WO2011090154A1 - 標的配列の増幅方法、多型検出方法およびそれに用いる試薬 - Google Patents

標的配列の増幅方法、多型検出方法およびそれに用いる試薬 Download PDF

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WO2011090154A1
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nucleic acid
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敏也 細見
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アークレイ株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to a method for amplifying a target sequence containing a target site that exhibits a polymorphism of interest, a method for detecting polymorphism, and a reagent used therefor.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • CML chronic myelogenous leukemia
  • a mutation for example, T315I
  • T315I a mutation on the bcr-abl gene is considered to affect drug resistance.
  • the detection of gene mutations is required to have high reliability because they are useful for early detection and treatment in the clinical field.
  • ASP Allele Specific Primer
  • Tm Melting temperature analysis method
  • the ASP-PCR method performs PCR using a primer that is complementary to a sequence including a target site and has a base complementary to a base of the target site in a 3 'region It is a method of determining a mutation by amplification of a target sequence containing a site.
  • a mutant-type primer in which the target site is set to a mutant-type base is used as the primer, it can be determined as “mutated” if amplification is confirmed, or “normal” if amplification can not be confirmed.
  • a normal type primer in which the target site is set to a normal type base as the primer, it can be judged as "normal” if amplification is confirmed or "mutated” if amplification can not be confirmed.
  • the Tm analysis is carried out, for example, by first amplifying a target sequence containing the target site in a gene, and then hybridizing (double-stranded) a probe obtained hybridizable with the obtained amplification product and a sequence containing the target site. Nucleic acid).
  • the hybrid is heat-treated, and dissociation (melting) of the hybrid into single-stranded nucleic acid with temperature rise is detected by signal measurement such as absorbance to determine the Tm value. And a mutation is judged from this Tm value.
  • the Tm value is higher as the complementarity of both single stranded nucleic acids in the hybrid is higher and lower as the complementarity is lower. Therefore, for example, if a mutant-type probe in which the target site is set to the mutant-type base (X) is used as the probe, the mutation can be determined as follows. First, a Tm value (evaluation standard Tm value) is previously obtained for a hybrid of a target sequence in which the target site is a mutant base and the mutant probe.
  • the Tm value (measured Tm value) is determined from the amplification product amplified from the gene and the mutant probe. Then, the evaluation reference Tm value is compared with the measured Tm value. As a result, if the measured Tm value is the same as the evaluation standard Tm value, the target sequence of the amplification product and the probe are perfect match, that is, the target site is a mutant base (X) and a mutation is It can be judged that it exists. On the other hand, if the measured Tm value is lower than the evaluation standard Tm value, the target sequence of the amplification product and the probe are mismatched, and thus the target site is a normal base (Y) and no mutation is present. It can be judged.
  • the ASP-PCR method is excellent in sensitivity, there is a problem that it lacks specificity. For example, when the mutant primer is used, amplification may be confirmed and it may be judged as false positive even though there is no mutation at the target site. In the ASP-PCR method, only one of the mutant primer and the normal primer can be used in one reaction system. Therefore, in order to confirm whether the target site is mutant or normal, PCR needs to be performed for a total of two types of reaction systems using the mutant primer and reaction systems using the normal primer. Since two types of reaction systems are used in this way, the operation takes time, time and cost.
  • the Tm analysis method is excellent in specificity, the problem of false positive can be avoided, and it is possible to determine whether the target site is normal or mutant in one reaction system.
  • the Tm analysis method has a problem that the sensitivity is not sufficient.
  • the present inventors established a new polymorphism detection method using normal and mutant primers and a probe.
  • the normal primer is a primer for amplifying a normal target sequence whose target site is a normal base
  • the mutant primer is a primer for amplifying a mutant target sequence whose target site is a mutant base.
  • the probe is a probe capable of hybridizing to a sequence containing the target site.
  • amplification reaction is performed on the template nucleic acid, and further, Tm analysis is performed using the probe to detect polymorphism. According to this method, since both the normal primer and the mutant primer are used, both the normal target sequence and the mutant target sequence can be specifically amplified.
  • a normal type and a variant can be detected by one reaction system.
  • the normal primer preferentially anneals to the normal template nucleic acid rather than the mutant primer, and thus an error occurs due to the annealing of the mutant primer. Amplification is suppressed. For this reason, in the detection of polymorphism using the above-mentioned probe, it is possible to prevent the false positive of the mutation type.
  • this method it is possible to determine with excellent reliability whether the target site contains a normal type, a mutant type or both in one reaction system.
  • Tm analysis after amplification reaction may cause false positive depending on conditions.
  • conditions such as when the annealing temperature of the primer is lower than usual when there is a larger amount of polymerase than usual in the amplification reaction. It is. Under such conditions, the mutant primer may be annealed to the normal target sequence to amplify the mutant target sequence, which may result in a false positive of the mutant.
  • the present invention provides, for example, an amplification method capable of suppressing amplification due to incorrect annealing of a primer regardless of conditions of a nucleic acid sample and amplification reaction, thereby providing a polymorphism detection method capable of suppressing false positive and a reagent used therefor With the goal.
  • the method for amplifying a target sequence of the present invention comprises an amplification step of amplifying a target sequence in a template nucleic acid in a reaction system comprising the following primer (X1) and the following primer (X2):
  • the sequence is a sequence including a target site showing polymorphism, and the base (x) of the target site is a first base (x1) or a second base (x2).
  • the array (A1 ′) is A sequence complementary to a partial sequence (A1) in the template nucleic acid, In its 3 'region, it has a base (x1') complementary to the first base (x1) of the target site in the 5 'region of the partial sequence (A1),
  • the array (E1) is A sequence that is not complementary to the partial sequence (B1) adjacent to the 3 'end of the partial sequence (A1) in the template nucleic acid, Primer primer (X2) bound to the 5 'end of the sequence (A1') Has an array (A2 '),
  • the array (A2 ') is A sequence complementary to the partial sequence (A2) in the template nucleic acid, A primer having, in its 3 'region, a base (x2') complementary to the second base (x2) of the target site in the 5 'region of the partial sequence (A2)
  • the method for detecting a polymorphism of the present invention comprises the steps of: amplifying a target sequence containing a target site in a template nucleic acid by the amplification method of the present invention; and using a probe capable of hybridizing to the target sequence in the target sequence.
  • the method is characterized by including a step of detecting a polymorphism of a target site.
  • the target sequence in the template nucleic acid is a sequence containing a target site exhibiting polymorphism, and the base (x) of the target site is a first base (x1) or a second base (x2) Yes,
  • the amplification reagent for use in the amplification method of the present invention characterized in that the primer (X1) and the primer (X2) are included.
  • the detection reagent of the present invention comprises the amplification reagent of the present invention and a probe capable of hybridizing to a target sequence containing a target site in a template nucleic acid, which is used in the method of detecting the polymorphism of the present invention Detection reagent for
  • the present invention for example, false primer annealing can be prevented.
  • false positives can be suppressed, and highly reliable polymorphism detection can be performed. Therefore, the present invention can be said to be extremely useful, for example, in the recent clinical field where therapy and diagnosis are performed by gene polymorphism detection.
  • FIG. 1 is a schematic view showing an example of the primer of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic view showing an example of annealing of a primer of the present invention and its extension strand.
  • FIG. 3 is a schematic view showing an example of annealing of the primer of the present invention and its extension strand.
  • FIG. 4 is a schematic view showing an example of primer annealing and its extension strand.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of Tm analysis in Comparative Example 1-1 and Example 1-1 of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of Tm analysis in Example 1-2 of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic view showing the annealing of normal and mutant primers and their extension chains.
  • the target site is a normal base
  • the normal primer consists of a sequence complementary to a partial sequence having a normal base in the normal template nucleic acid.
  • the mutant template nucleic acid the target site is a mutant base
  • the mutant primer consists of a sequence complementary to a partial sequence having a mutant base in the mutant template nucleic acid.
  • the strand capable of annealing the normal primer and the mutant primer is referred to as a normal strand, and is indicated by (+).
  • the normal-type primer, the mutant-type primer, and the extension strand therefrom are used as a reverse strand.
  • the normal primer and the mutant primer are reverse primers for extending a reverse strand.
  • white circles indicate normal bases and black circles indicate mutant bases (the same applies hereinafter).
  • the normal primer and the mutant primer are used as reverse primers, for example, false positives may occur due to the following reasons.
  • the template nucleic acid is only the normal template nucleic acid (+)
  • the normal primer is usually easier to anneal to the normal template nucleic acid (+) than the mutant primer (FIG. 4A). Therefore, a normal extension strand (-) is generated from the normal primer as a reverse strand, and a normal extension strand (+) is generated as a forward strand from the forward primer (FIG. 4B).
  • the mismatch of the mutant primer is only for one base of the target site. Therefore, as shown in FIG.
  • the present inventors have completed the present invention in order to prevent the false annealing of the primer, which causes the false positive.
  • a site where a polymorphism of interest is generated is referred to as "target site”, and a sequence including the target site is referred to as "target sequence”.
  • target site a mutant base
  • target sequence a sequence including the target site
  • target sequence a sequence including the target site
  • the template nucleic acid is referred to as a “mutant template”
  • the target sequence as a “mutant target sequence”
  • the gene as a “mutant gene”.
  • the template nucleic acid is also referred to as a “normal template”, the target sequence as a “normal target sequence”, and the gene as a “normal gene”.
  • the “normal type” can also be called, for example, a “wild type”.
  • the nucleic acid contained in the reaction system before the start of the amplification reaction is referred to as "template nucleic acid”
  • the nucleic acid produced by the amplification reaction in the reaction system containing the template nucleic acid after the start of amplification is "Amplified product or extension chain”.
  • the template nucleic acid may be single-stranded or double-stranded.
  • any one of two single strands constituting the template may be a strand which can anneal the primer (X1) and the primer (X2).
  • the strand that can be annealed by the primer (X1) and the primer (X2) is referred to as "forward strand or (+) strand”
  • the direction is referred to as “forward direction”
  • the complementary strand is called “reverse strand or (-) strand” and the direction is called “reverse direction”.
  • a primer that anneals to the normal strand and extends the reverse strand for example, the primer (X1) and the primer (X2), etc.
  • a reverse primer is annealed to the reverse strand and the reverse strand.
  • a primer that extends a strand such as a primer (Y1) described below, is referred to as a "forward primer”.
  • a strand to which the primer (X1) and the primer (X2) can be annealed may be a "reverse strand”.
  • the terms of the normal strand (+) and the reverse strand (-) are used for explanation, but, for example, in the case of a gene, which is the sense strand and which is the antisense strand May be.
  • the end of the base sequence is the 5 'end or the 3' end, and means the 5 'end or the 3' most end of the base sequence, respectively.
  • the 5 'region is a region from the 5' end of the base sequence to several bases
  • the 3 'region is a region from the 3' end of the base sequence to several bases.
  • the number of bases is not particularly limited, and examples thereof include 1 to 10 bases, 1 to 4 bases, 1 to 3 bases and 1 to 2 bases from the end.
  • the Zth base from the end of the base sequence (Z is a positive integer) is an order from the end base to the first, for example, the first end base is the end base, from the end
  • the second base means the base next to the terminal base.
  • the method for amplifying a target sequence of the present invention comprises, as described above, an amplification step of amplifying a target sequence in a template nucleic acid in a reaction system comprising the primer (X1) and the primer (X2), the target sequence comprising It is a sequence including a target site showing polymorphism, and the base (x) of the target site is a first base (x1) or a second base (x2).
  • the primer (X1) has a sequence (A1 ') and a sequence (E1).
  • the sequence (A1 ′) is a sequence complementary to the partial sequence (A1) in the template nucleic acid, and the 3 ′ region is the first base of the target site in the 5 ′ region of the partial sequence (A1) It has a base (x1 ') complementary to x1).
  • the sequence (E1) is a sequence that is non-complementary to the partial sequence (B1) adjacent to the 3 'end of the partial sequence (A1) in the template nucleic acid, and is linked to the 5' end of the sequence (A1 ') doing.
  • the sequence (E1) is also referred to, for example, as an additional sequence.
  • the primer (X2) has a sequence (A2 ').
  • the sequence (A2 ′) is a sequence complementary to the partial sequence (A2) in the template nucleic acid, and the 3 ′ region is the second base of the target site in the 5 ′ region of the partial sequence (A2) It has a base (x2 ') complementary to x2).
  • the target site means the same site showing polymorphism in the template nucleic acid.
  • the base (x) at the target site of the template nucleic acid is not particularly limited, as long as it is a polymorphic base at the target site of interest, for example, a normal base (x wt ) and a mutant base (x mt ) Can be mentioned.
  • a primer in which the base (x) of the target site is a normal base (x wt ) is referred to as a “normal primer”
  • a primer in which a mutant base (x mt ) is referred to as a “mutant primer”.
  • the primer (X1) is a normal primer (X1 wt )
  • the primer (X2) is referred to as a mutant primer (X2 mt ).
  • the primer (X1) is a mutant primer (X1 mt )
  • the primer (X2) is called a normal type primer (X2 wt ).
  • the first base (x1) is a normal base (x wt )
  • the primer (X1) is a normal primer (X1 wt )
  • the second base (x2) is a mutant base (x mt )
  • FIG. 1A is a schematic view showing a relationship between a normal template (eg, normal gene) and the normal primer (X1 wt ), and FIG. 1B is a mutant template (eg, mutant gene); It is a schematic diagram which shows the relationship with the said mutant-type primer (X2 mt ).
  • the base (x) at the target site is the normal base (x wt )
  • the mutant template is the base (x) at the target site is the mutant base (x mt ).
  • FIG. 2 is a schematic view showing the annealing of the normal primer (X1 wt ) and the mutant primer (X2 mt ) and their extension chains.
  • the normal-type primer (X1 wt ) and the mutant-type primer (X2 mt ) can be annealed as the strand that can be annealed, indicated by (+), normal-type primer (X1 wt ) and mutant-type primer X2 mt ) as well as the extension strand from each of the above primers is the reverse strand (the same applies hereinafter).
  • white circles indicate normal bases and black circles indicate mutant bases (the same applies hereinafter).
  • the configuration of the normal primer (X1 wt ) will be described.
  • the sequence having the normal base (x wt ) at the target site in the 5 ′ region is determined as the partial sequence (A1)
  • the sequence adjacent to the 3 'end of A1) is determined as partial sequence (B1).
  • the normal primer (X1 wt ) has a sequence (A1 ') complementary to the partial sequence (A1) and a sequence (E1) non-complementary to the partial sequence (B1) I assume.
  • the partial sequence (E1) is linked to the 5 'end of the sequence (A1').
  • the complementary base (x wt ') corresponding to the normal base (x wt ) is located in the 3' region of the sequence (A1 ').
  • the mutant primer (X2 mt ) As shown in FIG. 1B, in the sequence of the mutant template (+), a sequence having a mutant base (x mt ) at the target site in the 5 'region is determined as a partial sequence (A2). On the other hand, the mutant primer (X2 mt ) is configured to have a sequence (A2 ') complementary to the partial sequence (A2). In the mutant primer (X2 mt ), the complementary base (x mt ') corresponding to the mutant base (x mt ) is located in the 3' region of the sequence (A2 '). Other configurations shown in FIG. 1 will be described later.
  • normal primers (X1 wt ) and mutant primers (X2 mt ) and their extension chains will be described.
  • the normal primer (X1 wt ) is easier to anneal to the normal template (+) than the mutant primer (X2 mt ) (FIG. 2A).
  • the annealed normal primer (X1 wt ) produces a normal extension strand (-) whose target site is normal.
  • the normal primer (X1 wt ) has an additional sequence (E1) that is not complementary to the template in the 5 'region.
  • the normal extension chain (-) is a sequence having an additional sequence (E1) in the 5 'region.
  • the forward primer generates a normal extension strand (+) complementary to the normal extension strand ( ⁇ ) (FIG. 2B). Since this normal extension strand (+) is complementary to the normal extension strand ( ⁇ ), it has a sequence (E1 ′) complementary to the additional sequence (E1) in the 3 ′ region. Therefore, as shown in FIG. 2C, the normal type extended strand (+) is annealed with the normal type primer (X1 wt ) with better affinity than the mutant type primer (X2 mt ).
  • the mutated primer (X2 mt ) has a mismatch to the target site (x wt ) and does not have a complementary sequence (E1) to the sequence (E1 ') but the normal probe (X1 wt ) This is because it matches the site (x wt ) and has a complementary sequence (E1) to the sequence (E1 ′).
  • the normal primer (X1 wt ) has the additional sequence (E1)
  • the normal extension chain (+) of the normal strand necessarily includes the sequence (E1 ').
  • the first base (x1) is set as the normal type base (x wt ) and the second base (x2) is set as the mutant type base (x mt ), but as described later, Is not limited at all.
  • the primer (X1) has the additional sequence (E1), erroneous amplification of a target sequence containing a polymorphic base that is not present can be suppressed.
  • the base (x) of the target site includes, for example, a normal base (x wt ) and a mutant base (x mt ) as described above.
  • either the first base (x1) or the second base (x2) may be a normal base (x wt ), or either may be a mutant base (x mt ).
  • a gene generally has a normal base at a target site showing polymorphism. Therefore, it is very important to determine whether or not a gene having a mutated base is present. Therefore, when amplification of the mutant target sequence is confirmed when only the normal type gene is present, the mutant type gene is present, which results in false positive. Therefore, in the present invention, it is preferable to prevent, for example, erroneous amplification of a mutant target sequence containing a mutant base.
  • the first base (x1) is a normal base (x wt )
  • the primer (X1) is a normal primer (X1 wt )
  • the second base (x2) is a mutant base (x mt )
  • the primer (X2) is a mutant primer (X2 mt ).
  • the present invention is not limited thereto.
  • the base of the target site of the template nucleic acid may be, for example, any two types of mutant bases (x mt ) may be.
  • the primer (X1) has the sequence (A1 ′) in its 3 ′ region, for example, the 3 ′ end of the sequence (A1 ′) is the same as the primer (X1).
  • the primer (X2) has the sequence (A2 ′) in its 3 ′ region, for example, the 3 ′ end of the sequence (A2 ′) is 3 of the primer (X2). 'End.
  • the sequence (A1 ') of the primer (X1) is a sequence complementary to the partial sequence (A1) of the template nucleic acid as described above, and the 3' region is 5 'of the partial sequence (A1). It has a base (x1 ') complementary to the first base (x1) of the target site in the region.
  • the sequence (A2 ') of the primer (X2) is a sequence complementary to the partial sequence (A2) of the template nucleic acid as described above, and the 3' region of the sequence of the partial sequence (A2) It has a base (x2 ') complementary to the second base (x2) of the target site in the 5' region.
  • complementary bases refer to those which are in a relation of bonding by hydrogen bonding or the like in the formation of double stranded nucleic acid, such as adenine and thymine or uracil, guanine and cytosine and the like.
  • a sequence complementary to a partial sequence means, for example, that it is capable of annealing to the whole partial sequence, and from the bases completely complementary to the partial sequence only In addition to the above sequence, the sequence may include one or more non-complementary bases to the partial sequence.
  • mismatched sequence is, for example, a sequence in which one or more bases are deleted, substituted, added or inserted compared to the perfect match sequence, except for bases complementary to the target site. Such bases are referred to as “mismatched bases”.
  • the number of mismatched bases is not particularly limited and may be, for example, 1 to 30, preferably 1 to 5, as long as it can be annealed to the partial sequence.
  • the ratio of the number of mismatched bases to the base length of the sequence (A1 ') or the sequence (A2') is not particularly limited, and is, for example, 60% or less, preferably 10% or less.
  • the sequence (A1 ′) of the primer (X1) is preferably a perfect match sequence to the partial sequence (A1)
  • the sequence (A2 ′) of the primer (X2) is the partial sequence (A2 ′) It is preferred that the perfect match arrangement is for A2).
  • the prevention of the erroneous annealing of the primer as described above can be realized with high reliability because the primer (X1) has the additional sequence (E1).
  • This effect is particularly effective when only the former is included in the sample among the template nucleic acid whose target site is the first base (x1) and the template nucleic acid whose target site is the second base (x2).
  • the sample contains not only the template nucleic acid whose target site is the first base (x1) but also the template nucleic acid whose target site is the second base (x2)
  • the target containing the first base (x1) is amplified.
  • the target sequence that includes the first base (x1) is the first It is preferred to preferentially amplify a target sequence comprising 2 bases (x2). Specifically, for example, it is preferable to preferentially amplify a target sequence containing a mutant base as the second base (x2) rather than a target sequence containing a normal base as the first base (x1). .
  • polymorphism can be used as an indicator of diseases such as cancer, so it is desirable to detect with high sensitivity whether the target site is a normal base or a mutant base.
  • biological samples such as collected tissue fragments include not only cancer cells but also large amounts of normal cells. Therefore, for a small amount of cancer cell-derived template nucleic acid in the collected tissue fragment, it is desirable to amplify the target sequence more efficiently than a large amount of normal cell-derived template nucleic acid.
  • a large amount of normal template nucleic acid is contained in a biological sample than a mutant template nucleic acid. Therefore, also in such a case, it is desirable to efficiently amplify the mutant target sequence.
  • a primer for a template having a relatively high content ratio, such as a normal gene is used as the primer (X1), and a template having a relatively low content ratio, such as a mutant gene.
  • the primer is the primer (X2)
  • the sequence (A1 ′) of the primer (X1) and the sequence (A2 ′) of the primer (X2) are set as follows.
  • the target sequence having the second base (x2) can be amplified preferentially over the target sequence having the first base (x1).
  • the sequence (A1 ′) of the primer (X1) is a region that anneals to the partial sequence (A1), and the sequence (A2 ′) of the primer (X2) anneals to the partial sequence (A2) It is an area.
  • the affinity for the perfect match sequence of the sequence (A2 ′) in the primer (X2) ie, the ease of annealing, is determined by the perfect match of the sequence (A1 ′) in the primer (X1). It is preferable to make it higher than the affinity for the sequence.
  • the adjustment of the affinity of each of the primers is not particularly limited, and can be performed, for example, by setting the Tm value.
  • the Tm value for the perfect match sequence of the sequence (A2 ′) in the primer (X2) is relative to the Tm value for the perfect match sequence of the sequence (A1 ′) in the primer (X1) It is preferable that the value be as high as possible.
  • the Tm value of the sequence (A2 ') in the primer (X2) higher than the sequence (A1') in the primer (X1) for example, a template containing the second base (x2)
  • the binding property of the sequence (A2 ′) in the primer (X2) to the nucleic acid and the extension strand containing the second base (x2) is the template nucleic acid containing the first base (x1) and the first base (x1)
  • the binding property of the sequence (A1 ′) in the primer (X1) to the extension strand can be improved. Therefore, as a result, the amplification efficiency of the target sequence containing the first base (x1) by the primer (X1) is higher than that of the target sequence having the second base (x2) by the primer (X2).
  • the amplification efficiency can be improved.
  • amplification efficiency is improved, for example, even if the content of the template nucleic acid whose target site is the second base (x2) in the sample is low, the target sequence having the second base (x2) The amplification product of is sufficiently obtained. Therefore, even for the polymorphism of the second base (x2), detection with sufficient sensitivity can be performed in Tm analysis.
  • the difference between the Tm value of the sequence (A1 ′) in the primer (X1) and the Tm value of the sequence (A2 ′) in the primer (X2) is not particularly limited, and for example, preferably more than 0 and 20 ° C. or less, More preferably, it is more than 0 and 10 ° C. or less, and particularly preferably more than 0 and 5 ° C. or less.
  • the method of setting the Tm value of the sequence (A1 ') of the primer (X1) and the Tm value of the sequence (A2') of the primer (X2) is not particularly limited.
  • the Tm value can be adjusted, for example, by the length of the sequence (A1 ') and the sequence (A2'), the GC content in each of the sequences, and the like.
  • the Tm value can be set relatively higher.
  • the length of the sequence (A2 ') of the primer (X2) is preferably set longer than the sequence (A1') of the primer (X1).
  • the Tm value of the sequence (A2 ') in the primer (X2) can be set to a value relatively higher than the Tm value of the sequence (A1') in the primer (X1).
  • the Tm value can be set relatively high.
  • the Tm value can be adjusted by both the length of the sequence (A1 ') and the sequence (A2') and the GC content.
  • LNA which is an RNA analog
  • PNA which is a peptide nucleic acid
  • BNA which is a cross-linked nucleic acid
  • the difference in length between the two is not particularly limited. It is not more than a base, preferably more than 0 and not more than 10 bases, more preferably more than 0 and not more than 5 bases.
  • the primer (X2) annealed to the partial sequence (A2) containing the second base (x2) has the primer (X1) annealed to the partial sequence (A1) containing the first base (x1). It may be easier to occur than the extension reaction of X1).
  • a target sequence having the second base (x2) can be amplified preferentially over a target sequence having the first base (x1).
  • the reactivity of the extension reaction from the primer is adjustable, and the method is not particularly limited, and can be performed by, for example, a known method. Specific examples thereof include, for example, a method of adding a substance such as a fluorescent substance and biotin, or a method of adding an addition sequence to the 5 'region of the primer (X2). These methods can be performed based on the description of, for example, JP-A-2004-337124.
  • the primer (X1) may have a base (x1 ') complementary to the first base (x1) in the 3' region of the sequence (A1 '), and preferably, the sequence (A1) In '), at least one of the first base and the second base at the 3' end is a base (x1 ') complementary to the first base (x1), more preferably, In A1 ′), the base at the 3 ′ end is the base (x1 ′).
  • the sequence of the template nucleic acid is "5 '-... acGtt ... -3'"
  • the first base (x1) is capital letter "G”.
  • the primer (X1) has a sequence "5 '-...
  • the first base at the 3 'end is a base (x1') complementary to the first base (x1), and further, at least one of the second to the 5 'end of the 3' end It is preferable to set a base as a mismatched base with respect to the template nucleic acid.
  • at least one of the second and third bases of the 3 'end is preferably set as a mismatch base for the template nucleic acid, and the second base of the 3' end is set as a mismatch base. More preferable.
  • the sequence of the template nucleic acid is “5′ ⁇ ⁇ acG t t ⁇ 3 ′ ′, and the first base (x1) is capital letter“ G ”.
  • they may be designed to have a sequence “5′ -... At C-3 ′” which is not a complementary base (a) but a mismatch base ( t ).
  • the second base at the 3 'end is a base (x1') complementary to the first base (x1), and the first and / or third one at the 3 'end. It is preferable to set at least one base from 5 to the 5 'end as a mismatch base to the template nucleic acid. Among them, at least one of the first and third bases of the 3 'end is preferably set as the mismatch base, and more preferably, the third base of the 3' end is set as the mismatch base. For example, in the same manner as described above, it is assumed that the sequence in the template nucleic acid is “5′ ⁇ ⁇ acG t t ⁇ 3 ′ ′, and the first base (x1) is capital letter“ G ”.
  • the third base is the base (t) of the template nucleic acid underline rather than complementary bases (a) with respect to, it may be designed to sequence mismatched bases (t) "5'- ⁇ a t Cg-3 '".
  • the primer (X2) may have a base (x2 ') complementary to the second base (x2) in the 3' region of the sequence (A2 '), preferably, the sequence (A2) In '), at least one of the first base and the second base at the 3' end is a base (x2 ') complementary to the second base (x2), more preferably, In A2 ′), the base at the 3 ′ end is the above base (x2 ′).
  • the sequence of the template nucleic acid is "5 '-... acAtt ... -3'" and the second base (x2) is capital letter "A”.
  • the primer (X2) has a sequence "5 '-...
  • the first base at the 3 'end is a base (x2') complementary to the second base (x2), and at least one from the second to the 5 'end of the 3' end. It is preferable to set a base as a mismatched base with respect to the template nucleic acid. Among them, at least one of the second and third bases of the 3 'end is preferably set as a mismatch base for the template nucleic acid, and the second base of the 3' end is set as a mismatch base. More preferable. For example, in the same manner as described above, the sequence in the template nucleic acid is assumed to be “5′-... AcA t t... -3 ′”, and the second base (x2) is capital letter “A”.
  • the sequence may be designed to have a sequence "5 ' -... at T-3'" which is not a base (a) complementary to t) but a mismatch base ( t ).
  • the second base at the 3 'end is a base (x2') complementary to the second base (x2), and the first to third ends of the 3 'end and / or the third to the fifth It is preferable to set at least one base to the 'end as a mismatch base to the template nucleic acid.
  • At least one of the first and third bases of the 3 'end is preferably set as the mismatch base, and more preferably, the third base of the 3' end is set as the mismatch base.
  • the first and third bases of the 3 'end is preferably set as the mismatch base, and more preferably, the third base of the 3' end is set as the mismatch base.
  • the specificity of the primer (X2) for a sequence containing the second base (x2) can be further improved.
  • the additional sequence (E1) of the primer (X1) is non-complementary to the partial sequence (B1) of the template nucleic acid adjacent to the 3 ′ end of the partial sequence (A1) as described above.
  • the sequence is linked to the 5 'end of the sequence (A1').
  • “a sequence that is not complementary to a partial sequence” means, for example, that it can not anneal to the partial sequence (the same applies hereinafter).
  • the complementarity between the partial sequence (B1) of the template nucleic acid and the additional sequence (E1) is, for example, preferably 90% or less, more preferably 50% or less, and still more preferably 10% or less when the both are aligned. It is preferable that the additional sequence (E1) is a sequence consisting only of completely non-complementary bases to the partial sequence (B1).
  • the base length of the addition sequence (E1) is not particularly limited, and is, for example, 1 to 50 bases, preferably 1 to 20 bases, and more preferably 1 to 10 bases.
  • the base length of the additional sequence (E1) is, for example, 1/50 to 1/1, preferably 1/50 of the base length of the sequence (A1 ′) of the primer (X1).
  • the length is 20 to 1/1, more preferably 1/10 to 1/2.
  • the primer (X2) may further have a sequence (E2).
  • the sequence (E2) is, for example, a sequence that is not complementary to the partial sequence (B2) adjacent to the 3 'end of the partial sequence (A2) in the template nucleic acid.
  • the sequence (E2) is also referred to, for example, as an additional sequence.
  • FIG. 1B is a schematic view showing the relationship between a template and a primer (X2).
  • a sequence having the base (x2) of the target site in the 5 ′ region is determined as a partial sequence (A2), and 3 ′ of the partial sequence (A2) The sequence adjacent to the end is determined as the partial sequence (B2).
  • the primer (X2) has a sequence (A2 ') complementary to the partial sequence (A2) and a sequence (E2) non-complementary to the partial sequence (B2).
  • the additional sequence (E2) is linked to the 5 'end of the sequence (A2').
  • the complementary base (x2 ') corresponding to the second base (x2) of the target site is located in the 3' region of the sequence (A2 ').
  • the addition sequence (E2) is preferably a sequence different from the addition sequence (E1).
  • the primer (X2) has the additional sequence (E2), for example, the specificity of the primer (X2) for the sequence having the second base (x2) can be improved, and as a result, It is possible to amplify a target sequence in which the target site is the second base (x2) with better amplification efficiency.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the annealing of each of the primers to the template nucleic acid and the extension strand when using the primer (X1) having the additional sequence (E1) and the primer (X2) having the additional sequence (E2) It is.
  • the primer (X1) is set to a normal primer (X1 wt )
  • the primer (X2) is set to a mutant primer (X2 mt ), but as described above, the present invention It is not limited to
  • FIG. 3 is a schematic view showing the annealing state of each primer when using a normal primer (X1 wt ) and a mutant primer (X2 mt ) in the present invention.
  • the normal template (+) and the mutant template (+) are contained in the sample, usually, the normal template (X1 wt ) tends to be easily annealed to the normal template (+), The mutant primer (X2 mt ) is easily annealed to the mutant template (+) (FIG. 3A).
  • the annealed normal primer (X1 wt ) has an additional sequence (E1). Therefore, the normal extension strand (-) from the normal primer (X1 wt ) has the additional sequence (E1) on the 5 'side.
  • the annealed mutant primer (X2 mt ) has an additional sequence (E2). Therefore, the mutated extension chain (-) from the primer (X2 mt ) has the additional sequence (E2) on the 5 'side. Therefore, the complementary normal extension strand (+) generated based on the normal extension strand ( ⁇ ) by the forward primer is a sequence (E1 ′) complementary to the additional sequence (E1). And a complementary mutant extension strand (+) generated based on the mutant extension strand (-) has a sequence (E2 ') complementary to the additional sequence (E2) ( Figure 3B).
  • the sequence of the addition sequence (E1) of the normal primer (X1 wt ) and the addition sequence (E2) of the mutant primer (X2 mt ) differ from each other.
  • the normal primer (X1 wt ) having the additional sequence (E1) is specifically annealed, and the mutant extended strand (+) is specifically annealed the mutant primer (X2 mt ) having the additional sequence (E2) Do. Therefore, the normal type extended strand is amplified with excellent amplification efficiency by the normal type primer (X1 wt ), and the mutant type extended strand is amplified with excellent amplification efficiency by the mutant type primer (X2 mt ).
  • the primer (X1) it is also possible to preferentially carry out amplification with the primer (X2).
  • the first base (x1) is set as the normal base (x wt )
  • the second base (x2) is set as the mutant base (x mt ), but as described above, Is not limited at all.
  • the additional sequence (E2) of the primer (X2) is, for example, a sequence non-complementary to the partial sequence (B2) of the template nucleic acid, as described above.
  • the complementarity between the partial sequence (B2) and the additional sequence (E2) in the template nucleic acid is, for example, preferably 90% or less, more preferably 50% or less, and still more preferably 10% or less when the both are aligned. It is preferable that the additional sequence (E2) be a sequence consisting of only completely non-complementary bases to the partial sequence (B2).
  • the additional sequence (E1) of the primer (X1) and the additional sequence (E2) of the primer (X2) are, for example, different sequences.
  • the homology between the additional sequence (E1) and the additional sequence (E2) is, for example, preferably 90% or less, more preferably 50% or less, still more preferably 10% or less, when aligning the both. Preferably it is 0%.
  • the base length of the addition sequence (E2) is not particularly limited, and is, for example, 1 to 50 bases, preferably 1 to 20 bases, and more preferably 1 to 10 bases.
  • the base length of the additional sequence (E2) is, for example, 1/50 to 1/1, for example, preferably 1/50 to the base length of the sequence (A2 ') in the primer (X2).
  • the length is 20 to 1/1, more preferably 1/10 to 1/2.
  • the addition sequence (E2) preferably has, for example, the same base length as the addition sequence (E1) of the primer (X1).
  • the base length of the primer (X1) and the base length of the primer (X2) are not particularly limited.
  • the primer (X1) is, for example, 10 to 50 bases in length, preferably 15 to 45 bases in length, and more preferably 16 to 40 bases in length.
  • the primer (X2) is, for example, 10 to 50 bases in length, preferably 15 to 45 bases in length, more preferably 16 to 40 bases in length.
  • said primer (X2) consists only of said sequence (A2 ')
  • it is 10 to 50 bases long, preferably 15 to 40 bases long, more preferably 16 to 35 Base length.
  • the primer (X2) contains, for example, the sequence (A2 ′) and the addition sequence (E2)
  • the length is, for example, 10 to 50 bases, preferably 15 to 40 bases, and more preferably It is 16 to 35 bases long.
  • primer (Y1) may be further used in combination with the primer (X1) and the primer (X2) in the amplification step.
  • Primer (Y1) Primer having a partial sequence (C) on the 5 'side of the target site in the template nucleic acid
  • FIG. 1C is a schematic view showing the relationship between a template and a primer (Y1).
  • a partial sequence 5 'to the target site contained in the partial sequence (A1) is determined as the sequence (C).
  • the primer (Y1) is configured to have the partial sequence (C).
  • the reverse strand (-) which is the complementary strand of the normal strand (+)
  • the primer (Y1) is, for example, a forward primer that extends a forward strand while the primer (X1) and the primer (X2) are primers that extend a reverse strand. Therefore, for example, the primer (Y1) which is a forward primer, and the primer (X1) and the primer (X2) which is a reverse primer each become a pair of primers.
  • the primer (Y1) is a primer that anneals to a region different from the target site, for example, the target sequence can be amplified regardless of the type of base at the target site.
  • the length of the primer (Y1) is not particularly limited, and generally, it is preferably 10 to 50 bases, more preferably 15 to 40 bases, and particularly preferably 16 to 35 bases.
  • the primer (Y1) may have a partial sequence (C) on the 5 'side of the target site in the template nucleic acid.
  • the primer (Y1) may have an additional sequence, for example, on its 5 'side.
  • the additional sequence is preferably a sequence different from the sequence 5 'to the partial sequence (C) in, for example, a template.
  • a probe capable of hybridizing to a sequence including the target site in the template nucleic acid may be added to the reaction system.
  • the probe include a labeled probe having a labeling substance.
  • amplification can be performed using any of single-stranded nucleic acid and double-stranded nucleic acid as a template nucleic acid.
  • double-stranded nucleic acid for example, amplification may be performed using the two complementary single strands that constitute it as templates.
  • the template nucleic acid is a double stranded nucleic acid
  • the target site in the (+) strand and the target site in the ( ⁇ ) strand correspond to each other.
  • the probe used in the polymorphism detection method of the present invention described later may be, for example, a probe capable of hybridizing to the (+) strand or a probe capable of hybridizing to the ( ⁇ ) strand.
  • the template nucleic acid may be single-stranded or double-stranded as described above.
  • Examples of the template nucleic acid include DNA, and total RNA, RNA such as mRNA, and the like.
  • the template nucleic acid may be, for example, a nucleic acid in a sample or an amplification product of the nucleic acid.
  • examples include nucleic acids contained in samples such as biological samples.
  • the former includes, for example, the nucleic acid originally contained in the biological sample.
  • the latter is preferable, for example, because the detection accuracy can be improved, and the amplification product can be prepared, for example, by amplifying the nucleic acid in the sample as a template by a nucleic acid amplification method.
  • the amplification product may be, for example, an amplification product using DNA in the sample as a template, or an amplification product using cDNA synthesized from RNA in the sample as a template.
  • RNA in the sample examples include RNA such as total RNA and mRNA, and the cDNA can be synthesized, for example, from the RNA by RT-PCR (Reverse Transcription PCR).
  • the length of the amplification product is not particularly limited, and is, for example, 50 to 1000 bases, preferably 80 to 200 bases.
  • the amplification step it is preferable to perform an amplification reaction using a nucleic acid in a sample as a template.
  • the sample is not particularly limited as long as it is a sample containing a nucleic acid as a template, and examples thereof include a sample containing a nucleic acid derived from a biological sample.
  • the biological sample is, for example, whole blood, blood cells such as white blood cells, bone cells in the oral cavity such as bone marrow, oral mucosa, somatic cells such as nail cells and hair cells, germ cells, sputum, amniotic fluid, paraffin embedded tissue Urine, gastric juice, gastric lavage, etc., and their suspensions etc. may be mentioned.
  • a reaction solution obtained by performing nucleic acid amplification using a nucleic acid derived from a biological sample as a template may be used as a nucleic acid sample in the present invention, and an amplification product contained in the reaction solution may be used as a template nucleic acid.
  • the present invention is particularly suited to the application of unpurified samples, as the present invention, as mentioned above, can suppress false annealing of primers regardless of whether the sample is purified or unpurified. As described above, if the method can use an unpurified sample, the pretreatment for purification can be omitted, so that the operation is further simplified and the cost can be reduced.
  • the sample is not particularly limited.
  • a nucleic acid whose target site is unknown whether it is a mutant or a normal type The present invention is very useful for a sample containing H, a sample containing a nucleic acid having a mutated form and a nucleic acid having a normal form, a sample possibly containing these, and the like.
  • the origin of nucleic acids such as the DNA and RNA is not limited, and examples thereof include cells such as various cancer cells, viruses, and mitochondria.
  • the polymorphism detection method of the present invention is particularly preferably applied to a sample having a nucleic acid exhibiting a mutated form and a nucleic acid exhibiting a normal form, for example, biological samples such as various cancer cells such as leukemia, It is preferable to apply to blood samples, white blood cells and the like.
  • the method for collecting a sample, the method for preparing a nucleic acid and the like are not limited, and conventionally known methods can be adopted.
  • the nucleic acid derived from the biological sample can be isolated from the biological sample, for example, by a conventionally known method.
  • a commercially available genomic DNA isolation kit (trade name GFX Genomic Blood DNA Purification kit; manufactured by GE Healthcare Biosciences) can be used.
  • amplification in the same reaction system can be, for example, amplification of a target sequence in one reaction solution.
  • the amplification method of the present invention is characterized in that the aforementioned primers are used in the amplification step, and the other steps, conditions and the like are not limited at all.
  • the nucleic acid amplification method in the amplification step is not particularly limited.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • NASBA Nucleic acid sequence based amplification
  • TMA Transcription-mediated amplification
  • SDA String Displacement Amplification
  • the conditions in particular of a nucleic acid amplification method are not restrict
  • the addition ratio of the nucleic acid sample in the reaction system (for example, reaction solution) of the amplification reaction is not particularly limited.
  • the nucleic acid sample is a biological sample (for example, whole blood sample)
  • the lower limit of the addition ratio of the biological sample in the reaction system is, for example, preferably 0.01% by volume, more preferably 0.05. % By volume, more preferably 0.1% by volume.
  • the upper limit of the addition ratio is not particularly limited, and is preferably 2% by volume, more preferably 1% by volume, and still more preferably 0.5% by volume.
  • the addition ratio of the biological sample (for example, whole blood sample) in the reaction system is, for example, 0.1 to 0.5. It is preferable to set to volume%.
  • a heat treatment is usually applied for DNA denaturation (dissociation into single-stranded DNA), but this heat treatment denatures sugars and proteins contained in the sample, resulting in insolubilized precipitate or turbidity. Etc. may occur. For this reason, when the presence or absence of mutation is confirmed by an optical method, the occurrence of such a precipitate or turbidity may affect the measurement accuracy.
  • the addition ratio of the biological sample in the reaction system is set to the above-mentioned range, the mechanism is unclear, but, for example, the influence by the generation of a precipitate due to denaturation can be sufficiently prevented. Accuracy can be improved. In addition, since the inhibition of PCR by contaminants in the biological sample is sufficiently suppressed, the amplification efficiency can be further improved. Therefore, setting the addition rate of a biological sample such as a whole blood sample in the above-mentioned range can eliminate the need for pretreatment of the sample, for example, to prevent or remove the occurrence of sediment or turbidity. .
  • the proportion of the whole blood sample in the reaction system is represented by the weight proportion of hemoglobin (hereinafter referred to as “Hb”), not the volume proportion as described above (for example, 0.1 to 0.5 volume%). It can also be done.
  • the ratio of whole blood sample in the reaction system is, for example, preferably 0.565 to 113 g / L, more preferably 2.825 to 56.5 g / L, more preferably Hb, in terms of Hb amount. Of 5.65 to 28.25 g / L.
  • the addition ratio of the whole blood sample in the reaction system may satisfy both the volume ratio and the Hb weight ratio, for example, or may satisfy either one.
  • the whole blood may be any of, for example, hemolyzed whole blood, unlysed whole blood, anticoagulated whole blood, whole blood containing a clotted fraction, and the like.
  • albumin it is preferable to further add albumin to the reaction system prior to the start of the amplification reaction.
  • albumin for example, the influence of the occurrence of precipitates or turbidity as described above can be further reduced, and the amplification efficiency can be further improved.
  • the addition ratio of albumin in the reaction system is, for example, 0.01 to 2% by weight, preferably 0.1 to 1% by weight, and more preferably 0.2 to 0.8% by weight.
  • the albumin is not particularly limited, and examples thereof include bovine serum albumin (BSA), human serum albumin, rat serum albumin, horse serum albumin and the like, and any one of them may be used, or two or more of them may be used in combination. May be bovine serum albumin (BSA), human serum albumin, rat serum albumin, horse serum albumin and the like, and any one of them may be used, or two or more of them may be used in combination. May be
  • BSA bovine serum albumin
  • amplification is performed by PCR using a normal primer (X1 wt ) as the primer (X1) and a mutant primer (X2 mt ) as the primer (X2) Explain the method.
  • the present invention is not limited to this.
  • the conditions for PCR are not particularly limited, and can be performed by a conventionally known method.
  • a PCR reaction solution containing a template nucleic acid and the various primers described above is prepared.
  • the addition ratio of various primers in the PCR reaction solution is not particularly limited, and the normal primer (X1 wt ) is preferably added, for example, to 0.01 to 10 ⁇ mol / L, more preferably 0. It is 05 to 5 ⁇ mol / L, particularly preferably 0.1 to 1 ⁇ mol / L.
  • the mutant primer (X2 mt ) is preferably added, for example, to 0.01 to 10 ⁇ mol / L, more preferably 0.05 to 5 ⁇ mol / L, and particularly preferably 0.1 to 0. It is 5 ⁇ mol / L.
  • Molar ratio of the normal type primer (X1 wt) and mutant primer (X2 mt) (X1 wt: X2 mt) , for example, 0.001: 1 to 10: 1, more preferably more preferably, It is 0.01: 1 to 2: 1, particularly preferably 0.1: 1 to 1: 1.
  • the primer (Y1) is, for example, 0.01 to 10 ⁇ mol / L. It is preferable to add so as to be, more preferably 0.05 to 5 ⁇ mol / L, and particularly preferably 0.1 to 1 ⁇ mol / L.
  • the molar ratio (X2 mt : Y1) of the mutant primer (X2 mt ) to the primer (Y1) is, for example, preferably 1: 0.001 to 1:10, and more preferably 1: 0 .01 to 1: 2, particularly preferably 1: 0.1 to 1: 1.
  • the reaction solution may further contain other components, and for example, preferably contains components involved in the PCR reaction.
  • the other components are not particularly limited, and can be appropriately set by those skilled in the art.
  • examples of the other components include polymerases such as DNA polymerase, nucleoside triphosphates, solvents, and various catalysts.
  • the order of addition of the components is not limited.
  • the DNA polymerase is not particularly limited, and, for example, polymerases derived from thermostable bacteria known in the art can be used. Specific examples are: Thermus aquaticus- derived DNA polymerase (US Pat. Nos. 4,889,818 and 5,079,352) (trade name: Taq polymerase), Thermus thermophilus ( Thermus thermophilus ) DNA polymerase (WO 91/09950) (rTth DNA polymerase), DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus (WO 92/9689) (Pfu DNA polymerase: manufactured by Stratagenes), polymerase derived from Thermococcus litoralis ( Thermococcus litoralis ) (EP-A 455 430 (Vent trademark): New Eng and Biolabs Corp.) are commercially available, among others, Thermus aquaticus (Thermus aquaticus) derived from thermostable polymerases are preferred.
  • the addition ratio of the DNA polymerase in the reaction solution is not particularly limited, and is, for example, 1 to 100 U / mL, preferably 5 to 50 U / mL, more preferably 20 to 40 U / mL.
  • the activity unit (U) of DNA polymerase generally has 1 U activity of incorporating 10 nmol of total nucleotides into acid-insoluble precipitate in 30 minutes at 74 ° C. in a reaction solution for activity measurement, using activated salmon sperm DNA as a template primer. It is.
  • the composition of the reaction liquid for activity measurement is, for example, 25 mmol / L TAPS buffer (pH 9.3, 25 ° C.), 50 mmol / L KCl, 2 mmol / L MgCl 2 , 1 mmol / L mercaptoethanol, 200 ⁇ mol / L dATP, 200 ⁇ mol / L dGTP, 200 ⁇ mol / L dTTP, 100 ⁇ mol / L “ ⁇ - 32 P” dCTP, 0.25 mg / mL activated salmon sperm DNA.
  • the nucleoside triphosphates generally include dNTP (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP or dUTP).
  • dNTP dATP, dCTP, dGTP, and dTTP or dUTP
  • the addition ratio of dNTP in the reaction solution is not particularly limited, and is, for example, 0.01 to 1 mmol / L, preferably 0.05 to 0.5 mmol / L, and more preferably 0.1 It is ⁇ 0.3 mmol / L.
  • the solvent examples include buffers such as Tris-HCl, Tricine, MES, MOPS, HEPES and CAPS, and commercially available buffers for PCR, buffers for commercially available PCR kits, and the like can be used.
  • the reaction solution may further contain heparin, betaine, KCl, MgCl 2 , MgSO 4 , glycerol and the like, and the addition ratio thereof may be set, for example, in a range that does not inhibit the PCR reaction.
  • the total volume of the reaction solution is not particularly limited, and can be appropriately set according to, for example, the device to be used such as a thermal cycler, but is usually 1 to 500 ⁇ L, preferably 10 to 100 ⁇ L.
  • PCR includes, for example, three steps of (1) dissociation of double-stranded nucleic acid into single-stranded nucleic acid, (2) annealing of primers, and (3) extension of primers (polymerase reaction).
  • the conditions of each step are not particularly limited, and for example, the step (1) is preferably 90 to 99 ° C. for 1 to 120 seconds, more preferably 92 to 95 ° C.
  • the step is, for example, 40 to 70 ° C., preferably 1 to 300 seconds, more preferably 50 to 70 ° C., 5 to 60 seconds, and the step (3) may be, for example, 50 to 80 ° C., 1 It is preferably 300 seconds, more preferably 50 to 75 ° C., 5 to 60 seconds.
  • the number of cycles is not particularly limited, and for example, 30 cycles or more are preferable, with the three steps (1) to (3) as one cycle.
  • the upper limit is not particularly limited, and is, for example, 100 cycles or less in total, preferably 70 cycles or less, more preferably 50 cycles or less.
  • the temperature change of each step may be automatically controlled using, for example, a thermal cycler or the like.
  • each target sequence can be amplified simultaneously for two or more types of genes in one reaction system, or two or more types each including polymorphism at different sites for the same gene. It is also possible to amplify the target sequence of In this case, the aforementioned primer (X1) and primer (X2), and optionally the primer (Y1) may be prepared for each target sequence of interest, and the aforementioned amplification reaction may be performed in the coexistence of these.
  • the method for amplifying a target sequence of the present invention may further comprise the step of detecting an amplification product obtained by the aforementioned amplification reaction.
  • This allows, for example, detection of polymorphisms of target sites in the target sequence.
  • the polymorphism detection can be confirmed, for example, by Tm analysis as described later.
  • a probe capable of hybridizing to a target sequence including the target site in the template sequence is further added to the reaction system of the amplification reaction in the amplification step. Then, the temperature of the reaction system is changed, and a signal value indicating the melting state of the hybrid of the amplification product and the probe is measured.
  • the timing of addition of the probe is not particularly limited, and may be added to the reaction system, for example, before, during, or after the amplification reaction. Among them, for example, it is not necessary to expose the reaction solution to the external environment for the addition of the probe, and since the amplification reaction and the measurement of the signal value can be performed continuously, the probe Is preferably added before the amplification reaction.
  • the polymorphism detection is specifically described in the polymorphism detection method of the present invention described later. Moreover, it is as below-mentioned also regarding the said probe etc.
  • ⁇ Polymorphism detection method> In the method of detecting a polymorphism of the present invention, as described above, the step of amplifying a target sequence including a target site in a template nucleic acid by the amplification method of the present invention, and a probe capable of hybridizing to the target sequence And detecting the polymorphism of the target site in the target sequence.
  • the present invention is characterized in that a target sequence is amplified by the above-mentioned method and a polymorphism is detected by a probe for the obtained amplification product, and the other steps, conditions and the like are not limited at all.
  • the detection method of the present invention may include, for example, the following steps (a) to (c).
  • the present invention is preferably applied to a sample containing nucleic acid, and the sample is not particularly limited, and the same samples as described above can be mentioned. Further, the type of the template nucleic acid is not particularly limited, and examples thereof include the same nucleic acids as described above.
  • the probe is hereinafter also referred to as a “detection probe”.
  • the probe is not particularly limited, and can be set by a conventionally known method.
  • the template nucleic acid is double-stranded, it may be designed to hybridize to the target sequence of the sense strand (a probe for detection of the sense strand) or to hybridize to the target sequence of the antisense strand. It may be designed (probe for detection of antisense strand).
  • the base at the target site in the target sequence may be set to, for example, a normal base or a mutant base.
  • the base corresponding to the base of the target site in the target sequence may be, for example, complementary to a normal base or complementary to a mutant base. May be.
  • the base corresponding to the base of the target site is complementary to the mutant base and non-complementary to the normal base. Is preferred.
  • the probe may be a sequence capable of hybridizing to a target sequence including the target site.
  • the sequence of the probe is not particularly limited, and for example, 90% to 100% of complementarity with the target sequence except for the base of the site paired with the target site during hybridization, for example. Preferably, it is 100%, that is, a perfect match sequence with the target sequence.
  • the addition ratio of the probe in the reaction system is not particularly limited, and for example, the probe is preferably added so as to be in the range of 10 to 400 nmol / L, and more preferably 20 to 200 nmol / L.
  • the probe is a labeled probe labeled with a labeling substance such as a fluorescent dye, for example, an unlabeled probe having the same sequence as the labeled probe in order to adjust signal intensity such as fluorescence intensity to be detected You may use together.
  • the unlabeled probe may have, for example, a phosphate group at its 3 'end.
  • the molar ratio of the labeled probe to the unlabeled probe is preferably, for example, 1:10 to 10: 1.
  • the length of the probe is not particularly limited, and is, for example, 5 to 50 bases in length, preferably 10 to 30 bases in length.
  • the probe may be added to the reaction system of the amplification reaction after the step (a), that is, after the amplification reaction of the target sequence is performed, but the analysis can be easily and rapidly performed. It is preferable to add to the reaction system in advance prior to the amplification reaction in the step).
  • the addition ratio and the like of various probes in the reaction system are as described above.
  • a phosphate group may be further added to its 3 'end, for example, to prevent the extension of the probe itself,
  • the 3 'end may be labeled with a labeling substance as described above.
  • the polymorphism detection method of the present invention can be used for so-called Tm analysis (also referred to as melting curve analysis) as described above.
  • Tm analysis also referred to as melting curve analysis
  • the Tm value in the Tm analysis will be described.
  • the absorbance at 260 nm increases. This is because the hydrogen bond between both strands in double-stranded DNA is released by heating and dissociated into single-stranded DNA (DNA melting).
  • DNA melting single-stranded DNA
  • the melting temperature Tm is generally defined as the temperature at which the absorbance reaches 50% of the total increase in absorbance.
  • the measurement of the signal value indicating the melting state of the hybrid of the amplification product and the probe may be measurement of absorbance at 260 nm as described above, but may be measurement of the signal of the labeling substance.
  • a labeled probe labeled with a labeling substance as the probe to measure the signal of the labeling substance.
  • the labeled probe include a labeled probe that exhibits a signal alone and does not exhibit a signal upon hybridization, or a labeled probe that alone exhibits no signal and exhibits a signal upon hybridization.
  • the former probe does not show a signal when forming a hybrid (for example, double-stranded DNA) with an amplification product, and shows a signal when the probe is dissociated from the amplification product by heating.
  • a signal is shown by forming a hybrid (for example, double-stranded DNA) with the amplification product, and the signal decreases (disappears) when the probe is dissociated from the amplification product by heating. Therefore, by detecting the signal of the labeling substance, the progress of melting of the hybrid, the determination of the Tm value, and the like can be performed as in the absorbance measurement at 260 nm.
  • the signal detection of the labeling substance may be performed, for example, under conditions specific to the signal of the labeling substance, and the conditions include, for example, an excitation wavelength, a detection wavelength, and the like.
  • the detection of the polymorphism of the target site from the fluctuation of the signal value can be performed by a conventional method.
  • a specific example compares the variation of the signal value with the variation of the hybrid of the probe and the variant target sequence and / or the variation of the hybrid of the probe and the wild-type target sequence, It can be judged whether it is wild type. That is, if it is the same as the mutant type, it can be judged as the wild type if it is the same as the mutant type.
  • the Tm value is obtained from the fluctuation of the signal, and the polymorphism can be determined by comparison with the Tm value of the evaluation standard. First, the Tm value is obtained from the fluctuation of the signal value.
  • the measured Tm value is compared with the previously determined Tm wt value for the wild-type target sequence and / or the Tm mt value for the mutant target sequence. And if the measured Tm value is the same as or similar to the Tm value wt of the evaluation standard, it is wild type, if it is lower than the Tm wt value, the mutant type is the same or similar to the Tm mt value of the evaluation standard If the mutant type is lower than the T m m value, it can be judged as a wild type.
  • the same degree is, for example, about ⁇ 3 ° C.
  • step (a) two or more types of target sequences can be amplified simultaneously in the same reaction system. And about each amplification product, the polymorphism of each target site can be confirmed.
  • a hybridizing probe may be prepared for each target sequence including the target site. It is preferable that each of the probes use a labeled probe labeled with different labeling substances that are detected under different conditions. If such a probe is used, each polymorphism can be detected by changing the detection condition even in the same reaction system.
  • the site to be labeled with the labeling substance in the labeling probe is not particularly limited.
  • the labeling site is preferably, for example, a 5 'region or a 3' region, and more preferably a 1 to 4 position from the 5 'end or 3' end, Preferably, it is the first to third position, particularly preferably the first (5 'end or 3' end) or the second.
  • cytosine (c) or guanine (g) is preferable as the base to be labeled by the labeling substance.
  • the labeling substance may, for example, directly label a base, or indirectly label the base by labeling any site (eg, phosphate group) of a nucleotide residue containing the base. May be
  • the labeling substance is not particularly limited, and for example, one that emits a signal depending on whether the labeling probe is alone or forms a hybrid is preferable.
  • the type of the signal is not particularly limited, and examples thereof include fluorescence, color, and color.
  • the signal value may be, for example, fluorescence intensity.
  • the signal value may be, for example, reflectance, absorbance, transmittance or the like.
  • the signal may, for example, be emitted directly from the labeling substance or may be emitted indirectly.
  • the labeling substance is not particularly limited, and examples thereof include fluorescent substances such as fluorophores.
  • fluorescent substances include fluorescein, phosphor, rhodamine, polymethine dye derivative and the like, and commercially available fluorescent substances include, for example, Pacific Blue (registered trademark, manufactured by Molecular Probes), BODIPY FL (registered trademark, molecular, etc.) Probe Corporation), FluorePrime (trade name, Amersham Pharmacia), Fluoredite (trade name, Millipore), FAM (registered trademark, manufactured by ABI), Cy3 and Cy5 (trade name, manufactured by Amersham Pharmacia), TAMRA (Registered trademark, manufactured by Molecular Probes, Inc.) and the like.
  • the detection conditions of the fluorescent substance are not particularly limited, and can be determined as appropriate depending on, for example, the type of fluorescent substance used.
  • Pacific Blue can be detected at a detection wavelength of 450 to 480 nm
  • TAMRA can be detected at a detection wavelength of 585 to 700 nm
  • BODIPY FL can be detected at a detection wavelength of 515 to 555 nm. If such a probe is used, for example, by detecting fluorescence as a signal and measuring fluorescence intensity as a signal value, hybridization and dissociation can be easily confirmed from fluctuations in fluorescence intensity.
  • the labeled probe is preferably, for example, a labeled probe showing a signal alone and showing no signal by hybridization, or a labeled probe showing no signal alone and showing a signal by hybridization.
  • the labeling substance is a fluorescent substance
  • a probe which is labeled with the fluorescent substance exhibits fluorescence alone, and which decreases fluorescence (for example, quenching) by hybridization is preferable.
  • fluorescence quenching phenomenon Quenching phenomenon
  • Probes utilizing this phenomenon are generally referred to as fluorescence quenching probes.
  • the fluorescence quenching probe is preferably, for example, that the 3 'end or the 5' end of the oligonucleotide is labeled with the fluorescent substance, and the terminal base to be labeled is cytosine (c) or guanine (G) is preferable.
  • the fluorescence quenching probe is, for example, a base that forms a pair with the labeled terminal cytosine (c) in the amplification product when it forms a hybrid with the amplification product It is preferable to design the base sequence of the fluorescence quenching probe such that the base separated by 1 to 3 bases from the base pair is guanine (g).
  • the base separated by one base from the pair of bases means the base next to the pair of bases.
  • a probe is generally called a guanine quenching probe and is known as a so-called QProbe (registered trademark).
  • QProbe registered trademark
  • the fluorescence quenching probe is paired with a labeled terminal guanine (g) in the amplification product when forming a hybrid with the amplification product. It is preferable to design the base sequence of the fluorescence quenching probe such that the cytosine (c) is a base which is separated by 1 to 3 bases from the base forming the pair or the pair of bases.
  • the probe may have, for example, a phosphate group at the 3 'end, as described above.
  • the probe can be allowed to coexist in the reaction system of the amplification reaction.
  • a phosphate group is added to the 3 'end of the probe, it is possible to sufficiently prevent the probe itself from being elongated by the amplification reaction.
  • the same effect can also be obtained by adding a labeling substance as described above to the 3 'end.
  • the polymorphism detection method of the present invention will be described by taking an amplification reaction by PCR and using a labeled probe as the detection probe.
  • the present invention is not limited to this.
  • PCR is performed as described above using a reaction solution to which a sample containing a template nucleic acid, the various primers in the present invention described above, and a labeled probe that hybridizes to the target sequence are added.
  • the reaction solution may contain, for example, DNA polymerase, dNTP, and other various additives which can be used for nucleic acid amplification, in addition to the various primers and the labeled probe.
  • the timing of addition of the labeled probe is not particularly limited, and may be, for example, any of before amplification reaction, during amplification reaction and after amplification reaction, but the amplification reaction of the step (a) and the step (b) Since the reaction can be carried out continuously, it is preferable to add it before the amplification reaction.
  • dissociation of the obtained amplification product double-stranded DNA
  • hybridization between the single-stranded DNA obtained by dissociation and the labeled probe are performed. This can be performed, for example, by changing the temperature of the reaction solution.
  • the heating temperature in the dissociation step is not particularly limited as long as it is a temperature at which the double-stranded amplification product can be dissociated into single strands, and is, for example, 85 to 95 ° C.
  • the heating time is also not particularly limited, and is usually 1 second to 10 minutes, preferably 1 second to 5 minutes.
  • Hybridization between the dissociated single-stranded DNA and the labeled probe can be performed, for example, by decreasing the heating temperature in the dissociation step after the dissociation step.
  • the temperature condition is, for example, 40 to 50.degree.
  • the treatment time at the temperature is not particularly limited, and is, for example, 1 to 600 seconds.
  • the temperature of the reaction solution is changed, and a signal value indicating the melting state of the hybrid of the amplification product and the labeled probe is measured.
  • the reaction solution is heated, that is, the hybrid of the single-stranded DNA and the labeled probe is heated, and the fluctuation of the signal value accompanying the temperature rise is measured.
  • fluorescence decreases (or is quenched) in the state of being hybridized with single-stranded DNA, and is in the dissociated state Now it emits fluorescence.
  • the hybridization product in which the fluorescence is decreasing (or quenching) may be gradually heated, and the increase in fluorescence intensity with increasing temperature may be measured.
  • the said signal value can be measured on the conditions according to the labeled substance of the said labeled probe, for example.
  • probes labeled with labeling substances under different detection conditions are used. Each signal value may be measured under the condition corresponding to the labeled substance of
  • the temperature range for measuring the fluctuation of the fluorescence intensity is not particularly limited.
  • the start temperature is from room temperature to 85 ° C., preferably 25 to 70 ° C.
  • the end temperature is, for example, 40 to 105 ° C. is there.
  • the rate of temperature rise is not particularly limited, and is, for example, 0.1 to 20 ° C./second, preferably 0.3 to 5 ° C./second.
  • the fluctuation of the signal value accompanying the temperature change is analyzed, and the Tm value showing a large fluctuation (peak) is determined.
  • the fluctuation of the signal value can be analyzed, for example, by calculating the amount of change of the signal value (F) per unit time (t).
  • F the signal value
  • an increase amount of the signal value (F) per unit time (t) at each temperature or its negative derivative The value ( ⁇ dF / dt) can be calculated, and the temperature showing the lowest value can be determined as the Tm value.
  • the temperature at which the amount of increase of the signal value (F) per unit time (t) or the derivative thereof (dF / dt) exhibits the highest value can be determined as the Tm value.
  • the Tm value is calculated by calculating the decrease in signal value (F) per unit time (t). It can also be determined.
  • the signal value at the time of hybridization is measured and the fluctuation is analyzed.
  • the fluctuation of the signal value accompanying the temperature drop may be analyzed.
  • the analysis of the fluctuation of the signal value may be performed by, for example, creating and analyzing a graph plotting the relationship between the temperature and the fluctuation of the signal value, but the creation of the graph is not essential in the analysis step. .
  • the Tm value can be calculated by, for example, conventionally known MELTCALC software (http://www.meltcalc.com/) or the like, and can also be determined by the nearest neighbor method.
  • the type of base at the target site ie, polymorphism such as mutant or normal type is determined.
  • a completely complementary hybrid perfect match
  • the polymorphism at the target site can be determined by previously determining the Tm value of the completely complementary hybrid and the Tm value of the hybrid in which one base is different for the probe as the evaluation reference value.
  • the target site is a mutant, and using a probe complementary to the target sequence containing the mutant base, if the Tm value of the formed hybrid is the same as the Tm value of the completely complementary hybrid The target site can be judged to be a mutant. In addition, if the Tm value of the formed hybrid is the same as the Tm value of the hybrid differing by one base (a value lower than the Tm value of the completely complementary hybrid), the target site can be judged to be normal. In addition, when both Tm values are detected, it can be determined that, for example, a nucleic acid showing a mutant type and a nucleic acid showing a normal type coexist.
  • a labeled probe for example, a guanine quenched probe
  • a signal by hybridization eg, guanine quenched probe
  • fluorescence is emitted in the state where the single-stranded DNA and the probe are dissociated.
  • the temperature of the reaction solution may be gradually decreased to measure the decrease in fluorescence intensity as the temperature decreases.
  • the temperature of the reaction solution may be gradually decreased to measure the increase in fluorescence intensity accompanying the temperature decrease.
  • the nucleic acid in the sample may be single stranded or double stranded.
  • the nucleic acid is double-stranded, it is preferable to include a step of dissociating double-stranded nucleic acid in the sample by heating prior to the hybridization in the step (b), for example.
  • the amplification reagent of the present invention is an amplification reagent used in the method of amplification of a target sequence of the present invention.
  • the target sequence is a sequence containing a target site exhibiting polymorphism
  • the base (x) of the target site is a first base (x1) or a second base (x2), It is characterized by including the said primer (X1) and a primer (X2).
  • the amplification reagent of the present invention preferably further comprises a primer (Y1).
  • each of the primers is as described above.
  • the amplification reagent of the present invention may further contain, for example, the various components used in the amplification reaction described in the method of amplification of a target sequence of the present invention.
  • the amplification reagent of the present invention is preferably used in one reaction system.
  • the amplification reagent of the present invention may be an amplification kit used for the method of amplification of a target sequence of the present invention, each component may be contained in a separate container, or may be appropriately combined and contained in the same container. It may be The amplification kit preferably contains, for example, instructions for use.
  • the polymorphism detection reagent of the present invention is a detection reagent used in the detection method of polymorphism of the present invention, and comprises the amplification reagent of the present invention, and a probe capable of hybridizing to a sequence including the target site in the template nucleic acid. It is characterized by The polymorphism detection reagent of the present invention is preferably used in one reaction system.
  • the polymorphism detection reagent of the present invention may further contain, for example, the various components used in the amplification reaction described in the polymorphism detection method of the present invention.
  • the polymorphism detection reagent of the present invention may be, for example, the polymorphism detection kit of the present invention, and preferably includes, for example, instructions for use.
  • Example 1 Tm analysis was performed on the bcr-abl gene.
  • Example 1-1 Tm analysis was performed on an unpurified blood sample containing a normal bcr-abl gene using a normal primer having the additional sequence (E1) to confirm the presence or absence of false positives.
  • the base (y) of base number 270 was used as a detection site.
  • the y is cytosine (c) or thymine (t), and if it is cytosine, it can be judged that it is a normal polymorphism (T315), and if it is thymine, it is a mutant polymorphism (T315I).
  • PCR and Tm analysis were performed using a fully automatic SNPs tester (trade name i-densy (registered trademark), manufactured by ARKRAY, Inc.).
  • 10 ⁇ L of whole blood collected using an EDTA blood collection tube and 70 ⁇ L of the following dilution solution 1 are mixed to prepare diluted blood 1, and 10 ⁇ L of the diluted blood 1 is mixed with 2 70 ⁇ L of the following dilution solution.
  • Diluted blood 2 was prepared.
  • 17 ⁇ L of the diluted blood 2 was added, set in the test apparatus, and heated at 95 ° C. for 10 minutes.
  • the PCR was performed at 95 ° C. for 60 seconds, and then repeated 50 cycles with 95 ° C. for 1 second and 64 ° C. for 15 seconds as one cycle. Further, the Tm analysis is carried out at 95 ° C. for 1 second and 40 ° C. for 60 seconds, and then heated from 40 ° C. to 70 ° C. at a temperature rising rate of 1 ° C./3 seconds and fluorescence is temporally generated during temperature rising The change in intensity was measured. The detection wavelength was 520 to 555 nm.
  • the F primer is a forward primer
  • the R wt primer is a reverse primer
  • the base at the 3 'end is complementary to the normal target site in the sense strand
  • the R mt primer is a reverse primer.
  • the base at the 3 'end was complementary to the target site of the variant in the sense strand.
  • the underlined sequence is an additional sequence which is not complementary to the antisense strand
  • the other sequence is a sequence complementary to the antisense strand.
  • the “addition sequence (+) R wt primer” has the underlined sequence at the 5 ′ end being an addition sequence (E1) which is not complementary to the sense strand, and the other sequences are the sense strand Sequence complementary to (A1 ′), and the upper case base at the 3 ′ end (G) is the normal base (G) at the target site and corresponds to the normal base (C) at the target site in the sense strand Do.
  • the "addition sequence (-) R wt primer” has a sequence (A1 ') complementary to the sense strand without an addition sequence (E1), and has a base at the 3' end of capital letters (G) is the normal base (G) of the target site and corresponds to the normal base (C) of the target site in the sense strand.
  • the following "addition sequence (-) R mt primer” has a sequence (A2 ') complementary to the sense strand without the addition sequence (E2), and the upper case base (A) at the 3' end is the target It is a site variant base (A), which corresponds to the variant base (T) of the target site in the sense strand.
  • the primer set of the F primer, the additional sequence (+) R wt primer, and the additional sequence ( ⁇ ) R mt primer is referred to as Example 1-1.
  • a primer set of the F primer, the additional sequence ( ⁇ ) R wt primer, and the additional sequence ( ⁇ ) R mt primer was used as Comparative Example 1-1.
  • the T m mt value of the additional sequence ( ⁇ ) R mt primer and the mutant target sequence is 59 ° C.
  • the sequence of the probe is shown below.
  • the following probe is a probe that perfectly matches the sequence including the mutant target site in the sense strand of the mutant bcr-abl gene, and in the following sequence, upper case bases are bases complementary to the mutant target site. is there.
  • the probe was labeled at the 5 'end with the fluorescent dye BODIPY FL and phosphorylated at the 3' end. 5 '-(BODIPY FL) -ctcaAtgatgatatagaacg-P-3' (SEQ ID NO: 6)
  • FIG. 5 is a graph of Tm analysis showing the change in fluorescence intensity with temperature rise.
  • (A) shows the result of the primer set of Example 1-1
  • (B) shows the result of the primer set of Comparative Example 1-1.
  • the horizontal axis represents the temperature (° C.) at the time of measurement
  • the vertical axis represents the change in fluorescence intensity
  • the unit is the derivative value of the change in fluorescence intensity “d fluorescence intensity change amount / dt” (DF / dt).
  • the Tm wt value of the probe and the normal target sequence is 47 ° C.
  • the T m mt value of the probe and the mutant target sequence is 55 ° C.
  • the normal target sequence is normal. Peaks were observed not only in the vicinity of the Tm wt value of (1) but also in the vicinity of the T m mt value of the mutant target sequence. The size of the peak in the Tm mt value of this mutant is similar to that of the mutant (not shown) which is found when the normal gene contains 0.3% of the mutant gene. From this peak, it was found that the mutant polymorphism shows a false positive. On the other hand, in Example 1-1 of FIG.
  • Example 1-2 Tm analysis was performed on a plasmid sample containing a partial sequence of the bcr-abl gene, using a normal primer having the additional sequence (E1) and a mutant primer having the additional sequence (E2).
  • a normal type plasmid (WT) and a mutant type plasmid (mt) in which oligonucleotides of base numbers 51 to 550 in SEQ ID NO: 1 were inserted were prepared.
  • the base (y) of base No. 270 in SEQ ID NO: 1 is cytosine (c)
  • the mutant plasmid (mt) base No. 270 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • the base (y) is thymine (t).
  • Example 1-1 Using the primer set of the F primer, the additional sequence (+) R wt primer and the following additional sequence (+) R mt primer in Example 1-1 above, 1 ⁇ L of each of the above plasmid samples and all of Example 1-1 Tm analysis was performed in the same manner as in Example 1-1 except that a blood sample was used.
  • addition sequence (+) R mt primer the underlined sequence at the 5 'end is an addition sequence (E2) which is non-complementary to the sense strand, and the other sequence is a sequence complementary to the sense strand ((2) A2 ′), and the capital letter base (A) at the 3 ′ end is a variant base (A) at the target site, and corresponds to the variant base (T) at the target site in the sense strand.
  • the additional sequence (E2) of the additional sequence (+) R mt primer was a sequence different from the additional sequence (E1) of the additional sequence (+) R wt primer.
  • the Tm wt value of the additional sequence (+) R wt primer and the normal target sequence is 60 ° C.
  • the Tm mt value of the additional sequence (+) R mt primer and the mutant target sequence is 63.9. ° C.
  • the Tm wt value of the sequence (A1 ′) other than the additional sequence in the additional sequence (+) R wt primer and the normal target sequence is 55.4 ° C.
  • the additional sequence (+) R mt primer The Tm mt value of the sequence (A2 ′) other than the additional sequence in and the mutant target sequence is 59 ° C.
  • R mt primer Addition sequence (+) R mt primer 5'- tgctc aggttcccgtag gtcatgaactcaA-3 'T315 I-mt-R2 + tgctc (SEQ ID NO: 7)
  • FIG. 6 is a graph of Tm analysis showing the change in fluorescence intensity with temperature rise.
  • (A) shows the result of plasmid sample mt1%
  • (B) shows the result of plasmid sample mt0.3%
  • (C) shows the result of whole blood sample.
  • the horizontal axis indicates the temperature (° C.) at the time of measurement
  • the vertical axis indicates the change in fluorescence intensity
  • the unit is the derivative value of the change in fluorescence intensity “d fluorescence intensity change amount / dt” (DF / dt).
  • the Tm wt value of the probe and the normal target sequence is 47 ° C.
  • the T m mt value of the probe and the mutant target sequence is 55 ° C.
  • the present invention for example, erroneous annealing of the primers as described above can be prevented. As a result, false positives in polymorphism detection can be suppressed, and highly reliable polymorphism detection becomes possible. Therefore, the present invention can be said to be extremely useful, for example, in the recent clinical field where therapy and diagnosis are performed by gene polymorphism detection.

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Abstract

　誤ったプライマーのアニーリングによる増幅を抑制する増幅方法の提供を目的とする　多型を示す標的部位を含む標的配列の増幅において、プライマーＸ１およびＸ２を使用する。Ｘ１は、配列Ａ１'および配列Ｅ１を有し、Ａ１'は、前記鋳型核酸における部分配列Ａ１に相補的な配列であり、その３'領域に、Ａ１の５'領域における前記標的部位の第１塩基ｘ１に相補的な塩基ｘ１'を有し、Ｅ１は、前記鋳型核酸におけるＡ１の３'末端に隣接する部分配列Ｂ１に非相補的な配列であり、Ａ１'の５'末端に結合しているプライマーとする。Ｘ２は、配列Ａ２'を有し、Ａ２'は、前記鋳型核酸における部分配列Ａ２に相補的な配列であり、その３'領域に、Ａ２の５'領域における前記標的部位の第２塩基ｘ２に相補的な塩基ｘ２'を有するプライマーとする。Ｘ１およびＸ２は、共に３'領域に標的部位に相補的な塩基を有する。これらのプライマーにより、標的部位が第１塩基ｘ１である鋳型のみの場合、第２塩基ｘ２を有する標的配列の誤増幅を防止できる。これにより、第２塩基ｘ２の多型について、擬陽性を抑制できる。

Description

標的配列の増幅方法、多型検出方法およびそれに用いる試薬
　本発明は、目的の多型を示す標的部位を含む標的配列の増幅方法、多型検出方法、および、それに用いる試薬に関する。
　疾患の予防および治療において、一塩基多型（ＳＮＰ）をはじめとする遺伝子変異の検出が広く行われている。例えば、癌細胞の遺伝子には多くの変異が見られ、これらが細胞の癌化に関与することが知られている。このため、細胞中の遺伝子変異の検出によって、癌化の可能性および進行度等を確認可能であり、治療において、非常に有用な情報と考えられる。また、癌細胞において、薬剤耐性を示す遺伝子変異も報告されている。この変異の検出によって、患者に対する薬剤の有効性を判断できることから、より適切な治療が可能となる。例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、抗癌剤イマチニブの投薬治療が広く用いられているが、ｂｃｒ－ａｂｌ遺伝子上の変異（例えば、Ｔ３１５Ｉ）が薬剤耐性に影響していると考えられている。このように、遺伝子変異の検出は、臨床分野における早期発見および治療に有用であることから、高い信頼性が求められている。
　遺伝子変異の検出方法は、一般に、ＡＳＰ（Allele　Specific　Primer）－ＰＣＲ（Polymerase　Chain　Reaction）法（特許文献１）、Ｔｍ（Melting　temperature）解析法（非特許文献１）が知られている。前記ＡＳＰ－ＰＣＲ法は、プライマーとして、標的部位を含む配列に相補的であり、且つ、前記標的部位の塩基に相補的な塩基を３’領域に有するものを使用し、ＰＣＲを行い、前記標的部位を含む標的配列の増幅によって、変異を判断する方法である。前記プライマーとして、例えば、前記標的部位を変異型塩基に設定した変異型プライマーを使用する場合、増幅が確認されれば「変異」、増幅が確認できなければ「正常」と判断できる。また、前記プライマーとして、標的部位を正常型塩基に設定した正常型プライマーを使用する場合、増幅が確認されれば「正常」、増幅が確認できなければ「変異」と判断できる。前記Ｔｍ解析は、例えば、まず、遺伝子における前記標的部位を含む標的配列を増幅させた後、得られた増幅産物と、前記標的部位を含む配列にハイブリダイズ可能なプローブとのハイブリッド（二本鎖核酸）を形成させる。このハイブリッドに加熱処理を施して、温度上昇に伴うハイブリッドの一本鎖核酸への解離（融解）を、吸光度等のシグナル測定により検出し、Ｔｍ値を決定する。そして、このＴｍ値から、変異を判断する。Ｔｍ値は、ハイブリッドにおける両一本鎖核酸の相補性が高い程高く、相補性が低い程低くなる。このため、例えば、前記プローブとして、前記標的部位を変異型塩基（Ｘ）に設定した変異型プローブを使用すれば、以下のようにして、変異を判断できる。まず、予め、前記標的部位が変異型塩基である標的配列と前記変異型プローブとのハイブリッドについて、予めＴｍ値（評価基準Ｔｍ値）を求めておく。他方、前述のように、遺伝子から増幅させた増幅産物と前記変異型プローブとから、Ｔｍ値（測定Ｔｍ値）を決定する。そして、この評価基準Ｔｍ値と、測定Ｔｍ値とを比較する。その結果、測定Ｔｍ値が評価基準Ｔｍ値と同じであれば、前記増幅産物の標的配列と前記プローブとはパーフェクトマッチである、すなわち、前記標的部位が変異型塩基（Ｘ）であり、変異が存在すると判断できる。他方、前記測定Ｔｍ値が前記評価基準Ｔｍ値より低ければ、前記増幅産物の標的配列と前記プローブとはミスマッチであるため、前記標的部位が正常型塩基（Ｙ）であり、変異が存在しないと判断できる。
　しかしながら、前記ＡＳＰ－ＰＣＲ法は、感度に優れるものの、特異性に欠けるという問題がある。例えば、前記変異型プライマーを使用した際、前記標的部位に変異が存在しないにもかかわらず、増幅が確認され、擬陽性と判断されるおそれがある。また、前記ＡＳＰ－ＰＣＲ法では、１つの反応系において、前記変異型プライマーおよび前記正常型プライマーのいずれか一方しか使用できない。このため、標的部位が、変異型か正常型かを確認するためには、前記変異型プライマーを用いる反応系および前記正常型プライマーを用いる反応系の計２種類について、ＰＣＲを行う必要がある。このように２種類の反応系を使用するため、操作の手間と時間、コストがかかる。他方、前記Ｔｍ解析法は、特異性に優れるため、擬陽性の問題は回避可能であり、また、１つの反応系で、前記標的部位が正常型であるか変異型であるかを判断できる。しかしながら、前記Ｔｍ解析法は、感度が十分ではないという問題がある。
　特に、前述のように、癌細胞の遺伝子変異を検出する場合、患者から採取した検体には、目的遺伝子が変異している細胞と正常である細胞とが混在している。このため、例えば、多量の正常遺伝子と少量の変異遺伝子とを含む生体試料についても、正確に変異の有無を検出できることが求められている。
特許第２８５３８６４号公報
Analytical　Biochemistry、Vol．290、p．89－97（2001）
　そこで、本発明者らは、正常型プライマーおよび変異型プライマー、さらに、プローブを用いる、新たな多型の検出方法を確立した。前記正常型プライマーは、標的部位が正常型塩基である正常型標的配列を増幅させるプライマーであり、前記変異型プライマーは、標的部位が変異型塩基である変異型標的配列を増幅させるプライマーであり、前記プローブは、前記標的部位を含む配列にハイブリダイズ可能なプローブである。具体的に、前記正常型プライマーと前記変異型プライマーとを含む一つの反応系において、鋳型核酸に対して増幅反応を行い、さらに、前記プローブを用いてＴｍ解析を行い、多型を検出する。この方法によれば、前記正常型プライマーと前記変異型プライマーとの両方を使用するため、前記正常型標的配列と前記変異型標的配列の両方を、それぞれ特異的に増幅できる。そして、前記プローブを用いたＴｍ解析を行うため、一反応系で、正常型と変異型とを検出できる。また、例えば、正常型の鋳型核酸のみが存在する場合、前記正常型プライマーは、前記変異型プライマーよりも、前記正常型の鋳型核酸に優先的にアニーリングするため、前記変異型プライマーのアニーリングによる誤った増幅が抑制される。このため、前記プローブを用いた多型の検出において、変異型の擬陽性を防止できる。このように、この方法によれば、一反応系において、標的部位が、正常型、変異型または両方を含むいずれであるかということを、優れた信頼性で判断できる。
　しかしながら、さらなる検討を行った結果、条件によっては、増幅反応後のＴｍ解析において、擬陽性を生じるおそれがあることが明らかとなった。具体的には、例えば、血液等の生体試料を未精製のまま増幅に供した場合、増幅反応において通常よりも多量のポリメラーゼが存在する場合、プライマーのアニーリング温度が通常よりも低い場合等の条件である。このような条件の場合、前記変異型プライマーが前記正常型標的配列にアニーリングして、変異型標的配列が増幅され、その結果、変異型の擬陽性を示す場合がある。
　そこで、本発明は、例えば、核酸試料および増幅反応の条件にかかわらず、プライマーの誤ったアニーリングによる増幅を抑制可能な増幅方法、それにより擬陽性を抑制可能な多型検出方法ならびにそれに用いる試薬の提供を目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明の標的配列の増幅方法は、下記プライマー（Ｘ１）および下記プライマー（Ｘ２）を含む反応系において、鋳型核酸における標的配列を増幅させる増幅工程を含み、前記標的配列が、多型を示す標的部位を含む配列であり、前記標的部位の塩基（ｘ）が、第１塩基（ｘ１）または第２塩基（ｘ２）であることを特徴とする。
プライマー（Ｘ１）
配列（Ａ１’）および配列（Ｅ１）を有し、
前記配列（Ａ１’）が、
　前記鋳型核酸における部分配列（Ａ１）に相補的な配列であり、
　その３’領域に、前記部分配列（Ａ１）の５’領域における前記標的部位の第１塩基（ｘ１）に相補的な塩基（ｘ１’）を有し、
前記配列（Ｅ１）が、
　前記鋳型核酸における前記部分配列（Ａ１）の３’末端に隣接する部分配列（Ｂ１）に非相補的な配列であり、
　前記配列（Ａ１’）の５’末端に結合しているプライマー
プライマー（Ｘ２）
配列（Ａ２’）を有し、
前記配列（Ａ２’）が、
　前記鋳型核酸における部分配列（Ａ２）に相補的な配列であり、
　その３’領域に、前記部分配列（Ａ２）の５’領域における前記標的部位の第２塩基（ｘ２）に相補的な塩基（ｘ２’）を有するプライマー
　本発明の多型の検出方法は、前記本発明の増幅方法により、鋳型核酸における標的部位を含む標的配列を増幅させる工程、および、前記標的配列にハイブリダイズ可能なプローブにより、前記標的配列における前記標的部位の多型を検出する工程を含むことを特徴とする。
　本発明の増幅試薬は、鋳型核酸における標的配列が、多型を示す標的部位を含む配列であり、前記標的部位の塩基（ｘ）が、第１塩基（ｘ１）または第２塩基（ｘ２）であり、
前記プライマー（Ｘ１）および前記プライマー（Ｘ２）を含むことを特徴とする、前記本発明の増幅方法に使用するための増幅試薬である。
　本発明の検出試薬は、前記本発明の増幅試薬、および、鋳型核酸における標的部位を含む標的配列にハイブリダイズ可能なプローブを含むことを特徴とする、前記本発明の多型の検出方法に使用するための検出試薬である。
　本発明によれば、例えば、誤ったプライマーのアニーリングを防止できる。このため、結果的に、擬陽性を抑制して、信頼性に優れた多型検出が可能となる。したがって、本発明は、例えば、遺伝子の多型検出により治療や診断を行う近年の臨床分野において、極めて有用といえる。
図１は、本発明のプライマーの一例を示す概略図である。 図２は、本発明のプライマーのアニーリングならびにその伸長鎖の一例を示す概略図である。 図３は、本発明のプライマーのアニーリングならびにその伸長鎖の一例を示す概略図である。 図４は、プライマーのアニーリングならびにその伸長鎖の一例を示す概略図である。 図５は、比較例１－１および本発明の実施例１－１におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。 図６は、本発明の実施例１－２におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
　本発明者らは、鋭意研究を行った結果、擬陽性の原因についての知見を得た。以下に、図４を用いて説明する。図４は、正常型プライマーおよび変異型プライマーのアニーリングならびにそれらの伸長鎖を示す模式図である。正常型鋳型核酸は、標的部位が正常型塩基であり、前記正常型プライマーは、正常型鋳型核酸における正常型塩基を有する部分配列に相補的な配列からなる。変異型鋳型核酸は、標的部位が変異型塩基であり、前記変異型プライマーは、変異型鋳型核酸における変異型塩基を有する部分配列に相補的な配列からなる。図４において、前記正常型プライマーおよび前記変異型プライマーがアニーリング可能な鎖を順鎖とし、（＋）で示す。前記正常型プライマー、前記変異型プライマーおよびそれらからの伸長鎖を逆鎖とする。図４において、前記正常型プライマーおよび前記変異型プライマーは、逆鎖を伸長するための逆方向プライマーである。図４において、白丸が正常型塩基、黒丸が変異型塩基を示す（以下、同様）。
　逆方向プライマーとして、前記正常型プライマーおよび前記変異型プライマーを用いた場合、例えば、以下のような理由から、擬陽性が生じる可能性がある。鋳型核酸が前記正常型鋳型核酸（＋）のみの場合、通常、前記正常型鋳型核酸（＋）には、前記変異型プライマーよりも前記正常型プライマーがアニーリングし易い（図４Ａ）。このため、前記正常型プライマーから、逆鎖として、正常型伸長鎖（－）が生成され、さらに、順方向プライマーから、順鎖として、正常型伸長鎖（＋）が生成される（図４Ｂ）。しかしながら、前記正常型伸長鎖（＋）に対して、前記変異型プライマーのミスマッチは、標的部位の１塩基に対してのみである。このため、図４Ｃに示すように、前記正常型伸長鎖（＋）に対しては、前記正常型プライマーだけでなく、低い確率ではあるものの、前記変異型プライマーがアニーリングする可能性がある（図４Ｃにおいて＊１）。このように、前記変異型プライマーがアニーリングすると、図４Ｄに示すように、変異型鋳型核酸が存在しないにもかかわらず、前記正常型伸長鎖（＋）の他に、標的部位が変異型塩基に置換された変異型伸長鎖（＋）が生成される（図４Ｄにおいて＊２）。そして、図４Ｅに示すように、前記変異型伸長鎖（＋）に対しては、前記正常型プライマーよりも、変異型プライマーの方がアニーリングし易いため、変異型伸長鎖（＋）の増幅が繰り返し行われる（図４Ｅにおいて＊３）。さらに、前述した正常型伸長鎖（＋）に対する変異型プライマーの誤ったアニーリングは、増幅反応のいずれのサイクルにおいても生じ得る。このため、正常型伸長鎖（＋）に対して、新たに変異型プライマーのアニーリングが生じてしまう（図４Ｅにおいて＊４）。このように、正常型伸長鎖に対する変異型プライマーのアニーリングが原因となって、変異型伸長鎖が生成されるため、結果的に、後のＴｍ解析において擬陽性を示す量の変異型伸長鎖が生成するおそれがある。
　そこで、本発明者らは、擬陽性の原因となる、プライマーの誤ったアニーリングを防止すべく、本発明を完成するに至った。
　本発明において、鋳型核酸において、目的の多型が発生する部位を「標的部位」といい、前記標的部位を含む配列を「標的配列」という。以下、前記標的部位が変異型塩基（ｘｍｔ）の場合、前記鋳型核酸を「変異型鋳型」、前記標的配列を「変異型標的配列」、前記遺伝子を「変異型遺伝子」という。前記標的部位が正常型塩基（ｘｗｔ）の場合、前記鋳型核酸を「正常型鋳型」、前記標的配列を「正常型標的配列」、前記遺伝子を「正常型遺伝子」ともいう。「正常型」とは、例えば、「野生型」ということもできる。
　本発明において、増幅反応の開始前に反応系に含まれる核酸を、「鋳型核酸」といい、前記増幅開始後に、前記鋳型核酸を含む前記反応系において、増幅反応により生成された核酸を、「増幅産物または伸長鎖」という。
　本発明において、鋳型核酸は、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。前記鋳型核酸が二本鎖の場合、これを構成する２本の一本鎖のうち、いずれか一方が、前記プライマー（Ｘ１）および前記プライマー（Ｘ２）がアニーリング可能な鎖であればよい。本発明においては、便宜上、前記プライマー（Ｘ１）および前記プライマー（Ｘ２）がアニーリング可能な鎖を「順鎖または（＋）鎖」といい、その方向を「順方向」といい、前記順鎖の相補鎖を「逆鎖または（－）鎖」といい、その方向を「逆方向」という。また、前記順鎖にアニーリングして前記逆鎖を伸長するプライマー、例えば、前記プライマー（Ｘ１）および前記プライマー（Ｘ２）等を、「逆方向プライマー」といい、前記逆鎖にアニーリングして前記順鎖を伸長するプライマー、例えば、後述するプライマー（Ｙ１）等を、「順方向プライマー」という。なお、あくまでも便宜上であって、例えば、前記プライマー（Ｘ１）および前記プライマー（Ｘ２）がアニーリング可能な鎖が「逆鎖」でもよい。また、本発明において、便宜上、前記順鎖（＋）および前記逆鎖（－）の用語を、説明に使用しているが、例えば、遺伝子の場合、いずれがセンス鎖で、いずれがアンチセンス鎖でもよい。
　本発明において、塩基配列の末端は、５’末端または３’末端であり、それぞれ、塩基配列の５’側または３’側の最も端の塩基を意味する。また、５’領域は、塩基配列の５’末端から数塩基の領域であり、３’領域は、塩基配列の３’末端から数塩基の領域である。前記数塩基は、特に制限されず、例えば、末端から１塩基～１０塩基、１～４塩基、１～３塩基、１～２塩基である。本発明において、塩基配列の末端からＺ番目の塩基（Ｚは正の整数）は、末端の塩基を１番目とした順番であり、例えば、末端から１番目の塩基は、末端の塩基、末端から２番目の塩基は、末端塩基の隣の塩基を意味する。
＜増幅方法＞
　本発明の標的配列の増幅方法は、前述のように、前記プライマー（Ｘ１）および前記プライマー（Ｘ２）を含む反応系において、鋳型核酸における標的配列を増幅させる増幅工程を含み、前記標的配列が、多型を示す標的部位を含む配列であり、前記標的部位の塩基（ｘ）が、第１塩基（ｘ１）または第２塩基（ｘ２）であることを特徴とする。
　前記プライマー（Ｘ１）は、配列（Ａ１’）および配列（Ｅ１）を有する。前記配列（Ａ１’）は、前記鋳型核酸における部分配列（Ａ１）に相補的な配列であり、その３’領域に、前記部分配列（Ａ１）の５’領域における前記標的部位の第１塩基（ｘ１）に相補的な塩基（ｘ１’）を有する。前記配列（Ｅ１）は、前記鋳型核酸における前記部分配列（Ａ１）の３’末端に隣接する部分配列（Ｂ１）に非相補的な配列であり、前記配列（Ａ１’）の５’末端に結合している。前記配列（Ｅ１）は、例えば、付加配列ともいう。前記プライマー（Ｘ２）は、配列（Ａ２’）を有する。前記配列（Ａ２’）は、前記鋳型核酸における部分配列（Ａ２）に相補的な配列であり、その３’領域に、前記部分配列（Ａ２）の５’領域における前記標的部位の第２塩基（ｘ２）に相補的な塩基（ｘ２’）を有する。前記プライマー（Ｘ１）および（Ｘ２）を設定するにあたって、前記標的部位は、前記鋳型核酸において、多型を示す同じ部位を意味する。
　前記鋳型核酸の前記標的部位の塩基（ｘ）は、特に制限されず、目的の標的部位における多型の塩基であればよく、例えば、正常型塩基（ｘｗｔ）および変異型塩基（ｘｍｔ）があげられる。以下、前記標的部位の塩基（ｘ）が、正常型塩基（ｘｗｔ）であるプライマーを「正常型プライマー」、変異型塩基（ｘｍｔ）であるプライマーを「変異型プライマー」という。前記第１塩基（ｘ１）が正常型塩基（ｘｗｔ）、前記第２塩基（ｘ２）が変異型塩基（ｘｍｔ）の場合、前記プライマー（Ｘ１）を正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）、前記プライマー（Ｘ２）を変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）という。前記第１塩基（ｘ１）が変異型塩基（ｘｍｔ）、前記第２塩基（ｘ２）が正常型塩基（ｘｗｔ）の場合、前記プライマー（Ｘ１）を変異型プライマー（Ｘ１ｍｔ）、前記プライマー（Ｘ２）を正常型プライマー（Ｘ２ｗｔ）という。
　本発明により、前述のようなプライマーの誤ったアニーリングが防止できる理由を、図１および図２を用いて、以下に説明する。なお、本発明の一例として、第１塩基（ｘ１）を正常型塩基（ｘｗｔ）、プライマー（Ｘ１）を正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）、第２塩基（ｘ２）を変異型塩基（ｘｍｔ）、プライマー（Ｘ２）を変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）に設定して、説明する。これらの条件や図示した構造は、あくまでも一例であって、本発明は、これには制限されない。また、本発明は、以下の理由によって制限されない。
　図１Ａは、正常型鋳型（例えば、正常型遺伝子）と、前記正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）との関係を示す模式図であり、図１Ｂは、変異型鋳型（例えば、変異型遺伝子）と、前記変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）との関係を示す模式図である。前記正常型鋳型は、標的部位の塩基（ｘ）が正常型塩基（ｘｗｔ）であり、前記変異型鋳型は、標的部位の塩基（ｘ）が変異型塩基（ｘｍｔ）である。図２は、前記正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）および変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）のアニーリングおよびそれらの伸長鎖を示す模式図である。図１および図２は、正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）および変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）がアニーリング可能な鎖を順鎖とし、（＋）で示し、正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）および変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）ならびに前記各プライマーからの伸長鎖を逆鎖とする（以下、同様）。図２において、白丸が正常型塩基、黒丸が変異型塩基を示す（以下、同様）。
　まず、正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）の構成について説明する。図１Ａに示すように、予め、正常型鋳型（＋）の配列において、標的部位の正常型塩基（ｘｗｔ）を５’領域に有する配列を部分配列（Ａ１）と決定し、前記部分配列（Ａ１）の３’末端に隣接する配列を部分配列（Ｂ１）と決定する。これに対して、正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）は、前記部分配列（Ａ１）に相補的な配列（Ａ１’）と、前記部分配列（Ｂ１）に非相補的な配列（Ｅ１）とを有する構成とする。前記部分配列（Ｅ１）は、前記配列（Ａ１’）の５’末端に結合している。正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）において、正常型塩基（ｘｗｔ）に対応する相補的な塩基（ｘｗｔ’）は、配列（Ａ１’）の３’領域に位置する。
　つぎに、変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）の構成について説明する。図１Ｂに示すように、予め、変異型鋳型（＋）の配列において、標的部位の変異型塩基（ｘｍｔ）を５’領域に有する配列を部分配列（Ａ２）と決定する。これに対して、変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）は、部分配列（Ａ２）に相補的な配列（Ａ２’）を有する構成とする。変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）において、変異型塩基（ｘｍｔ）に対応する相補的な塩基（ｘｍｔ’）は、配列（Ａ２’）の３’領域に位置する。図１に示す他の構成については、後述する。
　つぎに、正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）および変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）のアニーリングおよびそれらの伸長鎖について説明する。鋳型核酸が正常型鋳型（＋）のみの場合、正常型鋳型（＋）には、変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）よりも正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）がアニーリングし易い（図２Ａ）。アニーリングした正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）からは、標的部位が正常型である正常型伸長鎖（－）が生成される。ここで、正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）は、鋳型に非相補的な付加配列（Ｅ１）を５’領域に有している。このため、正常型伸長鎖（－）は、５’領域に、付加配列（Ｅ１）を有する配列となる。続いて、この正常型伸長鎖（－）に基づいて、順方向プライマーによって、正常型伸長鎖（－）に相補的な正常型伸長鎖（＋）が生成される（図２Ｂ）。この正常型伸長鎖（＋）は、正常型伸長鎖（－）と相補的であることから、３’領域に、前記付加配列（Ｅ１）に相補的な配列（Ｅ１’）を有する。したがって、図２Ｃに示すように、前記正常型伸長鎖（＋）には、変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）よりも、正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）が、優れた親和性でアニーリングする。変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）は、標的部位（ｘｗｔ）に対するミスマッチを有し且つ前記配列（Ｅ１’）に対する相補配列（Ｅ１）を有していないが、正常型プローブ（Ｘ１ｗｔ）は、標的部位（ｘｗｔ）にマッチし且つ前記配列（Ｅ１’）に対する相補配列（Ｅ１）を有するためである。このように、正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）が前記付加配列（Ｅ１）を有することによって、順鎖の正常型伸長鎖（＋）には、必ず、前記配列（Ｅ１’）が含まれる。このため、正常型伸長鎖（＋）に対する正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）のアニーリングが優位に生じ、変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）のアニーリングは、十分に抑制される。したがって、本発明によれば、例えば、変異型プライマーの誤ったアニーリングが原因となる増幅を防止でき、これによって、多型検出における擬陽性を十分に抑制可能である。ここでは、一例として、第１塩基（ｘ１）を正常型塩基（ｘｗｔ）、第２塩基（ｘ２）を変異型塩基（ｘｍｔ）と設定して説明したが、後述するように、これには何ら制限されない。
　本発明は、前述のように、前記プライマー（Ｘ１）が前記付加配列（Ｅ１）を有することにより、存在しない多型塩基を含む標的配列の誤った増幅を抑制できる。このため、擬陽性の原因となる誤った増幅の防止が望まれる多型塩基を、前記第２塩基（ｘ２）に設定することが好ましい。そして、擬陽性の原因とはならない他方の多型塩基を、前記第１塩基（ｘ１）とすることが好ましい。前記標的部位の塩基（ｘ）は、前述のように、例えば、正常型塩基（ｘｗｔ）および変異型塩基（ｘｍｔ）があげられる。この場合、第１塩基（ｘ１）および第２塩基（ｘ２）は、いずれが正常型塩基（ｘｗｔ）でもよいし、いずれが変異型塩基（ｘｍｔ）でもよい。臨床分野においては、前述のように、遺伝子は、多型を示す標的部位において正常型塩基を有することが一般的である。そこで、変異型塩基を有する遺伝子が存在するか否かの判断が、非常に重要である。このため、正常型遺伝子のみが存在する場合に、変異型標的配列の増幅が確認されると、変異型遺伝子が存在することとなり、擬陽性の結果となる。したがって、本発明においては、例えば、変異型塩基を含む変異型標的配列の誤った増幅を防止することが好ましい。したがって、前記第１塩基（ｘ１）を正常型塩基（ｘｗｔ）、前記プライマー（Ｘ１）を正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）とし、前記第２塩基（ｘ２）を変異型塩基（ｘｍｔ）、前記プライマー（Ｘ２）を変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）とすることが好ましい。なお、これらには制限されず、例えば、標的部位において、変異型塩基（Ｘｍｔ）が複数存在する場合、前記鋳型核酸の標的部位の塩基は、例えば、いずれか２種類の変異型塩基（ｘｍｔ）でもよい。
　本発明において、前記プライマー（Ｘ１）は、その３’領域に、前記配列（Ａ１’）を有していることから、例えば、前記配列（Ａ１’）の３’末端が、前記プライマー（Ｘ１）の３’末端となる。また、前記プライマー（Ｘ２）は、その３’領域に、前記配列（Ａ２’）を有していることから、例えば、前記配列（Ａ２’）の３’末端が、前記プライマー（Ｘ２）の３’末端となる。
　前記プライマー（Ｘ１）の配列（Ａ１’）は、前述のように、前記鋳型核酸の部分配列（Ａ１）に相補的な配列であり、その３’領域に、前記部分配列（Ａ１）の５’領域における前記標的部位の第１塩基（ｘ１）に相補的な塩基（ｘ１’）を有する。また、前記プライマー（Ｘ２）の配列（Ａ２’）は、前述のように、前記鋳型核酸の部分配列（Ａ２）に相補的な配列であり、その３’領域に、前記部分配列（Ａ２）の５’領域における前記標的部位の第２塩基（ｘ２）に相補的な塩基（ｘ２’）を有する。本発明において、「相補的な塩基」は、例えば、アデニンとチミンまたはウラシル、グアニンとシトシン等のように、二本鎖核酸の形成において、水素結合等により結合する関係にあるものをいう。また、本発明において「部分配列に相補的な配列」は、例えば、前記部分配列の全体に対してアニーリング可能であることを意味し、前記部分配列に対して、完全に相補的な塩基のみからなる配列だけでなく、前記部分配列に対して、１個または複数個の非相補的な塩基を含む配列でもよい。以下、前記完全に相補的な塩基のみからなる配列を、「パーフェクトマッチ配列またはフルマッチ配列」といい、前記非相補的な塩基を含む配列を、「ミスマッチ配列」という。前記ミスマッチ配列は、前記標的部位に相補的な塩基を除き、例えば、前記パーフェクトマッチ配列と比較して、１個または複数個の塩基が、欠失、置換、付加または挿入されている配列があげられ、このような塩基を、「ミスマッチ塩基」という。前記ミスマッチ塩基の個数は、特に制限されず、前記部分配列にアニーリング可能であればよいが、例えば、１個～３０個、好ましくは１個～５個である。また、前記配列（Ａ１’）または前記配列（Ａ２’）の塩基長における前記ミスマッチ塩基の個数の割合は、特に制限されず、例えば、６０％以下、好ましくは１０％以下である。中でも、前記プライマー（Ｘ１）の配列（Ａ１’）は、前記部分配列（Ａ１）に対してパーフェクトマッチ配列であることが好ましく、前記プライマー（Ｘ２）の配列（Ａ２’）は、前記部分配列（Ａ２）に対してパーフェクトマッチ配列であることが好ましい。
　本発明において、前述のようなプライマーの誤ったアニーリングの防止は、前記プライマー（Ｘ１）が前記付加配列（Ｅ１）を有することにより、高い信頼性で実現できる。この効果は、特に、標的部位が第１塩基（ｘ１）である鋳型核酸および標的部位が第２塩基（ｘ２）である鋳型核酸のうち、前者のみが試料に含まれる場合に、有効である。他方、前記試料に、標的部位が第１塩基（ｘ１）である鋳型核酸だけでなく、標的部位が第２塩基（ｘ２）である鋳型核酸が含まれる場合、第１塩基（ｘ１）を含む標的配列だけでなく、第２塩基（ｘ２）を含む標的配列も、増幅する。このように、標的部位が第１塩基（ｘ１）である鋳型核酸および標的部位が第２塩基（ｘ２）である鋳型核酸が含まれる場合、第１塩基（ｘ１）を含む標的配列よりも、第２塩基（ｘ２）を含む標的配列を優先的に増幅することが好ましい。具体的には、例えば、前記第１塩基（ｘ１）として正常型塩基を含む標的配列よりも、前記第２塩基（ｘ２）として変異型塩基を含む標的配列を、優先的に増幅することが好ましい。前述のように、多型は、癌等の疾患の指標となり得るため、標的部位が、正常型塩基および変異型塩基のいずれであるかを、感度よく検出することが望まれる。例えば、癌の場合、採取された組織片等の生体試料は、癌細胞だけでなく、多量の正常細胞も含まれる。このため、採取した組織片における少量の癌細胞由来の鋳型核酸について、多量の正常細胞由来の鋳型核酸よりも、標的配列を効率よく増幅させることが望まれる。また、疾患の早期の段階は、例えば、生体試料中に、変異型鋳型核酸よりも正常型鋳型核酸が多量に含まれる。このため、このような場合にも、同様に、変異型の標的配列を効率よく増幅させることが望まれる。そこで、本発明において、例えば、正常型遺伝子のように、含有割合が相対的に高い鋳型に対するプライマーを、前記プライマー（Ｘ１）とし、変異型遺伝子のように、含有割合が相対的に低い鋳型に対するプライマーを、前記プライマー（Ｘ２）とし、前記プライマー（Ｘ１）の前記配列（Ａ１’）および前記プライマー（Ｘ２）の前記配列（Ａ２’）を、以下のように設定することが好ましい。これによって、第２塩基（ｘ２）を有する標的配列を、第１塩基（ｘ１）を有する標的配列よりも、優先的に増幅可能である。
　前記プライマー（Ｘ１）の前記配列（Ａ１’）は、前記部分配列（Ａ１）にアニーリングする領域であり、前記プライマー（Ｘ２）の前記配列（Ａ２’）は、前記部分配列（Ａ２）にアニーリングする領域である。本発明において、例えば、前記プライマー（Ｘ２）における前記配列（Ａ２’）のパーフェクトマッチ配列に対する親和性、つまり、アニーリングのし易さを、前記プライマー（Ｘ１）における前記配列（Ａ１’）のパーフェクトマッチ配列に対する親和性よりも、高くすることが好ましい。
　前記各プライマーの親和性の調節は、特に制限されず、例えば、Ｔｍ値の設定により行える。本発明において、例えば、前記プライマー（Ｘ２）における前記配列（Ａ２’）のパーフェクトマッチ配列に対するＴｍ値が、前記プライマー（Ｘ１）における前記配列（Ａ１’）のパーフェクトマッチ配列に対するＴｍ値よりも、相対的に高い値であることが好ましい。このように、前記プライマー（Ｘ２）における配列（Ａ２’）のＴｍ値を、前記プライマー（Ｘ１）における配列（Ａ１’）よりも高く設定することで、例えば、第２塩基（ｘ２）を含む鋳型核酸および第２塩基（ｘ２）を含む伸長鎖に対する、前記プライマー（Ｘ２）における配列（Ａ２’）の結合性を、前記第１塩基（ｘ１）を含む鋳型核酸および第１塩基（ｘ１）を含む伸長鎖に対する、前記プライマー（Ｘ１）における配列（Ａ１’）の結合性よりも、向上できる。このため、結果的に、前記プライマー（Ｘ１）による、前記第１塩基（ｘ１）を含む標的配列の増幅効率よりも、前記プライマー（Ｘ２）による、前記第２塩基（ｘ２）を有する標的配列の増幅効率を向上できる。このように、増幅効率を向上すれば、例えば、試料中において、前記標的部位が第２塩基（ｘ２）である鋳型核酸の含有量が低い場合でも、前記第２塩基（ｘ２）を有する標的配列の増幅産物が十分に得られる。このため、前記第２塩基（ｘ２）の多型についても、Ｔｍ解析において、十分な感度での検出が可能となる。
　前記プライマー（Ｘ１）における配列（Ａ１’）のＴｍ値と前記プライマー（Ｘ２）における配列（Ａ２’）のＴｍ値との差は、特に制限されず、例えば、０を超え２０℃以下が好ましく、より好ましくは０を超え１０℃以下であり、特に好ましくは０を超え５℃以下である。
　前記プライマー（Ｘ１）における配列（Ａ１’）のＴｍ値および前記プライマー（Ｘ２）における配列（Ａ２’）のＴｍ値の設定方法は、特に制限されない。Ｔｍ値は、例えば、前記配列（Ａ１’）および前記配列（Ａ２’）の長さ、および前記各配列におけるＧＣ含量等によって調節できる。長さにより調節する場合、一般的に、長さが相対的に長い程、Ｔｍ値を相対的に高く設定できる。本実施形態の場合、例えば、前記プライマー（Ｘ２）の前記配列（Ａ２’）の長さを、前記プライマー（Ｘ１）の前記配列（Ａ１’）よりも長く設定することが好ましい。これによって、前記プライマー（Ｘ２）における配列（Ａ２’）のＴｍ値を、前記プライマー（Ｘ１）における配列（Ａ１’）のＴｍ値よりも、相対的に高い値に設定できる。また、ＧＣ含量によって調節する場合、例えば、ＧＣ含量が相対的に高い程、Ｔｍ値を相対的に高く設定できる。本実施形態の場合、例えば、前記プライマー（Ｘ２）における配列（Ａ２’）のＧＣ含量を、前記プライマー（Ｘ１）における配列（Ａ１’）よりも高く設定することが好ましい。また、前記配列（Ａ１’）および配列（Ａ２’）の長さおよびＧＣ含量の両方によって、Ｔｍ値を調節することもできる。これらの他に、例えば、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ、ペプチド核酸であるＰＮＡ、架橋化核酸であるＢＮＡ等を含む配列にすることで、例えば、これらを含まない配列よりも、Ｔｍ値を相対的に高く設定できる。
　前記プライマー（Ｘ２）の配列（Ａ２’）を、前記プライマー（Ｘ１）の配列（Ａ１’）よりも長く設定する場合、両者の長さの差は、特に制限されず、例えば、０を超え２０塩基以下であり、好ましくは０を超え１０塩基以下であり、より好ましくは０を超え５塩基以下である。
　また、例えば、前記第２塩基（ｘ２）を含む部分配列（Ａ２）にアニーリングした前記プライマー（Ｘ２）の伸長反応を、第１塩基（ｘ１）を含む部分配列（Ａ１）にアニーリングした前記プライマー（Ｘ１）の伸長反応よりも起こり易くしてもよい。これによって、例えば、第２塩基（ｘ２）を有する標的配列を、第１塩基（ｘ１）を有する標的配列よりも、優先的に増幅できる。プライマーからの伸長反応の反応性は、調節可能であり、その方法は、特に制限されず、例えば、公知の方法によって行える。具体例は、例えば、前記プライマー（Ｘ２）の５’領域に、蛍光物質およびビオチン等の物質を付加する方法、または、付加配列を付加する方法等があげられる。これらの方法は、例えば、特開２００４－３３７１２４号公報等の記載に基づいて行うことができる。
　前記プライマー（Ｘ１）は、前記配列（Ａ１’）の３’領域に、前記第１塩基（ｘ１）に相補的な塩基（ｘ１’）を有していればよく、好ましくは、前記配列（Ａ１’）において、３’末端の１番目の塩基および２番目の塩基の少なくとも一方が、前記第１塩基（ｘ１）に対して相補的な塩基（ｘ１’）であり、より好ましくは、前記配列（Ａ１’）において、３’末端の塩基が前記塩基（ｘ１’）である。例えば、鋳型核酸の配列を「５’－・・・ａｃＧｔｔ・・・－３’」、前記第１塩基（ｘ１）を大文字「Ｇ」と想定する。この場合、前記プライマー（Ｘ１）は、３’末端の１番目の塩基が前記第１塩基（ｘ１＝Ｇ）の相補塩基（Ｃ）である配列「５’－・・・ａａＣ－３’」に設計できる。また、前記プライマー（Ｘ１）は、例えば、３’末端の２番目の塩基が前記第１塩基（ｘ１＝Ｇ）の相補塩基（Ｃ）である配列「５’－・・・ａａＣｇ－３’」に設計してもよい。
　前者の場合、前記３’末端の１番目の塩基を前記第１塩基（ｘ１）に相補的な塩基（ｘ１’）とし、さらに、前記３’末端の２番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基を、前記鋳型核酸に対してミスマッチ塩基に設定することが好ましい。中でも、前記３’末端の２番目および３番目のうち少なくとも１つの塩基を、前記鋳型核酸に対するミスマッチ塩基に設定することが好ましく、前記３’末端の２番目の塩基をミスマッチ塩基に設定することがより好ましい。例えば、前述と同様に、鋳型核酸の配列を「５’－・・・ａｃＧｔｔ・・・－３’」、前記第１塩基（ｘ１）を大文字「Ｇ」と想定する。この場合、前記プライマー（Ｘ１）は、３’末端の１番目の塩基を、前記第１塩基（ｘ１＝Ｇ）の相補塩基（Ｃ）、２番目の塩基を、下線部の塩基（ｔ）に対して相補的な塩基（ａ）ではなくミスマッチ塩基（ｔ）とする配列「５’－・・・ａｔＣ－３’」に設計してもよい。また、後者の場合、前記３’末端の２番目の塩基を、前記第１塩基（ｘ１）に相補的な塩基（ｘ１’）とし、さらに、前記３’末端の１番目、および／または３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基を、前記鋳型核酸に対するミスマッチ塩基に設定することが好ましい。中でも、前記３’末端の１番目および３番目のうち少なくとも１つの塩基を、前記ミスマッチ塩基に設定することが好ましく、前記３’末端の３番目の塩基をミスマッチ塩基に設定することがより好ましい。例えば、前述と同様に、鋳型核酸における配列を「５’－・・・ａｃＧｔｔ・・・－３’」、前記第１塩基（ｘ１）を大文字「Ｇ」と想定する。この場合、前記プライマー（Ｘ１）は、３’末端の２番目の塩基を第１塩基（ｘ１＝Ｇ）の相補塩基（Ｃ）、３番目の塩基を、鋳型核酸の下線部の塩基（ｔ）に対して相補的な塩基（ａ）ではなく、ミスマッチ塩基（ｔ）とする配列「５’－・・・ａｔＣｇ－３’」に設計してもよい。このように、前記プライマー（Ｘ１）における配列（Ａ１’）に、ミスマッチ塩基を入れることで、前記第１塩基（ｘ１）を含む配列に対する前記プライマー（Ｘ１）の特異性をさらに向上できる。
　前記プライマー（Ｘ２）は、前記配列（Ａ２’）の３’領域に、前記第２塩基（ｘ２）に相補的な塩基（ｘ２’）を有していればよく、好ましくは、前記配列（Ａ２’）において、３’末端の１番目の塩基および２番目の塩基の少なくとも一方が、前記第２塩基（ｘ２）に対して相補的な塩基（ｘ２’）であり、より好ましくは、前記配列（Ａ２’）において、３’末端の塩基が前記塩基（ｘ２’）である。例えば、鋳型核酸の配列を「５’－・・・ａｃＡｔｔ・・・－３’」、第２塩基（ｘ２）を大文字「Ａ」と想定する。この場合、前記プライマー（Ｘ２）は、３’末端の１番目の塩基が前記第２塩基（ｘ２＝Ａ）の相補塩基（Ｔ）である配列「５’－・・・ａａＴ－３’」に設計できる。また、前記プライマー（Ｘ２）は、例えば、３’末端から２番目の塩基が前記第２塩基（ｘ２＝Ａ）の相補塩基（Ｔ）である配列「５’－・・・ａａＴｇ－３’」に設計してもよい。
　前者の場合、前記３’末端の１番目の塩基を前記第２塩基（ｘ２）に相補的な塩基（ｘ２’）とし、さらに、前記３’末端の２番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基を、前記鋳型核酸に対してミスマッチ塩基に設定することが好ましい。中でも、前記３’末端の２番目および３番目のうち少なくとも１つの塩基を、前記鋳型核酸に対するミスマッチ塩基に設定することが好ましく、前記３’末端の２番目の塩基をミスマッチ塩基に設定することがより好ましい。例えば、前述と同様に、鋳型核酸における配列を「５’－・・・ａｃＡｔｔ・・・－３’」、前記第２塩基（ｘ２）を大文字「Ａ」と想定する。この場合、前記プライマー（Ｘ２）は、３’末端の１番目の塩基を、前記第２塩基（ｘ２＝Ａ）の相補塩基（Ｔ）、２番目の塩基を、鋳型核酸の下線部の塩基（ｔ）に対して相補的な塩基（ａ）ではなくミスマッチ塩基（ｔ）とする配列「５’－・・・ａｔＴ－３’」に設計してもよい。また、後者の場合、前記３’末端の２番目の塩基を第２塩基（ｘ２）に相補的な塩基（ｘ２’）とし、さらに、前記３’末端の１番目、および／または３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基を、前記鋳型核酸に対するミスマッチ塩基に設定することが好ましい。中でも、前記３’末端の１番目および３番目のうち少なくとも１つの塩基を、前記ミスマッチ塩基に設定することが好ましく、前記３’末端の３番目の塩基をミスマッチ塩基に設定することがより好ましい。例えば、前述のように、鋳型核酸における配列を「５’－・・・ａｃＡｔｔ・・・－３’」、前記第２塩基（ｘ２）を大文字「Ａ」と想定する。この場合、前記プライマー（Ｘ２）は、３’末端の２番目の塩基を、前記第２塩基（ｘ２＝Ａ）の相補塩基（Ｔ）、３番目の塩基を、鋳型核酸の下線部の塩基（ｔ）に対して相補的な塩基（ａ）ではなくミスマッチ塩基（ｔ）とする配列「５’－・・・ａｔＴｇ－３’」に設計してもよい。このように、前記プライマー（Ｘ２）に、ミスマッチ塩基を入れることで、前記第２塩基（ｘ２）を含む配列に対する前記プライマー（Ｘ２）の特異性をさらに向上できる。
　本発明において、前記プライマー（Ｘ１）の付加配列（Ｅ１）は、前述のように、前記部分配列（Ａ１）の３’末端に隣接する前記鋳型核酸の部分配列（Ｂ１）に非相補的な付加配列であり、前記配列（Ａ１’）の５’末端に結合している。本発明において、「部分配列に非相補的な配列」は、例えば、前記部分配列に対してアニーリング不可能であることを意味する（以下、同様）。前記鋳型核酸の部分配列（Ｂ１）と前記付加配列（Ｅ１）との相補性は、例えば、両者をアライメントした際、９０％以下が好ましく、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは１０％以下であり、特に好ましくは０％、つまり、前記付加配列（Ｅ１）は、前記部分配列（Ｂ１）に対して完全に非相補的な塩基のみからなる配列であることが好ましい。
　前記付加配列（Ｅ１）の塩基長は、特に制限されず、例えば、１～５０塩基長であり、好ましくは１～２０塩基長であり、より好ましくは１～１０塩基長である。前記付加配列（Ｅ１）の塩基長は、例えば、前記プライマー（Ｘ１）の配列（Ａ１’）の塩基長に対して、例えば、１／５０～１／１の塩基長であり、好ましくは１／２０～１／１の塩基長であり、より好ましくは１／１０～１／２の塩基長である。
　本発明において、前記プライマー（Ｘ２）は、さらに、配列（Ｅ２）を有してもよい。前記配列（Ｅ２）は、例えば、前記鋳型核酸における前記部分配列（Ａ２）の３’末端に隣接する部分配列（Ｂ２）に非相補的な配列である。前記配列（Ｅ２）は、例えば、付加配列ともいう。
　前記プライマー（Ｘ２）の概略を、図１Ｂに示す。図１Ｂは、鋳型とプライマー（Ｘ２）との関係を示す模式図である。図１Ｂに示すように、予め、鋳型（＋）の配列において、標的部位の塩基（ｘ２）を５’領域に有する配列を部分配列（Ａ２）と決定し、前記部分配列（Ａ２）の３’末端に隣接する配列を部分配列（Ｂ２）と決定する。これに対して、プライマー（Ｘ２）は、部分配列（Ａ２）に相補的な配列（Ａ２’）と、部分配列（Ｂ２）に非相補的な配列（Ｅ２）とを有する構成とする。前記付加配列（Ｅ２）は、前記配列（Ａ２’）の５’末端に結合している。プライマー（Ｘ２）において、標的部位の第２塩基（ｘ２）に対応する相補的な塩基（ｘ２’）は、配列（Ａ２’）の３’領域に位置する。
　前記付加配列（Ｅ２）は、前記付加配列（Ｅ１）と異なる配列であることが好ましい。このように、前記プライマー（Ｘ２）が、前記付加配列（Ｅ２）を有することによって、例えば、前記第２塩基（ｘ２）を有する配列に対する前記プライマー（Ｘ２）の特異性を向上でき、結果的に、より優れた増幅効率で、前記標的部位が第２塩基（ｘ２）である標的配列を増幅できる。
　前記プライマー（Ｘ２）が前記付加配列（Ｅ２）を有する場合、例えば、図３に示すような増幅反応となる。図３は、前記付加配列（Ｅ１）を有するプライマー（Ｘ１）および前記付加配列（Ｅ２）を有するプライマー（Ｘ２）を使用した際における、鋳型核酸および伸長鎖に対する前記各プライマーのアニーリングを示す模式図である。図３においては、一例として、前記プライマー（Ｘ１）を正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）、前記プライマー（Ｘ２）を変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）に設定したが、前述のように、本発明は、これには制限されない。
　図３は、本発明において、正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）および変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）を使用した際における、前記各プライマーのアニーリング状態を示す模式図である。前記試料中に、正常型鋳型（＋）および変異型鋳型（＋）の両方が含まれる場合、通常、前記正常型鋳型（＋）には、前記正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）がアニーリングし易く、前記変異型鋳型（＋）には、前記変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）がアニーリングし易い（図３Ａ）。アニーリングした正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）は、付加配列（Ｅ１）を有する。このため、前記正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）からの正常型伸長鎖（－）は、５’側に、前記付加配列（Ｅ１）を有する。一方、アニーリングした変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）は、付加配列（Ｅ２）を有する。このため、前記プライマー（Ｘ２ｍｔ）からの変異型伸長鎖（－）は、５’側に、前記付加配列（Ｅ２）を有する。このため、順方向プライマーによって、前記正常型伸長鎖（－）に基づいて生成された、相補的な正常型伸長鎖（＋）は、前記付加配列（Ｅ１）に相補的な配列（Ｅ１’）を有し、前記変異型伸長鎖（－）に基づいて生成された、相補的な変異型伸長鎖（＋）は、前記付加配列（Ｅ２）に相補的な配列（Ｅ２’）を有する（図３Ｂ）。さらに、前記正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）の付加配列（Ｅ１）と、前記変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）の付加配列（Ｅ２）とは、配列が異なるため、正常型伸長鎖（＋）には、付加配列（Ｅ１）を有する正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）が特異的にアニーリングし、変異型伸長鎖（＋）には、付加配列（Ｅ２）を有する変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）が特異的にアニーリングする。したがって、正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）により、正常型伸長鎖が優れた増幅効率で増幅され、変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）により、変異型伸長鎖が優れた増幅効率で増幅される。この際、前記プライマー（Ｘ１）の配列（Ａ１’）と、前記プライマー（Ｘ２）の配列（Ａ２’）とを、例えば、前述のような関係に設定することで、プライマー（Ｘ１）よりも、プライマー（Ｘ２）による増幅を、優先的に行うことも可能である。ここでは、一例として、第１塩基（ｘ１）を正常型塩基（ｘｗｔ）、第２塩基（ｘ２）を変異型塩基（ｘｍｔ）と設定して説明したが、前述のように、これには何ら制限されない。
　前記プライマー（Ｘ２）の付加配列（Ｅ２）は、前述のように、例えば、前記鋳型核酸における部分配列（Ｂ２）に対して非相補的な配列である。前記鋳型核酸における部分配列（Ｂ２）と前記付加配列（Ｅ２）との相補性は、例えば、両者をアライメントした際、９０％以下が好ましく、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは１０％以下であり、特に好ましくは０％、つまり、前記付加配列（Ｅ２）は、前記部分配列（Ｂ２）に対して完全に非相補的な塩基のみからなる配列であることが好ましい。
　前記プライマー（Ｘ１）の付加配列（Ｅ１）と、前記プライマー（Ｘ２）の付加配列（Ｅ２）とは、前述のように、例えば、異なる配列である。前記付加配列（Ｅ１）と前記付加配列（Ｅ２）との相同性は、例えば、両者をアライメントした際、９０％以下が好ましく、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは１０％以下であり、特に好ましくは０％である。
　前記付加配列（Ｅ２）の塩基長は、特に制限されず、例えば、１～５０塩基長であり、好ましくは１～２０塩基長であり、より好ましくは１～１０塩基長である。前記付加配列（Ｅ２）の塩基長は、例えば、前記プライマー（Ｘ２）における配列（Ａ２’）の塩基長に対して、例えば、１／５０～１／１の塩基長であり、好ましくは１／２０～１／１の塩基長であり、より好ましくは１／１０～１／２の塩基長である。前記付加配列（Ｅ２）は、例えば、前記プライマー（Ｘ１）の付加配列（Ｅ１）と同じ塩基長であることが好ましい。
　前記プライマー（Ｘ１）の塩基長と前記プライマー（Ｘ２）の塩基長は、特に制限されない。前記プライマー（Ｘ１）は、例えば、１０～５０塩基長であり、好ましくは１５～４５塩基長であり、より好ましくは１６～４０塩基長である。前記プライマー（Ｘ２）は、例えば、１０～５０塩基長であり、好ましくは１５～４５塩基長であり、より好ましくは１６～４０塩基長である。具体例として、前記プライマー（Ｘ２）が、例えば、前記配列（Ａ２’）のみからなる場合、例えば、１０～５０塩基長であり、好ましくは１５～４０塩基長であり、より好ましくは１６～３５塩基長である。前記プライマー（Ｘ２）が、例えば、前記配列（Ａ２’）と前記付加配列（Ｅ２）とを含む場合、例えば、１０～５０塩基長であり、好ましくは１５～４０塩基長であり、より好ましくは１６～３５塩基長である。
　本発明は、前記増幅工程において、前記プライマー（Ｘ１）およびプライマー（Ｘ２）とあわせて、例えば、さらに、下記プライマー（Ｙ１）を使用してもよい。
プライマー（Ｙ１）
前記鋳型核酸における前記標的部位よりも５’側の部分配列（Ｃ）を有するプライマー
　前記プライマー（Ｙ１）の概略を図１Ｃに示す。図１Ｃは、鋳型とプライマー（Ｙ１）との関係を示す模式図である。図１Ｃに示すように、鋳型において、前記部分配列（Ａ１）に含まれる標的部位よりも５’側の部分配列を配列（Ｃ）と決定する。これに対して、前記プライマー（Ｙ１）は、前記部分配列（Ｃ）を有する構成とする。順鎖（＋）の相補鎖である逆鎖（－）は、前記部分配列（Ｃ）に対する相補的な配列（Ｃ’）を有する。このため、前記プライマー（Ｙ１）は、その配列（Ｃ）において、前記逆鎖（－）の配列（Ｃ’）にアニーリングし、順鎖を増幅できる。
　前記プライマー（Ｙ１）は、例えば、前記プライマー（Ｘ１）およびプライマー（Ｘ２）が、逆鎖を伸長するプライマーであるのに対して、順鎖を伸長する順方向プライマーである。このため、例えば、順方向プライマーである前記プライマー（Ｙ１）と、逆方向プライマーである前記プライマー（Ｘ１）および前記プライマー（Ｘ２）とは、それぞれ対のプライマーとなる。また、前記プライマー（Ｙ１）は、前記標的部位とは異なる領域にアニーリングするプライマーであるため、例えば、標的部位の塩基の種類に関わらず、標的配列を増幅できる。
　前記プライマー（Ｙ１）の長さは、特に制限されず、通常、１０～５０塩基であることが好ましく、より好ましくは１５～４０塩基であり、特に好ましくは１６～３５塩基である。前記プライマー（Ｙ１）は、前記鋳型核酸における前記標的部位よりも５’側の部分配列（Ｃ）を有していればよい。
　前記プライマー（Ｙ１）は、例えば、その５’側に、付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、鋳型において、前記部分配列（Ｃ）の５’側の配列とは異なる配列であることが好ましい。
　本発明の増幅方法は、前記増幅工程において、例えば、前記反応系に、さらに、前記鋳型核酸における前記標的部位を含む配列にハイブリダイズ可能なプローブを添加してもよい。前記プローブは、例えば、標識物質を有する標識プローブがあげられる。
　本発明においては、例えば、一本鎖核酸および二本鎖核酸のいずれを鋳型核酸として、増幅を行うこともできる。後者の二本鎖核酸の場合、例えば、これを構成する２つの相補的な一本鎖を、それぞれ鋳型として、増幅を行ってもよい。前記鋳型核酸が二本鎖核酸の場合、例えば、（＋）鎖における標的部位と、（－）鎖における標的部位とは、それぞれ対応している。後述する本発明の多型検出方法において使用する前記プローブは、例えば、前記（＋）鎖にハイブリダイズ可能なプローブでもよいし、前記（－）鎖にハイブリダイズ可能なプローブでもよい。
　前記鋳型核酸は、前述のように、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。前記鋳型核酸は、例えば、ＤＮＡ、および、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。
　前記鋳型核酸は、例えば、試料中の核酸でもよいし、前記核酸の増幅産物でもよい。生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。前者は、例えば、生体試料中に元来含まれている核酸があげられる。後者は、例えば、検出精度を向上できることから好ましく、前記増幅産物は、例えば、前記試料中の核酸を鋳型として、核酸の増幅法により増幅させることで調製できる。前記増幅産物は、例えば、前記試料中のＤＮＡを鋳型とした増幅産物でもよいし、前記試料中のＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型とした増幅産物でもよい。前記試料中のＲＮＡは、例えば、例えば、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡがあげられ、前記ｃＤＮＡは、例えば、前記ＲＮＡから、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ＰＣＲ）により合成できる。前記増幅産物の長さは、特に制限されず、例えば、５０～１０００塩基であり、好ましくは８０～２００塩基である。
　本発明において、前記増幅工程は、試料中の核酸を鋳型として、増幅反応を行うことが好ましい。前記試料は、鋳型となる核酸を含む試料であればよく、特に制限されず、例えば、生体試料由来の核酸を含む試料があげられる。前記生体試料は、例えば、全血、白血球細胞等の血球、骨髄、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪の細胞および毛髪の細胞等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、胃洗浄液等、ならびに、それらの懸濁液等があげられる。また、前述のように、生体試料由来の核酸を鋳型として核酸増幅法を行った反応液を、本発明における核酸試料とし、前記反応液に含まれる増幅産物を鋳型核酸としてもよい。本発明は、前述のように、試料が精製されているか未精製であるかにかかわらず、プライマーの誤ったアニーリングを抑制できるため、本発明は、特に未精製の試料の適用に優れている。このように、未精製の試料を使用できる方法であれば、精製のための前処理も省略できることから、より一層操作が簡便となり、コストも低減できる。
　本発明の増幅方法を、後述する本発明の多型の検出方法に適用する場合、前記試料は、特に制限されず、例えば、標的部位が変異型および正常型のいずれを示すか不明である核酸を含む試料、変異型を有する核酸と正常型を有する核酸とを含む試料、これらを含む可能性のある試料等に対して、非常に有用である。前記ＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸の由来は、制限されず、例えば、各種癌細胞等の細胞、ウィルス、ミトコンドリア等があげられる。癌化した血液細胞等の細胞には、変異型を示す核酸を有する細胞と、正常型を示す核酸を有する細胞とが含まれるため、前述のような問題が起こり易い。したがって、本発明の多型検出方法は、特に、変異型を示す核酸と正常型を示す核酸とを有する試料への適用が好ましく、例えば、白血病等の各種癌細胞等の生体試料、具体例として、血液試料および白血球細胞等に適用することが好ましい。なお、本発明において、試料の採取方法、核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
　前記生体試料由来の核酸は、例えば、従来公知の方法によって、生体試料から単離できる。全血からのゲノムＤＮＡの単離は、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名GFX　Genomic　Blood　DNA　Purification　kit；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
　本発明の増幅工程において、同一の反応系での増幅は、例えば、一つの反応液内で標的配列を増幅させることがあげられる。
　本発明の増幅方法は、前記増幅工程において、前述のプライマーを使用する点が特徴であり、その他の工程や条件等は何ら制限されない。前記増幅工程における核酸増幅法は、特に制限されず、例えば、ＰＣＲ（Polymerase　Chain　Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic　acid　sequence　based　amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated　amplification）法、ＳＤＡ（Strand　Displacement　Amplification）法等があげられ、中でも、ＰＣＲ法が好ましい。なお、核酸増幅法の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
　前記増幅工程において、増幅反応の反応系（例えば、反応液）における核酸試料の添加割合は、特に制限されない。前記核酸試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、前記反応系における前記生体試料の添加割合は、下限が、例えば、０．０１体積％であることが好ましく、より好ましくは０．０５体積％、さらに好ましくは０．１体積％である。また、前記添加割合の上限は、特に制限されず、例えば、２体積％が好ましく、より好ましくは１体積％、さらに好ましくは０．５体積％である。
　また、後述する変異の検出において、例えば、プローブを用いた光学的検出を行う場合、前記反応系における前記生体試料（例えば、全血試料）の添加割合は、例えば、０．１～０．５体積％に設定することが好ましい。ＰＣＲ反応においては、通常、ＤＮＡ変性（一本鎖ＤＮＡへの解離）のために熱処理が施されるが、この熱処理によって、試料に含まれる糖およびタンパク質等が変性し、不溶化の沈殿物または濁り等が発生するおそれがある。このため、変異の有無を光学的手法により確認する場合、このような沈殿物または濁りの発生が、測定精度に影響を及ぼす可能性がある。しかしながら、反応系における前記生体試料の添加割合を前述の範囲に設定すれば、メカニズムは不明であるが、例えば、変性による沈殿物等の発生による影響を十分に防止できるため、光学的手法による測定精度を向上できる。また、前記生体試料中の夾雑物によるＰＣＲの阻害も十分に抑制されるため、増幅効率をより一層向上できる。したがって、全血試料等の生体試料の添加割合を前述の範囲に設定することによって、例えば、沈澱物または濁りの発生を防止したり除去するための、前記試料の前処理の必要性を排除できる。
　また、前記反応系中の全血試料の割合は、前述のような体積割合（例えば、０．１～０．５体積％）ではなく、ヘモグロビン（以下、「Ｈｂ」という）の重量割合で表すこともできる。この場合、前記反応系における全血試料の割合は、Ｈｂ量に換算して、例えば、０．５６５～１１３ｇ／Ｌが好ましく、より好ましくは２．８２５～５６．５ｇ／Ｌであり、さらに好ましくは５．６５～２８．２５ｇ／Ｌである。なお、前記反応系における全血試料の添加割合は、例えば、前記体積割合と前記Ｈｂ重量割合との両方を満たしてもよいし、いずれか一方を満たしてもよい。全血は、例えば、溶血した全血、未溶血の全血、抗凝固全血、凝固画分を含む全血等のいずれでもよい。
　前記増幅工程において、増幅反応の開始に先立ち、前記反応系にさらにアルブミンを添加することが好ましい。このようなアルブミンの添加によって、例えば、前述のような沈殿物または濁りの発生による影響を、より一層低減でき、且つ、増幅効率もさらに向上することができる。
　前記反応系におけるアルブミンの添加割合は、例えば、０．０１～２重量％であり、好ましくは０．１～１重量％であり、より好ましくは０．２～０．８重量％である。前記アルブミンは、特に制限されず、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等があげられ、これらはいずれか１種類でもよいし、２種類以上を併用してもよい。
　つぎに、本発明の増幅方法について、一例として、前記プライマー（Ｘ１）として正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）、前記プライマー（Ｘ２）として変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）を使用し、ＰＣＲ法により増幅を行う方法を説明する。なお、本発明は、これには制限されない。また、ＰＣＲの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
　まず、鋳型核酸および前述の各種プライマーを含むＰＣＲ反応液を調製する。前記ＰＣＲ反応液における各種プライマーの添加割合は、特に制限されず、正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）は、例えば、０．０１～１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０５～５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．１～１μｍｏｌ／Ｌである。変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）は、例えば、０．０１～１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０５～５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．１～０．５μｍｏｌ／Ｌである。前記正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）と変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）とのモル比（Ｘ１ｗｔ：Ｘ２ｍｔ）は、例えば、０．００１：１～１０：１であることが好ましく、より好ましくは、０．０１：１～２：１であり、特に好ましくは、０．１:１～１：１である。
　また、前記正常型プライマー（Ｘ１ｗｔ）と前記変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）とに加えて、前記プライマー（Ｙ１）を併用する場合、前記プライマー（Ｙ１）は、例えば、０．０１～１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０５～５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．１～１μｍｏｌ／Ｌである。前記変異型プライマー（Ｘ２ｍｔ）と前記プライマー（Ｙ１）とのモル比（Ｘ２ｍｔ：Ｙ１）は、例えば、１：０．００１～１：１０であることが好ましく、より好ましくは、１：０．０１～１：２であり、特に好ましくは、１：０．１～１：１である。
　前記反応液は、さらに他の成分を含んでもよく、例えば、ＰＣＲ反応に関与する成分を含むことが好ましい。前記他の成分は、特に制限されず、当業者であれば適宜設定できる。前記他の成分は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、溶媒、各種触媒等があげられる。前記反応液において、例えば、各成分の添加順序は何ら制限されない。
　前記ＤＮＡポリメラーゼは、特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例は、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号）（商品名Ｔａｑポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ　９１／０９９５０）（ｒＴｔｈ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ　９２／９６８９）（Ｐｆｕ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅｓ社製）、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来ポリメラーゼ（ＥＰ－Ａ　４５５　４３０（商標Ｖｅｎｔ）：Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来の耐熱性ポリメラーゼが好ましい。
　前記反応液におけるＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、特に制限されず、例えば、１～１００Ｕ／ｍＬであり、好ましくは、５～５０Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは、２０～４０Ｕ／ｍＬである。ＤＮＡポリメラーゼの活性単位（Ｕ）は、一般に、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型プライマーとして、活性測定用反応液中、７４℃で、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性が１Ｕである。前記活性測定用反応液の組成は、例えば、２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＴＡＰＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌメルカプトエタノール、２００μｍｏｌ／Ｌ　ｄＡＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ　ｄＧＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ　ｄＴＴＰ、１００μｍｏｌ／Ｌ「α－３２Ｐ」ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍＬ活性化サケ精子ＤＮＡである。
　前記ヌクレオシド三リン酸は、通常、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および、ｄＴＴＰまたはｄＵＴＰ）があげられる。前記反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、特に制限されず、例えば、０．０１～１ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．０５～０．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、０．１～０．３ｍｍｏｌ／Ｌである。
　前記溶媒は、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等の緩衝液があげられ、市販のＰＣＲ用緩衝液や市販のＰＣＲキットの緩衝液等が使用できる。
　前記反応液は、さらに、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含んでもよく、これらの添加割合は、例えば、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で設定すればよい。
　前記反応液の全体積は、特に制限されず、例えば、サーマルサイクラー等の使用する機器等に応じて適宜設定できるが、通常、１～５００μＬであり、好ましくは１０～１００μＬである。
　つぎに、ＰＣＲを行う。ＰＣＲは、例えば、（１）二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離、（２）プライマーのアニーリング、（３）プライマーの伸長（ポリメラーゼ反応）の３つの工程を含む。各工程の条件は、特に制限されず、前記（１）工程は、例えば、９０～９９℃、１～１２０秒が好ましく、より好ましくは、９２～９５℃、１～６０秒であり、前記（２）工程は、例えば、４０～７０℃、１～３００秒が好ましく、より好ましくは、５０～７０℃、５～６０秒であり、前記（３）工程は、例えば、５０～８０℃、１～３００秒が好ましく、より好ましくは、５０～７５℃、５～６０秒である。また、サイクル数も特に制限されず、前記（１）～（３）の３工程を１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。上限は特に制限されず、例えば、合計１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、より好ましくは５０サイクル以下である。各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。
　本発明においては、例えば、１つの反応系において、同時に、二種類以上の遺伝子について、それぞれの標的配列を増幅することもでき、また、同じ遺伝子について、部位の異なる多型をそれぞれ含む二種類以上の標的配列を増幅することもできる。この場合、目的の標的配列ごとに、前述のプライマー（Ｘ１）およびプライマー（Ｘ２）、任意でプライマー（Ｙ１）を準備し、これらの共存下で前述のような増幅反応を行えばよい。
　本発明の標的配列の増幅方法は、さらに、前述の増幅反応によって得られた増幅産物を検出する工程を含んでもよい。これによって、例えば、前記標的配列における標的部位の多型を検出できる。前記多型検出は、例えば、後述するようなＴｍ解析によって確認できる。具体的には、例えば、前記増幅工程における前記増幅反応の反応系に、さらに、前記鋳型配列における前記標的部位を含む標的配列にハイブリダイズ可能なプローブを添加する。そして、前記反応系の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する。これによって、温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、変異型または正常型等の多型の種類を確認できる。前記プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、前記増幅反応前、増幅反応途中および増幅反応後のいずれの段階で、前記反応系に添加してもよい。中でも、例えば、前記プローブの添加のために前記反応液を外部環境に露出する必要がなく、また、前記増幅反応とシグナル値の測定とを、連続的に行うことが可能であるため、前記プローブの添加は、前記増幅反応前であることが好ましい。前記多型検出に関しては、具体的に、後述する本発明の多型検出方法において説明する。また、前記プローブ等に関しても、後述のとおりである。
＜多型検出方法＞
　本発明の多型の検出方法は、前述のように、前記本発明の増幅方法により、鋳型核酸における標的部位を含む標的配列を増幅させる工程、および、前記標的配列にハイブリダイズ可能なプローブにより、前記標的配列における前記標的部位の多型を検出する工程を含むことを特徴とする。
　本発明は、前述の方法によって標的配列を増幅し、得られた増幅産物について、プローブにより多型を検出することが特徴であって、その他の工程ならびに条件等は、何ら制限されない。
　本発明の検出方法は、例えば、下記（ａ）～（ｃ）工程を含んでもよい。
（ａ）本発明の増幅方法により、前記標的配列を増幅させる増幅工程
（ｂ）前記プローブの存在下、前記（ａ）工程で得られた増幅産物を含む反応系の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する測定工程
（ｃ）前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記鋳型核酸における前記標的部位の多型を検出する工程
　本発明は、核酸を含む試料に適用することが好ましく、前記試料は、特に制限されず、前述と同様の試料があげられる。また、前記鋳型核酸の種類も、特に制限されず、前述と同様の核酸があげられる。
　前記プローブは、以下、「検出用プローブ」ともいう。前記プローブは、特に制限されず、従来公知の方法によって設定できる。例えば、前記鋳型核酸が二本鎖の場合、センス鎖の標的配列にハイブリダイズするように設計してもよいし（センス鎖の検出用プローブ）、アンチセンス鎖の標的配列にハイブリダイズするように設計してもよい（アンチセンス鎖の検出用プローブ）。前記プローブを設計する際、前記標的配列における標的部位の塩基は、例えば、正常型塩基に設定してもよいし、変異型塩基に設定してもよい。すなわち、前記プローブは、例えば、前記標的配列にハイブリダイズさせた際、前記標的配列における標的部位の塩基に対応する塩基が、例えば、正常型塩基に相補的でもよいし、変異型塩基に相補的でもよい。本発明において、例えば、変異型の検出を目的とする場合、前記プローブにおいて、標的部位の塩基に対応する塩基が、変異型塩基に相補的であって、正常型塩基に非相補的であることが好ましい。
　本発明において、前記プローブは、前述のように、前記標的部位を含む標的配列にハイブリダイズ可能な配列であればよい。前記プローブの配列は、特に制限されず、例えば、ハイブリッド形成の際に、前記標的部位と対をなす部位の塩基を除いて、前記標的配列との相補性が、例えば、９０％～１００％であることが好ましく、特に好ましくは１００％であり、つまり、前記標的配列とパーフェクトマッチ配列であることが好ましい。
　前記反応系におけるプローブの添加割合は、特に制限されず、例えば、前記プローブを１０～４００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０～２００ｎｍｏｌ／Ｌである。前記プローブが、蛍光色素等の標識物質で標識化された標識プローブである場合、例えば、検出する蛍光強度等のシグナル強度を調節するために、前記標識プローブと同じ配列である未標識プローブとを併用してもよい。この未標識プローブは、例えば、その３’末端にリン酸基が付加されてもよい。この場合、前記標識プローブと前記非標識プローブとのモル比は、例えば、１：１０～１０：１が好ましい。前記プローブの長さは、特に制限されず、例えば、５～５０塩基長であり、好ましくは１０～３０塩基長である。
　前記プローブは、前記（ａ）工程の後、すなわち、標的配列の増幅反応を行った後、増幅反応の反応系に添加することもできるが、容易且つ迅速に解析を行えることから、前記（ａ）工程の増幅反応に先立って、予め、前記反応系に添加しておくことが好ましい。前記反応系における各種プローブの添加割合等は、前述の通りである。このように、増幅反応に先立って前記反応系に前記プローブを添加する場合、例えば、プローブ自体の伸長を予防するために、その３’末端に、さらにリン酸基が付加されてもよいし、前述のような標識物質で３’末端を標識化してもよい。
　本発明の多型検出方法は、前述のような、いわゆるＴｍ解析（融解曲線解析ともいう）に利用できる。ここで、Ｔｍ解析におけるＴｍ値について説明する。例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
　前記（ｂ）工程において、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値の測定は、前述したように、２６０ｎｍの吸光度測定でもよいが、標識物質のシグナル測定でもよい。具体的には、前記プローブとして、標識物質で標識化された標識プローブを使用し、前記標識物質のシグナル測定を行うことが好ましい。前記標識プローブは、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、増幅産物とハイブリッド（例えば、二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱により前記増幅産物から前記プローブが解離するとシグナルを示す。後者のプローブであれば、増幅産物とハイブリッド（例えば、二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱により前記増幅産物から前記プローブが解離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、前記標識物質のシグナルを検出することによって、前記２６０ｎｍにおける吸光度測定と同様に、ハイブリッドの融解の進行ならびにＴｍ値の決定等を行うことができる。前記標識物質のシグナル検出は、例えば、前記標識物質のシグナルに特有の条件で検出すればよく、前記条件は、例えば、励起波長、検出波長等があげられる。
　前記（ｃ）工程において、シグナル値の変動からの前記標的部位の多型の検出は、従来の方法により行うことができる。具体例は、例えば、前記シグナル値の変動を、前記プローブと変異型標的配列とのハイブリッドの変動および／または前記プローブと野生型標的配列とのハイブリッドの変動と比較し、多型が変異型か野生型かを判断できる。つまり、変異型と同様であれば変異型、野生型と同様であれば野生型と判断できる。また、例えば、前記シグナルの変動からＴｍ値を求め、評価基準のＴｍ値との比較により、多型を判断できる。まず、前記シグナル値の変動から、Ｔｍ値を求める。つぎに、測定した前記Ｔｍ値を、予め求めた、野生型標的配列についてのＴｍｗｔ値および／または変異型標的配列についてのＴｍｍｔ値と比較する。そして、測定したＴｍ値が、評価基準のＴｍ値ｗｔと同じまたは同程度であれば野生型、Ｔｍｗｔ値よりも低いならば変異型、評価基準のＴｍｍｔ値と同じまたは同程度であれば変異型、Ｔｍｍｔ値よりも低いならば野生型と判断できる。同程度とは、例えば、±３℃程度である。
　また、前述のように、前記（ａ）工程においては、同一反応系において同時に、二種類以上の標的配列を増幅できる。そして、各増幅産物について、それぞれの標的部位の多型を確認できる。この場合、標的部位を含む標的配列ごとに、ハイブリダイズするプローブを準備すればよい。前記各プローブは、それぞれ異なる条件で検出される異なる標識物質で標識化した標識プローブを使用することが好ましい。このようなプローブを用いれば、同一反応系でも、検出条件を変更することによって、各多型をそれぞれ検出できる。
　前記標識プローブにおいて、前記標識物質により標識化される部位は、特に制限されない。前記標識プローブを構成するオリゴヌクレオチドにおいて、前記標識化部位は、例えば、５’領域または３’領域が好ましく、より好ましくは、５’末端または３’末端から数えて１～４番目の位置、より好ましくは、１～３番目の位置、特に好ましくは１番目（５’末端または３’末端）または２番目である。後述するように、前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される塩基は、例えば、シトシン（ｃ）またはグアニン（ｇ）が好ましい。前記標識物質は、例えば、塩基を直接標識化してもよいし、前記塩基を含むヌクレオチド残基のいずれかの部位（例えば、リン酸基）を標識することによって、前記塩基を間接的に標識化してもよい。
　前記標識物質は、特に制限されず、例えば、前記標識プローブが単独であるか、ハイブリッドを形成しているかによって、シグナルを発するものが好ましい。前記シグナルの種類は、特に制限されず、例えば、蛍光、呈色、発色等があげられる。前記シグナルが蛍光の場合、シグナル値は、例えば、蛍光強度があげられる。前記シグナルが呈色または発色の場合、前記シグナル値は、例えば、反射率、吸光度、透過率等があげられる。前記シグナルは、例えば、前記標識物質から直接発せられてもよいし、間接的に発せられてもよい。
　前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光団等の蛍光物質等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光物質は、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｌｕｅ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（登録商標、ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（商品名、アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ（登録商標、モレキュラープローブ社製）等があげられる。前記蛍光物質の検出条件は、特に制限されず、例えば、使用する蛍光物質の種類により適宜決定できる。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｌｕｅは、検出波長４５０～４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５～７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬは、検出波長５１５～５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、例えば、シグナルとして蛍光を検出し、シグナル値として蛍光強度を測定することにより、蛍光強度の変動から、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
　前記標識プローブは、例えば、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブであることが好ましい。前記標識物質が蛍光物質の場合、前記標識プローブは、例えば、前記蛍光物質で標識化され、単独で蛍光を示し、且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象（Quenching　phenomenon）と呼ばれる。この現象を利用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。中でも、前記蛍光消光プローブは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端が前記蛍光物質で標識化されていることが好ましく、標識化される前記末端の塩基は、シトシン（ｃ）またはグアニン（ｇ）であることが好ましい。前記末端の塩基がシトシン（ｃ）の場合、前記蛍光消光プローブは、例えば、増幅産物とハイブリッドを形成した際、前記増幅産物における、標識化された末端のシトシン（ｃ）と対をなす塩基または前記対をなす塩基から１～３塩基離れた塩基がグアニン（ｇ）となるように、前記蛍光消光プローブの塩基配列を設計することが好ましい。前記対をなす塩基から一塩基離れた塩基は、前記対をなす塩基の隣の塩基を意味する。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。このようなグアニン消光プローブが前記増幅産物にハイブリダイズすると、例えば、前記蛍光物質で標識化された末端のシトシン（ｃ）が、前記増幅産物におけるグアニン（ｇ）に近づくことによって、前記蛍光物質の蛍光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなプローブを使用すれば、蛍光強度の変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認できる。同様に、前記末端の塩基がグアニン（ｇ）の場合、前記蛍光消光プローブは、例えば、前記増幅産物とハイブリッドを形成した際、前記増幅産物における、標識化された末端のグアニン（ｇ）と対をなす塩基または前記対をなす塩基から１～３塩基離れた塩基がシトシン（ｃ）となるように、前記蛍光消光プローブの塩基配列を設計することが好ましい。
　前記プローブは、前述のように、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、増幅反応の際、前記プローブを増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、前記プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、前記プローブ自体が前記増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
　次に、本発明の多型検出方法について、ＰＣＲにより増幅反応を行い、前記検出用プローブとして標識プローブを使用する一例をあげて説明する。なお、本発明は、これには制限されない。
　まず、鋳型核酸を含む試料、前述の本発明における各種プライマー、および、前記標的配列にハイブリダイズする標識プローブを添加した反応液を用いて、前述のようにＰＣＲを行う。前記反応液は、前記各種プライマーおよび標識プローブの他に、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、その他の核酸増幅に使用できる種々の添加剤を含んでもよい。
　前記標識プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、増幅反応前、増幅反応途中および増幅反応後のいずれでもよいが、前記（ａ）工程の増幅反応と、前記（ｂ）工程とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。
　次に、得られた増幅産物（二本鎖ＤＮＡ）の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記反応液の温度を変化させることで行うことができる。
　前記解離工程における加熱温度は、二本鎖の前記増幅産物を一本鎖に解離できる温度であれば特に制限されず、例えば、８５～９５℃である。加熱時間も特に制限されず、通常、１秒～１０分であり、好ましくは１秒～５分である。
　解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行える。温度条件は、例えば、４０～５０℃である。前記温度での処理時間は、特に制限されず、例えば、１～６００秒である。
　そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液を加熱し、すなわち、前記一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリッドを加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、例えば、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。なお、前記標識プローブを使用する場合、前記シグナル値は、例えば、前記標識プローブの標識物質に応じた条件で測定できる。検出目的の標的部位が複数であり、複数種のプローブを使用して、多型を検出する際には、前述のように、異なる検出条件の標識物質で標識化したプローブを使用し、各プローブの標識物質に応じた条件で、それぞれのシグナル値を測定すればよい。
　蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されず、例えば、開始温度が室温～８５℃であり、好ましくは２５～７０℃であり、終了温度は、例えば、４０～１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されず、例えば、０．１～２０℃／秒であり、好ましくは０．３～５℃／秒である。
　つぎに、測定したシグナル値から、温度変化に伴うシグナル値の変動を解析し、大きな変動（ピーク）を示すＴｍ値を決定する。シグナル値の変動は、例えば、単位時間（ｔ）あたりのシグナル値（Ｆ）の変化量を算出することで解析できる。ハイブリッドの融解（一本鎖化）によりシグナル値が増加する場合は、例えば、得られたシグナル値から、各温度における単位時間（ｔ）当たりのシグナル値（Ｆ）の増加量またはその負の微分値（－ｄＦ／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間（ｔ）当たりのシグナル値（Ｆ）の増加量またはその微分値（ｄＦ／ｄｔ）が最も高い値を示す温度をＴｍ値として決定することもできる。他方、ハイブリッドの融解（一本鎖化）によりシグナル値が減少する場合には、例えば、反対に、単位時間（ｔ）当たりのシグナル値（Ｆ）の減少量を算出することにより、Ｔｍ値を決定することもできる。
　なお、前述のように、前記反応液の温度を上昇させて、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル値を測定し、その変動を解析してもよい。すなわち、前記反応系の温度を降下させてハイブリッドを形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル値の変動を解析してもよい。
　前記シグナル値の変動の解析は、例えば、温度とシグナル値の変動との関係をプロットしたグラフを作成して解析することも可能であるが、前記解析工程において、前記グラフの作成は必須ではない。
　前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のMELTCALCソフトウエア（http://www．meltcalc．com/）等により算出でき、また、隣接法（Nearest　Neighbor　Method）によって決定することもできる。
　そして、これらのＴｍ値から、標的部位の塩基の種類、すなわち、変異型または正常型等の多型を決定する。Ｔｍ解析において、完全に相補であるハイブリッド（パーフェクトマッチ）は、一塩基が異なるハイブリッド（ミスマッチ）よりも、解離を示すＴｍ値が高くなるという結果が得られる。したがって、予め、前記プローブについて、完全に相補であるハイブリッドのＴｍ値と、一塩基が異なるハイブリッドのＴｍ値とを、評価基準値として決定しておくことにより、標的部位における多型を決定できる。例えば、標的部位を変異型と仮定し、その変異型塩基を含む標的配列に相補的なプローブを使用した場合、形成したハイブリッドのＴｍ値が、完全に相補なハイブリッドのＴｍ値と同じであれば、標的部位は変異型と判断できる。また、形成したハイブリッドのＴｍ値が、一塩基異なるハイブリッドのＴｍ値と同じ（完全に相補なハイブリッドのＴｍ値より低い値）であれば、標的部位は正常型と判断できる。また、両方のＴｍ値が検出された場合には、例えば、変異型を示す核酸と、正常型を示す核酸とが共存すると決定できる。
　本発明においては、前述のように、前記プローブを含む反応液の温度を上昇させて、すなわち、ハイブリッドを加熱して、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。つまり、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッドを形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
　具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡと前記プローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
　本発明において、前記試料中の核酸は、一本鎖でもよいし二本鎖でもよい。前記核酸が二本鎖の場合は、例えば、前記（ｂ）工程のハイブリダイズに先立って、加熱により前記試料中の二本鎖核酸を解離させる工程を含むことが好ましい。二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離することによって、次の（ｂ）工程において、前記検出用プローブと前記標的配列とのハイブリダイズを効率よく行うことができる。
＜増幅試薬＞
　本発明の増幅試薬は、本発明の標的配列の増幅方法に使用する増幅試薬である。本発明の増幅試薬は、前記標的配列が、多型を示す標的部位を含む配列であり、前記標的部位の塩基（ｘ）が、第１塩基（ｘ１）または第２塩基（ｘ２）であり、前記プライマー（Ｘ１）およびプライマー（Ｘ２）を含むことを特徴とする。また、本発明の増幅試薬は、さらに、プライマー（Ｙ１）を含むことが好ましい。
　本発明の増幅試薬において、前記各プライマーは、前述と同様である。本発明の増幅試薬は、例えば、本発明の標的配列の増幅方法において記載した、増幅反応に使用する各種成分をさらに含んでもよい。本発明の増幅試薬は、一つの反応系内で使用することが好ましい。また、本発明の増幅試薬は、本発明の標的配列の増幅方法に使用する増幅キットでもよく、各成分は、それぞれ別個の容器に含まれてもよいし、適宜組み合せて、同一の容器に含まれてもよい。前記増幅キットは、例えば、使用説明書を含むことが好ましい。
＜多型検出試薬＞
　本発明の多型検出試薬は、本発明の多型の検出方法に使用する検出試薬であり、本発明の増幅試薬、および前記鋳型核酸における前記標的部位を含む配列にハイブリダイズ可能なプローブを含むことを特徴とする。本発明の多型検出試薬は、一つの反応系内で使用することが好ましい。
　なお、本発明の多型検出試薬は、例えば、本発明の多型の検出方法において記載した、増幅反応に使用する各種成分をさらに含んでもよい。また、本発明の多型検出試薬は、例えば、本発明の多型検出キットでもよく、例えば、使用説明書を含むことが好ましい。
　次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。
［実施例１］
　本例では、ｂｃｒ－ａｂｌ遺伝子について、Ｔｍ解析を行った。
（実施例１－１）
　本例では、付加配列（Ｅ１）を有する正常型プライマーを用いて、正常型ｂｃｒ－ａｂｌ遺伝子を含む未精製の血液試料について、Ｔｍ解析を行い、擬陽性の有無を確認した。
　本実施例においては、配列番号１に示すｂｃｒ－ａｂｌ遺伝子の部分配列において、塩基番号２７０の塩基（ｙ）を検出部位とした。前記ｙは、シトシン（ｃ）またはチミン（ｔ）であり、シトシンであれば正常型多型（Ｔ３１５）、チミンであれば変異型多型（Ｔ３１５Ｉ）と判断できる。
　ＰＣＲとＴｍ解析は、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ－ｄｅｎｓｙ（登録商標）、アークレイ社製）を用いて行った。まず、ＥＤＴＡ採血管を用いて採取した全血１０μＬと、下記希釈液１　７０μＬとを混合し、希釈血液１を調製し、さらに、前記希釈血液１　１０μＬと、下記希釈液２　７０μＬとを混合し、希釈血液２を調製した。前記検査装置用の反応セルに、前記希釈血液２　１７μＬを添加し、これを前記検査装置にセットし、９５℃で１０分間加熱した。加熱後、前記反応セルに、下記第１試薬２３μＬ、下記第２試薬１３μＬおよび下記第３試薬１０μＬを添加して、加熱処理後の前記希釈血液２と混合し、この混合液について、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。前記ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および６４℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。さらに、前記Ｔｍ解析は、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した後、昇温速度１℃／３秒で、４０℃から７０℃まで加熱し、昇温の間、経時的な蛍光強度の変化を測定した。検出波長は、５２０～５５５ｎｍとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　前記Ｆプライマーは、フォワードプライマーであり、Ｒｗｔプライマーは、リバースプライマーであり、３’末端の塩基が、センス鎖における正常型の標的部位に相補的とし、Ｒｍｔプライマーは、リバースプライマーであり、３’末端の塩基が、センス鎖における変異型の標的部位に相補的とした。
　以下に、Ｆプライマー、ＲｗｔプライマーおよびＲｍｔプライマーの配列を示す。下記Ｆプライマー（Ｙ１）において、下線部の配列は、アンチセンス鎖に非相補的な付加配列であり、その他の配列が、アンチセンス鎖に相補的な配列である。下記Ｒｗｔプライマーのうち、「付加配列（＋）Ｒｗｔプライマー」は、５’末端の下線部配列が、センス鎖に非相補的な付加配列（Ｅ１）であり、その他の配列が、センス鎖に相補的な配列（Ａ１’）であり、３’末端の大文字の塩基（Ｇ）が、標的部位の正常型塩基（Ｇ）であり、センス鎖における標的部位の正常型塩基（Ｃ）に対応する。下記Ｒｗｔプライマーのうち、「付加配列（－）Ｒｗｔプライマー」は、付加配列（Ｅ１）を有さず、センス鎖に相補的な配列（Ａ１’）からなり、３’末端の大文字の塩基（Ｇ）が、標的部位の正常型塩基（Ｇ）であり、センス鎖における標的部位の正常型塩基（Ｃ）に対応する。下記「付加配列（－）Ｒｍｔプライマー」は、付加配列（Ｅ２）を有さず、センス鎖に相補的な配列（Ａ２’）からなり、３’末端の大文字の塩基（Ａ）が、標的部位の変異型塩基（Ａ）であり、センス鎖における標的部位の変異型塩基（Ｔ）に対応する。
Ｆプライマー
　　5’-ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc-3’　BCR-ABL・F1+ggac（配列番号２）
Ｒｗｔプライマー
　付加配列（＋）Ｒｗｔプライマー
　　5’-ctacgttcccgtaggtcatgaactcaG-3’　T315I-WT-R1+ctacg（配列番号３）
　付加配列（－）Ｒｗｔプライマー
　　5’-ttcccgtaggtcatgaactcaG-3’　　　　T315I-WT-R1（配列番号４）
Ｒｍｔプライマー
　付加配列（－）Ｒｍｔプライマー
　　5’-aggttcccgtaggtcatgaactcaA-3’　　T315I-mt-R2（配列番号５）
　前記Ｆプライマー、付加配列（＋）Ｒｗｔプライマーおよび付加配列（－）Ｒｍｔプライマーのプライマーセットを、実施例１－１とした。前記Ｆプライマー、付加配列（－）Ｒｗｔプライマーおよび付加配列（－）Ｒｍｔプライマーのプライマーセットを、比較例１－１とした。
　前記付加配列（＋）Ｒｗｔプライマーと前記正常型標的配列とのＴｍｗｔ値は、６０℃、前記付加配列（－）Ｒｗｔプライマーと前記正常型標的配列とのＴｍｗｔ値は、５５．４℃、前記付加配列（－）Ｒｍｔプライマーと前記変異型標的配列とのＴｍｍｔ値は、５９℃である。
　以下に、前記プローブの配列を示す。下記プローブは、変異型ｂｃｒ－ａｂｌ遺伝子のセンス鎖において、前記変異型標的部位を含む配列にパーフェクトマッチするプローブであり、下記配列において、大文字の塩基が前記変異型標的部位に相補的な塩基である。前記プローブは、５’末端を、蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬで標識化し、３’末端を、リン酸化した。
　　5’-(BODIPY　FL)-ctcaAtgatgatatagaacg-P-3’　　（配列番号６）
　これらの結果を図５に示す。図５は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図５において、（Ａ）は、実施例１－１のプライマーセットの結果、（Ｂ）は、比較例１－１のプライマーセットの結果を示す。図５において、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。なお、前記プローブと前記正常型標的配列とのＴｍｗｔ値は、４７℃、前記プローブと前記変異型標的配列とのＴｍｍｔ値は、５５℃である。
　前述のように、本例で使用した全血由来のｂｃｒ－ａｂｌ遺伝子の多型は、正常型であるにもかかわらず、図５（Ｂ）の比較例１－１では、前記正常型標的配列とのＴｍｗｔ値付近だけでなく、前記変異型標的配列とのＴｍｍｔ値付近においても、ピークが確認された。この変異型のＴｍｍｔ値におけるピークの大きさは、正常型遺伝子に変異型遺伝子が０．３％の割合で含まれる場合にみられる変異型のピーク（図示せず）と同程度であることから、このピークによって、変異型多型は擬陽性を示すことがわかった。これに対して、図５（Ａ）の実施例１－１では、前記プローブと前記正常型標的配列とのＴｍｗｔ値付近のみでピークが確認され、前記プローブと前記変異型標的配列とのＴｍｍｔ値付近においては、ピークは確認されず、変異型多型は存在しないという正しい結果が、再現性良く（ｎ＝４）得られた。このように、本発明のプライマーを使用することによって、未精製の全血試料でも、プライマーの誤ったアニーリングと増幅を防止し、擬陽性を抑制できることがわかった。
（実施例１－２）
　本例では、付加配列（Ｅ１）を有する正常型プライマーおよび付加配列（Ｅ２）を有する変異型プライマーを用いて、ｂｃｒ－ａｂｌ遺伝子の部分配列を含むプラスミド試料について、Ｔｍ解析を行った。
　ｂｃｒ－ａｂｌ遺伝子の部分配列として、配列番号１における塩基番号５１～５５０のオリゴヌクレオチドが挿入された正常型プラスミド（ＷＴ）および変異型プラスミド（ｍｔ）を準備した。前記正常型プラスミド（ＷＴ）において、配列番号１における塩基番号２７０の塩基（ｙ）は、シトシン（ｃ）であり、変異型プラスミド（ｍｔ）において、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号２７０の塩基（ｙ）は、チミン（ｔ）である。これらのプラスミドを、以下に示す所定の割合で混合し、２種類のプラスミド試料を調製した。前記プラスミド試料におけるプラスミド含有量は、１μＬあたり、１×１０４コピー／μＬとした。
　プラスミド試料　　　　各プラスミドの混合割合　　
　　　　　　　　　　　　ＷＴ　　　　　　ｍｔ　　　
ｍｔ　１％　　　　　　　９９％　　　　　１％　　　
ｍｔ　０．３％　　　　　９９．７％　　　０．３％　
　前記実施例１－１における前記Ｆプライマー、前記付加配列（＋）Ｒｗｔプライマーおよび下記付加配列（＋）Ｒｍｔプライマーのプライマーセットを使用し、前記各プラスミド試料１μＬおよび実施例１－１の全血試料を使用した以外は、前記実施例１－１と同様にして、Ｔｍ解析を行った。前記「付加配列（＋）Ｒｍｔプライマー」は、５’末端の下線部配列が、センス鎖に非相補的な付加配列（Ｅ２）であり、その他の配列が、センス鎖に相補的な配列（Ａ２’）であり、３’末端の大文字の塩基（Ａ）が、標的部位の変異型塩基（Ａ）であり、センス鎖における標的部位の変異型塩基（Ｔ）に対応する。なお、前記付加配列（＋）Ｒｍｔプライマーの付加配列（Ｅ２）は、付加配列（＋）Ｒｗｔプライマーの付加配列（Ｅ１）とは、異なる配列とした。
　前記付加配列（＋）Ｒｗｔプライマーと前記正常型標的配列とのＴｍｗｔ値は、６０℃、前記付加配列（＋）Ｒｍｔプライマーと前記変異型標的配列とのＴｍｍｔ値は、６３．９℃である。そして、前記付加配列（＋）Ｒｗｔプライマーにおける付加配列以外の配列（Ａ１’）と前記正常型標的配列とのＴｍｗｔ値は、５５．４℃であり、前記付加配列（＋）Ｒｍｔプライマーにおける付加配列以外の配列（Ａ２’）と前記変異型標的配列とのＴｍｍｔ値は、５９℃である。
Ｒｍｔプライマー
　付加配列（＋）Ｒｍｔプライマー
　　5’-tgctcaggttcccgtaggtcatgaactcaA-3’　T315I-mt-R2+tgctc（配列番号７）
　これらの結果を図６に示す。図６は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図６において、（Ａ）は、プラスミド試料ｍｔ１％の結果、（Ｂ）は、プラスミド試料ｍｔ０．３％の結果、（Ｃ）は、全血試料の結果を示す。図６において、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。なお、前記プローブと前記正常型標的配列とのＴｍｗｔ値は、４７℃、前記プローブと前記変異型標的配列とのＴｍｍｔ値は、５５℃である。
　図６（Ｃ）に示すように、正常型の全血試料の場合、正常型のＴｍｗｔ値付近のみにピークが見られ、変異型のＴｍｍｔ値付近においては、ピークが確認されず、変異型多型についての擬陽性を防止できていることが、再現性よく確認された（ｎ＝８）。また、図６（Ａ）に示すように、変異型プラスミドが１％と少量であっても、前記変異型のＴｍｍｔ値付近のピークを検出でき、さらに、図６（Ｂ）に示すように、変異型プラスミドが０．３％と極めて少量の場合においても、前記変異型のＴｍｍｔ値付近におけるピークが検出できた。このことから、本発明によれば、変異型多型の擬陽性を防止し、さらに、十分に優れた感度を実現できることも確認できた。
　以上のように、本発明によれば、例えば、前述のようなプライマーの誤ったアニーリングを防止できる。このため、結果的に、多型検出における擬陽性を抑制でき、信頼性に優れた多型検出が可能となる。したがって、本発明は、例えば、遺伝子の多型検出により治療や診断を行う近年の臨床分野において、極めて有用といえる。

Claims (13)

  1. 下記プライマー（Ｘ１）および下記プライマー（Ｘ２）を含む反応系において、鋳型核酸における標的配列を増幅させる増幅工程を含み、
    前記標的配列が、多型を示す標的部位を含む配列であり、
    前記標的部位の塩基（ｘ）が、第１塩基（ｘ１）または第２塩基（ｘ２）であることを特徴とする、標的配列の増幅方法。
    プライマー（Ｘ１）
    配列（Ａ１’）および配列（Ｅ１）を有し、
    前記配列（Ａ１’）が、
    　前記鋳型核酸における部分配列（Ａ１）に相補的な配列であり、
    　その３’領域に、前記部分配列（Ａ１）の５’領域における前記標的部位の第１塩基（ｘ１）に相補的な塩基（ｘ１’）を有し、
    前記配列（Ｅ１）が、
    　前記鋳型核酸における前記部分配列（Ａ１）の３’末端に隣接する部分配列（Ｂ１）に非相補的な配列であり、
    　前記配列（Ａ１’）の５’末端に結合しているプライマー
    プライマー（Ｘ２）
    配列（Ａ２’）を有し、
    前記配列（Ａ２’）が、
    　前記鋳型核酸における部分配列（Ａ２）に相補的な配列であり、
    　その３’領域に、前記部分配列（Ａ２）の５’領域における前記標的部位の第２塩基（ｘ２）に相補的な塩基（ｘ２’）を有するプライマー
  2. 前記プライマー（Ｘ１）の前記配列（Ａ１’）において、３’末端の塩基または３’末端から２番目の塩基が、前記第１塩基（ｘ１）に相補的な塩基（ｘ１’）であり、
    前記プライマー（Ｘ２）の前記配列（Ａ２’）において、３’末端の塩基または３’末端から２番目の塩基が、前記第２塩基（ｘ２）に相補的な塩基（ｘ２’）である、請求項１記載の増幅方法。
  3. 前記プライマー（Ｘ２）における前記配列（Ａ２’）のＴｍ値が、前記プライマー（Ｘ１）における前記配列（Ａ１’）のＴｍ値よりも高い値である、請求項１記載の増幅方法。
  4. 前記第１塩基（ｘ１）および前記第２塩基（ｘ２）のうち、一方が、前記標的部位における変異型塩基（ｘｍｔ）であり、他方が、前記標的部位における正常型塩基（ｘｗｔ）である、請求項１記載の増幅方法。
  5. 前記プライマー（Ｘ２）は、さらに、配列（Ｅ２）を有し、
    前記配列（Ｅ２）が、
    　前記鋳型核酸における前記部分配列（Ａ２）の３’末端に隣接する部分配列（Ｂ２）に非相補的な配列であり、
    　前記配列（Ａ２’）の５’末端に結合しており、
    　前記プライマー（Ｘ１）における前記付加配列（Ｅ１）とは異なる配列である、請求項１記載の増幅方法。
  6. 請求項１記載の増幅方法により、鋳型核酸における標的部位を含む標的配列を増幅させる工程、および、
    前記標的配列にハイブリダイズ可能なプローブにより、前記標的配列における前記標的部位の多型を検出する工程を含むことを特徴とする多型の検出方法。
  7. 下記（ａ）～（ｃ）工程を含む、請求項６記載の多型の検出方法。
    （ａ）請求項１記載の増幅方法により、前記標的配列を増幅させる増幅工程
    （ｂ）前記プローブの存在下、前記（ａ）工程で得られた増幅産物を含む反応系の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する測定工程
    （ｃ）前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記鋳型核酸における前記標的部位の多型を検出する工程
  8. 鋳型核酸における標的配列が、多型を示す標的部位を含む配列であり、
    前記標的部位の塩基（ｘ）が、第１塩基（ｘ１）または第２塩基（ｘ２）であり、
    下記プライマー（Ｘ１）および下記プライマー（Ｘ２）を含むことを特徴とする、請求項１記載の増幅方法に使用するための増幅試薬。
    プライマー（Ｘ１）
    配列（Ａ１’）および配列（Ｅ１）を有し、
    前記配列（Ａ１’）が、
    　前記鋳型核酸における部分配列（Ａ１）に相補的な配列であり、
    　その３’領域に、前記部分配列（Ａ１）の５’領域における前記標的部位の第１塩基（ｘ１）に相補的な塩基（ｘ１’）を有し、
    前記配列（Ｅ１）が、
    　前記鋳型核酸における前記部分配列（Ａ１）の３’末端に隣接する部分配列（Ｂ１）に非相補的な配列であり、
    　前記配列（Ａ１’）の５’末端に結合しているプライマー
    プライマー（Ｘ２）
    配列（Ａ２’）を有し、
    前記配列（Ａ２’）が、
    　前記鋳型核酸における部分配列（Ａ２）に相補的な配列であり、
    　その３’領域に、前記部分配列（Ａ２）の５’領域における前記標的部位の第２塩基（ｘ２）に相補的な塩基（ｘ２’）を有するプライマー
  9. 前記プライマー（Ｘ１）の前記配列（Ａ１’）において、３’末端の塩基または３’末端から２番目の塩基が、前記第１塩基（ｘ１）に相補的な塩基（ｘ１’）であり、
    前記プライマー（Ｘ２）の前記配列（Ａ２’）において、３’末端の塩基または３’末端から２番目の塩基が、前記第２塩基（ｘ２）に相補的な塩基（ｘ２’）である、請求項８記載の増幅試薬。
  10. 前記プライマー（Ｘ２）における前記配列（Ａ２’）のＴｍ値が、前記プライマー（Ｘ１）における前記配列（Ａ１’）のＴｍ値よりも高い値である、請求項８記載の増幅試薬。
  11. 前記第１塩基（ｘ１）および前記第２塩基（ｘ２）のうち、一方が、前記標的部位における変異型塩基（ｘｍｔ）であり、他方が、前記標的部位における正常型塩基（ｘｗｔ）である、請求項８記載の増幅試薬。
  12. 前記プライマー（Ｘ２）は、さらに、配列（Ｅ２）を有し、
    前記配列（Ｅ２）が、
    　前記鋳型核酸における前記部分配列（Ａ２）の３’末端に隣接する部分配列（Ｂ２）に非相補的な配列であり、
    　前記配列（Ａ２’）の５’末端に結合しており、
    　前記プライマー（Ｘ１）における前記付加配列（Ｅ１）とは異なる配列である、請求項８記載の増幅試薬。
  13. 請求項８記載の増幅試薬、および、鋳型核酸における標的部位を含む標的配列にハイブリダイズ可能なプローブを含むことを特徴とする、請求項６記載の多型の検出方法に使用する検出試薬。
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