WO2011137574A1

WO2011137574A1 - 汞离子检测用氟硼染料荧光探针

Info

Publication number: WO2011137574A1
Application number: PCT/CN2010/001973
Authority: WO
Inventors: 彭孝军; 樊江莉; 王嵩; 李宏林; 胡明明; 宋克东
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2010-05-05
Filing date: 2010-12-06
Publication date: 2011-11-10
Anticipated expiration: 2012-11-05
Also published as: CN101851500B; CN101851500A

Description

汞离子检测用氟硼染料荧光探针

技术领域

本发明涉及一种汞离子检测用氟硼染料荧光探针，其属于精细化工领域中适用于自然水样及生物细胞内汞离子检测用荧光分子探针。

背景技术

当体温计、电池成为每个家庭必备的生活用品时，汞产品已经深入人们生活的各个角落，由于人们的不正确使用汞产品，或者因汞泄露处理不当而引起汞污染的事件层出不穷。其他造成汞污染的途径还有很多，例如火山爆发、矿物燃料的消耗，尤其是汞矿的开采，造成了严重的汞污染，危害生态环境以及人类健康的问题已经日益严重！

近年来，拥有高灵敏度、高选择性、简洁快速的荧光分子探针检测技术快速发展，在元素分析中的应用越来越广泛。目前能够检测汞离子的荧光分子探针有很多，例如罗丹明类荧光分子探针 (Chen X Q, Nam S W， Jou M J， et al.， Org. Lett, 2008, 10, 5235-5238.),荧光素为荧光母体、冠醚为识别基团的探针 (Yoon S， Albers A E, Wong A P, et al., J. Am. Chem. Soc. , 2005, 127, 16030-16031.)，基于荧光共振能量转移机理（FRET)设计的比率型荧光分子探针 (Zhang X L, Xiao Y, Qian X Η， Angew. Chem., Int. Ed" 2008, 47, 8025-8029.)以及离子催化水解型荧光探针 (Santra M, Ryu D， Chatterjee A, et al., Chem. Commun., 2009, 21 15-21 17)。由于汞离子的嗜硫性，这些探针的识别基团大部分都含有硫元素。这样虽然提高了配体与汞离子的络合能力，但是同时也降低了配体的选择性，因为含硫基团也常与铅、银等元素络合。其次，这些探针大部分测试都是在实验室条件下进行的，而实际应用在自然环境条件下的案例却很少，因为自然环境条件复杂，对探针的水溶性、选择性、灵敏度都是极大的挑战。另外，生物体内的一些分子含有巯基，他们能与汞离子形成稳定的配合物，但是很少有文献去探讨这些生物分子对探针识别汞离子时的影响。因此，开发一种新型的结构简单易于制备的、高选择性与灵敏度的、并且能够应用在实际的自然环境条件下及生物细胞内的荧光分子探针仍然是个挑战。

发明内容

本发明改进现有的基于络合型汞离子荧光探针结构和性能上的不足，设计并合成出适用于自然水样中低浓度汞离子检测以及活细胞内检测用、结构简单性能优良的基于氟硼荧光染料的探针分子为目的。

本发明采用的技术解决方案是： . 一种汞离子检测用氟硼染料荧光探针分子具有如下结构通式 BH_g:

所述探针分子采用乙醇 -HEPES缓冲溶液配制成用于汞离子检测用的组合物。

所述的汞离子检测用氟硼染料荧光探针分子的合成方法包括下列步骤： 1) 使 2， 4-二甲基吡咯与 3-羟基 -4硝基-苯甲醛反应：将 2， 4-二甲基吡咯和 3-羟基 -4硝基-苯甲醛溶解在二氯甲烷中，滴一滴三氟乙酸，然后室温下搅拌 5小时；减压蒸除溶剂，加入二氯二氰苯醌，搅拌 15分钟后再加入三乙胺和三氟化硼乙醚溶液，继续搅拌 45分钟，用水洗涤反应溶液，并用二氯甲垸萃取；减压蒸除二氯甲烷，用柱层析分离提纯目标产物，得到中间体 I：

2)将中间体 I还原，得到化合物 BH_g: 将中间体 I溶解在乙醇中，加入水合肼和钯碳催化剂，回流反应 2个小时；冷却后，将溶液过滤，滤液减压蒸除乙醇，然后用二氯甲垸重新溶解。用去离子水分两次洗涤有机层；有机层溶液用无水硫酸钠干燥，减压蒸除二氯甲垸，用柱层析分离提纯目标产物，得到红色固体：

上述的技术方案所得荧光染料可通过本领域公知的分离和纯化技术回收，以达到需要的纯度。使用的各种原料均可市售获得，或者可通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中公开的方法由本领域公知的原料简单地制备得到。本发明不仅提供了包含上述化合物 BH_g的组合物，所述组合物用于汞离子的检测。组合物可作为乙醇 -HEPES 缓冲溶液形式存在，或者可作为临用前用乙醇 -HEPES缓冲溶液配制为溶液的其它合适形式存在；而且还提供了使用上述化合物 BHg或包含 BHg的组合物以检测汞离子的方法，该方法包括使上述化合物 BH 或包含 BH_g的组合物检测样品中的汞离子。

本发明的有益效果是：上述的探针分子具有极其重要的应用价值。特别是探针分子检测灵敏度高，对 pH变化不敏感，对各种金属离子以及阴离子具有很好的抗干扰能力，不但可以应用在富硫环境中检测汞离子，并且还可以应用在实际的自然水样中检测汞离子以及实现在活细胞内检测汞离子的存在，使得这类探针作为测定汞离子浓度变化的试剂是极其有用的。由以上描述以及本领域技术人员公知的常识，可了解 BODIPY类染料分子荧光探针的各种优点，包括但不限于以下：

(1)荧光探针分子激发和发射光谱在可见区，荧光量子产率高，对溶剂极性不敏感，并且化学 /光稳定性好。

(2)荧光探针分子的设计基于邻氨基酚与汞离子络合的机理，探针分子络合汞离子前后荧光发射约有 20倍的增长。荧光探针分子对汞离子有很好的选择性，钠、钾、钙、镁、铜等金属离子对检测没有干扰。另外荧光探针分子对 pH变化不敏感，在 pH 5-12的范围内， pH变化对荧光发射基本无影响。

(3)荧光探针分子可以检测到 ppb级汞离子浓度，并且有很好的线形关系。

(4)荧光探针分子可以在富硫环境中检测汞离子而不受干扰。

(5)荧光探针分子可以应用在实际的自然水样中检测汞离子。

(6)荧光探针分子细胞渗透性好，对细胞本身毒副作用小，可以实现活细胞内汞离子的检测。

附图说明

图 1是在乙醇 -HEPES(N-2-羟乙基哌嗪 -N-2-乙磺酸）缓冲溶液（20 mM HEPES, 100 mM NaN0₃, 1:1, v/v, pH 7.2) 中进行的荧光分子探针 BHg的荧光强度随汞离子浓度的变化关系图。荧光探针分子 BHg的浓度是 10 汞离子的浓度变化从小到大依次是 0, 1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10， 12， 14,20/^4。横坐标为波长 (nm)，纵坐标为荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号： LS55。

图 2是荧光分子探针 BHg对汞离子的选择性荧光发射图。荧光探针分子 BHg的浓度是 10 ,各种金属离子的浓度是其 5倍当量时的荧光发射光谱。横坐标为波长 (nm)，纵坐标为荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号： LS55。

图 3是乙醇 -HEPES缓冲溶液（20 mM HEPES, 100 mM NaN0₃, 1:1, v/v, pH 7.2) 中荧光探针分子 BHg的荧光强度随 pH变化的荧光发射图。横坐标为 pH，纵坐标为荧光强度。荧光探针分子 BHg的浓度为 10 。用 NaOH (1 M) 和 HC1(1 M)调节 pH。所用仪器为荧光分光光度计，型号： LS55。

图 4是在乙醇 -HEPES缓冲溶液（20 mM HEPES, 100 mM NaN0₃, 1:1, v/v, pH 7.2) 中各种金属离子对于荧光探针分子 BHg—汞离子络合物的干扰实验，先加入除汞离子外其他金属离子以及探针后再加入汞离子。荧光探针分子 BHg的浓度为 10 。横坐标各种离子浓度为探针分子浓度的 5倍，纵坐标为荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号： LS 55。

图 5是在乙醇 -HEPES缓冲溶液（20 mM HEPES, 100 mM NaN0₃, 1 : 1 , v/v, pH 7.2 ) 中各种阴离子对于荧光探针分子 BHg—汞离子络合物的干扰实验，先加入各种阴离子以及探针后再加入汞离子。荧光探针分子 BHg 的浓度为 10 ,Μ .横坐标各种离子浓度为探针分子浓度的 5倍，纵坐标为荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号： LS 55。

图 6是用荧光探针分子 BH_g研究 ppb级浓度汞离子与荧光强度线形关系图。荧光探针分子 BH_g的浓度为 5 。横坐标为汞离子浓度，纵坐标为荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号： LS 55。

图 7为 BH_g的荧光增强倍数随不同浓度汞离子的变化关系图。荧光探针分子 BHg的浓度为 10 。横坐标为汞离子浓度，纵坐标为荧光增强倍数。所用仪器为荧光分光光度计，型号： LS 55。

图 8为三个水样中分别加入 50ppb汞离子后 BHg的荧光变化情况。横坐标为不同水源，纵坐标为荧光增强倍数。所用仪器为荧光分光光度计，型号： LS 55。

图 9是 BHg在富硫环境中识别汞离子的研究。荧光探针分子 BHg的浓度为 10^。横坐标为不同体系，纵坐标为荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号： LS 55。

图 10用荧光探针分子 BHg在 Osteoblasts细胞中对汞离子的识别成像图。图 (a)为 BHg加入培养好的 Osteoblasts细胞中在 37°C下培养基中培养 30分钟后白的亮场成像图；图 (b)为 BHg加入培养好的 Osteoblasts细胞中在 37°C下培养基中培养 30分钟后的图像；图 (c) 向上述含探针的细胞培养液中加入汞离子后在 37°C的条件下孵化 30分钟后的图像。荧光探针分子 BHg的浓度为 10 , 汞离子浓度为 10μΜ。仪器为 Olympus 1X70-131。

具体实施方式

实施例 1 探针 BHg的合成： τβζν ζί Ρ励 d X₊R-n)6 SVP9£ pro z/m :(S3)SW άθΐ -ίζ'Π 'L'6Z '" ΐ ΐ 8"9n 6ΌΠ 'ςΐζΖΙ ⁽92 ί\ 'ίΥζίλ 'όΟ'ΖΠ 'ϋ'ίη '9 ·^ΐ '66 5Ι -9 X^Z\DQD '^ZHW 001) Ή匪 _ει '(Η9 's)8S'l '(Η9 ⁽^)SVZ '(HZ ^)W9 '(ΖΗ 0·8 = f 'HI 'Ρ)9 ·9 '(HI 's)39'9 '(ΖΗ 0·8 = Γ 'ΗΙ 'Ρ)Ι6·9 ： § XHDQD '^ZHW 00^)Ή1Α[Ν Η, °% 8 ^

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C.6100/010ZN3/X3d tLSL£l/U0Z OAV 实施例 2 探针 BHg的荧光强度随汞离子浓度的变化关系：

将 BHg加入乙醇 -HEPES (N-2-羟乙基哌嗪 -N-2-乙磺酸）缓冲溶液（20 mM HEPES, 100 mM NaN0₃, 1:1, v/v, pH 7.2) 中，配成 10 M浓度的溶液。没加入汞离子时， BH 荧光很弱，然后依次逐渐增加汞离子的浓度 0, 1, 2， 3, 4, 5， 6， 7, 8, 9, 10, 12, 14, 20/^M,BHg荧光也逐渐增强，滴定到饱和荧光大约增强了 20倍（图 1) 。所用仪器为荧光分光光度计，型号： LS55。

实施例 3 探针 BH_g对汞离子选择性和抗千扰能力：

将 10 的化合物 BHg加到 5倍过量的各种金属离子的乙醇 -HEPES (N-2- 羟乙基哌嗪 -N-2-乙磺酸）缓冲溶液（20 mM HEPES, 100 mM NaN0₃, 1:1, v/v, pH 7.2) ，探针激发波长为 _{49Q nm}，探针发射波长 _{513 nm}，测试结果显示于图 2中。从图中可以看到，探针 BHg对汞离子具有很高的选择性，只有汞离子的加入才能产生明显的荧光的增强。另外从图 4、图 5中可以看出钠、钾、钙、镁、铜等金属离子以及氯离子、硝酸根离子、硫酸根离子等阴离子对整个识别过程几乎没有没有干扰。所用仪器为荧光分光光度计，型号： LS55。

实施例 4 探针 BHg对 pH的不敏感性：

于化合物 BHg (10 _μΜ 的乙醇 -HEPES缓冲溶液（20 mM HEPES, 100 mM NaN0₃, 1:1, v/v, pH 7.2) 中滴加 NaOH溶液 (1 M) 或 HC1溶液 (1M) 来调节溶液的 pH并测定荧光强度，记录相应的荧光强度变化，测试结果显示于图 3中。从图中可以看出探针 BH_g在 pH 5-12的范围内， pH变化对荧光发射基本没有影响。因此探针可用于此 pH范围内汞离子的检测。所用仪器为荧光分光光度计，型号： LS55。

实施例 5 探针 BHg对汞离子检测的灵敏度- 于化合物 BHg

乙醇 -HEPES缓冲溶液（20 mM HEPES, 100 mM NaN0₃, 1:1, v/v, pH7.2)中加入 2-12 ppb浓度的汞离子，记录相应的荧光强度变化，测试及过显示于图 6中。从图中可以看出探针 BH_g，在 2-12 ppb的范围内荧光强度有明显增强且荧光强度随汞离子浓度变化呈现很好的线形关系。因此探针可用于低浓度汞离子的检测。所用仪器为荧光分光光度计，型号： LS55。

实施例 6 探针 BH_g在自然水样中对汞离子的检测我们选取了三处不同的水源：黄海海水（大连）、池水及自来水。在三个样品中分别加入 BH_g配成 10 _M浓度的溶液，依次增加汞离子的加入量。从图 7中可以看出，随着汞离子浓度的增加，三个水样的荧光强度均显著增加并有很好的线性关系，尤其加入 50ppb汞离子后三个水样的荧光强度分别增加了 3.9倍、 4.5倍、 2.9倍（图 8 ) ，效果明显，说明 BH_g可以应用在实际的自然水样中进行汞离子的检测。

实施例 7 探针 BHg在富硫环境中对汞离子的检测

在乙醇 -HEPES缓冲溶液（20 mM HEPES, 100 mM NaNO₃, 1 : 1, v/v, pH 7.2) 中，依次加入探针 BHg ( 10 ) 、半胱氨酸（5(VM ) 、汞离子（50 _M ) ，记录荧光强度变化，并与直接加入汞离子（50^ ) BHg的荧光强度变化做比较，根据图 9所示，半胱氨酸并没有影响探针识别汞离子的过程，说明探针 BHg可以应用在富硫环境中检测汞离子。

实施例 8 探针 BHg系列在活细胞内对汞离子的检测：

将 BHg加入培养好的 Osteoblasts细胞中在 37°C下在培养基中培养 30分钟，此时的 BHg在活的 Osteoblasts细胞中的荧光很弱（图 10(b)) 。向上述含探针的细胞培养液中加入汞离子后在 yVC的条件下孵化 30分钟，此时在活的

Osteoblasts细胞中的荧光变得很强（图 10(c)) 。亮场成像证明含有 BHg以及汞离子的 Osteoblasts细胞在整个过程中均可以观测到（图 10(a)) 。所用仪器是 Olympus, 1X70-131。

Claims

1. 一种汞离子检测用氟硼染料荧光探针，其特征在于：所述探针分子具有如下结构通式 BHg:

2. 据权利要求 1所述的汞离子检测用氟硼染料荧光探针，其特征在于：所述探针分子采用乙醇 -HEPES缓冲溶液配制成用于汞离子检测用的组合物。

3. 据权利要求 1所述的汞离子检测用氟硼染料荧光探针的合成方法，其特征在于：所述探针分子的合成方法包括下列步骤：

1) 使 2， 4-二甲基吡咯与 3-羟基 -4硝基-苯甲醛反应：将 2， 4-二甲基吡咯和 ₃_羟基 _4硝基-苯甲醛溶解在二氯甲垸中，滴一滴三氟乙酸，然后室温下搅拌 5小时；减压蒸除溶剂，加入二氯二氰苯醌，搅拌 15分钟后再加入三乙胺和三氟化硼乙醚溶液，继续搅拌 45分钟，用水洗涤反应溶液，并用二氯甲垸萃取；减压蒸除二氯甲垸，用柱层析物，得到中间体 I：

2)将中间体 I还原，得到化合物 BH_g: 将中间体 I溶解在乙醇中，加入水合肼和钯碳催化剂，回流反应 2个小时；冷却后，将溶液过滤，滤液减压蒸除乙醇，然后用二氯甲烷重新溶解。用去离子水分两次洗涤有机层；有机层溶液用无水硫酸钠干燥，减压蒸除二氯甲垸，用柱层析分离提纯目标产物，得到红色固体：