WO2011149280A2 - 이중 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 이용하는 결핵균과 항산성비결핵균의 검출 방법 - Google Patents

이중 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 이용하는 결핵균과 항산성비결핵균의 검출 방법 Download PDF

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WO2011149280A2
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mycobacterium tuberculosis
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김정욱
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to a method for the detection of Mycobacterium tuberculosis bacteria and nonacidic tuberculosis bacteria. More specifically, a set of primers for detecting Mycobacterium tuberculosis and anti-acidic Mycobacterium tuberculosis, which are able to detect gene sequences specific for Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis and anti-acidic Mycobacterium tuberculosis detection kit comprising the same, and a dual real-time polymerase chain reaction method using the same.
  • the present invention relates to a method for simultaneous detection of Mycobacterium tuberculosis and nonacidic Mycobacterium tuberculosis using fusion curve analysis.
  • Nontuberculous mycobacteria have been recognized as non-pathogenic bacteria widely present in natural environments such as soil and water.
  • AIDS has been prevalent, and it has been confirmed that the bacterium is an opportunistic strain of M. tuberculosis as an opportunistic strain of patients with AIDS, and that it can cause infection in normal patients. Perception has spread.
  • tuberculosis smears and culture-positive specimens are isolated from non-acidic non-tuberculosis bacteria, and in Japan, Hong Kong and Korea, about 10-20% of the anti-acidic tuberculosis bacteria isolated from sputum cause lung disease and In the United States, Canada and Western Europe, about 40-50% are known to cause lung disease.
  • pulmonary disease caused by acidic non-tuberculosis bacillus is easy to be misdiagnosed because it is similar to the slowly progressing pulmonary tuberculosis.
  • the drugs showing susceptibility to tuberculosis bacteria and anti-acidic non-tuberculosis bacillus are different, the method of rapid and accurate detection of tuberculosis bacillus and acidic non-tuberculosis bacillus for selecting therapeutic drugs Is being requested.
  • test reagents for detecting tuberculosis bacteria and non-acidic non-tuberculosis bacteria are not unique to acidic non-tuberculosis bacteria.
  • the problem of poor detection and diagnosis accuracy is that it is incorrectly identified as an acidic non-tuberculosis bacterium that reacts only to the primers of an acidic non-tuberculosis bacterium without reacting to the primer, or when only an acidic non-tuberculosis bacillus is detected when both the acidic non-tuberculosis bacillus and tuberculosis bacteria are present. It is happening.
  • An object of the present invention is to provide a primer set having high detection ability in Mycobacterium tuberculosis-specific IS6110 for accurate detection and diagnosis of Mycobacterium tuberculosis bacteria and anti-acidic non-tuberculosis bacterium and a primer set having high detection ability in 16S rRNA gene of non-acidic tuberculosis bacteria.
  • Still another object of the present invention is to provide a primer set having high detection ability in specific Mycobacterium tuberculosis-specific IS6110 gene for accurate detection and diagnosis of Mycobacterium tuberculosis and nonacidic mycobacterium tuberculosis, and a primer having high detection ability in 16S rRNA gene of mycobacterium tuberculosis. It is to provide a detection kit comprising a set.
  • the present invention is a forward primer of nucleotide sequence 3; One or two or more reverse primers selected from the group consisting of a primer of SEQ ID NO: 4, a primer of SEQ ID NO: 5, and a primer of SEQ ID NO: 6; And it provides a primer set specific for 16S rRNA gene of non-acidic tuberculosis bacterium comprising a reverse primer of SEQ ID NO: 7.
  • the present invention provides a primer set specific for the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis comprising a forward primer of nucleotide sequence 1 and a reverse primer of nucleotide sequence 2; And one or more reverse primers selected from the group consisting of a forward primer of nucleotide sequence 3, a primer of nucleotide sequence 4, a primer of nucleotide sequence 5 and a primer of nucleotide sequence 6, and a reverse primer of nucleotide sequence 7
  • a Mycobacterium tuberculosis bacterium and an anti-acidic Mycobacterium tuberculosis detection kit comprising a primer set specific for a 16S rRNA gene.
  • the present invention comprises the steps of separating the DNA from the sample; A primer set specific for the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis comprising a forward primer of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer of SEQ ID NO: 2; And one or more reverse primers selected from the group consisting of a forward primer of nucleotide sequence 3, a primer of nucleotide sequence 4, a primer of nucleotide sequence 5 and a primer of nucleotide sequence 6, and a reverse primer of nucleotide sequence 7 Subjecting said DNA to dual real-time polymerase chain reaction using a primer set specific for 16S rRNA gene; Melting amplification products amplified by the double real-time polymerase chain reaction while changing temperature to obtain a melting curve; And it provides a method for detecting Mycobacterium tuberculosis and acid non-tuberculous bacteria comprising the step of confirming the melting temperature of the melting curve.
  • the present invention is a forward primer of SEQ ID NO: 20; And it provides a primer set specific to 16S rRNA gene of non-acidic tuberculosis bacterium comprising the reverse primer of SEQ ID NO: 21.
  • the present invention provides a primer set specific for the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis comprising a forward primer of nucleotide sequence 18 and a reverse primer of nucleotide sequence 19; And it provides a tuberculosis bacteria and anti-acidic tuberculosis detection kit comprising a primer set specific to 16S rRNA gene of non-acidic tuberculosis bacterium comprising a forward primer of nucleotide sequence 20 and a reverse primer of nucleotide sequence 21.
  • the present invention comprises the steps of separating the DNA from the sample; A primer set specific for the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis comprising a forward primer of SEQ ID NO: 18 and a reverse primer of SEQ ID NO: 19; And performing a double real-time polymerase chain reaction of the DNA using a primer set specific to 16S rRNA gene of non-acidic tuberculosis bacterium comprising a forward primer of nucleotide sequence 20 and a reverse primer of nucleotide sequence 21; Melting amplification products amplified by the double real-time polymerase chain reaction while changing temperature to obtain a melting curve; And it provides a method for detecting Mycobacterium tuberculosis and acid non-tuberculous bacteria comprising the step of confirming the melting temperature of the melting curve.
  • the present invention provides a primer comprising a primer of nucleotide sequence 38, a primer of nucleotide sequence 39 and a primer of nucleotide sequence 40; And it provides a primer set specific to 16S rRNA gene of non-acidic tuberculosis bacterium comprising the reverse primer of SEQ ID NO: 21.
  • the present invention provides a primer set specific for the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis comprising a forward primer of nucleotide sequence 18 and a reverse primer of nucleotide sequence 19;
  • Mycobacterium tuberculosis comprising a primer set specific for 16S rRNA gene of non-acidic tuberculosis comprising a forward primer comprising a primer of nucleotide sequence 38, a primer of nucleotide sequence 39 and a primer of nucleotide sequence 40, and a reverse primer of nucleotide sequence 21;
  • An acidic non-tuberculosis bacterium detection kit is provided.
  • the present invention comprises the steps of separating the DNA from the sample; A primer set specific for the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis comprising a forward primer of SEQ ID NO: 18 and a reverse primer of SEQ ID NO: 19; And a primer set specific to 16S rRNA gene of non-acidic Mycobacterium tuberculosis comprising a primer of SEQ ID NO: 38, a primer of SEQ ID NO: 39, and a primer of SEQ ID NO: 40, and a reverse primer of SEQ ID NO: 21.
  • the present invention provides a primer set for detecting Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium tuberculosis, and a kit for detecting mycobacterium tuberculosis, and a detection kit comprising the same, and a dual real-time polymerase chain reaction and a melting curve analysis using the same.
  • FIG 1 shows the melting curve analysis of Mycobacterium tuberculosis (MTC) amplification product (MTC) obtained in the double real-time polymerase chain reaction method according to Example 1.
  • MTC Mycobacterium tuberculosis
  • FIG 2 shows the melting curve analysis of the anti-acidic Mycobacterium tuberculosis (NTM) amplified product (amplicon) obtained in the double real-time polymerase chain reaction method according to Example 1.
  • NTM anti-acidic Mycobacterium tuberculosis
  • FIG. 3 shows the melting curve analysis of Mycobacterium tuberculosis (MTC) + anti-acidic tuberculosis (NTM) amplification product (amplicon) obtained in the double real-time polymerase chain reaction method according to Example 1.
  • MTC Mycobacterium tuberculosis
  • NTM anti-acidic tuberculosis
  • FIG 4 shows the melting curve analysis of Mycobacterium tuberculosis (MTC) amplification product (MTC) obtained in the double real-time polymerase chain reaction method according to Example 2.
  • MTC Mycobacterium tuberculosis
  • Figure 5 shows the melting curve analysis of the acid non-tuberculous bacteria (NTM) amplification product (amplicon) obtained in the double real-time polymerase chain reaction method according to Example 2.
  • NTM acid non-tuberculous bacteria
  • FIG. 6 shows a melting curve analysis of Mycobacterium tuberculosis (MTC) + anti-acidic Mycobacterium tuberculosis (NTM) amplification product (amplicon) obtained in a double real-time polymerase chain reaction according to Example 2.
  • MTC Mycobacterium tuberculosis
  • NTM anti-acidic Mycobacterium tuberculosis
  • FIG. 7 shows the melting curve analysis of Mycobacterium tuberculosis (MTC) amplification product (MTC) obtained in the double real-time polymerase chain reaction method according to Example 3.
  • MTC Mycobacterium tuberculosis
  • FIG. 8 shows a melting curve analysis of the anti-acidic Mycobacterium tuberculosis (NTM) amplified product (amplicon) obtained in the double real-time polymerase chain reaction according to Example 3.
  • NTM anti-acidic Mycobacterium tuberculosis
  • FIG. 9 shows a melting curve analysis of Mycobacterium tuberculosis (MTC) + anti-acidic Mycobacterium tuberculosis (NTM) amplification product (amplicon) obtained in the double real-time polymerase chain reaction method according to Example 3.
  • MTC Mycobacterium tuberculosis
  • NTM anti-acidic Mycobacterium tuberculosis
  • a forward primer of SEQ ID NO: 3 One or two or more reverse primers selected from the group consisting of a primer of SEQ ID NO: 4, a primer of SEQ ID NO: 5, and a primer of SEQ ID NO: 6; And it provides a primer set specific for 16S rRNA gene of non-acidic tuberculosis bacterium comprising a reverse primer of SEQ ID NO: 7.
  • the forward primer of SEQ ID NO: 3 is a 16S rRNA gene specific forward primer of non-acidic Mycobacterium tuberculosis.
  • nucleotide sequence 3 5′-ggyrayctgccctgcac-3 ′
  • 5′-ggtaatctgccctgcac-3 ′ base sequence 8
  • 5′-ggtaacctgccctgcac-3 ′ base sequence 9
  • 5′-ggcaatctgccctgcac-3 ′ SEQ ID NO: 10
  • 5′-ggcaacctgccctgcac-3 ′ SEQ ID NO: 11
  • 5′-ggtgatctgccctgcac-3 ′ SEQ ID NO: 12
  • 5′-ggtgacctgccctgcac-3 ′ SEQ ID NO: 13
  • 5′-ggcgatctgccctgcac-3 Primer set comprising ′ (base sequence 14) and
  • 5′-ggtaatctgccctgcac-3 ′, 5′-ggtaacctgccctgcac-3 ′, 5′-ggcaatctgccctgcac-3 ′ and 5′-ggcaacctgccctgcac-3 ′, 5′-ggtgatctgccctgcac-3 ′, 5′-ggtgacc-3gccctg ', 5'-ggcgatctgccctgcac-3' and 5'-ggcgacctgccctgcac-3 ' may be a primer set comprising a ratio of about 1: 1: 1: 1: 1: 1: 1: 1.
  • the primer of SEQ ID NO: 4 (NTM-1), primer of SEQ ID NO: 5 (NTM-1) and primer of SEQ ID NO: 6 (NTM-1) are 16S rRNA gene specific reverse primers.
  • the primer of SEQ ID NO: 7 (NTM-2) is a 16S rRNA gene specific reverse primer of non-acidic Mycobacterium tuberculosis.
  • the reverse primers of the 16S rRNA gene of the anti-acidic tuberculosis bacterium were designed to detect all of the various types of anti-acidic tuberculosis bacteria to be detected.
  • nucleotide sequence 7 5′-catcccacaccgctaccw-3 ′
  • it means a primer set including 5′-catcccacaccgctacct-3 ′ (base sequence 16) and 5′-catcccacaccgctacca-3 ′ (base sequence 17).
  • the primer of SEQ ID NO: 7 may be a primer set including about 5′-catcccacaccgctacct-3 ′ and 5′-catcccacaccgctacca-3 ′ at about 1: 1.
  • a primer set specific for the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis comprising a forward primer of nucleotide sequence 1 and a reverse primer of nucleotide sequence 2; And one or more reverse primers selected from the group consisting of a forward primer of nucleotide sequence 3, a primer of nucleotide sequence 4, a primer of nucleotide sequence 5 and a primer of nucleotide sequence 6, and a reverse primer of nucleotide sequence 7
  • a Mycobacterium tuberculosis bacterium and an anti-acidic Mycobacterium tuberculosis detection kit comprising a primer set specific for a 16S rRNA gene.
  • the Mycobacterium tuberculosis bacterium and the anti-acidic Mycobacterium tuberculosis detection kit include a primer set specific for the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis comprising a forward primer of nucleotide sequence 1 and a reverse primer of nucleotide sequence 2.
  • the primer set of the IS6110 gene of the Mycobacterium tuberculosis bacterium was designed to detect all types of Mycobacterium tuberculosis complex (MTC).
  • the Mycobacterium tuberculosis bacterium and the non-acidic Mycobacterium tuberculosis detection kit include a forward primer of SEQ ID NO: 3; One or more reverse primers selected from the group consisting of a primer of SEQ ID NO: 4 (NTM-1), a primer of SEQ ID NO: 5 (NTM-1), and a primer of SEQ ID NO: 6 (NTM-1); And a primer set specific for 16S rRNA gene of non-acidic Mycobacterium tuberculosis comprising a reverse primer (NTM-2) of SEQ ID NO: 7.
  • the reverse primers of the 16S rRNA gene of the anti-acidic tuberculosis bacterium were designed to detect all of the various types of anti-acidic tuberculosis bacteria to be detected.
  • the reverse primer of the nucleotide sequence 4 and the reverse primer of the nucleotide sequence 7 may be 1: 1, and the reverse primer of the nucleotide sequence 7 may correspond to the reverse primer of the nucleotide sequence 16 and Reverse primer of SEQ ID NO: 17 may be included 1: 1. Accordingly, the primer of base sequence 4, 5′-catcccacaccgctacct-3 ′ (base sequence 16) and 5′-catcccacaccgctacca-3 ′ (base sequence 17) may have a ratio of 2: 1: 1.
  • the reverse primer of the nucleotide sequence 5 and the reverse primer of the nucleotide sequence 7 may be 1: 1
  • the reverse primer of the nucleotide sequence 7 is the reverse primer of the nucleotide sequence 16
  • Reverse primer of SEQ ID NO: 17 may be included 1: 1.
  • the reverse primer of the base sequence 6 and the reverse primer of the base sequence 7 may be 1: 1
  • the reverse primer of the base sequence 7 is the reverse primer of the base sequence 16
  • Reverse primer of SEQ ID NO: 17 may be included 1: 1.
  • the detection kit may include a reagent for amplifying the DNA by real time polymerase chain reaction.
  • Reagents for amplifying the DNA by real-time polymerase chain reaction may include DNA polymerase, dNTPs, PCR buffer, and the like.
  • the Mycobacterium tuberculosis bacillus and the anti-acidic non-tuberculosis detection kit may include a primer designed to be distinct from Mycobacterium tuberculosis and anti-acidic Mycobacterium tuberculosis and mycobacterium tuberculosis and homeopathic non-tuberculosis, while having a large melting temperature difference.
  • the primer set can be designed in consideration of the characteristic melting curve according to the nucleotide sequence, size and GC ratio of the reaction product.
  • Mycobacterium tuberculosis and anti-acidic mycobacterium tuberculosis detection kit is a fluorescent pigment such as SYBR Green is a high resolution melting curve capable of degrading the polymerase chain reaction at high concentration and redistribution of fluorescent pigment during melting It may be disadvantageous for high-resolution melting curve analysis, and may include fluorescent dyes such as SYTO 9, EvaGreen, LCGreen, and the like.
  • the reaction solution for multiple real-time polymerase chain reaction and melting curve analysis may include fluorescent dyes such as SYTO 9, EvaGreen, and LCGreen.
  • the reaction solution for polymerase chain reaction and melting curve analysis may include EvaGreen fluorescent dye.
  • the real-time polymerase chain reaction was performed using a Type-it HRM PCR kit (QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA).
  • the Type-it HRM PCR kit contains EvaGreen as a fluorescent dye.
  • the step of separating the DNA from the sample A primer set specific for the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis comprising a forward primer of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer of SEQ ID NO: 2; And one or more reverse primers selected from the group consisting of a forward primer of nucleotide sequence 3, a primer of nucleotide sequence 4, a primer of nucleotide sequence 5 and a primer of nucleotide sequence 6, and a reverse primer of nucleotide sequence 7
  • Melting curve analysis according to an embodiment of the present invention can be performed by measuring the 510nm fluorescence wavelength.
  • a forward primer of SEQ ID NO: 20 provides a primer set specific to 16S rRNA gene of non-acidic tuberculosis bacterium comprising the reverse primer of SEQ ID NO: 21.
  • the forward primer of SEQ ID NO: 20 is a 16S rRNA gene specific forward primer of non-acidic Mycobacterium tuberculosis.
  • the forward primers of the 16S rRNA gene of the anti-acidic tuberculosis bacterium were designed to detect all of the various types of anti-acidic tuberculosis bacteria to be detected.
  • the reverse primer of SEQ ID NO: 21 is a 16S rRNA gene specific reverse primer of non-acidic tuberculosis bacteria.
  • a primer set specific for the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis comprising a forward primer of nucleotide sequence 18 and a reverse primer of nucleotide sequence 19; And it provides a tuberculosis bacteria and anti-acidic tuberculosis detection kit comprising a primer set specific to 16S rRNA gene of non-acidic tuberculosis bacterium comprising a forward primer of nucleotide sequence 20 and a reverse primer of nucleotide sequence 21.
  • the Mycobacterium tuberculosis bacterium and the anti-acidic Mycobacterium tuberculosis detection kit include a primer set specific for the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis comprising a forward primer of nucleotide sequence 18 and a reverse primer of nucleotide sequence 19.
  • the primer set of the IS6110 gene of the Mycobacterium tuberculosis bacterium was designed to detect all types of Mycobacterium tuberculosis complex (MTC).
  • the Mycobacterium tuberculosis bacillus and anti-acidic Mycobacterium tuberculosis detection kit comprises a forward primer of nucleotide sequence 20; And a primer set specific for the 16S rRNA gene of non-acidic Mycobacterium tuberculosis comprising a reverse primer of SEQ ID NO: 21.
  • the forward primers of the 16S rRNA gene of the anti-acidic tuberculosis bacterium were designed to detect all of the various types of anti-acidic tuberculosis bacteria to be detected.
  • the detection kit may include a reagent for amplifying the DNA by real time polymerase chain reaction.
  • Reagents for amplifying the DNA by real-time polymerase chain reaction may include DNA polymerase, dNTPs, PCR buffer, and the like.
  • the Mycobacterium tuberculosis bacillus and the anti-acidic non-tuberculosis detection kit may include a primer designed to be distinct from Mycobacterium tuberculosis and anti-acidic Mycobacterium tuberculosis and mycobacterium tuberculosis and homeopathic non-tuberculosis, while having a large melting temperature difference.
  • the primer set can be designed in consideration of the characteristic melting curve according to the nucleotide sequence, size and GC ratio of the reaction product.
  • Mycobacterium tuberculosis and anti-acidic mycobacterium tuberculosis detection kit is a fluorescent pigment such as SYBR Green is a high resolution melting curve capable of degrading the polymerase chain reaction at high concentration and redistribution of fluorescent pigment during melting It may be disadvantageous for high-resolution melting curve analysis, and may include fluorescent dyes such as SYTO 9, EvaGreen, LCGreen, and the like.
  • the reaction solution for multiple real-time polymerase chain reaction and melting curve analysis may include fluorescent dyes such as SYTO 9, EvaGreen, and LCGreen.
  • the reaction solution for polymerase chain reaction and melting curve analysis may include EvaGreen fluorescent dye.
  • the real-time polymerase chain reaction was performed using a Type-it HRM PCR kit (QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA).
  • the Type-it HRM PCR kit contains EvaGreen as a fluorescent dye.
  • the step of separating the DNA from the sample A primer set specific for the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis comprising a forward primer of SEQ ID NO: 18 and a reverse primer of SEQ ID NO: 19; And performing a double real-time polymerase chain reaction of the DNA using a primer set specific to 16S rRNA gene of non-acidic tuberculosis bacterium comprising a forward primer of nucleotide sequence 20 and a reverse primer of nucleotide sequence 21; Melting amplification products amplified by the double real-time polymerase chain reaction while changing temperature to obtain a melting curve; And it provides a method for detecting Mycobacterium tuberculosis and acid non-tuberculous bacteria comprising the step of confirming the melting temperature of the melting curve.
  • a forward primer comprising a primer of nucleotide sequence 38, a primer of nucleotide sequence 39 and a primer of nucleotide sequence 40; And it provides a primer set specific to 16S rRNA gene of non-acidic tuberculosis bacterium comprising the reverse primer of SEQ ID NO: 21.
  • the forward primers of nucleotide sequence 38 (NTM-1), nucleotide sequence 39 (NTM-2), and nucleotide sequence 40 (NTM-3) are 16S rRNA gene specific forward primers of non-acidic tuberculosis bacteria.
  • the forward primers of the 16S rRNA gene of the anti-acidic tuberculosis bacterium were designed to detect all of the various types of anti-acidic tuberculosis bacteria to be detected.
  • 5′-tgtggtggaaagcttttgc-3 ′ (base sequence 41) and 5′-tttggtggaaagcttttgc-3 ′ (base sequence 42) may be a primer set including a ratio of about 1: 1.
  • the primer set may include 5′-ggtgagtggtgcaaagctt-3 ′ (base sequence 43) and 5′-ggtgtgtggtgcaaagctt-3 ′ (base sequence 44) in a ratio of about 1: 1.
  • the reverse primer of SEQ ID NO: 21 is a 16S rRNA gene specific reverse primer of non-acidic tuberculosis bacteria.
  • a primer set specific for the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis comprising a forward primer of nucleotide sequence 18 and a reverse primer of nucleotide sequence 19;
  • Mycobacterium tuberculosis comprising a primer set specific for 16S rRNA gene of non-acidic tuberculosis comprising a forward primer comprising a primer of nucleotide sequence 38, a primer of nucleotide sequence 39 and a primer of nucleotide sequence 40, and a reverse primer of nucleotide sequence 21;
  • An acidic non-TB tuberculosis detection kit is provided.
  • the Mycobacterium tuberculosis bacterium and the anti-acidic Mycobacterium tuberculosis detection kit include a primer set specific for the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis comprising a forward primer of nucleotide sequence 18 and a reverse primer of nucleotide sequence 19.
  • the primer set of the IS6110 gene of the Mycobacterium tuberculosis bacterium was designed to detect all types of Mycobacterium tuberculosis complex (MTC).
  • the Mycobacterium tuberculosis bacillus and anti-acidic tuberculosis detection kit is specific for the 16S rRNA gene of the anti-acidic Mycobacterium tuberculosis comprising a forward primer comprising a primer of nucleotide sequence 38, a primer of nucleotide sequence 39 and a primer of nucleotide sequence 40, and a reverse primer of nucleotide sequence 21.
  • the forward primers of the 16S rRNA gene of the anti-acidic tuberculosis bacterium were designed to detect all of the various types of anti-acidic tuberculosis bacteria to be detected.
  • the detection kit may include a reagent for amplifying the DNA by real time polymerase chain reaction.
  • Reagents for amplifying the DNA by real-time polymerase chain reaction may include DNA polymerase, dNTPs, PCR buffer, and the like.
  • the Mycobacterium tuberculosis bacillus and the anti-acidic non-tuberculosis detection kit may include a primer designed to be distinct from Mycobacterium tuberculosis and anti-acidic Mycobacterium tuberculosis and mycobacterium tuberculosis and homeopathic non-tuberculosis, while having a large melting temperature difference.
  • the primer set can be designed in consideration of the characteristic melting curve according to the nucleotide sequence, size and GC ratio of the reaction product.
  • Mycobacterium tuberculosis and anti-acidic mycobacterium tuberculosis detection kit is a fluorescent pigment such as SYBR Green is a high resolution melting curve capable of degrading the polymerase chain reaction at high concentration and redistribution of fluorescent pigment during melting It may be disadvantageous for high-resolution melting curve analysis, and may include fluorescent dyes such as SYTO 9, EvaGreen, LCGreen, and the like.
  • the reaction solution for multiple real-time polymerase chain reaction and melting curve analysis may include fluorescent dyes such as SYTO 9, EvaGreen, and LCGreen.
  • the reaction solution for polymerase chain reaction and melting curve analysis may include EvaGreen fluorescent dye.
  • the real-time polymerase chain reaction was performed using a Type-it HRM PCR kit (QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA).
  • the Type-it HRM PCR kit contains EvaGreen as a fluorescent dye.
  • the step of separating the DNA from the sample A primer set specific for the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis comprising a forward primer of SEQ ID NO: 18 and a reverse primer of SEQ ID NO: 19; And a primer set specific to 16S rRNA gene of non-acidic Mycobacterium tuberculosis comprising a primer of SEQ ID NO: 38, a primer of SEQ ID NO: 39, and a primer of SEQ ID NO: 40, and a reverse primer of SEQ ID NO: 21.
  • Melting curve analysis according to an embodiment of the present invention can be performed by measuring the 510nm fluorescence wavelength.
  • M. abscessus (AJ419970.1, AJ416940.1, AJ536038), M. acapulcensis (AF480575.1), M. africanum (AF480605.1), M. agri (AJ429045) .1), M. aichiense (X55598.1), M. alvei (NR_024859.1), M. asiaticum (X55604.1), M. aurum (FJ172298.1), M. austroafricanum (GU121552.1), M avium (NR_025584.1, AJ536037.1, EF521892.1), M. bohemicum (NR_026054.1), M. botniense (NR_028878.1), M.
  • duvalii (NR_026073.1), M. engbaekii (AF480577.1), M. fallax (AF480600.1) , M. farcinogenes (X55592.1), M. flavescens (AY734993.1), M. fortuitum (AY457066.1, AF480580.1, GU142933.1), M. gadium (NR — 026087.1), M. gastri (GU142918.1), M. genavense (NR_029223.1), M. gilvum (AB491971.1), M. goodii (AY457079.1), M. gordonae (GU142923.1), M. haemophilum (V06638.1) ), M.
  • NR_026011.1 M. heidelbergense (NR_025268.1), M. hiberniae (NR_026092.1), M. hodleri (NR_026286.1), M. immunogen (AJ011771.1), M. interjectum (X70961.1), M. intermedium (X67847.1), M. intracellulare (AY652958.1, AJ536036.1, X52927.1, M61684.1), M.kansasii (M29575.1, X15916.1), M lentiflavum (AF480583.1), M. mageritense (AY457076.1), M. malmoense (GQ153278.1), M.
  • marinum (AF456238.1, AY513243.1), M. microti (NR_025234.1), M. monacense (GU142931.1), M. moriokaense (AY859686.1), M. mucogenicum (AF480585.1), M. neoaurum (FJ172306.1), M. nonchromogenicum (DQ058406.1), M. obuense (X55597.1 ), M. paraffinicum (GQ153282.1), M. parafortuitum (NR_026285.1), M. peregrinum (AY457069.1) , M. phlei (AF480603.1), M. porcinum (AY457077.1), M.
  • thermoresistibile (GU142928.1), M. tilburgii (AJ580826.1), M. triplex (GQ153279 .1), M. triviale (DQ058405.1), M. tuberculosis (GU142936.1, GU142935.1, AY53603.1, X55588.1, X52917.1), M. tusciae (NR_024903.1), M. ulcerans Sequence data of 16S ribosomal RNA genes of (Z13990.1), M. vaccae (X55601.1) , M. wolinskyi (AY457083.1) , and M. xenopi (X52929.1) were used for the analysis. Sequence data of the 16S ribosomal RNA gene of the mycobacteria was obtained from databases of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the nucleotide sequence data of the 16S rRNA gene of the Mycobacteria strain was analyzed by Sequencher 4.9 to find a specific sequence region. In other words, the nucleotide sequence specific to Mycobacterium tuberculosis and the native nucleotide sequence of mycobacterium tuberculosis were not found.
  • Example 1 Isolation and Detection of Mycobacterium Tuberculosis and Antimicrobial Mycobacterium Tuberculosis by Dual Real-Time Polymerase Chain Reaction and Fusion Curve Analysis
  • a method for discriminating Mycobacterium tuberculosis complex (MTC: M. tuberculosis, M.bovis , M. africanum , M. microti ) and non- acidic Mycobacterium tuberculosis (NTM) using dual real-time polymerase chain reaction and fusion curve analysis
  • MTC M. tuberculosis, M.bovis , M. africanum , M. microti
  • NTM non- acidic Mycobacterium tuberculosis
  • the IS6110 gene was detected
  • the antiacidic tuberculosis bacterium was detected for the 16S rRNA gene
  • the forward primer was the common nucleotide sequence of all mycobacteria
  • the reverse primer was the specific nucleotide sequence of the antiacidic tuberculosis bacteria.
  • NTM-1 and NTM-2 sequencing sites were used. The primer for the detection site was designed using the Primer3 program.
  • MTC Mycobacterium tuberculosis complex
  • Average melting temperature (Tm) of PCR product about 86.18 ⁇ 0.16 °C (However, the average melting temperature may be slightly different for each batch)
  • Target Gene 16S rRNA
  • NTM-1 5′-cccacaccgcaaaagctt-3 ′ (base 4) or 5′-cccacaccgcaaaagct-3 ′ (base 5) or 5′-tcccacaccgcaaaagct-3 ′ (base 6)
  • NTM-2 5′-catcccacaccgctaccw-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
  • Average melting temperature (Tm) of PCR products about 80.10 °C to 82.10 °C (Tm value varies depending on the species of anti-acidic tuberculosis bacteria, but has a Tm value in the range of about 80 °C to about 82 °C)
  • Example 1-1 Double real-time polymerase chain reaction and melting curve analysis using primers of nucleotide sequence 4 as the reverse primer NTM-1 for detecting acidic non-TB bacteria>
  • strains of Mycobacterium tuberculosis 78 strains of non-acidic Mycobacterium tuberculosis, and 7 strains of Mycobacteria were isolated from clinical specimens.
  • the ATCC standard strains used were M. tuberculosis (ATCC 25177), M. intracellulare (ATCC 13950), M. scrofulaceum (ATCC 19981), M. kansasii (ATCC 12478), M. fortuitum (ATCC 6841), M. abscessus ( ATCC 19977), M. avium (ATCC 25291).
  • the DNA of mycobacteria grown in liquid medium was extracted as follows. After mixing the bacteria cultured MGIT mycobacterial culture tube well, 500 ⁇ l of liquid medium was taken into a 1.5ml tube and centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was discarded, and 300 ⁇ l of sterile distilled water was added to the remaining sap. Supernatant was used as template DNA for the polymerase chain reaction by centrifugation at 14,000 rpm for 5 minutes after heating the bath.
  • the DNA of mycobacteria grown in solid medium was extracted as follows. 500 ⁇ l of sterile distilled water was added to a 1.5 ml tube, and 1 platinum was taken from a solid medium and then dissolved in sterile distilled water. The tube was heated in boiling water for 10 minutes and then centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes to use the supernatant as template DNA for polymerase chain reaction.
  • the sputum sample was processed as follows. Sputum was liquefied by adding 1N NaOH equal to the amount of sputum contained in a 15 ml or 50 ml tube and left for 10 minutes. The supernatant was discarded by centrifugation at 14,000 rpm for 2 minutes, 1 ml of sterile distilled water was added to the remaining precipitate, mixed well for 10 seconds, and centrifuged at 14,000 rpm for 2 minutes to remove the supernatant. 1 ml of sterile distillation was added to the remaining precipitate, mixed well for 10 seconds, centrifuged at 14,000 rpm for 2 minutes, and the supernatant was discarded.
  • the supernatant was removed, and 100 ⁇ l of 5% chelex resin (Biorad, USA) and 1 ⁇ l of 10 mg / ml proteinase K were added to the remaining precipitates. After standing at 56 ° C. for 15 minutes, the mixture was mixed well and heated in boiling water for 10 minutes. Supernatant was used as template DNA for the polymerase chain reaction by centrifugation at 14,000 rpm for 5 minutes after heating the bath.
  • Dual real time polymerase chain reaction was performed using a Type-it HRM PCR kit (QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA).
  • the Type-it HRM PCR kit contains EvaGreen as a fluorescent dye.
  • Dual real time polymerase chain reaction was performed using Rotor-gene 6000 (QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA). 40 cycles were performed using one cycle of the denaturation process at about 95 ° C. for about 5 minutes, one cycle of denaturation at about 95 ° C. for about 10 seconds, and one annealing and extension process at about 60 ° C. for about 30 seconds.
  • the melting curve was analyzed by measuring the fluorescence wavelength of 510nm while increasing the temperature at about 0.2 ° C per second from about 77 ° C to about 91.5 ° C.
  • the difference in the degree of reaction of the primer was adjusted to adjust the concentration of the primer, the annealing and extension (extension) temperature and the retention time so that the reaction could occur well in both detection sites.
  • the composition of the reaction to perform the double real-time polymerase chain reaction is shown in Table 1.
  • the forward primer and the reverse primer contained the same amount (10 pmole / ⁇ l).
  • MTC primer mix used for the reaction is 17.5 pmole for the forward and reverse primers, respectively, and the total volume of the reaction product performing 25 ⁇ l polymerization chain reaction is 25 ⁇ l.
  • the concentration is 0.7 uM (17.5 pmoles). / 25 mu l).
  • NTM primers were used with 1 ⁇ l of the forward and reverse primers in the reaction. The amount was 10 pmole and the concentration was 0.4 uM (10 pmoles / 25 ⁇ l), respectively.
  • NTM forward primers are 5′-ggtaatctgccctgcac-3 ′ (base 8), 5′-ggtaacctgccctgcac-3 ′ (base 9), 5′-ggcaatctgccctgcac-3 ′ (base 10), 5′-ggcaacctgccctgcac -3 '(base 11), 5'-ggtgatctgccctgcac-3' (base 12), 5'-ggtgacctgccctgcac-3 '(base 13), 5'-ggcgatctgccctgcac-3' (base 14) and 5 ' A primer set comprising -ggcgacctgccctgcac-3 '(base sequence 15), wherein the primers of nucleotide sequence 8, nucleotide sequence 9, nucleotide sequence 10, nucleotide sequence 11, nucleotide sequence 12, nucleotide sequence 13, nucleotide
  • primers of the nucleotide sequence 8, the nucleotide sequence 9, the nucleotide sequence 10, the nucleotide sequence 11, the nucleotide sequence 12, the nucleotide sequence 13, the nucleotide sequence 14, and the nucleotide sequence 15 were prepared to include the same amount of 1.25pmole.
  • NTM-1 reverse primer (SEQ ID NO: 4) and NTM-2 reverse primer (SEQ ID NO: 7) were present in equal amounts of 10 pmole
  • NTM-2 reverse primers were 5'-catcccacaccgctacct-3 '(SEQ ID NO: 16) and 5'-catcccacaccgctacca-3 '(SEQ ID NO: 17) were present in equal amounts of 5 pmoles.
  • Example 1-3 Double real-time polymerase chain reaction and melting curve analysis using primers of nucleotide sequence 6 as the reverse primer NTM-1
  • 1 to 3 show the melting curve analysis of the amplification product (amplicon) obtained in the double real-time polymerase chain reaction method of the strains.
  • 1 to 3 show the melting curves of each of the Mycobacterium tuberculosis (MTC), Mycobacterium tuberculosis (NTM) and Mycobacterium tuberculosis (MTC) + Mycobacterium tuberculosis (NTM).
  • MTC Mycobacterium tuberculosis
  • NTM Mycobacterium tuberculosis
  • MTC Mycobacterium tuberculosis + Mycobacterium tuberculosis
  • the x-axis is the temperature (° C)
  • the y-axis is the change in amount of fluorescence per unit time (dF / dT).
  • the mean melting temperature (Tm) of PCR amplification products of tuberculosis bacteria (MTC) was about 86.18 ⁇ 0.16 °C
  • the mean melting temperature of PCR amplification products of NTM was about 80.10 °C to 82.10 °C.
  • Acidic non-tuberculosis bacteria (NTM) showed two peaks of the mean melting temperature of the tuberculosis bacteria and acidic non-tuberculosis bacteria.
  • tuberculosis bacteria and the non-acidic non-tuberculosis bacteria can be detected with high reliability at the same time in clinical specimens.
  • MTC Mycobacterium tuberculosis complex
  • MTC M. tuberculosis , M. bovis , M. africanum , M. microti
  • NSA from dual real-time polymerase chain reaction and fusion curve analysis
  • the IS6110 gene was detected
  • the antiacidic tuberculosis bacterium was detected for the 16S rRNA gene
  • the forward primer used the specific base region of the antiacidic tuberculosis bacterium
  • the reverse primer was the common nucleotide sequence of all mycobacteria.
  • the site was used.
  • the primer for the detection site was designed using the Primer3 program.
  • MTC Mycobacterium tuberculosis complex
  • Target Gene 16S rRNA
  • Average melting temperature (Tm) of PCR product about 86.7 °C to 88.24 °C (Tm value is different depending on the species of anti-acidic tuberculosis bacteria, but has a Tm value in the range of about 86.5 °C to about 88.5 °C)
  • gordonae KCTC 9513 M. haemophilum ATCC 29548, M.hassiacum ATCC 700660, M.interjectum ATCC 51457, M. intermedium ATCC 51848, M. intracellulare ATCC 13950 , M. intracellulare KCTC 9514, M. kansasii ATCC 12478, M. lentiflavum KMRC 70087, M.malmoense ATCC 29571, M. mantobense KCTC 9977, M.marinum ATCC 927, M.massiliense KCTC 19086 , M.microti ATCC 19422, M. moriokaense KCTC 9516, M. mucogenicum KCTC 19088, M.
  • neoaurum KCTC 19096 M. nonchromogenicum ATCC 19530, M. obuense KCTC 19097, M. parascrofulaceum KCTC 9979 , M. peregrinum KCTC 9615, KMRC 75002, M. phlei KCTC 9689 , M. porcinum KCTC 9517, M. pulveris KCTC 9518, M. scrofulaceum ATCC 19981, M. septicum ATCC 700731, M. simiae ATCC 25275, M. shimoidei ATCC 27962, M. smegmatis KCTC 9108, M. szulgai KCTC 9520, KMRC 31125, M.
  • terrae KCTC 9614 M. triplex ATCC 700071, M. triviale KMRC 70093, M. tuberculosis ATCC 25177, ATCC 27294, M. ulcerans ATCC 19423, M. vaccae KCTC 19087, M. vanbaalenii KCTC 9966 , M. wolinskyi ATCC 700010, M. xenopi KMRC 42001.
  • M. tuberculosis and 78 non-acidic tuberculosis strains isolated from clinical specimens were detected in liquid medium (MGIT mycobacterial medium) or solid (Ogawa medium) or directly in sputum specimens.
  • ATCC and KCTC strains were used in culture in liquid medium, and KMRC strains were used in culture in solid medium.
  • the DNA of mycobacteria grown in liquid medium was extracted as follows. After mixing the bacteria cultured MGIT mycobacterial culture tube well, 500 ⁇ l of liquid medium was taken into a 1.5ml tube and centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was discarded, and 300 ⁇ l of sterile distilled water was added to the remaining sap. Supernatant was used as template DNA for the polymerase chain reaction by centrifugation at 14,000 rpm for 5 minutes after heating the bath.
  • the DNA of mycobacteria grown in solid medium was extracted as follows. 500 ⁇ l of sterile distilled water was added to a 1.5 ml tube, and 1 platinum was taken from a solid medium and then dissolved in sterile distilled water. The tube was heated in boiling water for 10 minutes and then centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes to use the supernatant as template DNA for polymerase chain reaction.
  • the sputum sample was processed as follows. Sputum was liquefied by adding 1N NaOH equal to the amount of sputum contained in a 15 ml or 50 ml tube and left for 10 minutes. The supernatant was discarded by centrifugation at 14,000 rpm for 2 minutes, 1 ml of sterile distilled water was added to the remaining precipitate, mixed well for 10 seconds, and centrifuged at 14,000 rpm for 2 minutes to remove the supernatant. 1 ml of sterile distillation was added to the remaining precipitate, mixed well for 10 seconds, centrifuged at 14,000 rpm for 2 minutes, and the supernatant was discarded.
  • the supernatant was removed, and 100 ⁇ l of 5% chelex resin (Biorad, USA) and 1 ⁇ l of 10 mg / ml proteinase K were added to the remaining precipitates. After standing at 56 ° C. for 15 minutes, the mixture was mixed well and heated in boiling water for 10 minutes. Supernatant was used as template DNA for the polymerase chain reaction by centrifugation at 14,000 rpm for 5 minutes after heating the bath.
  • Dual real time polymerase chain reaction was performed using a Type-it HRM PCR kit (QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA).
  • the Type-it HRM PCR kit contains EvaGreen as a fluorescent dye.
  • Dual real time polymerase chain reaction was performed using Rotor-Gene Q (QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA). 1 cycle of the denaturation process at about 95 ° C. for about 5 minutes, denaturation at about 95 ° C. for about 10 seconds, annealing at about 50 ° C. for about 10 seconds, and extension process at 63 ° C. for about 5 seconds as one cycle, 40 cycles were performed.
  • the melting curve was analyzed by measuring the fluorescence wavelength of 510 nm while increasing the temperature at about 0.2 °C per second from about 75 °C to about 93.5 °C.
  • the difference in the degree of reaction of the primer was adjusted to adjust the concentration of the primer, the annealing and extension (extension) temperature and the retention time so that the reaction could occur well in both detection sites.
  • the composition of the reaction to perform the double real-time polymerase chain reaction is shown in Table 2.
  • the forward primer and the reverse primer contained the same amount (10 pmole / ⁇ l).
  • the forward and reverse primers were 12.5 pmole in 1.25 ⁇ l of the MTC primer mix used for the reaction, and the total volume of the reactants performing the polymerization reaction of 25 ⁇ l was 25 ⁇ l. The concentration was 0.5 uM (12.5 pmoles), respectively. / 25 mu l). Similarly for NTM primers, 1.5 ⁇ l of the forward and reverse primers were used in the reaction, and the amount was 15 pmole and the concentration was 0.6 uM (15 pmoles / 25 ⁇ l), respectively.
  • NTM forward primers are 5′-catgtcttgtgggggaaagctt-3 ′ (base sequence 22), 5′-catgttttgtgggggaaagctt-3 ′ (base sequence 23), 5′-catgtcttctgggggaaagctt-3 ′ (base sequence 24), 5′-catgtcttgtggtggaaagctt-3 ′ (base sequence 25), 5′-catgtcttgtggggcaaagctt-3 ′ (base sequence 26), 5′-catgttttctgggggaaagctt-3 ′ (base sequence 27), 5′-catgtcttctggtggaaagctt-3 ′ (base sequence 28), 5 ′ -catgtcttgtggtgcaaagctt-3 ′ (base sequence 29), 5′-catgttttgtgtgt
  • 4 to 6 show the melting curve analysis of the amplification product (amplicon) obtained in the double real-time polymerase chain reaction method of the strains.
  • 4 to 6 show the melting curves of each of the Mycobacterium tuberculosis (MTC), Mycobacterium tuberculosis (NTM) and Mycobacterium tuberculosis (MTC) + Mycobacterium tuberculosis (NTM).
  • MTC Mycobacterium tuberculosis
  • NTM Mycobacterium tuberculosis
  • MTC Mycobacterium tuberculosis + Mycobacterium tuberculosis
  • the x-axis is the temperature (° C)
  • the y-axis is the change in amount of fluorescence per unit time (dF / dT).
  • the mean fusion temperature (Tm) of PCR amplification products of M. tuberculosis bacterium (MTC) was about 78.0 ⁇ 0.20 ° C, and the mean fusion temperature of PCR amplification products of NTM was about 86.5 ° C to about 88.5 ° C.
  • MTC) + antiacidic non-tuberculosis bacillus (NTM) showed two peaks of the mean melting temperature of the tuberculosis bacteria and the acidic non-tuberculosis bacillus.
  • tuberculosis bacteria and the non-acidic non-tuberculosis bacteria can be detected with high reliability at the same time in clinical specimens.
  • MTC Mycobacterium tuberculosis complex
  • MTC M. tuberculosis , M. bovis , M. africanum , M. microti
  • NSA from dual real-time polymerase chain reaction and fusion curve analysis
  • the IS6110 gene was detected
  • the antiacidic tuberculosis bacterium was detected for the 16S rRNA gene
  • the forward primer used the specific base region of the antiacidic tuberculosis bacterium
  • the reverse primer was the common nucleotide sequence of all mycobacteria.
  • the site was used.
  • the primer for the detection site was designed using the Primer3 program.
  • MTC Mycobacterium tuberculosis complex
  • Target Gene 16S rRNA
  • NTM-1 5′-tktggtggaaagcttttgc-3 ′ (SEQ ID NO: 38)
  • NTM-2 5′-ggtgwgtggtgcaaagctt-3 ′ (SEQ ID NO: 39)
  • NTM-3 5′-tggtggaaagcgtttggt-3 ′ (SEQ ID NO: 40)
  • gordonae KCTC 9513 M. haemophilum ATCC 29548, M. hassiacum ATCC 700660, M. interjectum ATCC 51457, M. intermedium ATCC 51848, M. intracellulare ATCC 13950 , M. intracellulare KCTC 9514, M. kansasii ATCC 12478, M. lentiflavum KMRC 70087, M. malmoense ATCC 29571 , M. mantobense KCTC 9977, M. marinum ATCC 927, M. massiliense KCTC 19086, M. microti ATCC 19422, M. moriokaense KCTC 9516, M. mucogenicum KCTC 19088, M.
  • neoaurum KCTC 19096 M. nonchromogenicum ATCC 19530, M. obuense KCTC 19097, M. parascrofulaceum KCTC 9979 , M. peregrinum KCTC 9615, KMRC 75002, M. phlei KCTC 9689 , M. porcinum KCTC 9517, M. pulveris KCTC 9518, M. scrofulaceum ATCC 19981, M. septicum ATCC 700731, M. simiae ATCC 25275, M. shimoidei ATCC 27962, M. smegmatis KCTC 9108 , M.
  • szulgai KCTC 9520 KMRC 31125, M. terrae KCTC 9614, M. triplex ATCC 700071, M. triviale KMRC 70093, M. tuberculosis ATCC 25177, ATCC 27294, M. ulcerans ATCC 19423, M. vaccae KCTC 19087, M vanbaalenii KCTC 9966 , M. wolinskyi ATCC 700010, M. xenopi KMRC 42001.
  • M. tuberculosis and 78 non-acidic tuberculosis strains isolated from clinical specimens were detected in liquid medium (MGIT mycobacterial medium) or solid (Ogawa medium) or directly in sputum specimens.
  • ATCC and KCTC strains were used in culture in liquid medium, and KMRC strains were used in culture in solid medium.
  • the DNA of mycobacteria grown in liquid medium was extracted as follows. After mixing the bacteria cultured MGIT mycobacterial culture tube well, 500 ⁇ l of liquid medium was taken into a 1.5ml tube and centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was discarded, and 300 ⁇ l of sterile distilled water was added to the remaining sap. Supernatant was used as template DNA for the polymerase chain reaction by centrifugation at 14,000 rpm for 5 minutes after heating the bath.
  • the DNA of mycobacteria grown in solid medium was extracted as follows. 500 ⁇ l of sterile distilled water was added to a 1.5 ml tube, and 1 platinum was taken from a solid medium, and then dissolved in sterile distilled water. The tube was heated in boiling water for 10 minutes and then centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes to use the supernatant as template DNA for polymerase chain reaction.
  • the sputum sample was processed as follows. Sputum was liquefied by adding 1N NaOH equal to the amount of sputum contained in a 15 ml or 50 ml tube and left for 10 minutes. The supernatant was discarded by centrifugation at 14,000 rpm for 2 minutes, 1 ml of sterile distilled water was added to the remaining precipitate, mixed well for 10 seconds, and centrifuged at 14,000 rpm for 2 minutes to remove the supernatant. 1 ml of sterile distillation was added to the remaining precipitate, mixed well for 10 seconds, centrifuged at 14,000 rpm for 2 minutes, and the supernatant was discarded.
  • the supernatant was removed, and 100 ⁇ l of 5% chelex resin (Biorad, USA) and 1 ⁇ l of 10 mg / ml proteinase K were added to the remaining precipitates. After standing at 56 ° C. for 15 minutes, the mixture was mixed well and heated in boiling water for 10 minutes. Supernatant was used as template DNA for the polymerase chain reaction by centrifugation at 14,000 rpm for 5 minutes after heating the bath.
  • Dual real time polymerase chain reaction was performed using a Type-it HRM PCR kit (QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA).
  • the Type-it HRM PCR kit contains EvaGreen as a fluorescent dye.
  • Dual real time polymerase chain reaction was performed using Rotor-Gene Q (QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA). 40 cycles were performed using one cycle of the denaturation process at about 95 ° C. for about 5 minutes, one cycle of denaturation at about 95 ° C. for about 10 seconds, and annealing and extension process at about 61 ° C. for about 30 seconds.
  • the melting curve was analyzed by measuring the fluorescence wavelength of 510 nm while increasing the temperature at about 0.2 °C per second from about 72 °C to about 93 °C.
  • the difference in the degree of reaction of the primer was adjusted to adjust the concentration of the primer, the annealing and the extension temperature, and the retention time so that the reaction could occur well at both detection sites.
  • the composition of the reaction to perform the double real-time polymerase chain reaction is shown in Table 3.
  • the forward primer and the reverse primer contained the same amount (10 pmole / ⁇ l).
  • 1.875 ⁇ l of the primer mix of MTC used for the reaction will have 18.75 pmole of forward and reverse primers, respectively, and the total volume of the reactants that will perform 25 ⁇ l of polymerization will be 25 ⁇ l. / 25 mu l).
  • NTM primers 1.25 ⁇ l of the forward and reverse primers were used in the reaction, and the amount was 12.5 pmole and the concentration was 0.5 uM (12.5 pmoles / 25 ⁇ l), respectively.
  • NTM-1 forward primer base sequence 38
  • NTM-2 forward primer base sequence 39
  • NTM-3 forward primer base sequence 40
  • NTM-1 forward primer SEQ ID NO: 38
  • 5′-tgtggtggaaagcttttgc-3 ′ SEQ ID NO: 41
  • 5′-tttggtggaaagcttttgc-3 ′ SEQ ID NO: 42
  • ⁇ 2 forward primer SEQ ID NO: 39
  • 5′-ggtgagtggtgcaaagctt-3 ′ SEQ ID NO: 43
  • 5′-ggtgtgtggtgcaaagctt-3 ′ SEQ ID NO: 44
  • 7 to 9 show the melting curve analysis of the amplification product (amplicon) obtained in the double real-time polymerase chain reaction method of the strains.
  • 7 to 9 show a melting curve of each of the Mycobacterium tuberculosis (MTC), Mycobacterium tuberculosis (NTM) and Mycobacterium tuberculosis (MTC) + Mycobacterium tuberculosis (NTM).
  • MTC Mycobacterium tuberculosis
  • NTM Mycobacterium tuberculosis
  • NTM Mycobacterium tuberculosis
  • NTM Mycobacterium tuberculosis
  • the x-axis is the temperature (° C)
  • the y-axis is the change in amount of fluorescence per unit time (dF / dT).
  • the mean melting temperature (Tm) of PCR amplification products of tuberculosis bacteria (MTC) was about 78.0 ⁇ 0.20 °C
  • the mean melting temperature of PCR amplification products of non-acidic tuberculosis bacteria (NTM) was about 86.6 ⁇ 0.26 °C.
  • Acidic non-tuberculosis bacteria (NTM) showed two peaks of the mean melting temperature of the tuberculosis bacteria and the acidic non-tuberculosis bacteria.
  • tuberculosis bacteria and the non-acidic non-tuberculosis bacteria can be detected with high reliability at the same time in clinical specimens.
  • the specific base sequence of Mycobacterium tuberculosis and the native nucleotide sequence of mycobacterium tuberculosis which are not present in Mycobacterium tuberculosis were designed as a forward primer or a reverse primer, and a test kit was prepared to perform dual real-time polymerase chain reaction and melting curve analysis.
  • a test kit was prepared to perform dual real-time polymerase chain reaction and melting curve analysis.
  • the primer sets for detecting tuberculosis bacteria and anti-acidic tuberculosis bacteria that can detect gene sequences specific for Mycobacterium tuberculosis and anti-acidic tuberculosis bacteria have high diagnostic susceptibility and specificity to Mycobacterium tuberculosis and anti-acidic tuberculosis bacteria.
  • clinical diagnosis can be more efficiently detected at the same time. Means can be provided.
  • the present invention provides a detection primer set, a detection kit, and a detection method capable of detecting gene sequences specific to Mycobacterium tuberculosis and anti-acidic Mycobacterium tuberculosis. It is possible to provide a clinical diagnostic means to detect acidic non-tuberculosis bacteria more efficiently at the same time, and to apply it to various industries such as hospitals and research institutes.
  • Base sequence 1 is a forward primer specific for the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis complex.
  • SEQ ID NO: 2 is a reverse primer specific for the IS6110 gene of Mycobacterium tuberculosis complex.
  • SEQ ID NO: 3 is a forward primer specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 4 is a reverse primer (NTM-1) specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 5 is a reverse primer (NTM-1) specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 6 is a reverse primer (NTM-1) specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 7 is a reverse primer (NTM-2) specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 8 is a forward primer specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 9 is a forward primer specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 10 is a forward primer specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 11 is a forward primer specific for 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 12 is a forward primer specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 13 is a forward primer specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 14 is a forward primer specific for 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 15 is a forward primer specific for 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 16 is a reverse primer (NTM-2) specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 17 is a reverse primer (NTM-2) specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 18 is a forward primer specific for the IS6110 gene of the Mycobacterium tuberculosis complex.
  • SEQ ID NO: 19 is a reverse primer specific for the IS6110 gene of the Mycobacterium tuberculosis complex.
  • SEQ ID NO: 20 is a forward primer specific for 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 21 is a reverse primer specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 22 is a forward primer specific for 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 23 is a forward primer specific for 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 24 is a forward primer specific for 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 25 is a forward primer specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 26 is a forward primer specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 27 is a forward primer specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 28 is a forward primer specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 29 is a forward primer specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 30 is a forward primer specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 31 is a forward primer specific for 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 32 is a forward primer specific for 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 33 is a forward primer specific for 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 34 is a forward primer specific for 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 35 is a forward primer specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 36 is a forward primer specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 37 is a forward primer specific for the 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 38 is a Forward Primer (NTM-1) specific for 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 39 is a forward primer (NTM-2) specific for 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 40 is a forward primer (NTM-3) specific for 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 41 is a forward primer (NTM-1) specific for 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 42 is a forward primer (NTM-1) specific for 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 43 is a forward primer (NTM-2) specific for 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.
  • SEQ ID NO: 44 is a forward primer (NTM-2) specific for 16S rRNA gene of Nontuberculous mycobacteria.

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Abstract

본 발명은 결핵균 특이적 IS6110 유전자와 항산성비결핵균에 특이적 16S rRNA 유전자에 특이적인 결핵균과 항산성비결핵균 검출용 프라이머, 이를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트 및 이를 이용하는 이중 실시간 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선 분석에 의한 결핵균과 항산성비결핵균의 검출 방법을 제공한다. 염기서열에 특이한 프로브를 사용하지 않아 저비용으로 단시간에 결핵균 및/또는 항산성비결핵균을 동시에 보다 효율적으로 검출할 수 있는 임상진단 수단을 제공할 수 있다.

Description

이중 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 이용하는 결핵균과 항산성비결핵균의 검출 방법
본 발명은 결핵균과 항산성비결핵균의 검출 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 결핵균과 항산성비결핵균에 특이적인 유전자 염기서열을 검출할 수 있는 결핵균과 항산성비결핵균 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트 및 이를 이용하는 이중 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 이용하는 결핵균과 항산성비결핵균의 동시 검출 방법에 관한 것이다.
항산성비결핵균(nontuberculous mycobacteria)은 토양이나 물 등 자연환경 등에 널리 존재하는 비병원성 균으로 인식되어 왔다. 그러나, 1980년대 후천성면역결핍증(AIDS)이 유행하면서, 상기 균이 후천성 면연결핍증 환자의 기회 균주로서 항산성비결핵균 유발 질환이 확인되고, 정상 환자에게서도 감염을 일으킬 수 있음이 알려지면서 임상적 중요성에 대한 인식이 확산되었다.
최근에는 결핵균에 의한 유병률이 낮은 미국 및 유럽 여러 나라 항산성비결핵균에 의한 감염증이 증가하고 있고, 국내에서도 결핵 유병율이 저하하고 있으나 상대적으로 항산성비결핵균에 의한 감염이 증가하는 추세이다. 2009년 액체 결핵배양법이 보험급여 됨에 따라 액체결핵배양 검사를 실시하는 검사실이 늘고 있으며 액체배지를 사용하여 결핵을 배양하는 경우 기존의 고체배지를 사용한 결핵 배양보다 항산성 비결핵균이 더 검출되고 있다. 보고에 의하면 결핵도말 및 배양 양성 검체의 약 12%에서 항산성비결핵균이 분리되고 있으며, 일본, 홍콩, 우리나라의 경우 객담에서 분리된 항산성비결핵균의 약 10~20%가 폐질환을 야기하고 미국, 캐나다, 서유럽 등에서는 약 40~50%가 폐질환을 야기하는 것으로 알려지고 있다.
그런데 항산성비결핵균에 의한 폐질환은 천천히 진행되는 폐결핵과 유사하여 오진되기 쉬우나, 결핵균과 항산성비결핵균에 감수성을 보이는 약제가 달라 치료 약제를 선택하기 위해 신속하고 정확한 결핵균과 항산성비결핵균의 분리검출 방법이 요청되고 있다.
하지만, 현재 시판되고 있는 결핵균과 항산성비결핵균을 검출하는데 사용되는 검사시약은 항산성비결핵균에만 고유한 부위가 아니고, 결핵균도 가지고 있는 염기서열 부위를 사용함으로써, 특정 농도의 결핵균만 있을 시에 결핵균 검출 프라이머에는 반응하지 않고 항산성비결핵균의 프라이머에만 반응 하는 항산성비결핵균으로 잘못 동정되거나, 항산성비결핵균과 결핵균이 동시에 존재하는 경우 항산성비결핵균만 검출되는 경우도 관찰되는 등 검출 및 진단 정확성이 떨어지는 문제가 발생하고 있다. 따라서, 결핵균에는 없고 항산성비결핵균의 고유염기서열을 인식할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 신속하고 정확한 결핵균과 항산성비결핵균의 분리 검출 방법이 요청되고 있다.
본 발명의 목적은 결핵균과 항산성비결핵균의 정확한 검출과 진단을 위한 결핵균 특이적 IS6110에 높은 검출력을 가진 프라이머 세트와 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 높은 검출력을 가진 프라이머 세트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 목적은 결핵균과 항산성비결핵균의 정확한 검출과 진단을 위한 결핵균 특이적 IS6110 유전자에 높은 검출력을 가진 프라이머 세트 및 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 높은 검출력을 가진 프라이머 세트를 포함하는 검출 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하는 이중 실시간 중합효소연쇄반응법(duplex real-time polymerase chain reaction)과 융해곡선분석을 이용하여 결핵균과 항산성비결핵균을 정확하게 검출과 진단할 수 있는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 염기서열 3의 정방향 프라이머; 염기서열 4의 프라이머, 염기서열 5의 프라이머 및 염기서열 6의 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 역방향 프라이머; 및 염기서열 7의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 염기서열 1의 정방향 프라이머 및 염기서열 2의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및 염기서열 3의 정방향 프라이머, 염기서열 4의 프라이머, 염기서열 5의 프라이머 및 염기서열 6의 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 역방향 프라이머 및 염기서열 7의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트를 제공한다.
본 발명은 검체시료로부터 DNA를 분리하는 단계; 염기서열 1의 정방향 프라이머 및 염기서열 2의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및 염기서열 3의 정방향 프라이머, 염기서열 4의 프라이머, 염기서열 5의 프라이머 및 염기서열 6의 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 역방향 프라이머 및 염기서열 7의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 상기 DNA를 이중 실시간 중합효소연쇄반응을 시키는 단계; 온도를 변화시키면서 상기 이중 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 증폭산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 상기 융해곡선의 융해온도를 확인하는 단계를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 염기서열 20의 정방향 프라이머; 및 염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 염기서열 18의 정방향 프라이머 및 염기서열 19의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및 염기서열 20의 정방향 프라이머 및 염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트를 제공한다.
본 발명은 검체시료로부터 DNA를 분리하는 단계; 염기서열 18의 정방향 프라이머 및 염기서열 19의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및 염기서열 20의 정방향 프라이머 및 염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 상기 DNA를 이중 실시간 중합효소연쇄반응을 시키는 단계; 온도를 변화시키면서 상기 이중 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 증폭산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 상기 융해곡선의 융해온도를 확인하는 단계를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 염기서열 38의 프라이머, 염기서열 39의 프라이머 및 염기서열 40의 프라이머를 포함하는 정방향 프라이머; 및 염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 염기서열 18의 정방향 프라이머 및 염기서열 19의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및 염기서열 38의 프라이머, 염기서열 39의 프라이머 및 염기서열 40의 프라이머를 포함하는 정방향 프라이머 및 염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트를 제공한다.
본 발명은 검체시료로부터 DNA를 분리하는 단계; 염기서열 18의 정방향 프라이머 및 염기서열 19의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및 염기서열 38의 프라이머, 염기서열 39의 프라이머 및 염기서열 40의 프라이머를 포함하는 정방향 프라이머 및 염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 상기 DNA를 이중 실시간 중합효소연쇄반응을 시키는 단계; 온도를 변화시키면서 상기 이중 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 증폭산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 상기 융해곡선의 융해온도를 확인하는 단계를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 결핵균과 항산성비결핵균에 특이적인 유전자 염기서열을 검출할 수 있는 결핵균과 항산성비결핵균 검출용 프라이머 세트, 이를 포함하는 검출 키트 및 이를 이용하는 이중 실시간 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선 분석에 의한 결핵균과 항산성비결핵균의 검출 방법을 제공할 수 있다. 상기 방법에 의하면, 염기서열에 특이한 프로브를 사용하지 않아 저비용으로 단시간에 결핵균 및/또는 항산성비결핵균을 동시에 보다 효율적으로 검출할 수 있는 임상진단 수단을 제공할 수 있다.
도 1은 실시예 1에 따라 이중 실시간 중합효소연쇄반응법에서 얻어진 결핵균(MTC) 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석을 나타낸다.
도 2는 실시예 1에 따라 이중 실시간 중합효소연쇄반응법에서 얻어진 항산성비결핵균(NTM) 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석을 나타낸다.
도 3은 실시예 1에 따라 이중 실시간 중합효소연쇄반응법에서 얻어진 결핵균(MTC)+항산성비결핵균(NTM) 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석을 나타낸다.
도 4는 실시예 2에 따라 이중 실시간 중합효소연쇄반응법에서 얻어진 결핵균(MTC) 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석을 나타낸다.
도 5는 실시예 2에 따라 이중 실시간 중합효소연쇄반응법에서 얻어진 항산성비결핵균(NTM) 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석을 나타낸다.
도 6은 실시예 2에 따라 이중 실시간 중합효소연쇄반응법에서 얻어진 결핵균(MTC)+항산성비결핵균(NTM) 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석을 나타낸다.
도 7는 실시예 3에 따라 이중 실시간 중합효소연쇄반응법에서 얻어진 결핵균(MTC) 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석을 나타낸다.
도 8는 실시예 3에 따라 이중 실시간 중합효소연쇄반응법에서 얻어진 항산성비결핵균(NTM) 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석을 나타낸다.
도 9은 실시예 3에 따라 이중 실시간 중합효소연쇄반응법에서 얻어진 결핵균(MTC)+항산성비결핵균(NTM) 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석을 나타낸다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 염기서열 3의 정방향 프라이머; 염기서열 4의 프라이머, 염기서열 5의 프라이머 및 염기서열 6의 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 역방향 프라이머; 및 염기서열 7의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 제공한다.
상기 염기서열 3의 정방향 프라이머는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자 특이적 정방향 프라이머이다. 상기 염기서열 3(5′-ggyrayctgccctgcac-3′)의 경우, 5′-ggtaatctgccctgcac-3′ (염기서열 8), 5′-ggtaacctgccctgcac-3′ (염기서열 9), 5′-ggcaatctgccctgcac-3′ (염기서열 10) 및 5′-ggcaacctgccctgcac-3′ (염기서열 11), 5′-ggtgatctgccctgcac-3′ (염기서열 12), 5′-ggtgacctgccctgcac-3′ (염기서열 13), 5′-ggcgatctgccctgcac-3′ (염기서열 14) 및 5′-ggcgacctgccctgcac-3′ (염기서열 15)을 포함하는 프라이머 세트일 수 있다. 예를 들어, 5′-ggtaatctgccctgcac-3′, 5′-ggtaacctgccctgcac-3′, 5′-ggcaatctgccctgcac-3′ 및 5′-ggcaacctgccctgcac-3′, 5′-ggtgatctgccctgcac-3′, 5′-ggtgacctgccctgcac-3′, 5′-ggcgatctgccctgcac-3′ 및 5′-ggcgacctgccctgcac-3′를 약 1:1:1:1:1:1:1:1의 비율로 포함하는 프라이머 세트일 수 있다.
상기 염기서열 4의 프라이머(NTM-1), 염기서열 5의 프라이머(NTM-1) 및 염기서열 6의 프라이머(NTM-1)는 16S rRNA 유전자 특이적 역방향 프라이머이다. 염기서열 7(NTM-2)의 프라이머는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자 특이적 역방향 프라이머이다. 상기 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자의 역방향 프라이머는 검출 대상이 되는 여러 종의 항산성비결핵균을 모두 검출할 수 있도록 설계되었다. 상기 염기서열 7(5′-catcccacaccgctaccw-3′)의 경우, 5′-catcccacaccgctacct-3′ (염기서열 16)과 5′-catcccacaccgctacca-3′ (염기서열 17)을 포함하는 프라이머 세트를 의미한다. 예를 들어, 염기서열 7의 프라이머는 5′-catcccacaccgctacct-3′와 5′-catcccacaccgctacca-3′를 약 1:1로 포함하는 프라이머 세트일 수 있다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 염기서열 1의 정방향 프라이머 및 염기서열 2의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및 염기서열 3의 정방향 프라이머, 염기서열 4의 프라이머, 염기서열 5의 프라이머 및 염기서열 6의 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 역방향 프라이머 및 염기서열 7의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트를 제공한다.
상기 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트는 염기서열 1의 정방향 프라이머 및 염기서열 2의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함한다. 상기 결핵균의 IS6110 유전자의 프라이머 세트는 검출 대상이 되는 여러 종의 결핵균(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC)을 모두 검출할 수 있도록 설계되었다.
상기 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트는 염기서열 3의 정방향 프라이머; 염기서열 4의 프라이머(NTM-1), 염기서열 5의 프라이머(NTM-1) 및 염기서열 6의 프라이머(NTM-1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 역방향 프라이머; 및 염기서열 7의 역방향 프라이머(NTM-2)를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함한다. 상기 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자의 역방향 프라이머는 검출 대상이 되는 여러 종의 항산성비결핵균을 모두 검출할 수 있도록 설계되었다.
일 실시예에 따르면, 상기 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트에서 염기서열 4의 역방향 프라이머와 염기서열 7의 역방향 프라이머는 1:1일 수 있으며, 염기서열 7의 역방향 프라이머는 염기서열 16의 역방향 프라이머 및 염기서열 17의 역방향 프라이머를 1:1로 포함할 수 있다. 이에 따라, 염기서열 4의 프라이머, 5′-catcccacaccgctacct-3′ (염기서열 16) 및 5′-catcccacaccgctacca-3′ (염기서열 17)은 2:1:1의 비를 가질 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트에서 염기서열 5의 역방향 프라이머와 염기서열 7의 역방향 프라이머는 1:1일 수 있으며, 염기서열 7의 역방향 프라이머는 염기서열 16의 역방향 프라이머 및 염기서열 17의 역방향 프라이머를 1:1로 포함할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트에서 염기서열 6의 역방향 프라이머와 염기서열 7의 역방향 프라이머는 1:1일 수 있으며, 염기서열 7의 역방향 프라이머는 염기서열 16의 역방향 프라이머 및 염기서열 17의 역방향 프라이머를 1:1로 포함할 수 있다.
상기 검출 키트는 DNA를 실시간 중합효소연쇄반응으로 증폭하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 상기 DNA를 실시간 중합효소연쇄반응으로 증폭하기 위한 시약으로는 DNA 중합효소, dNTPs, PCR 버퍼 등을 포함할 수 있다. 상기 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트는 결핵균과 항산성비결핵균을 신뢰성 있게 구별할 수 있도록 결핵균과 항상성비결핵균 특이적 유전자이면서, 융해온도 차이가 크도록 설계된 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 프라이머 세트는 반응산물의 염기서열, 크기 및 GC 비율에 따라 특징적인 융해곡선을 보이므로 이를 고려하여 설계할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트에는 SYBR Green과 같은 형광 색소는 고농도에서 중합효소연쇄반응을 저하시키고 융해과정에서 형광색소의 재분포가 일어나 유전자형결정까지 가능한 고해상 융해곡선(high-resolution melting curve)분석에는 불리할 수 있으므로, SYTO 9, EvaGreen, LCGreen 등의 형광색소를 포함할 수 있다. 다시 말해, 다중 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 위한 반응액에는 상기 SYTO 9, EvaGreen, LCGreen 등의 형광색소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 위한 반응액에는 EvaGreen 형광색소가 포함될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서 Type-it HRM PCR 키트(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)를 사용하여 실시간-중합효소연쇄반응을 실시하였다. 상기 Type-it HRM PCR 키트에는 형광 색소로서 EvaGreen이 들어 있다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 검체시료로부터 DNA를 분리하는 단계; 염기서열 1의 정방향 프라이머 및 염기서열 2의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및 염기서열 3의 정방향 프라이머, 염기서열 4의 프라이머, 염기서열 5의 프라이머 및 염기서열 6의 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 역방향 프라이머 및 염기서열 7의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 상기 DNA를 이중 실시간 중합효소연쇄반응을 시키는 단계; 온도를 변화시키면서 상기 이중 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 증폭산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 상기 융해곡선의 융해온도를 확인하는 단계를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 융해곡선분석은 510nm 형광파장을 측정하여 수행할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 염기서열 20의 정방향 프라이머; 및 염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 제공한다.
상기 염기서열 20의 정방향 프라이머는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자 특이적 정방향 프라이머이다. 상기 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자의 정방향 프라이머는 검출 대상이 되는 여러 종의 항산성비결핵균을 모두 검출할 수 있도록 설계되었다. 상기 염기서열 20의 정방향 프라이머의 경우, 5′-catgtcttgtgggggaaagctt-3′ (염기서열 22), 5′-catgttttgtgggggaaagctt-3′ (염기서열 23), 5′-catgtcttctgggggaaagctt-3′ (염기서열 24), 5′-catgtcttgtggtggaaagctt-3′ (염기서열 25), 5′-catgtcttgtggggcaaagctt-3′ (염기서열 26), 5′-catgttttctgggggaaagctt-3′ (염기서열 27), 5′-catgtcttctggtggaaagctt-3′ (염기서열 28), 5′-catgtcttgtggtgcaaagctt-3′ (염기서열 29), 5′-catgttttgtggggcaaagctt-3′ (염기서열 30), 5′-catgtcttctggggcaaagctt-3′ (염기서열 31), 5′-catgttttgtggtggaaagctt-3′ (염기서열 32), 5′-catgttttctggtggaaagctt-3′ (염기서열 33), 5′-catgttttctggggcaaagctt-3′ (염기서열 34), 5′-catgttttgtggtgcaaagctt-3′ (염기서열 35), 5′-catgtcttctggtgcaaagctt-3′ (염기서열 36) 및 5′-catgttttctggtgcaaagctt-3′ (염기서열 37)이 약 1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1의 비율로 포함되는 프라이머 세트일 수 있다.
상기 염기서열 21의 역방향 프라이머는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자 특이적 역방향 프라이머이다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 염기서열 18의 정방향 프라이머 및 염기서열 19의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및 염기서열 20의 정방향 프라이머 및 염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트를 제공한다.
상기 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트는 염기서열 18의 정방향 프라이머 및 염기서열 19의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함한다. 상기 결핵균의 IS6110 유전자의 프라이머 세트는 검출 대상이 되는 여러 종의 결핵균(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC)을 모두 검출할 수 있도록 설계되었다.
상기 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트는 염기서열 20의 정방향 프라이머; 및 염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함한다. 상기 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자의 정방향 프라이머는 검출 대상이 되는 여러 종의 항산성비결핵균을 모두 검출할 수 있도록 설계되었다.
상기 검출 키트는 DNA를 실시간 중합효소연쇄반응으로 증폭하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 상기 DNA를 실시간 중합효소연쇄반응으로 증폭하기 위한 시약으로는 DNA 중합효소, dNTPs, PCR 버퍼 등을 포함할 수 있다. 상기 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트는 결핵균과 항산성비결핵균을 신뢰성 있게 구별할 수 있도록 결핵균과 항상성비결핵균 특이적 유전자이면서, 융해온도 차이가 크도록 설계된 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 프라이머 세트는 반응산물의 염기서열, 크기 및 GC 비율에 따라 특징적인 융해곡선을 보이므로 이를 고려하여 설계할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트에는 SYBR Green과 같은 형광 색소는 고농도에서 중합효소연쇄반응을 저하시키고 융해과정에서 형광색소의 재분포가 일어나 유전자형결정까지 가능한 고해상 융해곡선(high-resolution melting curve)분석에는 불리할 수 있으므로, SYTO 9, EvaGreen, LCGreen 등의 형광색소를 포함할 수 있다. 다시 말해, 다중 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 위한 반응액에는 상기 SYTO 9, EvaGreen, LCGreen 등의 형광색소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 위한 반응액에는 EvaGreen 형광색소가 포함될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서 Type-it HRM PCR 키트(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)를 사용하여 실시간-중합효소연쇄반응을 실시하였다. 상기 Type-it HRM PCR 키트에는 형광 색소로서 EvaGreen이 들어 있다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 검체시료로부터 DNA를 분리하는 단계; 염기서열 18의 정방향 프라이머 및 염기서열 19의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및 염기서열 20의 정방향 프라이머 및 염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 상기 DNA를 이중 실시간 중합효소연쇄반응을 시키는 단계; 온도를 변화시키면서 상기 이중 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 증폭산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 상기 융해곡선의 융해온도를 확인하는 단계를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균을 검출하는 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 염기서열 38의 프라이머, 염기서열 39의 프라이머 및 염기서열 40의 프라이머를 포함하는 정방향 프라이머; 및 염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 제공한다.
상기 염기서열 38(NTM-1), 염기서열 39(NTM-2) 및 염기서열 40(NTM-3)의 정방향 프라이머는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자 특이적 정방향 프라이머이다. 상기 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자의 정방향 프라이머는 검출 대상이 되는 여러 종의 항산성비결핵균을 모두 검출할 수 있도록 설계되었다.
상기 염기서열의 정방향 프라이머의 경우, 5′-tgtggtggaaagcttttgc-3′ (염기서열 41), 5′-tttggtggaaagcttttgc-3′ (염기서열 42)이 약 1:1의 비율로 포함되는 프라이머 세트일 수 있다.
상기 염기서열의 정방향 프라이머의 경우, 5′-ggtgagtggtgcaaagctt-3′ (염기서열 43), 5′-ggtgtgtggtgcaaagctt-3′ (염기서열 44)이 약 1:1의 비율로 포함되는 프라이머 세트일 수 있다.
상기 염기서열 21의 역방향 프라이머는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자 특이적 역방향 프라이머이다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 염기서열 18의 정방향 프라이머 및 염기서열 19의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및 염기서열 38의 프라이머, 염기서열 39의 프라이머 및 염기서열 40의 프라이머를 포함하는 정방향 프라이머 및 염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균 검출키트를 제공한다.
상기 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트는 염기서열 18의 정방향 프라이머 및 염기서열 19의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함한다. 상기 결핵균의 IS6110 유전자의 프라이머 세트는 검출 대상이 되는 여러 종의 결핵균(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC)을 모두 검출할 수 있도록 설계되었다.
상기 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트는 염기서열 38의 프라이머, 염기서열 39의 프라이머 및 염기서열 40의 프라이머를 포함하는 정방향 프라이머 및 염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함한다. 상기 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자의 정방향 프라이머는 검출 대상이 되는 여러 종의 항산성비결핵균을 모두 검출할 수 있도록 설계되었다.
상기 검출 키트는 DNA를 실시간 중합효소연쇄반응으로 증폭하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 상기 DNA를 실시간 중합효소연쇄반응으로 증폭하기 위한 시약으로는 DNA 중합효소, dNTPs, PCR 버퍼 등을 포함할 수 있다. 상기 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트는 결핵균과 항산성비결핵균을 신뢰성 있게 구별할 수 있도록 결핵균과 항상성비결핵균 특이적 유전자이면서, 융해온도 차이가 크도록 설계된 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 프라이머 세트는 반응산물의 염기서열, 크기 및 GC 비율에 따라 특징적인 융해곡선을 보이므로 이를 고려하여 설계할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트에는 SYBR Green과 같은 형광 색소는 고농도에서 중합효소연쇄반응을 저하시키고 융해과정에서 형광색소의 재분포가 일어나 유전자형결정까지 가능한 고해상 융해곡선(high-resolution melting curve)분석에는 불리할 수 있으므로, SYTO 9, EvaGreen, LCGreen 등의 형광색소를 포함할 수 있다. 다시 말해, 다중 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 위한 반응액에는 상기 SYTO 9, EvaGreen, LCGreen 등의 형광색소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 위한 반응액에는 EvaGreen 형광색소가 포함될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서 Type-it HRM PCR 키트(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)를 사용하여 실시간-중합효소연쇄반응을 실시하였다. 상기 Type-it HRM PCR 키트에는 형광 색소로서 EvaGreen이 들어 있다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 검체시료로부터 DNA를 분리하는 단계; 염기서열 18의 정방향 프라이머 및 염기서열 19의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및 염기서열 38의 프라이머, 염기서열 39의 프라이머 및 염기서열 40의 프라이머를 포함하는 정방향 프라이머 및 염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 상기 DNA를 이중 실시간 중합효소연쇄반응을 시키는 단계; 온도를 변화시키면서 상기 이중 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 증폭산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 상기 융해곡선의 융해온도를 확인하는 단계를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 융해곡선분석은 510nm 형광파장을 측정하여 수행할 수 있다.
이하, 본 발명을 참고예 및 실시예에 의해 상세히 설명하지만, 하기 참고예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
참고예: 결핵균과 항산성비결핵균의 특이적 염기서열 탐색
1. 대상 및 유전자 부위
결핵균과 항산성비결핵균의 특이적 염기서열 탐색에는 M. abscessus (AJ419970.1, AJ416940.1, AJ536038), M. acapulcensis (AF480575.1), M. africanum (AF480605.1), M. agri (AJ429045.1), M. aichiense (X55598.1), M. alvei (NR_024859.1), M. asiaticum (X55604.1), M. aurum (FJ172298.1), M. austroafricanum (GU121552.1), M. avium (NR_025584.1, AJ536037.1, EF521892.1), M. bohemicum (NR_026054.1), M. botniense (NR_028878.1), M. bovis (GU142937.1), M. branderi (AF480574.1), M. brumae (NR_025233.1), M. celatum (L08169.1), M.chelonae (AM884324.1, AJ419969.1), M. chitae (NR_029220.1), M. chlorophenolicum (NR_026173.1), M. chubuense (X55596.1), M. confluentis (AJ634379.1), M. conspicuum (X029298.1), M. cookii (X53896.1), M. diernhoferi (AF480599.1), M. doricum (NR_025099.1), M. duvalii (NR_026073.1), M. engbaekii (AF480577.1), M. fallax (AF480600.1), M. farcinogenes (X55592.1), M. flavescens (AY734993.1), M. fortuitum (AY457066.1, AF480580.1, GU142933.1), M. gadium (NR_026087.1), M. gastri (GU142918.1), M. genavense (NR_029223.1), M. gilvum (AB491971.1), M. goodii (AY457079.1), M. gordonae (GU142923.1), M. haemophilum (V06638.1), M. hassiacum (NR_026011.1), M. heidelbergense (NR_025268.1), M. hiberniae (NR_026092.1), M. hodleri (NR_026286.1), M. immunogen (AJ011771.1), M. interjectum (X70961.1), M. intermedium (X67847.1), M.intracellulare (AY652958.1, AJ536036.1, X52927.1, M61684.1), M.kansasii (M29575.1, X15916.1), M. lentiflavum (AF480583.1), M. mageritense (AY457076.1), M. malmoense (GQ153278.1), M. marinum (AF456238.1, AY513243.1), M. microti (NR_025234.1), M. monacense (GU142931.1), M. moriokaense (AY859686.1), M. mucogenicum (AF480585.1), M. neoaurum (FJ172306.1), M.nonchromogenicum (DQ058406.1), M. obuense (X55597.1), M. paraffinicum (GQ153282.1), M. parafortuitum (NR_026285.1), M. peregrinum (AY457069.1), M. phlei (AF480603.1), M. porcinum (AY457077.1), M. poriferae (NR_025235.1), M. pulveris (NR_025528.1), M. rhodesiae (NR_025529.1), M. scrofulaceum (GQ153271.1), M. senuense (DQ536409.1), M. septicum (AY457070.1), M. shimoidei (X82459.1), M. simiae (GQ153280.1), M. smegmatis (NR_025311.1), M. sphagni (X55590.1), M. szulgai (X52926.1), M. terrae (NR_029168.1), M. thermoresistibile (GU142928.1), M. tilburgii (AJ580826.1), M. triplex (GQ153279.1), M. triviale (DQ058405.1), M. tuberculosis (GU142936.1, GU142935.1, AY53603.1, X55588.1, X52917.1), M. tusciae (NR_024903.1), M. ulcerans (Z13990.1), M. vaccae (X55601.1), M. wolinskyi (AY457083.1), M. xenopi (X52929.1)의 16S ribosomal RNA 유전자의 염기서열 자료를 분석에 이용하였다. 상기 마이코박테리아의 16S ribosomal RNA 유전자의 염기서열 자료는 NCBI(National center for Biotechnology Information)의 데이터베이스(Databases)에서 얻었다
상기 마이코박테리아 균종의 16S rRNA 유전자의 염기서열 자료를 Sequencher 4.9로 분석하여 특이 염기서열 부위를 발견하였다. 즉, 결핵균 특이적 염기서열 및 결핵균에는 없고 항산성비결핵균의 고유염기서열을 발견하였다.
실시예 1. 이중 실시간 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석을 통한 결핵균과 항산성비결핵균의 분리검출 방법
1. 검출대상 부위 및 프라이머 설계
결핵균(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC: M. tuberculosis, M.bovis, M. africanum, M. microti)과 항산성비결핵균(NTM)을 이중 실시간 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석을 이용하여 감별하기 위한 방법으로, 결핵균은 IS6110 유전자를 검출대상으로 하고, 항산성비결핵균은 16S rRNA 유전자를 검출대상으로 하여 정방향 프라이머는 모든 마이코박테리아의 공통염기서열부위로 하였고, 역방향 프라이머는 항산성비결핵균의 특이적 염기서열인 NTM-1, NTM-2 염기서열 부위를 이용하였다. 상기 검출대상 부위용 프라이머는 Primer3 프로그램을 이용하여 설계하였다.
(1) 결핵균(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC)
1) 대상 유전자: IS6110
2) 프라이머
a. 정방향 프라이머: 5′-cgaactcaaggagcacatca-3′ (염기서열 1)
b. 역방향 프라이머: 5′-agtttggtcatcagccgttc-3′ (염기서열 2)
3) PCR 산물의 크기: 135bp
4) PCR 산물의 평균융해온도(Tm): 약 86.18±0.16℃ (다만, 평균융해온도는 검사배치마다 약간의 차이가 발생할 수 있음)
(2) 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria, NTM)
1) 대상유전자: 16S rRNA
2) 프라이머
a. 정방향 프라이머: 5′-ggyrayctgccctgcac-3′ (염기서열 3)
b. 역방향 프라이머
NTM-1: 5′-cccacaccgcaaaagctt-3′ (염기서열 4) 또는 5′-cccacaccgcaaaagct-3′ (염기서열 5) 또는 5′-tcccacaccgcaaaagct-3′ (염기서열 6)
NTM-2: 5′-catcccacaccgctaccw-3′(염기서열 7)
3) PCR 산물의 크기: 104bp
4) PCR 산물의 평균융해온도(Tm): 약 80.10℃ 내지 82.10℃ (항산성비결핵균의 균종에 따라 Tm값이 다르나, 대략적으로 약 80℃ 내지 약 82℃ 정도의 범위의 Tm 값을 가짐)
<실시예 1-1. 항산성비결핵균 검출용 역방향 프라이머 NTM-1으로 염기서열 4의 프라이머를 사용하는 이중 실시간 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석>
(1) DNA의 분리
임상검체에서 분리된 결핵균 186주, 항산성비결핵균 78주, 마이코박테리아 표준 균주 7주를 사용하였다. 사용된 ATCC 표준균주는 M. tuberculosis (ATCC 25177), M. intracellulare (ATCC 13950), M. scrofulaceum (ATCC 19981), M. kansasii (ATCC 12478), M. fortuitum (ATCC 6841), M. abscessus (ATCC 19977), M. avium (ATCC 25291)이었다.
임상검체에서 분리된 결핵균 186주, 항산성비결핵균 78주는 액체배지(MGIT 마이코박테리아 배지)나 고체(Ogawa배지)배지에서 검출되었거나 객담검체에서 직접 검출된 균주이었다. ATCC 표준균주는 액체배지에서 배양하여 사용하였다.
액체배지에서 자란 마이코박테리아의 DNA는 다음과 같이 추출하였다. 균이 배양된 MGIT 마이코박테리아 배양튜브를 잘 섞은 후에 액체 배지 500㎕를 취해 1.5㎖ 튜브에 넣고 14,000 rpm로 5분간 원심분리 시켰다. 원심분리 후 상층액은 버리고 남은 침사부분에 멸균증류수 300㎕ 넣고 끓는 물에 10분간 중탕 가열하였다. 중탕 가열 후 14,000 rpm로 5분간 원심분리 시켜서 상층액을 중합효소연쇄반응의 주형 DNA로 사용하였다.
고체배지에서 자란 마이코박테리아의 DNA는 다음과 같이 추출하였다. 1.5㎖튜브에 멸균증류수 500㎕넣고 고체배지에서 1 백금이를 취해 멸균증류수에 풀었다. 이 튜브를 끓는 물에 10분간 중탕 가열한 후 14,000 rpm에서 5분간 원심 분리 시켜서 상층액을 중합효소연쇄반응의 주형 DNA로 사용하였다.
객담검체는 다음과 같이 처리하였다. 15㎖ 혹은 50㎖ 튜브에 담긴 객담량과 동일한 량의 1N NaOH를 첨가하여 10분간 방치하여 객담을 액화시켰다. 14,000rpm에서 2분간 원심 분리하여 상층액을 버리고 남아 있는 침전물에 멸균증류수 1㎖를 넣고 10초간 잘 섞은 후 14,000rpm으로 2분간 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 남아 있는 침전물에 멸균증류 1㎖를 넣고 10초간 잘 섞은 후 14,000rpm에서 2분간 원심 분리 한 후 상층액을 버렸다. 상층액을 제거하고 남아 있는 침전물에 5% chelex 수지(Biorad, USA) 100㎕와 10㎎/㎖ proteinase K 1㎕를 넣고 잘 섞어 주었다. 56℃에서 15분간 방치한 후 잘 혼합하여 끓은 물에 10분간 중탕 가열하였다. 중탕 가열 후 14,000 rpm 5분간 원심 분리 시켜서 상층액을 중합효소연쇄반응의 주형 DNA로 사용하였다.
(2) 이중 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석
Type-it HRM PCR 키트(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)를 사용하여 이중 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 상기 Type-it HRM PCR 키트에는 형광 색소로서 EvaGreen이 들어 있다. 이중 실시간 중합효소연쇄반응은 Rotor-gene 6000(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)을 이용하였다. 약 95℃에서 약 5분간 변성 공정을 1 사이클(cycle), 약 95℃에서 약 10초 간 변성, 약 60℃에서 약 30초 간 어닐링 및 연장 공정을 1 싸이클로 하여, 40 싸이클을 수행하였다. 마지막 중합효소연쇄반응이 끝난 후, 약 77℃에서 약 91.5℃까지 초당 약 0.2℃ 속도로 온도를 증가시키면서 510nm의 형광파장을 측정하여 융해곡선분석을 하였다. 프라이머의 반응 정도의 차이는 프라이머의 농도, 어닐링 및 연장(extension)온도와 유지 시간을 조절하여 2가지 검출 부위 모두 반응이 잘 일어날 수 있도록 조건을 조절하였다. 이 때, 이중 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 반응물의 조성은 하기 표 1과 같다. 하기 primer Mix에는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머가 동일한 량(10pmole/㎕)으로 들어 있었다. 따라서 반응에 사용되는 MTC의 primer mix 1.75㎕에는 정방향 및 역방향 프라이머가 각각 17.5pmole이 되며, 총 25㎕의 중합연쇄반응을 수행하는 반응물의 총부피가 25㎕가 되니 농도는 각각 0.7uM(17.5pmoles/25㎕)가 되었다. NTM 프라이머도 마찬가지로 정방향 및 역방향 프라이머가 반응물에 1㎕가 사용되며, 그때의 양이 10pmole이며 농도는 각각 0.4uM(10pmoles/25㎕)이 되었다. 이 때, NTM 정방향 프라이머는 5′-ggtaatctgccctgcac-3′ (염기서열 8), 5′-ggtaacctgccctgcac-3′ (염기서열 9), 5′-ggcaatctgccctgcac-3′ (염기서열 10), 5′-ggcaacctgccctgcac-3′ (염기서열 11), 5′-ggtgatctgccctgcac-3′ (염기서열 12), 5′-ggtgacctgccctgcac-3′ (염기서열 13), 5′-ggcgatctgccctgcac-3′ (염기서열 14) 및 5′-ggcgacctgccctgcac-3′ (염기서열 15)을 포함하는 프라이머 세트로서, 염기서열 8, 염기서열 9, 염기서열 10, 염기서열 11, 염기서열 12, 염기서열 13, 염기서열 14 및 염기서열 15의 프라이머를 각각 약 1:1:1:1:1:1:1:1의 비율로 포함하도록 제작되었다. 즉, 염기서열 8, 염기서열 9, 염기서열 10, 염기서열 11, 염기서열 12, 염기서열 13, 염기서열 14 및 염기서열 15의 프라이머는 동량인 1.25pmole씩 포함하도록 제작하였다. 또한, NTM-1 역방향 프라이머(염기서열 4)와와 NTM-2 역방향 프라이머(염기서열 7)는 동량인 10pmole씩 존재하였고, NTM-2 역방향 프라이머는 5′-catcccacaccgctacct-3′ (염기서열 16)와 5′-catcccacaccgctacca-3′ (염기서열 17)이 동량인 5pmole씩 존재하였다.
표 1
성분 부피(㎕) 농도
2X HRM PCR Master Mix 12.5 1X
Primer Mix (10pmole/㎕) MTC 1.75 0.7uM
NTM 1.0 0.4uM
Nuclease free water 4.75 -
샘플 DNA template 5 -
전체 25 -
<실시예 1-2. 항산성비결핵균 검출용 역방향 프라이머 NTM-1으로 염기서열 5의 프라이머를 사용하는 이중 실시간 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석>
실시예 1-1과 NTM-1의 역방향 프라이머로 염기서열 5의 프라이머를 사용하는 것을 제외하고는 실질적으로 동일한 방법으로 이중 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 수행하였다.
<실시예 1-3. 항산성비결핵균 검출용 역방향 프라이머 NTM-1으로 염기서열 6의 프라이머를 사용하는 이중 실시간 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석>
실시예 1-1과 NTM-1의 역방향 프라이머로 염기서열 6의 프라이머를 사용하는 것을 제외하고는 실질적으로 동일한 방법으로 이중 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 수행하였다.
2. 이중 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석 결과
도 1 내지 도 3은 상기 균주들의 이중 실시간 중합효소연쇄반응법에서 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석을 나타낸다. 도 1 내지 도 3은 각 결핵균(MTC), 항산성비결핵균(NTM) 및 결핵균(MTC)+항산성비결핵균(NTM)의 융해곡선을 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
결핵균(MTC)의 PCR 증폭 산물의 평균융해온도(Tm)는 약 86.18±0.16℃, 항산성비결핵균(NTM)의 PCR 증폭 산물의 평균융해온도는 약 80.10℃ 내지 82.10℃로 나타났고, 결핵균(MTC)+항산성비결핵균(NTM)은 상기 결핵균과 항산성 비결핵균의 평균융해온도의 두 개의 피크가 나타났다.
따라서, 상기 이중 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 수행할 경우, 임상 검체에서 결핵균과 항산성비결핵균을 동시에 높은 신뢰성을 가지고 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2. 이중 실시간 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석을 통한 결핵균과 항산성비결핵균의 분리검출 방법
1. 검출대상 부위 및 프라이머 설계
결핵균(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC: M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti)과 항산성비결핵균(NTM)을 이중 실시간 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석을 이용하여 감별하기 위한 방법으로, 결핵균은 IS6110 유전자를 검출대상으로 하고, 항산성비결핵균은 16S rRNA 유전자를 검출대상으로 하여 정방향 프라이머는 항산성비결핵균의 특이적 염기서열 부위를 이용하였고, 역방향 프라이머는 모든 마이코박테리아의 공통염기서열부위를 이용하였다. 상기 검출대상 부위용 프라이머는 Primer3 프로그램을 이용하여 설계하였다.
(1) 결핵균(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC)
1) 대상 유전자: IS6110
2) 프라이머
a. 정방향 프라이머: 5′-agaaggcgtactcgacctga-3′ (염기서열 18)
b. 역방향 프라이머: 5′-ctgaaccggatcgatgtgta-3′ (염기서열 19)
3) PCR 산물의 크기: 75bp
4) PCR 산물의 평균융해온도(Tm) : 78.0±0.20℃
(2) 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria, NTM)
1) 대상유전자: 16S rRNA
2) 프라이머
a. 정방향 프라이머: 5′-catgtyttstggkgsaaagctt-3′ (염기서열 20)
b. 역방향 프라이머: 5′-cgtaggagtctgggccgta-3′ (염기서열 21)
3) PCR 산물의 크기: 152bp
4) PCR 산물의 평균융해온도(Tm) : 약 86.7℃ 내지 88.24℃ (항산성비결핵균의 균종에 따라 Tm값이 다르나, 대략적으로 약 86.5℃ 내지 약 88.5℃ 정도의 범위의 Tm 값을 가짐)
2. 이중 실시간 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석
(1) DNA의 분리
임상검체에서 분리된 결핵균 186주, 항산성비결핵균 78주, 마이코박테리아 표준 균주 68주를 사용하였다. 사용된 표준균주는 M. abscessus ATCC 19977, M. acapulcensis KCTC 9501, M. africanum ATCC 25420, M. agri KCTC 9502, M. alvei KCTC 19709, M. asiaticum KCTC 9503, M. aurum KCTC 19457, M. austroafricanum KCTC 9504, M. avium ATCC 25291, M. bolletii KCTC 19281, M. botniense KCTC 19646, M. bovis ATCC 19210, M. brumae KCTC 19711, M. celatum ATCC 51131, M. chelonae subsp chelonae KCTC 9505, M. chlorophenolicum KCTC 19089, M. chubuense KCTC 19712, M. diernhoferi KCTC 9506, M. fallax KCTC 9508, M. flavescens ATCC 14474, M. fortuitum ATCC 6841, M. frederiksbergense KCTC 19100, M. gadium ATCC 27726, M. gastri ATCC 15754, M. gilvum KCTC 19423, M. goodii ATCC BAA-955, M. gordonae KCTC 9513, M. haemophilum ATCC 29548, M.hassiacum ATCC 700660, M.interjectum ATCC 51457, M. intermedium ATCC 51848, M. intracellulare ATCC 13950, M. intracellulare KCTC 9514, M. kansasii ATCC 12478, M. lentiflavum KMRC 70087, M.malmoense ATCC 29571, M. mantobense KCTC 9977, M.marinum ATCC 927, M.massiliense KCTC 19086, M.microti ATCC 19422, M. moriokaense KCTC 9516, M. mucogenicum KCTC 19088, M. neoaurum KCTC 19096, M. nonchromogenicum ATCC 19530, M. obuense KCTC 19097, M. parascrofulaceum KCTC 9979, M. peregrinum KCTC 9615, KMRC 75002, M. phlei KCTC 9689, M. porcinum KCTC 9517, M. pulveris KCTC 9518, M. scrofulaceum ATCC 19981, M. septicum ATCC 700731, M. simiae ATCC 25275, M. shimoidei ATCC 27962, M. smegmatis KCTC 9108, M. szulgai KCTC 9520, KMRC 31125, M. terrae KCTC 9614, M. triplex ATCC 700071, M. triviale KMRC 70093, M. tuberculosis ATCC 25177, ATCC 27294, M. ulcerans ATCC 19423, M. vaccae KCTC 19087, M. vanbaalenii KCTC 9966, M. wolinskyi ATCC 700010, M. xenopi KMRC 42001이었다.
임상검체에서 분리된 결핵균 186주, 항산성비결핵균 78주는 액체배지(MGIT 마이코박테리아 배지)나 고체(Ogawa배지)배지에서 검출되었거나 객담검체에서 직접 검출된 균주이었다. ATCC, KCTC 균주는 액체배지에서 배양하여 사용하였고, KMRC 균주는 고체배지에서 배양하여 사용하였다.
액체배지에서 자란 마이코박테리아의 DNA는 다음과 같이 추출하였다. 균이 배양된 MGIT 마이코박테리아 배양튜브를 잘 섞은 후에 액체 배지 500㎕를 취해 1.5㎖ 튜브에 넣고 14,000 rpm로 5분간 원심분리 시켰다. 원심분리 후 상층액은 버리고 남은 침사부분에 멸균증류수 300㎕ 넣고 끓는 물에 10분간 중탕 가열하였다. 중탕 가열 후 14,000 rpm로 5분간 원심분리 시켜서 상층액을 중합효소연쇄반응의 주형 DNA로 사용하였다.
고체배지에서 자란 마이코박테리아의 DNA는 다음과 같이 추출하였다. 1.5㎖튜브에 멸균증류수 500㎕넣고 고체배지에서 1 백금이를 취해 멸균증류수에 풀었다. 이 튜브를 끓는 물에 10분간 중탕 가열한 후 14,000 rpm에서 5분간 원심 분리 시켜서 상층액을 중합효소연쇄반응의 주형 DNA로 사용하였다.
객담검체는 다음과 같이 처리하였다. 15㎖ 혹은 50㎖ 튜브에 담긴 객담량과 동일한 량의 1N NaOH를 첨가하여 10분간 방치하여 객담을 액화시켰다. 14,000rpm에서 2분간 원심 분리하여 상층액을 버리고 남아 있는 침전물에 멸균증류수 1㎖를 넣고 10초간 잘 섞은 후 14,000rpm으로 2분간 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 남아 있는 침전물에 멸균증류 1㎖를 넣고 10초간 잘 섞은 후 14,000rpm에서 2분간 원심 분리 한 후 상층액을 버렸다. 상층액을 제거하고 남아 있는 침전물에 5% chelex 수지(Biorad, USA) 100㎕와 10㎎/㎖ proteinase K 1㎕를 넣고 잘 섞어 주었다. 56℃에서 15분간 방치한 후 잘 혼합하여 끓은 물에 10분간 중탕 가열하였다. 중탕 가열 후 14,000 rpm 5분간 원심 분리 시켜서 상층액을 중합효소연쇄반응의 주형 DNA로 사용하였다.
(2) 이중 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석
Type-it HRM PCR 키트(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)를 사용하여 이중 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 상기 Type-it HRM PCR 키트에는 형광 색소로서 EvaGreen이 들어 있다. 이중 실시간 중합효소연쇄반응은 Rotor-Gene Q(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)을 이용하였다. 약 95℃에서 약 5분간 변성 공정을 1 사이클(cycle), 약 95℃에서 약 10초 간 변성, 약 50℃에서 약 10초 간 어닐링 공정후 63℃에서 약 5초간 연장 공정을 1 싸이클로 하여, 40 싸이클을 수행하였다. 마지막 중합효소연쇄반응이 끝난 후, 약 75℃에서 약 93.5℃까지 초당 약 0.2℃ 속도로 온도를 증가시키면서 510nm의 형광파장을 측정하여 융해곡선분석을 하였다. 프라이머의 반응 정도의 차이는 프라이머의 농도, 어닐링 및 연장(extension)온도와 유지 시간을 조절하여 2가지 검출 부위 모두 반응이 잘 일어날 수 있도록 조건을 조절하였다. 이 때, 이중 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 반응물의 조성은 하기 표 2와 같다. 하기 primer Mix에는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머가 동일한 량(10pmole/㎕)으로 들어 있었다. 따라서 반응에 사용되는 MTC의 primer mix 1.25㎕에는 정방향 및 역방향 프라이머가 각각 12.5pmole이 되며, 총 25㎕의 중합연쇄반응을 수행하는 반응물의 총부피가 25㎕가 되니 농도는 각각 0.5uM(12.5pmoles/25㎕)가 되었다. NTM 프라이머도 마찬가지로 정방향 및 역방향 프라이머가 반응물에 1.5㎕가 사용되며, 그때의 양이 15pmole이며 농도는 각각 0.6uM(15pmoles/25㎕)이 되었다. 이 때, NTM 정방향 프라이머는 5′-catgtcttgtgggggaaagctt-3′ (염기서열 22), 5′-catgttttgtgggggaaagctt-3′ (염기서열 23), 5′-catgtcttctgggggaaagctt-3′ (염기서열 24), 5′-catgtcttgtggtggaaagctt-3′ (염기서열 25), 5′-catgtcttgtggggcaaagctt-3′ (염기서열 26), 5′-catgttttctgggggaaagctt-3′ (염기서열 27), 5′-catgtcttctggtggaaagctt-3′ (염기서열 28), 5′-catgtcttgtggtgcaaagctt-3′ (염기서열 29), 5′-catgttttgtggggcaaagctt-3′ (염기서열 30), 5′-catgtcttctggggcaaagctt-3′ (염기서열 31), 5′-catgttttgtggtggaaagctt-3′ (염기서열 32), 5′-catgttttctggtggaaagctt-3′ (염기서열 33), 5′-catgttttctggggcaaagctt-3′ (염기서열 34), 5′-catgttttgtggtgcaaagctt-3′ (염기서열 35), 5′-catgtcttctggtgcaaagctt-3′ (염기서열 36) 및 5′-catgttttctggtgcaaagctt-3′ (염기서열 37)이 약 1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1로 동량으로 존재하였다.
표 2
성분 부피(㎕) 농도
2X HRM PCR Master Mix 12.5 1X
Primer Mix (10pmole/㎕) MTC 1.25 0.5uM
NTM 1.5 0.6uM
Nuclease free water 4.75 -
샘플 DNA template 5 -
전체 25 -
3. 이중 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석 결과
도 4 내지 도 6은 상기 균주들의 이중 실시간 중합효소연쇄반응법에서 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석을 나타낸다. 도 4 내지 도 6은 각 결핵균(MTC), 항산성비결핵균(NTM) 및 결핵균(MTC)+항산성비결핵균(NTM)의 융해곡선을 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
결핵균(MTC)의 PCR 증폭 산물의 평균융해온도(Tm)는 약 78.0±0.20℃, 항산성비결핵균(NTM)의 PCR 증폭 산물의 평균융해온도는 약 86.5℃ 내지 약 88.5℃ 로 나타났고, 결핵균(MTC)+항산성비결핵균(NTM)은 상기 결핵균과 항산성 비결핵균의 평균융해온도의 두 개의 피크가 나타났다.
따라서, 상기 이중 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 수행할 경우, 임상 검체에서 결핵균과 항산성비결핵균을 동시에 높은 신뢰성을 가지고 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3. 이중 실시간 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석을 통한 결핵균과 항산성비결핵균의 분리검출 방법
1. 검출대상 부위 및 프라이머 설계
결핵균(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC: M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti)과 항산성비결핵균(NTM)을 이중 실시간 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석을 이용하여 감별하기 위한 방법으로, 결핵균은 IS6110 유전자를 검출대상으로 하고, 항산성비결핵균은 16S rRNA 유전자를 검출대상으로 하여 정방향 프라이머는 항산성비결핵균의 특이적 염기서열 부위를 이용하였고, 역방향 프라이머는 모든 마이코박테리아의 공통염기서열부위를 이용하였다. 상기 검출대상 부위용 프라이머는 Primer3 프로그램을 이용하여 설계하였다.
(1) 결핵균(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC)
1) 대상 유전자: IS6110
2) 프라이머
a. 정방향 프라이머: 5′-agaaggcgtactcgacctga-3′ (염기서열 18)
b. 역방향 프라이머: 5′-ctgaaccggatcgatgtgta-3′ (염기서열 19)
3) PCR 산물의 크기: 75bp
4) PCR 산물의 평균융해온도(Tm) : 78.0±0.20℃
(2) 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria, NTM)
1) 대상유전자: 16S rRNA
2) 프라이머
a. 정방향 프라이머
NTM-1: 5′-tktggtggaaagcttttgc-3′ (염기서열 38)
NTM-2: 5′-ggtgwgtggtgcaaagctt-3′ (염기서열 39)
NTM-3: 5′-tggtggaaagcgtttggt-3′ (염기서열 40)
b. 역방향 프라이머: 5′-cgtaggagtctgggccgta-3′ (염기서열 21)
3) PCR 산물의 크기: 152bp
4) PCR 산물의 평균융해온도(Tm) : 86.6±0.26℃
2. 이중 실시간 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석
(1) DNA의 분리
임상검체에서 분리된 결핵균 186주, 항산성비결핵균 78주, 마이코박테리아 표준 균주 68주를 사용하였다. 사용된 표준균주는 M. abscessus ATCC 19977, M. acapulcensis KCTC 9501, M. africanum ATCC 25420, M. agri KCTC 9502, M. alvei KCTC 19709, M. asiaticum KCTC 9503, M. aurum KCTC 19457, M. austroafricanum KCTC 9504, M. avium ATCC 25291, M. bolletii KCTC 19281, M. botniense KCTC 19646, M. bovis ATCC 19210, M. brumae KCTC 19711, M. celatum ATCC 51131, M. chelonae subsp chelonae KCTC 9505, M. chlorophenolicum KCTC 19089, M. chubuense KCTC 19712, M. diernhoferi KCTC 9506, M. fallax KCTC 9508, M. flavescens ATCC 14474, M. fortuitum ATCC 6841, M. frederiksbergense KCTC 19100, M. gadium ATCC 27726, M. gastri ATCC 15754, M. gilvum KCTC 19423, M. goodii ATCC BAA-955, M. gordonae KCTC 9513, M. haemophilum ATCC 29548, M. hassiacum ATCC 700660, M. interjectum ATCC 51457, M. intermedium ATCC 51848, M. intracellulare ATCC 13950, M. intracellulare KCTC 9514, M. kansasii ATCC 12478, M. lentiflavum KMRC 70087, M. malmoense ATCC 29571, M. mantobense KCTC 9977, M. marinum ATCC 927, M. massiliense KCTC 19086, M. microti ATCC 19422, M. moriokaense KCTC 9516, M. mucogenicum KCTC 19088, M. neoaurum KCTC 19096, M. nonchromogenicum ATCC 19530, M. obuense KCTC 19097, M. parascrofulaceum KCTC 9979, M. peregrinum KCTC 9615, KMRC 75002, M. phlei KCTC 9689, M. porcinum KCTC 9517, M. pulveris KCTC 9518, M. scrofulaceum ATCC 19981, M. septicum ATCC 700731, M. simiae ATCC 25275, M. shimoidei ATCC 27962, M. smegmatis KCTC 9108, M. szulgai KCTC 9520, KMRC 31125, M. terrae KCTC 9614, M. triplex ATCC 700071, M. triviale KMRC 70093, M. tuberculosis ATCC 25177, ATCC 27294, M. ulcerans ATCC 19423, M. vaccae KCTC 19087, M. vanbaalenii KCTC 9966, M. wolinskyi ATCC 700010, M. xenopi KMRC 42001이었다.
임상검체에서 분리된 결핵균 186주, 항산성비결핵균 78주는 액체배지(MGIT 마이코박테리아 배지)나 고체(Ogawa배지)배지에서 검출되었거나 객담검체에서 직접 검출된 균주이었다. ATCC, KCTC 균주는 액체배지에서 배양하여 사용하였고, KMRC 균주는 고체배지에서 배양하여 사용하였다.
액체배지에서 자란 마이코박테리아의 DNA는 다음과 같이 추출하였다. 균이 배양된 MGIT 마이코박테리아 배양튜브를 잘 섞은 후에 액체 배지 500㎕를 취해 1.5㎖ 튜브에 넣고 14,000 rpm로 5분간 원심분리 시켰다. 원심분리 후 상층액은 버리고 남은 침사부분에 멸균증류수 300㎕ 넣고 끓는 물에 10분간 중탕 가열하였다. 중탕 가열 후 14,000 rpm로 5분간 원심분리 시켜서 상층액을 중합효소연쇄반응의 주형 DNA로 사용하였다.
고체배지에서 자란 마이코박테리아의 DNA는 다음과 같이 추출하였다. 1.5㎖튜브에 멸균증류수 500㎕ 넣고 고체배지에서 1 백금이를 취해 멸균증류수에 풀었다. 이 튜브를 끓는 물에 10분간 중탕 가열한 후 14,000 rpm에서 5분간 원심 분리 시켜서 상층액을 중합효소연쇄반응의 주형 DNA로 사용하였다.
객담검체는 다음과 같이 처리하였다. 15㎖ 혹은 50㎖ 튜브에 담긴 객담량과 동일한 량의 1N NaOH를 첨가하여 10분간 방치하여 객담을 액화시켰다. 14,000rpm에서 2분간 원심 분리하여 상층액을 버리고 남아 있는 침전물에 멸균증류수 1㎖를 넣고 10초간 잘 섞은 후 14,000rpm으로 2분간 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 남아 있는 침전물에 멸균증류 1㎖를 넣고 10초간 잘 섞은 후 14,000rpm에서 2분간 원심 분리 한 후 상층액을 버렸다. 상층액을 제거하고 남아 있는 침전물에 5% chelex 수지(Biorad, USA) 100㎕와 10㎎/㎖ proteinase K 1㎕를 넣고 잘 섞어 주었다. 56℃에서 15분간 방치한 후 잘 혼합하여 끓은 물에 10분간 중탕 가열하였다. 중탕 가열 후 14,000 rpm 5분간 원심 분리 시켜서 상층액을 중합효소연쇄반응의 주형 DNA로 사용하였다.
(2) 이중 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석
Type-it HRM PCR 키트(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)를 사용하여 이중 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 상기 Type-it HRM PCR 키트에는 형광 색소로서 EvaGreen이 들어 있다. 이중 실시간 중합효소연쇄반응은 Rotor-Gene Q(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)을 이용하였다. 약 95℃에서 약 5분간 변성 공정을 1 사이클(cycle), 약 95℃에서 약 10초 간 변성, 약 61℃에서 약 30초 간 어닐링 및 연장 공정을 1 싸이클로 하여, 40 싸이클을 수행하였다. 마지막 중합효소연쇄반응이 끝난 후, 약 72℃에서 약 93℃까지 초당 약 0.2℃ 속도로 온도를 증가시키면서 510nm의 형광파장을 측정하여 융해곡선분석을 하였다. 프라이머의 반응 정도의 차이는 프라이머의 농도, 어닐링 및 연장 온도와 유지 시간을 조절하여 2가지 검출 부위 모두 반응이 잘 일어날 수 있도록 조건을 조절하였다. 이 때, 이중 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 반응물의 조성은 하기 표 3과 같다. 하기 primer Mix에는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머가 동일한 량(10pmole/㎕)으로 들어 있었다. 따라서 반응에 사용되는 MTC의 primer mix 1.875㎕에는 정방향 및 역방향 프라이머가 각각 18.75pmole이 되며, 총 25㎕의 중합연쇄반응을 수행하는 반응물의 총부피가 25㎕가 되니 농도는 각각 0.75uM(18.75pmoles/25㎕)가 되었다. NTM 프라이머도 마찬가지로 정방향 및 역방향 프라이머가 반응물에 1.25㎕가 사용되며, 그때의 양이 12.5pmole이며 농도는 각각 0.5uM(12.5pmoles/25㎕)이 되었다. 이 때, NTM-1 정방향 프라이머(염기서열 38), NTM-2 정방향 프라이머(염기서열 39) 및 NTM-3 정방향 프라이머(염기서열 40)는 실질적으로 동량 포함되었다. 그리고, NTM-1 정방향 프라이머(염기서열 38)에는 5′-tgtggtggaaagcttttgc-3′ (염기서열 41), 5′-tttggtggaaagcttttgc-3′ (염기서열 42)이 약 1:1의 비율로 존재하였고, NTM-2 정방향 프라이머(염기서열 39)에는 5′-ggtgagtggtgcaaagctt-3′ (염기서열 43), 5′-ggtgtgtggtgcaaagctt-3′ (염기서열 44)이 약 1:1의 비율로 존재하였다.
표 3
성분 부피(㎕) 농도
2X HRM PCR Master Mix 12.5 1X
Primer Mix (10pmole/㎕) MTC 1.875 0.75uM
NTM 1.25 0.5uM
Nuclease free water 4.375 -
샘플 DNA template 5 -
전체 25 -
3. 이중 중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석 결과
도 7 내지 도 9는 상기 균주들의 이중 실시간 중합효소연쇄반응법에서 얻어진 증폭산물(amplicon)의 융해곡선분석을 나타낸다. 도 7 내지 도 9는 각 결핵균(MTC), 항산성비결핵균(NTM) 및 결핵균(MTC)+항산성비결핵균(NTM)의 융해곡선을 나타낸다. 상기 융해곡선에서, x축은 온도(℃)이고 y축은 단위 시간당 형광량의 변화(dF/dT)이다.
결핵균(MTC)의 PCR 증폭 산물의 평균융해온도(Tm)는 약 78.0±0.20℃, 항산성비결핵균(NTM)의 PCR 증폭 산물의 평균융해온도는 약 86.6±0.26℃로 나타났고, 결핵균(MTC)+항산성비결핵균(NTM)은 상기 결핵균과 항산성 비결핵균의 평균융해온도의 두 개의 피크가 나타났다.
따라서, 상기 이중 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 수행할 경우, 임상 검체에서 결핵균과 항산성비결핵균을 동시에 높은 신뢰성을 가지고 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
본 실시예들을 통하여, 결핵균 특이적 염기서열 및 결핵균에는 없는 항산성비결핵균의 고유염기서열을 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머로 디자인하여, 검사키트를 제작하여 이중 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석을 수행하여, 상기 결핵균과 항산성비결핵균의 특이적 염기서열 탐색에 이용한 표준균주들에 평가할 때, 높은 수준의 신뢰성으로 결핵균과 항산성비결핵균을 평가할 수 있는 수단임을 확인할 수 있었다. 따라서, 여러 종의 결핵균과 항상성비결핵균을 효과적으로 검출할 수 있는 수단을 제공할 수 있다.
본 실시예들에 따르면, 결핵균과 항산성비결핵균에 특이적인 유전자 염기서열을 검출할 수 있는 결핵균과 항산성비결핵균 검출용 프라이머 세트는 결핵균과 항산성비결핵균에 대해 진단 감수성 및 특이성이 높다. 또한, 본 실시예들에 따른 결핵균과 항산성비결핵균 검출용 프라이머를 이용하는 이중 실시간 중합효소연쇄반응법과 융해곡선분석에 의하면 검체 내의 결핵균 및/또는 항산성비결핵균을 동시에 보다 효율적으로 검출할 수 있는 임상진단 수단을 제공할 수 있다.
본 발명은 결핵균과 항산성비결핵균에 특이적인 유전자 염기서열을 검출할 수 있는 검출용 프라이머 세트, 검출 키트 및 검출 방법을 제공함으로, 염기서열에 특이한 프로브를 사용하지 않아 저비용으로 단시간에 결핵균 및/또는 항산성비결핵균을 동시에 보다 효율적으로 검출할 수 있는 임상진단 수단을 제공할 수 있고, 이를 병원, 연구소 등 다양한 산업 분야에 활용할 수 있을 것이다.
염기서열 1은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis complex)의 IS6110 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 2은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis complex)의 IS6110 유전자에 특이적인 역방향 프라이머이다.
염기서열 3은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 4은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 역방향 프라이머(NTM-1)이다.
염기서열 5은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 역방향 프라이머(NTM-1)이다.
염기서열 6은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 역방향 프라이머(NTM-1)이다.
염기서열 7은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 역방향 프라이머(NTM-2)이다.
염기서열 8은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 9은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 10은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 11은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 12은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 13은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 14은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 15은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 16은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 역방향 프라이머(NTM-2)이다.
염기서열 17은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 역방향 프라이머(NTM-2)이다.
염기서열 18은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis complex)의 IS6110 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 19은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis complex)의 IS6110 유전자에 특이적인 역방향 프라이머이다.
염기서열 20은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 21은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 역방향 프라이머이다.
염기서열 22은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 23은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 24은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 25은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 26은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 27은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 28은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 29은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 30은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 31은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 32은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 33은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 34은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 35은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 36은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 37은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머이다.
염기서열 38은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머(NTM-1)이다.
염기서열 39은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머(NTM-2)이다.
염기서열 40은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머(NTM-3)이다.
염기서열 41은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머(NTM-1)이다.
염기서열 42은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머(NTM-1)이다.
염기서열 43은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머(NTM-2)이다.
염기서열 44은 항산성비결핵균(Nontuberculous mycobacteria)의 16S rRNA 유전자에 특이적인 정방향 프라이머(NTM-2)이다.

Claims (9)

  1. 염기서열 3의 정방향 프라이머;
    염기서열 4의 프라이머, 염기서열 5의 프라이머 및 염기서열 6의 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 역방향 프라이머; 및
    염기서열 7의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트.
  2. 염기서열 1의 정방향 프라이머 및 염기서열 2의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및
    염기서열 3의 정방향 프라이머, 염기서열 4의 프라이머, 염기서열 5의 프라이머 및 염기서열 6의 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 역방향 프라이머 및 염기서열 7의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트.
  3. 검체시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
    염기서열 1의 정방향 프라이머 및 염기서열 2의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및 염기서열 3의 정방향 프라이머, 염기서열 4의 프라이머, 염기서열 5의 프라이머 및 염기서열 6의 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 역방향 프라이머 및 염기서열 7의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 상기 DNA를 이중 실시간 중합효소연쇄반응을 시키는 단계;
    온도를 변화시키면서 상기 이중 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 증폭산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및
    상기 융해곡선의 융해온도를 확인하는 단계를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균을 검출하는 방법.
  4. 염기서열 20의 정방향 프라이머; 및
    염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트.
  5. 염기서열 18의 정방향 프라이머 및 염기서열 19의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및
    염기서열 20의 정방향 프라이머 및 염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트.
  6. 검체시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
    염기서열 18의 정방향 프라이머 및 염기서열 19의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및 염기서열 20의 정방향 프라이머 및 염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 상기 DNA를 이중 실시간 중합효소연쇄반응을 시키는 단계;
    온도를 변화시키면서 상기 이중 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 증폭산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및
    상기 융해곡선의 융해온도를 확인하는 단계를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균을 검출하는 방법.
  7. 염기서열 38의 프라이머, 염기서열 39의 프라이머 및 염기서열 40의 프라이머를 포함하는 정방향 프라이머; 및
    염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트.
  8. 염기서열 18의 정방향 프라이머 및 염기서열 19의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및
    염기서열 38의 프라이머, 염기서열 39의 프라이머 및 염기서열 40의 프라이머를 포함하는 정방향 프라이머 및 염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균 검출 키트.
  9. 검체시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
    염기서열 18의 정방향 프라이머 및 염기서열 19의 역방향 프라이머를 포함하는 결핵균의 IS6110 유전자에 특이적인 프라이머 세트; 및 염기서열 38의 프라이머, 염기서열 39의 프라이머 및 염기서열 40의 프라이머를 포함하는 정방향 프라이머 및 염기서열 21의 역방향 프라이머를 포함하는 항산성비결핵균의 16S rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 상기 DNA를 이중 실시간 중합효소연쇄반응을 시키는 단계;
    온도를 변화시키면서 상기 이중 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 증폭산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및
    상기 융해곡선의 융해온도를 확인하는 단계를 포함하는 결핵균과 항산성비결핵균을 검출하는 방법.
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CN118127201A (zh) * 2024-04-16 2024-06-04 山东省公共卫生临床中心 一种非结核分枝杆菌与结核分枝杆菌复合群多重耐药突变位点检测试剂盒的制备及应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR100234975B1 (ko) * 1997-07-28 1999-12-15 국윤호 마이코박테리아의 rpoB 유전자 분절을 표적으로 하는 PCR-RFLP에 의한 마이코박테리아 균종의 탐지 및 동정방법
KR100968069B1 (ko) * 2007-10-24 2010-07-08 대한민국 우결핵균 특이단백질 및 그 정제방법

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410810A (zh) * 2022-01-06 2022-04-29 广州蔚捷生物医药科技有限公司 一种检测非结核分枝杆菌的试剂盒、检测方法及其应用
CN118127201A (zh) * 2024-04-16 2024-06-04 山东省公共卫生临床中心 一种非结核分枝杆菌与结核分枝杆菌复合群多重耐药突变位点检测试剂盒的制备及应用

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