNA; 5.0 pL of 1.5 mM gS0 4 buffer (provided by Taq DNA Polymerase manufacturer); 2.4 pL of the 2.5m dNTPs mix (dCTP, dTTP, dGTP, dATP); 2 ⁇ l of the oligonucleotides at a concentration of 20 pmol / ⁇ l; 0.5 pL Taq DNA Polymerase and sterile ultrapure water qsp.
  • the program used consisted of 33 cycles: 94 ° C for 4 min; 94 ° C for 30 sec; 50 ° C for 1 min; 72 ° C for 1 min; 72 ° C for 5 min; 4 ° C until removed from the tubes.
  • the end products of the PCR reactions were analyzed by 1% agarose gel electrophoresis in IX TAE (1 mM EDTA; 40 mM Tris-Acetate; in deionized water) and stained in ethidium bromide solution (Sambrook J., Fritsch EF and Maniatis T., 1989), to verify the formation of a majority band corresponding to the target amplicon size of approximately 2.1 kb.
  • the electrophoresis was performed at approximately 80 V, using as a running buffer TAE.
  • the about 2.1 kb band was purified from the agarose gel using the PureLink TM Quick Gel Kit. Extraction "(invitrogen) according to manufacturer's instructions.
  • the TOPO (Invitrogen TM) system was used for the initial subcloning of the gene.
  • the amplicon band was suspended in a total volume of approximately 20 ⁇ l sterile ultra pure water and 5 to 10 ⁇ l of this solution was used for binding at approximately 16 ° C for 10-12 hours, according to the manufacturer's manual ( TOPO® TA Cloning® Kit for Subcloning - Invitrogen).
  • the ligation mixture ( ⁇ 6 ⁇ ) containing GDPase TOPO + amplicon vector was added to approximately 100 L of solution previously made competent E. coli TOP 10F 'bacteria (Sambrook J., Fritsch EF and Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). The mixture was incubated on ice for 45 to 60 min, heat shocked (42 ° C) for 1 to 5 min and placed back on ice.
  • LB-Liquid 1% Tryptone, 0.5% Yeast Extract, 1% NaCl, pH 7.5
  • the total volume of this mixture was divided into three aliquots and plated on solid LB-Agar medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 1.5% select Agar pH 7.5) containing ampicillin (5 to 10 mg / mL ⁇ 1 ) and incubated for 12 to 14 h at 37 ° C.
  • the ampicillin resistant clones were recovered and used to confirm the presence of the plasmid containing the gene of interest by PCR and restriction analysis (using BamH I and Sal I) from the plasmid miniprep extraction plasmid according to (Sambrook J., Fritsch EF and Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). One of the isolated and confirmed clones was then subjected to automatic sequencing. using flanking primers from the Mega-Bace cloning region according to the manufacturer's instructions. Clones containing the construct were stored in LB-liquid medium in 20% glycerol microcentrifuge tubes and kept at -80 ° C.
  • Plasmid DNA was extracted by the alkaline lysis method (Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) as described below. For this, the positive clones of the transformation with
  • the TOPO vector were grown in individual screw tubes containing 3 mL LB and 30 ⁇ . ampicillin (5 to 10 mg / mL -1 ) for 12 to 14 h at 37 ° C at 180 to 200 rpm. After growth a 1.5 mL volume of each culture was transferred to microcentrifuge tubes, and cells were collected by centrifugation (Centrifuge 5415C-EPPENDORF) at 12000 xg per
  • the cell pellet was washed with 0.5 to 1 mL STE (0.1 NaCl, 10 mM Tris.Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0) to remove endonuclease inhibitors. After centrifugation, 200 to 300 ⁇ l of ice-cold solution I (25 mM Tris.Cl pH 8.0, 10 mM EDTA and 5 mM D-Glucose) were added and the pellet was slowly and completely suspended. Then 200 to 300 L of freshly prepared solution II (0.2 M NaOH, 1% SDS) was added, and the tubes were slowly inverted for 6 to 10 times and kept on ice for 5 to 10 min.
  • STE 0.1 NaCl, 10 mM Tris.Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0
  • RNAse A 10 pg / ⁇ l
  • 550 to 700 ⁇ l phenol: chloroform (1: 1) was added to each tube, and the tubes were slowly inverted for about 5 to 10 times and centrifuged at 12000 x g for 5 to 10 min. This procedure was repeated once more. The aqueous phase was transferred to new tubes. Then 550 to 700 ⁇ l of chloroform was added and centrifugation at 12000 x g was performed for 5 to 10 min. The upper phase was transferred to new tubes, where 550 to 700 l of ice-cold isopropanol was added. The tubes were slowly inverted and kept at -70 ° C for 10 to 20 min.
  • the samples were centrifuged at 12000 x g for 5 to 10 min, the supernatant was discarded and the tubes were placed to dry for 30 to 50 min on paper towels.
  • the precipitate was washed with 200 to 400 ⁇ l of 70% ice cold ethanol and centrifuged at 12000 x g for 5 to 10 min. The supernatant was discarded and the tubes were placed to dry for 30 to 50 min.
  • the plasmid DNA was suspended in 20 to 30 pL of deionized ⁇ 0. Clones were selected by restriction analysis using BamH I and Sal I and confirmed by partial sequencing.
  • the TOPO amplification vector containing the gene was subjected to BamH I and Sal I digestion. After digestion, the TOPO vector mixture was subjected to 1% agarose gel electrophoresis.
  • E. coli TOP 10F 'bacteria previously rendered competent as described above, were transformed with the ligation product and incubated in LB liquid medium as described above (isolation of clone containing the TOP). Clone selection was done by restriction analysis and sequencing. Positive clones were stored in microcentrifuge tubes containing 15 to 30% glycerol and kept at -70 ° C.
  • Competent bacteria of the E. coli BL21 strain (DE-3) were transformed with the pET-21b-GDPase construct, similar to that performed with the TOPO vector.
  • the gi gene 1154872131 encodes an mRNA for the production of a 78.2 kDa protein whose predicted amino acid sequence is described in SEQ. ID No. 2
  • a inoculum was pre-inoculated in 5 to 7 mL of LB liquid medium containing 50 ⁇ L ampicillin (5 to 10 mg / mL ⁇ 1 ) from the glycerol preserved clone.
  • This pre-inoculum was incubated for 16 to 20 h at 37 ° C under shaking.
  • An aliquot of 2.5 to 5 mL of culture was collected and inoculated into a total volume of 250 mL of LB-liquid containing 2.5 mL of ampicillin (5 to 10 mg / mL -1 ). This mixture was incubated at 37 ° C under shaking and cell growth was followed by reading its OD100 (optical density).
  • IPTG isopropyl ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • the culture was centrifuged 3000 xg and the obtained pellet was kept on ice for 15 to 30 min and suspended in lysis buffer (50 mM Tris (pH 8.0), 300 m NaCl in distilled water) at a proportion of 3 to 5 mL per gram of sediment containing 30 to 50 L PMSF (100 mg / mL), 50 to 100 ⁇ > aprotinin (1 mg / mL), 50 to 100 ⁇ 1> pepstatin (1 mg / mL). Then 1 to 5 mg / ml lysozyme was added and kept on ice for 30 to 50 min.
  • lysis buffer 50 mM Tris (pH 8.0), 300 m NaCl in distilled water
  • the cells were then finally disrupted by sonication 6 to 10 times for 10 to 20 seconds at 200 W power with 10 to 20 seconds on ice between each sonication. 0.1% Triton was then added and the material was centrifuged for 30 to 50 min at 20400 x g and 4 ° C, with The pellet (insoluble fraction) and supernatant (soluble fraction) were stored at - 20 ° C for further purification of the recombinant protein.
  • IPTG concentration To determine the best IPTG concentration to be used as a standard for recombinant protein expression, colonies were inoculated into 4 mL LB liquid medium containing 40 ⁇ L ampicillin (5 to 10 mg / mL -1 ) and incubated at 37 ° C. for 12 to 14 h under stirring. An aliquot of 250 to 500 ⁇ of culture was collected and diluted to a total volume of 5 to 10 mL in 11 tubes. This mixture was incubated at 37 ° C under shaking and cell growth was followed by reading its ⁇ 500 .
  • Samples (induced and uninduced controls) were centrifuged, the supernatant discarded and the bacterial pellet mixed with SDS-PAGE sample buffer (62.5 mM Tris.HCl pH 6.8, 10% SDS, 0.01% bromophenol blue (ABF), 10% glycerol and 20 mM ⁇ -mercaptoethanol). The samples were heated at 100 ° C for 5 to 10 min. Bacterial lysates were analyzed by 10% SDS-PAGE according to Laemmli, UK, Nature. 227 (259): 680-5, 1970. The small (1mm thick) Mini-PROTEAN ® ( BIO-RAD) vertical electrophoresis system was used.
  • the samples were applied at D0 60 o 3.0 to 5.0, for a total volume of 20 ⁇ per channel, and after electrophoresis the gel was stained with Comassie blue.
  • the molecular weight standard used was the PageRuler TM Unstained Protein Ladder ( Figure 3, part A).
  • wash buffer 3 50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl 2 , 10 mM Imidazole, 5 mM MgCl 2
  • wash buffer 3 50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl 2 , 10 mM Imidazole, 5 mM MgCl 2
  • This procedure was repeated 2 to 4 times.
  • the proteins most strongly bound to the resin were eluted in elution buffer.
  • Elution Buffer 1 50 mM Tris pH 8.0, 300 mM 80 mM NaCl 2 , Imidazole, 5 mM MgCl 2
  • the membrane was rapidly washed in TBS buffer (0.01 M Tris; 0.14 M NaCl) and then incubated with the primary anti-rNTPDase antibody of ⁇ . 1: 1000 diluted in TBS-T buffer for about 16 to 20 h at 100 rpm. Later the membrane 3 to 6 washes with TBS-T buffer for 5 to 10 min under slight constant agitation. The membrane was then incubated with peroxidase-conjugated rabbit anti-IgG secondary antibody at a dilution of 1: 20,000. The membrane was allowed to stir at 100 to 200 rpm for 1 to 3 hours. Then the membrane went through another 3 to 6 washes with TBS-T buffer for 5 to 10 min under the same stirring conditions.
  • TBS buffer 0.01 M Tris; 0.14 M NaCl
  • DAB diaminobenzidine substrate
  • micro-dilution plates were exposed to a solution containing 1.5, 3, 4.5 and 30 g of the purified recombinant GDPase protein in 0.1 M carbonate / bicarbonate buffer pH 9.6 and incubated overnight at 4 ° C. .
  • Non-specific sites were blocked by incubating the plate with blocking solution containing 5% fetal bovine serum (SFB) in PBS for one hour at 37 ° C.
  • the plate was washed 3 to 6 times with PBS-T (0.05% Tween-20 PBS) to remove excess blocking solution. After washes, serum was added at a dilution of 1:80.
  • reaction containing serum was incubated for 1 to 3 hours at 37 ° C. Washing proceeded in the same manner as described above.
  • the reaction with the peroxidase conjugated dog anti-IgG antibody at the 1: 5000 dilution was incubated for 1 to 3 hours at 37 ° C.
  • the plate was again washed as described above. Reaction of recombinant GDPase protein with antibodies was evidenced by staining with 5 to 10 mg / ml o-phenylenediamine (OPD) and 0.01% ⁇ 2 0 2 in citrate phosphate buffer (0.1 M citric acid, 0.2 M sodium phosphate pH 5.0) for 15 to 30 min.
  • OPD o-phenylenediamine
  • the reaction was stopped by the addition of 32 to 40 ⁇ of a 2.5 MH 2 S0 4 solution .
  • the intensity of the reaction related to the intensity of the staining, was determined by the absorbance reading at 490nm (Labsystems iEMS). Data analysis was performed using Exceli software ( Figure 5), which shows positive recognition with higher absorbance reading of sera known positive for leishmaniasis in relation to negative sera and dogs with Chagas disease.

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Abstract

Esta invenção refere-se às proteínas da família E-NTPDases recombinantes que podem ser usadas como antígenos em kits de diagnósticos das leishmanioses animais e humanas. As proteínas da família das E-NTPDases recombinantes obtidas poderão ser empregadas na produção de Kits de diagnósticos para a detecção de anticorpos nas leishmanioses, usando testes do tipo imunológicos. Estes testes podem ser aplicados em detecção de indivíduos soropositivos, em programas de controle de leishmanioses ou no diagnóstico laboratorial das leishmanioses. Estas proteínas também poderão ser usadas em ensaios prognósticos e vacinais, no desenho racional de quimioterápicos para o tratamento das leishmanioses e no desenvolvimento de anticorpos monoclonais a serem usados no diagnóstico, prognóstico ou terapia das leishmanioses

Description

Relatório Descritivo da patente de Invenção para: "E- NTPDases RECOMBINANTES , USO NA PRODUÇÃO DE KIT DE DIAGNÓSTICO PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS NAS LEISHMANIOSES CAUSADAS POR ESPÉCIES DO GÉNERO Leisbxnanla"'
Campo de Aplicação da Invenção
As proteínas da família das E-NTPDases recombinantes obtidas, objeto de pedido de patente, serão empregadas na produção de Kits de diagnósticos para a detecção de anticorpos nas leishmanioses, testes estes do tipo imunológicos. Estes testes podem ser aplicados em detecção de indivíduos soropositivos em programas de controle epidemiológico a campo das leishmanioses ou no diagnóstico laboratorial das leishmanioses. Estas proteínas também poderão ser usadas em ensaios prognósticos, vacinais, na produção de anticorpos monoclonais e no desenho racional de drogas para a quimioterapia das leishmanioses.
Estado da Técnica
Sabe-se que as Leishmanioses compreendem um conjunto de enfermidades cujos agentes etiológicos são espécies do género Leishmania , que são protistas pertencentes à família Trypanosomatidae . A transmissão se dá através da picada do flebotomío fêmea. Dependendo da espécie de Leishmania envolvida na infecção e do tipo de hospedeiro, a leishmaniose pode ser dividida classicamente em duas formas clínicas: visceral e tegumentar ou cutânea. A forma visceral se não tratada costuma ser fatal, já as formas cutâneas, apesar de raramente evoluírem para a fatalidade são mutilantes e desagradáveis especialmente quando da existência de múltiplas lesões. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS/ HO) (WHO, 2009, http: //whqlibdoc.who. int/hq/2007/WHO_CDS_NTD_IDM_2007.3_eng . df) a leishmaniose é uma doença de caráter zoonótico que acomete o homem, uma variedade de animais silvestres e domésticos. É uma doença endémica em 88 países distribuídos em quatro continentes. Mais de 90% dos casos de Leishmaniose cutânea ocorrem no Irã, Afeganistão, Síria, Arábia Saudita, Brasil e Peru e mais de 90% dos casos da forma visceral ocorrem em Bangladesh, Brasil, índia e Sudão. Ainda segundo a OMS (WHO, 2009, http://whqlibdoc.who.int/hq/2007/WHO CDS NTD IDM 2007.3 enq . pdf) o número de casos de leishmaniose cutânea (LC) vem crescendo no Brasil nos últimos anos (1988: 21.800 casos; 1999: 30.550 casos; 2000: 35.000 casos). Fato este relacionado ao desenvolvimento económico e à mudança de hábitos e ambientais que expõem mais a população aos vetores da doença. Um dos principais reservatórios atualmente descrito é o cão, que por sua proximidade com o homem participa ativamente do processo de manutenção da leishmaniose .
A leishmaniose canina tem se tornado foco de vários estudos visto a importância do cão como animal doméstico e a sua relevância como reservatório da doença. Porém o cão não é simplesmente um reservatório de parasitos, pois o mesmo também apresenta a patologia associada à infecção tanto na forma cutânea quanto visceral.
Uma das principais ações empregadas no controle da leishmaniose canina ainda é a eliminação do cão infectado devido ao insucesso da antimonioterapia . Atualmente o tratamento de cães está proibido visto que não há eficácia completa comprovada com as drogas disponíveis.
Na prática clínica, diante da suspeita de infecção os cães passam por vários testes diagnósticos que são muitas vezes contraditórios e nem sempre tem uma correlação com o estado da doença no cão, dificultando o prognóstico e consequente tratamento. Este tipo de constatação levou ao desenvolvimento de técnicas mais especificas baseadas na amplificação de regiões de DNA do parasito por Reação em Cadeia pela Polimerase-PCR (Francino, O., Altet, L., Sanchez-Robert , E., Rodriguez, A., Solano-Gallego, L., Alberola, J. , Ferrer, L., Sanchez, A., Roura, X., Veterinary Parasitology 137: 214-221, 2006). Apesar de usualmente demonstrar alta eficiência, o ensaio de PCR tem a desvantagem de ter alto custo e falhas em relação à extração de DNA. O diagnóstico da doença em cães tem sido muito estudado, porém ainda hoje não há um método diagnóstico considerado como padrão e cada laboratório utiliza um método próprio de escolha (Da Silva E. S., Van Der Meide W. F. , Schoone G. J. , Gontijo C. M. F. , Schallig H. D. F. H., Brazil R. P., Veterinary Research Communications 30: 637-643, 2006). Diante disto novos métodos diagnósticos alternativos, mais eficientes, discriminatórios e rápidos são necessários.
A abordagem de proteínas recombinantes para serem usadas no diagnóstico tem sido o foco de muitos pesquisadores (S. Farajnia, B. Darbani, H. Babaei, M. H. Alimohammadian, F. Mahboudi And A.M. Gavgani, Parasitology 135, 1035-1041, 2008; Renato Porrozzi, Marcos V. Santos da Costa, Antonio Teva, Aloísio Falqueto, Adelson L. Ferreira, Claudiney dos Santos, Ana Paula Fernandes, Ricardo T. Gazzinelli, Antonio Campos-Neto and Gabriel Grimaldi, Jr. , Clinicai And Vaccine Immunology 14: 544-548, 2007).
As E-NTPDases são uma família específica de ecto- nucleotidases , proteínas que são descritas de maneira geral, como proteínas de membrana ecto localizadas ou solúveis (secretadas) que tem como função primária a degradação de nucleotídeos, principalmente extracelulares , tri e difosfatados (Zimmermann, H., Beaudoin, A. R. , Bollen, . , Belgium, Shaker Publishing; 1-9. 1999.)
O interesse nestas enzimas se baseia em dados obtidos na literatura que sugerem a participação de ecto- nucleotidases , entre outras coisas, na virulência, infectividade e aquisição de purinas em parasitos (Barrêdo- Pinho, M . , Peres-Sampaio, C. E., Chrispim, P. P. M . , Belmont-Firpo, R. , Lemos, A. P., Martiny, A., Vannier- Santos, M. A., Meyer-Fernandes, J. R. A Archives of Biochemistry and Biophysics, 391:16-24, 2001).
Recentemente, estudando a infecção experimental de camundongos C57BL/6 com L. (L. ) amazonensis e L. (V. ) braziliensis, ambas causadoras de leishmaniose tegumentar, verificou-se que os animais foram capazes de controlar a infecção por L. (V.) braziliensis, mas não por L. (L.) amazonensis. A diferença de resposta à infecção foi relacionada a um estado anérgico observado nos animais infectados por L. (L.) amazonensis (Maioli, T. U., Érica, T., Arantes, R. . E., Fietto, J. L. R. , Afonso, L. C. C, Parasitol Res 94: 207-212, 2004). Além disto, foi verificado que as células intactas de L. (L.) amazonensis foram capazes de hidrolisar uma maior quantidade de nucleotídeos extracelulares de adenosina. Considerando que o ATP extracelular é uma molécula pró-inflamatória e que um dos produtos de sua degradação, a adenosina possui efeito imunossupressor, esta diferença poderia então levar a um efeito antiinflamatório e imunossupressor, como o observado (Maioli, T. U, Érica, . , Arantes, R. M. E., Fietto, J. L. R. , Afonso, L. C. C, Parasitol Res 94: 207-212, 2004). Esta foi a primeira evidência da participação de ecto- nucleotidases de um parasita no controle da resposta imunológica do hospedeiro.
Na busca feita junto ao Instituo Nacional da
Propriedade Industrial - INPI foram encontradas solicitações de patentes nas áreas de imunoterapia e imunodiagnóstico, porém nenhuma destas patentes utiliza produtos relacionados ao objeto desta patente. Nesta busca foi encontrado o documento de patente PI 9406509, que refere-se a "COMPOSTOS, PROCESSO, SUA PREPARAÇÃO, USO DOS MESMOS, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E PROCESSO PARA PROFILAXIA E PARA TRATAMENTO TERAPÊUTICO DE MALÁRIA E DOENÇAS CAUSADAS POR LEISHMANIA, TOXOPLASMA GONDII, PNEUMOCY", onde se descreve o pirrol-amidínicos de fórmula geral e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, processos para a preparação e composições farmacêuticas contendo-os úteis como antivirótico e antiparasitico . Este documento versa então sobre o uso de formulações farmacêuticas derivadas de compostos pirrol-amidinicos para tratamento e prevenção das leishmanioses . 0 objeto do pedido de patente em questão é diferente da patente descrita, pois utiliza proteína recombinante para ser usada em diagnóstico, prognóstico, desenvolvimento de anticorpos monoclonais, vacinação e desenvolvimento de quimioterápicos para as leishmanioses. Não há inter-relação entre os mesmos. Porém é importante salientar que no caso de doenças infecciosas é desejável que se tenham métodos alternativos de diagnóstico, prevenção e tratamento visto que existe uma diversidade muito grande de resposta a quimioterapia e vacinação das populações dos hospedeiros, bem como diferentes susceptibilidades a drogas e produção de resposta imune protetora em relação aos parasitos.
Outro depósito encontrado foi o de n° PI 9807332 que trata de "ANTIGENOS DE LEISHMANIA PARA UTILIZAÇÃO NA TERAPIA E DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE" onde são demonstradas composições e processos para prevenir, tratar e detectar ' leishmaniose e estimular respostas imunes em pacientes. A presente invenção não tem sobreposição com esta patente, embora ambas visem aplicações em comum. Os antigenos apresentados na patente PI 9807332 são distintos das proteínas antigênicas desta patente. A aplicação em mesma área se justifica como descrito no item anterior, além disto, a própria patente em questão salienta a necessidade de desenvolvimento de alternativas no diagnóstico, tratamento e profilaxia das leishmanioses que são causadas por mais de 20 espécies diferentes de Leishmania .
O depósito de n° 2133236A1 feito no banco da Espanha refere-se a "GEN QUIMÉRICO FORMADO POR LAS SECUENCIAS DE DNA QUE CODIFICAN LOS DETERMINANTES ANTIGÊNICOS DE CUATRO PROTEÍNAS DE L. infantum, APLICABLE PARA EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE LEISHMANIOSIS CANINA Y PROTEÍNA OBTENIDA" onde se descreve os determinantes antigênicos de quatro proteínas de L. infantum (LiP2a, LiP2b, LÍP2A, LiPO), que foram aplicadas em diagnóstico de Leishmaniose. Os objetos desta patente são proteínas distintas daquelas que estão sendo patenteadas neste processo, portanto como justificado anteriormente apesar da aplicação poder ser a mesma os antigenos são diferentes. No caso das Leishmanioses, como dito anteriormente, é importante que se tenham proteínas alternativas para serem usadas em diagnóstico, profilaxia e tratamento, visto que existe grande diversidade de parasitos e hospedeiros.
É um primeiro objetivo da presente invenção, fornecer as proteínas da família das E-NTPDases recombinantes de três espécies de Leishmania (Leishmania major, Leishmania braziliensis, Leishmania infantum) homóloga à sua proteína natural, para ser utilizada como antígeno em kits de diagnóstico das leishmanioses .
É objetivo também da presente invenção usar as ditas proteínas e suas variantes, modificadas em suas sequências de aminoácidos, que conservem suas propriedades antigênicas, para o uso em diagnóstico, compostos vacinais, desenvolvimento de anticorpos, marcadores de prognóstico e no desenho racional de drogas inibidoras das E-NTPDases que possam ser usadas na quimioterapia das leishmanioses.
0 desenvolvimento de compostos antigênicos capazes de aumentar a eficiência no diagnóstico e efetivação como agente vacinai tem sido busca no âmbito geral da pesquisa em leishmaniose. A proteína GDPase recombinante, conforme visto na Figura 5, aponta como um potente antígeno. O antígeno quando utilizado em diagnóstico em teste de ELISA, foi capaz de discriminar de maneira satisfatória soros de cães contaminados com Trypanossoma cruzi dos contaminados com Leishmania sp. Desse modo o investimento neste antígeno recombinante como alvo para produção de kit de diagnóstico, bem como para as outras aplicações é muito promissor.
Descrição da Invenção
O primeiro objetivo da presente invenção é alcançado através das proteínas da família das E-NTPDases expressas de forma recombinante, sendo as sequências SEQ. ID. N° 1, SEQ. ID. N° 2, SEQ. ID. N° 3, SEQ. ID. N° 4, SEQ. ID. N° 5, SEQ. ID. N° 6, SEQ . ID. N° 7, SEQ. ID. N° 8, SEQ. ID. N° 9, SEQ. ID. N° 10, SEQ. ID. N° 11 e SEQ. ID. N° 12 utilizadas como antigeno.
O segundo objetivo da presente invenção é usar as ditas proteínas e suas variantes, modificadas em suas sequências de aminoácidos, que conservem suas propriedades antigênicas, para o uso em diagnóstico, compostos vacinai, marcador de prognóstico, produção de anticorpos monoclonais e desenvolvimento de quimioterápicos para as leishmanioses .
A presente invenção será, a seguir, detalhadamente descrita .
Figura 1.1 - ilustra o esquema do vetor de expressão pET 21b para sistema de expressão em Escherichia coli e do cassete de expressão de DNA.
Figura 1.2 - ilustra o inserto de DNA, no caso o gene gi_| 154872131 , que foi clonado entre os sitios de restrição BamHI e Sall.
Figura 2.1 - ilustra a comparação das sequências das E-NTPDases de espécies do género Leishmania. As regiões marcadas com quadros amarelos representam as regiões conservadas das E-NTPDases.
Figura 2.2 - idem a Figura 2.1, continuação.
Figura 3 - a parte A ilustra uma foto de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 10%, mostrando proteínas de um lisado de E. coli BL21 (DE3) transfectadas com plasmídeo contendo o gene da GDPase de Leishmania major expresso em diferentes tempos. A primeira coluna mostra uma proteína NTPDase recombinante de Trypanossoma cruzi. As próximas 8 linhas mostram os produtos dos lisados de bactérias após 2 a 4 h de indução com IPTG nas concentrações de 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,3 mM, 0,2 mM, 0,1 mM e sem indução respectivamente. Os números correspondem aos mostrados por marcador de massa molecular (kDa) . A parte B ilustra um resultado de Western blot mostrando a proteína GDPase de Leishmania major do lisado de E. coli reagindo com anticorpos do soro de coelhos imunizados com a NTPDase recombinante de T. cruzi. As linhas de 1 a 8 mostram a reação da proteína GDPase com o soro de coelhos imunizados com NTPDase de T. cruzi. A linha 9 mostra ausência de bandas quando não havia indução da proteína GDPase recombinante. A seta indica a reação da proteína com os anticorpos mostrando uma banda de aproximadamente 78 kDa.
Figura 4 - Ilustra uma foto de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 10% mostrando a proteína GDPase de Leishmania major expressa em E. coli BL21 (DE3) após a purificação por cromatografia de afinidade em coluna de Níquel-agarose . A proteína GDPase recombinante de Leishmania major pode ser observada nas colunas 10 e 11, após ter sido recuperada em tampão contendo 80 mM e 160 mM imidazol respectivamente. Os números correspondem aos mostrados por marcador de massa molecular (kDa) . A proteína GDPase recombinante de Leishmania major possui 78,2 kDa.
Figura 5 - gráfico que ilustra o resultado de diagnóstico imunológico por ELISA em que se utilizou como antígeno a proteína GDPase recombinante de Leishmania major purificada nas concentrações de 1.5, 3, 4.5 e 30 pg/ml e como controle foi utilizado o extrato total de Leishmania sp. lisada na concentração de 3 g/ml, referenciadas pelos números 1, 2, 3, 4 e 5 respectivamente . Foram testados 8 soros de cães domésticos {Canis familiaris) na diluição de 1: 80. Sendo 3 soros de cães sabidamente positivos para Leishmania sp. (L+) , 3 soros de cães sabidamente negativos para infecção por Leishmania sp. (L- ) e 2 soros de cães sabidamente positivos para infecção por Γ. cruzi.
Figura 6 - gráfico que ilustra o resultado de diagnóstico imunológico por ELISA utilizando como antigeno a proteína GDPase recombinante de Leishmania major na concentração 1,5 g/ml. Foram utilizadas 169 amostras de soros de cães, sendo 117 sabidamente positivas e 52 sabidamente negativas.
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção se refere às proteínas da família
E-NTPDase recombinantes de Leishmania major, Leishmania braziliensis e Leishmania infantu , obtidas a partir da sequência nucleotídica dos genes codificantes destas proteínas com modificações destinadas a aplicações antigênicas, as quais após etapas de preparação de primers para amplificação dos genes alvos, amplificação dos genes codificantes dessas proteínas e clonagem em vetor de expressão, é finalmente expressa e posteriormente purificada por cromatografia de afinidade por Níquel. As ditas proteínas recombinantes assim purificadas podem ser usadas de forma satisfatória no imunodiagnóstico por ELISA e Western-blot , como demonstrado pelo uso da isoforma recombinante GDPase de L. major aplicada ao diagnóstico da Leishmaniose canina.
A presente invenção se refere às proteínas da família
E-NTPDases recombinantes identificadas como SEQ. ID. N° 1, SEQ. ID. N° 2, SEQ. ID. N° 3, SEQ. ID. N° 4, SEQ. ID. N° 5, SEQ. ID. N° 6, SEQ. ID. N° 7, SEQ. ID. N° 8, SEQ. ID. N° 9, SEQ. ID. N° 10, SEQ. ID. N° 11 e SEQ. ID. N° 12 as quais poderão ser utilizadas como antígenos em diagnóstico das leishmanioses . A SEQ. ID. N° 2 derivada do gene codificante da GDPase de L. major, apresenta uma identidade de aminoácidos de 93,74% em relação à proteína GDPase natural de Leishmania major quando se compara a mesma com relação aos trechos disponíveis no GenBank de 690 aminoácidos predita pelo acesso gi_ | 154872131. Adicionalmente a GDPase de L. infantum (SEQ ID. N° 6) e L. braziliensis (SEQ ID. N° 4) apresentam identidade de 84,49% e 65,75% respectivamente em relação à GDPase recombinante de L. major, conforme visualizado na Tabela 1. Esta alta identidade mostra que são proteínas similares, da mesma família. Esta similaridade é suficiente para haver reatividade imunológica cruzada sendo possível utilizar todas estas variantes nas mesmas aplicações descritas para a GDPase, ou seja, diagnóstico, prognóstico e vacinação para as leishmanioses . O mesmo ocorre para as variantes denominadas nucleosídeo difosfatases (NTPDases, descritas como SEQ ID. N° 8, SEQ ID. N° 10 e SEQ ID. N° 12), que apesar de apresentarem menor identidade comparativamente (Tabela 1) apresentam domínios conservados, conforme mostrado nas Figuras 2.1 e 2.2. Sendo assim, as NTPDases recombinantes também são objetos deste pedido de patente e poderão ser usadas nas mesmas aplicações, ou seja, no diagnóstico, prognóstico, vacinação, desenvolvimento de monoclonais e quimioterápicos para as leishmanioses.
Tabela 1 - Relação de Similaridade e Identidade da sequência de aminoácidos da proteína GDPase de L. major recombinante modificada com as demais sequências de aminoácidos das E-NTPDases de diferentes espécies de Leishmania .
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Proteína GDPase 1 93, 84, 65, 23, 23, 22, recombinai!te 74 49 75 09 09 13
L. major GDPase 2 674 90, 67, 24, 24, 23,
10 86 49 49 48
L. infantum 3 610 610 69, 23, 23, 22, GDPase 15 67 52 94
L. braziliensis 4 478 473 482 22, 22, 21, GDPase 22 22 52
L. major 5 169 169 164 158 92, 77, NTPDase 00 88
L. infantum 6 169 169 163 158 391 79, NTPDase 29
L. braziliensis 7 162 162 159 153 331 337 NTPDase
Números de 1 a 7 na horizontal representam as respectivas proteínas da vertical. Onde os números se cruzam fornece a identidade no quadrante de cima e similaridade no de baixo.
O gene natural das GDPase de Leishmania major, Leishmania braziliensis e Leishmania infantum estão disponíveis no GenBank sob os acessos gi_ | 15487213 | , XP_001562788, XP_001463665 respectivamente. O gene de Leishmania major possui uma sequência de 2073 nucleotídeos que codifica uma proteína de 690 aminoácidos. O gene de Leishmania braziliensis possui uma sequência de 2076 nucleotídeos que codifica uma proteína de 691 aminoácidos. O gene de Leishmania infantum possui uma sequência de 2034 nucleotídeos que codifica uma proteína de 677 aminoácidos. As sequências de nucleotídeos recombinantes em relação às naturais apresentam modificações na porção aminoterminal e carboxiterminal . À porção aminoterminal foram adicionados 42 pares de bases. Na porção carboxiterminal foi removido os três últimos nucleotídeos (códon de parada) e adicionado 45 pares de base. As proteínas recombinantes preditas de Leishmania major, Leishmania braziliensis e Leishmania infantum, possuem 719, 720 e 706 aminoácidos respectivamente (SEQ. ID N° 2, SEQ. ID N° 4 e SEQ . ID N° 6) .
O gene natural das NTPDase de Leishmania major, Leishmania braziliensis e Leishmania infantum estão disponíveis no GenBank sob' os acessos XP_001681917, XP_001562178, XM_001464304 respectivamente. Ambas as espécies possuem uma sequência de 1278 nucleotídeos que codifica 425 aminoácidos. A sequência de nucleotídeos recombinantes em relação ao natural apresenta modificações na porção aminoterminal e carboxiterminal . À porção aminoterminal foram adicionados 42 pares de bases. Na porção carboxiterminal foram removidos os três últimos nucleotídeos (códon de parada) e adicionados 45 pares de base, exceto em Leishmania major que foram adicionados somente 39 pares de base. Esta diferença se deve ao uso de diferentes sítios de restrição usados no processo de clonagem gênica. As proteínas recombinantes preditas de Leishmania major, Leishmania braziliensis e Leishmania infantum, possuem 452, 454 e 454 aminoácidos respectivamente (SEQ. ID N° 8, SEQ. ID N° 10 e SEQ. ID N° 12) .
A presente invenção ainda se refere ao uso da proteína GDPase recombinante em kit de diagnóstico para as leishmanioses causadas por espécies do género Leishmania , compreendendo as E-NTPDases recombinantes, tal como mencionado acima, que são capazes de interagir com anticorpos específicos em amostras de soros ou sangue ou outros líquidos ou amostras de indivíduos sendo capazes de indicarem a infecção nestes indivíduos humanos ou animais.
A seguir serão descritos experimentos de demonstração que permitirão ilustrar a potencialidade da presente invenção. Resumidamente estes experimentos se baseiam em amostra contendo Leishmania major que foi submetida à extração de seu material genômico para isolamento do gene específico codificante da GDPase. Posteriormente a isso, foi feito a amplificação do gene específico por PCR sendo esse clonado em vetor de clonagem e expressão, o qual foi utilizado na transformação de células de Escherichia coli que passaram a expressar a proteína GDPase recombinante do protozoário. A proteína GDPase de Leishmania major, após purificação foi utilizada como antígeno em testes de ELISA em soros de cães visando à pesquisa de anticorpos da classe IgG contra espécies do género Leishmania. Esta proteína GDPase recombinante de Leishmania major, produzida em larga quantidade, poderá ser amplamente distribuída a laboratórios por todo país e desta forma, contribuir de forma relevante para o diagnóstico sorológico das leishmanioses no Brasil ou no exterior, ou ainda ser usada em kits e aplicações imunológicas vacinais e de produção de anticorpos. Todos os processos descritos neste documento se estendem também as outras isoformas das E-NTPDases das outras espécies de Leishmania descritas nas sequências SEQ. ID. N° 3, SEQ. ID. N° 4, SEQ. ID. N° 5, SEQ. ID. N° 6, SEQ. ID. N° 7, SEQ. ID. N° 8, SEQ. ID. N° 9, SEQ. ID. N° 10, SEQ. ID. N° 11 e SEQ. ID. N° 12 as quais poderão ser também utilizadas como antigenos em diagnóstico das leishmanioses. Experimentos De Demonstração
Isolamento e Clonagem da região codificante da GDPase de Leishmania major
A cepa utilizada para extração genômica foi a MHOM/IL/80/Friedlin de Leishmania major. Para a extração de DNA genômico (DNAg) aproximadamente lxlO8 células foram recolhidas por centrifugação a 13.000 x g por 2 a 3 min, descartando o sobrenadante foi adicionado 500 a 700 pL de fenol equilibrado ao "pellet" e deixado a temperatura ambiente (T. A.) por 5 a 10 min. Em seguida foi adicionado de 200 a 400 de 10 mM Tris (pH 8,0) estéril e homogeneizado no vortex. O homogeneizado foi submetido à centrifugação a 13.000 x g por 10 a 12 min e recuperado a fase aquosa sem a interface. A essa foi adicionada de 200 a 400 μΐ, de uma mistura de fenol: clorofórmio: álcool isoamilico (25:24:1) e homogeneizada no vortex. O homogeneizado foi submetido à centrifugação a 13.000 x g por 10 a 12 min e recuperada a fase aquosa sem a interface. A essa foi adicionada de 200 a 400 pL de clorofórmio e homogeneizado no vortex. Sendo posteriormente centrifugada a 13.000 x g por 10 a 12 min e recuperada a fase aquosa como descrito anteriormente. Em seguida, foi adicionado 1/10 do volume de uma solução de 3 M de acetato de sódio (pH 5,2) e dois volumes de etanol 100% gelado homogeneizando sem vortexar. O homogeneizado foi deixado precipitando por 2 a 3 h no freezer -80 °C, sendo posteriormente centrifugado a 13.000 x g por 20 a 30 min a 4°C. O sobrenadante foi descartado, adicionando ao precipitado de 250 a 500 μΐ. de etanol 70% gelado e a amostra foi centrifugada a 13.000 x g por 5 a 10 min a 4°C. O sobrenadante foi descartado e o "pellet" colocado para secar com a tampa do frasco aberta. Posteriormente o "pellet" de DNA seco foi suspendido em 50 a 60 L de 10 mM Tris (pH 8,0) estéril. O DNA genômico foi estocado a - 20 °C e utilizado para isolamento da região codificante do gene da GDPase (gi_ | 15487213 | ) contendo 2073 pares de bases por reação da polimerase em cadeia (PCR) .
Para tanto foram utilizados o oligonucleotídeo direto 5 ' CGGGATCCCATGCCAATGACTGACG3 ' que anela no genoma de Leishmanía major e insere um sitio de restrição para BamH I na extremidade 5' para inserção posterior no vetor de expressão em bactéria pET-21b e oligonucleotídeo reverso 5 ' GCGTCGACGGTAAGAGAGAGGAGTGA3 ' , que cria um sítio para Sal I no final da região codificante. Para amplificação do gene foi usado um aparelho termociclador (Programmable Thermal Controller-PTC-100™) . A reação foi realizada em um volume total de aproximadamente 50 pL, utilizando 4 pL do DNAg; 5,0 pL de tampão 1,5 mM gS04 (fornecido pelo fabricante da Taq DNA Polimerase); 2,4 pL do mix de 2,5m dNTPs (dCTP, dTTP, dGTP, dATP) ; 2 pL dos oligonucleotídeos em uma concentração de 20 pmol/pL; 0,5 pL de Taq DNA Polimerase e água ultrapura estéril qsp. O programa utilizado consistiu em 33 ciclos: 94 °C por 4 min; 94 °C por 30 seg; 50 °C por 1 min; 72 °C por 1 min; 72 °C por 5 min; 4 °C até retirada dos tubos. Os produtos finais das reações de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1% em IX TAE (1 mM EDTA; 40 mM Tris-Acetato; em água deionizada) e corado em solução de brometo de etídio (Sambrook J. , Fritsch E. F. and Maniatis T., 1989), para a verificação da formação de uma banda majoritária correspondente ao tamanho do amplicon alvo com aproximadamente 2,1 kb. A eletroforese foi feita a aproximadamente 80 V, utilizando como tampão de corrida TAE. A banda de cerca de 2,1 kb foi purificada do gel de agarose utilizando o Kit "PureLink™ Quick Gel Extraction" (invitrogen ) conforme instruções do fabricante. Foi utilizado o sistema TOPO ( Invitrogen™) para a subclonagem inicial do gene.
A banda do amplicon foi suspensa em um volume total de aproximadamente 20 pL de água ultra-pura estéril e 5 a 10 L desta solução foi usada na ligação feita a aproximadamente 16 °C por 10 a 12 h, de acordo com manual do fabricante (TOPO® TA Cloning® Kit for subcloning - Invitrogen) . A mistura de ligação (~6 μΐ) contendo vetor TOPO + amplicon da GDPase, foi adicionada a aproximadamente 100 L de solução contendo bactérias E. coli TOP 10F' , previamente tornadas competentes (Sambrook J. , Fritsch E. F. and Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . A mistura foi incubada em gelo por 45 a 60 min, submetida a choque térmico (42 °C) por 1 a 5 min e colocada novamente no gelo. Adicionaram-se 1 a 5 mL de LB-Líquido (1% triptona, 0,5 % extrato de levedura, 1% NaCl, pH 7.5) seguido de incubação a 37 °C por 40 min com agitação de 180 rpm em Shaker TE-420. O volume total dessa mistura foi dividido em três aliquotas e plaqueado em meio sólido LB- Agar (1% triptona, 0,5 % extrato de levedura, 1% NaCl, 1,5% select Agar pH 7.5) contendo ampicilina (5 a 10 mg/mL~ 1) e incubadas por 12 a 14 h a 37 °C.
Os clones resistentes a ampicilina foram recuperados e utilizados para confirmação da presença do plasmideo contendo o gene de interesse por PCR e análise de restrição (utilizando BamH I e Sal I) a partir do plasmideo extraído por minipreparação plasmidial de acordo com (Sambrook J. , Fritsch E. F. and Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Um dos clones isolados e confirmado foi então submetido a sequenciamento automático parcial usando iniciadores flanqueadores da região de clonagem em aparelho Mega-Bace de acordo com instruções do fabricante. Os clones que continham a construção foram estocados em meio LB-liquido em tubos de microcentrifuga com 20% de glicerol e mantidos a -80 °C.
Extração do DNA plasmidial
O DNA plasmidial (DNAp) foi extraido pelo método da lise alcalina (Sambrook J. , Fritsch E. F. and Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) como descrito a seguir. Para isso, os clones positivos da transformação com
0 vetor TOPO, foram crescidos em tubos de rosca individuais contendo 3 mL de LB e 30 μΐ. de ampicilina (5 a 10 mg/mL-1) por 12 a 14 h a 37 °C em 180 a 200 rpm. Após o crescimento um volume de 1,5 mL de cada cultura foi transferido para tubos de microcentrifuga, e as células foram coletadas por centrifugação (Centrífuga 5415C- EPPENDORF) a 12000 x g por
1 a 5 min. 0 sedimento celular foi lavado com 0,5 a 1 mL de STE (0,1 NaCl, 10 mM Tris.Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0) para retirada de inibidores de endonucleases . Após a centrifugação foram adicionados de 200 a 300 da solução I (25 mM Tris.Cl pH 8.0, 10 mM de EDTA e 5mM de D-Glicose) gelada e suspenso vagarosa e completamente o "pellet". Em seguida foram adicionados de 200 a 300 L da solução II (NaOH 0,2M, SDS 1%) preparada na hora, e os tubos foram invertidos lentamente por 6 a 10 vezes e mantidos no gelo por 5 a 10 min. Após isso, 150 a 300 pL da solução III (3 M Kac, 2 M Hac pH 8.0) gelada foram adicionados e os tubos foram invertidos lentamente 6 a 10 vezes e mantidos no gelo por 5 min. Em seguida os tubos foram centrifugados por 12000 x g por 5 a 10 min e transferidos os sobrenadantes para outros tubos novos onde foram adicionados 5 L de RNAse A (10 pg/uL) e mantidos os tubos a 37 °C em banho- maria por 30 a 50 min.
A cada tubo foram adicionados 550 a 700 pL de fenol: clorofórmio (1:1), e os tubos foram invertidos lentamente por cerca de 5 a 10 vezes e centrifugados a 12000 x g por 5 a 10 min. Esse procedimento se repetiu mais uma vez. A fase aquosa foi transferida para tubos novos. Em seguida adicionou-se 550 a 700 pL de clorofórmio e foi realizada nova centrifugação a 12000 x g por 5 a 10 min. A fase superior foi transferida para novos tubos, onde foram adicionados 550 a 700 L de isopropanol gelado. Os tubos foram invertidos lentamente e mantidos a -70 °C por 10 a 20 min. Em seguida as amostras foram centrifugadas a 12000 x g por 5 a 10 min, o sobrenadante foi descartado e os tubos foram colocados para secar por 30 a 50 min sobre papel toalha. O precipitado foi lavado com 200 a 400 pL de etanol 70% gelado e centrifugado a 12000 x g por 5 a 10 min. O sobrenadante foi descartado e os tubos foram colocados para secar por 30 a 50 min. Após estar secos, o DNA plasmidial foi suspenso em 20 a 30 pL de ¾0 deionizada. Os clones foram selecionados por análise de restrição utilizando BamH I e Sal I e confirmados por sequenciamento parcial.
Transferência da região codificante da proteína GDPase recombinante para vetor de expressão em sistema procarioto pET-21b
0 vetor de amplificação TOPO contendo o gene, foi submetido à digestão com BamH I e Sal I. Após a digestão, a mistura do vetor TOPO foi submetida à eletroforese em gel de agarose 1%.
O inserto relativo à região codificante completa da
GDPase foi purificado com kit "PureLink™ Quick Gel Extraction" (invitrogen ) e ligado, de forma análoga a descrita na subclonagem em TOPO, no vetor pET-21b previamente digerido com as mesmas enzimas e purificado também pelo mesmo kit. A Figura 1.2 mostra um esquema da construção pET-21b-GDPase .
Bactérias E. coli TOP 10F' , previamente tornadas competentes como descrito acima, foram transformadas com o produto de ligação e foram incubadas em meio liquido LB conforme descrito acima (isolamento do clone contendo o TOPO) . A seleção dos clones foi feita por análise de restrição e sequenciamento . Os clones positivos foram estocados em tubos de microcentrifuga, contendo 15 a 30 % de glicerol, e mantidos a temperatura de -70 °C.
Expressão da proteína GDPase recombinante e análise em gel de SDS
A expressão total das proteínas recombinantes foi feita, em média escala, em 250 mL de LB. 0 cassete de expressão do vetor pET-21b, destacando os sítios de clonagem e sequência de 6 resíduos de histidina na porção carboxi-terminal da proteína recombinante, está esquematizado na Figura 1.2.
Bactérias competentes, da linhagem E. coli BL21(DE-3), foram transformadas com a construção pET-21b-GDPase, de modo análogo ao realizado com vetor TOPO. O gene gi 1154872131 codifica um RNAm para a produção de uma proteína de 78,2 kDa cuja sequência de aminoácidos predita está descrita na SEQ. ID. N° 2.
Um total de 45 nucleotídeos extra, correspondentes a 15 aminoácidos a mais na extremidade carboxi-terminal da proteína recombinante foram adicionados à proteína final pela ligação do gene alvo com o vetor pET-21b, que codifica 9 aminoácidos de ligação entre a proteína GDPase e a cauda de hexa-histidina mais 6 de histidinas. Na porção aminoterminal um total de 14 aminoácidos foram inseridos.
Em seguida, realizou-se um pré-inoculo em 5 a 7 mL de meio liquido LB contendo 50 pL de ampicilina (5 a 10 mg/mL~ 1) a partir do clone preservado em glicerol. Este pré- inoculo foi incubado por 16 a 20 h a 37 °C sob agitação. Uma aliquota de 2,5 a 5 mL de cultura foi coletada e inoculada em um volume total de 250 mL de LB-líquido contendo 2,5 mL de ampicilina (5 a 10 mg/mL-1). Essa mistura foi incubada a 37 °C sob agitação e o crescimento celular foi acompanhado pela leitura de sua DOÔOO (densidade ótica) . Para indução da proteína recombinante modificada usou-se IPTG (isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) . No momento em que a DOÔOO atingiu cerca de 0,6 a 0,8, foram adicionados aos tubos de cada clone aproximadamente 0,3 mM de IPTG. A incubação prosseguiu por 2 a 4 h a 37 °C sob agitação.
Após a indução a cultura foi centrifugada 3000 x g e o sedimento obtido foi mantido no gelo por 15 a 30 min e suspenso em tampão de lise (50 mM Tris (pH 8.0), 300 m NaCl, em água destilada) , na proporção de 3 a 5 mL por grama de sedimento, contendo 30 a 50 L de PMSF (100 mg/mL) , 50 a 100 μΙ> de aprotinina (1 mg/mL) , 50 a 100 μ1> de pepstatina (1 mg/mL) . Em seguida foi adicionado 1 a 5 mg/mL de lisozima e manteve-se no gelo por 30 a 50 min.
Procedeu-se então o rompimento final das células por sonicação por 6 a 10 vezes por 10 a 20 segundos na potência 200 W com intervalo de 10 a 20 segundos no gelo entre cada sonicação. Em seguida adicionou-se 0,1% Triton e o material foi centrifugado por 30 a 50 min a 20400 x g a 4 °C, sendo armazenado tanto o "pellet" (fração insolúvel) quanto o sobrenadante (fração solúvel) a - 20 °C para posterior purificação da proteína recombinante.
Para determinar a melhor concentração do IPTG a ser usada como padrão para expressão da proteína recombinante, as colónias foram inoculadas em 4 mL de meio liquido LB contendo 40 pL de ampicilina (5 a 10 mg/mL-1) e incubadas a 37 °C por 12 a 14 h sob agitação. Uma alíquota de 250 a 500 μΐ, de cultura foi coletada e diluída para um volume total de 5 a 10 mL em 11 tubos. Essa mistura foi incubada a 37 °C sob agitação e o crescimento celular foi acompanhado pela leitura de sua ΌΟ500.
Quando a cultura atingiu D060o de aproximadamente 0,6 a 0,8, aliquotou-se 1 a 5 mL da cultura (controle não induzido) , em seguida foram adicionados aos outros tubos, IPTG na concentração seriada de 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 e 1 mM. A incubação prosseguiu por 2 a 4 h a 37 °C sob agitação. Ao final deste tempo 1 mL de cada cultura foi coletado (controles induzidos) e feita a leitura de D06oo. As amostras (controles induzidos e não induzido) foram centrifugadas, o sobrenadante descartado e o sedimento bacteriano misturado com tampão de amostra de SDS-PAGE (62,5 mM Tris.HCl pH 6.8, 10% SDS, 0,01% azul de bromofenol (ABF) , 10% glicerol e 20 mM de β- mercaptoetanol) . As amostras foram aquecidas a 100 °C por 5 a 10 min. Os lisados bacterianos foram analisados por SDS-PAGE 10% de acordo com Laemmli, U. K. , Nature . 227(259): 680-5, 1970. Foi utilizado o sistema de eletroforese vertical Mini-PROTEAN® {BIO-RAD) pequeno (lmm de espessura). As amostras foram aplicadas na D060o 3,0 a 5,0, para um volume total de 20 μΐ por canaleta, e após a eletroforese o gel foi corado com Comassie blue. O padrão de peso molecular utilizado foi o PageRuler™ Unstained Protein Ladder (Figura 3, na parte A) .
Purificação da proteína GDPase recombinante e análise em gel de SDS
Para purificação da proteína recombinante foram empregadas as amostras do sobrenadante (solúvel) . Estas amostras foram mantidas sobre agitação na presença de 500 a 700 \i da resina HIS-Select™ Nickel Affinity Gel devidamente preparada segundo o fabricante, em tubos de 15 mL por 1 a 3 horas a 4 °C. Posteriormente o material foi passado em uma coluna, contendo lã de vidro na extremidade abaixo para impedir perda da resina, e as proteínas não ligadas à coluna foram recuperadas no volume separado da resina. O fluxo foi dependente somente da pressão atmosférica não sendo padronizado.
Após a saída de todo material líquido visível da coluna, manualmente preparada pela imobilização da resina de afinidade a uma seringa de 10 mL, a esta foi adicionado um volume de 2 a 4 mL de tampão de lavagem 1 (50 mM Tris pH '8.0, 300 mM NaCl2, 5 mM MgCl2) . Esse procedimento se repetiu por 2 a 4 vezes. Em seguida foi adicionado um volume de 2 a 4 mL de tampão de lavagem 2 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl2, 5 mM Imidazol, 5 mM MgCl2) . Esse procedimento foi repetido por 2 a 4 vezes. Em seguida foi adicionado um volume -de 2 a 4 mL do tampão de lavagem 3 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl2, 10 mM Imidazol, 5 mM MgCl2) . Esse procedimento foi repetido por 2 a 4 vezes. Posteriormente as proteínas mais fortemente ligadas à resina foram eluídas em tampão de eluição. Um volume de 1,5 a 3 mL do tampão de eluição 1 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl2, 80 mM Imidazol, 5 mM MgCl2) , foi adicionado. Após término desta eluição, um volume de 1 a 3 mL do tampão de eluição 2 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl2, 160 mM Imidazol, 5 mM MgCl2) e finalmente um volume de 1 a 3 mL de tampão de eluição 3 (50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl2, 250 mM Imidazol, 5 mM MgCl2) se procedeu como o primeiro. O processo de eluição 3 se repetiu por mais uma vez. As amostras de todos os passos de purificação foram coletadas em tubos de microcentrifuga e estocadas a 4°C e analisadas em gel de SDS 10% corado com Comassie blue . As amostras foram aplicadas em um volume total de 20 μΐ (Figura 4) . Western Blot
Várias amostras do processo de purificação foram submetidas à eletroforese SDS-PAGE 10% e transferidas sob corrente elétrica para membrana de nitrocelulose sob a condição de transferência de 200-250 mA por 2 a 4 h em sistema de transferência vertical Mini-PROTEAN® 3 Celi Assembly Guide. Após a transferência a membrana foi corada com Ponceau S (Ponceau 0,2% em ácido acético 1,0%) por 10 a 30 min para visualização das bandas protéicas e marcação da região das bandas do padrão de massa molecular. Em seguida a membrana foi descorada com água destilada e colocada em solução de bloqueio com incubação por 1 a 3 hora em temperatura ambiente utilizando o tampão TBS-T (0,01 M Tris; 0,14 M NaCl; 0,1% Tween 20) contendo 5% de leite desnatado .
Posteriormente a membrana passou por uma rápida lavagem em tampão TBS (0,01 M Tris; 0,14 M NaCl) e em seguida foi feita a incubação com o anticorpo primário anti-rNTPDase de Γ. cruzi 1:1000 diluídos em tampão TBS-T por cerca de 16 a 20 h à 100 rpm. Posteriormente a membrana passou por 3 a 6 lavagens com tampão TBS-T por 5 a 10 min, sob leve agitação constante. Em seguida, a membrana foi incubada com o anticorpo secundário anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase, na diluição de 1:20.000. A membrana foi deixada sob agitação a 100 a 200 rpm por 1 a 3 horas. Em seguida, a membrana passou por mais 3 a 6 lavagens com tampão TBS-T por 5 a 10 min, sob as mesmas condições de agitação. A revelação foi realizada com substrato diaminobenzidina (DAB) em solução contendo 50 mM Tris (pH 7,6); 10 mg DAB; 10 L H202 (20%) na ausência de luz por aproximadamente 10 min. Após a revelação a membrana foi tirada com auxilio de uma pinça, parada a reação com água, seca sob papel toalha e a imagem foi digitalizada (Figura 3, parte B) .
Ensaios de ELISA indireto usando a GDPase recombiante de L. major como antigeno
Nos experimentos de ELISA para análise da reatividade da proteína recombinante purificada foram utilizados 8 soros de cães previamente diagnosticados, sendo 3 soros positivos de cães infectados com Leishmania sp., 3 soros de animais negativos e 2 soros positivos de cães infectados com Γ. cruzi.
Para adsorção da rGDPase, placas de micro-diluição foram expostas a uma solução contendo 1,5, 3, 4,5 e 30 g da proteínaGDPase recombinante purificada em tampão 0,1 M carbonato/bicarbonato pH 9.6 e incubadas overnight a 4 °C. Os sítios inespecíficos foram bloqueados incubando-se a placa com solução de bloqueio contendo 5% de soro fetal bovino (SFB) em PBS por uma hora a 37 °C. Posteriormente, a placa foi lavada 3 a 6 vezes com PBS-T (PBS com 0,05% Tween-20) para retirar o excesso de solução de bloqueio. Após as lavagens, o soro foi adicionado na diluição de 1:80. A reação contendo o soro foi incubada por 1 a 3 horas por 37 °C. A lavagem prosseguiu da mesma maneira como descrito anteriormente. A reação com o anticorpo anti-IgG de cão conjugado a peroxidase na diluição 1:5000, foi incubada por 1 a 3 horas por 37 °C. A placa foi novamente lavada conforme descrito acima. A reação da proteína GDPase recombinante com anticorpos foi evidenciada através de revelação com 5 a 10 mg/mL de o-fenilenodiamina (OPD) e 0,01% Η202, em tampão citrato-fosfato (0,1 M ácido cítrico, 0,2 M fosfato de sódio pH 5,0), por 15 a 30 min. A reação foi interrompida pela adição de 32 a 40 μΐ, de uma solução 2,5 M H2S04. A intensidade da reação, relacionada à intensidade da coloração, foi determinada pela leitura de absorbância a 490nm (Labsystems iEMS) . A análise dos dados foi feita no programa Exceli (Figura 5) onde se pode ver o reconhecimento positivo com maior leitura de absorbância dos soros sabidamente positivos para leishmaniose em relação aos soros negativos e de cães com doença de Chagas.
A GDPase recombinante foi posteriormente usada em ensaio com maior número de amostras (Figura 6) mostrando um bom reconhecimento específico na maioria dos soros positivos e negativos utilizados no teste. Análises estatísticas destes dados mostraram Especificidade de 90,3%, Precisão de 72,1% e Sensibilidade de 44,1 %.
Estes resultados em conjunto mostram de forma clara a potencialidade de uso de proteínas da família E-NTPDase de Leishmania como antígenos para o diagnóstico da Leishmnaiose .

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. E-NTPDases recombinantes do género Leishmania caracterizadas por serem homólogas as proteínas naturais, obtidas a partir da sequência nucleotidica dos genes codificantes destas proteínas, incluindo as SEQ. ID. N° 1, SEQ. ID. N° 2, SEQ. ID. N° 3, SEQ. ID. N° 4, SEQ. ID. N° 5, SEQ. ID. N° 6, SEQ. ID. N° 7, SEQ. ID. N° 8, SEQ. ID. N° 9, SEQ. ID. N° 10, SEQ. ID. N° 11 e SEQ. ID. N° 12, e quaisquer variação distinta das referidas sequências, desde que destinadas a conservarem as suas propriedades antigênicas ;
2. E-NTPDase recombinante da Leishmania major, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas SEQ. ID. N° 1 e SEQ. ID. N° 2, derivada do gene codificante da GDPase de Leishmania major, apresentando uma identidade de aminoácidos de 93,74% em relação à proteína GDPase natural de Leishmania major, sendo que à porção aminoterminal são adicionados 42 pares de bases e à porção carboxiterminal são removidos os três últimos nucleotídeos (códon de parada) e adicionados 45 pares de base, possuindo 719 aminoácidos;
3. E-NTPDase recombinante da Leishmania braziliensis, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas SEQ. ID. N° 3 e SEQ. ID. N° 4, derivada do gene codificante da GDPase de Leishmania braziliensis, apresentando uma identidade de aminoácidos de 65,75% em relação à proteína GDPase recombinante da Leishmania major, sendo que à porção aminoterminal são adicionados 42 pares de bases e à porção carboxiterminal são removidos os três últimos nucleotídeos (códon de parada) e adicionados 45 pares de base, possuindo 720 aminoácidos;
4. E-NTPDase recombinante da Leishmania infantum, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas SEQ. ID. N° 5 e SEQ. ID. N° 6, derivada do gene codificante da GDPase de Leishmania infantum, apresentando uma identidade de aminoácidos de 84,49% em relação à proteína GDPase recombinante da Leishmania major, sendo que à porção aminoterminal são adicionados 42 pares de bases e à porção carboxiterminal são removidos os três últimos nucleotídeos (códon de parada) e adicionados 45 pares de base, possuindo 706 aminoácidos;
5. "NTPDase recombinante da Leishmania major", de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas SEQ. ID.
N° 7 e SEQ. ID. N° 8, derivada do gene codificante da NTPDase de Leishmania major, apresentando uma identidade de aminoácidos de 23,09% em relação à proteína GDPase natural de Leishmania major, sendo que à porção aminoterminal foram adicionados 42 pares de bases e à porção carboxiterminal são removidos os três últimos nucleotídeos (códon de parada) e adicionados 39 pares de base, possuindo 452 aminoácidos ;
6. "NTPDase recombinante da Leishmania braziliensis", de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas SEQ.
ID. N° 9 e SEQ. ID. N° 10, derivada do gene codificante da NTPDase de Leishmania braziliensis, apresentando uma identidade de aminoácidos de 23,09% em relação à proteína GDPase natural de Leishmania major, sendo que à porção aminoterminal foram adicionados 42 pares de bases e à porção carboxiterminal são removidos os três últimos nucleotídeos (códon de parada) e adicionados 45 pares de base, possuindo 454 aminoácidos;
7. "NTPDase recombinante da Leishmania infantum", de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas SEQ. ID.
N° 11 e SEQ. ID. N° 12, derivada do gene codificante da NTPDase de Leishmania infantum, apresentando uma identidade de aminoácidos de 22,13% em relação à proteína GDPase natural de Leishmania major, sendo que à porção aminoterminal foram adicionados 42 pares de bases e à porção carboxiterminal são removidos os três últimos nucleotideos (códon de parada) e adicionados 45 pares de base, possuindo 454 aminoácidos;
8. Uso das E-NTPDases recombinantes conforme definidas nas reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser utilizado na produção de kit de diagnóstico para detecção de anticorpos nas leishmanioses causadas por espécies do género Leishmania, em compostos vacinais, em desenvolvimento de anticorpos monoclonais, em marcadores de prognóstico, no desenho racional de drogas inibidoras das E-NTPDases que possam ser usadas na quimioterapia das leishmanioses .
PCT/BR2011/000176 2010-06-08 2011-06-08 E-ntpdases recombinantes, uso na produção de kit de diagnósticos para detecção de anticorpos nas leishmanioses causadas por espécies do gênero leishmania WO2011153602A2 (pt)

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