WO2011132584A1

WO2011132584A1 - 膜電位変化検出装置および膜電位変化検出方法

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Publication number: WO2011132584A1
Application number: PCT/JP2011/059186
Authority: WO
Inventors: 範和杉山; 卓治片岡; 池田　貴裕
Original assignee: 浜松ホトニクス株式会社
Priority date: 2010-04-23
Filing date: 2011-04-13
Publication date: 2011-10-27
Also published as: EP2562533A1; EP2562533A4; JP5457262B2; US20130088719A1; EP2562533B1; US9423343B2; JP2011232056A

Abstract

　膜電位変化検出装置１は、反射干渉計測用光源１０６と、細胞１０１が載置された透明部材１０２ａを保持する保持部１０３と、反射干渉計測用光源１０６から放射され、透明部材１０２ａを介して細胞１０１から反射される光を撮像することにより、反射干渉画像を生成する反射干渉検出用カメラ１１０と、反射干渉画像から細胞１０１と透明部材１０２ａとの接着に関するパラメータｄＩを算出し、当該パラメータｄＩの変化に基づいて細胞１０１の膜電位の変化を検出する解析部２０２と、を備えている。

Description

膜電位変化検出装置および膜電位変化検出方法

　本発明は、膜電位変化検出装置および膜電位変化検出方法に関するものである。

　細胞のイオンチャンネルを標的とした治療薬の開発は、創薬の開発において重要度を増している。従来の生細胞を用いたアッセイにおいてはパッチクランプ電極を用いた膜電位の測定や膜電位感受性色素を用いた光学的な膜電位の計測などが用いられてきた。例えば、非特許文献１には、蛍光色素によって細胞を染色し、蛍光干渉コントラスト顕微鏡画像を用いて基板に載置された当該細胞と基板との距離（細胞の接着度）を求めたり、膜電位感受性色素によって細胞を染色し、光学的に細胞の膜電位の変化を求めたりする技術が開示されている。また、非特許文献２には、ＦＲＥＴ色素によって細胞を染色（着色）し、ＦＲＥＴ現象を用いて細胞の膜電位の変化を算出する技術が開示されている。

Raimund Gleixner and PeterFromherz, "The Extracellular Electrical Resistivity in Cell Adhesion." ,Biophysical Journal , Volume90, 2600-2611, (2006) Jesus E Gonzalez and Roger YTsien, "Improved indicators of cell membrane potential that use fluorescenceresonance energy transfer" , Chemistry & Biology，1997，Vol.4, No.4，Page.269-277

　細胞の膜電位変化を測定するためのラベル剤である蛍光色素を細胞に取り込ませる必要がある。また、上記の測定には強い励起光を照射する必要があり、生細胞の状態に影響を及ぼす。生細胞の正常な状態を保って測定するには色素濃度や励起光照射強度の最適な条件を試行錯誤により見極める必要がある。また今後、幹細胞をもとにヒト細胞が薬効評価の対象として利用が拡大するとこれらの細胞の中にはダメージを受けやすい細胞も多く、ラベルした測定はますます難しくなる。したがって、できるだけラベルをせず、細胞を培養した状態からできるだけ手を加えずに膜電位を非侵襲に測定するラベルフリー技術が望まれている。

　そこで、本発明は上記に鑑みてなされたもので、ラベルすることなく非侵襲的な方法で細胞の膜電位の変化を検出することが可能な膜電位変化検出装置および膜電位変化検出方法を提供することを目的とする。

　上記課題を解決するために、本発明の膜電位変化検出装置は、反射干渉計測用光源と、細胞が載置された透明部材を保持する保持手段と、反射干渉計測用光源から放射され、透明部材を介して細胞から反射される光を撮像することにより、反射干渉画像を生成する反射干渉撮像手段と、反射干渉画像から細胞と透明部材との接着に関するパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて細胞の膜電位の変化を検出する解析手段と、を備えている。

　また、本発明の膜電位変化検出方法は、反射干渉撮像手段が、反射干渉計測用光源から放射され、細胞が載置された透明部材を介して細胞から反射される光を撮像することにより、反射干渉画像を生成する反射干渉撮像ステップと、解析手段が、反射干渉画像から細胞と透明部材との接着に関するパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて、細胞の膜電位の変化を検出する解析ステップと、を含んでいる。

　このような発明によれば、反射干渉計測用光源、保持手段、反射干渉撮像手段および解析手段を備えることにより、細胞からの反射光をもとに細胞と透明部材との接着に関するパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて細胞の膜電位の変化を検出している。発明者らは、細胞が載置された透明部材と細胞との接着度合と、細胞の膜電位の変化との間に相関関係があることを発見した。本発明は、発見されたこのような相関関係を利用して、細胞の膜電位の変化を、細胞と透明部材との接着距離（接着度合）の変化として捉えているところに特徴がある。当該接着距離に基づく細胞と透明部材との接着に関するパラメータは非侵襲的な方法で得られるので、細胞の膜電位の変化をラベルすることなく非侵襲的に検出することが可能となる。

　また、本発明では、解析手段は、脱分極になると細胞が透明部材から離れ、過分極になると細胞が透明部材に近づくという相関関係に基づいて細胞の膜電位の変化を検出してもよい。この発明によれば、発明者らが発見した上記相関関係に基づいて、細胞が脱分極および過分極になったときの細胞の膜電位の変化を検出することができる。

　また、本発明では、反射干渉計測用光源から放射され細胞から反射される光が集光される対物レンズを更に備えており、対物レンズと透明部材とは空気層を介して配置されていてもよい。この発明によれば、対物レンズの操作性を改善することができるので、細胞が載置された透明部材全体をスキャンしながら撮像することが容易となる。これにより、細胞の膜電位の変化を検出する際のスループットを向上させることができる。

　また、本発明では、透明部材の載置面とは反対側の面は、反射防止コートが施されていてもよい。この発明によれば、ドライ系の対物レンズを用いる場合であっても、高いコントラストで細胞接着面の反射干渉画像を得ることができる。

　また、本発明では、対物レンズの反射干渉計測用光源側の開口絞りと共役な位置に配置されているリング状のスリットを更に備えていてもよい。この発明によれば、リング状に開口したスリットを反射干渉計測用光源からの照明光が通り、照明光は対物レンズの中心は通らず周辺を通って照明され、角度のついた高いＮＡの光のみを使って細胞が照明されるため、細胞上部の溶液からの反射光の影響を低減することができる。また、リング状のスリットを用いることにより、対物レンズ内部の反射による背景光を低減することもできる。

　また、本発明では、定量位相計測用光源と、定量位相計測用光源から放射され細胞を透過する光を撮像することにより、定量位相画像を生成する定量位相撮像手段と、を更に備えていてもよい。この発明によれば、定量位相計測用光源と定量位相撮像手段とを備えることにより、個々の細胞の光学的厚さ、体積および面積などの情報を取得している。定量位相撮像手段から取得できる個々の細胞の光学的厚さ、体積および面積などの情報を用いることにより、細胞と透明部材との接着に関するパラメータのバリエーションを増やすことが可能となる。

　また、本発明の膜電位変化検出装置では、反射干渉画像と定量位相画像との間で、空間的な位置を一致させることにより、両画像の位置合わせを行う画像位置合わせ手段と、定量位相画像に基づき、細胞の輪郭を抽出する輪郭抽出手段と、輪郭抽出手段が抽出した輪郭を反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する輪郭適用手段と、を更に備えており、解析手段は、輪郭適用後の反射干渉画像に基づいて、細胞と透明部材との接着に関する細胞ごとのパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて細胞ごとの膜電位の変化を検出してもよい。

　また、本発明の膜電位変化検出方法では、反射干渉撮像手段が、反射干渉計測用光源から放射され、細胞が載置された透明部材を介して細胞から反射される光を撮像することにより、反射干渉画像を生成する反射干渉撮像ステップと、定量位相撮像手段が、定量位相計測用光源から放射され、細胞を透過する光を撮像することにより、定量位相画像を生成する定量位相撮像ステップと、画像位置合わせ手段が、反射干渉画像と定量位相画像との間で、空間的な位置を一致させることにより、両画像の位置合わせを行う画像位置合わせステップと、輪郭抽出手段が、定量位相画像に基づき、細胞の輪郭を抽出する輪郭抽出ステップと、輪郭適用手段が、輪郭抽出手段が抽出した輪郭を反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する輪郭適用ステップと、解析手段が、輪郭適用後の反射干渉画像に基づいて、細胞と透明部材との接着に関する細胞ごとのパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて細胞ごとの膜電位の変化を検出する解析ステップと、を含んでいてもよい。

　これらの発明によれば、画像位置合わせ手段と、輪郭抽出手段と、輪郭適用手段とを備えることにより、定量位相画像に基づき細胞の輪郭を抽出し、当該輪郭を反射干渉画像と重ね合わせている。これにより、反射干渉撮像手段および定量位相撮像手段により取得される画像の中に複数の細胞が含まれている場合には、個々の細胞について膜電位の変化を検出することが可能となる。

　また、本発明では、反射干渉計測用光源から放射される光の光量を調整する反射干渉光量調整手段と、定量位相計測用光源と、定量位相計測用光源から放射される光の光量を調整する定量位相光量調整手段と、を更に備えており、反射干渉撮像手段は、反射干渉計測用光源から放射され、細胞から反射される反射光を撮像することにより、反射干渉画像を生成するとともに、定量位相計測用光源から放射され、細胞を透過する透過光を撮像することにより、定量位相画像を生成し、反射干渉画像を生成する際に、定量位相光量調整手段が定量位相計測用光源からの光を遮光し、反射干渉撮像手段が反射光を撮像し、定量位相画像を生成する際に、反射干渉光量調整手段が反射干渉計測用光源からの光を遮光し、反射干渉撮像手段が透過光を撮像してもよい。この発明によれば、定量位相計測用光源と定量位相撮像手段とを備えることにより、個々の細胞の光学的厚さ、体積および面積などの情報を取得している。定量位相撮像手段から取得できる個々の細胞の光学的厚さ、体積および面積などの情報を用いることにより、細胞と透明部材との接着に関するパラメータのバリエーションを増やすことが可能となる。

　また、本発明の膜電位変化検出装置では、反射干渉光量調整手段は、反射干渉計測用光源から放射される光の光量を調整するシャッタであり、定量位相光量調整手段は、定量位相計測用光源から放射される光の光量を調整するシャッタであってもよい。この発明によれば、光の光量を調整するための具体的な手段が提供される。

　また、本発明の膜電位変化検出装置では、反射干渉光量調整手段は、反射干渉計測用光源のＯＮ/ＯＦＦによる切り替えにより、反射干渉計測用光源から放射される光の光量を調整し、定量位相光量調整手段は、定量位相計測用光源のＯＮ/ＯＦＦによる切り替えにより、定量位相計測用光源から放射される光の光量を調整してもよい。この発明によれば、光の光量を調整するための具体的な方法が提供される。この方法は、光源がＬＥＤ（発光ダイオード）やＬＤ（レーザーダイオード)、ＳＬＤ（スーパールミネッセントダイオード）などの半導体型光源である場合に特に有用である。

　また、本発明の膜電位変化検出装置では、定量位相画像に基づき、細胞の輪郭を抽出する輪郭抽出手段と、輪郭抽出手段が抽出した輪郭を反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する輪郭適用手段と、を更に備えており、解析手段は、輪郭適用後の反射干渉画像に基づいて、細胞と透明部材との接着に関する細胞ごとのパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて細胞ごとの膜電位の変化を検出してもよい。

　また、本発明の膜電位変化検出方法では、撮像手段が、反射干渉計測用光源から放射され、細胞から反射される反射光を撮像することにより、反射干渉画像を生成するとともに、定量位相計測用光源から放射され、細胞を透過する透過光を撮像することにより、定量位相画像を生成する撮像ステップと、輪郭抽出手段が、定量位相画像に基づき、細胞の輪郭を抽出する輪郭抽出ステップと、輪郭適用手段が、輪郭抽出手段が抽出した輪郭を反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する輪郭適用ステップと、解析手段が、輪郭適用後の反射干渉画像に基づいて、細胞と透明部材との接着に関する細胞ごとのパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて細胞ごとの膜電位の変化を検出する解析ステップと、を含んでおり、反射干渉画像を生成する際に、定量位相光量調整手段が定量位相計測用光源からの光を遮光し、撮像手段が反射光を撮像し、定量位相画像を生成する際に、反射干渉光量調整手段が反射干渉計測用光源からの光を遮光し、撮像手段が透過光を撮像してもよい。

　本発明の膜電位変化検出装置および膜電位変化検出方法によれば、ラベルすることなく非侵襲的な方法で細胞の膜電位の変化を検出することが可能となる。

第１実施形態に係る膜電位変化検出装置の全体構成を示す概要図である。第１実施形態に係る処理部のハードウェア構成図である。容器の構成を示す断面図である。反射防止コートによる効果を示すための図である。反射防止コートによる効果を示すための図である。波長幅の違いによる反射干渉画像の違いを示す図である。処理部の機能および動作を示すフローチャートである。変化率の時間的変化の一例を示す図である。測定例１における反射干渉画像の変化を示す図である。測定例１における変化率の時間的変化を示すグラフである。測定例１における濃度とピーク時の変化率との関係を示すグラフである。測定例２における反射干渉画像の変化を示す図である。測定例２における変化率の変化を示すグラフである。測定例２における濃度とピーク時の変化率との関係を示すグラフである。第２実施形態に係る膜電位変化検出装置の全体構成を示す概要図である。第２実施形態に係る処理部の機能および動作を示すフローチャートである。第２実施形態に係る画像位置合わせに用いる標本を示す図である。第２実施形態に係る輪郭抽出処理および輪郭適用処理の一例を示す図である。第３実施形態に係る膜電位変化検出装置の全体構成を示す概要図である。参照光カット装置として機能する参照光シャッタを示す図である。定量位相撮像および反射干渉撮像にかかるタイミングチャートに示す図である。第３実施形態に係る処理部の機能および動作を示すフローチャートである。第３実施形態に係る輪郭抽出処理および輪郭適用処理の一例を示す図である。第３実施形態の変形例に係る膜電位変化検出装置の全体構成を示す概要図である。

　以下、添付図面を参照して本発明にかかる膜電位変化検出装置および膜電位変化検出方法の好適な実施形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。

　第１実施形態では、反射干渉の計測から得られる反射干渉画像を利用して細胞の膜電位の変化を検出する装置について説明を行う。第２実施形態と第３実施形態では、反射干渉の計測と同時に定量位相の計測を行い、反射干渉画像と定量位相画像とを取得し、これらの両画像を利用して細胞の膜電位の変化を検出する方法について説明を行う。

　［第１実施形態］
　（膜電位変化検出装置１の全体構成）
　まず、本発明の実施形態に係る膜電位変化検出装置１の全体構成について、図１を参照しながら説明する。図１は、膜電位変化検出装置１の全体構成を示す概要図である。図１に示すように、膜電位変化検出装置１は、画像取得部１０および処理部２０から構成されている。

　画像取得部１０は、保持部１０３（特許請求の範囲の「保持手段」に相当）、対物レンズ１０４、反射干渉計測用光源１０６、リング状のスリット１０７、ハーフミラー１０８、反射干渉検出用カメラ１１０（特許請求の範囲の「反射干渉撮像手段」に相当）、ＸＹステージ１１５およびディスペンサ１１７を備えている。処理部２０は、画像受信部２０１、解析部２０２（特許請求の範囲の「解析手段」に相当）および記憶部２０３を備えている。

　保持部１０３は、透明部材１０２ａで形成され、細胞１０１が収容（載置）された容器１０２を静置（保持）する。対物レンズ１０４は、反射干渉計測用光源１０６から放射され細胞１０１から反射される光を集光する。対物レンズ１０４と透明部材１０２ａとは、空気層を介して配置されている。反射干渉計測用光源１０６は照明光を放射する。リング状のスリット１０７は輪体照明を行う。ハーフミラー１０８は、所定の比率で入射光を反射または透過する。反射干渉検出用カメラ１１０は、反射干渉計測用光源１０６から放射され、透明部材１０２ａを介して細胞１０１から反射される光を撮像することにより、反射干渉画像を生成する。ＸＹステージ１１５は測定領域を切り換える。ディスペンサ１１７は細胞１０１に薬液を投与する。画像受信部２０１は、反射干渉検出用カメラ１１０が出力した反射干渉画像を受信する部分である。解析部２０２は、反射干渉画像から細胞と透明部材との接着に関するパラメータを算出し、当該パラメータに基づいて細胞の膜電位の変化を検出する部分である。本実施形態では、解析部２０２は、脱分極になると細胞１０１が透明部材１０２ａから離れ、過分極になると細胞１０１が透明部材１０２ａに近づくという相関関係に基づいて、細胞１０１の膜電位の変化を検出している。記憶部２０３は、解析部２０２によって算出されるパラメータや、反射干渉検出用カメラ１１０から出力される画像を記憶する部分である。

　図２は、上述した機能的構成要素を備える処理部２０のハードウェア構成図である。図２に示すように、処理部２０は、物理的には、ＣＰＵ２１、ＲＯＭ２２及びＲＡＭ２３などの主記憶装置、キーボード及びマウスなどの入力デバイス２４、ディスプレイなどの出力デバイス２５、画像取得部１０との間でデータの送受信を行うためのネットワークカードなどの通信モジュール２６、ハードディスクなどの補助記憶装置２７などを含む通常のコンピュータシステムとして構成される。処理部２０の各機能は、ＣＰＵ２１、ＲＯＭ２２、ＲＡＭ２３などのハードウェア上に所定のコンピュータソフトウェアを読み込ませることにより、ＣＰＵ２１の制御の元で入力デバイス２４、出力デバイス２５、通信モジュール２６を動作させると共に、主記憶装置２２，２３や補助記憶装置２７におけるデータの読み出しおよび書き込みを行うことで実現される。

　（膜電位変化検出装置１の詳細説明）
　（画像取得部１０の説明）
　再び、図１を参照しながら説明する。保持部１０３は、計測中の細胞１０１の状態を維持するために、細胞１０１の状態に適した温度に維持することが望ましい。また、細胞１０１の測定が長時間に及ぶ場合には、保持部１０３は、細胞１０１の生育、状態維持に適した温度、湿度、炭酸ガス濃度などが整った環境に維持することが望ましい。

　図３は、容器１０２の構成を示す断面図である。保持部１０３に保持される容器１０２は、細胞１０１が載置される部分が透明部材１０２ａによって形成されている。容器１０２としては、例えばディッシュやマイクロプレートが例示される。容器１０２における細胞１０１の載置面１０２ｂは帯電されており、本実施形態においては＋に帯電されている。

　容器１０２は、細胞１０１の載置面１０２ｂの反対側（容器１０２の観察領域の対物レンズ１０４側）１０２ｃに反射防止コート１０２ｄが施されている。この反射防止コート１０２ｄは、反射干渉画像を取得する上で著しい効果を発揮する。できるだけ多くの細胞１０１を計測するためには、低倍率の対物レンズを利用することが望ましい。しかし、低倍率の対物レンズは開口数（ＮＡ:Numerical Aperture）が低く、通常油浸や水浸ではなく、ドライ系の対物レンズが一般的である。しかしながら、反射干渉画像において、ドライ系の対物レンズを用いると、対物レンズから出射した照明光は細胞の入っている容器の底面で大きく反射する。これは空気と容器の底面のガラスなどの屈折率差が大きいためである。そのため、大幅に背景光が増加して細胞の接着面の反射干渉画像を見ることはほとんど困難となる。従来、反射干渉観察に、油浸や水浸の対物レンズが用いられてきた理由はここにある。

　そこで、本実施形態の容器１０２では、細胞１０１が入れられた容器１０２の細胞１０１の載置面１０２ｂの反対側１０２ｃに反射防止コート１０２ｄを施すことによって、ドライ系の対物レンズでの反射干渉画像の取得を可能にした。図４に示すように、反射防止コート１０２ｄをしていない状態で対物レンズから照射された照明光は空気とガラスとの界面で４％程度の反射があるが、ガラス底面に照明光の波長範囲（４２０ｎｍ～７２０ｎｍ）において反射率Ｒを０．５％程度に抑えた反射防止コート処理を行うことによって、背景光を１／８以下に低減することができる。このため、本実施形態によれば、ドライ系の対物レンズを用いる場合であっても、高いコントラストで細胞接着面の反射干渉画像を得ることができる。

　図５に容器１０２の底面１０２ｃに反射防止コート１０２ｄを施した場合のドライ系の対物レンズを用いた反射干渉画像を示す。図５（Ａ）のように反射防止コート１０２ｄを施さないと、容器１０２の底面１０２ｃからの反射が大きいために、反射干渉画像のコントラストは極めて低下してしまう。これに対して、図５（Ｂ）のように底面１０２ｃに反射防止コート１０２ｄを施した容器１０２を用いることによって、ドライ系の対物レンズでも良好なコントラストを得ることができる。

　図１に戻り、対物レンズ１０４は、上述したようにできるだけ多くの細胞を視野に入れるため、１０倍または２０倍の低倍率でかつ開口数のより大きい対物レンズであることが望ましい。また、対物レンズ１０４は、水浸や油浸ではなく、上述したようにドライ系の対物レンズであることが望ましい。本実施形態では、このようなドライ系の対物レンズを使用することにより、対物レンズ１０４の操作性が改善されるので、容器１０２全体をスキャンしながら撮像することが可能となる。これにより、細胞１０１の膜電位の変化を検出する際のスループットを向上させることが可能となる。また、対物レンズ１０４には、図示しないフォーカス機構が設けられており、後述する反射干渉検出用カメラ１１０にて得られた画像に基づいてオートフォーカスを実行することができる。

　反射干渉計測用光源１０６は、ハロゲンランプやキセノンランプなどの広い波長範囲にわたって放射感度を有する光源が望ましい。従来、コントラストを得るためにある程度波長幅を制限したバンドパスフィルタを用いた照明光が利用されていた。しかしながら、バンドパスされた照明光では、干渉性が高く、細胞の接着面とは関係のない細胞の上部の細胞膜と培養液との界面からの反射による干渉縞が映り込むことがしばしばある。本実施形態では、波長幅の広く干渉性の低い低コヒーレント光を使用している。広い波長幅の照明光を用いることにより、干渉が起きる距離を狭くすることができ、細胞の基板への接着面に限定した反射干渉画像を取り出すことが可能となる。また、ハロゲンランプやキセノンランプなどの広い波長範囲にわたって放射感度を有する光源であれば、７００ｎｍ～２５００ｎｍの近赤外領域の光を照明光として用いることが可能であり、細胞１０１に対する毒性を低減できる。なお、反射干渉計測用光源１０６としては、ＬＥＤ（発光ダイオード）や半導体レーザー（レーザーダイオード)、ＳＬＤ（スーパールミネッセントダイオード）などの光源を用いてもよい。

　図６に４２０ｎｍ～７５０ｎｍの波長幅の広い照明光を用いた場合と４８０ｎｍ、５３０ｎｍを中心波長として波長幅３０ｎｍ程度に狭い波長範囲でバンドパスされた照明光を用いた場合の反射干渉画像の違いを示す。図６（Ａ）と図６（Ｂ）のように狭い波長範囲でバンドパスされた照明光では、細胞の接着面ではない細胞の上部の細胞膜と培養液との界面からの反射が干渉縞のように重なって観察されるが、図６（Ｃ）のように波長幅の広い照明光を用いることにより、細胞の上部からの反射光による干渉は観察されず、細胞の接着面により限定した情報のみを取り出すことが可能である。

　本実施形態の反射干渉計測用光源１０６は、広い放射波長を有するハロゲンランプを光源として用い、出力光に４２０ｎｍから８００ｎｍ程度の可視から近赤外の波長域において任意の広い波長幅のバンドパスフィルタを用いている。中心波長が５００ｎｍから１０００ｎｍで、半値全幅が１００ｎｍ以上のバンドパスされた光を用いると、細胞の接着面に限定した反射干渉画像を取り出すことができる。基板に接着している細胞と基板との距離は、光軸方向に最大でも１μｍ以下であると考えられることから、細胞と基板の接着面の情報のみを特異的に取り出すためには反射干渉の過干渉距離を１μｍ以下になるようにすることが好ましいと考えられる。そこで、反射干渉用の照明光は、細胞に悪影響を与える紫外線領域および熱線領域を除外したうえで、白色光または近赤外光の領域にて波長幅が数百ｎｍ程度になるように光学フィルタにてバンドパスされた光を照射する。このように、波長幅を広げることにより光のコヒーレンス長を短くし、可干渉距離を短くすることによって、細胞と容器底面との接着領域から得られる反射光の干渉のみを取り出すことができる。例えば中心波長６００ｎｍ、波長幅２００ｎｍの広帯域にバンドパスされた光を用いると、可干渉距離は５００ｎｍ程度に短くすることができ、細胞の接着面付近の５００ｎｍ程度の距離における干渉のみを取り出すことができる。

　図１に戻り、リング状のスリット１０７は、照明光の光束の対物レンズ１０４の瞳と共役の位置に配置され、輪帯照明を行うことが望ましい。一般に、統計的に優位なデータを取得するためにはできるだけ多くの細胞について計測を行う必要がある。そのため、できるだけ低倍率の対物レンズを用いて一度に広い視野を計測することが望まれる。しかしながら、低倍率の対物レンズはＮＡが低く、ＮＡの低い照明光は標本に垂直に照射される成分が多く、細胞上部に存在する溶液と空気の界面で反射し、反射光によって細胞が照明されるという現象を引き起こす。これによって接着面とは無関係な細胞の形態像が観察側に含まれるようになる。また、対物レンズの中心部分を通過した照明光は、対物レンズ内部で反射され、反射光が観察側に多く含まれて高い背景光となり、接着面の反射干渉画像のコントラストを低下させる原因となる。

　本実施形態に係る膜電位変化検出装置１の反射干渉計測において、低いＮＡの対物レンズ１０４を使う場合は、対物レンズ１０４の反射干渉計測用光源１０６側の開口絞りと共役な位置にリング状のスリット１０７を設ける。リング状に開口したスリット１０７を反射干渉計測用光源１０６からの照明光が通り、照明光は対物レンズ１０４の中心は通らず周辺を通って照明され、角度のついた高いＮＡの光のみを使って細胞１０１が照明されるため、細胞１０１上部の溶液からの反射光の影響を低減することができる。また、リング状のスリット１０７を用いた照明は、低ＮＡの対物レンズ１０４のみならず、広く対物レンズ１０４内部の反射による背景光を低減することができる。リング状に開口したスリット１０７は使用する対物レンズ１０４の瞳径に適合して対物レンズ１０４ごとに変えられるように、使用する対物レンズ１０４に適合したリング状のスリット１０７が円盤上に複数個取り付けられて、必要に応じて、円盤を回転させることによって、使用者がリング状のスリット１０７を選択できるように構成されている。なお、リング状のスリット１０７を、対物レンズ１０４の瞳そのものの存在する位置に配置することでも同じ効果を得ることができる。

　次に、反射干渉計測について述べる。図１に示すように、反射干渉計測用光源１０６から放射された照明光は、リング状のスリット１０７を通過して、ハーフミラー１０８にて反射して、対物レンズ１０４を通って、測定対象となる細胞１０１を入れた容器１０２の底面側から入射する。ハーフミラーに限らず、照明光強度が十分ある場合には５：９５（反射：透過）や２０：８０（反射：透過）にするなど、反射比率を低減させたビームスプリッタを用いてもよい。また、波長によって反射率・透過率が異なるダイクロイックミラーを用いてもよい。容器１０２の底面の細胞１０１の接着面から得られる反射光は細胞１０１の接着距離に応じて干渉を生じ、得られた反射干渉光は再び対物レンズ１０４にて集光され、ハーフミラー１０８を介して、反射干渉検出用カメラ１１０にて撮像される。このようにして、容器１０２の底面の細胞１０１の接着面から反射した光は、細胞１０１の接着距離に応じて干渉した光の振幅が異なり、明暗のコントラストとして撮影される。

　ここで、反射干渉の原理について簡単に説明する。一般に、反射干渉計測においては照明光を細胞の接着している基板の裏面側から入射し、基板と培養液との界面からの反射光とその上部の培養液と細胞底面の界面からの反射光が干渉することにより細胞と基板との距離に応じた明暗のコントラストを得ることができる。可視光の照明においては、おおむね細胞と基板との距離が数十ｎｍ以下に近づいた状態では暗く撮影される。一方、細胞と基板との距離が１００ｎｍから２００ｎｍ程度に離れた状態では明るく撮影される。

　本実施形態の膜電位変化検出装置１では、できるだけ多くの細胞１０１を測定したり、異なる試薬に対する応答を測定したりするために、観察する位置を移動させる機構を有していてもよい。細胞１０１への影響を少なくするため、および定量位相計測において液面の揺れを抑えるために、細胞１０１を入れた容器は静止したままで、照明光学系と観察光学系を一体とした画像取得部１０の本体をＸＹ平面上で移動させることによって観察位置を変える方法が望ましい。これと合わせて、観察しているＸＹの空間平面座標を画像に記録することが望ましい。本実施形態では、稼動距離が容器１０２の観察範囲を十分にカバーしており、かつ位置決め精度が数十μｍ以下（好ましくは１μm以下）のＸＹステージ１１５が備えられている。

　（処理部２０の説明）
　図７のフローチャートを更に参照しながら、処理部２０の機能および動作について説明する。最初に、反射干渉検出用カメラ１１０にて細胞１０１の接着面の反射干渉画像が得られる（ステップＳ１０１、特許請求の範囲の「反射干渉撮像ステップ」に相当）。容器１０２の底面の基板上に接着している細胞１０１の容器１０２の底面の基板からの距離に応じて干渉光の振幅が異なり、反射干渉画像は明暗のコントラストとして撮影される。次に、反射干渉画像の視野内の反射光のシェーディングを補正する。あわせて細胞１０１のない背景の値が時間的に変動しないように、時間ごとに背景部のオフセット補正を行う。これらの画像演算補正によって、空間的、時間的に変動の少ない反射干渉画像を得ることができる。

　反射干渉検出用カメラ１１０は、例えば１秒間隔で反射干渉画像を取得している。なお、反射干渉画像の取得間隔は、細胞１０１の膜電位の変化の速度に合わせて適宜調節することが好ましい。そして、反射干渉検出用カメラ１１０が画像の取得を開始した一定時間の後、ディスペンサ１１７の薬液分注操作を行い、細胞１０１の入っている溶液に目的の薬液を目的の濃度になるように投与する。

　解析部２０２は、このようにして継続的に得られる反射干渉画像を用いて細胞１０１と透明部材１０２ａとの接着に関するパラメータを算出する（ステップＳ１０２、特許請求の範囲の「解析ステップ」に相当）。本実施形態では、細胞１０１の膜電位の変化を評価するパラメータ（特許請求の範囲の「接着に関するパラメータ」に相当）として、「平均輝度の変化率」を算出している。解析部２０２は、反射干渉画像から細胞１０１の接着している領域と細胞１０１が接着していない領域とを区別して、細胞１０１の接着している領域を特定し、当該領域（以下、「計測領域」と示す）の平均輝度を計測する。

　解析部２０２は、反射干渉検出用カメラ１１０から順次出力されてくる反射干渉画像を画像受信部２０１が受信すると、当該反射干渉画像における計測領域の平均輝度Ｉ（ｔ）を算出し、薬液投与前に予め取得されている計測領域の平均輝度（以下、「基礎となる平均輝度Ｉ(base)」と示す）に対する変化率ｄＩを算出する（ステップＳ１０３、特許請求の範囲の「解析ステップ」に相当）。なお、基礎となる平均輝度は、例えば薬液投与前に取得された計測領域の反射干渉画像から得られる平均輝度を用いてもよいし、細胞の種類ごとに予め初期値として記憶されている初期輝度を用いてもよい。このような基礎となる平均輝度は、記憶部２０３に記憶されており、解析部２０２は記憶部２０３から適時、基礎となる平均輝度を読み出して、変化率ｄＩを算出する。変化率ｄＩは、以下の式により算出される。

　　変化率ｄＩ（ｔ）＝｛Ｉ（ｔ）－Ｉ（base）｝／Ｉ（base）
　　Ｉ（ｔ）＝反射干渉の平均輝度（背景補正された値）
　　Ｉ(base)＝薬液投与前のＩ（ｔ）の平均値

　解析部２０２は、上記式によって算出される変化率ｄＩに基づいて細胞１０１の膜電位の変化を検出する。すなわち、解析部２０２は、所定の変化率ｄＩが算出されたとき、細胞１０１における膜電位に何らかの変化が検出されたと評価している。また、解析部２０２は、上記式によって算出される薬液投与前の平均的な輝度に対する変化率ｄＩ（％）を時間軸にプロットした、例えば図８（Ａ）や図８（Ｂ）に示すようなグラフを出力してもよい。すなわち、薬液投与前の輝度に対する変化率ｄＩ（％）をプロットしたグラフを、細胞１０１の膜電位の変化を示したグラフとして出力してもよい。

　また、本実施形態の膜電位変化検出装置１では、脱分極になると細胞１０１が透明部材１０２ａから離れ反射干渉画像が明るくなり、過分極になると細胞１０１が透明部材に近づき反射画像が暗くなるという相関関係に基づいている。したがって、変化率ｄＩのプラス方向への変化により細胞１０１の膜電位が脱分極になったことを検知し、変化率ｄＩのマイナス方向への変化により細胞１０１の膜電位が過分極になったことを検知することができる。また、薬液投与後の一定時間内におけるピーク（脱分極の場合は最大値、過分極の場合は最小値）を求めて、当該数値の大小から細胞１０１に投与した薬液濃度に対する判定も行うことができる。なお、この点については後段の測定例１および２の欄で述べる。

　膜電位変化検出装置１は、ひとつのウエルの解析が終了すると、次の計測を行うべきウエルの位置にＸＹステージ１１５を移動させ、細胞１０１の載置面１０２ｂに焦点を合わせて再び計測を開始する。これを繰り返し、各種の薬剤に対して細胞１０１の反応を測定する。

　（測定例１）
　ここでは、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）が収容された容器１０２を保持部１０３にセットし、当該ＣＨＯ細胞に脱分極を引き起こすＫＣｌ（薬品：塩化カリウム）を投与した場合に、反射干渉検出用カメラ１１０により取得される反射干渉画像と、解析部２０２により算出される平均輝度の変化率ｄＩ（パラメータ）とについて検証を行った。

　まず、反射干渉検出用カメラ１１０にて取得される、ＣＨＯ細胞にＫＣｌを投与する前、ＫＣｌを投与して５分後、ＫＣｌを投与して１０分後、およびＫＣｌを投与して１５分後の反射干渉画像について検証を行った。これによると、図９に示されるようにＣＨＯ細胞にＫＣｌを投与した後に、ＣＨＯ細胞が載置されている透明部材から離れる離反現象が起きて、反射干渉画像が明るくなっていることが観察できた（５分後の画像）。これにより、本実施形態の膜電位変化検出装置１では、細胞１０１の膜電位の変化を評価するパラメータ（接着に関するパラメータ）として、例えば「平均輝度の変化率ｄＩ」を算出し、当該パラメータの変化を検出することで、細胞１０１の膜電位が脱分極になったことを検出できることが確認できた。

　次に、当該ＣＨＯ細胞に、濃度の異なる（６．２５ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ）ＫＣｌをそれぞれ投与し、解析部２０２による平均輝度の変化率ｄＩ（パラメータ）の算出をそれぞれ行った。この結果、図１０に示されるようなグラフを得た。これによれば、細胞１０１の膜電位が脱分極になると、一過的に平均輝度の変化率ｄＩがプラス方向に変化することが確認できた。これにより、本実施形態の膜電位変化検出装置１では、図１０に示すように、解析部２０２によって一過的に平均輝度の変化率ｄＩがプラス方向に大きくなることが検出できるので、細胞１０１の膜電位が脱分極になったことを検出することができる。

　また、図１０のグラフからは、投与したＫＣｌの濃度に比例して平均輝度の変化率ｄＩがプラス方向に最大振幅が大きくなることが確認できた。そこで、平均輝度の変化率ｄＩのピーク時（図１０において５分少し経過したとき）におけるＫＣｌの濃度と平均輝度の変化率ｄＩとの関係をグラフ化すると、図１１に示すような、ＫＣｌ濃度が６．２５ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭと高くなるにつれ、ピーク時の平均輝度の変化率も＋８％、＋３５％、＋５５％、＋９５％と順に高くなる結果を得た。これにより、ピーク時の平均輝度の変化率と投与した薬品の濃度とには依存関係があることが確認できた。本実施形態の膜電位変化検出装置１では、投与した薬品の濃度に比例（濃度に依存）した平均輝度の変化率ｄＩが算出されるので、投与した薬品の濃度ごとに細胞１０１の膜電位の変化を評価することができる。このため、細胞１０１に対する薬効評価をする場合にも本実施形態の膜電位変化検出装置１を利用することが可能となる。

　（測定例２）
　ここでは、ＭＩＮ－６膵β細胞株（マウス由来膵β細胞株）を用いたカルシウムイオン依存性カリウムチャンネル（以下、「試料細胞」と示す）に作動性化合物を投与した場合に、反射干渉検出用カメラ１１０により取得される反射干渉画像と、解析部２０２により算出される平均輝度の変化率ｄＩ（パラメータ）とについて検証を行った。

　まず、反射干渉検出用カメラ１１０にて取得される、試料細胞に作動性化合物を投与する前、作動性化合物を投与した直後、および作動性化合物を投与して５分後の反射干渉画像について検証を行った。これによると、図１２に示されるように試料細胞に作動性化合物を投与した後に、試料細胞が載置されている透明部材に近づく接近現象が起きて、反射干渉画像が暗くなっていることが観察できた（作動性化合物した直後の画像）。これにより、本実施形態の膜電位変化検出装置１では、細胞１０１の膜電位の変化を評価するパラメータ（接着に関するパラメータ）として、例えば「平均輝度の変化率ｄＩ」を算出し、当該パラメータの変化を検出することで、細胞１０１の膜電位が過分極になったことを検出できることが確認できた。

　次に、当該試料細胞に、リガンド濃度の異なる（１００μＭ、２５μＭ、６．２５μＭ）作動性化合物をそれぞれ投与し、解析部２０２による平均輝度の変化率ｄＩ（パラメータ）の算出をそれぞれ行った。この結果、図１３に示されるようなそれぞれのグラフを得た。これによれば、細胞１０１の膜電位が過分極になると、一過的に平均輝度の変化率ｄＩがマイナス方向に変化することが確認できた。これにより、本実施形態の膜電位変化検出装置１では、図１３に示すように、解析部２０２によって一過的に平均輝度の変化率ｄＩがマイナス方向に大きくなることが検出できるので、細胞１０１の膜電位が過分極になったことを検出することができる。

　また、図１３のグラフを総じてみると、投与した作動性化合物の濃度に比例して平均輝度の変化率ｄＩがマイナス方向に最大振幅が大きくなることが確認できた。そこで、平均輝度の変化率ｄＩのピーク時（図１２において３００ミリ秒付近）における作動性化合物の濃度と平均輝度の変化率ｄＩとの関係をグラフ化すると、図１４に示すような、作動性化合物の濃度が１００μＭ、２５μＭ、６．２５μＭと高くなるにつれ、薬剤投与後の平均輝度の変化率ｄＩのマイナス方向への変化量も１０％、１７％、２３％、４２％、４９％、５５％と順に大きくなる結果を得た。これにより、ピーク時の平均輝度の変化率と投与した薬品の濃度とには依存関係があることが確認できた。本実施形態の膜電位変化検出装置１では、投与した薬品の濃度に比例（濃度に依存）した平均輝度の変化率ｄＩが算出されるので、投与した薬品の濃度ごとに細胞１０１の膜電位の変化を評価することができる。このため、細胞１０１に対する薬効評価をする場合にも本実施形態の膜電位変化検出装置１を利用することが可能となる。

　（第１実施形態の作用及び効果）
　続いて、以上まで説明した第１実施形態に係る膜電位変化検出装置１の作用及び効果について説明する。本実施形態の膜電位変化検出装置１によれば、反射干渉計測用光源１０６、保持部１０３、反射干渉検出用カメラ１１０、および解析部２０２を備えることにより、細胞１０１からの反射光をもとに細胞１０１と透明部材１０２ａとの接着に関するパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて細胞１０１の膜電位の変化を検出している。発明者らは、細胞が載置された透明部材と細胞との接着度合と、細胞の膜電位の変化との間に相関関係があることを発見した。本発明は、発見されたこのような相関関係を利用して、細胞の膜電位の変化を、細胞と透明部材との接着距離（接着度合）の変化として捉えていることに特徴がある。当該接着距離に基づく細胞１０１と透明部材１０２ａとの接着に関するパラメータは非侵襲的な方法で得られるので、細胞１０１の膜電位の変化をラベルすることなく非侵襲的に検出することが可能となる。

　また、上記膜電位変化検出装置１によれば、細胞１０１が脱分極および過分極になったときの細胞１０１の膜電位の変化を検出することができる。

　（第１実施形態の変形例）
　上記実施形態においては、細胞１０１の膜電位変化を評価するための解析対象となる計測領域として、細胞１０１の接着している領域を「計測領域」とする例を挙げて説明したがこれに限定されるものではない。例えば細胞１０１をコンフルエント（容器の面積に対して約８０％）に培養した被検体を用意し、測定開始時に得られた反射干渉画像の視野全体を計測領域として定めてもよい。また、測定開始時に得られた反射干渉画像から一定の輝度のしきい値や画像処理を用いて抽出した細胞１０１の存在する領域を計測領域として定めてもよい。

　上記実施形態においては、細胞１０１の膜電位変化を評価するパラメータとして、「平均輝度の変化率」を用いた例を挙げて説明したがこれに限定されるものではない。例えば細胞１０１の膜電位変化を評価するパラメータとして「接着面積の増減の変化」を用いることもできる。この場合、時系列に取得した反射干渉画像から一定の輝度のしきい値や画像処理を用いて抽出した細胞１０１の接着に相当する領域を計測領域として定めて、視野全体における計測領域の画素数を求める。この場合の接着面積の増減の変化率ｄＡは、以下の式により算出される。

　　変化率　ｄＡ（ｔ）＝｛Ａ（ｔ）－Ａ（base）}／Ａ（base）
　　Ａ（ｔ）＝反射干渉の各時間の接着領域の画素数
　　Ａ（base）＝薬液投与前のＡ（ｔ）の平均値

　解析部２０２は、上記式によって算出される変化率ｄＡに基づいて細胞１０１の膜電位の変化を検出する。すなわち、解析部２０２は、所定の変化率ｄＡが算出されたとき、細胞１０１における膜電位に何らかの変化が検出されたと評価してもよい。また、解析部２０２は、上記式によって算出される変化率ｄＡを時間軸にプロットしたグラフを、細胞１０１の膜電位の変化を示したグラフを出力してもよい。すなわち、薬液投与前の接着面積に対する変化率ｄＡ（％）をプロットしたグラフを、細胞１０１の膜電位の変化を示したグラフとして出力してもよい。これにより、膜電位変化検出装置１を使用する使用者に対して、細胞１０１における膜電位の変化を明示的に示すことができる。

　上述したように、本実施形態の膜電位変化検出装置１では、脱分極になると細胞１０１が透明部材１０２ａから離れ、過分極になると細胞１０１が透明部材に近づくという相関関係に基づいているので、変化率ｄＡのプラス方向への変化により膜電位の細胞１０１が脱分極になったことを検知し、変化率ｄＡのマイナス方向への変化により細胞１０１の膜電位が過分極になったことを検知することができる。また、薬液投与後の一定時間内におけるピーク（脱分極の場合は最大値、過分極の場合は最小値）を求めて、当該数値の大小から細胞１０１に投与した薬液濃度に対する判定も行うことができる点も同様である。

　［第２実施形態］
　本発明の第２実施形態について説明する。第２実施形態では、第１実施形態にはない構成についてのみ詳細な説明を行い、第１実施形態と同じ構成については同じ参照番号を付して詳細な説明を省略する。

　（膜電位変化検出装置４１の全体構成）
　まず、本発明の実施形態に係る膜電位変化検出装置４１の全体構成について、図１５を参照しながら説明する。図１５は、膜電位変化検出装置４１の全体構成を示す概要図である。図１５に示すように、膜電位変化検出装置４１は、画像取得部１０および処理部２０から構成されている。

　画像取得部１０は、保持部１０３（特許請求の範囲の「保持手段」に相当）、対物レンズ１０４、定量位相計測用光源１２１、照射光絞り部１２１Ｂ、反射干渉計測用光源１０６、ハーフミラー１０８、ダイクロイックミラー１２２、全反射ミラー１２３、反射干渉検出用カメラ１１０（特許請求の範囲の「反射干渉撮像手段」に相当）、回折型干渉光学系１２４、および定量位相検出用カメラ１２５（特許請求の範囲の「定量位相撮像手段」に相当）を備えている。ハーフミラー１０８は反射干渉計測用光源１０６からの光を細胞１０１へ導くための反射干渉入射用光学系であり、また、ダイクロイックミラー１２２は、反射干渉検出用カメラ１１０へ細胞１０１からの光を導くための反射干渉計測用光学系である。また、対物レンズ１０４およびハーフミラー１０８、ダイクロイックミラー１２２は、細胞１０１の同一範囲からの光を反射干渉検出用カメラ１１０および定量位相検出用カメラ１２５へ導くための共通光学系である。つまり、本実施形態では、反射干渉入射用光学系と反射干渉計測用光学系が共通光学系となっている。また、全反射ミラー１２３および回折型干渉光学系１２４は、定量位相検出用カメラ１２５へ光を導くための定量位相光学系である。反射干渉検出用カメラ１１０は、反射干渉計測用光源１０６から放射され、細胞１０１から反射される光を撮像することにより、反射干渉画像を生成する。定量位相検出用カメラ１２５は、定量位相計測用光源１２１から放射され、細胞１０１を透過する光を撮像することにより、定量位相画像を生成する。照射光絞り部１２１Ｂは、照明光を絞る手段である。照射光絞り部１２１Ｂとしては、ピンホールやアパーチャーが例示される。

　処理部２０は、画像位置合わせ部２１１（特許請求の範囲の「画像位置合わせ手段」に相当）、輪郭抽出部２１２（特許請求の範囲の「輪郭抽出手段」に相当）、輪郭適用部２１３（特許請求の範囲の「輪郭適用手段」に相当）、解析部２０２（特許請求の範囲の「解析手段」に相当）、および記憶部２０３を備えている。

　画像位置合わせ部２１１は、反射干渉画像と定量位相画像との間で、空間的な位置を一致させることにより、両画像の位置合わせを行う部分である。輪郭抽出部２１２は、定量位相画像に基づき、細胞１０１の範囲である輪郭を抽出する部分ある。輪郭適用部２１３は、輪郭抽出部２１２が抽出した輪郭を反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する部分である。解析部２０２は、輪郭適用後の反射干渉画像に基づいて、細胞１０１と透明部材１０２ａとの接着に関する細胞１０１ごとのパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて細胞１０１ごとの膜電位の変化を検出する部分である。図２は、以上のような機能的構成要素を備える処理部２０のハードウェア構成図である。当該ハードウェア構成についても第１実施形態の膜電位変化検出装置１と同様であるのでここではその説明を省略する。

　次に、図１５を参照しながら、画像取得部１０について詳細に説明する。定量位相計測について述べる。細胞１０１の入った容器１０２の上部に設置した、ハロゲンランプやキセノンランプなどの定量位相計測用光源１２１から放射された照明光は、ピンホールやアパーチャーなどの照明光絞り部１２１Ｂを通過することで点光源に近い照射光となり、細胞１０１の入った容器１０２を透過し、対物レンズ１０４にて集光される。なお、定量位相計測用光源１２１としては、ＬＥＤ（発光ダイオード）や半導体レーザー（レーザーダイオード）、ＳＬＤ（スーパールミネッセントダイオード）などの光源を用いてもよい。なお、レーザーやＳＬＤの場合には、光源サイズが十分小さいため、照明光絞り部１２１Ｂは不要になる。そして、ハーフミラー１０８を介し、定量位相像と反射干渉像を波長で分離するためのダイクロイックミラー１２２を透過して、更に全反射ミラー１２３を介して、位相計測のための回折型干渉光学系１２４にて物体光と参照光の干渉像を形成し、定量位相検出用カメラ１２５にて干渉縞画像が撮像される。なお、ダイクロイックミラー１２２はハーフミラーなどのビームスプリッタでもよく、この場合、ビームスプリッタと定量位相検出用カメラ１２５の間に定量位相検出に用いる波長を選択するためのフィルタを配置する。

　反射干渉計測について述べる。反射干渉計測用光源１０６から放射された照明光は、ハーフミラー１０８にて反射して、対物レンズ１０４を通って、測定対象となる細胞１０１を入れた容器１０２の底面側から入射する。ハーフミラーに限らず、照明光強度が十分ある場合には５：９５（反射：透過）や２０：８０（反射：透過）にするなど、反射比率を低減させたビームスプリッタを用いてもよい。また、波長によって反射率・透過率が異なるダイクロイックミラーを用いてもよい。容器１０２の底面の細胞１０１の接着面から得られる反射光は細胞１０１の接着距離に応じて干渉を生じ、得られた反射干渉光は再び対物レンズ１０４にて集光され、ハーフミラー１０８を介し、定量位相像と反射干渉像とを波長で分離するためのダイクロイックミラー１２２にて反射干渉像のみを反射して、反射干渉検出用カメラ１１０にて撮像される。なお、ダイクロイックミラー１２２の代わりにハーフミラーなどのビームスプリッタを用いる場合は、ビームスプリッタと反射干渉検出用カメラ１１０との間に反射干渉検出に用いる波長を選択するためのフィルタを配置すればよい。容器１０２の底面の細胞１０１の接着面から反射した光は、細胞１０１の接着距離に応じて干渉した光の振幅が異なり、明暗のコントラストとして撮影される。なお、定量位相像および反射干渉像は、共通の対物レンズ１０４を介して取得されるので、細胞１０１の撮像範囲は、定量位相計測および反射干渉計測においてほぼ同一範囲となる。

　定量位相画像を取得するカメラ１２５と反射干渉画像を取得するカメラ１１０は同じ性能、同じ画素分解能のカメラに限定する必要はない。それぞれのカメラに入射する光量や入射波長は互いに異なるので、それぞれに適した性能、空間分解能のカメラを用いてもよい。例えば定量位相検出用カメラ１２５には８３０ｎｍに感度が高く、画素サイズが大きめの感度優先のカメラを用い、反射干渉検出用カメラ１１０には可視域に感度が高く、画素サイズが小さめの空間分解能優先のカメラを利用するなどしてよい。このような場合に二つのカメラの空間座標を一致させる処理が必要となるが、これについては後段にて詳述する。

　定量位相計測と反射干渉計測を波長で区別できるように、反射干渉計測用光源１０６と定量位相計測用光源１２１のそれぞれの照明波長には、異なる波長域の光を用いても良い。ダイクロイックミラー１２２にて特定の波長で定量位相像と反射干渉像を分離選択することができる。したがって、定量位相計測と反射干渉計測で、クロストークなく同時刻の像を得ることができる。

　次に、図１６のフローチャートを更に参照しながら、処理部２０の機能および動作について説明する。最初に、定量位相検出用カメラ１２５にて参照光と細胞１０１を透過した物体光の干渉縞画像が得られる（ステップＳ２０１、特許請求の範囲の「定量位相撮像ステップ」に相当）。干渉縞画像から公知の演算方法を用いて定量的な位相画像を形成する。定量位相画像を得るためには、細胞１０１のない背景領域のオフセット補正および背景領域の視野におけるシェーディング補正を施し、背景部分は空間的に均一で、背景部の位相の値を０に補正し、細胞１０１の位相（光路長）の２次元マップを得る。

　一方で、ステップＳ２０１とともに、反射干渉検出用カメラ１１０にて細胞１０１の接着面の反射干渉画像が得られる（ステップＳ２０２、特許請求の範囲の「反射干渉撮像ステップ」に相当）。容器１０２の底面の基板上に接着している細胞１０１の容器１０２の底面の基板からの距離に応じて干渉光の振幅が異なり、反射干渉画像は明暗のコントラストとして撮影される。反射干渉画像の視野内の反射光のシェーディングを補正する。あわせて細胞１０１のない背景の値が時間的に変動しないように、時間ごとに背景部のオフセット補正を行う。これらの画像演算補正によって、空間的、時間的に変動の少ない定量位相画像および反射干渉画像を得ることができる。

　次に、定量位相画像および反射干渉画像の空間的位置補正が行われる（ステップＳ２０３、特許請求の範囲の「画像位置合わせステップ」に相当）。図１７は、画像位置合わせに用いる標本３０を示す。位置合わせの標本３０として、ガラス基板に格子３１が刻まれたマイクロスケールやドットパターンなどを用いる。マイクロスケールやドットパターンには２つのカメラで撮影したときに同じ位置が分かるように、少なくとも１か所以上に目印が付いていると操作が簡便である。図１７の例では、三角と丸の二つの目印が付いている。

　ここで、反射干渉側のカメラ１１０の像を定量位相の像に合わせて位置をずらす手順について詳細に説明する。まず、細胞１０１の標本の代わりにマイクロスケールまたはドットパターンを置き、反射干渉および定量位相のそれぞれの撮影用カメラで撮影する。次に、マイクロスケールまたはドットパターンを撮影して得られた反射干渉画像と定量位相画像をそれぞれ異なる疑似カラー（例えば反射干渉画像は緑、定量位相画像は赤など）で重ね合わせる。場合によっては画像の輝度を反転すると見やすくなる。続いて、反射干渉画像の格子像またはドット像を定量位相側の格子像またはドット像に合致させるために、重ね合わせた画像を見ながら、反射干渉画像に対して（１）拡大縮小倍率、（２）水平方向の移動量（画素数）、（３）垂直方向の移動量（画素数）、（４）回転角度、（５）回転方向、（６）左右反転などを微調整し、調整量を決定する。調整量は、重ね合わせて表示した格子像またはドット像が重なり、エッジが出なくなるような位置に決定されればよく、例えば、それぞれの格子像またはドット像が重なり合って緑色と赤色が黄色になるような位置で決定される。

　撮影した２つのカメラの像に空間歪があり、両者の空間歪のパターンが大きく異なる場合は、上述の（１）から（６）のデータだけで一律にすべての画素の位置を合致させることは難しい場合がある。その場合は視野内のすべての画素における移動量が異なるため、各々の画素に対して移動量を定める必要がある。具体的には、格子像の各交点またはドット像の各ドットの中心座標が２つのカメラで一致するように、各点のずらし量を決定する。格子またはドットの存在する座標以外の空間座標は補間することによってずらし量を決定する。このようにして空間的に全画素（全座標）について１画素単位でずらし量を記憶したテーブルを作成して、位置合わせデータとする。得られた位置合わせデータをファイルで保存する。新規に測定を行い画像を取得したときに、ファイルで保存した位置合わせデータを用いて、画像間の位置合わせを行い、位置を補正した画像を出力する。また、新規に測定を行い取得した画像データをファイルに保存するときには、位置合わせデータを画像データと一緒にファイルに保存することが好ましい。こうすることによって、画像ファイルを呼び出した時にも、画像を新規に取得した時の最も適切であった位置合わせデータを援用して、当該呼び出した画像を補正することができる。

　なお、以上のような位置合わせは定量位相や反射干渉の計測のたびに行う必要はなく、同じ光学系を利用するのであれば、使用環境や振動の影響による位置ずれを考慮して、例えば１カ月に１回程度の頻度で行えば良い。また、観察側の光学系に観察用のフィルタを選択する部品（例えば電動フィルタホイールなど）が装着されている場合は、位置合わせは使用するフィルタごとに行うことが望ましい。なぜなら、使用するフィルタの傾きや平行度によって像の位置ずれ量や位置ずれの方向が異なるからである。

　なお、繰り返しとなるため説明は省略するが、以上とは逆に、定量位相側のカメラ１２５の像を反射干渉の像に合わせて位置をずらす場合にも、上述の手順を適宜適用することができる。また、以上の手順は、自動化された画像処理によって、人の手に寄らずに、行うことができる。

　図１６に戻り、ステップＳ２０３の位置合わせの後に、細胞１０１の輪郭領域を抽出する処理（以下、「セグメンテーション」ともいう。）が行われる（ステップＳ２０４およびＳ２０５、特許請求の範囲の「輪郭抽出ステップ」に相当）。

　まず、図１８に示すように、同時刻に撮像され、位置合わせが行われた後の定量位相画像および反射干渉画像のうち、定量位相画像から個々の細胞１０１の輪郭となる領域を画像処理により検出する（ステップＳ２０４：輪郭抽出ステップ）。つまり、定量位相画像では、細胞１０１のない背景となる溶液を通る光に対して細胞１０１を通る光は、細胞１０１の屈折率が溶液の屈折率よりも大きいために、光路長が長くなる。そのため、細胞１０１の存在する領域の画素の位相の値は背景よりも大きな値となる。そこで、適正な閾値または空間フィルタ処理を用いることにより、人の手に寄らず自動的に、背景と細胞１０１を分離することができる。そして、一つ一つの細胞１０１に対応した輪郭を決定し、それぞれの細胞１０１の占める領域に対応する画素座標の領域を決定することができる。

　次に、ステップＳ２０４で得られた個々の細胞１０１の輪郭領域の画素座標を空間座標の一致した反射干渉画像に適応させ、つまりステップＳ２０４で得られたセグメンテーション領域を反射干渉画像にコピーすることにより、定量位相画像で決定された個々の細胞１０１の輪郭領域を反射干渉画像に当てはめる（ステップＳ２０５、特許請求の範囲の「輪郭適用ステップ」に相当）。このようにすることで、図１８に示すように、定量位相画像と反射干渉画像の両方の画像Ａ，Ｂに対して同じ輪郭領域を決定することができる。また、一つ一つの細胞に対応した輪郭を決定し、それぞれの細胞の占める領域に対応する画素座標の領域を決定することができる。

　図１６に戻り、次に、解析部２０２は、定量位相画像で決定された個々の細胞１０１の輪郭領域を反射干渉画像に当てはめた画像（以下、「合成画像」と示す）を用いて、個々の細胞１０１と透明部材１０２ａとの接着に関するパラメータを算出する（ステップＳ２０６、特許請求の範囲の「解析ステップ」に相当）。本実施形態の処理が第１実施形態における処理と異なる点は、第１実施形態の解析部２０２が、反射干渉画像全体から細胞１０１の接着している領域を計測領域としているのに対し、本実施形態の解析部２０２は、個々の細胞の領域を計測領域としている点である。

　本実施形態では、個々の細胞１０１の膜電位の変化を評価するパラメータ（特許請求の範囲の「接着に関するパラメータ」に相当）として、「平均輝度の変化率」を算出している。解析部２０２は、上述したように個々の細胞の領域を計測領域としての平均輝度を計測する。

　解析部２０２は、画像位置合わせ部２１１から出力される順次出力されてくる合成画像を受信すると、当該合成画像における個々の計測領域の平均輝度Ｉ（ｔ）を算出し、薬液投与前に予め取得されている個々の計測領域の平均輝度（以下、「基礎となる平均輝度Ｉ(base)」と示す）に対する変化率ｄＩを算出する。なお、基礎となる平均輝度は、例えば薬液投与前に取得された個々の計測領域の合成画像から得られる平均輝度を用いてもよいし、細胞の種類ごとに予め初期値として記憶されている初期輝度を用いてもよい。このような基礎となる平均輝度は、記憶部２０３に記憶されており、解析部２０２は記憶部２０３から適時、基礎となる平均輝度を読み出して、変化率ｄＩを算出する。変化率ｄＩは、以下の式により算出される。

　　変化率ｄＩ（ｔ）＝｛Ｉ（ｔ）－Ｉ（base）｝／Ｉ（base）
　　Ｉ（ｔ）＝反射干渉の平均輝度（背景補正した値）
　　Ｉ(base)＝薬液投与前のＩ（ｔ）の平均値

　解析部２０２は、上記式によって算出される変化率ｄＩに基づいて個々の計測領域に対する細胞１０１の膜電位の変化を検出する。すなわち、解析部２０２は、個々の計測領域において所定の変化率ｄＩが算出されたとき、個々の細胞１０１における膜電位に何らかの変化が検出されたと評価している。また、解析部２０２は、上記式によって算出される変化率ｄＩを時間軸にプロットした、例えば図８（Ａ）や図８（Ｂ）に示すようなグラフを出力してもよい。また、薬液投与前の接着面積に対する変化率ｄＩ（％）をプロットしたグラフを、細胞１０１の膜電位の変化を示したグラフとして出力してもよい。なお、上記グラフを出力する際には、個々の計測領域ごと、すなわち個々の細胞ごとに出力することが好ましい。

　また、本実施形態の膜電位変化検出装置４１では、脱分極になると細胞１０１が透明部材１０２ａから離れ反射干渉画像が明るくなり、過分極になると細胞１０１が透明部材に近づき反射画像が暗くなるという相関関係に基づいている。したがって、変化率ｄＩのプラス方向への変化により膜電位の個々の細胞１０１が脱分極になったことを検知し、変化率ｄＩのマイナス方向への変化により個々の細胞１０１の膜電位が過分極になったことを検知することができる。また、薬液投与後の一定時間内におけるピーク（脱分極の場合は最大値、過分極の場合は最小値）を求めて、当該数値の大小から個々の細胞１０１に投与した薬液濃度に対する判定も行うことができる。

　（第２実施形態の作用及び効果）
　第２実施形態に係る膜電位変化検出装置４１では、定量位相計測用光源１２１、反射干渉計測用光源１０６、反射干渉検出用カメラ１１０、定量位相検出用カメラ１２５、および解析部２０２を備えることにより、細胞１０１の接着に関する情報、また細胞１０１の面積、光学的厚さに関する情報を同時に取得することができるので、細胞１０１と透明部材１０２ａとの接着に関するパラメータのバリエーションを増やすことができる。また、自動化された処理により細胞１０１のセグメンテーションが実行されるので、個々の細胞１０１に対してデータを取得することが容易に可能となる。また、薬液分注後の細胞の反応が早く、できるだけ短いインタバルで計測を行いたい場合には、本実施形態に係る膜電位変化検出装置４１のような反射干渉画像と定量位相画像を同時に取得する構成が有効である。

　（第２実施形態の変形例）
　上記第２実施形態においては、定量位相画像から取得できる細胞の輪郭を反射干渉画像にコピー（セグメンテーション）する例を挙げて説明したがこれに限定されるものではない。例えば、セグメンテーションの工程を経なくても、細胞１０１の膜電位の変化を検出することが可能である。すなわち、定量位相画像から一定のしきい値にて得られる細胞１０１の存在を示す領域全体を計測領域とし、この計測領域における平均的な輝度を用いて細胞１０１の膜電位の変化を検出してもよい。なお、計測領域の平均輝度に対する変化率ｄＩを算出することについては上述したとおりなので、ここではその説明を省略する。

　［第３実施形態］
　本発明の第３実施形態について説明する。第３実施形態では、第１実施形態にはない構成についてのみ詳細な説明を行い、第１実施形態と同じ構成については同じ参照番号を付して詳細な説明を省略する。

　（膜電位変化検出装置６１の全体構成）
　まず、本発明の実施形態に係る膜電位変化検出装置６１の全体構成について、図１９を参照しながら説明する。図１９は、膜電位変化検出装置６１の全体構成を示す概要図である。図１９に示すように、膜電位変化検出装置６１は、画像取得部１０および処理部２０から構成されている。

　画像取得部１０は、保持部１０３（特許請求の範囲の「保持手段」に相当）、対物レンズ１０４、定量位相計測用光源１２１、定量位相シャッタ１２１Ａ（特許請求の範囲の「定量位相光量調整手段」に相当）、照明光絞り部１２１Ｂ、反射干渉計測用光源１０６、反射干渉シャッタ１０６Ａ（特許請求の範囲の「反射干渉光量調整手段」に相当）、反射干渉照明用光学系としてのハーフミラー１０８、全反射ミラー１３１、回折型干渉光学系１３２、参照光カット装置１３３およびカメラ１３４（特許請求の範囲の「反射干渉撮像手段」に相当）を備えている。

　処理部２０は、画像受信部２２１、輪郭抽出部２１２（特許請求の範囲の「輪郭抽出手段」に相当）、輪郭適用部２１３（特許請求の範囲の「輪郭適用手段」に相当）、解析部２０２、および記憶部２０３を備えている。画像受信部２２１は、カメラ１３４の撮像により生成された反射干渉画像および定量位相画像を受信する部分である。輪郭抽出部２１２は、定量位相画像に基づき、細胞１０１の範囲である輪郭を抽出する部分である。輪郭適用部２１３は、輪郭抽出部２１２が抽出した輪郭を反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する部分である。解析部２０２は、輪郭適用後の反射干渉画像に基づいて、細胞１０１と透明部材１０２ａとの接着に関する細胞１０１ごとのパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて細胞１０１ごとの膜電位の変化を検出する部分である。図２は、以上のような機能的構成要素を備える処理部２０のハードウェア構成図である。当該ハードウェア構成についても第１実施形態の膜電位変化検出装置１と同様であるのでここではその説明を省略する。

　次に、図１９を参照しながら、画像取得部１０について詳細に説明する。反射干渉シャッタ１０６Ａは、ハロゲンランプやキセノンランプなどの反射干渉計測用光源１０６から放射される光の光量を調整する。定量位相シャッタ１２１Ａは、ハロゲンランプやキセノンランプなどの定量位相計測用光源１２１から放射される光の光量を調整する。なお、ハロゲンランプやキセノンランプなどの広い波長範囲にわたって放射感度を有する光源であれば、７００ｎｍ～２５００ｎｍの近赤外領域の光を照明光として用いることが可能であり、細胞１０１に対する毒性を低減できる。ハロゲンランプやキセノンランプなどの電球系光源を、光源として用いた場合、光量や波長などの安定性を考慮すると、測定中は光源自体をＯＮ／ＯＦＦせずに光源をＯＮにしておいたほうがよい。そのため、反射干渉シャッタ１０６Ａや定量位相シャッタ１２１Ａが必要となる。ただし、ＬＥＤ（発光ダイオード）や半導体レーザー（レーザーダイオード)、ＳＬＤ（スーパールミネッセントダイオード）などの半導体系光源を光源として用いた場合、光源自体をＯＮ／ＯＦＦすることで反射干渉計測と定量位相計測との切り替えを行ってもよい。この場合、図２４に示すように、反射干渉計測用光源１０６のＯＮ/ＯＦＦによる切り替えにより、反射干渉計測用光源１０６から放射される光の光量を調整し、且つ定量位相計測用光源１２１のＯＮ/ＯＦＦによる切り替えにより、定量位相計測用光源１２１から放射される光の光量を調整する光源制御部２２５を備えればよい。そして、図１９に示す実施形態における画像取得部１０から反射干渉シャッタ１０６Ａ、定量位相シャッタ１２１Ａ、および照明光絞り部１２１Ｂをなくせばよい。

　カメラ１３４は、反射干渉計測用光源１０６から放射され、細胞１０１から反射される反射光を撮像することにより、反射干渉画像を生成するとともに、定量位相計測用光源１２１から放射された照射光が、ピンホールやアパーチャーなどの照明光絞り部１２１Ｂを通過することで点光源に近い照射光となり、細胞１０１を透過する透過光を撮像することにより、定量位相画像を生成する。後述するように、反射干渉画像を生成する際には、定量位相シャッタ１２１Ａが定量位相計測用光源１２１からの光を遮光した上で、カメラ１３４が反射光を撮像する。また、定量位相画像を生成する際には、反射干渉シャッタ１０６Ａが反射干渉計測用光源１０６からの光を遮光した上で、カメラ１３４が透過光を撮像する。以上により、カメラ１３４は、反射干渉計測および定量位相計測に共通の一つのカメラとして、時間的に互いに排他的に両計測を行うこととなる。

　回折型干渉光学系１３２は、定量位相画像を生成するために、細胞１０１からの透過光を物体光および参照光に分離して干渉させる。参照光カット装置１３３は、回折型干渉光学系１３２において参照光が通る光路上に設置され、反射干渉画像を生成する際に、参照光を遮光する。

　定量位相計測について述べる。細胞１０１の入った容器１０２の上部に設置した定量位相計測用光源１２１から放射された照明光は、細胞１０１の入った容器１０２を透過し、対物レンズ１０４にて集光される。そして、ハーフミラー１０８を介し、更に全反射ミラー１３１を介して、位相計測のための回折型干渉光学系１３２にて物体光と参照光の干渉像を形成し、カメラ１３４にて干渉縞画像が撮像される。

　反射干渉計測について述べる。反射干渉計測用光源１０６から放射された照明光は、ハーフミラー１０８にて反射して、対物レンズ１０４を通って、測定対象となる細胞１０１を入れた容器１０２の底面側から入射する。反射干渉照明用光学系としては、ハーフミラーに限らず、照明光強度が十分ある場合には５：９５（反射：透過）や２０：８０（反射：透過）にするなど、反射比率を低減させたビームスプリッタを用いてもよい。また、波長によって反射率・透過率が異なるダイクロイックミラーを用いてもよい。容器１０２の底面の細胞１０１の接着面から得られる反射光は細胞１０１の接着距離に応じて干渉を生じ、得られた反射干渉光は再び対物レンズ１０４にて集光され、ハーフミラー１０８を介し、更に全反射ミラー１３１を介して、カメラ１３４にて撮像される。容器１０２の底面の細胞１０１の接着面から反射した光は、細胞１０１の接着距離に応じて干渉した光の振幅が異なり、明暗のコントラストとして撮影される。なお、定量位相像および反射干渉像は、共通の対物レンズ１０４を介して取得されるので、細胞１０１の撮像範囲は、定量位相計測および反射干渉計測においてほぼ同一範囲となる。

　第３実施形態は、定量位相画像および反射干渉画像を一つのカメラ１３４を用いて、交互に時間差を置いて取得することを特徴の一つとする。このためには、定量位相計測用光源１２１および反射干渉計測用光源１０６がそれぞれの照明光を照射するタイミングにおいて互いに排他的に照明を行う必要がある。そこで、定量位相計測用光源１２１および反射干渉計測用光源１０６のそれぞれの照射口に光の照射・遮断を行うための機械シャッタ１２１Ａ，１０６Ａを備える。あわせて定量位相画像を作成するための回折型干渉光学系１３２の内部に、参照光カット装置１３３を備える。

　回折型干渉光学系１３２は定量位相画像を作成するための光学系であり、定量位相計測用光源１２１にて照明された透過照明像から回折素子１３２Ａを通して物体光と参照光を分離してそれぞれ取り出し、干渉させる役目を果たす。また、定量位相像と反射干渉像はいずれも同じ回折型干渉光学系１３２を通るため、反射干渉画像を取り出すためには、回折素子１３２Ａを通ることにより分離された参照光をカットするための装置が必要となり、本実施形態では参照光カット装置１３３を備えている。

　参照光カット装置１３３は、例えば参照光側の光路１３２Ｂ上に設けた機械シャッタとして構成することができる。図２０は、参照光カット装置１３３として機能する参照光シャッタ１３３Ａを示す図である。図２０（Ａ）は、定量位相画像撮像時の参照光シャッタ１３３Ａの動きを示す。定量位相画像撮像時には、回折素子１３２Ａにより分離された後に、ピンホール１３３Ｂを通る物体光およびピンホール１３３Ｃを通る参照光の両方が必要であるため、参照光シャッタ１３３Ａはピンホール１３３Ｃを遮ることなく、物体光および参照光はピンホール１３３Ｂおよび１３３Ｃを通ってカメラ１３４に到達する。一方、図２０（Ｂ）は、反射干渉画像撮像時の参照光シャッタ１３３Ａの動きを示す。反射干渉画像撮像時には、回折素子１３２Ａにより分離された後にピンホール１３３Ｂを通る物体光は必要であるが、ピンホール１３３Ｃを通る参照光は不要である。このため、参照光シャッタ１３３Ａはピンホール１３３Ｃを遮ることにより参照光を遮光し、物体光のみがピンホール１３３Ｂを通ってカメラ１３４に到達する。

　図２１は、定量位相シャッタ１２１Ａ、参照光カット装置１３３、カメラ１３４による定量位相撮像、反射干渉シャッタ１０６Ａ、およびカメラ１３４のそれぞれの動作にかかるタイミングチャートに示す。定量位相画像と反射干渉画像は時系列にお互い排他的に照明と画像取得を行う。具体的には、定量位相画像を取得する時は、定量位相シャッタ１２１Ａが開口し、反射干渉シャッタ１０６Ａが閉じる。逆に反射干渉画像を取得する時には、反射干渉シャッタ１０６Ａが開口し、定量位相シャッタ１２１Ａが閉じるという具合である。同時に、定量位相画像を取得するタイミングにおいては、回折型干渉光学系１３２の回折素子１３２Ａによって得られる物体光と参照光のうち、参照光側に設けた参照光カット装置１３３が開口し、カメラ１３４にて物体光と参照光の干渉像が結像することによって定量位相画像を得る。一方、反射干渉画像を取得するタイミングにおいては、回折素子１３２Ａによって得られた参照光は不要であるので、参照光側に設けた参照光カット装置１３３が閉じて、物体光のみが反射干渉画像としてそのままカメラ１３４に結像する。このように定量位相画像と反射干渉画像とを時間的に交互に取得して２つの画像をペアとして同時刻の画像として扱う。

　次に、図２２のフローチャートを更に参照しながら、処理部２０の機能および動作について説明する。最初に、カメラ１３４にて参照光と細胞１０１を透過した物体光の干渉縞画像が得られる（ステップＳ３０１、特許請求の範囲の「撮像ステップ」に相当）。干渉縞画像から公知の演算方法を用いて定量的な位相画像を形成する。定量位相画像を得るためには、細胞１０１のない背景領域のオフセット補正および背景領域の視野におけるシェーディング補正を施し、背景部分は空間的に均一で、背景部の位相の値を０に補正し、細胞１０１の位相（光路長）の２次元マップを得る。

　一方で、ステップＳ１０１とともに、カメラ１３４にて細胞１０１の接着面の反射干渉画像が得られる（ステップＳ３０２、特許請求の範囲の「撮像ステップ」に相当）。容器１０２の底面に接着している細胞１０１の容器１０２の底面からの距離に応じて干渉光の振幅が異なり、反射干渉画像は明暗のコントラストとして撮影される。反射干渉画像の視野内の反射光のシェーディングを補正する。あわせて細胞１０１のない背景の値が時間的に変動しないように、時間ごとに背景部のオフセット補正を行う。これらの画像演算補正によって、空間的、時間的に変動の少ない定量位相画像および反射干渉画像を得ることができる。

　ステップＳ３０１およびステップＳ３０２にて撮像および補正された両画像（定量位相画像および反射干渉画像）が処理部２０に入力される（ステップＳ３０３）。

　次に、ステップＳ３０３にて入力された両画像に対して、細胞１０１の輪郭領域を抽出する処理（以下、「セグメンテーション」ともいう。）が行われる（ステップＳ３０４およびＳ３０５、特許請求の範囲の「輪郭抽出ステップ」および「輪郭適用手段」に相当）。

　まず、図２３に示すように、同一観察位置および同時刻に撮像された定量位相画像および反射干渉画像のうち、定量位相画像から個々の細胞１０１の輪郭となる領域を画像処理により検出する（ステップＳ３０４、図２３の画像Ａ、特許請求の範囲の「輪郭抽出ステップ」に相当）。つまり、定量位相画像では、細胞１０１のない背景となる溶液を通る光に対して細胞１０１を通る光は、細胞１０１の屈折率が溶液の屈折率よりも大きいために、光路長が長くなる。そのため、細胞１０１の存在する領域の画素の位相の値は背景よりも大きな値となる。そこで、適正な閾値または空間フィルタ処理を用いることにより、人の手に寄らず自動的に、背景と細胞１０１を分離することができる。そして、一つ一つの細胞１０１に対応した輪郭を決定し、それぞれの細胞１０１の占める領域に対応する画素座標の領域を決定することができる。

　次に、ステップＳ３０４で得られた個々の細胞１０１の輪郭領域の画素座標を空間座標の一致する反射干渉画像に適応させ、つまりステップＳ３０４で得られたセグメンテーション領域を反射干渉画像にコピーすることにより、定量位相画像で決定された個々の細胞１０１の輪郭領域を反射干渉画像に当てはめる（ステップＳ３０５、図２３の画像Ｂ、特許請求の範囲の「輪郭適用ステップ」に相当）。このようにすることで、図２３に示すように、定量位相画像と反射干渉画像の両方の画像Ａ，Ｂに対して同じ輪郭領域を決定することができる。また、一つ一つの細胞に対応した輪郭を決定し、それぞれの細胞の占める領域に対応する画素座標の領域を決定することができる。

　解析部２０２が、定量位相画像で決定された個々の細胞１０１の輪郭領域を反射干渉画像に当てはめた画像（以下、「合成画像」と示す）を用いて、個々の計測領域の「平均輝度の変化率」を算出し、この平均輝度の変化率ｄＩに基づいて個々の計測領域に対する細胞１０１の膜電位の変化を検出する（ステップＳ３０６、特許請求の範囲の「解析ステップ」に相当）については、第２実施形態と同様であるので、ここではその説明を省略する。また、個々の細胞に対して薬液投与後の一定時間内におけるピーク（脱分極の場合は最大値、過分極の場合は最小値）を求めて、これらの数値の大小から薬物濃度の判定をそれぞれ行うことができる点についても同様である。

　（第３実施形態の作用及び効果）
　第３実施形態に係る膜電位変化検出装置６１では、定量位相計測用光源１２１、定量位相シャッタ１２１Ａ、反射干渉計測用光源１０６、反射干渉シャッタ１０６Ａ、およびカメラ１３４備えることにより、細胞１０１の接着に関する情報、また細胞１０１の面積、光学的厚さに関する情報を同時に取得することができるので、細胞１０１と透明部材１０２ａとの接着に関するパラメータのバリエーションを増やすことができる。また、自動化された処理により細胞１０１のセグメンテーションが実行されるので、個々の細胞１０１に対してデータを取得することが容易に可能となる。

　また、第３実施形態の膜電位変化検出装置６１は、第２実施形態に係る膜電位変化検出装置４１と比べて定量位相画像および反射干渉画像を取得するためのカメラが１台で済むので低コスト化を図ることが可能であり、かつ２台のカメラの位置合わせの必要がないことにメリットがある。また、第３実施形態の膜電位変化検出装置６１は、薬液投与に対して細胞の応答が比較的ゆっくりであり、定量位相画像と反射干渉画像とを順次に取得する場合の時間間隔であっても変化が検出できる用途に利用することが有用である。

　１，４１，６１…膜電位変化検出装置、１０…画像取得部、２０…処理部、１０１…細胞、１０２…容器、１０２ａ…透明部材、１０２ｂ…載置面、１０２ｃ…底面、１０２ｄ…反射防止コート、１０３…保持部、１０４…対物レンズ、１０６…反射干渉計測用光源、１０６Ａ…反射干渉シャッタ、１０７…リングスリット、１０８…ハーフミラー、１１０…反射干渉検出用カメラ、１１５…ＸＹステージ、１１７…ディスペンサ、１２１…定量位相計測用光源、１２１Ａ…定量位相シャッタ、１２１Ｂ…照明光絞り部、１２２…ダイクロイックミラー、１２３，１３１…全反射ミラー、１２４…回折型干渉光学系、１２５…定量位相検出用カメラ、１３２…回折型干渉光学系、１３２Ａ…回折素子、１３３…参照光カット装置、１３３Ａ…参照光シャッタ、１３３Ｂ，１３３Ｃ…ピンホール、１３４…カメラ、２０１，２２１…画像受信部、２０２…解析部、２０３…記憶部、２１１…画像位置合わせ部、２１２…輪郭抽出部、２１３…輪郭適用部、２２５…光源制御部。

　本発明は、ラベルすることなく非侵襲的な方法で細胞の膜電位の変化を検出することが可能な膜電位変化検出装置および膜電位変化検出方法を提供する。

Claims

　反射干渉計測用光源と、
　細胞が載置された透明部材を保持する保持手段と、
　前記反射干渉計測用光源から放射され、前記透明部材を介して前記細胞から反射される光を撮像することにより、反射干渉画像を生成する反射干渉撮像手段と、
　前記反射干渉画像から前記細胞と前記透明部材との接着に関するパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて前記細胞の膜電位の変化を検出する解析手段と、を備えている膜電位変化検出装置。
　前記解析手段は、脱分極になると前記細胞が前記透明部材から離れ、過分極になると前記細胞が前記透明部材に近づくという相関関係に基づいて、前記細胞の前記膜電位の変化を検出する、請求項１に記載の膜電位変化検出装置。
　前記反射干渉計測用光源から放射され前記細胞から反射される光が集光される対物レンズを更に備えており、
　前記対物レンズと前記透明部材とは空気層を介して配置されている、請求項１または２に記載の膜電位変化検出装置。
　前記透明部材の前記載置面とは反対側の面は、反射防止コートが施されている、請求項３に記載の膜電位変化検出装置。
　前記対物レンズの前記反射干渉計測用光源側の開口絞りと共役な位置に配置されているリング状のスリットを更に備えている、請求項３または４に記載の膜電位変化検出装置。
　定量位相計測用光源と、
　前記定量位相計測用光源から放射され前記細胞を透過する光を撮像することにより、定量位相画像を生成する定量位相撮像手段と、を更に備えている、請求項１～５の何れか１項に記載の膜電位変化検出装置。
　前記反射干渉画像と前記定量位相画像との間で、空間的な位置を一致させることにより、両画像の位置合わせを行う画像位置合わせ手段と、
　前記定量位相画像に基づき、前記細胞の輪郭を抽出する輪郭抽出手段と、
　前記輪郭抽出手段が抽出した前記輪郭を前記反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する輪郭適用手段と、を更に備えており、
　前記解析手段は、前記輪郭適用後の反射干渉画像に基づいて、前記細胞と前記透明部材との接着に関する細胞ごとのパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて細胞ごとの膜電位の変化を検出する、請求項６に記載の膜電位変化検出装置。
　前記反射干渉計測用光源から放射される光の光量を調整する反射干渉光量調整手段と、
　定量位相計測用光源と、
　前記定量位相計測用光源から放射される光の光量を調整する定量位相光量調整手段と、を更に備えており、
　前記反射干渉撮像手段は、前記反射干渉計測用光源から放射され、細胞から反射される反射光を撮像することにより、反射干渉画像を生成するとともに、前記定量位相計測用光源から放射され、前記細胞を透過する透過光を撮像することにより、定量位相画像を生成し、
　前記反射干渉画像を生成する際に、前記定量位相光量調整手段が前記定量位相計測用光源からの光を遮光し、前記反射干渉撮像手段が前記反射光を撮像し、
　前記定量位相画像を生成する際に、前記反射干渉光量調整手段が前記反射干渉計測用光源からの光を遮光し、前記反射干渉撮像手段が前記透過光を撮像する、請求項１～５の何れか１項に記載の膜電位変化検出装置。
　前記反射干渉光量調整手段は、前記反射干渉計測用光源から放射される光の光量を調整するシャッタであり、
　前記定量位相光量調整手段は、前記定量位相計測用光源から放射される光の光量を調整するシャッタである、
　ことを特徴とする請求項８に記載の膜電位変化検出装置。
　前記反射干渉光量調整手段は、前記反射干渉計測用光源のＯＮ/ＯＦＦによる切り替えにより、前記反射干渉計測用光源から放射される光の光量を調整し、
　前記定量位相光量調整手段は、前記定量位相計測用光源のＯＮ/ＯＦＦによる切り替えにより、前記定量位相計測用光源から放射される光の光量を調整する、
　ことを特徴とする請求項８に記載の膜電位変化検出装置。
　前記定量位相画像に基づき、前記細胞の輪郭を抽出する輪郭抽出手段と、
　前記輪郭抽出手段が抽出した前記輪郭を前記反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する輪郭適用手段と、を更に備えており、
　前記解析手段は、前記輪郭適用後の反射干渉画像に基づいて、前記細胞と前記透明部材との接着に関する細胞ごとのパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて細胞ごとの膜電位の変化を検出する、請求項８～１０の何れか１項に記載の膜電位変化検出装置。
　反射干渉撮像手段が、反射干渉計測用光源から放射され、細胞が載置された透明部材を介して前記細胞から反射される光を撮像することにより、反射干渉画像を生成する反射干渉撮像ステップと、
　解析手段が、前記反射干渉画像から前記細胞と前記透明部材との接着に関するパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて、前記細胞の膜電位の変化を検出する解析ステップと、を含んでいる膜電位変化検出方法。
　反射干渉撮像手段が、反射干渉計測用光源から放射され、細胞が載置された透明部材を介して前記細胞から反射される光を撮像することにより、反射干渉画像を生成する反射干渉撮像ステップと、
　定量位相撮像手段が、定量位相計測用光源から放射され、細胞を透過する光を撮像することにより、定量位相画像を生成する定量位相撮像ステップと、
　画像位置合わせ手段が、前記反射干渉画像と前記定量位相画像との間で、空間的な位置を一致させることにより、両画像の位置合わせを行う画像位置合わせステップと、
　輪郭抽出手段が、前記定量位相画像に基づき、前記細胞の輪郭を抽出する輪郭抽出ステップと、
　輪郭適用手段が、前記輪郭抽出手段が抽出した前記輪郭を前記反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する輪郭適用ステップと、
　前記解析手段が、前記輪郭適用後の反射干渉画像に基づいて、前記細胞と前記透明部材との接着に関する細胞ごとのパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて細胞ごとの膜電位の変化を検出する解析ステップと、
　を含んでいる膜電位変化検出方法。
　撮像手段が、反射干渉計測用光源から放射され、細胞から反射される反射光を撮像することにより、反射干渉画像を生成するとともに、定量位相計測用光源から放射され、前記細胞を透過する透過光を撮像することにより、定量位相画像を生成する撮像ステップと、
　輪郭抽出手段が、前記定量位相画像に基づき、前記細胞の輪郭を抽出する輪郭抽出ステップと、
　輪郭適用手段が、前記輪郭抽出手段が抽出した前記輪郭を前記反射干渉画像に適用することにより、輪郭適用後の反射干渉画像を生成する輪郭適用ステップと、
　前記解析手段が、前記輪郭適用後の反射干渉画像に基づいて、前記細胞と前記透明部材との接着に関する細胞ごとのパラメータを算出し、当該パラメータの変化に基づいて細胞ごとの膜電位の変化を検出する解析ステップと、
　を含んでおり、
　前記反射干渉画像を生成する際に、定量位相光量調整手段が前記定量位相計測用光源からの光を遮光し、前記撮像手段が前記反射光を撮像し、
　前記定量位相画像を生成する際に、反射干渉光量調整手段が前記反射干渉計測用光源からの光を遮光し、前記撮像手段が前記透過光を撮像する、
　ことを特徴とする膜電位変化検出方法。