WO2011111785A1 - 反射光強度測定用積層構造体、反射光測定用積層構造体を含んでなる装置、並びに薄膜の膜厚及び／又は質量及び／又は粘度測定方法 - Google Patents

反射光強度測定用積層構造体、反射光測定用積層構造体を含んでなる装置、並びに薄膜の膜厚及び／又は質量及び／又は粘度測定方法 Download PDF

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惠雄 岡畑
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    • G01N2021/7769—Measurement method of reaction-produced change in sensor
    • G01N2021/7779—Measurement method of reaction-produced change in sensor interferometric

Definitions

  • the present invention relates to a laminated structure for measuring reflected light intensity, a device comprising the laminated structure for measuring reflected light, and a method for measuring the thickness and / or mass and / or viscosity of a thin film.
  • a method for measuring the thickness of a thin film existing on a substrate having high light reflectivity a method using white light interference is known. Since the reflected light on the surface of the thin film and the reflected light on the interface between the thin film and the substrate interfere with each other, the reflected light intensity periodically increases or decreases depending on the wavelength. By theoretically fitting this fringe pattern, film thickness measurement on the order of nm to mm can be optically performed. This may be referred to as an optical interference film thickness measurement method, an interference amplification reflection method (IER method), or a reflection spectral film thickness measurement method.
  • IER method interference amplification reflection method
  • the interference fringes are measured over a wide wavelength region from ultraviolet to infrared, and the function is calculated by calculation. It is necessary to apply, and it becomes a little big device to handle properly.
  • a transparent substrate is mainly used, light is incident from the opposite surface of the layer causing interference, and an interference spectrum is obtained.
  • An opaque substrate cannot be used.
  • there is a method for measuring the adsorption of a thin film on a silicon nitride interference layer as a change in the interference spectrum by forming a silicon nitride interference layer on the silicon substrate as a substrate for measuring light from the interference layer side.
  • a proposal for performing a high sensitivity assay by providing a two-dimensional grating (for example, having a period of about 0.01 ⁇ m to 1 ⁇ m and a depth of about 0.01 ⁇ m to 1 ⁇ m) including a material having a high refractive index on the substrate
  • a two-dimensional lattice since a two-dimensional lattice is used, there are difficulties in manufacturing simplicity and cost.
  • the present invention solves the above problems and provides a laminated structure for reflected light intensity measurement that can measure the surface adsorption film thickness and the like with a higher sensitivity by a simple optical technique.
  • the present invention relates to a novel interference substrate for optically measuring the film thickness of a substance adsorbed on the surface, aiming at application of chemical sensors, biosensors, etc., 1) constructing a simpler optical system In order to enable measurement from the sample side for the purpose of doing so, a substrate with good reflectivity is used. 2)
  • the interference layer formed on the substrate has a relatively high refractive index and uses a material and a formation method that can arbitrarily control the film thickness. 3) Use a substrate having a surface that can be easily regenerated so that repeated measurement is possible. 4)
  • the surface should be smooth so that it can be combined with a crystal oscillator. It is an object of the present invention to provide an optical interference substrate that solves the above problems and that can perform optical measurement with high sensitivity.
  • the valve metal is a metal selected from titanium, aluminum, chromium, and stainless steel.
  • the reflected light intensity measurement multilayer structure according to any one of (10) and (11) installed in the measurement medium is irradiated with light, and at least one from the reflected light intensity measurement multilayer structure
  • a laminated structure for measuring reflected light intensity at at least one wavelength comprising a valve metal interference layer, a cell containing the laminated structure for measuring reflected light intensity, a light source, and the laminated structure for measuring reflected light intensity A reflected light intensity measuring apparatus comprising: a light irradiating means for irradiating light from a light source; and a means for detecting reflected light intensity at at least one wavelength from the laminated structure for measuring reflected light intensity.
  • a sensor chip comprising a laminated structure for measuring reflected light intensity at at least one wavelength comprising a valve metal interference layer and a metal electrode of a crystal oscillator.
  • a crystal comprising the sensor chip according to (14), an oscillation circuit connected to a metal electrode of the sensor chip, and means for detecting a resonance frequency of a crystal oscillator provided in the sensor chip.
  • Oscillator microbalance device (16)
  • the reflected light intensity measuring device according to (13) and the quartz crystal microbalance device according to (15) are combined, and the laminated structure for measuring reflected light intensity is at least one Equipment used for both reflected light intensity measurement at wavelength and quartz crystal microbalance measurement.
  • a laminated structure for measuring reflected light intensity at at least one wavelength comprising a valve metal interference layer, performing reflected light intensity measurement at at least one wavelength and measurement by a quartz oscillator microbalance method; and A viscosity measuring method for measuring the viscosity of a thin film to be measured on a laminated structure for measuring reflected light intensity from the relationship between the measured value of reflected light intensity and the measured value of quartz crystal microbalance.
  • the present invention can provide a reflected light intensity measurement laminated structure capable of measuring the surface adsorption film thickness and the like with higher sensitivity by a simple optical technique.
  • FIG. 3 is a diagram showing a change in reflection spectrum in Example 1.
  • Example 3 (a) is a figure which shows the outline
  • FIG. The figure which shows the frequency change in Example 6.
  • FIG. FIG. 10 is a diagram showing a change in reflectance in Example 7.
  • FIGS. 1A and 1B are diagrams showing (a) a batch-type crystal oscillator-light reflection spectroscopy simultaneous measurement apparatus and (b) a flow-type crystal oscillator-light reflection spectroscopy simultaneous measurement apparatus, which are embodiments of the present invention.
  • the laminated structure for reflected light intensity measurement of the present invention includes a valve metal light interference layer.
  • the valve metal is a metal that can form a passive thin film on the surface thereof, and is selected from titanium, aluminum, chromium, and stainless steel in the present invention.
  • titanium can be suitably used optically.
  • the “light interference layer” refers to a layer that is laminated on the surface of the valve metal, has a refractive index different from that of the valve metal, and interferes with reflected light from the valve metal.
  • the term “lamination” of the laminated structure means that an optical interference layer is laminated on the valve metal. Further, the optical interference layer may further include a laminated structure.
  • the term “reflected light intensity at at least one wavelength” is the intensity of reflected light from the light irradiated to the laminated structure of the present invention, and the reflected light may be measured as it is. Alternatively, the measurement may be performed after spectroscopic analysis using a diffraction grating, a prism, or a band pass filter. Preferably, it is measured spectroscopically. Examples of spectroscopic measurement may include spectral measurement or measurement of at least one specific wavelength.
  • a passive thin film such as a titanium oxide layer
  • a general oxidation method such as chemical treatment or UV ozone treatment can be employed, but anodic oxidation is preferably used.
  • the thickness can be easily controlled by an oxidation potential or an oxidation time by a known method.
  • the thickness of the thin film such as titanium oxide can be appropriately determined in consideration of the reflectance of the measurement medium such as the liquid to be used, but is usually about 5 nm to 0.1 mm. For example, the lower limit is 5 nm.
  • the upper limit may be selected from the group consisting of 0.1 mm (100 ⁇ m), 10 ⁇ m, 1 ⁇ m, 800 nm, and 500 nm.
  • the range may be arbitrarily selected.
  • valve metal such as titanium metal
  • a plate-like bulk substrate or a thin film is used as the valve metal.
  • the thickness of the valve metal is about 400 nm to 2 mm, preferably 500 nm to 1.5 mm, more preferably 700 nm to 1 mm.
  • a thin film such as metallic titanium
  • the thin film is formed on various nonmetallic or metallic substrates. It is formed.
  • the non-metallic substrate glass, polystyrene, polyethylene terephthalate, polycarbonate, silicon, quartz or the like is generally used as the non-metallic substrate.
  • the thickness of the substrate on which the metal titanium thin film is formed is not particularly limited, but is usually about 0.1 mm to 2 mm.
  • Formation of a valve metal thin film such as titanium metal can be performed by a conventional method, for example, by sputtering, vapor deposition, ion plating, electroplating, electroless plating, etc.
  • a sputtering method and a vapor deposition method are methods that can form a film.
  • a substrate different from the valve metal can be used as a surface for measuring the optical film thickness and / or mass.
  • a substrate different from the valve metal can be used as a surface for measuring the optical film thickness and / or mass.
  • the amount and dynamic characteristics of the adsorbed material can be analyzed from the difference between the values obtained from these two measurement methods.
  • a technique has been developed.
  • the present invention can also be applied for this purpose. That is, titanium oxide thin film is formed by depositing metal titanium on the crystal oscillator electrode and further anodizing this, for example, and the film thickness measurement using the optical interference is measured for the change in the frequency of the crystal oscillator. Can be done at the same time.
  • a thin film to be measured is further adsorbed onto a passive thin film such as a titanium oxide thin film, and the thin film to be measured is irradiated with light, and the change in reflected light intensity at at least one wavelength (interference shift, ie, light).
  • the reflection spectrum change or the reflected light intensity change of at least one specific wavelength the thickness of the thin film or the mass from the density is measured.
  • the thin film to be measured is not particularly limited as long as it can be adsorbed on the surface of a passive thin film such as a titanium oxide thin film and is made of a material different from the measurement medium, but preferably a protein, a nucleic acid, a sugar chain, a lipid, a synthesis It is selected from organic substances such as polymers, alcohols such as water, ethanol and acetone, and low molecular compounds such as ketones.
  • a titanium oxide thin film is formed by preferably anodizing, and the surface is irradiated with light and measured.
  • Proteins are adsorbed while measuring a reflection spectrum or reflected light intensity of at least one specific wavelength in a medium.
  • the frequency decreases, but the change in the reflection spectrum or the reflected light intensity of at least one specific wavelength changes more than the unmodified gold substrate. High sensitivity measurement is achieved.
  • the thickness and / or mass of the thin film to be measured can be measured by measuring the change in the reflection spectrum or the reflected light intensity of at least one specific wavelength in the measurement medium.
  • the measurement method itself using a crystal oscillator can be based on a normal crystal oscillator microbalance method. In this case, measurement using light and surface analysis using an oscillator can be performed simultaneously, and measurement relating to the viscoelasticity of the adsorption thin film can be performed.
  • the measurement medium may be either a gas such as air or a liquid such as water.
  • the measurement of substance adsorption on the surface of the titanium oxide thin film will be further described.
  • the laminated structure for measuring reflected light intensity of the present invention is placed inside the cell, and the surface of the titanium oxide thin film is passed through the optical fiber from the outside of the cell. Is irradiated with light, and the reflected light intensity is measured.
  • the reflection spectrum or the intensity of the reflected light of at least one specific wavelength changes as the substance is adsorbed on the titanium oxide thin film surface from the gas phase or liquid phase inside the cell, and this is measured.
  • the reflection spectrum when the thickness of the adsorbent changes, or the change in the intensity of reflected light of at least one specific wavelength can be theoretically simulated.
  • the reflection spectrum can be observed as it is, so the film thickness can be measured by theoretically fitting the entire spectrum or monitoring at least one specific wavelength change. . More simply, when a monochromatic light source is used, the film thickness can be obtained from the change in reflected light intensity at that wavelength.
  • the present invention uses light interference, and a change in the reflection spectrum or reflected light intensity of at least one specific wavelength actually appears in the form of a shift of interference fringes. That is, when the reflected light intensity is monitored at a specific wavelength, there are a wavelength at which the reflected light intensity increases as the substance is adsorbed and a wavelength at which the reflected light intensity decreases. By taking the difference between the changes in the two wavelengths having different phases, noise derived from the optical system such as light source modulation can be canceled and the optical response can be amplified and monitored.
  • reflection spectrum measurement is suitable for measurement of a relatively large film thickness (for example, 10 nm to 1 ⁇ m) of protein, synthetic polymer, etc.
  • measurement at at least one specific wavelength for example, 1 wavelength, 2 wavelengths, 3 wavelengths, 4 wavelengths, 5 wavelengths, 10 wavelengths, or the like is suitable.
  • the selection of whether to use reflection spectrum measurement or measurement at at least one specific wavelength depends on the nature of the measurement object and the purpose of the measurement.
  • titanium oxide is known to have an action of photodecomposing organic substances adhering to it with ultraviolet light, and its application has been progressing in recent years.
  • the adsorption film can be easily removed by irradiation with ultraviolet light, and the measurement laminated structure can be easily regenerated, Can be reused.
  • plate-like metal titanium is anodized and a titanium oxide thin film is formed on the surface.
  • the amount of adsorption can be monitored at an arbitrary wavelength from 450 nm to 750 nm by controlling the thickness of the titanium oxide thin film.
  • the amount of change in absorbance associated with the adsorption of proteins and lipid membranes is improved by about 10 times compared to the conventional abnormal reflection of gold.
  • the present invention also provides a laminated structure for measuring reflected light intensity at at least one wavelength comprising a valve metal interference layer, a cell containing the laminated structure for measuring reflected light intensity, a light source, and a laminated structure for measuring reflected light intensity.
  • the present invention relates to a reflected light intensity measuring apparatus comprising light irradiating means for irradiating light from a light source to a structure, and detecting means for detecting reflected light intensity at at least one wavelength from a laminated structure for measuring reflected light intensity.
  • the cell may be any cell as long as it is a cell used for normal optical measurement.
  • Examples of the light irradiation means for irradiating light from the light source include white light such as a high pressure mercury lamp, deuterium lamp, xenon lamp, and white LED, single color light such as a single color LED and laser, and the like.
  • Examples of the detection means include a spectroscope, a photodiode, and a photoresistor.
  • the laminated structure for measuring reflected light intensity and the cell are detachable.
  • the crystal oscillator when titanium metal is vapor-deposited on a gold electrode of a crystal oscillator and a titanium oxide thin film is formed, the crystal oscillator can be measured without any problem as a light reflection measurement method. Yes, information on the viscoelasticity of the adsorbed material can be obtained by measuring two measurement methods simultaneously.
  • the present invention also relates to a sensor chip including a laminated structure for measuring reflected light intensity at at least one wavelength including a valve metal interference layer and a metal electrode of a crystal oscillator.
  • the sensor chip may be of any shape suitable for crystal oscillator microbalance measurement, for example, for a batch type or a flow type, and may be an open system or a sealed system.
  • the sensor chip can be used repeatedly by using the above-described regeneration method.
  • the present invention also provides a crystal oscillator micro comprising the sensor chip, an oscillation circuit connected to a metal electrode of the sensor chip, and means for detecting a resonance frequency of the crystal oscillator included in the sensor chip.
  • the present invention relates to a balance device.
  • the quartz crystal microbalance device may be of any measurement method that is normally used, and examples thereof include a batch method and a flow method.
  • the laminated structure for measuring the reflected light intensity or the sensor chip is detachable.
  • the reflected light measurement device and the crystal oscillator microbalance device are combined, and the reflected light intensity measurement laminated structure includes the reflected light intensity measurement and the crystal oscillator micro at least at one wavelength. It relates to a device used for both balance measurements. The reflected light measurement and the crystal oscillator microbalance measurement may be performed at the same time or only one of them.
  • the laminated structure for measuring reflected light intensity or the sensor chip is detachable.
  • the adsorbed organic matter is decomposed by UV ozone treatment and the same surface can be regenerated, it can be repeatedly measured.
  • the change in reflected light intensity due to the adsorption / desorption of ethanol in the gas phase system is about 10 times larger than the gold abnormal reflection method in which the surface adsorption amount can be quantified with the same measuring device, and the sensitivity is improved by an order of magnitude.
  • the viscosity of the thin film to be measured on the laminated structure for reflected light intensity measurement can also be measured from the relationship between the reflected light intensity measurement value and the crystal oscillator microbalance measurement value.
  • the present inventor has found that when the target measurement thin film is a protein, when the relationship between the reflected light intensity and the measured value of the crystal oscillator is plotted, the fitting can be performed by the Huggins equation representing the relationship between the polymer concentration and the solution viscosity. Normally, the intrinsic viscosity of the polymer is obtained from the above formula, but the parameter corresponding to the intrinsic viscosity obtained from the fitting of the protein plot obtained by the measurement method of the present invention is determined by each method measured by another method.
  • the intrinsic viscosity of the thin film to be measured adsorbed on the surface can be measured from the relationship between the reflected light intensity obtained by the measurement of the present invention and the measured value of the crystal oscillator.
  • Example 1 (TiO 2 / Ti surface preparation method 1) A 40 ⁇ 8 ⁇ 2 mm titanium plate was polished with an abrasive and then washed with water and acetone. After air-drying, it was immersed in 6 ml of 100 mM NaOH solution placed in a glass cell and connected to the anode of a Keyence 2400 source meter. The cathode was connected to a copper wire and immersed in the same cell so as not to touch the titanium plate. This was energized at a constant potential from 0 to 22 V. At this time, the reflection spectrum from the surface of the titanium plate was monitored using an optical fiber type reflected light spectrometer (USB4000 manufactured by Ocean Optics).
  • USB4000 optical fiber type reflected light spectrometer
  • Titanium was vapor-deposited to a thickness of 700 nm on the entire surface of one side of a ceramic mold type crystal oscillator chip (ULVAC, crystal plate diameter 9 mm, gold electrode diameter 3 mm). This chip was immersed in 6 ml of 100 mM NaOH solution in a glass cell, and the solution-side electrode on which titanium was deposited was connected to the anode of a 2400 source meter manufactured by Keyence Corporation. The cathode was connected to a copper wire and immersed in the same cell so as not to touch the titanium surface. This was energized at a potential of 12 V.
  • UVAC ceramic mold type crystal oscillator chip
  • the reflection spectrum from the titanium surface was monitored using an optical fiber type reflected light spectrometer (USB4000 manufactured by Ocean Optics).
  • the titanium surface turned purple, and from the result of simulation of the reflection spectrum, a titanium oxide layer of approximately 35 nm was formed.
  • this chip oscillated stably as an oscillator in water, and could be used as a chip for a crystal oscillator microbalance method.
  • Example 3 (Protein binding to TiO 2 / Ti surface 1)
  • the 35 nm TiO 2 thin film-forming metal titanium plate shown in Example 1 was immersed in 5 ml pure water, and stabilized by adding 100 ml of acetic acid 40 mM. This state was set as an initial state, and 100 ml of a solution of BSA (bovine serum albumin) 1 mg / ml was added thereto.
  • BSA bovine serum albumin
  • Example 4 (Protein binding to TiO 2 / Ti surface 2) Each of the 35 nm and 55 nm TiO 2 thin film-forming metal titanium plates shown in Example 1 was immersed in 5 ml pure water. This state was set as an initial state, and 100 ml of a 1 mg / ml lysozyme solution was added thereto. The change in reflectance at each wavelength was tracked. As shown in FIG. 3, the reflectance of each wavelength varies with lysozyme adsorption according to the titanium oxide layer. The direction of increase / decrease in the change is due to the phase shift corresponding to the titanium oxide layer, and this can be arbitrarily and easily controlled depending on the conditions at the time of forming the titanium oxide layer.
  • the same protein binding can be measured simultaneously at multiple wavelengths. If the difference in wavelength between the phases is taken, a response amount can be obtained, and noise caused by the optical system can be offset. More importantly, when the solution has light absorption, measurement can be performed while avoiding the wavelength.
  • Example 5 (35 nm TiO 2 thin film forming metal titanium 700 nm vapor deposition crystal resonator chip surface protein binding 3)
  • the 35 nm TiO 2 thin film-forming metal titanium 700 nm vapor-deposited crystal oscillator chip shown in Example 2 was attached to the oscillation circuit and immersed in 4 ml pure water. With this state as the initial state, 100 ml of a BSA (bovine serum albumin) 1 mg / ml solution was added. The change in reflectance at 450 nm and 600 nm was followed. At the same time, the frequency change of the crystal oscillator was also tracked. As shown in Fig.
  • BSA bovine serum albumin
  • Example 6 Boding of succinic acid to the surface of a 700 nm-deposited quartz crystal chip made of TiO 2 thin film and removal by UV-ozone treatment
  • the TiO 2 thin film-formed metal titanium 700 nm vapor-deposited crystal resonator chip shown in Example 2 was attached to the oscillation circuit, and after measuring the initial resonance frequency, it was immersed in 4 ml pure water.
  • succinic acid aqueous solution was added to water and the change in the frequency became stable, it was pulled up to the gas phase and the frequency was measured after sufficient drying.
  • this chip was subjected to UV-ozone treatment for 15 minutes, and the frequency was measured again. This cycle was repeated 5 times (FIG. 5).
  • Example 7 (Adsorption of ethanol in the gas phase on the surface of a 700 nm-deposited quartz crystal chip with 35 nm TiO 2 thin film and the vibration effect of the quartz oscillator)
  • the 35 nm TiO 2 thin film-forming metal titanium 700 nm vapor-deposited crystal oscillator chip shown in Example 2 was attached to the oscillation circuit, and set in an empty 8 ml glass cell equipped with filter paper. Light reflection measurement was performed while repeating the oscillation of the crystal oscillator every minute. After a certain time, 100 ml of ethanol was injected into the cell.
  • the change in reflectivity shows that ethanol vapor is generated in the cell and ethanol is adsorbed from the gas phase to the titanium oxide surface, and finally all the ethanol introduced into the cell evaporates and desorbs from the titanium oxide surface.
  • Fig. 6 This change was about 6 times the change in reflectance due to the abnormal reflection of conventional gold.
  • the reflectance changes greatly depending on whether or not the crystal oscillator oscillates. This indicates that more than half of the ethanol adsorbed on the surface is desorbed by the vibration of the crystal oscillator.
  • the amount of desorption caused by this vibration and its dynamic characteristics vary depending on the amount of molecules adsorbed and affinity for the surface. Therefore, it was shown that by using an apparatus combining a crystal oscillator and a light reflection method, information on vapor molecules in the gas phase can be obtained with the effect of having no vibration.
  • Example 8 (Correlation between relative humidity and response value of quartz crystal-light reflection measurement) The 35 nm TiO2 thin film-formed metal titanium 700 nm vapor-deposited crystal oscillator chip shown in Example 2 was attached to the oscillation circuit, and concentrated sulfuric acid (0%) or various salt-saturated aqueous solutions (relative humidity) (lithium bromide (7% ), Phosphoric acid (9%), lithium chloride (15%), potassium acetate (22%), potassium carbonate (43%), sodium bromide (58%), sodium chloride (75%), sodium acetate (76% ), Potassium chloride (86%), sodium hydrogenphosphate (95%)) was placed in an 8 ml glass cell without touching the aqueous solution and set.
  • the light reflection measurement was performed while repeating the oscillation of the crystal oscillator every minute.
  • the oscillation of the oscillator was turned on, it was observed that the adsorbed water film thickness decreased from the optical measurement, and when it was turned off, the original film thickness was restored (Fig. 9 left).
  • This difference between the on and off optical film thicknesses depends on the type of salt in the saturated aqueous solution used, which is considered to be due to the difference in relative humidity.
  • the relative humidity and the magnitude of the desorbed film thickness due to the vibration of the surface adsorbed water layer show a good correlation. That is, the relative humidity can be measured by obtaining the desorption amount of the surface adsorbed water due to mechanical vibration by reflection interference spectroscopy using the surface according to the present invention.
  • Example 9 viscosity measurement
  • the same experiment was performed for lysozyme and RNase A in the same manner as in Example 5 in which the bonding process of BSA to the surface was observed by two methods of reflectance change and crystal oscillator frequency change.
  • the size varies depending on the protein, and a saturated response is obtained.
  • This curve could be fitted by the Huggins formula that formulated the concentration dependence of the polymer solution viscosity (curve in the figure). In other words, it is easy to understand this behavior when it is considered that the change in the frequency of the crystal oscillator is monitoring the protein solution viscosity of the two-dimensional liquid near the surface.
  • a parameter corresponding to the intrinsic viscosity in the Huggins equation obtained as a result of the fitting can be obtained from this figure, and the magnitude of the parameter shows a good correlation with the viscoelastic parameter of the existing protein. Therefore, the light reflectance change-frequency change simultaneous measurement method can be said to be a technique capable of evaluating dynamic characteristics unique to proteins.
  • the surface adsorbed film thickness and the like can be measured with higher sensitivity by a simple optical technique.

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Abstract

　簡便な光学的な手法によって、表面吸着膜厚等をより高感度に測定することができる反射光強度測定用積層構造体を提供する。　金属チタン等のバルブ金属光干渉層を含んでなる少なくとも１つの波長における反射光強度測定用積層構造体。さらに、この反射光強度測定用積層構造体において、測定対象薄膜に光を照射し、測定媒体中で少なくとも１つの波長における反射光強度の変化を測定することにより測定対象薄膜の膜厚および／または質量および／または粘度を測定する薄膜の膜厚または質量測定方法。

Description

反射光強度測定用積層構造体、反射光測定用積層構造体を含んでなる装置、並びに薄膜の膜厚及び／又は質量及び／又は粘度測定方法
　本発明は反射光強度測定用積層構造体、反射光測定用積層構造体を含んでなる装置、並びに薄膜の膜厚及び／又は質量及び／又は粘度測定方法に関する。
　表面において、光学的に吸着した膜の膜厚を測定する方法には多くの種類が知られている。例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)を利用した方法は、化学センサーやバイオ測定のための、表面を用いた分子認識、反応解析装置として広範囲に応用されている。しかし、この方法は共鳴角の変化を検出するため光学的に取り扱いが難しいため、水晶発振子との組み合わせにより動的な薄膜物性を同時に測定するようなことはできない。
　また、高い光反射性を有する基板上に存在する薄膜の膜厚測定法として、白色光の干渉を利用する方法が知られている。薄膜表面での反射光と、薄膜と基板との界面での反射光とは互いに干渉するので、波長に依存して反射光強度が周期的に増減する。このフリンジパターンを理論的にフィットすることでnmからmmのオーダーの膜厚測定を光学的に行うことができる。これを光干渉式膜厚測定法、干渉増幅反射法（Interference Enhanced Reflection Method；IER 法）、あるいは反射分光膜厚測定法と呼ぶ場合もある。
　しかし、屈折率差が媒体に対して大きくなく、また膜厚が薄い場合には、高精度に測定するためには紫外から赤外に至る広い波長領域にわたって干渉縞を測定し、計算によって関数を当てはめる必要があり、まともに扱うにはいささか大がかりな装置となる。またこれらの方法では主に透明基板を用い、干渉を起こす層の反対面から光を入射し、干渉スペクトルを得るものであり、不透明な基板を用いることができない。これとは逆に、干渉層側から光を入れて測定する基板としては、シリコン基板上に窒化ケイ素の干渉層を形成し、これに対する薄膜の吸着を、干渉スペクトルの変化として測定する方法もあるが、窒化ケイ素層の作製には蒸着装置を用いる必要があり、汎用性に欠ける。例えば測定する溶液が光を吸収する場合には、これが測定を阻害する。これを逃れるためには干渉層の膜厚を制御することが必要になるが、これは測定者には容易ではない。
　さらにより簡便な方法で、他の手法として組み合わせやすいものとしては、金の異常反射を用いるものもある。これは、金の表面に物質が吸着すると、その量に応じて近紫外から紫外の領域にかけての波長の光の反射率が比較的大きく低下することを利用するもので、表面への吸着物質量を定量化する新たな手法としての応用の検討がなされているが、反射率の変化量は実際には既存の装置で検出するには限界に近い。
　また、基板上に高屈折率を有する材料を含む２次元格子（たとえば、約０．０１μｍ～１μｍの周期および約０．０１μｍ～１μｍの深さを有する）を設けて、高感度アッセイを行なう提案もなされているが、２次元格子を用いるため、製作上の簡便性およびコストには難点がある。
特開２００９－２５３１２号公報
　本発明は、上記の課題を解決し、簡便な光学的な手法によって、表面吸着膜厚等をより高感度に測定することができる反射光強度測定用積層構造体を提供する。
　すなわち、本発明は表面に吸着する物質の膜厚を光学的に測定するための新規な干渉基板に関するものであり、化学センサー、バイオセンサー等の応用を目指し、1)より簡便な光学系を構築することを目的に試料側からの測定を可能にするため、反射率の良い基板を用いる。2)基板上に形成する干渉層は比較的屈折率が高く、任意に膜厚が制御可能な物質と形成法を用いる。3)繰り返し測定が可能なように、再生処理が簡便に行えるような表面を有する基板を用いる。4)水晶発振子と組み合わせることができるように、表面が平滑であること。以上の課題を解決し、なおかつ高感度で光測定を行える光干渉基板を提供するものである。
　本発明は、上記の課題を解決するために、以下の発明を提供する。
（１）バルブ金属光干渉層を含んでなる、少なくとも１つの波長における反射光強度測定用積層構造体。
（２）前記バルブ金属が、チタン、アルミニウム、クロムおよびステンレス鋼から選ばれる金属である（１）に記載の反射光強度測定用積層構造体。
（３）前記バルブ金属が板または薄膜である（１）または（２）に記載の反射光強度測定用積層構造体。
（４）前記バルブ金属の酸化によりバルブ金属表面に不働態薄膜が形成されている（１）～（３）のいずれか１つに記載の反射光強度測定用積層構造体。
（５）前記酸化が陽極酸化である（４）に記載の反射光強度測定用積層構造体。
（６）前記不働態薄膜の膜厚が５ｎｍ～０．１ｍｍである（４）又は（５）に記載の反射光強度測定用積層構造体。
（７）前記バルブ金属の厚さが４００ｎｍ～２ｍｍである（１）～（６）のいずれか１つに記載の反射光強度測定用積層構造体。
（８）前記薄膜が蒸着またはスパッタ法により形成される（３）～（７）のいずれか１つに記載の反射光強度測定用積層構造体。
（９）前記薄膜が水晶発振子の金属電極上に形成される（３）～（８）のいずれか１つに記載の反射光強度測定用積層構造体。
（１０）前記不働態薄膜上にさらに測定対象薄膜を吸着させた（４）～（９）のいずれか１つに記載の反射光強度測定用積層構造体。
（１１）前記測定対象薄膜がタンパク質、核酸、糖鎖、脂質、合成高分子化合物および低分子化合物から選ばれる（１０）に記載の反射光強度測定用積層構造体。
（１２）測定媒体中に設置された（１０）又は（１１）のいずれかに記載の反射光強度測定用積層構造体に光を照射し、当該反射光強度測定用積層構造体からの少なくとも１つの波長における反射光強度の変化を測定することにより、前記測定対象薄膜の膜厚及び／または質量を測定する薄膜の膜厚及び／または質量測定方法。
（１３）バルブ金属干渉層を含んでなる少なくとも１つの波長における反射光強度測定用積層構造体、当該反射光強度測定用積層構造体を収納したセル、光源、前記反射光強度測定用積層構造体に光源からの光を照射するための光照射手段、及び反射光強度測定用積層構造体からの少なくとも１つの波長における反射光強度の検出手段を備えてなる反射光強度測定装置。
（１４）バルブ金属干渉層を含んでなる少なくとも１つの波長における反射光強度測定用積層構造体及び水晶発振子の金属電極を備えてなるセンサーチップ。
（１５）（１４）に記載のセンサーチップ、当該センサーチップの金属電極と接続される発振回路、及び前記センサーチップに備えられている水晶発振子の共振振動数を検出する手段を備えてなる水晶発振子マイクロバランス装置。
（１６）（１３）に記載の反射光強度測定装置と（１５）に記載の水晶発振子マイクロバランス装置とが組み合わされてなり、ここで前記反射光強度測定用積層構造体が、少なくとも１つの波長における反射光強度測定と水晶発振子マイクロバランス測定の両方に使用される、装置。
（１７）バルブ金属干渉層を含んでなる少なくとも１つの波長における反射光強度測定用積層構造体を用いて、少なくとも１つの波長における反射光強度測定及び水晶発振子マイクロバランス法による測定を行い、そして得られた反射光強度の測定値及び水晶発振子マイクロバランス測定値の関係から、反射光強度測定用積層構造体上の測定対象薄膜の粘度を測定する、粘度測定方法。
　本発明は、簡便な光学的な手法によって、表面吸着膜厚等をより高感度に測定することができる反射光強度測定用積層構造体を提供し得る。
実施例１における反射スペクトル変化を示す図。 実施例３において、（ａ）は実験の概要を示す図、（ｂ）は反射スペクトル変化のシミュレーション結果を示す図、および（ｃ）は反射スペクトルを示す図。 （ａ）および（ｂ）は、実施例４において、それぞれ酸化チタン膜厚が３５ｎｍ及び５５ｎｍでの反射率変化を示す図、および（ｃ）は酸化チタン膜厚が５５ｎｍでの反射スペクトルを示す図。 実施例５における振動数変化と反射率変化を示す図。 実施例６における振動数変化を示す図。 実施例７における反射率変化を示す図。 水晶発振子の金電極上に蒸着したチタンに対する陽極酸化の図。 本発明の実施態様である、（ａ）バッチ式水晶発振子－光反射分光同時測定装置、（ｂ）フロー式水晶発振子－光反射分光同時測定装置を示す図。 水晶発振子のオン・オフの切り替えにより変化する反射率変化と相対湿度との関係を示す図。 タンパク質の違いによる水晶発振子と光反射変化相関の違いを示す図。
　本発明の反射光強度測定用積層構造体は、バルブ金属光干渉層を含んでなる。
　バルブ金属は、その表面に不働態薄膜を形成し得る金属であり、本発明においては、チタン、アルミニウム、クロムおよびステンレス鋼から選ばれるが、特にチタンが光学的に好適に使用され得る。
　本明細書において「光干渉層」とは、バルブ金属表面に積層されており、バルブ金属とは異なる屈折率を有し、バルブ金属からの反射光を干渉させる層のことを言う。
　本明細書において、積層構造体の「積層」なる用語は、バルブ金属上に光干渉層が積層されていることを意味する。また、光干渉層がさらに積層構造を含んでもよい。
　本明細書において、「少なくとも１つの波長における反射光強度」なる用語は、本発明の積層構造体に対して照射した光からの反射光の強度であり、当該反射光は、そのまま測定されても、回折格子、プリズム、又はバンドパスフィルター等を用いて分光してから測定されてもよい。好ましくは、分光して測定される。分光して測定する例としては、スペクトル測定、又は少なくとも１つの特定波長の測定があり得る。
　以下には代表例として金属チタンの場合を中心に説明する。
　酸化チタン層等の不働態薄膜の形成には、化学的処理、UVオゾン処理等の一般的な酸化方法を採用し得るが、好適には陽極酸化が用いられる。その厚みは、公知の方法により、酸化電位や酸化時間によって容易に制御することができる。酸化チタン等の薄膜の膜厚は、使用する液体等の測定媒体の反射率等を考慮して、適宜決定し得るが、通常５ｎｍ～０．１ｍｍ程度であり、例えば、下限値としては、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｍ、１５ｎｍ、及び２０ｎｍからなる群から任意に選択されてよく、且つ上限値としては、０．１ｍｍ（１００μｍ）、１０μｍ、１μｍ、８００ｎｍ、５００ｎｍからなる群から任意に選択される範囲であってよい。
　金属チタン等のバルブ金属としては、板状のバルク基板または薄膜が用いられる。バルブ金属の厚さは４００ｎｍ～２ｍｍ程度、好ましくは５００ｎｍ～１．５ｍｍ、より好ましくは７００ｎｍ～１ｍｍであり、金属チタン等の薄膜を用いる場合には、非金属または金属の各種基板上に薄膜が形成される。非金属基板としては、一般的にはガラス、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シリコン、石英等が使用される。金属チタン薄膜が形成される基板の厚さは特には限定されないが、通常０．１ ～２mm程度である。
　金属チタン等のバルブ金属の薄膜の形成は常法によることでき、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができるが、好ましくは、均一に膜形成が可能な手法である、スパッタ法、蒸着法である。
　様々な表面に金属チタン等のバルブ金属を蒸着することで、バルブ金属とは異なる基材も、光膜厚及び／又は質量測定用表面とすることができる。例えば、水晶発振子マイクロバランス法と金の異常反射を利用した膜厚測定を同時に行うことで、それら二つの測定法から得られた値の差から、吸着物質の量と動的な特性を解析するという手法が開発されている。本発明もこのために応用することができる。即ち、水晶発振子電極上に金属チタンを蒸着し、さらにこれをたとえば陽極酸化することで酸化チタン薄膜を形成させ、これによる光干渉を利用した膜厚測定を、水晶発振子の振動数変化測定と同時に行うことができる。
　反射光強度測定に際しては、酸化チタン薄膜等の不働態薄膜上にさらに測定対象薄膜を吸着させ、測定対象薄膜に光を照射し、その少なくとも１つの波長における反射光強度の変化（干渉シフトすなわち光反射スペクトル変化、又は少なくとも１つの特定波長の反射光強度変化）を測定することにより薄膜の膜厚、またはその密度から質量、が測定される。
　測定対象薄膜としては、酸化チタン薄膜等の不働態薄膜表面に吸着され得、かつ測定媒体とは異なる材料からなるものであれば特に制限されないが、好ましくはタンパク質、核酸、糖鎖、脂質、合成高分子等の有機物、水、エタノール、アセトン等のアルコール類、ケトン類等の低分子化合物から選ばれる。
　たとえば、水晶発振子の金電極表面に金属チタン薄膜を蒸着あるいはスパッタ法により積層させた後に、好適には陽極酸化することで酸化チタン薄膜を形成させ、この表面に対して光を照射し、測定媒体中で反射スペクトル、又は少なくとも１つの特定波長の反射光強度を測定しながら、タンパク質を吸着させる。タンパク質が水晶発振子の表面に吸着すると振動数は減少するが、その変化に対して、反射スペクトル、又は少なくとも１つの特定波長の反射光強度の変化が未修飾の金基板よりも大きく変化し、高感度測定が達成される。このようにして、測定媒体中で反射スペクトル、又は少なくとも１つの特定波長の反射光強度の変化を測定することにより測定対象薄膜の膜厚及び／または質量を測定することができる。水晶発振子を用いる測定法自体は通常の水晶発振子マイクロバランス法によることができる。この場合、光による測定と、発振子による表面解析を同時に行うことができ、吸着薄膜の粘弾性に関する測定を行うことができる。
　上記の測定媒体は、空気等の気体または水等の液体のいずれでもよい。
　本発明において、酸化チタン薄膜表面への物質吸着の測定についてさらに説明すると、たとえばセルの内部にこの本発明の反射光強度測定用積層構造体を入れ、セルの外から光ファイバー等を通して酸化チタン薄膜表面に光を照射し、反射光強度を測定する。セル内部の気相あるいは液相からの酸化チタン薄膜表面への物質の吸着に伴って、反射スペクトル、又は少なくとも１つの特定波長の反射光強度が変化するので、これを測定する。酸化チタン薄膜の厚みに応じた、吸着物質の膜厚が変化した際の反射スペクトル、又は少なくとも１つの特定波長の反射光強度の変化は理論的にシミュレートすることができ、光源として白色光、光検出器として分光器を用いれば、反射スペクトルがそのまま観察できるので、理論的にスペクトル全体をフィットさせるか、少なくとも１つの特定の波長の変化量をモニターすることで膜厚を測定することができる。より簡単には、単色光源を用いた場合は、その波長での反射光強度の変化から膜厚を求めることができる。
　また、本発明は光の干渉を利用しており、反射スペクトル、又は少なくとも１つの特定波長の反射光強度の変化は実際には干渉縞のシフトという形で現れる。つまりある特定の波長で反射光強度をモニターすると、反射光強度が物質の吸着に伴って増大する波長と、減少する波長がある。この位相の異なる二波長の変化の差分をとると、光源変調などの光学系に由来するノイズを相殺し、且つ光応答を増幅してモニターすることができる。
　限定するものではないが、タンパク質や合成高分子等の比較的膜厚が大きい（例えば、１０ｎｍ～１μｍ）測定対象の測定については、反射スペクトル測定が適し、一方、低分子等の比較的膜厚が小さい（例えば、１０ｎｍ以下）測定対象の測定については、少なくとも１つの特定波長、例えば１波長、２波長、３波長、４波長、５波長、１０波長等での測定が適する。ただし、反射スペクトル測定と、少なくとも１つの特定波長での測定のいずれかを用いるかの選択は、測定対象物の性質及び測定の目的に依存することになる。
　また、酸化チタンは、これに付着した有機物を紫外光によって光分解する作用があることが知られ、近年様々に応用が進んでいる。このことを利用すれば、本発明の反射光強度測定用積層構造体において、一旦測定が終了した後に、紫外光照射によって吸着膜を容易に除去でき、測定用積層構造体を簡単に再生し、再利用することができる。
　本発明の１つの実施態様において、板状金属チタンを陽極酸化し、酸化チタン薄膜を表面に成膜する。これに対し、水相系においてタンパク質の吸着実験を行ったところ、酸化チタン薄膜の膜厚を制御することで、450 nmから750 nmまでの任意の波長で吸着量をモニタリングすることができる。これにより、溶液に光吸収がある場合も、その波長を避けて測定することができる。また、タンパクや脂質膜の吸着に伴う吸光度変化量は、従来の金の異常反射に比べ10倍程度向上する。
　本発明はまた、バルブ金属干渉層を含んでなる少なくとも１つの波長における反射光強度測定用積層構造体、当該反射光強度測定用積層構造体を収納したセル、光源、前記反射光強度測定用積層構造体に光源からの光を照射するための光照射手段、及び反射光強度測定用積層構造体からの少なくとも１つの波長における反射光強度の検出手段を備えてなる反射光強度測定装置に関する。セルは、通常の光学的測定に用いられるセルであればどのようなセルでもよい。光源からの光を照射するための光照射手段としては、例えば、高圧水銀灯、重水素ランプ、キセノンランプ、白色ＬＥＤ等の白色光、単色ＬＥＤ、レーザー等の単色光等があり、反射光強度の検出手段としては、例えば分光器、フォトダイオード、フォトレジスタ等がある。また、本発明の反射光強度測定装置において、反射光強度測定用積層構造体、及びセルは着脱可能である。
　さらに、本発明のもう１つの実施態様において、水晶発振子の金電極上に金属チタンを蒸着し、さらに酸化チタン薄膜を作成すると、水晶発振子としても光反射測定法としても問題なく測定可能であり、二つの測定法を同時に測定することで、吸着物質の粘弾性に関する情報を得ることができる。
　本発明はまた、バルブ金属干渉層を含んでなる少なくとも１つの波長における反射光強度測定用積層構造体及び水晶発振子の金属電極を備えてなるセンサーチップに関する。当該センサーチップは、水晶発振子マイクロバランス測定に適するいかなる形状のものでもよく、例えば、バッチ式用、フロー式用などがあり、解放系であっても、又は密閉系であってもよい。当該センサーチップは、上記の再生方法を用いることにより、繰り返し利用が可能である。
　本発明はまた、前記センサーチップ、当該センサーチップの金属電極と接続される発振回路、及び前記センサーチップに備えられている水晶発振子の共振振動数を検出する手段を備えてなる水晶発振子マイクロバランス装置に関する。当該水晶発振子マイクロバランス装置は、通常使用されるいかなる測定方式のでもよく、例えば、バッチ式、フロー式などがある。また、また、本発明の水晶発振子マイクロバランス装置において、反射光強度測定用積層構造体、又はセンサーチップは着脱可能である。
　本発明はまた、前記反射光測定装置と前記水晶発振子マイクロバランス装置とが組み合わされてなり、前記反射光強度測定用積層構造体が、少なくとも１つの波長における反射光強度測定と水晶発振子マイクロバランス測定の両方に使用される装置に関する。反射光測定と水晶発振子マイクロバランス測定は同時に行っても、一方のみ行ってもよい。また、当該装置において、反射光強度測定用積層構造体、又はセンサーチップは着脱可能である。
　また、ＵＶオゾン処理によって吸着有機物が分解され、同一の表面を再生し得るので、繰り返し測定可能である。
　また、気相系でエタノールの吸脱着による反射光強度変化は、同様の測定装置により表面吸着量が定量化できる金の異常反射法に比べ10倍程度大きくなり、感度が一桁向上する。水晶発振子と組み合わせることで、水晶発振子の振動による吸着分子の脱離も本発明により高感度で検出でき、これを利用して大気中の湿度も測定することができる。
　また、反射光強度測定値と水晶発振子マイクロバランス測定値の関係から、反射光強度測定用積層構造体上の測定対象薄膜の粘度を測定することもできる。本発明者は、対象測定薄膜がタンパク質である場合において、反射光強度と水晶発振子の測定値の関係をプロットすると、高分子濃度－溶液粘度の関係を表すＨｕｇｇｉｎｓ式でフィッティングできることを見出した。通常、当該式からは高分子の固有粘度が得られるが、本発明の測定方法により得られるタンパク質のプロットのフィッティングから得られる固有粘度に相当するパラメータは、別の方法で測定されている各々のタンパク質の圧縮係数と高い相関性があることがわかった。よって、本発明の測定により得られる反射光強度と水晶発振子の測定値の関係から、表面に吸着した測定対象薄膜の固有粘度が測定できると言える。
実施例１（TiO2/Ti表面作成法１）
　40 x 8 x 2 mmのチタン製板を研磨剤で研磨後、水およびアセトンで洗浄した。風乾させた後、ガラスセルに入れた6 mlの100 mM NaOH溶液に浸し、キーエンス社製2400ソースメーターの陽極に接続した。 陰極は銅線に接続し、チタン板に触れないように同じセルに浸した。これに0から22 Vまで一定の電位で通電した。この時、チタン板表面からの反射スペクトルを光ファイバー型反射光分光器(オーシャンオプティクス社製USB4000)を用いてモニターした。加える電位によって異なる反射スペクトルが得られ、金色から赤、青、紫までの色調で表面の色が変化した。その結果を図1に示す。この変化はシミュレーションの結果から、TiO2薄膜の0から60 nm程度までの膜厚変化に対応することが分かった。
実施例２（TiO2/Ti表面作成法２）
　セラミックモールド型水晶発振子チップ(ULVAC社製、水晶板直径9 mm, 金電極直径3 mm)の水晶板片側全面にチタンを700 nmの厚みで蒸着した。このチップをガラスセルに入れた6 mlの100 mM NaOH溶液に浸し、チタンを蒸着した溶液側の電極をキーエンス社製2400ソースメーターの陽極に接続した。 陰極は銅線に接続し、チタン表面に触れないように同じセルに浸した。これに12 Vの電位で通電した。この時、チタン表面からの反射スペクトルを光ファイバー型反射光分光器(オーシャンオプティクス社製USB4000)を用いてモニターした。チタン表面は紫色になり、反射スペクトルのシミュレーションの結果から、およそ35 nmの酸化チタン層が形成された。このチップは反射スペクトル測定と同時に、安定に水中で発振子として発振し、水晶発振子マイクロバランス法のチップとしても使用可能であった。
実施例３（TiO2/Ti表面へのタンパク質結合１）
　実施例１で示した35 nmTiO2薄膜形成金属チタン板を、5 ml純水中に浸し、酢酸40 mMを100 ml加えて安定化させた。この状態を初期状態とし、これにBSA（牛血清アルブミン）1 mg/mlの溶液100 mlを加えた。最終的な反射スペクトルは図２の（ｃ）の様になり、図２の（ｂ）のシミュレーション結果からわかるように、平均膜厚約2 nm程度のタンパク質が吸着したことが分かる。変化の大きい波長で経時的に追跡すれば、吸着過程がその場観察できることが分かる。図２の（ａ）は実験の概要を示す。
実施例４（TiO2/Ti表面へのタンパク質結合２）
　実施例１で示した35 nmおよび55 nm TiO2薄膜形成金属チタン板それぞれを、5 ml純水中に浸した。この状態を初期状態とし、これにリゾチーム1 mg/mlの溶液100 mlを加えた。各波長での反射率変化を追跡した。図３に示したように、酸化チタン層に応じて、各波長の反射率がリゾチーム吸着とともに変動する。変化の増減の向きは、酸化チタン層に応じた位相のずれによるもので、これは酸化チタン層成型時の条件によって任意に、かつ容易に制御可能である。このようにおなじタンパク質の結合を多波長同時に測定することができる。位相の異なる波長の差をとれば、応答量を稼ぐことができ、光学系に起因するノイズも相殺できる。さらに重要なことは、溶液に光吸収がある場合に、その波長を避けて測定できる点にある。
実施例５（35 nm TiO2薄膜形成金属チタン700 nm蒸着水晶発振子チップ表面へのタンパク質結合３）
　実施例２で示した35 nm TiO2薄膜形成金属チタン700 nm蒸着水晶発振子チップを発振回路に取り付け、4 ml純水中に浸した。この状態を初期状態とし、BSA（牛血清アルブミン）1 mg/mlの溶液100 mlを加えた。450 nmと600 nmでの反射率変化を追跡した。同時に水晶発振子の振動数変化も追跡した。図４に示したように、振動数の低下と、450 nmと600 nmでの反射率変化の差分が同様に観察されており、二つの原理の異なる測定法が、同時に行えることが示された。さらに、これまでの水晶発振子と金の異常反射との組み合わせによる評価では、水晶発振子の振動数変化が1000 Hzであった時、金の異常反射による反射率変化は、同じBSAの純水中での表面への結合で1 %程度であったのに対し、本発明の方法では、11 %と一桁向上した応答量が得られている。
実施例６（TiO2薄膜形成金属チタン700 nm蒸着水晶発振子チップ表面へのコハク酸の結合とUV-オゾン処理による除去）
　実施例２で示したTiO2薄膜形成金属チタン700 nm蒸着水晶発振子チップを発振回路に取り付け、初期の共振周波数を測定後、4 ml純水中に浸した。水中にコハク酸水溶液20 mMを100 ml添加し振動数変化が安定したところで、気相に引き上げ、十分に乾燥後振動数を測定した。さらにこのチップをUV-オゾン処理を15分行い、再度振動数を測定した。このサイクルを5回繰り返した（図５）。操作前後での振動数変化から、水中でコハク酸が一層程度酸化チタン表面に結合し、UV-オゾン処理によって除去されることが分かった。UV-オゾン処理のサイクルによって振動数が全体に若干低下、即ち重くなっているのは、UV-オゾン処理によってわずかに金属チタン層が酸化されているためであると考えられる。
実施例７（35 nm TiO2薄膜形成金属チタン700 nm蒸着水晶発振子チップ表面へ気相中でのエタノールの吸着と水晶発振子の振動効果）
　実施例２で示した35 nm TiO2薄膜形成金属チタン700 nm蒸着水晶発振子チップを発振回路に取り付け、濾紙を装着した空の8 mlガラスセルにセットした。1分毎に水晶発振子の発振のオン・オフを繰り返しながら光反射測定を行った。一定時間後にセルにエタノールを100 ml打ち込んだ。エタノール蒸気がセル中で発生し、気相から酸化チタン表面にエタノールが吸着すること、さらに最終的にセルに導入したエタノールがすべて蒸発して酸化チタン表面から脱離していく様子が、反射率変化から確認できた(図６)。この変化は、従来の金の異常反射による反射率変化の6倍程度であった。さらに、水晶発振子の発振の有無で反射率が大きく変わることが分かった。これは、水晶発振子の振動によって表面に吸着したエタノールが半分以上脱離することを示している。この振動による脱離量とその動的な特性は吸着する分子の量と表面への親和性などによって変わる。よって、水晶発振子と光反射法を組み合わせた装置を用いることで、振動の有る無しの効果で気相中の蒸気分子に関する情報が得られる可能性が示された。
実施例８（相対湿度と、水晶発振子－光反射測定の応答値との相関）
　実施例２で示した35 nm TiO2薄膜形成金属チタン700 nm蒸着水晶発振子チップを発振回路に取り付け、濃硫酸(0 %)もしくは、各種の塩飽和水溶液(相対湿度) (臭化リチウム(7 %)、リン酸(9 %)、塩化リチウム(15 %)、酢酸カリウム(22 %)、炭酸カリウム(43 %)、臭化ナトリウム(58 %)、塩化ナトリウム(75 %)、酢酸ナトリウム(76 %)、塩化カリウム(86 %)、リン酸水素ナトリウム(95 %))を2ml入れた、8 mlガラスセルに水溶液に触れないように入れ込み、セットした。平衡に達した後、一分毎に水晶発振子の発振のオン・オフを繰り返しながら光反射測定を行った。発振子の振動をオンにすると、光学測定からその吸着水膜厚の減少が起き、オフにするとまたもとの膜厚に戻ることが観察された(図９左)。このオン・オフの光学膜厚の差は、用いる飽和水溶液の塩の種類に依存し、これは相対湿度の違いによるものと考えられる。図９右に示したように、この相対湿度と、表面吸着水層の振動による脱離膜厚の大きさは良い相関性を示している。つまり、機械的な振動による表面吸着水の脱離量を本発明による表面を用いた反射干渉分光法により求めることで、相対湿度を測定することができる。
実施例９（粘度測定）
　実施例５での、表面へのBSAの結合過程を反射率変化と水晶発振子の振動数変化という二つの手法により観察したのと同様の実験をリゾチームおよびRNase Aについても同様に行った。この時の反射率変化の差分（光学膜厚＝表面に結合したタンパク質の絶対量）を横軸に、水晶発振子の振動数変化を縦軸に示した(図１０)。水晶発振子の振動数変化がこれまで言われてきたように、表面に結合した物質の絶対量を測定しているのであれば、二つの手法による変化量は直線的に変化し、しかもタンパク質の種類によらず同じ傾きになるはずである。しかし、図１０からも明らかなように、タンパク質によって、大きさも異なり、飽和的な応答となる。この曲線は高分子溶液粘度の濃度依存性を定式化したHuggins式によりフィッティングが可能であった（図中の曲線）。つまり、水晶発振子の振動数変化は、表面近傍の二次元液体のタンパク質溶液粘度をモニタリングしていると考えるとこの振る舞いは理解しやすい。フィッティングの結果得られるHuggins式における固有粘度に相当するパラメータをこの図から得ることが出来、その大きさは既存のタンパク質の粘弾性パラメータと良い相関性を示すことが分かった。よって、光反射率変化―振動数変化同時測定法は、タンパク質固有の動的特性評価を行える手法であると言える。
　本発明によれば、簡便な光学的な手法によって、表面吸着膜厚等をより高感度に測定することができる。

Claims (17)

  1. 　バルブ金属光干渉層を含んでなる、少なくとも１つの波長における反射光強度測定用積層構造体。
  2. 　前記バルブ金属が、チタン、アルミニウム、クロムおよびステンレス鋼から選ばれる金属である請求項１に記載の反射光強度測定用積層構造体。
  3. 　前記バルブ金属が板または薄膜である請求項１または２に記載の反射光強度測定用積層構造体。
  4. 　前記バルブ金属の酸化によりバルブ金属表面に不働態薄膜が形成されている請求項１～３のいずれか１項に記載の反射光強度測定用積層構造体。
  5. 　前記酸化が陽極酸化である請求項４に記載の反射光強度測定用積層構造体。
  6. 　前記不働態薄膜の膜厚が５ｎｍ～０．１ｍｍである請求項４又は５に記載の反射光強度測定用積層構造体。
  7. 　前記バルブ金属の厚さが４００ｎｍ～２ｍｍである請求項１～６のいずれか１項に記載の反射光強度測定用積層構造体。
  8. 　前記バルブ金属の薄膜が蒸着またはスパッタ法により形成される請求項３～７のいずれか１項に記載の反射光強度測定用積層構造体。
  9. 　前記バルブ金属の薄膜が水晶発振子の金属電極上に形成される請求項３～８のいずれか１項に記載の反射光強度測定用積層構造体。
  10. 　前記不働態薄膜上にさらに測定対象薄膜を吸着させた請求項４～９のいずれか１項に記載の反射光強度測定用積層構造体。
  11. 　前記測定対象薄膜がタンパク質、核酸、糖鎖、脂質、合成高分子化合物および低分子化合物から選ばれる請求項１０に記載の反射光強度測定用積層構造体。
  12. 　測定媒体中に設置された請求項１０又は１１のいずれかに記載の反射光強度測定用積層構造体に光を照射し、当該反射光強度測定用積層構造体からの少なくとも１つの波長における反射光強度の変化を測定することにより、前記測定対象薄膜の膜厚及び／または質量を測定する薄膜の膜厚及び／または質量測定方法。
  13. 　バルブ金属干渉層を含んでなる少なくとも１つの波長における反射光強度測定用積層構造体、当該反射光強度測定用積層構造体を収納したセル、光源、前記反射光強度測定用積層構造体に光源からの光を照射するための光照射手段、及び反射光強度測定用積層構造体からの少なくとも１つの波長における反射光強度の検出手段を備えてなる反射光強度測定装置。
  14. 　バルブ金属干渉層を含んでなる少なくとも１つの波長における反射光強度測定用積層構造体及び水晶発振子の金属電極を備えてなるセンサーチップ。
  15. 　請求項１４に記載のセンサーチップ、当該センサーチップの金属電極と接続される発振回路、及び前記センサーチップに備えられている水晶発振子の共振振動数を検出する手段を備えてなる水晶発振子マイクロバランス装置。
  16. 　請求項１３に記載の反射光強度測定装置と請求項１５に記載の水晶発振子マイクロバランス装置とが組み合わされてなり、ここで前記反射光強度測定用積層構造体が、少なくとも１つの波長における反射光強度測定と水晶発振子マイクロバランス測定の両方に使用される、装置。
  17. 　バルブ金属干渉層を含んでなる少なくとも１つの波長における反射光強度測定用積層構造体を用いて、少なくとも１つの波長における反射光強度測定及び水晶発振子マイクロバランス法による測定を行い、そして得られた反射光強度の測定値及び水晶発振子マイクロバランス測定値の関係から、反射光強度測定用積層構造体上の測定対象薄膜の粘度を測定する、粘度測定方法。
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