WO2011144396A1 - Verfahren und vorrichtung zum durchmischen einer flüssigkeit mit einem mikrofluidischen testelement - Google Patents

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Carlo Effenhauser
Christoph Böhm
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Roche Diagnostics Gmbh
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Definitions

  • the present invention relates to a method for mixing a liquid by means of a microfluidic test element, which has a substrate and a channel structure and rotates at an angular velocity about an axis of rotation.
  • the invention also relates to a device for mixing a liquid and the test element itself.
  • Microfluidic test elements are used, for example, for analyzing liquid samples and for mixing a liquid, primarily in diagnostic tests (in-vitro diagnostics). In such tests, for example, body fluid samples are examined for an analyte for medical purposes contained therein.
  • microfluidic test elements are so-called microarrays or solid-phase tests based on solid-phase binding reactions.
  • One group of such tests are sandwich tests in which a solid phase-bound first binding partner has a specific binding action with an analyte in the liquid.
  • the analyte in turn, can be visualized by "docking" a label molecule.
  • the visualization may be by, for example, luminescence or fluorescence or other forms of labeling, such as by enzymes in enzyme immunoassays.
  • mock tests are carried out in which the solid-phase-bound reactant does not cover the entire bottom surface of an incubation chamber but only individual regions or points thereof.
  • the use of spots thus results in a concentration of the analyte and the label at the individual spots in the chamber. Particularly at low concentrations, the density of the analyte and of the label in the area of the spots is considerably higher than in the case of full-area application of the solid phase-bound reactant.
  • an arrangement of several (three to ten) spots for the same parameter (analyte) has proved suitable. The spots are evaluated individually. The results are averaged. In some tests, another, preferably higher number of spots per parameter is advantageous.
  • the analytes and labels must be distributed as evenly as possible over all spots.
  • microarrays even in biochemical reaction chambers with surface sensors and a corresponding measuring technique uniform binding of the analytes is necessary, especially if optical evaluation takes place, for example by image recognition.
  • fully coated (active) surfaces may be, for example, a gel (solid phase reaction partner hydrogel) at the bottom of the chamber or a large pore 3D matrix as an alternative to a planar surface.
  • microfluidic test elements are also used in tests in which a reagent in the reagent chamber is in liquid form or as a solid. substance is present, which is dried on the test element. Such dry reagents must be dissolved and homogenized prior to analysis. It is necessary in each case a uniform mixing or solving.
  • mixing also includes the possibility that two liquids are mixed with one another when the reagent is in liquid form, for example.
  • test carriers on which microfluidic test elements with channel structures for receiving a liquid sample are arranged or integrated.
  • the channel structures often comprise a multiplicity of channel sections, chambers and fluidic valves for outlet control.
  • Test carriers and microfluidic test elements consist of a carrier material, often a substrate made of plastic material. Suitable materials include COC (cyclo-olefin copolymer) or plastics such as
  • the channel structure of the test carrier is enclosed by the substrate and a cover or a cover layer.
  • Such a channel structure is manufactured by a three-dimensional structuring of the plastic parts, for example by injection molding techniques or other methods. It is also possible the structure
  • the control of the liquid transport within the channel structures and the control of the process sequence can be done with internal (within the fluidic test element) or with external (outside the fluidic test element) measures.
  • the control can be caused by applying pressure differences or by changing forces, for example by changing the effective direction of gravity.
  • a targeted control of the liquid flow can be achieved within the channel structure by the rotation of a test element.
  • the generated forces may be made by controlling the change in rotational speed or direction of rotation, or by the distance from the axis of rotation, or by utilizing density differences in the liquid (eg, dissolving a solid).
  • the microfluidic test elements can be arranged in a rotating disk in the form of a compact disc (CD).
  • CD compact disc
  • the rotational frequency is first of all increased in order to cause the opening of a microfluidic valve in a "loading phase" by an increased centrifugal force and to transport the liquid into the corresponding microfluidic structures and chambers.
  • 25 mentation phase connect, in which the test element is rotated at an increased rotational speed constant over a long time, Fig. 6.16.
  • the test element is rotated at a reduced rotational speed, which may be lower than the peak speed in the shake mode, in order to produce an optical evaluation.
  • the evaluation phase in the sequence described is significantly longer than the previous process phases, which include the shake-mode mixing phase.
  • the mixing of the liquid in the chamber takes place in a uniform "shake mode" in which the rotational frequency is constantly accelerated up to an end angular velocity of the rotating disk and then with a second acceleration (deceleration), which is opposite to the first, first is braked to a standstill. Subsequently, the disk is accelerated in the opposite direction until a second end angular velocity is reached. The disc is then braked again and accelerated again in the opposite direction after standstill.
  • the first and the second acceleration and the first and second end angular velocity are equal in magnitude, however, the direction of rotation is opposite.
  • This "shake-mode” is also called “Euler-mixing” in professional circles, since the centrifugal force and Coriolis force, which occur with the disks rotating constantly, add another force component to the acceleration of the disk, the Euler force.
  • the Euler force is proportional to the time change of the angular velocity, while the centrifugal force is proportional to the square of the angular velocity and the Coriolis force is proportional to the angular velocity.
  • EP 1 894 617 A2 (5) relates to a system with a microfluidic test element having a channel structure and a liquid chamber in which liquids are mixed.
  • the test element is rotated in a system, changing the direction of rotation.
  • the test element is accelerated to a first end angular velocity in a first direction, then in the opposite direction to a second final angular velocity. This is followed by a reversal of the direction of rotation.
  • the first and second end angular velocities and the respective accelerations may be the same (FIG. 6a) or different (FIG. 6b).
  • the individual half-cycles may be different, the successive cycles (full cycle) are the same.
  • DE 10 2005 048 260 A1 (6) likewise proposes a shake mode for measuring a liquid in a rotating test carrier.
  • the shaking mode (FIG. 8)
  • the test carrier is alternately accelerated and decelerated, with the direction of rotation changing repeatedly between the two end angular speeds.
  • the rotational speed when reaching the maximum speed for a certain period of time can be kept constant.
  • the maximum rotation frequency and acceleration / deceleration are the same in each cycle.
  • a shake mode without reverse rotation is proposed, in which the rotation frequency between the stop and a maximum rotation frequency is changed 25.
  • shaking mode according to FIG. 9 shaking is first effected for two cycles before a resting phase takes place, followed by two shaking cycles again. The mixing of the liquid within the shaking mode takes place with the same rotation cycles.
  • the sample Prior to performing shake-mode mixing, the sample is supplied and first accelerated and decelerated to disperse the liquid in the channel structures.
  • the shaking mode is followed by a resting phase in which a washing buffer is fed, which is then replaced by a washing buffer. accelerating and decelerating is controlled in the channel structure is moved. This can be followed by further process steps with different rotational speeds.
  • the object of the present invention is thus to propose an improved method and an improved apparatus for mixing liquids.
  • the present object is achieved by a method having the features of claim 1 and by an apparatus having the features of claim 14 and by a test element having the features of claim 15.
  • the method according to the invention for mixing a liquid by means of a microfluidic test element which has a substrate and a microfluidic channel structure with a mixing chamber requires that the microfluidic test element rotate at an angular velocity ⁇ about an axis of rotation which can preferably extend through the test element ,
  • the axis of rotation may be a central axis of rotation through the center of the test element or through the center of gravity.
  • the test element is designed as a test carrier or integrated into a test carrier.
  • the test carrier rotates about an axis of rotation, which preferably extends through the test carrier and is preferably arranged centrally.
  • the microfluidic test element rotates according to a rotation profile that includes at least three cycles and in which the angular velocity changes within one cycle.
  • the rotation profile is to be understood as a time sequence of several end angular velocities, which are subdivided into cycles.
  • One cycle starting from an end angular velocity, comprises accelerating the rotation of the test element with at least a first acceleration a1 until reaching a first end angular velocity ⁇ 1 and after reaching the first end angular velocity ⁇ 1 accelerating the rotation of the test element with at least one second acceleration a2 until reaching a second final angular velocity ⁇ 2.
  • the two accelerations a1 and a2 are opposite. This applies both within a cycle as well as from one cycle to the next, so that, for example, the acceleration a2 of the first cycle Z- ⁇ is opposite to the acceleration a1 of the second cycle Z 2 .
  • a cycle begins, for example, at a curve minimum, followed by a section of increasing angular velocity followed by a positive acceleration until reaching a curve maximum. After reaching the maximum curve, the angular velocity decreases with a negative acceleration until again a curve minimum is reached.
  • the cycle therefore comprises two half-cycles, each of which extends from a curve minimum to the subsequent curve maximum or from a curve maximum to the subsequent curve minimum. Two consecutive half-cycles form one full cycle.
  • the rotation profile has a plurality of cycles, wherein the rotation profile can also be repeated periodically, so that the sequence of the cycles is repeated after a predetermined number of cycles (greater than 2). However, this is not mandatory.
  • At least one of the accelerations a1, a2 and / or at least one of the final angular velocities ⁇ 1, ⁇ 2 are changed from one cycle to the next in order to produce a (preferably homogeneously) mixed liquid. It was recognized that the homogeneity of the mixed liquid can be significantly improved by the juxtaposition of different cycles. Also, the use of different cycles has positive effects on the mixing time, which is reduced.
  • the method according to the invention also solves the problem that there is a "depletion" of the liquid in the analyte, if the analyte in the liquid, for example, on the solid phase of the microfluidic roarrays sets and therefore the solid-phase part of the liquid has little or fewer analyte molecules.
  • the method according to the invention it is ensured that (continuously) analyte is replenished from the liquid phase regions of the chamber which are remote from the phase to the depleted liquid regions.
  • the mass transport within the liquid is optimized by the method as well as the mixing.
  • the constant shaking causes the flow pattern on the array surface to "burn in".
  • the array spots detection sites
  • the array spots can not be introduced at arbitrary locations in the chamber, but would have to be selected as a function of the flow pattern and thus as a function of the rotation profile.
  • the coupling of an equal amount of analyte in the liquid at different locations on the chamber surface is thus different efficient.
  • multiple array spots are evaluated by averaging the actual actual spot values.
  • the formation of flow patterns distorts the measurement result, so that this method has significant disadvantages here.
  • the rotational profile of the shake mode comprises at least three successive cycles.
  • a rotation of the test element for controlling the liquid transport within the capillary structure of the test element can take place prior to the mixing of the liquid.
  • This rotation can be accelerated and decelerated and, for example, also have a rotation profile, in which initially an acceleration up to a first end angular velocity and then a deceleration can occur up to a lower end angular velocity.
  • These pre-mixing process steps and rotation profiles are not part of the inventive method for mixing a liquid. Only when the liquid to be mixed is contained in the corresponding mixing chamber, the mixing of the liquid takes place.
  • a rotational profile subsequent to the mixing for the evaluation of the liquid, for the addition of further liquid, for example a washing buffer, for carrying out a sedimentation process step or similar process steps, is not considered in the rotary profile for mixing the liquid.
  • These rotation profiles for process control must be clearly distinguished from the rotation profile for mixing the liquid.
  • the rotation profile according to the invention for mixing with at least three successive cycles is designed such that in each case one cycle differs from the respective preceding cycle in at least one of the end angular velocities and / or the accelerations.
  • the shake mode comprises at least ten consecutive cycles, wherein also at least 15 or 20 or 25 cycles can be carried out.
  • the shake mode has at least 10 consecutive cycles, which are completed within 20 seconds, preferably within at most 30 seconds, at most 40 seconds, at most 50 seconds or at most 60 seconds.
  • a likewise preferred embodiment of the method provides that the average duration of a Cycle less than 2 seconds, preferably less than a second. It is also possible that the average cycle time is at least less than 5 seconds or less 10 seconds.
  • the round chamber is preferably circular and not elliptical. Since the shape of a flat disk is selected for the rotating test elements and an optical evaluation is carried out over the surface of the disk, it was recognized that a chamber in the form of a cylindrical disk is optimal. Particularly preferably, this has a circular floor plan. A ratio of chamber diameter to chamber height of 1 to 1 has been found to be ideal. This "aspect ratio" should therefore preferably be close to 1 and, taking into account the typical systemic boundary conditions, should be a maximum of 4. The quotient from surface A to volume V should have a value between 1 and 3.5, as a result of investigations at constant volume.
  • the liquid chamber is to be arranged such that the rotation axis (preferably extending through the test element) around which the test element rotates does not extend through the liquid chamber. Rather, the liquid chamber is preferably spaced from the axis of rotation.
  • the amounts of the accelerations a1 and a2 are different in one cycle. The formation of constant flow patterns in the liquid chamber is prevented within a cycle.
  • At least one of the accelerations a1, a2 is variable during a cycle.
  • the one or both accelerations a1, a2 thus change within the cycle.
  • at least one of the accelerations a1, a2 can be constant during one cycle, preferably both accelerations.
  • the change in the angular velocity within the cycle thus changes continuously (constant). Since a cycle is relatively short in relation to the rotation profile and thus to the entire mixing time, no stationary, constant flow patterns are formed within the period (cycle duration).
  • the mixing results are of (nearly) the same quality as with changing accelerations during the cycle.
  • the control of the rotation with a constant acceleration is much easier to realize.
  • the direction of rotation of the test element is equal to or opposite to the direction of rotation of the test element when the second end angular velocity ⁇ 2 is reached.
  • the direction of rotation is opposite. Consequently, a reversal of the direction of rotation takes place while an acceleration is exerted on the rotating test element between the first and second end angular speeds. The “vibration" thus takes place around the zero point of the frequency.
  • the rotating test element is consequently decelerated until it comes to a standstill and then accelerated further with the same second acceleration a2 until the second final angular velocity ⁇ 2 is reached.
  • the term "mixing” means not only the dissolution of a solid in a liquid and the mixing of several liquids, but also the uniform transport of dissolved in the liquid components, for example, a depletion of the solution with reagent or analyte to avoid a binding phase (solid phase). After the reaction of individual analyte molecules with capture molecules of the binding phase, the analyte in the fluid is depleted in the region of the binding phase.
  • the transport of analyte molecules within the liquid is ensured in such a way that a continuous subsequent delivery of the analyte molecules from remote areas to the liquid zones near the binding phase takes place in order to connect as far as possible all analyte molecules which are possible in the context of the relevant equilibrium reaction to the binding molecules. phase (or to their catcher molecules), which increases the sensitivity of the detection method.
  • the goal thus achieved is enrichment of all possible analyte molecules from the liquid phase at the binding phase.
  • the term "mixing" thus also includes this balancing of the analyte molecules within the liquid.
  • FIG. 1 shows a device for homogeneous mixing of a liquid.
  • FIGS. 5a-c show a diagram with the temporal sequence of the angular velocity at different accelerations
  • FIG. 6 shows another diagram of the time sequence of the angular velocity in the "random shake mode"
  • Fig. 7 is a table for comparing various shake modes
  • Fig. 8 is a diagram for comparing two shake modes
  • Fig. 9 is a diagram showing the time course of two "random shake modes”.
  • FIG. 1 shows a device 1 for homogeneous mixing of a liquid with a test element 2, which is held in the device 1.
  • the device 1 comprises a holder 3 for receiving the test element 2, which is rotatable about a rotation axis 4.
  • the two test elements 2 are integrated in a test carrier 16.
  • the rotatable holder 3 with its shaft 3 a is moved by a drive 5 such that the holder 3 together with the held i o test carrier 16 rotates about the rotation axis 4 with an adjustable variable angular velocity.
  • the drive 5 is controlled by a control unit 6, wherein a movement sequence can be defined, which is preferably stored as a rotation profile in the control unit 6.
  • the rotation profile can for example consist of several control commands,
  • the rotation profile can either be stored in a memory of the device 1 or set by manual adjustment of the above parameters on the device or
  • the device 1 comprises an optical measuring and evaluation unit 7 with an optical sensor 8.
  • a liquid recorded in the test element 2 can be analyzed and measured.
  • the known in the prior art investigation can be applied.
  • the microfluidic test element 2 comprises a microfluidic channel structure 10, which has a channel section 11 extending from an opening 12 to a microfluidic fluid chamber 13.
  • the liquid chamber 13 is fluidically connected via a siphon channel 14 with a collection chamber 15, which is also referred to as waste chamber.
  • the test elements 2 are embedded in the test carrier 16, which is designed as a round disk (disc). is det and through which the rotation axis 4 extends.
  • the channel structure 10 is enclosed by a substrate and a cover layer, not shown, which covers the test carrier 16 from above.
  • the holder 3 in the device 1 is formed as a shaft 3 a, which runs concentrically to the axis of rotation 4.
  • holders 3 for example, a retaining disk, a rotor or a clamping device with outer brackets, in which the test element is clamped.
  • the central shaft 3a it is possible to rotate the test carrier with one or more test elements about an eccentric (eccentric) axis of rotation.
  • the axis of rotation may extend, for example, through the center of gravity of the test carrier 16, in order to take into account spatial structures in the test carrier 16 or the test elements 2 and to avoid an imbalance during rotation.
  • Rotation axis does not necessarily have to be aligned vertically. It can also run diagonally in space at a solid angle ⁇ ⁇ 0 with respect to the vertical.
  • the test carrier 16 in FIG. 2 for homogeneous mixing of a liquid 20 comprises a test element 2 with a channel structure 10.
  • the channel structure 10 has two openings 12a, 12b, to which two adjacent channel sections 11a, 11b up to two intermediate chambers 17a , 17b extend. For example, two liquids can be supplied simultaneously.
  • the intermediate chambers 17a, 17b are in fluid communication via a further channel 18a or 18b 25, each with an opening 19a, 19b. Through the openings 19a, b, the liquid receiving channel section can be reliably vented in multiple use.
  • a channel section 20a, 20b adjoining the intermediate chambers 17a, 17b leads to a fluidic valve 21, through which fluids from the intermediate chambers 17a, 17b can be directed into the liquid chamber 13 in a controlled manner.
  • the fluidic valve 21 has an air outlet 22 for venting, which provides an air channel 23 for the venting of the fluidic valve 21 and connected thereto fluidic regions (eg, chamber 13).
  • the liquid chamber 13 is followed by a siphon channel 14 which connects the liquid chamber 5 to a collection chamber 15.
  • the applied accelerations a1, a2 are equal in magnitude.
  • the period is thus constant.
  • the cycle duration is understood to mean the time between the first reaching of the first end frequency f1 and the next reaching of the first end frequency f1.
  • 25 benförmigen test carrier 16 is arranged with a height of 2.7 to 3 mm, recognized that a round liquid chamber 13 is advantageous.
  • the liquid chamber 13 is preferably designed as a round cylindrical disk with a height smaller than the height of the test carrier 16. Particularly preferred is a circular floor plan of the cylinder disc. The quotient of the diameter of the
  • the height of the cylinder should be as close as possible.
  • a quotient of 1 25 a chamber diameter r1 of 2.5 mm and a height h1 of 2 mm, a homogeneous mixing of two liquids containing plasma is achieved after only 5 seconds, while with a diameter r2 of 4 mm and a height h2 of 0.8 mm Homogeneous mixing only takes place after 10 seconds. It was recognized that the ratio of surface A to volume V is crucial.
  • the quotient is close to 1.
  • the chamber with the smaller quotient achieves homogenous mixing faster.
  • the mixing efficiency can be further increased.
  • at least one of the accelerations a1, a2 and / or at least one of the final angular velocities ⁇ 1, ⁇ 2 has to be changed from one cycle Z- ⁇ to the next cycle Z 2 .
  • the incubation time with mixing over the solid phase of the microarray can thus be reduced to a few minutes, while the quality of the subsequent delivery of analytes to the detection surface and the homogeneity of the setting on the solid phase are markedly improved.
  • Figure 4 shows a rotational profile for mixing a liquid in which only the final angular velocities ⁇ 1, ⁇ 2 have been changed from cycle to cycle.
  • the accelerations a1, a2 are the same in all cycles. In this preferred embodiment, the first and second accelerations a1, a2 are equal in magnitude.
  • Further rotational profiles or rotational sequences for controlling the liquid transport are not shown here and can follow the rotational profile for mixing the liquid or after this rotation profile. However, these are not considered in the definition of the rotation profile for mixing the liquid.
  • FIGS. 5a to c each show a section of a rotational profile for the angular velocity.
  • This rotation profile is also used for mixing the liquid and not for controlling the liquid transport in the channel structures.
  • the first acceleration a1 1 in the first cycle Z-1 is different from the first acceleration a12 in the second cycle Z 2 .
  • the first end angular velocity ⁇ 1 1 of the first cycle is different from the first end angular velocity ⁇ 12 of the second cycle.
  • the second acceleration a21, a22 and the second end angular velocity ⁇ 21 and ⁇ 22 are constant and does not change.
  • At least one of the accelerations a1, a2 is variable during a cycle Z.
  • the respective acceleration a1, a2 consist of two partial accelerations a1 a , a1 b and 15 a2 a , a2b.
  • the respective accelerations a a , ab may be constant. Preferably, they are different from each other. However, the accelerations a a , ab may also be variable, so that in the diagram no straight line, but a curve would be shown.
  • a cycle consists of a first subcycle Z T i until reaching the first end angular velocity ⁇ 1 and from an adjoining second subcycle Z 2 until reaching the second final angular velocity ⁇ 2.
  • the rotation of the test element takes place in at least one of the two partial cycles Z T i, Z T 2 with at least two accelerations.
  • FIG. 5b shows that the first cycle Z-1 consists of the two partial cycles Z T ii and Z T 2i.
  • the rotation of the test element is first carried out with the acceleration a1 1 a and then with a second acceleration a1 1 b , which in this embodiment is different from the first partial acceleration a1 1 a .
  • the second subcycle Z T 2i of the first cycle also has two accelerations a21 a and a21 b .
  • at least one of the two partial accelerations a a , a b is equal to zero in at least one of the partial cycles Z T -i, Z T 2.
  • the acceleration in a subcycle a1, a2 also consist of more than two partial accelerations a a , a b , a c ... exist. It is conceivable that even before reaching the final angular velocity, the rotation of the test element with a constant angular velocity (unlike the end angular velocity), ie with an acceleration equal to zero, and then again the rotation is accelerated until the final angular velocity is reached , Preferably, at least one of the partial accelerations when reaching one of the end angular velocities is equal to zero. The test element is then constantly rotated at the final angular velocity of the cycle for a predetermined period of time T P , ie not accelerated.
  • T P ie not accelerated.
  • the accelerations of the rotation profile are coded with a random number; they are formed from the random number.
  • the end angular velocities ⁇ 1, ⁇ 2 are preferably formed from a random number.
  • a random number may be used that is within the system's 5 system limits.
  • the amount of the final angular velocity is limited to 100 Hz due to the system, so that the final angular velocities determined by a random number can likewise not be greater than 100 Hz in terms of magnitude.
  • the amount of the final angular velocity must be greater than or equal to 20 Hz due to the system, since otherwise the siphon channel 14 adjoining the liquid chamber 13 breaks through and liquid escapes.
  • the random number is preferably a "true random number”. For example, you can
  • the random number is used as a matrix for choosing the "random" process parameters. For example, values of the accelerations and / or the end angular velocities may be formed from two consecutive 20 digits each of the random number. Alternatively, any number may be used that is constant with a factor, e.g. B. 10, is multiplied.
  • This process also includes braking, a (short) standstill with reversal of the direction of rotation and an acceleration.
  • the first acceleration a1 is opposite to the second acceleration a2 and consequently has a positive sign.
  • This first end angular velocity ⁇ 1 already belongs to the second cycle Z 2 of the rotation profile.
  • FIG. 7 shows the measurement results of two measurements.
  • FIG. 9 shows the comparison of two measurements in a "chaotic Euler mixing".
  • the median of the measured, signaling fluorescence signals (FS) counts
  • S individual spots
  • the result shows a low variance across all spots.
  • the two outliers were expected in this attempt because they are systemic.
  • the fact that both outliers were detected at different spots is due to the fact that no ideal matrices io (coated liquid chambers) were available.
  • the mixing of a liquid can be significantly improved.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testelement sowie eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Erzeugen einer durchmischten Flüssigkeit mittels eines mikrofluidischen, rotierenden Testelements (2) mit einem Substrat und einer mikrofluidischen Kanalstruktur (10) zur Aufnahme der Flüssigkeit. Das Verfahren umfasst das Rotieren des Testelements (2) mit der Flüssigkeit gemäß eines Rotationsprofils, das wenigstens zwei Zyklen umfasst, wobei in einem Zyklus die folgenden Schritte ausgeführt werden: Beschleunigen der Rotation des Testelements (2) mit einer Beschleunigung a1 bis zum Erreichen einer ersten End-Winkelgeschwindigkeit ω1 und anschließend das Beschleunigen der Rotation des Testelements (2) mit einer Beschleunigung a2 bis zum Erreichen einer zweiten End-Winkelgeschwindigkeit ω2. Die Beschleunigung a1 und die Beschleunigung a2 sind entgegengerichtet. Wenigstens eine der Beschleunigungen a1, a2 und/oder wenigstens eine der End-Winkelgeschwindigkeiten ω1, ω2 ändert sich von einem Zyklus zum nächsten Zyklus, wodurch ein gleichmäßiger Transport von in der Flüssigkeit enthaltenen Molekülen an eine aktive Oberfläche in der Kanalstruktur (10) erzielt wird.

Description

Verfahren und Vorrichtung zum Durchmischen einer Flüssigkeit mit mikrofluidischen Testelement
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Durchmischen einer Flüssigkeit mittels eines mikrofluidischen Testelements, das ein Substrat und eine Kanalstruktur aufweist und mit einer Winkelgeschwindigkeit um eine Rotationsachse rotiert. Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zum Durchmischen einer Flüssigkeit sowie das Testelement selbst.
Mikrofluidische Testelemente werden beispielsweise zum Analysieren von Flüssigkeitsproben und zum Durchmischen einer Flüssigkeit vorwiegend in diagnostischen Tests (In-Vitro-Diagnostik) eingesetzt. Bei derartigen Tests werden beispielsweise Körperflüssigkeitsproben auf einen darin enthaltenen Analyten für medizinische Zwecke untersucht.
Ein Anwendungsgebiet von mikrofluidischen Testelementen sind sogenannte Microarrays oder Festphasentests, die auf Festphasenbindungsreaktionen basieren. Eine Gruppe derartiger Tests sind Sandwichtests, bei denen ein festphasengebundener erster Bindungspartner eine spezifische Bindungsre- aktion mit einem Analyten in der Flüssigkeit eingeht. Der Analyt wiederum kann durch das "Andocken" eines Markierungsmoleküls (Label) sichtbar gemacht werden. Die Sichtbarmachung kann beispielsweise durch Lumineszenz oder Fluoreszenz oder andere Formen der Labelung erfolgen, wie etwa durch Enzyme in Enzymimmunoassays.
Da bei Einsatz kleiner Probenvolumina häufig eine geringe Konzentration des Analyten vorliegt, werden sogenannte Spottests durchgeführt, bei denen der festphasengebundene Reaktionspartner nicht die gesamte Bodenfläche einer Inkubationskammer bedeckt, sondern nur einzelne Bereiche bzw. Punkte davon. Durch die Verwendung von Spots erfolgt also eine Konzentration des Analyten und des Labels an den einzelnen Spots in der Kammer. Insbesondere bei geringer Konzentration ist die Dichte des Analyten und des Labels im Bereich der Spots erheblich höher als bei vollflächiger Aufbringung des fest- phasengebundenen Reaktionspartners. Für viele Tests hat sich eine Anordnung von mehreren (drei bis zehn) Spots für den gleichen Parameter (Analyten) als geeignet erwiesen. Die Spots werden einzeln ausgewertet. Aus den Ergebnissen wird ein Mittelwert gebildet. Bei einigen Tests ist auch eine andere, vorzugsweise höhere Anzahl von Spots pro Parameter vorteilhaft. Damit eine aussagekräftige Mittelwertauswertung erfolgen kann, müssen die Analyten und Label möglichst gleichmäßig über alle Spots verteilt sein.
Genau wie bei den Microarrays ist auch bei biochemischen Reaktionskammern mit Oberflächensensoren und einer entsprechenden Messtechnik eine gleichmäßige Abbindung der Analyten notwendig, insbesondere wenn eine optische Auswertung erfolgt, beispielsweise durch Bilderkennung. Gleiches gilt auch für vollflächig beschichtete (aktive) Oberflächen. Diese können beispielsweise ein Gel (Hydrogel mit Festphasenreaktionspartner) am Boden der Kammer oder eine großporige 3D-Matrix als Alternative zu einer planen Ober- fläche sein.
Daneben werden mikrofluidische Testelemente auch bei Tests verwendet, bei denen in der Reagenzkammer ein Reagenz in flüssiger Form oder als Fest- stoff vorliegt, der auf dem Testelement eingetrocknet ist. Derartige Trockenreagenzien müssen vor der Analyse aufgelöst und homogenisiert werden. Es ist jeweils ein gleichmäßiges Durchmischen bzw. Anlösen notwendig. Der Begriff "Durchmischen" umfasst dabei neben dem Auflösen eines Feststoffes in einer 5 Flüssigkeit (Homogenisieren mit einem flüssigen Lösungsmittel) auch die Möglichkeit, dass zwei Flüssigkeiten miteinander gemischt werden, wenn das Reagenz beispielsweise in flüssiger Form vorliegt.
Ein wichtiger Bestandteil bei den oben genannten Tests und der Analyse einer 10 Probenflüssigkeit sind Testträger, auf denen mikrofluidische Testelemente mit Kanalstrukturen zur Aufnahme einer Flüssigkeitsprobe angeordnet oder integriert sind. Um die Durchführung aufwendiger, mehrstufiger Testführungen ("Testprotokolle") zu ermöglichen, umfassen die Kanalstrukturen häufig eine Vielzahl von Kanalabschnitten, Kammern und fluidischen Ventilen zur Abi s laufsteuerung.
Testträger und mikrofluidische Testelemente bestehen aus einem Trägermaterial, häufig aus einem Substrat aus Kunststoffmaterial. Geeignete Materialien sind beispielsweise COC (Cyclo-Olephin-Copolymer) oder Kunststoffe wie
20 PMMA (Polymethylmethacrylat), Polycarbonat oder Polystyrol. Die Kanalstruktur des Testträgers ist von dem Substrat und einem Deckel oder einer Deckschicht umschlossen. Hergestellt wird eine derartige Kanalstruktur durch eine drei-dimensionale Strukturierung der Kunststoffteile, beispielsweise durch Spritzgießtechniken oder andere Verfahren. Es ist auch möglich, die Struktur
25 durch materialabtragende Verfahren, wie beispielsweise Fräsen oder Laser- ablation einzubringen.
Die Steuerung des Flüssigkeitstransports innerhalb der Kanalstrukturen und die Steuerung des Prozessablaufes kann mit internen (innerhalb des fluidi- 30 sehen Testelements) oder mit externen (außerhalb des fluidischen Testelements) Maßnahmen erfolgen. Die Steuerung kann durch Anwendung von Druckunterschieden oder durch Änderung von Kräften hervorgerufen werden, beispielsweise durch Änderung der Wirkrichtung der Schwerkraft. Eine gezielte Steuerung des Flüssigkeitsflusses kann innerhalb der Kanalstruktur durch die Rotation eines Testelements erzielt werden. Die erzeugten Kräfte können durch Steuerung der Änderung der Rotationsgeschwindigkeit oder der Drehrichtung oder durch den Abstand von der Drehachse vorgenommen oder durch Ausnutzung von Dichteunterschieden in der Flüssigkeit erzeugt werden (z. B. beim Auflösen eines Feststoffs). Beispielsweise können die mikrofluidischen Testelemente in einer rotierenden Scheibe in Form einer Compactdisc (CD) angeordnet sein. Eine Gegenüberstellung verschiedener Methoden ist beispielsweise aus Marc Madou, et al.; Lab on CD; Annual Review of Biomedical Engineering, 2006.8, Page 601 to 628 (onli- ne@http://bioenc. annualreviews.org) bekannt.
Analysesysteme mit rotierenden Biosensoren sind beispielsweise auch aus den folgenden Veröffentlichungen bekannt:
1. Peytavi, et al.; Microfluidic Device for Rapid (< 15 Min.) Automated Micro- array Hybridization, 2005, Clinical Chemistry; page 1.138 to 1.844; (online published at DOI: 10.1373/clin_chem.2005.052845)
2. Guangyao, Jia, et al.; Dynamic Automated DNA Hybridization on a CD (Compact Disc) Fluid Platform; Sensors and Actors B 1 14 (2006); page 173 to 181 ; (online at www.sciencedirect.com) 3. Grumann; Readout of Diagnostic Assays on a Centrifugal Microfluidic Platform; Oktober 2005; Dissertation an der Universität Freiburg
4. S. Lutz, et al.; Unidirectional Shake-Mode for Mixing Highly Wetting Fluids on Centrifugal Platforms; 12th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Live Science; October 12 to 16, 2008; San
Diego, California, USA 5. EP 1 894 617 A2
6. DE 10 2005 048 260 A1
5
7. Zahra Noroozi, et al; Reciprocating flow-based centrifugal microfluidics mixer; Review of Scientific Instruments 80, 075102 (2009).
Um das Vermischen von Flüssigkeiten bei rotierenden Scheiben zu verbes- i o sern, schlägt Grumann (3) in seiner Dissertation zwei Möglichkeiten vor: Im ersten Konzept werden paramagnetische Polymerkugeln (Beads) in die Mischkammer gegeben und bei Rotation der Disc über ortsfeste Permanentmagnete periodisch ausgelenkt. Die Relativbewegung der Beads gegenüber der Flüssigkeit beschleunigt das Mischen. Im zweiten Konzept wird die Disc 15 nicht mit einer konstanten Frequenz rotiert, sondern unter sich periodisch änderndem Drehsinn einem sogenannten Shake-Mode unterworfen, so dass auf Grund von Trägheitseffekten der Flüssigkeiten das Mischen verbessert und beschleunigt wird.
20 Bevor das Vermischen im Shake-Mode erfolgen kann, wird zunächst einmalig die Drehfrequenz erhöht, um in einer "loading phase" durch eine erhöhte Zentrifugalkraft das Öffnen eines mikrofluidischen Ventils zu bewirken und die Flüssigkeit in die entsprechenden mikrofluidischen Strukturen und Kammern zu transportieren. Nach dem Mischen im Shake-Mode kann sich eine Sedi-
25 mentationsphase anschließen, bei der das Testelement mit einer erhöhten Drehgeschwindigkeit konstant über eine längere Zeit rotiert wird, Fig. 6.16. In einer sich anschließenden sogenannten Read-Out-Phase wird das Testelement mit einer reduzierten Drehgeschwindigkeit, die geringer sein kann als die Spitzengeschwindigkeit im Shake-Mode, gedreht, um eine optische Auswer-
30 tung vorzunehmen. Die Auswertephase ist in der beschriebenen Abfolge deutlich länger als die vorherigen Prozessphasen, zu denen auch die Shake- Mode-Mixing-Phase gehört. Das Vermischen der Flüssigkeit in der Kammer erfolgt in einem gleichmäßigen "Shake-Mode", in dem die Rotationsfrequenz bis zu einer End- Winkelgeschwindigkeit der rotierenden Scheibe konstant beschleunigt wird und anschließend mit einer zweiten Beschleunigung (Verzögerung), die der ersten entgegengerichtet ist, zunächst bis zum Stillstand abgebremst wird. Anschließend wird die Scheibe in die Gegenrichtung beschleunigt, bis eine zweite End-Winkelgeschwindigkeit erreicht ist. Anschließend wird die Disc wieder gebremst und nach dem Stillstand erneut in Gegenrichtung beschleunigt. Die erste und die zweite Beschleunigung und die erste und zweite End- Winkelgeschwindigkeit sind jeweils betragsmäßig gleich, jedoch ist die Drehrichtung entgegengesetzt. Dieser "Shake-Mode" wird in Fachkreisen auch "Euler-Mischen" genannt, da bei der Beschleunigung der Scheibe neben der bei konstant rotierenden Scheiben auftretenden Zentrifugalkraft und Corio- liskraft eine weitere Kraftkomponente hinzukommt, die Eulerkraft. Die Euler- kraft ist proportional zur zeitlichen Änderung der Winkelgeschwindigkeit, während die Zentrifugalkraft proportional zum Quadrat der Winkelgeschwindigkeit und die Corioliskraft proportional zur Winkelgeschwindigkeit ist.
Lutz et al. (4) haben in Studien herausgefunden, dass das Euler-Mischen ver- bessert werden kann, wenn die Beschleunigung (Änderung der Drehwinkelgeschwindigkeit) nicht um den Nullpunkt (Frequenz = Null bzw. Winkelgeschwindigkeit = Null) stattfindet, sondern mit einem Offset. Nach Lutz wird die rotierende Disc ebenfalls konstant beschleunigt, bis eine erste End- Winkelgeschwindigkeit erreicht wird. Anschließend wird die Disc abgebremst, bis eine zweite End-Winkelgeschwindigkeit erreicht ist, danach folgt wiederum ein Beschleunigen. Die erste und zweite End-Winkelgeschwindigkeit unterscheiden sich betragsmäßig. Die Rotationsrichtung wird jedoch nicht geändert. Dieser als "unidirektionaler Shake-Mode" bezeichnete Mischvorgang hat sich zumindest in Systemen bewährt, bei denen sich an die Reaktionskammer oder Mischkammer eine Kanalstruktur anschließt, die eine Kombination aus Siphon- und Flüssigkeitsventil aufweist. Der unidirektionale Shake-Mode soll verhindern, dass Flüssigkeit bei geringen Drehgeschwindigkeiten bzw. beim Stillstand kapillar getrieben durch den Siphon hindurchtreten kann. Die EP 1 894 617 A2 (5) betrifft ein System mit mikrofluidischem Testelement mit einer Kanalstruktur und einer Flüssigkeitskammer, in der Flüssigkeiten durchmischt werden. Das Testelement wird in einem System rotiert, wobei die 5 Rotationsrichtung geändert wird. Zunächst erfolgt eine Beschleunigung des Testelements bis zu einer ersten End-Winkelgeschwindigkeit in eine erste Richtung, anschließend in die entgegengesetzte Richtung bis zu einer zweiten End-Winkelgeschwindigkeit. Daraufhin erfolgt wiederum eine Umkehr der Rotationsrichtung. Die erste und zweite End-Winkelgeschwindigkeit sowie die i o jeweiligen Beschleunigungen können gleich sein (Figur 6a) oder unterschiedlich sein (Figur 6b). Obwohl die einzelnen Halbzyklen unterschiedlich sein können, sind die aufeinanderfolgenden Zyklen (Vollzyklus) jeweils gleich.
In der DE 10 2005 048 260 A1 (6) wird ebenfalls ein Shake-Mode zum Mi- 15 sehen einer Flüssigkeit in einem rotierenden Testträger vorgeschlagen. Hierbei wird während des Schüttelmodus (Figur 8) der Testträger abwechselnd beschleunigt und abgebremst, wobei sich die Drehrichtung mehrfach zwischen den beiden End-Winkelgeschwindigkeiten ändert. Daneben kann die Drehgeschwindigkeit beim Erreichen der Maximalgeschwindigkeit für einen 20 gewissen Zeitraum konstant gehalten werden. Die maximale Drehfrequenz und die Beschleunigung bzw. das Abbremsen sind in jedem Zyklus gleich. Neben einem Schüttelmodus mit Drehrichtungsumkehr wird auch ein Schüttelmodus ohne Drehrichtungsumkehr vorgeschlagen, bei dem die Drehfrequenz zwischen dem Stillstand und einer Maximalrotationsfrequenz verändert 25 wird. Im Schüttelmodus gemäß Figur 9 wird zunächst zwei Zyklen lang geschüttelt, bevor eine Ruhephase erfolgt, an die sich wieder zwei Schüttelzyklen anschließen. Das Vermischen der Flüssigkeit innerhalb des Schüttelmodus erfolgt mit gleichen Rotationszyklen.
30 Vor der Durchführung des Vermischens im Shake-Mode erfolgt das Zuführen der Probe und ein erstes Beschleunigen und Abbremsen, um die Flüssigkeit in den Kanalstrukturen zu verteilen. An den Schüttelmodus schließt sich eine Ruhephase an, in der ein Waschpuffer zugeführt wird, der dann durch ein Be- schleunigen und Abbremsen in der Kanalstruktur gesteuert bewegt wird. Hieran können sich weitere Verfahrensschritte mit unterschiedlichen Drehgeschwindigkeiten anschließen.
5 Noroozi (7) schlägt zwar auch ein Shake-Mode-ähnliches Rotationsprofil vor; dieses dient jedoch zur Steuerung des Flüssigkeitstransports in der Kanalstruktur und gerade nicht dem Vermischen einer Flüssigkeit. Um eine optische Analyse durchzuführen, wird der Testträger zunächst mit einer konstanten Geschwindigkeit rotiert, um den verwendeten Laser zu justieren. Anschlie- i o ßend erfolgt eine Erhöhung der Drehfrequenz bis zu einem Wert, bei der die Zentrifugalkraft die Kapillarkraft übersteigt, um einen Transport der Flüssigkeit in den mikrofluidischen Kanal zu ermöglichen. Im Anschluss daran erfolgt die weitere Steuerung der Flüssigkeitsbewegung in der Kanalstruktur, wobei die Rotationsgeschwindigkeit konstant verändert wird, so dass der Testträger zwi-
15 sehen der Ruheposition und einer Maximaldrehfrequenz ohne eine Umkehr der Drehrichtung bewegt wird. Die einzelnen Zyklen des Rotationsprofils sind jeweils gleich.
Trotz intensiver Untersuchungen in unterschiedlichen Richtungen und trotz 20 der erzielten Fortschritte besteht im Stand der Technik weiterhin ein großer Bedarf daran, das Durchmischen von Flüssigkeiten und eine (homogene) Verteilung von Komponenten in einer Flüssigkeit innerhalb von Prozesskammern eines rotierenden Testelements zu verbessern. Dabei soll vorwiegend die Homogenität innerhalb des Flüssigkeitsraums verbessert werden und, wenn 25 möglich, gleichzeitig die Prozessdauer reduziert werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, ein verbessertes Verfahren und eine verbesserte Vorrichtung zum Durchmischen von Flüssigkeiten vorzuschlagen.
30
Gelöst wird die vorliegende Aufgabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 sowie durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 14 und durch ein Testelement mit den Merkmalen des Anspruchs 15. Das erfindungsgemäße Verfahren zum Durchmischen einer Flüssigkeit mittels eines mikrofluidischen Testelements, das ein Substrat und eine mikrofluidi- sche Kanalstruktur mit einer Mischkammer aufweist, setzt voraus, dass das mikrofluidische Testelement mit einer Winkelgeschwindigkeit ω um eine Rotationsachse rotiert, die sich bevorzugt durch das Testelement erstrecken kann. Beispielsweise kann die Rotationsachse eine zentrale Rotationsachse durch den Mittelpunkt des Testelements oder durch den Schwerpunkt sein. Bevorzugt ist das Testelement als Testträger ausgebildet oder in einen Testträger integriert. Der Testträger rotiert um eine Rotationsachse, die sich bevorzugt durch den Testträger erstreckt und bevorzugt zentral angeordnet ist.
Das mikrofluidische Testelement rotiert gemäß eines Rotationsprofils, das wenigstens drei Zyklen umfasst und bei dem sich die Winkelgeschwindigkeit innerhalb eines Zyklus ändert. Das Rotationsprofil ist dabei als eine zeitliche Abfolge von mehreren End-Winkelgeschwindigkeiten zu verstehen, die in Zyklen unterteilt sind. Ein Zyklus umfasst, ausgehend von einer End- Winkelgeschwindigkeit, das Beschleunigen der Rotation des Testelements mit zumindest einer ersten Beschleunigung a1 bis zum Erreichen einer ersten End-Winkelgeschwindigkeit ω1 und nach Erreichen der ersten End- Winkelgeschwindigkeit ω1 das Beschleunigen der Rotation des Testelements mit zumindest einer zweiten Beschleunigung a2 bis zum Erreichen einer zweiten End-Winkelgeschwindigkeit ω2. Die beiden Beschleunigungen a1 und a2 sind entgegengerichtet. Dies gilt sowohl innerhalb eines Zyklus wie auch von einem Zyklus zum nächsten, so dass beispielsweise die Beschleunigung a2 des ersten Zyklus Z-ι der Beschleunigung a1 des zweiten Zyklus Z2 entgegengerichtet ist.
Im Sinne der vorliegenden Anmeldung beginnt ein Zyklus beispielsweise bei einem Kurvenminimum, an das sich ein Abschnitt zunehmender Winkelgeschwindigkeit mit einer positiven Beschleunigung bis zum Erreichen eines Kurvenmaximums anschließt. Nach dem Erreichen des Kurvenmaximums nimmt die Winkelgeschwindigkeit mit einer negativen Beschleunigung ab, bis wieder ein Kurvenminimum erreicht wird. Der Zyklus umfasst demnach zwei Halbzyklen, die sich jeweils von einem Kurvenminimum zum anschließenden Kurvenmaximum bzw. von einem Kurvenmaximum bis zum anschließenden Kurvenminimum erstrecken. Zwei aufeinanderfolgende Halbzyklen bilden ei- nen Vollzyklus.
Ein Zyklus ist also derart definiert, dass er die zeitliche Abfolge der Winkelgeschwindigkeit definiert, wobei die eine, beispielsweise die erste, End- Winkelgeschwindigkeit zweimal in einem Zyklus enthalten ist. Findet die Ände- rung der Winkelgeschwindigkeit um den Nullpunkt (Stillstand; f = 0) herum statt, so kann ein Zyklus auch durch die Nulldurchgänge veranschaulicht werden. Der Zyklus entspricht folglich einer Periode, also dem kleinsten zeitlichen Intervall, nachdem sich ein Vorgang wiederholt. Dabei müssen die End- Winkelgeschwindigkeiten und/oder die Beschleunigungen nicht gleich oder konstant sein.
Das Rotationsprofil weist eine Mehrzahl von Zyklen auf, wobei sich das Rotationsprofil ebenfalls periodisch wiederholen kann, so dass sich die Reihenfolge der Zyklen nach einer vorgegebenen Zykluszahl (größer 2) wiederholt. Dies ist jedoch nicht zwingend erforderlich.
Erfindungsgemäß werden zum Erzeugen einer (vorzugsweise homogen) durchmischten Flüssigkeit wenigstens eine der Beschleunigungen a1 , a2 und/oder wenigstens eine der End-Winkelgeschwindigkeiten ω1 , ω2 von ei- nem Zyklus zum nächsten geändert. Es wurde erkannt, dass sich durch die Aneinanderreihung unterschiedlicher Zyklen die Homogenität der durchmischten Flüssigkeit deutlich verbessern lässt. Auch hat die Anwendung unterschiedlicher Zyklen positive Auswirkungen auf die Mischzeit, die verringert wird.
Neben den oben gestellten Aufgaben löst das erfindungsgemäße Verfahren auch das Problem, dass ein "Verarmen" der Flüssigkeit am Analyt erfolgt, wenn der Analyt in der Flüssigkeit beispielsweise an der Festphase des Mik- roarrays abbindet und daher der festphasennahe Teil der Flüssigkeit wenig bzw. weniger Analytmoleküle aufweist. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird sichergestellt, dass (kontinuierlich) Analyt aus den festphasenfernen Flüssigkeitsbereichen der Kammer zu den verarmten Flüssigkeitsbereichen nachgeliefert wird. Somit wird also der Massentransport innerhalb der Flüssigkeit durch das Verfahren ebenso optimiert wie das Vermischen.
Es wurde erkannt, dass sich bei Rotationsprofilen, die in allen Zyklen jeweils dieselben Beschleunigungen und dieselben End-Winkelgeschwindigkeiten aufweisen, in der Kanalstruktur, insbesondere in einer Flüssigkeitskammer bzw. Mischkammer, wiederholende Muster ausbilden. Diese wiederkehrenden Strömungsmuster wiederholen sich mit jedem Zyklus (Schwingung) und sind charakteristisch für die gewählte Beschleunigung und End-Frequenz des Schütteins (Shake-Mode) bzw. der End-Winkelgeschwindigkeit. Insbesondere bei einem periodischen Shake-Mode mit konstanter Beschleunigung und konstanter Endfrequenz mit Drehrichtungswechsel sind diese Muster sehr ausgeprägt.
Bei biochemischen Assays mit einer Mehrzahl von Detektionsspots (Array- Spots) führt das konstante Schütteln dazu, dass sich das Strömungsmuster auf der Array-Oberfläche "einbrennt". In diesem Fall können die Array-Spots (Detektionsorte) nicht an beliebigen Orten in die Kammer eingebracht werden, sondern müssten in Abhängigkeit des Strömungsmusters und somit in Abhängigkeit des Rotationsprofils ausgewählt werden. Das Ankoppeln einer in der Flüssigkeit gleichverteilten Analytmenge an unterschiedlichen Orten auf der Kammeroberfläche ist somit unterschiedlich effizient. Um systemische Schwankungen zu eliminieren, werden zur Steigerung der Präzision bei Biosensoren im Array-Format jeweils mehrere Array-Spots durch Mittelwertbildung aus den tatsächlichen Spot- Ist-Werten ausgewertet. Die Ausbildung von Strömungsmustern verzerrt jedoch das Messergebnis, so dass diese Methode hier deutliche Nachteile aufweist. Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass es vorteilhaft ist, wenn zum Durchmischen der Flüssigkeit das Rotationsprofil des Shake-Modes wenigstens drei aufeinanderfolgende Zyklen umfasst. Dabei kann vor dem Durchmischen der Flüssigkeit eine Rotation des Testelementes zur Steuerung des Flüssigkeitstransports innerhalb der Kapillarstruktur des Testelementes erfolgen. Diese Rotation kann beschleunigt und abgebremst sein und beispielsweise ebenfalls ein Rotationsprofil aufweisen, bei dem zunächst eine Beschleunigung bis zu einer ersten End-Winkelgeschwindigkeit und anschließend ein Abbremsen bis zu einer geringeren End-Winkelgeschwindigkeit auf- treten kann. Diese dem Durchmischen vorgelagerten Verfahrensschritte und Rotationsprofile sind jedoch nicht Teil des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Durchmischen einer Flüssigkeit. Erst wenn die zu durchmischende Flüssigkeit in der entsprechenden Mischkammer enthalten ist, erfolgt das Durchmischen der Flüssigkeit. Auch ein an das Durchmischen anschließendes Ro- tationsprofil zur Auswertung der Flüssigkeit, zur Hinzufügung von weiterer Flüssigkeit, wie beispielsweise eines Waschpuffers, zur Durchführung eines Sedimentationsverfahrensschritts oder ähnlicher Verfahrensschritte bleibt bei dem Rotationsprofil zum Durchmischen der Flüssigkeit außer Betracht. Diese Rotationsprofile zur Prozesssteuerung sind deutlich zu unterscheiden von dem Rotationsprofil zum Durchmischen der Flüssigkeit.
Das erfindungsgemäße Rotationsprofil zum Durchmischen mit wenigstens drei aufeinanderfolgenden Zyklen ist so ausgelegt, dass sich jeweils ein Zyklus von dem jeweils vorhergehenden Zyklus in mindestens einer der End- Winkelgeschwindigkeiten und/oder der Beschleunigungen unterscheidet. Es hat sich als besonderes vorteilhaft erwiesen, wenn der Shake-Mode mindestens zehn aufeinanderfolgende Zyklen umfasst, wobei auch mindestens 15 oder 20 oder 25 Zyklen ausgeführt werden können. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung hat der Shake-Mode mindestens 10 aufeinanderfolgen- de Zyklen, die innerhalb von 20 Sekunden durchlaufen werden, bevorzugt innerhalb von höchstens 30 Sekunden, höchstens 40 Sekunden, höchstens 50 Sekunden oder höchstens 60 Sekunden. Eine ebenfalls bevorzugte Ausgestaltung des Verfahrens sieht vor, dass die durchschnittliche Dauer eines Zyklus weniger als 2 Sekunden umfasst, bevorzugt weniger als eine Sekunde. Möglich ist auch, dass die durchschnittliche Zyklusdauer wenigstens weniger als 5 Sekunden oder weniger 10 Sekunden ist. Ausgehend von der Erkenntnis, dass bei mikrofluidischen Verhältnissen im Gegensatz zur Makrofluidik stets laminare Strömungsverhältnisse vorliegen, wurde erkannt, dass eine Teilbefüllung der Kammer einen negativen Einfluss auf die Strömungsverhältnisse einer (runden) Kammer hat und somit auch einen negativen Einfluss auf die Mischeffizienz. Bei den kleinen Dimensionen der Mischkammern und Kanalstrukturen des mikrofluidischen Testelements und den typischen erreichbaren Strömungsgeschwindigkeiten von mehreren mm/sec kann von laminaren Bedingungen ausgegangen werden. So wurde im Rahmen der Erfindung erkannt, dass die besten Mischeffekte bei einer runden Kammerform erreicht werden, bei der auch die Wände der Kammer im Wesentlichen glatt sind. In den Raum hineinragende Rührelemente oder ähnliche Elemente wirken sich nicht messbar bis negativ aus. Im Rahmen der Versuche wurde weiter erkannt, dass die runde Kammer bevorzugt kreisrund und nicht elliptisch ist. Da bei den rotierenden Testelementen die Form einer flachen Scheibe gewählt wird und eine optische Auswertung über die Oberfläche der Scheibe erfolgt, wurde erkannt, dass eine Kammer in Form einer Zylinderscheibe optimal ist. Besonders bevorzugt weist diese einen kreisrunden Grundriss auf. Dabei hat sich ein Verhältnis von Kammerdurchmesser zu Höhe der Kammer von 1 zu 1 als ideal erwiesen. Dieses "Aspektverhältnis" soll also bevorzugt nahe 1 liegen und unter Berücksichtigung der typischen sys- temischen Randbedingungen maximal 4 betragen. Der Quotient von Oberfläche A zu Volumen V sollte aufgrund der Untersuchungen bei konstantem Volumen einen Wert zwischen 1 und 3,5 haben. Dabei ist die Flüssigkeitskammer derart anzuordnen, dass sich die (bevorzugt durch das Testelement erstreckende) Rotationsachse, um die sich das Testelement dreht, nicht durch die Flüssigkeitskammer erstreckt. Vielmehr ist die Flüssigkeitskammer bevorzugt von der Rotationsachse beabstandet. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Beträge der Beschleunigungen a1 und a2 in einem Zyklus verschieden. Die Ausbildung konstanter Strömungsmuster in der Flüssigkeitskammer wird schon innerhalb eines Zyklus verhindert.
Bevorzugt ist wenigstens eine der Beschleunigungen a1 , a2 während eines Zyklus veränderlich. Die eine oder beide Beschleunigungen a1 , a2 ändern sich also innerhalb des Zyklus. Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass alternativ wenigstens eine der Beschleunigungen a1 , a2 während eines Zyklus konstant sein kann, bevorzugt beide Beschleunigungen. Die Änderung der Winkelgeschwindigkeit innerhalb des Zyklus ändert sich also kontinuierlich (konstant). Da ein Zyklus im Verhältnis zum Rotationsprofil und somit zur gesamten Mischdauer relativ kurz ist, bilden sich innerhalb der Periodendauer (Zyklusdauer) keine stehenden, gleichbleibenden Strömungsmuster aus. Es hat sich jedoch gezeigt, dass mit einer konstanten Beschleunigung innerhalb eines Zyklus die Mischergebnisse von (annähernd) gleicher Qualität sind wie bei sich ändernden Beschleunigungen während des Zyklus. Allerdings ist die Steuerung der Rotation mit einer konstanten Beschleunigung deutlich einfacher zu realisieren.
Es hat sich auch gezeigt, dass die Mischeffizienz mit höheren Amplituden (größere End-Winkelgeschwindigkeiten ω1 , ω2) effektiver ist als die Mischeffizienz mit geringen Amplituden (ω1 , ω2). Bei gleicher Beschleunigung ist folglich die Mischeffizienz mit einer längeren Periodendauer und weniger Zyklen (Assay-Intervall) effektiver als mit einer demzufolge kurzen Periodendauer und vielen Zyklen pro Untersuchung, also bei gleicher Gesamt-Mischdauer.
Gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Drehrichtung des Testelements beim Erreichen der ersten End-Winkelgeschwindigkeit ω1 gleich oder entgegengerichtet zu der Drehrichtung des Testelements beim Erreichen der zweiten End-Winkelgeschwindigkeit ω2. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Drehrichtung entgegengesetzt. Folglich findet eine Umkehr der Drehrichtung statt, während zwischen der ersten und zweiten End-Winkelgeschwindigkeit eine Beschleunigung auf das rotierende Testelement ausgeübt wird. Die "Schwingung" findet also um den Nullpunkt der Frequenz statt. Nach Erreichen der ersten End- Winkelgeschwindigkeit ω1 wird durch Einwirken lassen einer zweiten Beschleunigung a2 folglich das rotierende Testelement so weit abgebremst, bis es zum Stillstand kommt und dann mit der gleichen zweiten Beschleunigung a2 weiter beschleunigt, bis die zweite End-Winkelgeschwindigkeit ω2 erreicht ist. Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass eine bessere Durchmischung erfolgt, wenn sich die Drehrichtung des Testelements ändert. Zum Zeitpunkt des Nulldurchgangs (Frequenz f = 0, Drehwinkelgeschwindigkeit ω = 0) wirken auf die Flüssigkeit in dem Testelement keine Zentrifugalkraft und keine Corioliskraft. Zu der weiterhin wirkenden Eulerkraft tritt die Kapillarkraft als vorherrschende Komponente hinzu, die durch die Anordnung und Geometrie der Kapillarstrukturen gegeben ist. Durch das kurzzeitige (dominante) Wirken der Kapillarkraft wird das Mischergebnis insgesamt verbessert. Wichtig ist jedoch, dass die Geometrie, insbesondere ein sich an die Mischkammer anschließender Siphon, entsprechend ausgebildet ist, so dass ein Durchbrechen des Siphons verhindert wird.
Im Rahmen der Erfindung wird unter dem Begriff "Durchmischen" nicht nur das Auflösen eines Feststoffes in einer Flüssigkeit und das Mischen mehrerer Flüssigkeiten verstanden, sondern auch der gleichmäßige Transport von in der Flüssigkeit gelösten Bestandteilen, um beispielsweise ein Verarmen der Lösung mit Reagenz bzw. Analyt an einer Bindephase (Festphase) zu vermeiden. Nach der Reaktion einzelner Analytmoleküle mit Fängermolekülen der Bindephase erfolgt ein Verarmen des Analyten in der Flüssigkeit in dem Bereich der Bindephase. Durch das Mischen wird der Transport von Analyt- molekülen innerhalb der Flüssigkeit derart sichergestellt, dass eine kontinuierliche Nachlieferung der Analytmoleküle aus entfernten Bereichen zu den Flüssigkeitszonen nahe der Bindephase erfolgt, um möglichst alle im Rahmen der relevanten Gleichgewichts-Reaktion möglichen Analytmoleküle an die Binde- phase (bzw. an deren Fängermoleküle) zu binden, was die Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens erhöht. Das erreichte Ziel ist somit ein Anreichern möglichst aller Analytmoleküle aus der Flüssigphase an der Bindephase. Der Begriff "Durchmischen" schließt also auch diesen Ausgleich der Analytmolekü- le innerhalb der Flüssigkeit ein.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von in den Figuren dargestellten besonderen Ausführungsformen näher erläutert. Die dort dargestellten Besonderheiten können einzeln oder in Kombination verwendet werden, um bevor- zugte Ausgestaltungen der Erfindung zu schaffen. Die beschriebenen Ausführungen stellen keine Einschränkung der durch die Ansprüche in ihrer Allgemeinheit definierten Erfindung dar. Es zeigen:
Fig. 1 eine Vorrichtung zum homogenen Durchmischen einer Flüssigkeit;
Fig. 2 einen Testträger mit einem erfindungsgemäßen Testelement;
Fig. 3 ein Diagramm mit der zeitlichen Abfolge der Winkelgeschwindigkeit im "Standard-Shake-Mode";
Fig. 4 ein Diagramm mit der zeitlichen Abfolge der Winkelgeschwindigkeit bei geänderten End-Winkelgeschwindigkeiten;
Fig. 5a-c je ein Diagramm mit der zeitlichen Abfolge der Winkelgeschwin- digkeit bei unterschiedlichen Beschleunigungen;
Fig. 6 ein weiteres Diagramm der zeitlichen Abfolge der Winkelgeschwindigkeit im "Zufalls-Shake-Mode"; Fig. 7 eine Tabelle zur Gegenüberstellung verschiedener Shake-Modi;
Fig. 8 ein Diagramm zum Vergleich zweier Shake-Modi; Fig. 9 ein Diagramm mit dem zeitlichen Verlauf zweier "Zufalls-Shake- Modes".
Figur 1 zeigt eine Vorrichtung 1 zum homogenen Durchmischen einer Flüssig- 5 keit mit einem Testelement 2, das in der Vorrichtung 1 gehalten wird. Die Vorrichtung 1 umfasst eine Halterung 3 zur Aufnahme des Testelements 2, die um eine Rotationsachse 4 drehbar ist. Die zwei Testelemente 2 sind in einem Testträger 16 integriert. Die drehbare Halterung 3 mit ihrer Welle 3a wird von einem Antrieb 5 derart bewegt, dass die Halterung 3 mitsamt des gehaltenen i o Testträgers 16 mit einer einstellbaren veränderlichen Winkelgeschwindigkeit um die Rotationsachse 4 dreht. Der Antrieb 5 wird von einer Steuerungseinheit 6 gesteuert, wobei ein Bewegungsablauf festgelegt werden kann, der bevorzugt als Rotationsprofil in der Steuerungseinheit 6 hinterlegt ist. Das Rotationsprofil kann beispielsweise aus mehreren Steuerungsbefehlen bestehen,
15 mit der die Rotationsgeschwindigkeit (Winkelgeschwindigkeit), die Beschleunigung, die Haltezeit, während der die End-Winkelgeschwindigkeit konstant gehalten wird, und die Drehrichtung festgelegt sind. Das Rotationsprofil kann entweder in einem Speicher der Vorrichtung 1 hinterlegt sein oder durch manuelle Einstellung der obigen Parameter an der Vorrichtung eingestellt oder
20 aus den Parametern erzeugt werden.
In der gezeigten Ausführungsform umfasst die Vorrichtung 1 eine optische Mess- und Auswerteeinheit 7 mit einem optischen Sensor 8. Eine in dem Testelement 2 aufgenommene Flüssigkeit kann analysiert und gemessen werden. 25 Dabei können die im Stand der Technik bekannten Ermittlungsverfahren angewendet werden.
Das mikrofluidische Testelement 2 umfasst eine mikrofluidische Kanalstruktur 10, die einen Kanalabschnitt 1 1 aufweist, der sich von einer Öffnung 12 zu 30 einer mikrofluidischen Flüssigkeitskammer 13 erstreckt. Die Flüssigkeitskammer 13 ist über einen Siphonkanal 14 mit einer Sammelkammer 15 fluidisch verbunden, die auch als Waste-Chamber bezeichnet wird. Die Testelemente 2 sind in dem Testträger 16 eingebettet, der als runde Scheibe (Disc) ausgebil- det ist und durch den sich die Rotationsachse 4 erstreckt. Die Kanalstruktur 10 wird von einem Substrat und einer nicht gezeigten Deckschicht umschlossen, die den Testträger 16 von oben abdeckt.
5 Die Halterung 3 in der Vorrichtung 1 ist als Welle 3a ausgebildet, die konzentrisch zur Rotationsachse 4 verläuft. Selbstverständlich ist es auch möglich, andere Halterungen 3 vorzusehen, beispielsweise eine Halte-Scheibe, ein Rotor oder eine Spannvorrichtung mit äußeren Klammern, in die das Testelement eingespannt wird. Neben der zentralen Welle 3a ist es möglich, den i o Testträger mit einem oder mehreren Testelementen um eine außerzentrische (exzentrische) Rotationsachse rotieren zu lassen. Die Rotationsachse kann sich dabei beispielsweise durch den Schwerpunkt des Testträgers 16 erstrecken, um räumlichen Strukturen in dem Testträger 16 bzw. den Testelementen 2 zu berücksichtigen und eine Umwucht beim Rotieren zu vermeiden. Die
15 Rotationsachse muss nicht zwingend vertikal ausgerichtet sein. Sie kann auch schräg im Raum verlaufen unter einem Raumwinkel θ Φ 0 gegenüber der Vertikalen.
Der Testträger 16 in Figur 2 zum homogenen Durchmischen einer Flüssigkeit 20 umfasst ein Testelement 2 mit einer Kanalstruktur 10. Die Kanalstruktur 10 hat zwei Öffnungen 12a, 12b, an die sich zwei nebeneinander verlaufende Kanalabschnitte 1 1 a, 1 1 b bis zu zwei Zwischenkammern 17a, 17b erstrecken. So können beispielsweise zwei Flüssigkeiten gleichzeitig zugeführt werden. Die Zwischenkammern 17a, 17b stehen über einen weiteren Kanal 18a bzw. 18b 25 mit je einer Öffnung 19a, 19b in Fluidverbindung. Über die Öffnungen 19a, b kann der die Flüssigkeit aufnehmende Kanalabschnitt bei Mehrfachnutzung zuverlässig entlüftet werden. Ein sich an die Zwischenkammern 17a, 17b anschließender Kanalabschnitt 20a, 20b führt zu einem fluidischen Ventil 21 , durch das Flüssigkeiten aus den Zwischenkammern 17a, 17b gesteuert in die 30 Flüssigkeitskammer 13 geleitet werden können. Das fluidische Ventil 21 hat einen Luftauslass 22 zum Entlüften, der über einen Luftkanal 23 für die Entlüftung des fluidischen Ventils 21 und daran angeschlossener Fluidikbereiche (z. B. Kammer 13) sorgt. Sobald Flüssigkeit aus den Zwischenkammern 17a, 17b in die Flüssigkeitskammer 13 gelangt ist, kann ein Durchmischen stattfinden. An die Flüssigkeitskammer 13 schließt sich ein Siphonkanal 14 an, der die Flüssigkeits- 5 kammer 13 mit einer Sammelkammer 15 verbindet.
Werden zwei unterschiedliche Flüssigkeiten getrennt in den Zwischenkammern 17a, 17b gelagert und in die Flüssigkeitskammer 13 gegeben, so findet eine Durchmischung beider Flüssigkeiten auf Grund von Diffusion statt. Dieser i o Prozess dauert jedoch sehr lange, häufig mehrere Stunden. Um dies zu beschleunigen, wird im Stand der Technik ein Standard-Shake-Mode (Standard- Eulermischen) verwendet, bei dem die Rotationsgeschwindigkeit des Testträgers 16 bzw. des Testelements 2 verändert wird, Figur 3. Die Änderung der Frequenz beschreibt eine "Schwingung" mit Nulldurchgang (f = 0) zwischen
15 einer ersten Endfrequenz von f1 = +40 Hz und einer zweiten Endfrequenz f2 = -40 Hz. Die ausgeübten Beschleunigungen a1 , a2 sind betragsmäßig gleich. Die Periodendauer ist somit konstant. Als Zyklusdauer (Periodendauer) wird die Zeit zwischen dem ersten Erreichen der ersten Endfrequenz f1 und dem nächsten Erreichen der ersten Endfrequenz f1 verstanden.
20
Im Rahmen der Erfindung wurde mit diesem "Standard-Eulermischen" erkannt, dass die Formgebung der Flüssigkeitskammer 13 einen Einfluss auf die Mischgeschwindigkeit hat. So wurde am Beispiel einer Flüssigkeitskammer 13 mit einem konstanten Volumen von 10 Mikrolitern (10 μΙ), die in dem schei-
25 benförmigen Testträger 16 mit einer Höhe von 2,7 bis 3 mm angeordnet ist, erkannt, dass eine runde Flüssigkeitskammer 13 vorteilhaft ist. Bevorzugt ist die Flüssigkeitskammer 13 als runde Zylinderscheibe mit einer Höhe kleiner der Höhe des Testträgers 16. ausgebildet. Besonders bevorzugt ist ein kreisrunder Grundriss der Zylinderscheibe. Der Quotient aus dem Durchmesser der
30 kreisrunden Zylinderscheibe und der Höhe des Zylinders sollte möglichst nahe eins liegen. Bei einem Quotienten von 1 ,25, einem Kammerdurchmesser r1 von 2,5 mm und einer Höhe h1 von 2 mm wird bereits nach 5 Sekunden eine homogene Durchmischung zweier Plasma enthaltenden Flüssigkeiten erzielt, während bei einem Durchmesser r2 von 4 mm und einer Höhe h2 von 0,8 mm eine homogene Durchmischung erst nach 10 Sekunden erfolgt. Es wurde erkannt, dass das Verhältnis von Oberfläche A zu Volumen V entscheidend ist. Bevorzugt ist der Quotient nahe 1 . Die erste Kammer hat einen Quotienten Qi = Ai / Vi = 2,6 während die zweite Kammer einen Quotienten Q2 = A2 / V2 = 3,5 aufweist. Die Kammer mit dem kleineren Quotienten erzielt schneller eine homogene Durchmischung.
Durch Verwendung eines erfindungsgemäßen Rotationsprofils mit unterschiedlichen Zyklen kann die Mischeffizienz weiter gesteigert werden. So wur- de erkannt, dass erfindungsgemäß von einem Zyklus Z-ι zum nächsten Zyklus Z2 wenigstens eine der Beschleunigungen a1 , a2 und/oder wenigstens eine der End-Winkelgeschwindigkeiten ω1 , ω2 verändert werden muss. Die Inkubationsdauer unter Mischen über der Festphase des Microarrays lässt sich damit auf wenige Minuten reduzieren, während die Güte der Nachlieferung von Ana- lyten an die Nachweis-Oberfläche und die Homogenität der Abbindung auf der Festphase deutlich verbessert werden.
Figur 4 zeigt ein Rotationsprofil zum Vermischen einer Flüssigkeit, bei dem nur die End-Winkelgeschwindigkeiten ω1 , ω2 von Zyklus zu Zyklus verändert wurden. Die Beschleunigungen a1 , a2 sind in allen Zyklen gleich. In dieser bevorzugten Ausführungsform sind die erste und zweite Beschleunigung a1 , a2 betragsmäßig gleich. Weitere Rotationsprofile bzw. Rotationsabläufe zur Steuerung des Flüssigkeitstransports, beispielsweise zum Füllen einer Mischkammer oder zur Auswertung und Analyse einer durchmischten Flüssigkeit, sind hier nicht gezeigt und können sich vor dem Rotationsprofil zum Durchmischen der Flüssigkeit bzw. nach diesem Rotationsprofil anschließen. Diese bleiben jedoch bei der Definition des Rotationsprofils zum Durchmischen der Flüssigkeit außer Betracht. Die Figuren 5a bis c zeigen jeweils einen Ausschnitt eines Rotationsprofils für die Winkelgeschwindigkeit. Auch dieses Rotationsprofil wird zum Durchmischen der Flüssigkeit und nicht zur Steuerung des Flüssigkeitstransports in den Kanalstrukturen eingesetzt. Bei allen hier gezeigten Profilen ändern sich sowohl die Beschleunigungen a1 , a2 als auch die End- Winkelgeschwindigkeiten ω1 , ω2 in den jeweiligen Zyklen. Gezeigt werden dabei jeweils exemplarisch zwei Zyklen Z^, Z2.
In Figur 5a ist die erste Beschleunigung a1 1 im ersten Zyklus Z-ι verschieden 5 von der ersten Beschleunigung a12 im zweiten Zyklus Z2. Gleichzeitig ist die erste End-Winkelgeschwindigkeit ω1 1 des ersten Zyklus verschieden von der ersten End-Winkelgeschwindigkeit ω12 des zweiten Zyklus. Gleiches gilt für die zweite Beschleunigung a21 , a22 und die zweite End- Winkelgeschwindigkeit ω21 und ω22. Innerhalb eines Zyklus ist die jeweilige i o Beschleunigung a1 , a2 konstant und ändert sich nicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist wenigstens eine der Beschleunigungen a1 , a2 während eines Zyklus Z veränderlich. Beispielsweise kann die jeweilige Beschleunigung a1 , a2 aus zwei Teilbeschleunigungen a1 a, a1 b bzw. 15 a2a , a2b bestehen. Beispielsweise können die jeweiligen Beschleunigungen aa, ab jeweils konstant sein. Bevorzugt sind sie voneinander verschieden. Die Beschleunigungen aa , ab können jedoch auch veränderlich sein, so dass im Diagramm keine Gerade, sondern eine Kurve dargestellt wäre.
20 Bevorzugt besteht ein Zyklus aus einem ersten Teilzyklus ZTi bis zum Erreichen der ersten End-Winkelgeschwindigkeit ω1 und aus einem sich daran anschließenden zweiten Teilzyklus Z 2 bis zum Erreichen der zweiten End- Winkelgeschwindigkeit ω2. Die Rotation des Testelements erfolgt in wenigstens einem der beiden Teilzyklen ZTi, ZT2 mit wenigstens zwei Beschleuni-
25 gungen aa, ab.
Figur 5b ist zu entnehmen, dass der erste Zyklus Z-ι aus den beiden Teilzyklen ZTii und ZT2i besteht. Im ersten Teilzyklus ZTn erfolgt die Rotation des Testelements zunächst mit der Beschleunigung a1 1a und anschließend mit einer 30 zweiten Beschleunigung a1 1 b, die in dieser Ausführungsform von der ersten Teilbeschleunigung a1 1 a verschieden ist. Der zweite Teilzyklus ZT2i des ersten Zyklus weist ebenfalls zwei Beschleunigungen a21 a und a21 b auf. In einer bevorzugten Ausführungsform ist wenigstens eine der beiden Teilbeschleunigungen aa, ab in wenigstens einem der Teilzyklen ZT-i , ZT2 gleich Null. Für die vorgegebene Zeitdauer TP (Plateauzeit, Haltezeit), während der die Beschleunigung aa, ab gleich Null ist, findet folglich keine Änderung der Win- kelgeschwindigkeit statt, so dass für die Zeitdauer TP das Testelement mit einer konstanten Geschwindigkeit rotiert. Bevorzugt ist jedoch wenigstens eine der Teilbeschleunigungen aa, ab ungleich Null. Ein derartiges Rotationsprofil hat sich insbesondere bei biochemischen Tests und Tests in der Immunologie als vorteilhaft erwiesen, wenn während der Phasen mit einer konstan- ten Rotation (Beschleunigung gleich Null) ein Abbinden stattfindet.
Selbstverständlich kann die Beschleunigung in einem Teilzyklus a1 , a2 auch aus mehr als zwei Teilbeschleunigungen aa, ab, ac ... bestehen. Denkbar ist, dass noch vor Erreichen der End-Winkelgeschwindigkeit die Rotation des Testelements mit einer konstanten Winkelgeschwindigkeit (ungleich der End- Winkelgeschwindigkeit) erfolgt, also mit einer Beschleunigung gleich Null, und anschließend erneut die Rotation beschleunigt wird, bis die End- Winkelgeschwindigkeit erreicht wird. Bevorzugt ist wenigstens eine der Teilbeschleunigungen beim Erreichen einer der End-Winkelgeschwindigkeiten gleich Null. Das Testelement wird dann mit der End-Winkelgeschwindigkeit des Zyklus für eine vorgegebene Zeitdauer TP konstant rotiert, also nicht beschleunigt. Figur 5c zeigt ein derartiges Rotationsprofil, bei dem die Beschleunigungen a1 1b und a21 b im ersten Zyklus gleich Null sind. Die Rotation des Testelements mit einer konstanten Geschwindigkeit findet hier beim Erreichen der End-Winkelgeschwindigkeiten ω1 1 , ω21 im ersten Zyklus Z-ι statt. Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass die Rotation für ein vorgegebenes Zeitintervall TP mit der End- Winkelgeschwindigkeit positive Auswirkungen auf das Abbinden der Moleküle auf der aktiven Oberfläche hat. Die Zeitdauern TP1 und TP2 innerhalb eines Zyklus können gleich oder unterschiedlich voneinander sein. Sie können von Zyklus zu Zyklus variieren oder sich wiederholen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Beschleunigungen des Rotationsprofils mit einer Zufallszahl kodiert; sie werden aus der Zufallszahl gebildet. Bevorzugt werden zusätzlich oder optional die End-Winkelgeschwindigkeiten ω1 , ω2 aus einer Zufallszahl gebildet. Beispielsweise können für jede anzuwendende Beschleunigung und End- Winkelgeschwindigkeit eine Zufallszahl verwendet werden, die innerhalb der 5 systemisch vorgegebenen Grenzen der Vorrichtung liegen. In den ausgeführten Beispielen ist der Betrag der End-Winkelgeschwindigkeit systembedingt auf 100 Hz beschränkt, so dass die durch eine Zufallszahl ermittelten End- Winkelgeschwindigkeiten ebenfalls betragsmäßig nicht größer als 100 Hz werden können. Gleichzeitig muss bei dem hier verwendeten Testelement 2 i o der Betrag der End-Winkelgeschwindigkeit systembedingt größer oder gleich 20 Hz sein, da sonst der sich an die Flüssigkeitskammer 13 anschließende Siphonkanal 14 durchbricht und Flüssigkeit entweicht.
Die Zufallszahl ist bevorzugt eine "echte Zufallszahl". Beispielsweise können
15 die Kreiszahl π oder die Eulerzahl e = 2,718281828459 verwendet werden.
Diese als echte Zufallszahlen bezeichneten Zahlen eignen sich besonders für ein "chaotisches Eulermischen". Die Zufallszahl wird als Matrix für die Wahl der "zufälligen" Prozessparameter verwendet. Beispielsweise können Werte der Beschleunigungen und/oder der End-Winkelgeschwindigkeiten aus je zwei 20 aufeinander folgenden Ziffern der Zufallszahl gebildet werden. Alternativ kann jede Ziffer verwendet werden, die mit einem konstanten Faktor, z. B. 10, multipliziert wird.
Am Beispiel der Zahl π = 3, 141592653589793... folgt daraus, dass das Test- 25 element 2 im ersten Zyklus Z-ι von einer ersten End-Winkelgeschwindigkeit ω1 = 31 Hz (Anfangsgeschwindigkeit) mit einer zweiten Beschleunigung a2 = -41 Hz/sec beschleunigt wird bis zum Erreichen einer zweiten End- Winkelgeschwindigkeit ω2 = -59 Hz. Das Testelement 2 wird also zunächst gebremst und dann mit geänderter Rotationsrichtung beschleunigt. Anschlie- 30 ßend wird es mit der ersten Beschleunigung a1 = 26 Hz/sec beschleunigt.
Auch dieser Vorgang umfasst ein Bremsen, einen (kurzen) Stillstand mit Drehrichtungsumkehr und ein Beschleunigen. Die erste Beschleunigung a1 ist der zweiten Beschleunigung a2 entgegengerichtet und weist folglich ein positives Vorzeichen auf. Das Testelement 2 wird bis zum Erreichen der ersten End- Winkelgeschwindigkeit ω1 = 53 Hz mit der ersten Beschleunigung a1 beschleunigt. Diese erste End-Winkelgeschwindigkeit ω1 gehört bereits zum zweiten Zyklus Z2 des Rotationsprofils. Für den zweiten Zyklus Z2 des Rotationsprofils werden die nachfolgenden Ziffern der Zahl π ausgewählt, so dass die zweite Beschleunigung des zweiten Zyklus a2 = -58 Hz/sec ist. Alle nachfolgenden Beschleunigungen und End- Winkelgeschwindigkeiten der einzelnen Zyklen werden entsprechend ausgewählt.
Dieses Rotationsprofil eines „π-Shake-Modes" (π-Eulermischen), das zum Durchmischen einer Flüssigkeit verwendet wird, ist in Figur 6 dargestellt. Bei dem Rotationsprofil werden sowohl die End-Winkelgeschwindigkeiten ω1 , ω2 als auch die Beschleunigungen a1 , a2 von Zyklus zu Zyklus verändert wer- den. Der Betrag der maximal auftretenden End-Winkelgeschwindigkeit ω1 , ω2 beträgt in diesem Anwendungsbeispiel systembedingt 100 Hz. Deutlich zu erkennen ist, dass die Zyklen unterschiedliche Zyklusdauern haben, was aus den unterschiedlichen Beschleunigungen bzw. End-Winkelgeschwindigkeiten folgt.
Der Nachweis der verbesserten Durchmischung eines Analyten in einer Flüssigkeit durch Einsatz eines chaotischen Euler-Rotationsprofils, bei dem sowohl die Beschleunigungen wie auch die End-Winkelgeschwindigkeiten von einem Zyklus zum nächsten verändert werden, ist in der Tabelle in Fig. 7 ge- zeigt. Dazu wurden drei Spots eines festphasengebundenen Reaktionspartners in einer Flüssigkeitskammer 13 platziert. Ein Analyt (in diesem Fall ein Protein), der in einer Flüssigkeit enthalten ist, wurde durch eine optische Auswertung mit einer Belichtungszeit von 10 Sekunden ermittelt. Dargestellt ist der Mittelwert MW der gemessenen Signale über verschiedene Testelemente. Als Signal gilt der Mittelwert aus den Spot-Integralen (= Spot-Signale). Je höher der Mittelwert und je geringer der Variationskoeffizient, desto vorteilhafter ist die Art des Mischens für die Microarrays. In Figur 7 sind die Messergebnisse zweier Messungen gezeigt. Sowohl in der ersten (1 .) als auch in der zweiten (2.) Messung wird ein Standardschütteln (Standard-Eulermischen) mit gleich bleibenden Beschleunigungen und gleich bleibenden End-Winkelgeschwindigkeiten über alle Zyklen verglichen mit ei- 5 nem "chaotischen Eulermischen", bei dem die Beschleunigungen a1 , a2 konstant sind und die End-Winkelgeschwindigkeiten ω1 , ω2 innerhalb der Inkubationsdauer variieren und Zeitintervalle der konstanten Rotation sich mit aktiven Mischphasen während der Inkubation abwechseln. In der ersten Messung werden beim chaotischen Eulermischen etwa 5 % mehr Signale (Counts) er- i o mittelt, während der Variationskoeffizient VK von 27 % auf 21 % gesunken ist.
Auch bei der zweiten Messung mit einer geänderten Proteindichte in der Flüssigkeit ergibt sich eine Erhöhung des Mittelwerts der detektierten Signale (Counts). In diesem Fall liegt die Erhöhung bei 1 1 %. Gleichzeitig verbessert sich der Variationskoeffizient VK von 26 % auf 17 %. Aus beiden Werten lässt
15 sich erkennen, dass eine deutlich verbesserte Homogenität erzielt wurde.
In Figur 8 wird das Standard-Eulermischen (Kurve A) mit dem chaotischen Eulermischen (Kurve B) auf Grundlage der Zahl π (π-Eulermischen) verglichen. Zum Nachweis der Homogenität wurde ein BI-DIG-Modellsystem einge-
20 setzt, bei dem der Boden der Flüssigkeitskammer 13 mit einem TRSA-BI- Streptavidin gecoatet ist. Auf dem Boden sind einzelne Spots mit einem Bl- RPLA-DIG (BI-Rinderplasmaalbumin-DIG) angeordnet, wobei die Bodenfläche um die Spots mit Biotin geblockt (beschichtet) ist. Nachgewiesen wird ein Anti- DIG-Latex als Modell-Analyt in einer Probenflüssigkeit. In Figur 8 ist jeweils
25 der Median der gemessenen, signalgebenden Fluoreszenzsignale (FS) (counts) über den einzelnen (nummerierten) Spots (S) der Kammer 13 dargestellt. Der Vergleich der beiden Kurven zeigt, dass bei dem chaotischen Eulermischen deutlich geringere Ausreißer der einzelnen Spots zu detektieren sind als beim Standardmischen. Auch in diesem Fall ist die Variation der ein-
30 zelnen Spots geringer. Es erfolgt also eine bessere Verteilung des in der Flüssigkeit enthaltenen Analyten, was ein Indikator für eine bessere Durchmischung der Flüssigkeit ist. Figur 9 zeigt den Vergleich zweier Messungen bei einem "chaotischen Euler- Mischen". Auch hier sind jeweils der Median der gemessenen, signalgebenden Fluoreszenzsignale (FS) (counts) über den einzelnen (nummerierten) Spots (S) einer Kammer gezeigt. Bis auf jeweils einen Ausreißer an je einem 5 Spot zeigt das Messergebnis eine geringe Varianz über alle Spots. Es erfolgt somit eine sehr gute Gleichverteilung, da der Variationskoeffizient gering ist. Die beiden Ausreißer waren bei diesem Versuch erwartet worden, da sie systembedingt sind. Dass beide Ausreißer an unterschiedlichen Spots detektiert wurden, hängt damit zusammen, dass keine idealgleichen Matrizen i o (gecoatete Flüssigkeitskammern) zur Verfügung standen. Allerdings ist der deutliche Trend zu erkennen, dass durch eine Veränderung der Beschleunigungen und der End-Winkelgeschwindigkeiten von Zyklus zu Zyklus innerhalb eines Rotationsprofils die Durchmischung einer Flüssigkeit deutlich verbessert werden kann.
15

Claims

Patentansprüche
Verfahren zum Durchmischen einer Flüssigkeit mittels eines mikrofluidi- schen Testelements (2) mit einem Substrat und einer mikrofluidischen Kanalstruktur (10) zur Aufnahme der Flüssigkeit, wobei das Testelement (2) mit einer Winkelgeschwindigkeit ω um eine Rotationsachse (4) rotiert,
umfassend die folgenden Schritte:
- Rotieren des Testelements (2) mit der Flüssigkeit gemäß eines Rotationsprofils, das wenigstens drei Zyklen umfasst und bei dem sich die Winkelgeschwindigkeit innerhalb eines Zyklus ändert,
wobei in einem Zyklus die folgenden Schritte ausgeführt werden:
- Beschleunigen der Rotation des Testelements (2) mit wenigstens einer Beschleunigung a1 bis zum Erreichen einer ersten End- Winkelgeschwindigkeit ω1 ,
- nach Erreichen der ersten End-Winkelgeschwindigkeit ω1 , Beschleunigen der Rotation des Testelements (2) mit wenigstens einer Beschleunigung a2 bis zum Erreichen einer zweiten End- Winkelgeschwindigkeit ω2,
wobei die Beschleunigung a1 und die Beschleunigung a2 entgegengerichtet sind,
dadurch gekennzeichnet, dass
sich wenigstens eine der Beschleunigungen a1 , a2 und/oder wenigstens eine der End-Winkelgeschwindigkeiten ω1 , ω2 von einem Zyklus zum nächsten Zyklus ändert.
Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Beträge der Beschleunigungen a1 , a2 in einem Zyklus verschieden sind. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine der Beschleunigungen a1 , a2 während eines Zyklus konstant ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine der Beschleunigungen a1 , a2 sich während eines Zyklus ändert.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zyklus aus einem ersten Teilzyklus bis zum Erreichen der ersten End-Winkelgeschwindigkeit ω1 und aus einem sich daran anschließenden zweiten Teilzyklus bis zum Erreichen der zweiten End-Winkelgeschwindigkeit ω2 besteht und die Rotation des Testelements in wenigstens einem der beiden Teilzyklen mit wenigstens zwei Beschleunigungen aa, ab erfolgt, wobei die Beschleunigen aa, ab voneinander verschieden sind.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine der Beschleunigungen aa, ab in wenigstens einem der Teilzyklen gleich Null ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine der Beschleunigungen aa, ab beim Erreichen einer der End- Winkelgeschwindigkeiten ω1 , ω2 gleich Null ist, so dass das Testelement für eine vorgegebene Zeitdauer Tp konstant mit der End- Winkelgeschwindigkeit ω1 , ω2 rotiert.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Drehrichtung des Testelements (2) beim Erreichen der ersten End-Winkelgeschwindigkeit ω1 der Drehrichtung beim Erreichen der zweiten End-Winkelgeschwindigkeit ω2 entgegengesetzt ist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Rotationsprofil eine Mehrzahl von Zyklen um- fasst und die Beschleunigung a1 , a2 und/oder End- Winkelgeschwindigkeit ω1 , ω2 des Rotationsprofils mit einer Zufallszahl
5 derart kodiert sind, dass wenigstens eine der Beschleunigungen a1 , a2 und/oder End-Winkelgeschwindigkeiten ω1 , ω2 aus der Zufallszahl gebildet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Zufalls- i o zahl eine echte Zufallszahl ist und die Werte der Beschleunigungen a1 , a2 aus aufeinander folgenden Ziffern der Zufallszahl gebildet werden.
1 1 . Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Zufallszahl eine echte Zufallszahl ist und die End-
15 Winkelgeschwindigkeiten ω1 , ω2 aus aufeinander folgenden Ziffern der
Zufallszahl gebildet werden.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Rotationsprofil mindestens zehn aufeinanderfol-
20 gende Zyklen umfasst, wobei bevorzugt die mindestens zehn aufeinanderfolgenden Zyklen innerhalb von 20 Sekunden durchlaufen werden.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die durchschnittliche Zyklusdauer eines Zyklus we-
25 niger als 10 Sekunden, bevorzugt weniger als 5 Sekunden, besonders bevorzugt weniger als 2 Sekunden ist.
14. Vorrichtung zum Durchmischen einer Flüssigkeit mit einem mikrofluidi- schen Testelement (2), das eine mikrofluidische Kanalstruktur (10) mit
30 einer Flüssigkeitskammer (13) aufweist, umfassend ein Analysegerät
- mit einer Halterung (3) zur Aufnahme und Rotation des Testelements (2), - mit einem Antrieb (5) zum Rotieren der Halterung (3) um eine Rotationsachse (4) mit einer Winkelgeschwindigkeit ω
- mit einer Steuerungseinheit (6) zum Steuern des Antriebs (5) derart, dass das Testelement (2) gemäß eines mehrere Zyklen umfassenden Rotationsprofils rotiert wird, wobei
- sich die Winkelgeschwindigkeit innerhalb eines Zyklus ändert,
- innerhalb eines Zyklus die Rotation mit wenigstens einer ersten Beschleunigung a1 bis zu einer ersten End-Winkelgeschwindigkeit ω1 beschleunigt und anschließend mit wenigstens einer entgegengerichteten zweiten Beschleunigung a2 bis zu einer zweiten End-Winkelgeschwindigkeit ω2 beschleunigt wird, und
- wenigstens eine der Beschleunigungen a1 , a2 und/oder wenigstens eine der End-Winkelgeschwindigkeiten ω1 , ω2 innerhalb des Rotationsprofils von einem Zyklus zum nächsten Zyklus geändert wird.
Testelement zum Durchmischen einer Flüssigkeit umfassend eine Öffnung (12) zur Aufnahme von Flüssigkeit und eine mit der Öffnung (12) in Fluidverbindung stehende Flüssigkeitskammer (13), insbesondere geeignet zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 1 1 oder insbesondere geeignet zum Einsatz in einer Vorrichtung gemäß Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeitskammer (13) die Form einer runden Zylinderscheibe aufweist und sich das Testelement (2) um eine Rotationsachse (4) dreht, die von der Flüssigkeitskammer (13) beabstandet ist.
Testelement nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeitskammer (13) einen kreisrunden Grundriss hat.
Testelement nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeitskammer (13) derart ausgebildet ist, dass der Quotient aus Oberfläche der Flüssigkeitskammer (13) zu dem Volumen der Flüssigkeitskammer (13) zwischen 1 und 3,5 ist, bevorzugt nahe 1 ist.
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