WO2011152339A1 - 慢性腎臓病の病期を判定する方法又は装置若しくはその作動方法 - Google Patents

慢性腎臓病の病期を判定する方法又は装置若しくはその作動方法 Download PDF

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紀陽 田仲
河野　雅弘
恵美子 佐藤
功一 藤原
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Tanaka Noriaki
Kohno Masahiro
Sato Emiko
Fujiwara Kouichi
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Definitions

  • the present invention relates to a method or apparatus for determining the stage of chronic kidney disease or an operating method thereof.
  • CKD Chronic Kidney Disease
  • End-stage renal failure has been increasing all over the world, and as a countermeasure, it is important that early detection and, therefore, early treatment of so-called “hidden kidney disease” be important.
  • diabetic nephropathy one of the three major complications of diabetes. Because diabetic nephropathy is CKD, diabetes becomes a CKD reserve. According to the 2006 National Health and Nutrition Survey (Ministry of Health, Labor and Welfare), there are an estimated 8.2 million diabetics and 18.7 million with additional diabetes reserves. Since 30% of these patients are thought to have renal failure, CKD patients are expected to increase in the future. For example, the medical cost of dialysis treatment in Japan is about 5.4 million yen per person per year, which is 1.5 trillion yen per year as a whole. As the number of dialysis patients is steadily increasing, medical costs for dialysis treatment are also increasing, and measures to control medical costs are urgently needed. For this reason, it is important all over the world to detect kidney damage early, treat early so as not to worsen the symptoms, and ultimately reduce even one dialysis patient.
  • GFR glomerular filtration rate
  • An object of the present invention is to provide a method or apparatus for determining the stage of chronic kidney disease or an operation method thereof.
  • the inventors of the present invention have made a thorough comparison of the pre-dialysis plasma and pre-dialysis urine of CKD patients in various stages, with trial and error, day and night. We searched for low molecular weight compounds that are related to each other.
  • the present inventors finally found out that there are low molecular compounds whose abundance increases with the progression of the disease stage.
  • the present inventors have also found that there are low molecular weight compounds that are observed only in a specific stage.
  • the present inventors have repeatedly studied and clarified that the plasma abundance of these specific low molecular weight compounds can be an indicator for appropriate determination of the stage of chronic kidney disease, and completed the present invention.
  • the present invention is as follows: (I) Method for determining the stage of chronic kidney disease [Section I-1] A method for determining the stage of chronic kidney disease for a subject suffering from kidney disease, (A-1) The subject-derived specimen is subjected to liquid chromatography / time-of-flight mass spectrometry under the following specific conditions, and at least one selected from the group consisting of the following markers (1) to (16): A step of measuring the amount of the marker, and (B-1) comparing the amount of the marker in the subject-derived sample measured in the step (A-1) with a reference abundance range determined for each stage, Determining the stage indicated by A method characterized by comprising: [Liquid chromatography conditions] Liquid chromatography system: Agilent 1100 Series (Agilent) Column: Cadenza C18 2 ⁇ 150 mm, 3 ⁇ m (Imtakt) Pre-column: TCI OPTI-GURD Fit ODS (TCI) Mobile phase A: 0.05% Formic acid mobile phase
  • the conditions of liquid chromatography and time-of-flight mass spectrometry mean the above-mentioned conditions
  • the markers (1) to (16) mean the markers specified by the above-mentioned retention time and accurate mass, respectively. It shall be.
  • [Section I-2] (C-1) a step of determining that chronic kidney disease in the subject is in the stage when all the stages indicated by the markers determined in step (B-1) are the same,
  • the marker to be measured in the step (A-1) is at least one marker selected from the group consisting of markers (1) to (9), and is described in (Section I-1) or (Section I-2) Method.
  • [Section I-4] A method for determining the stage of chronic kidney disease for a subject suffering from kidney disease, (A-2) The subject-derived specimen is subjected to liquid chromatography / time-of-flight mass spectrometry under the above specific conditions, and at least one selected from the group consisting of the above markers (10) to (16) Measuring the marker, (B-2) a step of determining that the stage of chronic kidney disease in the subject is severe when at least one marker is detected in step (A-2); A method comprising the steps of: [Section I-5] A method for determining the stage of chronic kidney disease for a subject suffering from kidney disease, (B-1) at least selected from the group consisting of the above markers (1) to (16) in the subject-derived specimen, measured using liquid chromatography / time-of-flight mass spectrometry under the above specific conditions The amount of one marker is compared with a reference abundance range determined for each stage, and the stage indicated by each marker is determined, and (C-1) is determined in step (B-1) When
  • (II) Device for determining the stage of chronic kidney disease and its operation method [Section II-1]
  • a device for determining the stage of chronic kidney disease for subjects suffering from kidney disease (A-2) means for measuring at least one marker selected from the group consisting of the above markers (10) to (16) by liquid chromatography / time-of-flight mass spectrometry under the above specific conditions; (B-2) An apparatus comprising means for determining that the stage of chronic kidney disease in the subject is severe when at least one marker is detected in the means (A-2) .
  • [Section II-4] A method of operating the device according to Item II-1, wherein: (A-1) activating the means (A-1) to measure the amount of at least one marker selected from the group consisting of markers (1) to (16) in a sample collected from a subject; (B-1) means (B-1) to determine the stage indicated by each marker by comparing the amount measured in step (a-1) with a reference abundance range determined for each stage. Operating process, (C-1) means (C ⁇ ) for determining that the chronic kidney disease in the subject is in the stage when all the stages indicated by the markers determined in step (b-1) are the same.
  • An operating method characterized by comprising: [Section II-5] A method for operating the device according to Item II-2, wherein: (A-1) activating the means (A-1) to measure the amount of at least one marker selected from the group consisting of markers (1) to (9) in a sample collected from a subject; (B-1) means (B-1) to determine the stage indicated by each marker by comparing the amount measured in step (a-1) with a reference abundance range determined for each stage.
  • Operating process, (C-1) means (C ⁇ ) for determining that the chronic kidney disease in the subject is in the stage when all the stages indicated by the markers determined in step (b-1) are the same.
  • An operating method characterized by comprising: [Section II-6] A method of operating the apparatus according to Item II-3, comprising: (A-2) activating means (A-2) to measure at least one marker selected from the group consisting of markers (10) to (16) in a sample collected from a subject; and (b -2) means (B-2) for determining that the stage of chronic kidney disease in the subject is severe when at least one marker is detected in the sample in step (a-2)
  • the process of operating, An operating method characterized by comprising: (III) Chronic kidney disease staging kit [Section III-1] Chronic kidney disease staging kit, A material necessary for detecting at least one marker selected from the group consisting of the above markers (1) to (16) using liquid chromatography / time-of-flight mass spectrometry under the above specific conditions is included.
  • [Section III-2] A kit for staging chronic kidney disease, A material necessary for detecting at least one marker selected from the group consisting of the above markers (1) to (9) using liquid chromatography / time-of-flight mass spectrometry under the above specific conditions is included.
  • [Section III-3] A kit for staging chronic kidney disease, A kit comprising a material necessary for detecting at least one marker selected from the group consisting of the above markers (10) to (16) by liquid chromatography / time-of-flight mass spectrometry under the above specific conditions.
  • the stage of chronic kidney disease can be determined more appropriately than before by using a novel marker.
  • the stage of chronic kidney disease can be determined easily, at low cost, and in a short time.
  • the first method (method (1)) for determining the stage of chronic kidney disease of the present invention is (A-1) liquid chromatography under the following conditions: / Subject-derived specimen of at least one marker selected from the group consisting of markers (1) to (16) whose retention time and accurate mass (m / z) are as follows, as measured by time-of-flight mass spectrometry: For assessing abundance in liquid [liquid chromatography conditions] Liquid chromatography system: Agilent 1100 Series (Agilent) Column: Cadenza C18 2 ⁇ 150 mm, 3 ⁇ m (Imtakt) Pre-column: TCI OPTI-GURD Fit ODS (TCI) Mobile phase A: 0.05% Formic acid mobile phase B: Acetonitrile elution: Mobile phase B linear gradient from 5% to 95% in mobile phase A 0-15 min Mobile phase B linear gradient from 95% to 100% in mobile phase A 15-20 min 100% mobile phase B retention 20-35 min Flow rate: 0.2
  • the second method (method (2)) for determining the stage of chronic kidney disease of the present invention is (A-2) a retention time and a measurement by liquid chromatography / time-of-flight mass spectrometry under the following conditions: A step of evaluating an abundance in a subject-derived sample of at least one marker selected from the group consisting of markers (10) to (16) each having an accurate mass (m / z) as shown below [liquid chromatography conditions ]
  • Liquid chromatography system Agilent 1100 Series (Agilent) Column: Cadenza C18 2 ⁇ 150 mm, 3 ⁇ m (Imtakt) Pre-column: TCI OPTI-GURD Fit ODS (TCI)
  • the method (1) and (2) for determining the stage of chronic kidney disease according to the present invention is a method in which a test subject-derived sample is used as a test target and to which stage the test subject belongs.
  • stage classification based on glomerular filtration rate which is an evaluation index of renal function
  • GFR glomerular filtration rate
  • Table 1 five stages according to the amount of GFR can be used as they are.
  • the amount of GFR can be estimated by an estimation formula based on the serum creatinine value. This estimated amount of GFR is called “eGFR”.
  • the necessity of introduction of dialysis treatment is determined based on the stage determined by the method (1) or (2) for determining the stage of chronic kidney disease of the present invention. May be. That is, if it is determined that the progression of the stage is high, it is determined that dialysis treatment introduction is necessary, and if it is determined that the progression is low, it is determined that introduction of dialysis treatment is unnecessary. May be.
  • the disease stage in the stage classification (Table 1) based on glomerular filtration rate (GFR), which is an evaluation index of renal function, is 4 (highly reduced GFR) or 5 (renal failure) If it is determined that dialysis treatment introduction is necessary and the disease stage is determined to be 1 to 3, it may be determined that dialysis treatment introduction is unnecessary.
  • GFR glomerular filtration rate
  • the method for determining the stage of chronic kidney disease of the present invention comprises a marker abundance evaluation step (step (A-1) or step (A-2)) and a stage determination step of chronic kidney disease (step (B- 1) and step (C-1) or step (B-2)).
  • a marker abundance evaluation step step (A-1) or step (A-2)
  • a stage determination step of chronic kidney disease step (B- 1) and step (C-1) or step (B-2).
  • the marker abundance evaluation step comprises at least one marker selected from the group consisting of (1) to (16) or (10) to (16) in a sample collected from a human. This is a step of evaluating the abundance.
  • a blood-derived specimen or a urine specimen can be used, but it is not particularly limited.
  • the blood-derived specimen for example, whole blood, serum, or plasma can be used. Among them, serum and plasma are preferable. Further, plasma is more preferable from the viewpoint that the separation time can be shortened or the degradation of the marker to be evaluated is prevented.
  • a substance exhibiting an anticoagulant action by chelating action or the like may be added to these blood-derived specimens. Examples of such a substance exhibiting an anticoagulant action include EDTA (Ethylene Diamine-Tetraacetic Acid). Moreover, you may add the substance which shows a protease inhibitory effect for the same purpose. Examples of the substance exhibiting such anticoagulant action include aprotinin.
  • the specimen may be used as a means for evaluating the abundance of the marker after being subjected to a pretreatment step in advance as necessary.
  • the pretreatment step include a step of removing unnecessary materials by centrifugation or the like.
  • the precipitate may be removed by centrifugation and used for the means.
  • the conditions for centrifugation for example, 3,000 to 10,000 ⁇ g and 5 to 10 minutes are preferable. For example, 10,000g, 10 minutes, etc. are mentioned.
  • solid phase extraction may be performed using a hydrophobic adsorbent as a solid phase extraction column.
  • the solid phase extraction column that is a hydrophobic adsorbent include a Sep-Pak® Light® Cartrides® C18 column (Nihon Waters Co., Ltd.).
  • elution can be performed using 90% methanol, for example.
  • the step of evaluating the abundance of at least one marker selected from the group consisting of (1) to (16) or (10) to (16) is a step of confirming the presence or absence of these, or It is not limited as long as it is a process capable of quantitative measurement.
  • the detection limit of the evaluation means is adjusted to be greater than or equal to the reference abundance of a certain marker, by using this evaluation means, it is possible to evaluate whether or not the marker exists in the specimen in excess of the reference abundance.
  • a step of evaluating that the marker is not present if it is below the detection limit of the evaluation means for example, a step of evaluating that the marker is not present if it is below the detection limit of the evaluation means, and a step of evaluating that the marker is present if it is above the detection limit can be mentioned. .
  • LC-TOFTOMS liquid chromatograph-time-of-flight mass spectrometer
  • LC-Q MS liquid chromatography quadrupole mass spectrometer
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • a spectrophotometer a chemiluminescence measuring instrument, and the like.
  • LC-TOF MS is preferred from the viewpoint of reproducibility or measurement accuracy.
  • m / z peak relative area The value obtained by dividing the average area of the peak area of m / z corresponding to the internal standard by the relative area (hereinafter referred to as “m / z peak relative area”), and comparing this between different samples, the abundance Is evaluated.
  • benzyloxycarbonyl-L-tyrosyl-glutamic acid Z-Tyr-Glu
  • tosyl-L-arginine methyl ester monohydrochloride Tos-Arg-OMe ⁇ HCl
  • the column used for liquid chromatography is not limited as long as the marker can be analyzed. It may be a reverse phase column or a normal phase column. A reverse phase column is preferred.
  • the filler is not limited as long as the marker can be analyzed. An example is C18 (octadecyl).
  • the particle system and length can be appropriately set.
  • the abundance of one marker selected from the group consisting of (1) to (16) or (10) to (16) When quicker or simpler determination is required, it is preferable to evaluate the abundance of one marker selected from the group consisting of (1) to (16) or (10) to (16) . When more reliable determination is required, it is preferable to evaluate the abundance of two or more types of markers selected from these groups. Depending on the degree of certainty required, the abundance of the three types of markers may be evaluated, or the abundance of the four types of markers may be evaluated.
  • GFR has been used as an indicator of CKD severity, but it is calculated based on serum creatinine concentration. Since serum creatinine concentration is strongly influenced by muscle mass, accurate determination is made by eliminating that effect. There was a problem that it was difficult to do. In addition, there was a problem that it was difficult to find a mild kidney injury because no increase in serum creatinine concentration was observed until eGFR was 50% or less.
  • none of the markers (1) to (16) has been used as a conventional marker. By using these as markers, the stage of chronic kidney disease can be more appropriately determined. In particular, since markers (1) to (9) tend to increase in abundance at a milder stage, milder renal disorders can be found by using these markers.
  • Stage determination step of chronic kidney disease is a reference existence in which the abundance of the marker evaluated in step (A-1) is determined for each stage. In comparison with the dose range, when the abundance of all markers is within the reference abundance range of the same stage, it is a step of determining that chronic kidney disease in the subject is in the stage.
  • step (A-2) the presence of at least one marker in step (A-2) indicates that the stage of chronic kidney disease in the subject is severe It is a step of determining.
  • the classification of disease stage is not limited, but for example, the classification shown in Table 1 can be used. In addition, classifications generally accepted in the field can also be used.
  • the reference abundance range of a specific marker at a specific stage is not particularly limited. For example, based on the average value or distribution of the marker abundance in a sample collected from a plurality of patients belonging to the stage. It can be confirmed.
  • a standard stage may be determined, and a magnification with respect to the abundance of the marker in the standard stage may be set as a standard abundance range.
  • a magnification with respect to the abundance of the marker in the standard stage may be set as a standard abundance range.
  • a stage classification standard stage based on GFR it belongs to any one of stages 2 to 5 depending on how many times the average abundance in the healthy person is compared to the healthy person. May be determined.
  • the reference abundance range at this time is specifically referred to as a “reference existence magnification range”.
  • the following is an example of the standard magnification ratio range for each marker. This is a value obtained based on samples collected from five Japanese patients belonging to each stage. However, when the determination method of the present invention is actually performed, a new reference abundance range may be appropriately determined according to the purpose, object, and the like.
  • Reference abundance ratio of marker (1) with positive ion measurement [M + H] + and retention time of 2.03 ⁇ 0.5 (min) and accurate mass (m / z) of 104.10 ⁇ 10 mDa when using healthy subjects as a reference The range is, for example, 1.5 to 3.5 times for stage 2, 3.5 to 5.5 times for stage 3, and 5.5 times or more for stage 4.
  • Reference abundance of marker (2) with positive ion measurement [M + H] + and retention time of 3.80 ⁇ 0.5 (min) and accurate mass (m / z) of 257.10 ⁇ 10 mDa when using healthy subjects as a reference The ranges are, for example, 7 to 9.5 times for stage 3, 9.5 to 24 times for stage 4, and 24 times or more for stage 5.
  • the ranges are, for example, 2 to 2.5 times for stage 2, 2.5 to 7 times for stage 3, 7 to 24 times for stage 4, and 24 times or more for stage 5.
  • the ranges are, for example, 1.3 to 3 times for stage 2, 3 to 4.5 times for stage 3, 4.5 to 8 times for stage 4, and 8 times or more for stage 5.
  • Reference abundance ratio of marker (5) with positive ion measurement [M + H] + , retention time of 8.32 ⁇ 0.5 (min) and accurate mass (m / z) of 265.12 ⁇ 10 mDa when using healthy subjects as a reference The range is, for example, 1.5 to 15 times for stage 3, 15 to 24 times for stage 4, and 24 times or more for stage 5.
  • the ranges are, for example, 1.5 to 6.5 times for stage 2, 6.5 to 11 times for stage 4, and 11 times or more for stage 5.
  • negative ions measured [MH] - reference presence magnification range of retention time is 6.57 ⁇ 0.5 (min) and precise mass (m / z) markers (7) is 211.08 ⁇ 10 mDa is
  • stage 2 is 3 to 5 times
  • stage 3 is 5 to 10 times
  • stage 4 is 10 times or more.
  • negative ions measured [MH] - reference presence magnification range of retention time 7.19 ⁇ 0.5 (min) and precise mass (m / z) markers (8) is 411.13 ⁇ 10 mDa
  • stage 3 is 1.5 to 4 times
  • stage 4 is 4 to 15 times
  • stage 5 is 15 times or more.
  • negative ions measured [MH] - reference presence magnification range of retention time 8.25 ⁇ 0.5 (min) and precise mass (m / z) markers (9) is 263.10 ⁇ 10 mDa
  • stage 3 is 2 to 7 times
  • stage 4 is 7 to 18 times
  • stage 5 is 18 times or more.
  • the stage determination step of chronic kidney disease in method (1) For example, the abundance of the marker evaluated in step (A-1) is compared with the abundance in a healthy person, and if the abundance of all markers is greater than the abundance in a healthy person, chronic kidneys in the subject It may be a step of determining that the disease is at least at an early stage. This enables early detection of chronic kidney disease that has not been possible in the past.
  • “Early stage” as used herein refers to, for example, stage stage 1 (stage of renal injury, although GFR is present) in stage classification (Table 1) based on glomerular filtration rate (GFR), which is an evaluation index of renal function. Is normal or increased), stage 2 (nephropathy present, GFR is mildly decreased), and 3 (moderately decreased GFR).
  • the “early stage” here is preferably the same stage 1 and stage 2 or the same stage 1.
  • the standard is 1.3 times, 1.4 times, 1.5 times, 2 times, 2.5 times, 3 times, 3.5 times, 4 times, 5.5 times, 6 times, 6 times, 5 times 7 times, 7.5 times, 8 times, 8.5 times, 9 times, 9.5 times, and 10 times.
  • the step of determining that the stage of chronic kidney disease is severe means, for example, stage classification based on glomerular filtration rate (GFR) which is an evaluation index of renal function (Table 1) It may be a step of determining that the stage stage is 4 (highly reduced GFR) or 5 (renal failure).
  • GFR glomerular filtration rate
  • the first apparatus (apparatus (1)) for determining the stage of chronic kidney disease of the present invention is based on the following conditions: At least one marker selected from the group consisting of markers (1) to (16), whose retention time and accurate mass (m / z) are as follows, as measured by liquid chromatography / time-of-flight mass spectrometry: For evaluating the abundance of human samples collected from humans [liquid chromatography conditions] Liquid chromatography system: Agilent 1100 Series (Agilent) Column: Cadenza C18 2 ⁇ 150 mm, 3 ⁇ m (Imtakt) Pre-column: TCI OPTI-GURD Fit ODS (TCI) Mobile phase A: 0.05% Formic acid mobile phase B: Acetonitrile elution: Mobile phase B linear gradient from 5% to 95% in mobile phase A 0-15 min Mobile phase B linear gradient from 95% to 100% in mobile phase A 15-20 min 100% mobile phase B retention 20-
  • the second apparatus (apparatus (2)) for determining the stage of chronic kidney disease comprises (A-2) retention time and accurate mass as measured by liquid chromatography / time-of-flight mass spectrometry under the following conditions: Means for evaluating the abundance of at least one marker selected from the group consisting of markers (10) to (16) (m / z) as shown below in a sample collected from a human [liquid chromatography conditions]
  • Liquid chromatography system Agilent 1100 Series (Agilent) Column: Cadenza C18 2 ⁇ 150 mm, 3 ⁇ m (Imtakt) Pre-column: TCI OPTI-GURD Fit ODS (TCI)
  • the apparatus (1) and (2) for determining the stage of chronic kidney disease comprises marker abundance evaluation means (means (A-1) or means (A-2)), and stage of chronic kidney disease. Determination means (means (B-1) and means (C-1) or means (B-2)).
  • marker abundance evaluation means means (A-1) or means (A-2)
  • stage of chronic kidney disease Determination means (means (B-1) and means (C-1) or means (B-2)).
  • the marker abundance evaluation means comprises at least one marker selected from the group consisting of (1) to (16) or (10) to (16) in a sample collected from a human. It is a means for evaluating the abundance.
  • the marker abundance evaluation means is a means for performing the marker abundance evaluation step described in the method for determining the stage of chronic kidney disease of the present invention. Description of the marker abundance evaluation means is omitted because it is the same as that for the marker abundance evaluation step.
  • Stage determination means for chronic kidney disease compares the abundance of the marker evaluated by means (A-1) with a reference abundance range determined for each stage. If the abundance of all markers is within the reference abundance range of the same stage, it is means for determining that chronic kidney disease in the donor of the sample is in the stage.
  • the means (B-2) determines that the stage of chronic kidney disease in the donor of the sample is severe when the presence of at least one marker is recognized in the means (A-2). Means.
  • Mean (A-1) is a means for quantitatively evaluating the abundance of the marker.
  • the reference abundance determined in the same manner as described in the chronic kidney disease stage determination step of the method for determining the stage of chronic kidney disease of the present invention may be used.
  • the means for comparing the abundance of the marker evaluated by the means (A-1) with the reference abundance range is the reference abundance range stored in the memory with the abundance of the marker evaluated by the means (A-1). It may be a means for comparison.
  • the means for comparing the abundance of the marker evaluated by the means (A-1) with the reference abundance range is a means for enabling the person who operates the apparatus to compare with the reference abundance range. May be.
  • a means for visually or audibly transmitting the marker abundance evaluated by the means (A-1) to a person who operates the apparatus may be provided.
  • a display unit that displays the abundance of the marker.
  • a voice transmitting section that informs the presence of the marker by voice.
  • the stage determination means for chronic kidney disease may further comprise means for indicating the determination result.
  • the means for indicating the determination result is not limited, but may be a means for visually displaying the determination result on a separate display unit, a means for indicating the determination result audibly, or the determination result. Further, it may be a means for transmitting to the outside.
  • the method of operating apparatus (1) for determining the stage of chronic kidney disease of the present invention is as follows. (A-1) activating the means (A-1) to measure the amount of at least one marker selected from the group consisting of markers (1) to (16) in a sample collected from a subject; (B-1) means (B-1) to determine the stage indicated by each marker by comparing the amount measured in step (a-1) with a reference abundance range determined for each stage. And (c-1) When all the stages indicated by the markers determined in step (b-1) are the same, it is determined that chronic kidney disease in the subject is in the stage
  • the operation method is characterized by comprising the step of operating the means (C-1).
  • the operation method of the device (2) for determining the stage of chronic kidney disease of the present invention is: (A-2) activating means (A-2) to measure at least one marker selected from the group consisting of markers (10) to (16) in a sample collected from a subject; and (b -2) means (B-2) for determining that the stage of chronic kidney disease in the subject is severe when at least one marker is detected in the sample in step (a-2) It is the operating method characterized by comprising the process of operating.
  • the description of the sample, the marker, and the step of evaluating the abundance of the marker is the same as the description of the apparatus for determining the stage of chronic kidney disease according to the present invention, and is therefore omitted.
  • Chronic kidney disease staging kit (1) of the present invention comprises at least one marker selected from the group consisting of markers (1) to (16). It is a kit containing the material necessary for detecting.
  • the stage determination kit (2) for chronic kidney disease of the present invention comprises a material necessary for detecting at least one marker selected from the group consisting of markers (10) to (16). It is.
  • the explanation of the marker is the same as that in the “method for determining the stage of chronic kidney disease” of the present invention.
  • the material necessary for detecting at least one marker selected from the group consisting of markers (1) to (16) is not limited as long as these markers can be detected.
  • the substance etc. which react specifically with these markers are mentioned.
  • a marker can be detected by allowing such a substance to act on a specimen and detecting the presence or absence or concentration of a reaction product.
  • substances that specifically react with these markers include enzymes that specifically metabolize these markers.
  • a hydrolase is used as an enzyme, and this hydrolase acts specifically on the marker to generate carbon dioxide (CO 2 ) and water (H 2 O), thereby reducing the oxygen (O 2 ) concentration.
  • the marker abundance can be quantitatively analyzed by detecting the decrease in the oxygen concentration using, for example, an oxygen electrode.
  • a human blood sample was used to search for a marker that could be an indicator of the stage of chronic kidney disease.
  • a plasma sample was used as a sample. Samples collected from 26 patients shown in Table 2 were used. In addition, the staging classification in Table 2 is shown in Table 1.
  • LC-TOF MS was used as an analysis means. The analysis was performed as follows. Plasma samples or urine samples were centrifuged at 10,000 g for 15 minutes to remove precipitates. This was subjected to solid phase extraction using a solid phase column (Sep-Pak Light C18cartridge; Nippon Waters Co., Ltd.) according to the following procedure, and the obtained sample was used as a measurement sample to be subjected to LC-TOF MS.
  • Solid phase extraction conditions Procedure 1. Condition the solid phase column with 1 mL MetOH. Procedure 2. Equilibrate the solid phase column with 1 mL ultrapure water. Procedure 3. Load 500 ⁇ L of plasma sample onto a solid phase column. Procedure 4. Wash with 2 mL of ultrapure water. Procedure 5.
  • markers (1) to (9) P-Nos. 14, 23, 44, 54, 86, and 184, respectively, and N-Nos. 27, 33, and 49, respectively
  • markers (1) to (9) the extent to which the marker abundance increased with reference to healthy subjects was also examined (Tables 4 and 5).
  • markers (10) to (16) P-Nos. 16, 82, 88, 97, and 113, respectively, and N-Nos. 18 and 21
  • markers (10) to (16) P-Nos. 16, 82, 88, 97, and 113, respectively, and N-Nos. 18 and 21
  • markers (10) to (16) P-Nos. 16, 82, 88, 97, and 113, respectively, and N-Nos. 18 and 21
  • the stage of chronic kidney disease can be predicted by measuring markers (1) to (16).
  • chronic kidney disease at an earlier stage can be found by measuring markers (1) to (9).
  • the stage of disease can be predicted to be in stage 4 or 5 particularly for patients derived from specimens for which markers (10) to (16) were measured.
  • the stage derived from the specimen from which the marker (14) was measured can be predicted to be in stage 5.

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Abstract

慢性腎臓病の病期を判定する方法又は装置若しくはその作動方法を提供する。 腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する方法であって、 （Ａ－１）当該被験者由来検体をマーカー（１）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの量を測定する工程、（Ｂ－１）工程（Ａ－１）において測定された被験者由来検体中のマーカーの量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する工程、及び（Ｃ－１）工程（Ａ－１）において測定された各マーカーが示す病期が同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する工程を含むことを特徴とする方法。

Description

慢性腎臓病の病期を判定する方法又は装置若しくはその作動方法
　本発明は、慢性腎臓病の病期を判定する方法又は装置若しくはその作動方法に関する。
　慢性腎臓病（Chronic Kidney Disease：CKD）は、腎障害を示す所見や腎機能低下が慢性的に続く状態のまま放置することにより進行する病気である。そのまま進行すると末期腎不全へと至り、人工透析や腎移植を受けない限り生存が困難となる。
　末期腎不全は全世界的に増加の一途を辿っており、対処としては、いわゆる「隠れ腎臓病」のうちに早期発見、ひいては早期治療を施すことが重要であるとされる。
　現在、日本国内には約1,330万人のCKD患者が存在するといわれている。すなわち、成人の約8人に1人がCKD患者である計算になる。
　透析導入患者の中で最も多い原疾患は糖尿病の3大合併症の一つである糖尿病性腎症である。糖尿病性腎症はCKDであるため、糖尿病はCKD予備軍となる。2006年の国民健康・栄養調査（厚生労働省）によると、糖尿病患者は820万人、さらに糖尿病予備軍を加えると1,870万人と推定されている。このうち3割の患者が腎不全になると考えられるため、今後もCKD患者は増加するとみられる。例えば日本の透析治療にかかる医療費は、一人当たり年間およそ540万円であり、全体で年間1兆5千億円にも上る。透析患者数が増加の一途を辿っているため、透析治療にかかる医療費も増加しており、医療費を抑制するための対策が急務とされている。このため、腎障害を早期発見し、症状を悪化させないよう早期治療を行い、最終的に透析導入患者を1人でも少なくすることが世界中で重要視されている。
　CKDの病期分類には、腎機能の評価指標である糸球体濾過量（GFR）が用いられている。すなわち、GFR量に応じて、5段階の病期に分類することが行われている（非特許文献１）。
　しかしながら、このようにして行われているCKDの病期分類の判定では血清クレアチニン濃度が基準とされており、血清クレアチニン濃度は筋肉量に強く影響されるため、その影響を排除して正確な判定を行うことが難しいという問題があった。また、推定GFR量（eGFR）が50％以下になるまで血清クレアチニン濃度の上昇が認められないため、軽度の腎障害を見つけにくいという問題もあった。それにもかかわらず、現在に至るまで、それに代わる適切な判定方法は開発されていない。
CKD診療ガイド　2007年5月23日修正、12～13頁、日本腎臓学会編、2009年発行
　本発明は、慢性腎臓病の病期を判定する方法又は装置若しくはその作動方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは試行錯誤を日夜重ねながら、各種病期にあるCKD患者の透析前血漿及び透析前尿を互いに綿密に比較し、多大な労力をかけて病期の進行とその存在量との間に関連が認められる低分子化合物の検索を行った。
　この長期間に渡る困難な作業を経て、本発明者らは遂に病期の進行とともにその存在量が増加する低分子化合物が存在することを突き止めた。また、本発明者らは、特定の病期においてのみ観察される低分子化合物が存在することも突き止めた。さらに、本発明者らは検討を重ね、これら特定の低分子化合物の血漿中存在量が慢性腎臓病の病期の適切な判定における指標となりうることを明らかにし、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は次の通りである：
（Ｉ）慢性腎臓病の病期を判定する方法
［項Ｉ－１］
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する方法であって、
（Ａ－１）当該被験者由来検体を下記の特定の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析に供して、下記のマーカー（１）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの量を測定する工程、及び
（Ｂ－１）工程（Ａ－１）において測定された被験者由来検体中のマーカーの量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する工程、
を含むことを特徴とする方法：
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配　0～15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配　15～20 min
移動相Bを100%保持　20～35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70～1,000
オリフィス1電圧：10～40V、-10～ (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500～2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
であるものとする。
［マーカー］
マーカー（１）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が104.10±10 mDaであるマーカー；
マーカー（２）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が257.10±10 mDaであるマーカー；
マーカー（３）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が312.12±10 mDaであるマーカー；
マーカー（４）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が232.15±10 mDaであるマーカー；
マーカー（５）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が265.12±10 mDaであるマーカー；
マーカー（６）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー；
マーカー（７）：負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が211.08±10 mDaであるマーカー；
マーカー（８）：負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が411.13±10 mDaであるマーカー；
マーカー（９）：負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が263.10±10 mDaであるマーカー；
マーカー（１０）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
マーカー（１１）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
マーカー（１２）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
マーカー（１３）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
マーカー（１４）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
マーカー（１５）：負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.05±10 mDaであるマーカー；及び
マーカー（１６）：負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー。
　以下、特に言及しない限り、液体クロマトグラフィーおよび飛行時間型質量分析の条件は上記の条件を、またマーカー（１）～（１６）は、上記保持時間及び精密質量で特定されるマーカーを、それぞれ意味するものとする。
［項Ｉ－２］
さらに、（Ｃ－１）工程（Ｂ－１）において決定された各マーカーが示す病期がすべて同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する工程、
を含むことを特徴とする、（項Ｉ－１）に記載する方法。
［項Ｉ－３］
（Ａ－１）工程において測定するマーカーが、マーカー（１）～（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである（項Ｉ－１）または（項Ｉ－２）に記載する方法。
［項Ｉ－４］
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する方法であって、
（Ａ－２）当該被験者由来検体を上記の特定の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析に供して、上記のマーカー（１０）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを測定する工程、
（Ｂ－２）工程（Ａ－２）において、少なくとも１種のマーカーが検出された場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
［項Ｉ－５］
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する方法であって、
（Ｂ－１）上記の特定の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析を用いて測定された、被験者由来検体中の上記のマーカー（１）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの量を、病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する工程、及び
（Ｃ－１）工程（Ｂ－１）において決定された各マーカーが示す病期がすべて同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
［項Ｉ－６］
工程（Ｂ－１）において対象とするマーカーが、マーカー（１）～（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである（項Ｉ－５）に記載する方法。
（II）慢性腎臓病の病期を判定する装置及びその作動方法
［項II－１］
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する装置であって：
（Ａ－１）上記の特定の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析を用いて、上記のマーカー（１）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの被験者由来検体における量を測定する手段、
（Ｂ－１）手段（Ａ－１）により測定された被験者由来検体中のマーカーの量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する手段、
（Ｃ－１）手段（Ｂ－１）において決定された各マーカーが示す病期がすべて同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する手段、
を備えることを特徴とする装置。
［項II－２］
手段（Ａ－１）において測定するマーカーが、マーカー（１）～（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである、（項II－１）に記載する装置。
［項II―３］
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する装置であって：
（Ａ－２）上記の特定の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析によって、上記のマーカー（１０）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを測定する手段、
（Ｂ－２）手段（Ａ－２）において、少なくとも１種のマーカーが検出された場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定する手段
を備えることを特徴とする装置。
［項II－４］
項II―１に記載の装置の作動方法であって：
（ａ－１）被験者から採取した検体におけるマーカー（１）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの量を測定するように手段（Ａ－１）を作動する工程、
（ｂ－１）工程（ａ－１）により測定された量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定するように手段（Ｂ－１）を作動する工程、
（ｃ－１）工程（ｂ－１）により決定された各マーカーが示す病期がすべて同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定するように手段（Ｃ－１）を作動する工程、
からなることを特徴とする作動方法。
［項II－５］
項II－２に記載の装置の作動方法であって：
（ａ－１）被験者から採取した検体におけるマーカー（１）～（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの量を測定するように手段（Ａ－１）を作動する工程、
（ｂ－１）工程（ａ－１）により測定された量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定するように手段（Ｂ－１）を作動する工程、
（ｃ－１）工程（ｂ－１）により決定された各マーカーが示す病期がすべて同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定するように手段（Ｃ－１）を作動する工程、
からなることを特徴とする作動方法。
［項II－６］
項II－３に記載の装置の作動方法であって：
（ａ－２）被験者から採取した検体におけるマーカー（１０）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを測定するように手段（Ａ－２）を作動する工程、及び
（ｂ－２）工程（ａ－２）において、検体中に少なくとも１種のマーカーが検出された場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定するように手段（Ｂ－２）を作動する工程、
からなることを特徴とする作動方法。
（III）慢性腎臓病の病期判定用キット
［項III－１］慢性腎臓病の病期判定用キットであって、
上記の特定の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析を用いて上記のマーカー（１）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを検出するために必要な材料を含むキット。
［項III－２］
慢性腎臓病の病期判定用キットであって、
上記の特定の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析を用いて上記のマーカー（１）～（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを検出するために必要な材料を含むキット。
［項III－３］
慢性腎臓病の病期判定用キットであって、
上記の特定の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析によって上記のマーカー（１０）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを検出するために必要な材料を含むキット。
　本発明によれば、新規なマーカーを用いることにより、慢性腎臓病の病期の判定を従来よりも適切に行うことができる。
　特に、本発明によれば、簡便に、低コストで、かつ短時間で慢性腎臓病の病期の判定を行うことができる。
　また、本発明により慢性腎臓病の病期を判定することで、多くの腎疾患患者、そしてその診断及び治療等に携わる医療機関の双方が大きなメリットを享受できることが期待される。
各マーカー（ESI-Positive）の病期ステージごとの成分変化(SN>20)を示したグラフである。 各マーカー（ESI-Positive）の病期ステージごとの成分変化(SN>20)を示したグラフである。 各マーカー（ESI-Positive）の病期ステージごとの成分変化(SN>20)を示したグラフである。 各マーカー（ESI-Negative）の病期ステージごとの成分変化(SN>20)を示したグラフである。 各マーカー（ESI-Positive）の病期ステージごとの成分変化を示したグラフである。 各マーカー（ESI-Negative）の病期ステージごとの成分変化を示したグラフである。
　Ｉ．慢性腎臓病の病期を判定する方法
本発明の慢性腎臓病の病期を判定する第一の方法（方法（１））は、（Ａ－１）以下の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析による測定で保持時間及び精密質量 (m/z)がそれぞれ下記の通りであるマーカー（１）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの被験者由来検体における存在量を評価する工程
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配　0～15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配　15～20 min
移動相Bを100%保持　20～35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70～1,000
オリフィス1電圧：10～40V、-10～ (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500～2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
（１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が104.10
±10 mDaであるマーカー；
（２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が257.10
±10 mDaであるマーカー；
（３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が312.12
±10 mDaであるマーカー；
（４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が232.15
±10 mDaであるマーカー；
（５）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が265.12
±10 mDaであるマーカー；
（６）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー；
（７）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が211.10
±10 mDaであるマーカー；
（８）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が411.13
±10 mDaであるマーカー；
（９）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が263.10
±10 mDaであるマーカー；
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.05±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー；並びに
（Ｂ－１）工程（Ａ－１）において測定された被験者由来検体中のマーカーの量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する工程、
（Ｃ－１）工程（Ｂ－１）において決定された各マーカーが示す病期がすべて同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する工程、
を含むことを特徴とする方法である。
　また、本発明の慢性腎臓病の病期を判定する第二の方法（方法（２））は、（Ａ－２）以下の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析による測定で保持時間及び精密質量 (m/z)がそれぞれ下記の通りであるマーカー（１０）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの被験者由来検体における存在量を評価する工程
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配　0～15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配　15～20 min
移動相Bを100%保持　20～35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70～1,000
オリフィス1電圧：10～40V、-10～ (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500～2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.06±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー；並びに
（Ｂ－２）工程（Ａ－２）において少なくとも１種のマーカーの存在が認められた場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定する工程
を含むことを特徴とする方法である。
　本発明の慢性腎臓病の病期を判定する方法（１）及び（２）は、被験者由来検体を検査対象とし、その被験者がいずれの病期に属するかを判定することができる方法である。
　病期としては、例えば、腎機能の評価指標である糸球体濾過量（GFR）を基準とするステージ分類を用いてもよい。すなわち、表１に示すような、GFR量に応じた5段階の病期ステージをそのまま用いることができる。（CKD診療ガイド　2007年5月23日修正、12～13頁、日本腎臓学会編、2009年発行）。なお、GFR量は、血清クレアチニン値を基にした推算式にて推定することができる。この推定GFR量のことを「eGFR」という。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　現在透析治療を受けていない患者に対しては、本発明の慢性腎臓病の病期を判定する方法（１）又は（２）により判定した病期に基づいて透析治療導入の要否を決定してもよい。すなわち、病期の進行度が高いと判断された場合には、透析治療導入が必要であると判断し、進行度が低いと判断された場合には、透析治療導入が不要であると判断してもよい。
　例えば、腎機能の評価指標である糸球体濾過量（GFR）を基準とするステージ分類（表１）における病気ステージが４（GFR高度低下）又は５（腎不全）であると判定された場合に透析治療導入が必要であると判断し、病気ステージが１～３と判断された場合には、透析治療導入が不要であると判断してもよい。
　本発明の慢性腎臓病の病期を判定する方法は、マーカー存在量評価工程（工程（Ａ－１）又は工程（Ａ－２））、及び慢性腎臓病の病期判定工程（工程（Ｂ－１）及び工程（Ｃ－１）、又は工程（Ｂ－２））を含む。以下、各工程に分けて本発明を詳述する。
　マーカー存在量評価工程
マーカー存在量評価工程は、ヒトから採取した検体における（１）～（１６）又は（１０）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの存在量を評価する工程である。
　検体としては、例えば、血液由来検体、又は尿検体等を用いることができるが、特に限定されない。血液由来検体としては、例えば、全血、血清、又は血漿を用いることができる。その中では血清及び血漿が好ましい。さらに分離時間を早めることができるという観点、又は評価対象マーカーの分解を防ぐという観点では、血漿がより好ましい。なお、評価対象マーカーの分解を防ぐためにこれらの血液由来検体に対してキレート作用等により抗凝固作用を示す物質を添加してもよい。そのような抗凝固作用を示す物質としてはEDTA（Ethylene Diamine-Tetraacetic Acid）等が挙げられる。また、同じ目的でタンパク質分解酵素阻害作用を示す物質を添加してもよい。そのような抗凝固作用を示す物質としてはアプロチニン等が挙げられる。
　また、検体は採取後にいったん凍結保存等された場合には、必要に応じてあらかじめ前処理工程に供してからマーカーの存在量を評価する手段に供してもよい。前処理工程としては、例えば遠心分離等により不要物を除去する工程が挙げられる。例えば、血液由来検体として血漿を用いる場合は、必要に応じて、遠心分離して沈殿物を除去してから手段に供してもよい。遠心分離の条件としては、例えば、3,000～10,000 g、5～10分間が好ましい。例えば、10,000g、10分間等が挙げられる。前処理工程としては、さらに、必要に応じて固相抽出工程に供してもよい。例えば、疎水性吸着剤を用いる工程が挙げられる。この場合、疎水性吸着剤を固相抽出カラムとして固相抽出を行ってもよい。疎水性吸着剤である固相抽出カラムとしては例えば、Sep-Pak Light Cartrides C18カラム（日本ウォーターズ株式会社）が挙げられる。この場合、例えば、90%メタノールを用いて溶出することができる。
　（１）～（１６）又は（１０）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの存在量を評価する工程は、これらの存在の有無を確認することができる工程、又は定量的に測定することができる工程であればよく限定されない。
　評価手段の検出限界をあるマーカーの基準存在量以上となるように調整すれば、この評価手段を用いることによって、検体においてマーカーが基準存在量以上存在しているか否かを評価することができる。この場合、存在の有無を確認する工程としては、例えば、評価手段の検出限界以下であればマーカーが存在しないと評価し、一方、検出限界以上であればマーカーが存在すると評価する工程が挙げられる。
　定量的に測定する工程としては、例えば、液体クロマトグラフ－飛行時間型質量分析計（LC-TOF MS）液体クロマトグラフィー四重極型質量分析計(LC-Q MS)、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、分光光度計、化学発光計測器等が挙げられる。再現性、又は測定精度という観点ではLC-TOF MSが好ましい。
　例えば、評価する工程としてLC-TOF MSを用いる場合、あらかじめ検体中に複数種の内部標準物質を添加してからLC-TOF MSにて分析を行い、マーカーに対応するm/zのピーク面積を内部標準物質に対応するm/zのピーク面積の平均面積で割った値を相対面積（以下、「m/zピーク相対面積」という。）とし、これを異なる検体間で比較することにより存在量を評価することが挙げられる。
　内部標準物質としては、例えば、benzyloxycarbonyl-L-tyrosyl-glutamic acid (Z-Tyr-Glu)、tosyl-L-arginine methyl ester monohydrochloride (Tos-Arg-OMe・HCl)等を用いることができる。
　液体クロマトグラフィー（LC）に用いるカラムは、マーカーを解析することができればよく限定されない。逆相カラムであってもよいし、順相カラムであってもよい。逆相カラムが好ましい。充填剤もマーカーを解析することができればよく限定されない。例えば、C18（オクタデシル）が挙げられる。粒子系や長さは適宜設定することができる。
　より迅速な、又はより簡便な判定が求められる場合は、（１）～（１６）又は（１０）～（１６）からなる群より選択される１種のマーカーの存在量を評価することが好ましい。より確実な判定が求められる場合は、これらの群より選択される２種以上のマーカーの存在量を評価することが好ましい。求められる確実性の程度に応じて３種のマーカーの存在量を評価してもよいし、４種のマーカーの存在量を評価してもよい。
　従来はGFRがCKD重症度の指標とされてきたが、血清クレアチニン濃度を基に算定されるものであり、血清クレアチニン濃度は筋肉量に強く影響されるため、その影響を排除して正確な判定を行うことが難しいという問題があった。また、eGFRが50％以下になるまで血清クレアチニン濃度の上昇が認められないため、軽度の腎障害を見つけにくいという問題もあった。これに対して、マーカー（１）～（１６）はいずれも従来マーカーとしては用いられてこなかった。これらをマーカーとして用いることにより、慢性腎臓病の病期をより適切に判定することができる。特に、マーカー（１）～（９）はより軽度の段階で存在量が上昇してくる傾向があるため、これらを利用することでより軽度の腎障害を発見することができる。
　慢性腎臓病の病期判定工程
方法（１）における慢性腎臓病の病期判定工程は、工程（Ａ－１）において評価されたマーカーの存在量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較し、全マーカーの存在量が同一の病期の基準存在量範囲内である場合には当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する工程である。
　方法（２）における慢性腎臓病の病期判定工程は、工程（Ａ－２）において少なくとも１種のマーカーの存在が認められた場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定する工程である。
　病期の分類としては、限定されないが、例えば、表１に記載の分類を用いることができる。また、その他にも当該分野で一般的に受け容れられている分類を用いることもできる。
　特定のマーカーの特定の病期における基準存在量範囲は、特に限定されないが、例えば、当該病期に属する複数の患者から採取した検体中の当該マーカーの存在量の平均値や分布を基にして確定することができる。
　また、基準となる病期を定め、その基準病期における当該マーカーの存在量に対する倍率を基準存在量範囲としてもよい。例えば、GFRを基準とするステージ分類基準病期を用いる場合、健常人を基準とし、健常人における存在量の平均値に比べて何倍上昇したかに応じてステージ２～５のいずれかに属すると判定してもよい。このときの基準存在量範囲のことを特別に「基準存在倍率範囲」という。
　下記にそれぞれのマーカーについての基準存在倍率範囲の一例を示す。これは各病期に属する各５名の日本人患者から採取した検体に基づいて得られた値である。ただし、実際に本発明の判定方法を実施するに際しては、その目的や対象等に応じて基準存在量範囲を適宜新たに求めてもよい。
　健常人を基準とするとき、正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が104.10±10 mDaであるマーカー（１）の基準存在倍率範囲は、例えば、ステージ２は１．５～３．５倍、ステージ３は３．５～５．５倍、ステージ４は５．５倍以上である。
　健常人を基準とするとき、正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が257.10±10 mDaであるマーカー（２）の基準存在倍率範囲は、例えば、ステージ３は７～９．５倍、ステージ４は９．５～２４倍、ステージ５は２４倍以上である。
　健常人を基準とするとき、正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が312.12±10 mDaであるマーカー（３）の基準存在倍率範囲は、例えば、ステージ２は２～２．５倍、ステージ３は２．５～７倍、ステージ４は７～２４倍、ステージ５は２４倍以上である。
　健常人を基準とするとき、正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が232.15±10 mDaであるマーカー（４）の基準存在倍率範囲は、例えば、ステージ２は１．３～３倍、ステージ３は３～４．５倍、ステージ４は４．５～８倍、ステージ５は８倍以上である。
　健常人を基準とするとき、正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が265.12±10 mDaであるマーカー（５）の基準存在倍率範囲は、例えば、ステージ３は１．５～１５倍、ステージ４は１５～２４倍、ステージ５は２４倍以上である。
　健常人を基準とするとき、正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー（６）の基準存在倍率範囲は、例えば、ステージ２は１．５～６．５倍、ステージ４は６．５～１１倍、ステージ５は１１倍以上である。
　健常人を基準とするとき、負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が211.08±10 mDaであるマーカー（７）の基準存在倍率範囲は、例えば、ステージ２は３～５倍、ステージ３は５～１０倍、ステージ４は１０倍以上である。
　健常人を基準とするとき、負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が411.13±10 mDaであるマーカー（８）の基準存在倍率範囲は、例えば、ステージ３は１．５～４倍、ステージ４は４～１５倍、ステージ５は１５倍以上である。
　健常人を基準とするとき、負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が263.10±10 mDaであるマーカー（９）の基準存在倍率範囲は、例えばステージ３は２～７倍、ステージ４は７～１８倍、ステージ５は１８倍以上である。
　先述の通りマーカー（１）～（９）はより軽度の段階で存在量が上昇してくる傾向があるため、これらのマーカーを使用する場合、方法（１）における慢性腎臓病の病期判定工程は、例えば、工程（Ａ－１）において評価されたマーカーの存在量を健常人における存在量と比較し、全マーカーの存在量が健常人における存在量よりも多い場合には当該被験者における慢性腎臓病が少なくとも早期段階にあると判定する工程であってもよい。これにより、従来できなかった慢性腎臓病の早期発見が可能となる。ここでいう「早期段階」とは、例えば、腎機能の評価指標である糸球体濾過量（GFR）を基準とするステージ分類（表１）における病期ステージ１（腎障害は存在するが、GFRは正常又は増加）、病期ステージ２（腎障害が存在し、GFRは軽度低下）、及び３（GFR中等度低下）である。また、ここでいう「早期段階」は、好ましくは同ステージ１及びステージ２、若しくは同ステージ１である。
　マーカー存在量が健常人に比べてどの程度多い場合に早期段階にあると判定するかは、使用するマーカー、早期段階の定義、及び被験者の属性等によって変動するため、適宜設定することができる。基準としては例えば１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５．５倍、６倍、６，５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、及び１０倍等が挙げられる。
　方法（２）における「慢性腎臓病の病期が重症であると判定する工程」とは、例えば、腎機能の評価指標である糸球体濾過量（GFR）を基準とするステージ分類（表１）における病期ステージが４（GFR高度低下）又は５（腎不全）であると判定する工程であってもよい。
　ＩＩ．慢性腎臓病の病期を判定する装置及びその作動方法
本発明の慢性腎臓病の病期を判定する第一の装置（装置（１））は、（Ａ－１）以下の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析による測定で保持時間及び精密質量 (m/z)がそれぞれ下記の通りであるマーカー（１）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの、ヒトから採取した検体における存在量を評価する手段
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配　0～15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配　15～20 min
移動相Bを100%保持　20～35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70～1,000
オリフィス1電圧：10～40V、-10～ (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500～2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
（１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が104.10±10 mDaであるマーカー；
（２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が257.10±10 mDaであるマーカー；
（３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が312.12±10 mDaであるマーカー；
（４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が232.15±10 mDaであるマーカー；
（５）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が265.12±10 mDaであるマーカー；
（６）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー；
（７）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が211.10±10 mDaであるマーカー；
（８）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が411.13±10 mDaであるマーカー；
（９）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が263.10±10 mDaであるマーカー；
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.06±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー；並びに
（Ｂ－１）手段（Ａ－１）により測定された被験者由来検体中のマーカーの量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する手段、
（Ｃ－１）手段（Ｂ－１）において決定された各マーカーが示す病期がすべて同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する手段、
を備えることを特徴とする装置である。
　本発明の慢性腎臓病の病期を判定する第二の装置（装置（２））は、（Ａ－２）以下の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析による測定で保持時間及び精密質量(m/z)がそれぞれ下記の通りであるマーカー（１０）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの、ヒトから採取した検体における存在量を評価する手段
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配　0～15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配　15～20 min
移動相Bを100%保持　20～35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70～1,000
オリフィス1電圧：10～40V、-10～ (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500～2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.06±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー；並びに
（Ｂ－２）手段（Ａ－２）において、少なくとも１種のマーカーが検出された場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定する手段、
を備えることを特徴とする装置である。
　本発明の慢性腎臓病の病期を判定する装置（１）及び（２）は、マーカー存在量評価手段（手段（Ａ－１）又は手段（Ａ－２））と、慢性腎臓病の病期判定手段（手段（Ｂ－１）及び手段（Ｃ－１）、又は手段（Ｂ－２））とを備える。以下、手段ごとに分けて本発明を詳述する。
　マーカー存在量評価手段
マーカー存在量評価手段は、ヒトから採取した検体における（１）～（１６）又は（１０）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの存在量を評価する手段である。
　マーカー存在量評価手段は、本発明の慢性腎臓病の病期を判定する方法において説明したマーカー存在量評価工程を実施する手段である。マーカー存在量評価手段についての説明はこのマーカー存在量評価工程に関する説明と同様であるため省略する。
　慢性腎臓病の病期判定手段
慢性腎臓病の病期判定手段は、手段（Ａ－１）により評価されたマーカーの存在量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較し、全マーカーの存在量が同一の病期の基準存在量範囲内である場合には当該検体の提供者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する手段である。
　また、手段（Ｂ－２）は、手段（Ａ－２）において少なくとも１種のマーカーの存在が認められた場合に、当該検体の提供者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定する手段である。
　手段（Ａ－１）はマーカーの存在量を定量的に評価する手段である。本発明の慢性腎臓病の病期を判定する方法の慢性腎臓病の病期判定工程において説明したのと同様にして決定された基準存在量を用いればよい。
　手段（Ａ－１）により評価されたマーカーの存在量を基準存在量範囲と比較する手段は、手段（Ａ－１）により評価されたマーカーの存在量をメモリーに記憶された基準存在量範囲と比較する手段であってもよい。
　また、手段（Ａ－１）により評価されたマーカーの存在量を基準存在量範囲と比較する手段は、本装置を操作する者が基準存在量範囲と比較することができるようにする手段であってもよい。例えば、手段（Ａ－１）により評価されたマーカーの存在量を、本装置を操作する者に対して視覚的又は聴覚的に伝達する手段を備えていてもよい。視覚的に伝達する手段としては、マーカーの存在量を表示する表示部が挙げられる。聴覚的に伝達する手段としては、マーカーの存在量を音声で知らせる音声発信部が挙げられる。
　慢性腎臓病の病期判定手段はさらに判定結果を示す手段を備えていてもよい。判定結果を示す手段は限定されないが、判定結果を別に設ける表示部に視覚的に表示する手段であってもよいし、判定結果を聴覚的に示す手段であってもよいし、又は判定結果をさらに外部に伝達する手段であってもよい。
　慢性腎臓病の病期を判定する装置の作動方法
本発明の慢性腎臓病の病期を判定する装置（１）の作動方法は、
（ａ－１）被験者から採取した検体におけるマーカー（１）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの量を測定するように手段（Ａ－１）を作動する工程、
（ｂ－１）工程（ａ－１）により測定された量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定するように手段（Ｂ－１）を作動する工程、及び
（ｃ－１）工程（ｂ－１）により決定された各マーカーが示す病期がすべて同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定するように手段（Ｃ－１）を作動する工程
からなることを特徴とする作動方法である。
　また、本発明の慢性腎臓病の病期を判定する装置（２）の作動方法は、
（ａ－２）被験者から採取した検体におけるマーカー（１０）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを測定するように手段（Ａ－２）を作動する工程、及び
（ｂ－２）工程（ａ－２）において、検体中に少なくとも１種のマーカーが検出された場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定するように手段（Ｂ－２）を作動する工程
からなることを特徴とする作動方法である。
　検体、マーカー、及びマーカーの存在量を評価する工程についての説明は本発明の慢性腎臓病の病期を判定する装置に関する説明と同様であるため省略する。
　ＩＩＩ．慢性腎臓病の病期判定用キット
本発明の慢性腎臓病の病期判定用キット（１）は、マーカー（１）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを検出するために必要な材料を含むキットである。
　また、本発明の慢性腎臓病の病期判定用キット（２）は、マーカー（１０）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを検出するために必要な材料を含むキットである。
　マーカーについての説明は、本発明の「慢性腎臓病の病期を判定する方法」においてしたのと同様である。
　マーカー（１）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを検出するために必要な材料は、これらマーカーを検出することができればよく限定されない。例えば、これらマーカーと特異的に反応する物質等が挙げられる。そのような物質を検体に作用させて、反応産物の有無又は濃度を検出することによりマーカーを検出することができる。これらマーカーと特異的に反応する物質としては、例えば、これらマーカーを特異的に代謝する酵素が挙げられる。例えば、酵素として加水分解酵素を用い、この加水分解酵素がマーカーに特異的に作用することにより二酸化炭素（CO2）と水（H2O）が生じて酸素（O2）濃度が減少するような場合には、酸素濃度の減少を例えば酸素電極等を用いて検出することによりマーカー存在量の定量分析が可能となる。
［実施例］
　以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の例にのみ限定されるものではない。ヒト血液検体を用いて、慢性腎臓病の病期の指標となりうるマーカーの探索を行った。
　検体としては、血漿検体を用いた。検体としては表２に示す26人の患者から採取したものを用いた。なお、表２中における病期分類は、表１で示したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　分析手段としては、LC-TOF MSを用いた。分析は次の通り行った。血漿検体又は尿検体を10,000 gで15分間遠心分離し、沈殿物を除去した。これを固相カラム（Sep-Pak Light C18cartridge；日本ウォーターズ株式会社）を用いて固相抽出を次の手順で行い、得られたものをLC-TOF MSに供する測定試料とした。
［固相抽出条件］
手順１．固相カラムを1 mL MetOHでコンディショニングする。
手順２．固相カラムを1 mL超純水で平衡化する。
手順３．血漿検体500 μLを固相カラムにロードする。
手順４．超純水2 mLで洗浄する。
手順５．90％ MetOH 300μLで溶出する。
手順６．溶出した試料に内部標準物質としてbenzyloxycarbonyl-L-tyrosyl-glutamic acid (Z-Tyr-Glu)、tosyl-L-arginine methyl ester monohydrochloride (Tos-Arg-OMe・HCl)を添加した。
　この測定試料をLC-TOF MSに供した。液体クロマトグラフィー（LC）の条件は次の二通りでそれぞれn=3ずつ行った。
条件１：
［LC条件］
LC装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配　0～15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配　15～20 min
移動相Bを100%保持　20～35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL　
 飛行時間型質量分析（TOF MS）の条件は次の通りとした。
［TOF MS条件］
測定範囲：m/z 70～1,000
オリフィス1電圧：10～40V、-10～ (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500～2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
 血漿検体に、内部標準物質として2種類のアミノ酸誘導体を混合して分析を行い、その[M+H]+ (ESI Positive) イオン又は [M-H]-(ESI Negative) イオンのピーク面積を内部標準物質のピーク面積の平均値で割った値を相対面積として比較した。マーカー候補物質の保持時間、及び精密質量を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　病期ステージ毎の、各マーカーの変化を図１～６に示す。
　その結果、マーカー（１）～（９）（それぞれ順にＰ－Ｎｏ．１４，２３，４４，５４，８６，及び１８４；並びにＮ－Ｎｏ．２７，３３，及び４９）については、ステージの上昇とともに相対面積も大きくなる傾向が認められた。マーカー（１）～（９）については、さらに健常人を基準としてマーカー存在量がどの程度増加したかについても検討した（表４及び５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　また、マーカー（１０）～（１６）（それぞれ順にＰ－Ｎｏ．１６，８２，８８，９７，及び１１３；並びにＮ－Ｎｏ．１８，及び２１）については、健常人およびステージ２～３で相対面積が確認できなかったのに対して、ステージ４及び５で相対面積が大きくなる傾向が認められた。特にマーカー（１４）（Ｐ－Ｎｏ．１１３）は、健常人およびステージ２～４では相対面積が確認できなかったのに対して、ステージ５で相対面積が大きくなる傾向が認められた。
　これらの結果から、マーカー（１）～（１６）を測定することによって、慢性腎臓病の病期を予測することができることが分かった。特にマーカー（１）～（９）を測定することによって、より早期段階にある慢性腎臓病を発見できることが分かった。また、特にマーカー（１０）～（１６）が測定された検体の由来患者については、病期がステージ４又は５にあると予測することができることも分かった。特に、マーカー（１４）が測定された検体の由来患者については、病期がステージ５にあると予測することができることも分かった。

Claims (11)

  1. 腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する方法であって、
    （Ａ－１）当該被験者由来検体を下記以下の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析に供して、下記のマーカー（１）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの量を測定する工程：
    ［液体クロマトグラフィー条件］
    液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
    カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
    プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
    移動相A：0.05% ギ酸
    移動相B：アセトニトリル
    溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配　0～15 min
    移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配　15～20 min
    移動相Bを100%保持　20～35 min
    流速：0.2 mL/min
    測定試料量：5μL
    ［飛行時間型質量分析条件］
    測定範囲：m/z 70～1,000
    オリフィス1電圧：10～40V、-10～ (-40) V 掃引
    イオンガイド電圧：500～2,500 V掃引
    検出器：2,800 V
    測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
    ［マーカー］
    （１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が104.10±10 mDaであるマーカー；
    （２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が257.10±10 mDaであるマーカー；
    （３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が312.12±10 mDaであるマーカー；
    （４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が232.15±10 mDaであるマーカー；
    （５）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が265.12±10 mDaであるマーカー；
    （６）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー；
    （７）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が211.08±10 mDaであるマーカー；
    （８）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が411.13±10 mDaであるマーカー；
    （９）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が263.10±10 mDaであるマーカー；
    （１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
    （１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
    （１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
    （１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
    （１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
    （１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.05±10 mDaであるマーカー；及び
    （１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー；並びに
    （Ｂ－１）工程（Ａ－１）において測定された被験者由来検体中のマーカーの量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する工程、及び
    （Ｃ－１）工程（Ａ－１）において測定された各マーカーが示す病期が同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する工程
    を含むことを特徴とする方法。
  2. 工程（Ａ－１）において測定するマーカーが、マーカー（１）～（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである請求項１に記載する方法。
  3. 腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する方法であって、
    （Ｂ－１）被験者由来検体について、を下記以下の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析を用いて測定されたに供して、下記のマーカー（１）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの量を、病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する工程、
    ［液体クロマトグラフィー条件］
    液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
    カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
    プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
    移動相A：0.05% ギ酸
    移動相B：アセトニトリル
    溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配　0～15 min
    移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配　15～20 min
    移動相Bを100%保持　20～35 min
    流速：0.2 mL/min
    測定試料量：5μL
    ［飛行時間型質量分析条件］
    測定範囲：m/z 70～1,000
    オリフィス1電圧：10～40V、-10～ (-40) V 掃引
    イオンガイド電圧：500～2,500 V掃引
    検出器：2,800 V
    測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
    ［マーカー］
    （１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が104.10±10 mDaであるマーカー；
    （２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が257.10±10 mDaであるマーカー；
    （３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が312.12±10 mDaであるマーカー；
    （４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が232.15±10 mDaであるマーカー；
    （５）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が265.12±10 mDaであるマーカー；
    （６）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー；
    （７）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が211.08±10 mDaであるマーカー；
    （８）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が411.13±10 mDaであるマーカー；
    （９）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が263.10±10 mDaであるマーカー；
    （１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
    （１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
    （１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
    （１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
    （１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
    （１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.05±10 mDaであるマーカー；及び
    （１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー；並びに
    （Ｃ－１）工程（Ｂ－１）において決定された各マーカーが示す病期がすべて同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する工程
    を含むことを特徴とする方法。
  4. 工程（Ｂ－１）において対象とするマーカーが、マーカー（１）～（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである請求項３に記載する方法。
  5. 腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する方法であって、
    （Ａ－２）当該被験者由来検体を下記条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析に供して、下記のマーカー（１０）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの存在を測定する工程
    ［液体クロマトグラフィー条件］
    液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
    カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
    プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
    移動相A：0.05% ギ酸
    移動相B：アセトニトリル
    溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配　0～15 min
    移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配　15～20 min
    移動相Bを100%保持　20～35 min
    流速：0.2 mL/min
    測定試料量：5μL
    ［飛行時間型質量分析条件］
    測定範囲：m/z 70～1,000
    オリフィス1電圧：10～40V、-10～ (-40) V 掃引
    イオンガイド電圧：500～2,500 V掃引
    検出器：2,800 V
    測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
    ［マーカー］
    （１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.12±10 mDaであるマーカー；
    （１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.26±10 mDaであるマーカー；
    （１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.28±10 mDaであるマーカー；
    （１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.15±10 mDaであるマーカー；
    （１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.24±10 mDaであるマーカー；
    （１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.14±10 mDaであるマーカー；及び
    （１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.28±10 mDaであるマーカー；並びに
    （Ｂ－２）工程（Ａ－２）において少なくとも１種のマーカーが検出さの存在が認められた場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定する工程、
    を含むことを特徴とする方法。
  6. 腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する装置であって、
    （Ａ－１）下記以下の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析を用いてによって、下記のマーカー（１）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの被験者由来検体における量を測定する手段
    ［液体クロマトグラフィー条件］
    液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
    カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
    プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
    移動相A：0.05% ギ酸
    移動相B：アセトニトリル
    溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配　0～15 min
    移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配　15～20 min
    移動相Bを100%保持　20～35 min
    流速：0.2 mL/min
    測定試料量：5μL
    ［飛行時間型質量分析条件］
    測定範囲：m/z 70～1,000
    オリフィス1電圧：10～40V、-10～ (-40) V 掃引
    イオンガイド電圧：500～2,500 V掃引
    検出器：2,800 V
    測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
    ［マーカー］
    （１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が104.10±10 mDaであるマーカー；
    （２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が257.10±10 mDaであるマーカー；
    （３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が312.12±10 mDaであるマーカー；
    （４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が232.15±10 mDaであるマーカー；
    （５）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が265.12±10 mDaであるマーカー；
    （６）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー；
    （７）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が211.10±10 mDaであるマーカー；
    （８）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が411.13±10 mDaであるマーカー；
    （９）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が263.10±10 mDaであるマーカー；
    （１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
    （１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
    （１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
    （１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
    （１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
    （１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.05±10 mDaであるマーカー；及び
    （１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー；並びに
    （Ｂ－１）手段（Ａ－１）により測定された被験者由来検体中のマーカーの量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する手段、
    （Ｃ－１）手段（Ｂ－１）において決定された各マーカーが示す病期が同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する手段、
    を備えることを特徴とする装置。
  7. 手段（Ａ－１）により測定するマーカーが、マーカー（１）～（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである請求項６に記載する装置。
  8. 腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する装置であって、
    （Ａ－２）下記以下の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析を用いてによって、下記のマーカー（１０）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを測定する手段
    ［液体クロマトグラフィー条件］
    液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
    カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
    プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
    移動相A：0.05% ギ酸
    移動相B：アセトニトリル
    溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配　0～15 min
    移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配　15～20 min
    移動相Bを100%保持　20～35 min
    流速：0.2 mL/min
    測定試料量：5μL
    ［飛行時間型質量分析条件］
    測定範囲：m/z 70～1,000
    オリフィス1電圧：10～40V、-10～ (-40) V 掃引
    イオンガイド電圧：500～2,500 V掃引
    検出器：2,800 V
    測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
    ［マーカー］
    （１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
    （１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
    （１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
    （１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
    （１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
    （１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.06±10 mDaであるマーカー；及び
    （１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー；並びに
    （Ｂ－２）手段（Ａ－２）において少なくとも１種のマーカーが検出された場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定する手段
    を備えることを特徴とする装置。
  9. 慢性腎臓病の病期判定用キットであって、
    下記以下の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析によって下記のマーカー（１）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを検出するために必要な材料を含むキット
    ［液体クロマトグラフィー条件］
    液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
    カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
    プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
    移動相A：0.05% ギ酸
    移動相B：アセトニトリル
    溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配　0～15 min
    移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配　15～20 min
    移動相Bを100%保持　20～35 min
    流速：0.2 mL/min
    測定試料量：5μL
    ［飛行時間型質量分析条件］
    測定範囲：m/z 70～1,000
    オリフィス1電圧：10～40V、-10～ (-40) V 掃引
    イオンガイド電圧：500～2,500 V掃引
    検出器：2,800 V
    測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
    ［マーカー］
    （１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が104.10±10 mDaであるマーカー；
    （２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が257.10±10 mDaであるマーカー；
    （３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が312.12±10 mDaであるマーカー；
    （４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が232.15±10 mDaであるマーカー；
    （５）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が265.12±10 mDaであるマーカー；
    （６）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー；
    （７）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が211.10±10 mDaであるマーカー；
    （８）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が411.13±10 mDaであるマーカー；
    （９）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が263.10±10 mDaであるマーカー；
    （１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
    （１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
    （１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
    （１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
    （１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
    （１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.05±10 mDaであるマーカー；及び
    （１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー。
  10. マーカーがマーカー（１）～（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである請求項９に記載するキット。
  11. マーカーがマーカー（１０）～（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである請求項９に記載するキット。
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