WO2011087178A1

WO2011087178A1 - 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성 표지자를 선별하는 방법

Info

Publication number: WO2011087178A1
Application number: PCT/KR2010/000775
Authority: WO
Inventors: 김효수; 강현재; 이은주
Original assignee: Seoul National University Hospital
Current assignee: Seoul National University Hospital
Priority date: 2010-01-12
Filing date: 2010-02-09
Publication date: 2011-07-21
Anticipated expiration: 2012-07-12
Also published as: KR101238181B1; KR20110082831A

Abstract

본 발명은 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성 표지자(바이오마커)를 선별하는 방법에 관한 것으로, 생체내 활성도가 상이한 인간 중배엽 줄기세포들에 대하여 DNA 어레이(array)를 실시하는 단계; 상기 인간 중배엽 줄기세포간 발현의 차이를 보이는 유전자들을 선별하는 단계; 및 상기 유전자들 중 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성도 차이를 표지하는 바이오마커를 확인하는 단계를 포함한다. 또한 본 발명은 상기 방법에 따라 선별된 바이오마커를 제공하며, 나아가 상기 바이오마커를 이용하여 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성을 표식화하는 시스템을 제공한다. 본 발명에 따르면, 유전적 배경 및/또는 기원이 상이한 인간 중배엽 줄기세포의 다양한 생체 활성도의 차이를 생체외에서 선 판별하는 것이 가능하며, 이는 타가 유래 세포치료제 개발 및 선발에 있어 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

【명세서】

【발명의명칭]

인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성 표지자를 선별하는 방법

【기술분야】 ,

본 발명은 다양한 유전적 배경 또는 기원을 가지는 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성도 차이를 나타내는 생체내 활성 표지자 (바이오마커)를 선별하는 방법， 및 상기 바이오마커를 이용한 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성 표식화 시스템 등에 관한 것이다.

【배경기술】

줄기세포 (st em cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화 (differential; ion)할 수 있는 세포로서 배아， 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극 (환경) 에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 분화가 완료되어 세포분열이 정지된 세포 와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산 (self-renewal)할 수 있어 증식 (proliferation; expansion)하는 특성이 있으며， 다른 환경 또는 다른 분화 자 극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성 (plasticity)을 가지고 있 는 것이 특징이다.

줄기세포는 그 분화능에 따라 만능 (pluripotency), 다분화능 (mult ipotency) 및 단분화능 (unipotency) 줄기세포로 나눌 수 있다. 만능줄기세포 (pluripotent stem eel Is)는 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력 (totiportent)을 지닌 전분화능 (pluripotency)의 세포로서 배아줄기세포 (embryonic stem cell, ES cell) 및 유도 만능줄기세포 (induced pluripotent stem cells, iPS) 등이 이에 해당된다. 다분화 능 및 또는 단분화능 줄기세포로는 성체줄기세포를 예로 들 수 있다.

배아줄기세포는 배아발생초기인 포배기 (blastocyte)의 세포내괴 (inner cell mass)로부터 형성되며， 모든 세포로 분화가능한 잠재력 (totipotent)을 가지고 있어 어떠한 조직 세포로도 분화될 수 있으며, 또한 사멸하지 않고 (immortal) 미분화상 태에서 배양가능하며， 성체줄기세포와 달리 배세포 (germ cell)의 제조도 가능하므 로 다음 세대로 유전될 수 있는 특징을 가지고 있다 (Thomson et al . , Science, 282： 1145-1147, 1998； Reubinoff et al . , Nat. Biotechnol. , 18: 399-404, 2000) . 인간 배아줄기세포는 인간 배아 형성시 세포내괴 (inner cell mass)만을 분리 하여 배양함으로써 제조되는데， 현재 전 세계적으로 만들어진 인간 배아줄기세포는 불임시술 뒤 남은 넁동배아로부터 얻어진 것이다 . 모든 세포로 분화될 수 있는 전 분화능을 가진 인간 배아줄기세포를 세포치료제로 이용하기 위 한 다양한 시도가 이 루어져 왔지만 아직 암발생의 위험과 면역거부반웅의 높은 벽을 완전히 제어하지 못하고 있는 실정 이다 .

<6> 이에 대한 보완책으로 최근 보고 되고 있는 것으로 유도만능줄기세포 ( iPS)가 있다 . 만능줄기세포의 개념으로 포함되고 있는 iPS 는 분화가 끝난 성 체세포를 여 러 가지 방법으로 역분화시켜， 분화 초기 단계인 배아줄기세포로의 상태로 회귀시 킨 세포이다. 현재까지 역분화 세포는 유전자 발현과 분화능에서 만능줄기세포인 배아줄기세포와 거의 동일한 성 격을 나타내는 것으로 보고되어 있다 . 하지 만 이 러 한 iPS의 경우도 자가 세포를 이용하여 면역거부반웅의 위험성은 배제할 수 있으 나， 암발생의 위험성은 여 전히 해결해야 할 과제로 남아있다 .

<7> 최근 이러한 문제점을 극복하기 위 한 대안으로 면역조절기능과 함께 암발생 의 위험성 이 없는 중배엽 줄기세포가 제시되고 있다 . 중배엽 줄기세포는 지방세포， 골세포， 연골세포， 근육세포， 신경세포， 및 심근세포 등으로의 분화가 가능한 다능 성을 가진 세포로 면역 반응을 조절하는 기능도 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 증배엽 줄기세포는 골수， 제대혈， 지방조직 등 다양한 조직에서 분리， 배양이 가능 하나 각 기원에 따른 세포 표면 표지자가 조금씩 다르기 때문에 중배엽 줄기세포를 명 확히 정 의하는 것은 용이하지 아니하다. 다만 골세포， 연골세포 , 및 근육세포로 분화가 가능하며， 소용돌이 모양의 형 태를 가지고， 기본적 인 세포 표면 표지자인

CD73(+) , CD105C+) , CD34(-) 및 CD45(— )를 발현하는 경우 일반적으로 중배엽 줄기 세포로 규정하고 있다.

<8> 특히 중배엽 줄기세포의 능력 (생체내 활성도)에 있어서도 각 기원에 따라 차 이가 있는 것으로 알려져 있으나 현재까지 그 능력의 차이를 표지 할 수 있는 생체 내 활성 표지자 (바이오마커 )는 보고된 바 없다. 이와 관련하여， 상이한 유전적 기 원 및 /또는 배경을 가지는 중배엽 줄기세포들의 경우， 위에서 언급한 기존의 중배 엽 줄기세포를 규정하는 기준들에 대하여는 서로 차이 점을 나타내지 아니하지만 각 각의 생체내 활성쎄 있어서는 차이를 나타낼 수 있다 . 중배엽 줄기세포를 세포치료 제로 사용함에 있어서， 그 생체내 활성도의 차이가 세포 치료제의 궁극적 차이를 유발한다는 점을 고려해 볼 때， 중배엽 즐기세포의 세포 치료제로서 의 효율성 및 실용성을 극대화 하기 위 해서는 다양한 유전적 기원 및 /또는 배경을 가지는 중배엽 줄기세포들의 생체내 활성도의 차이를 판별할 수 있는 생체내 활성 표지자 (바이오 마커)를 찾아내는 것이 재생 의학 및 세포치료제 실용화를 위한 당업계의 과제라 할 수 있을 것이다.

<9> 또한， 중배엽 줄기세포가 세포치료제로 이용되기 위해서는 재생의학 및 /또는 세포치료 분야에서 요구되는 최소 세포수 (약 mo⁹정도)를 만족시켜야 하는데, 적 정조건을 잡고 기준을 정하는 실험까지 고려한다면 필요한 세포수는 더욱 늘어나게 된다. 따라서 기존의 다양한 기원의 중배엽 줄기세포로부터 이 정도의 양을 공급하 려면 in vitro(체외) 실험에서 최소 10번 이상의 계대가 필요하게 되는데 이 경우 세포가 노화되고 변형되어 더 이상 세포치료제로서의 목적을 달성하기에는 적합하 지 아니할 수 있다. 설령 이러한 세포로 조건과 기준을 잡았다 하더라도 정작 세포 치료 목적으로 사용할 시점에는 이미 그 세포가 바닥이 나서 다른 사람의 중배엽 줄기세포를 써야 하고 그럴 경우 또 다른 세포이용에 따른 부가적인 실험을 다시 거처야 하는 문제가 발생할 수 있다.

<ιο> 이에 대한 가장 이상적인 대안은 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성 표지 자를 이용하여 그 활성도를 표식화 하고， 나아가 이를 도표화 · bank화 함으로써 세포치료제로서의 적절한 최소의 중배엽 줄기세포 수를 계산할 수 있는 시스템을 제공하는 것이다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

<ιι> 본 발명은 상이한 유전적 배경 및 /또는 기원을 가지는 여러 인간 중배엽 줄 기세포의 다양한 생체내 활성도 차이를 생체외에서 선 판별할 수 있는 방법을 제공 하고자 한다. 또한 본 발명은 다양한 기원의 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성 차이를 표지할 수 있는 바이오마커를 제공하고， 나아가 상기 바이오마커를 이용하 여 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성도를 표식화 할 수 있는 일반화된 시스템을 제공하고자 한다.

【기술적 해결방법】

<12> 상기와 같은 과제를 해결하기 위해， 본 발명은 다양한 유전적 배경 및 /또는 기원을 가지는 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성 차이를 나타내는 바이오마커를 검색 및 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 생체내 활성도가 상이한 인간 중 배엽 줄기세포들에 대하여 DNA 어레이 (array)를 실시하는 단계; 상기 인간 중배엽 줄기세포간 발현의 차이를 보이는 유전자들을 선별하는 단계; 및 상기 유전자들 중 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성도 차이를 표지하는 바이오마커를 확인하는 단 계를 포함한다.

<13> 구체적으로， 상기 생체내 활성도는 허혈성 심혈관 래트 (rat) 모델을 이용하 여 심혈관 질환을 호전시키는 능력을 측정함으로써 그 차이를 비교할 수 있으며, 상기 선별된 유전자들에 대하여 그 단백질의 양적 발현 수준과 생체내 활성도와의 상관관계를 확인함으로써 궁극적으로 중배엽 줄기세포의 바이오마커를 선별해^' 낼 수 있다.

【유리한 효과】

<14> 본 발명에 따르면, 상이한 유전적 배경 및 /또는 기원을 가지는 여러 인간 중 배엽 줄기세포의 다양한 생체 활성의 차이를 생체외에서 선 판별하는 것이 가능하 며， 이는 타가 유래 세포치료제 개발 및 선발에 있어 매우 유용하게 이용될 수 있 을 것이다. 또한 본 발명은 인간 중배엽 줄기세포의 바이오마커를 이용하여 상이한 유전적 배경 또는 기원을 가지는 여러 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성도를 표 식화 하고 이를 도표화 · bank 화하여 궁극적으로 규격화하는 것을 가능하게 한 다. 따라서， 중배엽 줄기세포가 가지는 생체내 활성 차이로 인한 case by case 평 가 문제를 극복할 수 있을 뿐만 아니라 나아가 세포치료 및 재생의학에 필요한 고 기능의 적절한 인간 중배엽 줄기세포수의 도출을 가능하게 할 것이다.

<15> 궁극적으로 본 발명은 인간 중배엽 줄기세포의 세포치료제로서의 효율성을 증대시킴으로서 세포치료제의 실용화를 앞당기는데 기여할 수 있을 것으로 기대되 며 나아가 심혈관계질환， 신경계질환 등의 난치병 치료제 개발에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

【도면의 간단한 설명】

<16> 도 1 내지 도 3은 허혈성 동물 모델 실험을 위해 적절한 실험 조건을 잡은 결과를 나타낸 것으로， 도 1은 전체적인 time line을 나타내며， 도 2는 세포 수에 따른 8주째의 심전도 변화를 보여 주는 그림이고， 도 3은 좌심실 확장기내경 (LVEDD) 및 좌심실 수축기내경 (LVESD) 등을 수치화하여 나타낸 것아다.

<17> 도 4 내지 도 8은 동정된 인간 제대혈 유래 중배엽 줄기세포 4종의 생체내 활성도를 측정한 결과를 나타낸 것으로， 도 4는 8주째의 심전도 결과를 보여주는 그림이고， 도 5는 좌심실 확장기내경 (LVEDD) 및 좌심실 수축기내경 (LVESD) 등을 수 치화하여 나타낸 것이며， 도 6은 전체적인 심장의 크기 변화와 벽 두께 및 섬유화 를 볼 수 있게 염색 한 그림이고， 도 7 및 도 8은 이를 수치화하여 나타낸 것이다.

<18> 도 9 내지 도 12는 생체내 활성도 차이를 검증하기 위한 조직 분석 결과를 보여주는 것으로 도 9는 미세 혈관의 분포를 염 색하여 나타낸 것 이고， 도 10은 이 를 수치화하여 나타낸 것 이며 , 도 11은 세포 사멸을 염색하여 나타낸 것이고， 도 12는 이를 수치화 하여 나타낸 것이다 .

<19> 도 13 내지 도 16은 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성 표지자를 선별하는 과정을 보여주는 것으로， 도 13은 M01 과 M02 에 대해 DNA array 를 실시한 결과를 나타낸 것.이며 , 도 14는 이들 중 세표 표면 관련 유전자 5개를 선별한 것 이고， 도 15는 이를 RNA 수준에서 확인한 결과이며， 도 16은 FACS 로 단백질 수준에서 확인 한 결과이다 .

<20> 도 17은 4종 세포에 대한 CD146 의 western blot 및 FACS 결과를 나타낸 것 이다.

<2i> 도 18은 4종 세포에 대한 N-cadherin의 western blot 2회 실시 결과를 나타 낸 것이다.

<22> 도 19 내지 도 23은 N-cadherin 의 활성을 관찰한 결과를 나타낸 것으로， 도

19는 cadherin이 ERK 및 /또는 AKT 활성화에 미치는 효과를 나타낸 것이며， 도 20은 상기 효과가 N-cadherin 에 의 한 것 임을 확인한 결과이고 , 도 21은 N-cadherin 의 RNA 수준에서의 발현 억제시 세포 사멸이 증가되는 것을 관찰한 그림 이며， 도 22는 PI FACS 결과를 나타낸 것이며， 도 23은 N-cadherin blocking 에 의해 VEGF 가 RNA 와 protein 수준에서 모두 억 제되는 것을 나타낸 그림 이다 .

<23> 도 24 및 도 25는 N-cadherin 의 혈관 형성능에 대한 효과를 나타내는 것으 로， 도 24는 N-cadherin 의 유사 혈관 형성능을 보여주는 것 이며， 도 25는 실질적 인 혈관내피세포의 혈관 형성과정에서의 N— cadherin 의 역할을 나타낸 것 이다 . 【발명의 실시를 위 한 형 태】

<24> 본 발명은 다양한 유전적 배경 및 /또는 기원을 가지는 인간 중배엽 줄기세포 의 생체내 활성도 차이를 판별할 수 있는， 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성 표 지자 (바이오마커 )를 검 색 및 확인하는 방법에 관한 것이다 . 상기 방법은 생체내 활 성도가 상이 한 인간 중배엽 줄기세포들에 대하여 DNA 어 레이 (array)를 실시하는 단 계 ; 상기 인간 중배엽 줄기세포간 발현의 차이를 보이는 유전자들을 선별하는 단 계 ; 및 상기 유전자들 중 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성도 차이를 표지하는 바이오마커를 확인하는 단계를 포함한다：

<25> 본 발명 에 사용되는 인간 중배엽 줄기세포는 그 유전적 배경 및 /또는 기원에 있어서 제한이 없다 . 예를 들면 상이한 개체로부터 얻은 여 러 인간 제대혈 유래 중 배엽 줄기세포들을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 a-MEM(Invitrogen ) +10% FBSCfetal bovine serum) 배지에서 상기 중배엽 줄기세포를 배양할 수 있다. 본 발 명에 사용되는 상이한 유전적 배경 및 /또는 기원을 가지는 인간 중배 ¾ 줄기세포들

- 에 대하여 체외 (in vitro) 동정 평가를 실시하면 기존의 일반적인 중배엽 줄기세포 를 규정하는 특징을 동일하게 나타낸다; 골세포, 연골세포， 및 근육세포로 분화가 가능하며， 소용돌이 모양의 형태를 가지고， 기본적인 세포 표면 표지자인 CD73(+), CD105(+), CD34(-) 및 CD45(-)를 발현한다. 한편, 상기 인간 중배엽 줄기세포들에 대하여 생체내 활성도 평가를 실시하면 그 활성도에 차이를 나타낼 수 있다. 구체 적으로, 생체내 (in vivo) 활성도 평가를 위해 허혈성 심혈관 래트 (rat) 모델을 이 용할 수 있다. 허혈성 심혈관 래트 모델이라 함은 심장의 관상동맥을 결찰시켜 허 혈상태를 유도하여 만든 동물 허혈성 심혈관 질환 모델을 의미한다. 상기 질환 모 델의 허혈 주위 심근육에 각각 동일한 수의 중배엽 줄기세포를 주입하고 심전도를 측정하여 그 호전도를 비교함으로써 생체내 활성도를 평가할 수 있다. 상기 세포 주입은 상기 질환 모델 화 후 7일 내지 10일째에 실시할 수 있으며， 심전도 측정은 4주 후， 바람직하게는 4주 내지 8주째에 실시할 수 있다.

<26> 본 발명에서는 in vitro중배엽 줄기세포 동정 평가시 유의적 차이를 나타내 지 아니하는 4종의 인간 제대혈 유래 중배엽 줄기세포들 (M01, M02, M03, M04)에 대 하여 상기 허혈성 심혈관 래트 (rat) 모델을 이용하여 심혈관 질환의 호전도를 ：찰 한 결과 상기 4종의 세포가 활성도의 차이를 나타내었다 (도 4 내지 도 8 참조). 구 체적으로 M02 가 가장 높은 활성을 보였으며， M01 이 가장 낮은 활성을 나타내었 다. 통상의 허혈성 심혈관 질환의 호전은 우선적으로 허혈 부위에 혈관을 공급하고 그 부위의 세포 사멸을 막음으로 이루어질 수 있다. 상기 4종의 중배엽 줄기세포들 이 심혈관 질환을 호전시키는 기전을 알아보기 위하여 혈관공급 및 세포 사멸에 대 한 효과를 살펴본 결과， 심혈관 질환을 호전시키는 능력과 동일한 순 (M02> M03> M04> M01)으로 그 효과에 차이를 나타내었다 (도 9 내지 도 12 참조). 즉， M02 를 주입한 경우, 혈관공급 및 세포 사멸 방지에 가장 큰 효과를 나타내었다.

<27> 본 발명은 in vitro 의 중배엽 줄기세포 동정 평가에서는 동일한 결과를 나 타내지만 in vivo 활성 평가에서는 차이를 나타내는 상기 인간 중배엽 줄기세포들 에 대하여 그 생체내 활성의 차이를 표지할 수 있는 바이오마커를 검색하기 위하여

DNA array 를 실시하는 단계 및 상기 인간 중배엽 줄기세포간 발현의 차이를 보이 는 유전자들을 선별하는 단계를 포함한다. <28> 구체적으로， 상기 4종의 중배엽 줄기세포들 중 생체내 활성도가 가장 높은

M02 와 활성도가 가장 낮은 M01 에 대하여 DNA array를 3회 반복실시하여 M02 에 서 상대적으로 발현이 높은 세표 표면 관련 유전자 5개를 선별하였다 (도 13 및 도 14 참조). 일반적으로 DNA array 결과는 그 진실성이 70% 이므로， 실질적으로 RNA 수준 및 단백질 수준에서의 발현을 모두 확인하는 것이 필요하다. 따라서， 상기 5 개의 유전자에 대하여 추가로 RNA수준 및 단백질 수준에서 그 발현을 다시 확인한 후 CD146과 N-cadherin을 선별하였다 (도 15 및 도 16 참조).

<29> 또한 본 발명은 상기 유전자들 중 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성도 차 이를 표지하는 바이오마커를 확인하는 단계를 포함한다. 구체적으로 상기 선별된 표지자들에 대하여 각각 그 단백질 발현 수준과 생체내 활성도의 상관관계를 관찰 함으로써 최종적으로 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성 표지자 (바이오마커)를 확인할 수 있다. 상기 단백질 발현은 항원 -항체 반웅을 이용한 웨스턴 블롯 (western blot) 및 /또는 형광세포분석기 (FACS)를 이용하여 확인할 수 있으며， CD146 의 경우 그 단백질 발현 수준과 상기 4종의 중배엽 줄기세포들의 생체내 활 성도의 차이에 대하여 상관관계가 형성되지 아니하는 것으로 확인되었다 (도 17 참 조). 반면， N-cadherin 의 경우 상기 4종 중배엽 즐기세포 각각의 그 단백질 발현 수준과 생체내 활성도 차이에 있어서 상관관계가 관찰되었다 (도 18 참조).

<30> 상기 결과로부터， 다양한 유전적 배경 또는 기원을 가지는 인간 중배엽 줄기 세포의 생체내 활성도 차이를 표지할 수 있는 바이오마커로 N-cadherin 이 최종 선 별 확인되었다. 따라서 본 발명은 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성도 차이를 표지할 수 있는 바이오마커를 제공한다.

<3i> 추가적으로， 본 발명자들은 상기 N-cadherin 의 활성을 확인하는 실험을 실 시하였다. 일반적으로 세포의 생리기전을 설명하는 경우， 세포의 활성올 나타내는 가장 핵심적 인자인 ERK(extracellular signal -regul ted kinase) 와 AKT(V-AKT MURINE THYMOMA VIRAL ONCOGENE H0M0L0G) 인산화를 통한 활성화를 고찰하게 된다. 대부분의 세포들은 상기 두 인자의 활성통로를 이용하여 분열， 이동， 및 생존하고, 각종 인자들을 분비한다.

<32> 본 발명자들은 Ca-의존적 세포간 부착 인자인 cadherin의 기능을 제거 후 다 시 자극하는 실험을 실시하였으며， 그 결과 cadherin 은 AKT 가 아닌 ERK 의 활성 화를 조절하는 기능을 가짐이 관찰되었다 (도 19 참조). 이는 ERK통로가 인간 중배 엽 줄기세포의 생리 활성 통로로 사용될 수 있다는 것을 시사한다. 또한 상기 결과 는 cadherin 중 N-cadherin 에 의한 것으로 확인되었으며 (도 20 참조)， 상기 N- cadherin 은 세포간의 결합은 물론 세포의 사멸을 조절하는 기능도 가지는 것으로 나타났다 (도 21 및 도 22 참조). 이에 더하여 중배엽 줄기세포의 대표적 특성 증 하나인 분비능 조절에 대한 N-cadherin의 효과를 살펴보았다. 구체적으로 심혈관 질환을 호전시키는 데 있어서 주요 paracrine (주변분비) factor 인 VEGF(vascular endothelial growth factor, 혈관내피세포 성장인자)가 N-cadherin blocking 에 의 해 RNA 및 단백질 수준에서 모두 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (도 23 참조). 상 기 결과로부터 N-cadherin은 중배엽 줄기세포의 대표적 특성 중 하나인 분비능 조 절에도 관여하고 있음을 알 수 있다.

<33> 또한 혈관형성시 N-cadherin 의 역할을 살펴본 결과， N-cadherin이 혈관 손 상 질환의 호전에 중요한 인자인 혈관 형성능을 증가시키는 것으로 나타났다 (도 24 및 도 25 참조). 결론적으로， N-cadherin은 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성 도의 차이를 표지할 수 있는 바이오마커일 뿐만 아니라 다양한 생체 활성 조절 인 자로도 작용함을 알 수 있다.

<34> 본 발명은 또한 상기 인간 중배엽 줄기세포의 바이오마커를 이용하여 다양한 유전적 배경 및 /또는 기원을 가지는 여러 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성도를 표식화할 수 있는 시스템을 제공한다. 따라서 인간 중배엽 줄기세포가 세포치료제 로서 사용됨에 있어서 그 효율성 및 실용성을 증가시키는 효과를 기대할 수 있다. 상기 시스템은 다양한 유전적 배경 또는 기원을 가지는 인간 중배엽 줄기세포들에 대하여 N-cadherin 유전자의 발현을 확인하는 단계, 및 상기 N-cadherin 의 단백질 발현 수준을 비교 분석하는 단계를 포함할 수 있다.

<35> 중배엽 줄기세포를 세포치료제로 사용하기 위해서는 이미 언급한 바와 같이 충분한 양의 세포를 공급하는 것이 우선되어야 하는데， 이를 위해서는 중배엽 줄기 세포의 계대배양이 필요하다. 그러나 계대배양을 계속하게 되면 중배엽 줄기세포가 노화되어 분열능력이 없어지고 그 활성 (분화능)을 잃어버리게 되는 문제를 발생시 킬 수 있다. 이와 관련하여 본 발명에 의해 선별된 상기 인간 중배엽 줄기세포의 바이오마커를 이용하면 다양한 유전적 배경 및 /또는 기원을 가지는 여러 인간 중배 엽 줄기세포의 생체내 활성도의 표식화가 가능하고 이를 도표화， bank 화함으로써 세포치료 및 재생의학에 필요한 고기능의 적절한 인간 중배엽 줄기세포 수의 도출 을 가능하게 한다. 궁극적으로， 본 발명은 인간 중배엽 줄기세포의 세포치료제로서 의 효율성을 증대시킴으로서 세포치료제의 실용화를 앞당기는데 크게 기여할 수 있 을 것으로 기대된다.

<36>

<37> 이하， 하기 실시예를 들어 본 발명의 실시 형태를 구체적으로 설명하겠으나， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정 되는 것은 아니다.

<38>

<39> [실시예]

<40> 본 발명에서는 MEDIP0ST (주)에서 제공받은 4종의 유전적 기원이 다른 인간 제대혈 유래 중배엽 줄기세포를 사용하였다. 상기 세포들은 유전적 기원이 상이한 여러 인간 제대혈에서 단핵구 세포들을 정형화된 방법으로 분리하고 이들을 고착배 양시 부착하여 자라나는 세포들을 대상으로 인간 중배엽 줄기세포 동정 실험을 실 시하여 선별된 것으로， 중배엽 줄기세포의 양성 세포 표지자 (CD29, CD44, CD73, CD105, CD166, HLA-ABC) 95%이상 표현과 음성 세포 표지자 (CD34, CD45, HLA-DR) 5% 미만의 획일적 표현 확인， 및 중배엽 줄기세포의 다중 분화능을 확인한 후 "인간 제대혈 유래 중배엽 줄기세포" 로 동정 ·분류된 세포들이다 (각각 MOl, M02, M03, M04로 명명함) .

<41>

<42> 실시예 1. 인간중배엽 줄기세포의 생체내 (in vivo) 활성도평가

<43> In vitro 중배엽 줄기세포 동정 평가에서 유의적 차이를 나타내지 아니하는 상기 4종의 중배엽 줄기세포들 (MOl, M02, M03, M04)에 대하여 생체내 활성도 평가 를 실시하였다. 상기 생체내 활성도를 평가하기 위하여 허혈성 심혈관 래트 (rat) 모델을 이용하였으며， 상기 허혈성 심혈관 래트 모델이라 함은 심장의 관상동맥을 결찰시켜 허혈상태를 유도하여 만든 동물 허혈성 심혈관 질환 모델을 의미한다.

<44>

<45> (1) 세포수 및 생체내 활성도 평가조건 설정

<46> 먼저 적정 세포수 및 생체내 활성도 평가 조건을 설정하기 위한 실험을 실시 하였다. 구체적으로， 상기 4종 (MOl, M02, M03, 및 M04)의 중배엽 줄기세포 중 하나 를 무작위로 선발하여 (passage 6-7), 최소 효과 세포수 및 방법을 개발하고 정형화 하기 위한 사전 실험을 수행하였다. 질환 모델 rat 1마리당 1X10³개， ΙΧΙΟ개, ixio⁵개， 1X10⁶개， 및 1X10⁷개를 주입한 후 그 생체내 활성도를 평가하여 도 1 내지 도 3에 나타내었다. 상기 4종의 중배엽 줄기세포 각각에 대하여 최소 7 마리 이상 의 rat 를 사용하였다.

<47> 도 1 은 전체적인 time line 을 보여주는 것으로, 상기 질환 모델화 후 4일 째 baseline 심전도를 축정하였다. 그리고， 상기 질환 모델화 후 7일째에 상기 중 배엽 줄기세포를 상기 질환 모델에 주입하였으며， 8주째에 심전도를 측정하여 질환 의 호전여부를 분석하였다. 세포 수에 따른 8주째의 심전도 변화 (도 2 참조)와 심 장 수축 및 확장의 수치 등 (도 3 참조)을 바탕으로 최저 효과 세포 수를 정하였다. 최저 효과 세포 수는 세포의 각 차이를 규명하고자 할 때 필요한 것으로， 최저 효 과 세포 수 이상의 세포를 주입하면 당연히 효과는 더욱 좋아지지만 개별적 비교차 이를 보고자 할 때는 최소 효과 세포 수를 주입하는 것이 바람직하다.

<48> 도 2에 나타난 바와 같이， baseline 심전도에서는 위쪽 물결 무늬의 좌심실 심벽운동성이 없어 진 것을 알 수 있고， 8주 후 심전도에서는 위쪽 물결 무늬의 좌 심실 심벽 운동의 호전도를 볼 수 있다. 도 3은 좌심실 확장기내경 (Left ventricular end-diastol ic dimension(LVEDD)) , 좌심실 수축기내경 (Left ventricular end-systol ic dimension(LVESD)) , 좌심실 분획단축 (Left ventricular end-fractional shortening(LVFS)) , 좌심실 구혈률 (Left ventricular end-ejection fraction(LVEF))을 수치화하여 나타낸 것으로， 이때 좌심실 분획단축 (LVFS)은

LVEDD-LVESD/LVEDD로 정의되며， 좌심실 구혈를 (LVEF)은 LVEDD²-LVESD²/LVEDD²로 정 의된다. 좌심실 확장기내경 (LVEDD) 및 좌심실 수축기내경 (LVEDD)이 작을수록， 좌심 실 분획단축 (LVFS) 및 좌심실 구혈률 (LVEF)이 클수록 높은 호전도를 나타낸다. 따 라서 도 2 및 도 3의 결과로부터， 최저 효과 세포 수는 1X10⁵개로 정하는 것이 바람 직하다는 것을 알 수 있다.

<49>

<50> (2) 생체내 활성도평가

<51> 상기 실시예 1(1) 의 결과에 기초하예 상기 4종 (M01, M02, M03, 및 M04)의 중배엽 줄기세포 (passage 6-7)를 각각 상기 질환 모델 rat 1마리당 1X10⁵개 주입하 였으며, 8주째에 심전도를 측정하여 질환의 호전 여부를 분석하였다. 상기 4종의 중배엽 줄기세포 각각에 대하여 최소 7 마리 이상의 rat 를 사용하였으며 상기 질 환모델화 후 4일째 baseline심전도를 측정하였다.

<52> 심전도 측정결과를 보여주는 도 4에서 알 수 있는 바와 같이， 8주 후 4종의 줄기세포 심전도를 비교해 보면， 위쪽 물결 무늬의 좌심실 심벽운동성이 없는 baseline 심전도에 비해， M02 를 주입한 경우, 위쪽 물결 무늬의 좌심실 심벽 운동 이 상대적으로 현저히 호전된 것을 볼 수 있다. 또한 도 5에 나타난 바와 같이， M02 에서 호전도의 표지인 좌심실 확장기내경 (LVEDD) 및 좌심실 수축기내경 (LVESD) 이 작고， 좌심실 분획단축 (LWS) 및 좌심실 구혈률 (LVEF)이 현저하게 높은 것을 알 수 있 . ^'

<53> 이에 더하여 전체적인 심장의 크기 변화와 벽 두께 및 섬유화 (fibrosis)를 비교해 보았다. 도 6은 전체적인 심장의 크기 변화와 벽 두께 및 섬유화를 볼 수 있게 염색한 그림으로， 섬유화는 MT 염색을 통하여 가시화하였으며 그림에서 푸른 부분이 섬유화를 표시한다. 도 7은 섬유화 면적을， 도 8은 심장벽의 두께를 각각 수치화하여 나타낸 것아다. 일반적으로 심장이 허혈에 노출되었을 경우， 도 6와 controK중배엽 줄기세포를 주입하지 않은 군)에서 볼 수 있는 바와 같이， 심장벽 의 섬유화로 인해 심벽이 얇아지고, 운동성 상실과 부피 확장이 일어난다. 이와 관 련하여 4종의 세포들을 비교해 보면， 도 6에 나타난 바와 같이 M02 를 주입한 경우 허혈에 노출되었음에도 통상의 진행과 같은 심벽의 얇아짐， 운동성 상실 및 부피 확장 등과 같은 현상이 다른 세포들을 주입한 군에 비해 상대적으로 현저히 줄어 든 것을 알 수 있으며， 이를 수치화한 도 7 및 도 8에서도 이를 명백히 알 수 있 다.

<54> 상기 결과로부터， 4종의 유전적 기원이 다른 인간 제대혈 유래 중배엽 줄기 세포들이 중배엽 줄기세포의 in vitro 동정 평가에서는 유의적 차이가 없는 결과를 나타내지만 생체내 활성도 평가에는 차이가 있음을 알 수 있다.

<55>

<56> (3) 작용기전을통한생체내 활성도차이 검증

<57> 상기 4종의 인간 제대혈 유래 중배엽 줄기세포들의 생체내 활성도 차이를 심 혈관 질환의 호전 기전을 통해 검증해 보는 실험을 실시하였다. 통상의 허혈성 심 혈관 질환은 우선적으로 허혈 부위에 혈관을 공급하고 동시에 그 부위의 세포 사멸 을 막음으로 호전된다.

<58> 상기 4종 세포의 혈관 공급에 미치는 영향을 보기 위하여 혈관 특이적 발현 단백질인 Iso Lectin B4 의 항원 -항체반웅을 이용하여 4종의 세포를 주입시 미세 혈관의 분포를 살펴보았다. 본 실험은 8주째 rat 심장을 4%포르말린으로 고정 후, 파라핀 조직화하여 자른 후 얹은 슬라이드를 이용하여 수행하였다. 구체적으로， 슬 라이드의 조직에서 파라핀 제거 및 탈수 과정을 거친 후 혈관 특이적 1차 항체 Iso Lectin B4 을 반응시키고 12시간 후 세척한 다음， 2차 항체 FITC 를 반웅시키고 2 시간 후 세척하여 형광 현미경으로 관찰하였다. 상기ᅵ 염색결과를 도 9에 나타내었 으며， 도 10는 미세혈관 밀도 (capillary density)를 수치화하여 나타낸 것이다. 도 9의 확대한 그림 (merged) 및 도 10에서 잘 알 수 있는 바와 같이， M02 를 주입 한 경우 가장 높은 혈관 분포를 나타내었다.

<59> 또한 사멸세포의 표지인 조각 DNA(TUNEL)의 항원—항체 반웅을 이용하여 상기

4종 세포의 세포 사멸에 미치는 영향을 살펴보았다. 본 실험은 상기 미세혈관 분포 실험과 동일한 방법으로 준비된 조직 슬라이드를 이용하여， 세포 사멸시 일어나는 조각난 DNA 에 형광 표지된 dUTP를 반응 시킨 후, 형광현미경으로 관찰하는 방법을 이용하였다. 그 염색결과를 도 11에 나타내었으며， 도 12는 이를 수치화한 것이다. 도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이， M02 를 주입한 경우 세포 사멸이 가장 적게 일어난 것을 알 수 있다.

<60> 결론적으로， 4종의 유전적 기원이 다른 인간 제대혈 유래 중배엽 줄기세포들 이 중배엽 줄기세포의 in vitro 동정 평가에서는 유의적 차이가 없는 결과를 나타 내지만 생체내 활성도 평가에서는 차이를 나타내었으며， 이와 상관된 기전 연구를 통하여 그 차이를 검증할수 있었다.

<61>

<62> 실시예 2. 생체내 활성 표지자선별 및 확인

<63> 상기 실시예 1의 결과로부터， 생체내 활성도가 가장 높은 M02 와 가장 활성 도가 낮은 M01 을 이용하여 생체내 활성 차이를 예측할 수 있는 표지자 (바이오마 커)를 확인하는 실험을 실시하였다.

<64>

<65> (1) DNA array

<66> M01 및 M02 에 대하여 DNA array 를 3회 반복실시하였다. 세포를 배양 후

RNA 를 추출하여 cDNA 를 합성한 다음， 인간 유전자 올리고 탐침자가 있는 슬라이 드에 반웅시켰다. 반웅의 정도를 기준샘플 M01 과 비교하여 M02 에서 높을수록 붉 은 색의 명도가 높아지게 표시하고， 낮은 것은 녹색의 명도가 높아지도록 표시하였 다. 도 13은 M01 보다 M02 에서 발현이 높은 (up-regulated) 유전자를 붉은 색으로, M01 보다 M02 에서 발현이 낮은 ( down-regulated ) 유전자를 녹색으로 표지하여 나타 낸 것이다. 도 14는 이들 중 M02 에서 발현이 높은 세표 표면 관련 유전자 5개를 선별한 것으로 좌측 그림은 scatter plot 형식으로 나타낸 그림이며， M02 에서 발 현이 2배 이상 높은 유전자들을 보여주고 있다. 도 14의 우측 그림은 M02 에서 발 현이 높은 유전자만을 붉은 색으로 따로 분류하여 표시한 것이다.

<67>

<68> (2) R A및 단백질 수준에서의 발현 비교

<69> 상기 DNA array결과 선별된 5개의 유전자에 대하여 RNA 및 단백질 수준에서 의 발현을 비교하였다. M01 및 M02 를 배양 후 RNA를 추출하고, 중합 효소를 이용 하여 cDNA를 합성하였다. 이 후 상기 DNA array에서 선별된 5종의 유전자들에 대한 특이적 프라이머 (primer)를 이용하여 real-time PCR 로 확인한 결과를 도 15에 나 타내었다. 또한 M01 및 M02 를 배양 후 trypsin 으로 처리하여 single cell 로 분 리한 다음, 상기 DNA array에서 선별된 5종의 유전자들에 대한 항체를 이용하여 반 웅시키고, 2차 항체 반웅 후 형광세포분석기 (FACS) 로 단백질 수준에서 확인한 결 과를 도 16에 나타내었다.

<70> 상기 RNA 및 단백질 수준에서의 확인 결과， M01 에 비해 M02 에서 현저하게 높은 발현을 나타내는 2개의 표지자 (CD146 과 N-cadherin)가 최종적으로 선별되었 다.

<71>

<72> (3) CD146및 N-cadherin의 단백질 발현과생체내 활성 비교

<73> 최종 선별된 상기 두 유전자 CD146 및 N-cadherin 에 대하여 상기 4종 세포 내에서의 단백질 발현 수준을 양적으로 비교하는 실험을 실시하였다.

<74> 구체적으로 M01, M02, M03, 및 M04를 배양 후 (passage 7), 단백질을 분리하 여 CD146 및 N-cadherin 각각에 대하여 항원 -항체 반웅을 이용한 western blot 을 실시하였다. 상기 방법은 세포를 환원제로 용해시킨 후 SDS-polyacrylamide (폴리아 크릴아미드) gel 전기영동하고 Coomassie brilliant blue 로 염색하여， 전기영동으 로 분리된 단백질 대 (band)를 확인하거나 nitrocel lulose (니트로셀를로오즈) 또는 nylone membrane (나일론 막)에 옮긴 후 항원 -항체 반응을 이용하여 특정 항체에 대 한 항원 (단백질)을 찾아내는 기법이다. CD146 에 대하여는 항원 -항체 반웅을 실시 후 형광세포분석기 (FACS)를 이용하여 단백질 발현 정도를 추가적으로 비교 확인학 였다. 도 17은 CD146의 western blot 및 FACS 결과를 나타낸 것이며， 도 18은 N- cadherin의 western blot 2회 실시 결과를 나타낸 것이다.

<75> 도 17에서 알 수 있는 바와 같이， CD146 의 경우 M02 에 비해 M04 에서 더 많이 발현되는 것으로 나타났다. 상기 결과는 CD146 의 발현은 상기 4종의 세포간 생체내 활성도의 차이 (M02> M03> M04> M01)와 상관관계가 형성 되지 않음을 시사하 는 것이며， 따라서 CD146 은 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성도의 차이를 표지 할 수 있는 적 절한 바이오마커가 아님을 의 미 한다. N-cadherin 의 경우， 도 18에 나타난 바와 같이 N-cadherin 의 단백질 수준에서의 발현이 상기 4종의 세포간 생 체내 활성도의 차이 (M02> M03> M04> M01)와 상관관계가 형성됨을 알 수 있다.

<76> 상기 결과로부터， 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성도의 차이를 표지할 수 있는 바이오마커로 N-cadherin 이 선별되 었다 .

<77>

<?8> 실시예 3. N-cadherin의 생리활성 확인

<79> 상기 실시 예 2로부터 인간 중배엽 줄기세포의 바이오마커로 확인된 N- cadherin 에 대하여 그 구체적 인 생리활성을 확인하는 실험을 실시하였다 .

<80>

<8 i> (1) ERK 및 /또는 AKT에 대한 영향

<82> 세포의 생리기 전 설명시 ERK 와 AKT 의 인산화를 통한 활성화는 세포의 활성 을 나타내는 가장 핵심 적 인자들이다 . 따라서 먼저 Ca (칼슘) -의존적 세포간 부착 인자인 cadherin 의 상기 인자들에 대한 효과를 알아보는 실험을 실시하였다. 구체 적으로 N-cadherin 발현이 높은 M02 를 80-90% 가 채워지는 정도로 배양 후 Ca-의 존적 세포간 부착을 파괴하기 위하여 칼슴 chelator 인 EDTA 를 처 리하였다. 이 후 다시 부착 인자들의 활성을 유도하기 위하여 CaCl₂(염화칼슘)를 처 리 한 다음， ERK 및 /또는 AKT의 인산화에 의 한 활성화를 보기 위하여 30분 , 1시간， 및 2시간 간격으 로 세포를 채취 (sampl ing)하였다 .

<83> 도 19에 나타난 바와 같이， Ca-의존적 세포간 cadherin 부착을 파괴하기 위 한 칼슘 chelator 인 EDTA 처 리 (+) 후 AKT의 인산화에 의 한 활성화는 변화가 없으 나， ERK의 활성화 (pERK)가 억제되는 것이 관찰되 었다 (도 19, lane 2 참조) . 반면， Ca-의존적 세포간 부착 인자들의 재부착을 유도하기 위한 CaCl₂ 처 리 그룹에서는

ERK의 인산화에 의 한 활성화가 다시 증가되는 것으로 나타났다. 일반적으로 상기 ERK 및 AKT의 활성화는 세포의 종류와 조건에 따라 달라지며， 통상적으로는 30분에 서 2시간 사이에 적정 시 간대를 잡을 수 있다 . 본 실험을 통하여 인간 제대혈 유래 중배엽 줄기세포의 Ca-의존적 세포간 부착 인자인 cadherin 은 AKT가 아닌 ERK의 인산화에 의한 활성화를 조절하는 기능을 가지며, CaCl₂처리후 활성화 증가를 가장 잘볼 수 있는 시간대가 1시간째임을 알 수 있다 (도 19， lane 4참조).

<84> 이에 더하여 상기 도 19의 결과가 Ca-의존적 세포간 부착 인자인 cadherin 중 N-cadherin 에 의한 것인지를 알아보기 위하여 N-cadherin blocking antibody ( 항체) 처리 후 반웅을 살펴보았다. 구체적으로 N-cadherin 발현이 높은 M02 를 80- 90% 가 채워지는 정도로 배양 후 Ca-의존적 세포간 부착을 파괴하기 위하여 칼슴 chelator 인 EDTA를 처리하였다. 이 후 N-cadherin 또는 CD146 중화기능을 가진 항체를 이용하여 N-cadherin또는 CD146 의 기능을 억제하고， 다시 부착 인자들의 활성을 유도하기 위하여 CaCl₂ 를 처리한 다음, 도 19의 결과에서 도출된 ERK의 활 성화를 보기 위하여 처리 후 1시간째 세포를 sampling하였다.

<85> 도 20에 나타난 바와 같이， 전체 ERK(tERK) 에 대비하여 ERK의 인산화 (pERK) 에 의한 활성화가 N-cadherin blocking 에 의해 억제되는 것을 볼 수 있다 (도 20， lane 4 참조). Control (대조군)로 사용한 CD146 blocking antibody 의 경우, N- cadherin blocking antibody를 사용했을 때와는 달리 pERK 에 아무런 변화가 없음 을 알 수 있다 (도 20， lane 3참조).

<86>

<87> (2)세포사멸에 미치는효과

<88> N-cadherin의 세포 사멸에 미치는 효과를 살펴보기 위해 R A 수준에서 발현 을 억제 할 수 있는 siRNA 기법을 이용하였다. 구체적으로， 세포내 유전자의 발현 을 억제 시키는 siRNA 기법은 RNA 와 100% 동일한 염기 19개를 체외에서 합성 후 세포내로 주입하여 RNA 수준에서부터 억제하여 최종적으로 단백질 발현을 억제시키 는 기법으로， 체외에서 합성된 RNA 와 100%동일한 염기 19개는 체내에서 상동 R A 와 결합하여 이중 R A를 만들게 되고 세포는 이를 인지하여 잘게 잘라 분해한다. 상기 방법으로 만들어진 N-cadherin siRNA 를 세포내로 주입하여 발현 억제를 확인 한 후 세포 사멸 정도를 관찰한 결과를 도 21에 나타내었으며， 도 22는 세포를 70% EtOH (에탄올)로 고정하고， 세포 핵을 요오드화 ^로피디움 (Propidium Iodide, PI) 염색 후 FACS 를 sub G1 (도 22의 Ml 부분)으로 축정하여 세포 사멸이 일어난 세 포를 관찰한 결과이다. Sub G1을 이용하면 2nᅳ 4 n의 세포;주기에 포함되지 않는 세포사가 일어난 세포의 비율을 확인할 수 있다.

<89> 도 21에 나타난 바와 같이， 무작위， 불매치 서열의 합성 siRNA 가 주입된 Cont si 세포 그룹과 비교하여 N-cadherin siRNA 그룹에서는 세포와 세포 사이의 결합력 이 떨어져 있음을 알 수 있고， 도 22에 나타난 바와 같이 이와 함께 세포사 도 증가되는 것을 알 수 있다 (5.8% v . 8.0%) . 상기 결과로부터 N— cadherin 은 세 포간의 결합 및 이를 통한 세포 사멸의 조절에도 관여하고 있는 것으로 나타났다 .

<90>

<91> (3) 중배엽 줄기세포의 분비능에 대한 효과

<92> 심 혈관 질환 호전의 주요 paracrine factor 인 VEGF 에 대한 N-cadherin 의 효과를 살펴보았다 . 구체적으로 , N-cadherin 발현이 높은 M02 를 80-9OT 가 채워지 는 정도로 배양 후 Ca-의존적 세포간 부착을 파괴하기 위하여 칼슴 chelator 인 EDTA 를 처 리하였다 . 이후 N-cadherin 중화기능을 가진 항체를 이용하여 N- cadherin 기능을 억제하고 , 다시 부착 인자들의 활성을 유도하기 위하여 CaCl₂ 를 처 리하고 24시간 후 배양액과 세포를 수집하였다 . 수집된 배양액에 VEGF 항원 -항체 반웅을 유도 하여 그 양을 정량화 하고 (도 23의 ELISA 결과 참조)， 세포의 RNA를 추출 후 중합 반웅을 유도하여 VEGF의 발현량을 확인하였다 (도 23의 RT-PCR 결과 참조) .

<93> 도 23에 나타난 바와 같이， control 로 사용된 IgG 를 첨가한 경우에 비하여

N-cadherin 중화기능을 가진 항체를 이용하여 N-cadherin 기능을 억제한 그룹 (neuN-cad)에서 VEGF 가 RNAC RT-PCR 결과 참조) 및 단백질 수준 (ELISA 결과 참조) 에서 모두 억제되는 것을 알 수 있다 . 상기 결과로부터 N-cadher in 은 중배엽 줄기 세포의 대표적 특성 중 하나인 분비능 조절에도 관여하고 있는 것으로 나타났다 .

<94>

<95> (4) 혈관 형성능에 대한 효과

<96> 혈관 형성시 N-cadher in 의 역할을 보기 위 한 실험을 실시하였다. 통상적으

TM

로 혈관 형성능을 보기 위하여 사용하는 성장인자가 적은 matrigel BD 을 사용하 였다 . 구체적으로 , matr igel BD (BD Biosciences 제조)을 코팅 후 37^°C 에서 고 형화를 유도한 배양 디쉬 (di sh)에 세포 (M01 , M02)를 뿌린 후 12시간째 N-cadherin 염 색하여 M01 및 M02 단독으로 유사 혈관을 형성하는 능력을 관찰하여 그 결과를 도 24에 나타내었다 . 통상적으로 혈관을 직접 적으로 만드는 혈관내피세포가 아닌 세포에 의해 만들어지는 체외 튜브 형성 결과는 체내에서 직 접 적 증명을 하기 전에 는 모두 유사 혈관 형성능으로 분류한다. 도 24 에 나타난 바와 같이， N-cadherin 의 발현이 높은 세포 (M02)가 N-cadherin 의 발현이 낮은 세포 (M01)에 비하여 자체 적으로도 유사 혈관 형성도가 높은 것을 알수 있다.

또한 M01 및 M02를 인간 탯줄 혈관 내피세포 (HUVEC)와 matrigel 에 흔합 배

TM

양하여 전형적 혈관 형성 정도를 관찰하였다. 구체적으로, matrigel BD 을 코팅 후 37^°C 에서 고형화를 유도한 배양 dish 에 M01 또는 M02 와 인간 탯줄 혈관 내 피세포 (HUVEC)를 동일 수로 뿌린 후 관찰하였다. 또한 M02 에 대하여 트립신 (trypsin)을 처리한 후, N-cadherin 중화기능을 가진 항체를 이용하여 N-cadherin 기능을 억제시킨 다음 (neuN-cad), 인간 랫줄 혈관 내피세포와 동일한 수로 뿌린 후 상기 항체를 처리하지 아니한 M02 의 경우와 비교하여 도 25에 나타내었다. 도 25에서 알 수 있는 바와 같이， N-cadherin 의 발현이 높은 M02 의 경우 혈관내피세포와의 혈관 형성 기여능이 높았으며， N-cadherin 항체 처리시 혈관 형 성능이 저하되는 것으로 나타났다. 상기 결과로부터 M02 에서 혈관 형성능이 높게 나타난 것은 N-cadherin 에 의한 것임을 확인할 수 있으며， 이는 N-cadherin 이 혈 관 손상 질환의 호전에 중요한 인자인 혈관 형성능의 조절에도 관여한다는 것이 명 백하다.

결론적으로， N-cadherin은 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성도의 차이를 표지할 수 있는 바이오마커일 뿐만 아니라 다양한 생체 활성 조절 인자로도 작용하 는 것으로 나타났다.

【산업상 이용 가능성】

본 발명은 인간 중배엽 줄기세포의 바이오마커를 이용하여 상이한 유전적 배 경 또는 기원을 가지는 여러 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성도를 표식화 하고 이를 도표화 · bank 화하여 궁극적으로 규격화하는 것을 가능하게 하며， 나아가 세포치료 및 재생의학에 필요한 고기능의 적절한 인간 중배엽 줄기세포수의 도출을 가능하게 한다. 궁극적으로 본 발명은 인간 중배엽 줄기세포의 세포치료제로서의 효율성을 증대시킴으로서 세포치료제의 실용화를 앞당기는데 기여할 수 있을 것으 로 기대되며 나아가 심혈관계질환， 신경계질환 등의 난치병 치료제 개발에 크게 기 여할 수 있을 것이다.

Claims

【청구의 범위】

【청구항 1】

하기 단계들을 포함하는， 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성 표지자 (바이 오마커)를 선별하는 방법 : - a) 생체내 활성도가 상이한 인간 중배엽 줄기세포들에 대하여 DNA 어레이 (array)를 실시하는 단계 ;

b) 상기 인간 중배엽 줄기세포간 발현의 차이를보이는 유전자들을 선별하는 단계 ; 및

c) 상기 유전자들 중 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성도 차이를 표지하 는 바이오마커를 확인하는 단계.

【청구항 2】

제 1항에 있어서, 상기 인간 중배엽 줄기세포들은 체외 (in vitro) 동정 평가 에서 유의적 차이가 없는 결과를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.

【청구항 3]

제 1항에 있어서， 상기 생체내 활성도는 심혈관 질환을 호전시키는 능력을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 .

【청구항 4】

제 3항에 있어서， 상기 심혈관 질환의 호전도는 허혈성 심혈관 래트 (rat) 모 델을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.

【청구항 5】

제 4항에 있어서， 상기 심혈관 질환의 호전도의 측정은 상기 질환 모델에 상 기 인간 중배엽 줄기세포를 주입 후 4주 내지 8주째 측정한 심전도 결과를 비교하 는 것을 포함하는 방법.

【청구항 6】

제 5항에 있어서， 상기 인간 중배엽 줄기세포를 상기 질환 모델화 후 7내지 10일째 주입하는 것을 특징으로 하는 방법.

【청구항 7】

제 6항에 있어서， 상기 인간 중배엽 줄기세포를 상기 질환 모델 래트 1마리 당 1X10⁵개 주입하는 것을 특징으로 하는 방법.

【청구항 8】

제 1항에 있어서， 상기 인간 중배엽 즐기세포는 인간 제대혈 유래 중배엽 줄 기세포인 것을 특징으로 하는 방법 .

【청구항 9】

제 1항에 있어서， 상기 b) 단계의 유전자에 대하여 RNA 수준 및 단백질 수준 에서 그 발현의 차이를 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 . 【청구항 101

제 1항에 있어서， 상기 c) 단계는 상기 b) 단계에서 선별된 유전자들에 대하 여 그 단백질의 양적 발현 수준과 생체내 활성도와의 상관관계를 확인하는 것을 특 징으로 하는 방법 .

【청구항 111

제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 선별된 인간 중배엽 줄 기세포의 바이오마커 .

【청구항 12]

제 11항에 있어서 , 상기 바이오마커는 심 혈관 질환을 호전시키는 것에 관여 하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 .

【청구항 13]

제 11항에 있어서， 상기 바이오마커는 혈관 형성능을 증가시 키는 것을 특징 으로 하는 바이오마커 ᅳ

【청구항 14]

제 11항에 있어서， 상기 바이오마커는 인간 중배엽 줄기세포의 분비능의 조 절에 관여하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 .

【청구항 15】

제 11항에 있어서， 상기 바이오마커가 N-cadherin 인 바이오마커 .

【청구항 16]

하기 단계들을 포함하는， 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성 표식화 시스 템：

a) 다양한 유전적 배경 또는 기원을 가지는 인간 중배엽 줄기세포들에 대하 여 N-cadherin 유전자의 발현을 확인하는 단계 ; 및

b) 상기 인간 중배엽 줄기세포들에 대하여 상기 N-cadherin 의 단백질 수준 에서의 발현정도를 비교 분석하는 단계 .

【청구항 17】

제 16항에 있어서， 상기 생체내 활성은 심 혈관 질환을 호전시 키는 능력을 포 함하는 것을 특징으로 하는 시스템 .

【청구항 18】

하기 단계들을 포함하는， 인간 중배엽 줄기세포의 생체내 활성 표지자 (바아 오마커 )를 선별하는 방법 :

a) 생체내 활성도가 상이 한 인간 중배엽 줄기세포들에 대하여 DNA 어 레이 (array)를 실시하는 단계 ;

b) 상기 인간 중배엽 줄기세포들 중 가장 높은 생체내 활성을 보이는 세포에 서 상대적으로 현저하게 발현되는 유전자들을 선별하는 단계 ; 및

c) 상기 유전자들 중 그 단백질 발현 수준이 상기 중배엽 줄기세포들의 생체 내 활성도 차이와 상관관계를 가지는 유전자를 확인하는 단계 .

【청구항 19】

제 18항에 있어서， 상기 인간 중배엽 줄기세포들은 체외 ( in vitro) 동정 평 가시 유의 적 차이가 없는 결과를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법 .

【청구항 20】

제 18항에 있어서 , 상기 생체내 활성도는 심 혈관 질환의 호전도를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법 .

[청구항 21】

제 18항에 있어서， 상기 인간 중배엽 줄기세포는 인간 제대혈 유래 중배엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법 .