WO2011089288A1 - COMPOSICIÓN QUE COMPRENDE GDNF Y TGF-β1 Y SU USO PARA EL TRATAMIENTO DE UNA ENFERMEDAD NEUROLÓGICA - Google Patents

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treatment
neurological disease
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Ramiro José GONZÁLEZ APARICIO
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Definitions

  • Composition comprising GDNF and TGF- ⁇ ⁇ and its use for the treatment of a neurological disease
  • the present invention falls within the field of neurobiology and biomedicine and refers to a pharmaceutical composition comprising the glia-derived neurotrophic factor (GDNF) and the transforming factor beta 1 (TGF- ⁇ ) in a range of concentrations. of GDNF.TGF ⁇ from 2: 1 to 4: 1.
  • the present invention also relates to the use of said pharmaceutical composition for the preparation of a medicament for the treatment of a neurological disease.
  • the neurological disease is a neurodegenerative disease. This disease can occur with dyskinesias or other abnormal or involuntary movements.
  • the disease is Parkinson's.
  • Parkinson's disease is a neurodegenerative disease characterized by the progressive death of dopaminergic neurons of the black substance, which causes a decrease in the concentration of striatal dopamine, determining the appearance of muscle stiffness, slowness of movement and tremor, symptoms that characterize to the EP.
  • the absorbed levodopa is converted to dopamine by the enzyme dopadecarboxylase (DDC).
  • DDC dopadecarboxylase
  • Levodopa crosses the BHE by means of transporters of the same class that allow its entry from the intestine. Once in the brain circulation, it enters the neuron directly and is converted by the DDC into dopamine.
  • the effect of levodopa is exerted primarily through the dopamine produced in the neuron.
  • Dopamine acts by directly stimulating type 1 and type 2 dopamine receptors.
  • Dopamine released into the synaptic space is recaptured by the dopamine neuron.
  • GDNF glia-derived neurotrophic factor
  • GDNF induces arborization or "sprouting" of dopamine neurons, so that inhibition of GDNF with "antisenses” reduces “sprouting” after striatal damage (Batchelor, PE, et al., 2000. Eur. J. Neurosci. 12, 3462-3468), acts by reducing the degeneration of dopaminergic fibers, a process regulated by the ubiquitin-proteasome system because inhibition of this system increases neuronal degeneration (McNaught, KS, et al., 2002. J. Neurochem. 81 , 301-306), protects the proteasome by suppressing reticulum stress and activating caspases-3 (Li, X., et al., 2007. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 62, 943 -950.) And, finally, it also increases the activity and expression of the enzyme tyrosine hydroxylase or TH, which synthesizes dopamine.
  • GDNF neurotrophic factor
  • GDNF has failed in clinical trials, and its intracerebroventricular administration (ICV) by bolus (25 to 4000 [ig. Per dose) or by chronic infusion with osmotic pumps (3 to 50 [ig. Per day) has not shown great therapeutic efficacy. .
  • adverse effects have been frequent, such as nausea (70% of patients), paraesthesia (50% of patients), and weight loss.
  • the use of cell transplants with cells that secrete GDNF has also been accompanied by serious difficulties, such as the appearance of dyskinesias, or the difficult diffusion of GDNF by the cerebral parenchyma.
  • TGF- ⁇ transforming growth factor ⁇
  • TGF- ⁇ in addition to acting as a protective agent for dopamine neurons in vitro (Unsicker, K., et al., 1996. Ciba Found Symp. 196, 70-80.) would enhance the actions of GDNF in vitro and in vivo (Krieglstein, K., et al., 1998. J. Neurosci. 8, 9822-9834 .; Schober, A., et al., 2007. Neurobiol. Dis.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the glia-derived neurotrophic factor (GDNF) and the transforming factor beta 1 (TGF- ⁇ ) in a range of GDNF GF ⁇ -i between 2: 1 to 4: 1 .
  • the present invention also relates to the use of said pharmaceutical composition for the treatment of a neurological disease.
  • the neurological disease is a neurodegenerative disease. This disease can occur with dyskinesias or other abnormal or involuntary movements, such as, but not limited to, the Parkinson's disease, Gilies de la Tourette's disorder, Lesch-Nyhan syndrome or a neurological disorder caused by drug withdrawal or treatment with at least one neuroleptic.
  • the disease is Parkinson's.
  • said composition is administered intracerebroputaminally by presenting itself adapted to this route of administration for application on the damaged caudate and / or the damaged putamen.
  • the GDNF: TGF- ⁇ range is most suitable to favor the pharmacological action of both compounds in their administration in vivo.
  • the present invention provides a method for the treatment of neurological diseases or disorders that occur with neurodegeneration and, more specifically with dyskinesias or other abnormal and involuntary movements through the use of a pharmaceutical composition that it comprises the combined factors GDNF and TGF- ⁇ in a range of GDNF: TGF- i different from that disclosed in the prior art and therefore, which one skilled in the art would not consider obvious.
  • the present invention solves the technical problem posed by the effective treatment of some pathologies with neuronal character, mainly the treatment of Parkinson's disease, in combination with the administration of said pharmaceutical composition precisely in the caudate putamen damaged intracerebroputaminal route , preferably by infusion pumps, connected to intracerebral catheters.
  • one aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the following compounds, the glia-derived neurotrophic factor (GDNF) and the betal transforming factor (TGF- ⁇ ), in a range of GDNF concentrations: TGF- i between 2: 1 to 4: 1. That is, for a same concentration of TGF- ⁇ , a range of concentrations between 2 and 4 times higher than the GDNF factor can be used.
  • GDNF glia-derived neurotrophic factor
  • TGF- ⁇ betal transforming factor
  • neurotrophic factors as already mentioned, is an alternative to levodopa. These factors are molecules required by neurons for their development, migration, and trophic maintenance. They express themselves in different regions of the nervous system during development, and are specific to different neuronal populations, which makes them good candidates for neurodegenerative diseases.
  • GDNF or glia-derived neurotrophic factor was isolated from rat glia cell lines and is very specific for dopaminergic neurons. After intracellular processing, GDNF is secreted in glycosylated form as a protein of 134 amino acids, in the form of a dimer of about 32 Kda.
  • TGF- ⁇ or transforming factor beta-1 belongs to the same family as GDNF (TGF- ⁇ factors), and also exerts effects on dopaminergic neurons.
  • TGF- ⁇ was identified in platelets, and has a molecular mass of 25 KDa. It is synthesized as a precursor of 390 amino acids that is processed in a mature peptide of 12 amino acids.
  • TGF- ⁇ also protects dopamine neurons in vitro, and potentiates the actions of GDNF in vitro and in vivo. It is known that the combined action of both factors is necessary for a greater trophic action of GDNF, which makes the combination of both very attractive from the point of view therapeutic.
  • TGF- ⁇ and GDNF cooperate in intracellular signaling, increasing the expression of the GFRal receptor in the cell membrane, made of great importance to increase the effect of GDNF.
  • a preferred embodiment of the present invention relates to the pharmaceutical composition that additionally comprises at least one pharmacologically acceptable excipient in addition to GDNF and TGF- ⁇ , in a range of concentrations of between 2: 1 to 4: 1.
  • excipient refers to a substance that aids the absorption of any of the sequences of the present invention, stabilizes said sequence or aids in the preparation of said pharmaceutical composition in the sense of giving it consistency or providing flavors that make it more nice.
  • the excipients could have the function of keeping the ingredients together such as starches, sugars or cellulose, sweetening function, dye function, drug protection function such as to isolate it from air and / or moisture, function filling a tablet, capsule or any other form of presentation such as dibasic calcium phosphate, a disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • compositions which additionally comprises at least one pharmacologically acceptable vehicle.
  • vehicle must be pharmaceutically acceptable.
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to those substances, or combination of substances, known in the pharmaceutical sector, used in the preparation of pharmaceutical forms of administration and includes, but are not limited to, solids, liquids, solvents or surfactants.
  • the carrier can be an inert substance or action analogous to any of the compounds of the present invention.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of the compounds of the invention GDNF and TGF- ⁇ - ⁇ as well as other compounds, allow a better dosage and administration or give consistency and form to the pharmaceutical composition.
  • the presentation form is liquid, the vehicle is the diluent.
  • pharmaceutically acceptable refers to the compound referred to being allowed and evaluated so as not to cause damage to the organisms to which it is administered.
  • pharmaceutically acceptable refers to the compound referred to allowing the activity of the concentration range of GDNF: TGF- ⁇ between 2: 1 and 4: 1.
  • composition of the present invention or “composition of the invention” may be used.
  • both neurotrophic factors cooperate functionally.
  • the action of GDNF is mediated by a trophic effect on nigrostriatal dopamine neurons, while TGF- ⁇ acts by increasing GDNF activity and decreasing dopaminergic hypersensitivity, which is a fact that appears in advanced PD, and that It has been associated with the appearance of dyskinesias after levodopa.
  • composition of the invention originates two novel and unexpected facts:
  • neuronal diseases or disorders preferably neurodegenerative
  • dyskinesias or other abnormal and involuntary movements as can be seen in the examples, where the treatment of these combined factors in parkinsonian rats produced a reduction of motor symptoms in rats.
  • the development of disabling dyskinesias and secondary to dopaminergic hypersensitivity was not observed as occurs with the use of levodopa.
  • neurode disease refers to those diseases in which an injury or dysfunction of the nervous system occurs, either central or peripheral. They are disorders of the brain, spinal cord and nerves throughout the body. Together, these organs control all functions of the body and when something goes wrong somewhere in the nervous system, you may have difficulty moving, talking, swallowing, breathing or learning. Problems related to memory, senses or mood may also occur.
  • a preferred embodiment of the present invention relates to the use of the pharmaceutical composition of the invention for the preparation of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of a neurological disease, wherein said neurological disease is a neurodegenerative disease.
  • neurodegenerative disease refers to those diseases caused by an increase in cell death processes, reducing the number of neurons, generating changes in behavior causing the worsening of many of the bodily activities, including balance, movement, speech, breathing and cardiac function. Many of these diseases are genetic, which means that they are inherited or that there is a genetic mutation. Some clinical conditions, such as alcoholism, a tumor or a stroke, can cause other types. There are still other types that can be caused by toxins, chemicals or viruses.
  • the neurological disease occurs with dyskinesias or other abnormal or involuntary movements.
  • the neurological disease is Parkinson's, Gilies de la Tourette's disorder, Lesch-Nyhan syndrome or a neurological disorder caused by drug withdrawal or by treatment with at least one neuroleptic.
  • the neurological disease is Parkinson's.
  • GDNF is a macromolecule that does not cross the blood brain barrier, so in order to facilitate these macromolecules the transport through the blood brain barrier, a more preferred embodiment of the use of the pharmaceutical composition of The present invention relates to the use where the medicament of the present invention is presented in a form adapted to intracerebroputaminal administration.
  • adapted form refers to how to adapt the medicament of the present invention so that it can be administered intracerebroputaminally.
  • the intracerebroputaminal administration of the composition of the invention can be carried out through several methods such as, but not limited to slow-release microcapsules implanted in the caudate / putamen, infused viruses that release both factors or continuous intraputaminal infusions with Infusion pumps connected to intracerebral catheters.
  • Continuous infusion allows the composition of the invention to be transported in a controlled manner and directly to the damaged caudate and / or damaged putamen, thus achieving a greater trophic effect in this area, together with a reduction in the development of dopaminergic hypersensitivity in the caudate / putamen.
  • the first effect would be mediated by GDNF and the second by TGF- ⁇ - ⁇ .
  • composition pharmaceutical of the invention wherein the medicament has an amount of GDNF capable of reaching a daily concentration in brain tissue of between 5 and 50 Mg / day.
  • GDNF concentrations between 5 and 50 g / day is most suitable in humans (Nutt JG. Et al. 2003 Neurology. Jan 14; 60 (1): 69-73).
  • the ranges of 8 to 50 g / day, 15 to 50 Mg / day, 17 to 45 pg / day, 21 to 40 pg / day, 25 to 37 pg / day, 27 to 31 pg / day or GDNF range from 8 to 12 Mg / day.
  • the dose of TGF- ⁇ - ⁇ must be 2 to 4 times lower than that of GDNF so that both concentrations are maintained in the range of 2: 1 at 4: 1 of GDNF GF- ⁇
  • the drug has an amount of TGF ⁇ capable of reaching a daily concentration in brain tissue between 1 to 25 pg / day, in addition the ranges ranging from 1 to 20 pg / can also be used day, from 1 to 15 pg / day, 1 to 0 pg / day or the range of TGF- ⁇ - ⁇ ranging from 1 to 3 Mg / day.
  • Another aspect of the invention relates to the kit comprising the composition of the invention.
  • the kit further comprises infusion pumps and intracerebral catheters.
  • FIG. 1 Rotations induced by amphetamine / apomorphine.
  • Figures 1A and B show the number of rotations per hour that the animal performs when amphetamine is injected and do not receive any treatment, and later, at the second month, when they are implanted with the mini-pumps with control vehicle, GDNF alone, GDNF + TGF- ⁇ combined, or with TGF- ⁇ alone.
  • Figure 1A includes the data with the 4: 1 ratio of GDNF: TGF- ⁇ , with doses of 8 ng / day of GDNF (x 8 days) and 2 ng / day of TGF- ⁇ (x 8 days).
  • Figure 1 B includes the data with the 2: 1 ratio of GDNF: TGF ⁇ , with doses of 6 ng / day of GDNF (x 8 days) and 3 ng / day of TGF- ⁇ (x 8 days) (Average ⁇ SEM, * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 vs. 2 months after inducing parkinsonism in the rat, Newman-Keuls test).
  • Figures 1C and D show the number of rotations per hour that the animal performs when apomorphine is injected and do not receive any treatment, and later, at the second month, when the mini pumps are implanted with a control vehicle, GDNF only, GDNF + TGF- ⁇ combined, or with TGF- ⁇ alone.
  • Figure 1C includes the data with the 4: 1 ratio of GDNF: TGF- ⁇ ! , with doses of 8 ng / day of GDNF (x 8 days) and 2 ng / day of TGF- ⁇ (x 8 days).
  • Figure 1D includes the data with the 2: 1 ratio of GDNF: TGF- ⁇ - ⁇ , with doses of 6 ng / day of GDNF (x 8 days) and 3 ng / day of TGF- ⁇ (x 8 days ) (Mean ⁇ SEM, * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 vs. 2 months after inducing parkinsonism in the rat, Newman-Keuls test).
  • FIG. 2 Immunostaining of the striatal signal of tyrosine hydroxylase (TH).
  • Figure 2 shows immunostaining of the striatal tyrosine-hydroxylase (TH) signal after one month after cessation of the constant infusion (by implanted osmotic pump) of saline vehicle, GDNF + TGF- ⁇ or GDNF only, for 8 days in rats with injured striatum.
  • TH striatal tyrosine-hydroxylase
  • Figure 2A shows the injured striatum (to the right of the image) after saline infusion.
  • Figure 2B shows the injured striatum (to the right of the image) after infusion of GDNF + TGF- ⁇ at a ratio of 4: 1 (dose of 8 ng / day of GDNF and 2 ng / day of TGF- ⁇ ).
  • Figure 2C is an enlargement of Figure 2B, the most stained area is the infusion zone.
  • Figure 2 shows the striated lesion (to the right of the image) after infusion of GDNF + TGF- ⁇ at a ratio of 2: 1 (dose of 6 ng / day of GDNF and 3 ng / day of TGF- ⁇ ).
  • Figure 2E shows the injured striatum (to the right of the image), after infusion of GDNF only in that area (8 ng / day for 8 days).
  • FIG. 3. Immunoblotting of the GRFalfal receptor (GDNF receptor).
  • Figure 3 shows the results of an immunoblotting of the GRFalfal receptor (GDNF receptor) in the contralateral and injured striates of rats unilaterally injured with 6-OHDA, after one month after the cessation of the constant infusion (by implanted osmotic pump ) of saline vehicle, GDNF + TGF- ⁇ (4: 1 ratio) or GDNF only, for 8 days.
  • GDNF receptor GRFalfal receptor
  • the striated lesion with infusion of GDNF is marked with an asterisk and with a pad the injured striatum with combined infusion of GDNF + TGF ⁇ .
  • the invention is based on the treatment with intraputaminal infusions of pharmacologically effective doses of GDNF and TGF- ⁇ combined to parkinsonian rats.
  • the infusions were made with infusion pumps connected to intracerebral catheters, in order to maintain a constant flow injection of these trophic factors.
  • the recommended dose of GDNF is 5-50 pg / day and that of TGF-fa is 1-10 pg / day, always maintaining a higher concentration of GDNF in the range of ratios from 2: 1 to 4: 1 .
  • Experimental data with animal models of parkinsonism indicated that this range of ratios is appropriate, and concentration ratios above or below it are not equally effective. This combination ratio is also novel, since to date only 5: 1 combinations in cell culture had been tested.
  • TGF- ⁇ because it blocks desensitization or downregulation of GFRal GDNF receptors and induces the brake of degeneration, increased regeneration and increased dopamine levels (increased expression of the enzyme tyrosine-dopamine hydroxylase).
  • EXAMPLE 1 Parkinsonism induced by 6-hydroxypamine.
  • 6- hydroxidepamine 6- hydroxidepamine
  • 6-OHDA 6- hydroxidepamine
  • 6-OHDA 6-OHDA
  • This model is very interesting for several reasons. First of all it represents a model of Parkinsonism in an initial stage of the disease since the neuronal loss obtained ranges from 60-70%.
  • it allows, according to the dose of 6-OHDA injected in the striatum, to obtain a nigrostriated partial lesion and therefore may be the ideal model to be used for the study of the neuroprotective effect of certain substances.
  • amphetamine by increasing the release of dopamine in the presynaptic terminals, increased the concentration of dopamine only in the striatum contralateral to the lesion, producing a functional imbalance in favor of the contralateral striatum.
  • Amphetamine was injected at 5 specific times: one week after the induction of parkinsonism, 1 month after the induction of parkinsonism, 2 months after the induction of parkinsonism, 9 days after the pump was implanted and 1 month after pump implantation.
  • Apomorphine was injected at 5 specific times: one week after induction of parkinsonism, 1 month after induction of parkinsonism, 2 months after induction of parkinsonism, 9 days after implantation of the pump and 1 month after The implantation of the pump.
  • the combined treatment resulted in a better recovery of motor symptoms in PD and the non-development of disabling dyskinesias and secondary to dopaminergic hypersensitivity, so that it can be applied to any neuronal, neurodegenerative disease or disorder that occurs with dyskinesias. or other abnormal or involuntary movements.

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Abstract

Composición farmacéutica que comprende el factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF) y el factor transformante beta 1 (TGF-β1) en un rango de concentraciones de GDNF:TGF-β1 de entre 2:1 a 4:1. Asimismo la presente invención se refiere al uso de dicha composición farmacéutica para la elaboración de un medicamento para el tratamiento una enfermedad neurológica. Preferiblemente la enfermedad neurológica es una enfermedad neurodegenerativa. Dicha enfermedad puede cursar con discinesias u otros movimientos anormales o involuntarios. Preferiblemente la enfermedad es Parkinson.

Description

Composición que comprende GDNF y TGF-β^ y su uso para el tratamiento de una enfermedad neurolóqica
La presente invención se enmarca dentro del campo de la neurobiología y de la biomedicina y se refiere a una composición farmacéutica que comprende el factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF) y el factor transformante beta 1 (TGF-βΙ) en un rango de concentraciones de GDNF.TGF^ de entre 2:1 a 4:1. Asimismo la presente invención se refiere al uso de dicha composición farmacéutica para la elaboración de un medicamento para el tratamiento una enfermedad neurológica. Preferiblemente la enfermedad neurológica es una enfermedad neurodegenerativa. Dicha enfermedad puede cursar con discinesias u otros movimientos anormales o involuntarios. Preferiblemente la enfermedad es Parkinson.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por la muerte progresiva de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra, lo que produce disminución de la concentración de dopamina estriatal, condicionando aparición de rigidez muscular, lentitud de movimientos y temblor, síntomas que caracterizan a la EP.
Hasta ahora, debido a que la dopamina no puede cruzar la barrera hematoencefálica (BHE) el tratamiento más efectivo era la administración oral de levodopa, precursor de dopamina, que se absorbe por el intestino delgado y cruza la barrera hemato-encefálica penetrando en el cerebro.
Desde su introducción en la medicina a inicios de la década de 1960, la L-3,4- dihidroxifenilalanina o levodopa se ha convertido en uno de los fármacos más sorprendentes en neurología. Y, aunque después de 50 años, continúa siendo el principal fármaco para tratar la EP, en los últimos años, diversas investigaciones han aportado nuevos conocimientos sobre los mecanismos de acción y fisiopatología de las complicaciones inducidas por ella.
La levodopa absorbida es convertida a dopamina por la enzima dopadecarboxilasa (DDC). La conversión de levodopa en dopamina es altamente eficiente y es la dopamina que circula en el plasma, la que produce múltiples y frecuentes efectos adversos.
Las altas dosis empleadas y el alto porcentaje de conversión de la levodopa en dopamina hacían que sólo el 5% de la levodopa administrada alcanzara el sistema nervioso central. Por ello, se ralentizó el uso clínico masivo de levodopa hasta la introducción de inhibidores de DDC que incrementaban en un 25% la cantidad de levodopa que iba al Sistema Nervioso Central. Esto marcó el inicio de una combinación terapéutica que se mantiene en la actualidad.
La levodopa cruza la BHE por medio de transportadores de la misma clase que permiten su ingreso desde el intestino. Una vez en la circulación encefálica, entra a la neurona directamente y es convertida mediante la DDC en dopamina.
El efecto de la levodopa es ejercido fundamentalmente a través de la dopamina producida en la neurona. La dopamina actúa estimulando directamente los receptores dopaminérgicos tipo 1 y tipo 2. La dopamina liberada al espacio sináptico es recaptada por la neurona dopaminérgica.
Probablemente, la levodopa además de convertirse en dopamina, sufre transformación a noradrenalina, así como a productos trazas de aminas, los cuales actúan en receptores no dopaminérgicos. Del mismo modo la dopamina sería capaz de estimular receptores GABA inhibitorios en la sustancia negra.
Por otro lado, recientes estudios demuestran que de los pacientes que llevan 5 años de tratamiento con levodopa, cerca de 40% desarrollan complicaciones motoras y aparición de movimientos involuntarios o discinesias. Además, estudios in vitro muestran muerte neuronal acelerada por la presencia de levodopa, por lo que se está planteando la posibilidad de que la levodopa sea tóxica.
Una alternativa a la levodopa la encontramos en el empleo de factores neurotróficos, moléculas requeridas por las neuronas para su desarrollo, migración y mantenimiento trófico que se expresan en distintas regiones del sistema nervioso. Dentro de las potenciales familias de factores neurotróficos con capacidad terapéutica, numerosos estudios demuestran que el factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF) es una potente molécula que protege a las neuronas dopaminérgicas de la neurodegeneración en modelos animales de EP, cuando se inyecta por ejemplo por vía intraventricular, o por medio de células trasplantadas o virus (Lin, L.F. et al., 1993. Science 260, 1130-1132; Tseng, J.L. et al., 1997. J. Neurosci. 17, 325-333; Gash, D.M., et al., 1998. Ann. Neurol. (suppl.) 44, G121-S125; Wider, C, et al., 2006. Rev. Med. Suisse 2, 1 158-1 162).
El GDNF induce arborización o "sprouting" de neuronas de dopamina, de tal modo que la inhibición de GDNF con "antisenses" reduce el "sprouting" tras daño estriatal (Batchelor, P.E., et al., 2000. Eur. J. Neurosci. 12, 3462-3468), actúa reduciendo la degeneración de las fibras dopaminérgicas, proceso regulado por el sistema ubiquitina-proteosoma pues la inhibición de este sistema aumenta la degeneración neuronal (McNaught, K.S., et al., 2002. J. Neurochem. 81 , 301-306), protege al proteosoma suprimiendo el estrés del retículo y la activación de caspasas-3 (Li, X., et al., 2007. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 62, 943-950.) y, finalmente, también incrementa la actividad y expresión de la enzima tirosina-hidroxilasa o TH, que sintetiza dopamina.
Aunque el uso de GDNF como terapia neurotrófica ya se ha realizado, ha encontrado dificultades, pues por una parte el GDNF debido a su tamaño tiene grandes dificultades en atravesar la barrera hematoencefálica, y por otra, su empleo en animales es difícil de extrapolar a humanos por la diferencia en el tamaño cerebral.
El GDNF ha fracasado en ensayos clínicos, y su administración intracerebroventricular (ICV) mediante bolos (25 a 4000 [ig. por dosis) o por infusión crónica con bombas osmóticas (3 a 50 [ig. por día) no ha mostrado gran eficacia terapéutica. Además los efectos adversos han sido frecuentes, como náuseas (70% de los pacientes), parestesias (50% de los pacientes), y pérdida de peso. El empleo de trasplantes celulares con células que segregan GDNF también se ha acompañado de dificultades serias, como la aparición de discinesias, o la difícil difusión de GDNF por el parénquima cerebral. Recientemente se ha visto que el GDNF necesita del cofactor TGF-βι (factor de crecimiento transformante βι) para tener actividad trófica. El TGF-βι además de actuar como agente protector de las neuronas de dopamina in vitro (Unsicker, K., et al., 1996. Ciba Found Symp. 196, 70-80.) potenciaría las acciones del GDNF in vitro e in vivo (Krieglstein, K., et al., 1998. J. Neurosci. 8, 9822-9834.; Schober, A., et al., 2007. Neurobiol. Dis. 25, 378-391.), cooperando ambos factores funcionalmente, de forma que el GDNF favorece la regeneración trófica del tejido dañado y el cese de la degeneración, y el TGF-βι disminuye el desarrollo de la hipersensibilidad dopaminérgica que aparece en el caudado/putamen de los pacientes que han desarrollado la enfermedad.
Hasta la fecha no ha sido ensayada una composición de la combinación de ambos factores tróficos en modelos animales, y por tanto, no se ha podido establecer el rango GDNF:TGF^i más adecuado. Para estudiar el efecto sinérgico de ambos factores hasta ahora sólo se ha realizado in vitro, divulgándose un rango de GDNF GF^ 5:1 , de forma que se utilizaba una concentración de GDNF de 10 ng/ml y una concentración de TGF-βι de 2 ng/ml (H. Peterziel, et al., 2002, The Journal of Cell Biology, 159 (1), 157-167). Por otra parte, el ensayo de este tipo de composición presenta una gran dificultad a la hora de atravesar la barrera hematoencefálica.
Por tanto, persiste el problema del tratamiento de algunas patologías con carácter neuronal, principalmente el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF) y el factor transformante beta 1 (TGF-βΙ) en un rango de GDNF GF^-i de entre 2:1 a 4:1. Asimismo la presente invención se refiere al uso de dicha composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad neurológica. Preferiblemente la enfermedad neurológica es una enfermedad neurodegenerativa. Dicha enfermedad puede cursar con discinesias u otros movimientos anormales o involuntarios, como por ejemplo, pero sin limitarse, la enfermedad de Parkinson, trastorno de Gilíes de la Tourette, síndrome de Lesch-Nyhan o un desorden neurológico causado por abstinencia a drogas o por tratamiento con al menos un neuroléptico. Preferiblemente la enfermedad es Parkinson. Además, dicha composición se administra vía intracerebroputaminal presentándose de forma adaptada a esta vía de administración para su aplicación sobre el caudado dañado y/o el putamen dañado.
Es de destacar que en la presente invención se determina el rango GDNF:TGF- βι más adecuado para favorecer la acción farmacológica de ambos compuestos en su administración in vivo. Con el fin de aumentar la capacidad terapéutica del factor GDNF, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de enfermedades o desórdenes neurológicos que cursen con neurodegeneraclón y, más específicamente con discinesias u otros movimientos anormales e involuntarios mediante el uso de una composición farmacéutica que comprende los factores combinados GDNF y TGF-βι en un rango de GDNF:TGF- i diferente del que se divulga en el estado de la técnica y por tanto, que un experto en la materia no consideraría obvio.
Por tanto, la presente invención resuelve el problema técnico que plantea el tratamiento eficaz de algunas patologías con carácter neuronal, principalmente el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, en combinación con la administración de dicha composición farmacéutica de forma precisa en el caudado putamen dañado vía intracerebroputaminal, preferiblemente mediante bombas de infusión, conectadas a catéteres intracerebrales.
Así pues, un aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende los siguientes compuestos, el factor neurotróflco derivado de la glía (GDNF) y el factor transformante betal (TGF-βι), en un rango de concentraciones de GDNF:TGF- i de entre 2:1 a 4:1. Es decir, para una misma concentración de TGF-βι se puede emplear un rango de concentraciones de entre 2 y 4 veces superior del factor GDNF.
El empleo de factores neurotróficos, como ya se ha comentado, es una alternativa a la levodopa. Estos factores son moléculas requeridas por las neuronas para su desarrollo, migración, y mantenimiento trófico. Se expresan en diferentes regiones del sistema nervioso durante el desarrollo, y son específicos para distintas poblaciones neuronales, lo que les hace buenos candidatos para enfermedades neurodegenerativas.
El GDNF o factor neurotrófico derivado de la glía se aisló de líneas celulares de glía de rata y es muy específico de neuronas dopaminérgicas. Tras el procesamiento intracelular, el GDNF se segrega en forma glicosilada como proteína de 134 aminoácidos, en forma de dímero de unos 32 Kda.
Se acepta que es el factor dopaminotrófico más potente, pues como ya se ha comentado protege a las neuronas dopaminérgicas de la neurodegeneracion en modelos animales de EP, cuando se inyecta, por ejemplo, por vía intraventricular, o por medio de células trasplantadas o virus. Entre las propiedades que hacen al GDNF uno de los más potentes factores neurotróficos, destacan:
• inducción de arborización o "sprouting" de las fibras nerviosas de las neuronas de dopamina.
• reducir la degeneración de las fibras dopaminérgicas, de forma que se inhibe el proceso regulado por el sistema ubiquitina-proteosoma aumentando así la degeneración neuronal.
• proteger al proteosoma suprimiendo el estrés del retículo y la activación de caspasas-3.
• incrementar la actividad y expresión de la enzima tirosina-hidroxilasa o TH, enzima encargada de la síntesis de dopamina.
Por otro lado, el TGF-βι o factor transformante beta-1 pertenece a la misma familia que el GDNF (factores TGF-β), y también ejerce efectos sobre las neuronas dopaminérgicas. TGF-βι se identificó en plaquetas, y tiene una masa molecular de 25 KDa. Se sintetiza como un precursor de 390 aminoácidos que se procesa en un péptido maduro de 1 12 aminoácidos.
El TGF-βι, también protege las neuronas de dopamina in vitro, y potencia las accciones del GDNF in vitro e in vivo. Se sabe que la acción combinada de ambos factores es necesaria para una acción trófica mayor de GDNF, lo que hace la combinación de ambos muy atractiva desde el punto de vista terapéutico.
TGF-βι y GDNF cooperan en la señalización intracelular, aumentando la expresión del receptor GFRal en la membrana celular, hecho de gran importancia para aumentar el efecto de GDNF.
Además, datos experimentales con modelos animales de parkinsonismo indican que el rango 2:1 a 4:1 de GDNF GF-βι es apropiado, y ratios de concentraciones por encima o debajo del mismo no son igualmente efectivas. En ratas parkinsonianas se han empleado dosis de GDNF de 6, 8 y 10 ng/día durante 8 días, combinadas con TGF-βι a dosis de 1 , 2 y 3 ng/día durante 8 días en bombas osmóticas, en distintas combinaciones o ratios. Cuando se combinaron entre sí todas las posibles dosis se obtuvo que las dosis más efectivas eran las que pertenecían al rango de 2:1 a 4:1 de GDNF:TGF- i (datos mostrados en los ejemplos).
Una realización preferida de la presente invención se refiere a la composición farmacéutica que adicionalmente comprende, al menos, un excipiente farmacológicamente aceptable además de GDNF y TGF-βι, en un rango de concentraciones de
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de entre 2:1 a 4:1.
El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de cualquiera de las secuencias de la presente invención, estabiliza dicha secuencia o ayuda a la preparación de dicha composición farmacéutica en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.
Otra realización preferida se refiere a la composición farmacéutica, según se describe en párrafos anteriores, que adicionalmente comprende, al menos, un vehículo farmacológicamente aceptable. Además, el vehículo debe ser farmacéuticamente aceptable. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos. El vehículo puede ser una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los compuestos de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de los compuestos de la invención GDNF y TGF-β-ι así como también de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo es el diluyente.
El término "farmacológicamente aceptable" se refiere a que el compuesto al que hace referencia esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.
El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a que el compuesto al que hace referencia permita la actividad del rango de concentraciones de GDNF: TGF-βι de entre 2:1 y 4:1.
De aquí en adelante, para hacer referencia a cualquier composición descrita en párrafos anteriores se puede emplear el término "composición de la presente invención" o "composición de la invención".
En la presente invención se demuestra que ambos factores neurotróficos cooperan funcionalmente. Así, la acción de GDNF está mediada por un efecto trófico sobre las neuronas de dopamina nigroestriatales, mientras que el TGF- βι actúa aumentando la actividad de GDNF y disminuyendo la hipersensibilidad dopaminérgica, que es un hecho que aparece en la EP avanzada, y que se ha asociado a la aparición de discinesias tras levodopa.
A lo largo de la presente invención, se demuestra que la composición de la invención origina dos hechos novedosos e inesperados:
• el efecto trófico de GDNF es mayor, debido a un bloqueo de la desensibilización de su receptor GFRal en el que participa el TGF-βι y, • no se desarrolla hipersensibilidad dopaminérgica.
Ello puede tener repercusiones muy favorables para el tratamiento de enfermedades o desórdenes neuronales, preferentemente neurodegenerativos, que cursen con discinesias u otros movimientos anormales e involuntarios, como se puede ver en los ejemplos, donde el tratamiento de estos factores combinados en ratas parkinsonianas producía una reducción de la sintomatología motora en las ratas. Además, con el tratamiento prolongado tampoco se observaba el desarrollo de discinesias invalidantes y secundarias a la hipersensibilidad dopaminérgica como ocurre con el uso de levodopa.
Por ello, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de una enfermedad neurológica. El término "enfermedad neurológica" hace referencia a aquellas enfermedades en las que se produce una lesión o una disfunción del sistema nervioso, ya sea central o periférico. Son trastornos del cerebro, la médula espinal y los nervios de todo el cuerpo. En conjunto, esos órganos controlan todas las funciones del cuerpo y cuando algo funciona mal en alguna parte del sistema nervioso, es posible que tenga dificultad para moverse, hablar, tragar, respirar o aprender. También pueden aparecer problemas relacionados con la memoria, los sentidos o el estado de ánimo.
Una realización preferida de la presente invención se refiere al uso de la composición farmacéutica de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de una enfermedad neurológica, donde dicha enfermedad neurológica es una enfermedad neurodegenerativa. El término "enfermedad neurodegenerativa" hace referencia a aquellas enfermedades causadas por un aumento en los procesos de muerte celular, reduciendo el número de neuronas, genera cambios en la conducta causando el empeoramiento de muchas de las actividades corporales, incluyendo el equilibrio, el movimiento, el habla, la respiración y la función cardiaca. Muchas de estas enfermedades son genéticas, lo que significa que son hereditarias o que existe una mutación genética. Algunos cuadros clínicos, como lo es el alcoholismo, un tumor o un derrame, pueden causar otros tipos. Existen todavía otros tipos que pueden ser causados por toxinas, sustancias químicas o virus. Según una realización más preferida, la enfermedad neurológica cursa con discinesias u otros movimientos anormales o involuntarios. Según otra realización más preferida de la presente invención, la enfermedad neurológica es Parkinson, trastorno de Gilíes de la Tourette, síndrome de Lesch-Nyhan o un desorden neurológico causado por abstinencia a drogas o por tratamiento con al menos un neuroléptico.
Todas estas enfermedades o desórdenes neurológicos han sido seleccionados debido a que en todas ellas se desarrollan discinesias e hipersensibilidad dopaminérgica
En una realización aún más preferida, la enfermedad neurológica es Parkinson.
Tal como se ha comentado anteriormente, el GDNF es una macromolécula que no atraviesa la barrera hematoencefálica, por lo que con el fin de facilitar a estas macromoléculas el transporte a través de la barrera hematoencefálica, una realización más preferida del uso de la composición farmacéutica de la presente invención se refiere al uso donde el medicamento de la presente invención se presenta en una forma adaptada a la administración intracerebroputaminal. El término "forma adaptada" hace referencia al modo de adecuar el medicamento de la presente invención para que pueda ser administrado vía intracerebroputaminal.
La administración por vía intracerebroputaminal de la composición de la invención, puede efectuarse a través de varios métodos como, por ejemplo, pero sin limitarse a microcápsulas de liberación lenta implantadas en el caudado/putamen, virus infundidos que liberen ambos factores o infusiones intraputaminales continuas con bombas de infusión conectadas a catéteres intracerebrales. La infusión continua permite el transporte de la composición de la invención de forma controlada y directamente al caudado dañado y/o putamen dañado, consiguiendo así un mayor efecto trófico en esta zona, junto a una reducción del desarrollo de hipersensibilidad dopaminérgica en el caudado/putamen. El primer efecto estaría mediado por GDNF y el segundo por TGF-β-ι .
Otra realización preferida de la invención se refiere a la composición farmacéutica de la invención, donde el medicamento tiene una cantidad de GDNF capaz de alcanzar una concentración diaria en tejido cerebral de entre 5 y 50 Mg/día.
Es conocido que el rango de concentraciones de GDNF de entre 5 y 50 g/día es el más adecuado en humanos (Nutt JG. et al. 2003 Neurology. Jan 14; 60(1):69-73). Además también pueden emplearse los rangos de 8 a 50 g/día, 15 a 50 Mg/día, 17 a 45 pg/día, 21 a 40 pg/día, 25 a 37 pg/día, 27 a 31 pg/día o el rango de GDNF que va desde 8 a 12 Mg/día.
Por otro lado, debido a que tal y como se demuestra en la invención, la dosis de TGF-β-ι debe ser de 2 a 4 veces inferior a la de GDNF de forma que ambas concentraciones se mantengan en el rango de 2:1 a 4:1 de GDNF GF-βι , el medicamento tiene una cantidad de TGF^ capaz de alcanzar una concentración diaria en tejido cerebral de entre 1 a 25 pg/día, además también pueden emplearse los rangos que van de 1 a 20 pg/día, de 1 a 15 pg/día, 1 a 0 pg/día o el rango de TGF-β-ι que va desde 1 a 3 Mg/día.
Otro aspecto de la invención se refiere al kit que comprende la composición de la invención.
En una realización preferida del aspecto anterior, además el kit comprende bombas de infusión y catéteres intracerebrales.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1. Rotaciones inducidas por anfetamina/apomorfina. Las Figuras 1A y B, muestran el número de rotaciones por hora que realiza el animal cuando se le inyecta anfetamina y no reciben ningún tratamiento, y posteriormente, al segundo mes, cuando se les implantan las minibombas con vehículo control, GDNF solo, GDNF + TGF-βι combinados, o con TGF-βι solo. La figura 1A incluye los datos con la ratio 4:1 de GDNF: TGF-βι , con dosis de 8 ng/día de GDNF (x 8 días) y de 2 ng/día de TGF-βι (x 8 días). La figura 1 B incluye los datos con la ratio 2:1 de GDNF: TGF^, con dosis de 6 ng/día de GDNF (x 8 días) y de 3 ng/día de TGF-βι (x 8 días) (Medias ± EEM, * p<0.05, ** p<0.01 vs. 2 meses después de inducir parkinsonismo en la rata, test de Newman-Keuls).
La Figuras 1C y D, muestran el número de rotaciones por hora que realiza el animal cuando se le inyecta apomorfina y no reciben ningún tratamiento, y posteriormente, al segundo mes, cuando se les implantan las minibombas con vehículo control, GDNF solo, GDNF + TGF-βι combinados, o con TGF-βι solo. La figura 1C incluye los datos con la ratio 4:1 de GDNF: TGF-β! , con dosis de 8 ng/día de GDNF (x 8 días) y de 2 ng/día de TGF-βι (x 8 días). La figura 1 D incluye los datos con la ratio 2:1 de GDNF: TGF-β-ι , con dosis de 6 ng/día de GDNF (x 8 días) y de 3 ng/día de TGF-βι (x 8 días) (Medias ± EEM, * p<0.05, ** p<0.01 vs. 2 meses después de inducir parkinsonismo en la rata, test de Newman-Keuls).
FIG. 2. Inmunotinción de la señal estriatal de tirosina-hidroxilasa (TH).
La Figura 2 muestra inmunotinción de la señal estriatal de tirosina-hidroxilasa (TH) después de un mes tras el cese de la infusión constante (mediante bomba osmótica implantada) de vehículo salino, GDNF+TGF-βι o GDNF sólo, durante 8 días en ratas con estriado lesionado.
En la Figura 2A se observa el estriado lesionado (a la derecha de la imagen) tras infusión de salino.
En la Figura 2B se observa el estriado lesionado (a la derecha de la imagen) tras infusión de GDNF + TGF-βι a una ratio de 4:1 (dosis de 8 ng/día de GDNF y de 2 ng/día de TGF-βι). La Figura 2C es una ampliación de la Figura 2B, la zona más teñida es la zona de infusión.
En la figura 2D se observa el estriado lesionado (a la derecha de la imagen) tras infusión de GDNF+ TGF-βι a una ratio de 2:1 (dosis de 6 ng/día de GDNF y de 3 ng/día de TGF-βι).
En la Figura 2E se observa el estriado lesionado (a la derecha de la imagen), tras infusión de GDNF sólo en esa zona (8 ng/día por 8 días).
Barra: 1 mm.
FIG. 3. Inmunoblotting del receptor GRFalfal (receptor de GDNF).
En la Figura 3 se muestran los resultados de un inmunoblotting del receptor GRFalfal (receptor de GDNF) en los estriados contralateral y lesionado de ratas lesionadas unilateralmente con 6-OHDA, después de un mes tras el cese de la infusión constante (mediante bomba osmótica implantada) de vehículo salino, GDNF+TGF-βι (ratio 4:1) o GDNF sólo, durante 8 días.
Se marca con un asterisco el estriado lesionado con infusión de GDNF y con almohadilla el estriado lesionado con infusión combinada de GDNF+TGF^.
EJEMPLOS
La invención se basa en el tratamiento con infusiones intraputaminales de dosis farmacológicamente efectivas de GDNF y TGF-βι combinados a ratas parkinsonianas. Las infusiones se realizaron con bombas de infusión conectadas a catéteres intracerebrales, con el fin de mantener una inyección con flujo constante de estos factores tróficos. En humanos, la dosis recomendada de GDNF es 5-50 pg/día y la de TGF-fa es de 1-10 pg/día, manteniendo siempre una mayor concentración de GDNF en el rango de ratios de 2:1 a 4:1. Datos experimentales con modelos animales de parkinsonismo indicaron que este rango de ratios es apropiado, y ratios de concentraciones por encima o debajo del mismo no son igualmente efectivas. Esta ratio de combinaciones es también novedosa, pues hasta la fecha sólo combinaciones 5:1 en cultivo celular se habían ensayado.
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores que describen cómo el tratamiento con infusiones intraputaminales de dosis farmacológicamente efectivas de GDNF y TGF-βι combinados y su correspondiente vehículo en solución dio lugar a una mejor recuperación de la sintomatología motora de ratas a las que se les había inducido la enfermedad de Parkinson que si las ratas se trataban mediante los factores GDNF o TGF-βι por separado, demostrando los efectos aumentados por la cooperación entre ambos factores. Por otro lado, también se comprobó que el efecto trófico mediado por GDNF se ve incrementado por TGF-βι porque éste bloquea la desensibilización o regulación a la baja de los receptores GFRal de GDNF e induce el freno de la degeneración, incremento de la regeneración y aumento de los niveles de dopamina (aumentó la expresión de la enzima tirosina-hidroxilasa de dopamina). El TGF-βι indujo per se una disminución del desarrollo de la hipersensibilidad de receptores de dopamina, que surgió como consecuencia del proceso degenerativo de la enfermedad y originó discinesias a la levodopa.
EJEMPLO 1. Parkinsonismo inducido por 6-hidroxidopamina.
Se crearon modelos animales de ratas parkinsonianas inyectando 6- hidroxidopamina (6-OHDA), la neurotoxina más ampliamente utilizada en el desarrollo de modelos experimentales de EP en roedores. Cuando es administrada por vía sistémica destruye las neuronas adrenérgicas de los ganglios simpáticos pero carece de acción tóxica a nivel del sistema nervioso central. Sin embargo, la inyección intracerebral de 6-OHDA produce una destrucción selectiva de neuronas catecolaminérgicas. Esta especificidad es debida a su alta afinidad por el sistema de transporte de catecolaminas.
En los últimos años, la inyección estriatal de 6-OHDA está siendo utilizada como modelo de degeneración neuronal debido a que produce atrofia y degeneración lenta y progresiva de las neuronas de la sustancia negra. Este modelo resulta muy interesante por varias razones. En primer lugar representa un modelo de parkinsonismo en un estadio inicial de la enfermedad ya que la pérdida neuronal que se obtiene oscila entre un 60-70%. Por otro lado permite, de acuerdo a la dosis de 6-OHDA inyectada en el estriado, obtener una lesión parcial nigroestriada y por tanto puede ser el modelo ideal a utilizar para el estudio del efecto neuroprotector de determinadas sustancias.
Los animales con lesión unilateral de la vía nigroestriada, presentaron una rotación ipsilateral a la lesión cuando se les administraron sustancias que aumentan la liberación de dopamina como anfetamina (Figura 1A, B), y mostraron una rotación contralateral al lado de la lesión cuando recibieron agonistas dopaminérgicos como apomorfina (Figura 1C, D). La rotación contralateral inducida por apomorfina u otros agonistas dopaminérgicos, fue debida al incremento del número de receptores dopaminérgicos que aparecieron en el estriado homolateral a la lesión como consecuencia de la denervación. Por el contrario la anfetamina, al incrementar la liberación de dopamina en las terminales presinápticas incrementó la concentración de dopamina únicamente en estriado contralateral a la lesión, produciéndose un desequilibrio funcional a favor del estriado contralateral.
La lesión unilateral de la sustancia negra indujo cambios en el sistema nigroestriado que intentaron compensar el déficit de dopamina inducido por la pérdida de neuronas dopaminérgicas. Así, se ha descrito una inducción y activación de tirosina hidroxilasa (enzima limitante de la síntesis de catecolaminas) en las neuronas dopaminérgicas todavía funcionantes (Figura 2), un aumento de la cantidad de dopamina liberada en el estriado por las terminales dopaminérgicas existentes y un incremento en el número de receptores dopaminérgicos estriatales postsinápticos (Figura 3). Este incremento apareció únicamente cuando la pérdida de neuronas dopaminérgicas fue superior al 90% y tuvo lugar después de 4 semanas de haberse producido la denervación dopaminérgica.
1.1 Medida de las rotaciones inducidas a ratas parkinsonianas.
1.1.1 Rotaciones inducidas por anfetamina.
Todas las ratas parkinsonianas sin tratamiento giraron durante los dos meses tras la lesión con 6-OHDA. Tras implantar las minibombas con GDNF solo, GDNF + TGF-β! combinados, TGF-βι solo o vehículo salino, se redujo el giro progresivamente, en todos los casos excepto en las control o con TGF-βι solo, indicativo de recuperación funcional. La combinación GDNF: TGF-βι (4:1 o 2:1) tuvo más efecto que el GDNF sólo (Figuras 1A, B).
La anfetamina se inyectó en 5 momentos determinados: una semana después de la inducción del parkinsonismo, 1 mes después de la inducción del parkinsonismo, 2 meses después de la inducción del parkinsonismo, 9 días después de la implantació la bomba y 1 mes después de la implantación de la bomba.
(Medias ± EEM, * p<0.05, ** p<0.01 vs 2 meses después de inducir parkinsonismo en la rata).
1.1.2 Rotaciones inducidas por apomorfina.
Las rotaciones aumentaron en todas las ratas parkinsonianas sin tratamiento durante dos meses tras la lesión con 6-OHDA, indicativo de desarrollo de hipersensibilidad dopaminérgica. La implantación de bombas con GDNF, TGF-βι o ambos factores combinados redujo la hipersensibilidad dopaminérgica, siendo el efecto mayor cuando se combinaron ambos factores o cuando se añadió TGF-βι sólo. Todos los efectos mencionados se mantuvieron durante un mes tras el cese de las bombas, indicando que la recuperación funcional y la hipersensibilidad disminuida eran efectos mantenidos (Figuras 1C, D).
La apomorfina se inyectó en 5 momentos determinados: una semana después de la inducción del parkinsonismo, 1 mes después de la inducción del parkinsonismo, 2 meses después de la inducción del parkinsonismo, 9 días después de la implantación de la bomba y 1 mes después de la implantación de la bomba.
(Medias ± EEM, ** p<0.01 vs 2 meses tras la inducción del parkinsonismo).
1.2 Inmunotinción de la señal estriatal de tirosina-hidroxilasa (TH).
Se puede observar en la Figura 2 que la inmunotinción de la señal estriatal de tirosina-hidroxilasa (TH), enzima de síntesis de la dopamina, después de un mes tras el cese de la infusión constante (mediante bomba osmótica implantada) de vehículo salino, GDNF+TGF-β! o GDNF sólo durante 8 días en ratas con estriado lesionado, mostró que:
• el estriado lesionado presentaba ausencia de señal oscura de inmunotinción de TH, indicativa de degeneración dopaminérgica (compárese con el estriado contralateral no lesionado) cuando se infundió vehículo salino (Figura 2A),
• se observó una clara recuperación de la señal TH en el estriado cuando se infundió GDNF + TGF-βι durante 8 días a ratios 4:1 (Figura 2B y C) o 2:1 (Figura 2D), con una mayor señal de TH en la zona de infusión (Figura 2C, imagen ampliada de la zona de infusión). Dicha señal fue indicativa de que se había regenerado el tejido dopaminérgico tras la infusión de ambos factores neurotróficos (compárese la señal con el estriado contralateral, normal, no lesionado),
• la infusión de GDNF indujo un aumento de la señal de TH en el estriado inyectado, indicativo de su efecto trófico, pero dicha señal fue menor en densidad y tamaño al de la combinación GDNF+ TGF^ a ambas ratios (4:1 o 2:1) (Figura 2E).
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1.3 Inmunoblottinq del receptor GRFalfal (receptor de GDNF) en los estriados contralateral y lesionado.
El inmunoblotting del receptor GRFalfal (receptor de GDNF) en los estriados contralateral y lesionado de ratas lesionadas unilateralmente con 6-OHDA, después de un mes tras infusión constante (mediante bomba osmótica implantada) de vehículo control, GDNF, TGF-βι o ambos combinados en el estriado lesionado mostró cómo la señal del receptor (bandas a 55KDa) disminuyó tras la infusión de GDNF indicativo de "regulación a la baja" por desensibilización del receptor (asterisco), pero ello no ocurrió tras combinar GDNF con TGF-βι (almohadilla), lo que explica a nivel molecular por qué se facilita in vivo la acción trófica del GDNF a través de su receptor. Los datos experimentales permiten afirmar por tanto que ambos factores neurotróficos cooperan funcionalmente: el GDNF favorece la regeneración trófica del tejido dañado y el cese de la degeneración, y el TGF-βι disminuye el desarrollo de la hipersensibilidad dopaminérgica que aparece en el caudado/putamen en la EP. Este último efecto es novedoso e inesperado, y con importantes repercusiones funcionales pues la hipersensibilidad dopaminérgica anómala se considera causa de discinesias y fracasos en la acción de levodopa en los enfermos de Parkinson.
Así, el tratamiento combinado dio lugar a una mejor recuperación de la sintomatología motora en la EP y al no desarrollo de discinesias invalidantes y secundarias a la hipersensibilidad dopaminérgica, de forma que puede ser aplicado a cualquier enfermedad o desorden neuronal, neurodegenerativo que curse con discinesias u otros movimientos anormales o involuntarios.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Composición farmacéutica que comprende el factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), y el factor transformante betal (TGF-β-ι) en un rango de GDNF:TGF-Pi de entre 2:1 a 4:1.
2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 , que adicionalmente comprende, al menos, un excipiente farmacológicamente aceptable.
3. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que adicionalmente comprende, al menos, un vehículo farmacológicamente aceptable.
4. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de al menos una enfermedad neurológica.
5. Uso de la composición según la reivindicación 4, donde la enfermedad neurológica es una enfermedad neurodegenerativa.
6. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, donde la enfermedad neurológica es una enfermedad que cursa con discinesias u otros movimientos anormales o involuntarios.
7. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, donde la enfermedad neurológica es Parkinson, trastorno de Gilíes de la Tourette, síndrome de Lesch-Nyhan o un desorden neurológico causado por abstinencia a drogas o por tratamiento con al menos un neuroléptico.
8. Uso según la reivindicación 7, donde la enfermedad neurológica es Parkinson.
9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, donde dicho medicamento se presenta en una forma adaptada a la administración intracerebroputaminal.
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, donde el medicamento tiene una cantidad de GDNF capaz de alcanzar una concentración diaria en tejido cerebral de entre 5 y 50 yg/día.
11. Kit que comprende la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
12. Kit según la reivindicación 11 que además comprende bombas de infusión y catéteres intracerebrales.
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