WO2011086211A1 - Sistema de autolisis celular para el procesado de la biomasa bacteriana en la producción de polihidroxialcanoatos en pseudomonas putida kt2440 - Google Patents

Sistema de autolisis celular para el procesado de la biomasa bacteriana en la producción de polihidroxialcanoatos en pseudomonas putida kt2440 Download PDF

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WO2011086211A1
WO2011086211A1 PCT/ES2010/070858 ES2010070858W WO2011086211A1 WO 2011086211 A1 WO2011086211 A1 WO 2011086211A1 ES 2010070858 W ES2010070858 W ES 2010070858W WO 2011086211 A1 WO2011086211 A1 WO 2011086211A1
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WO
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strain
pseudomonas putida
lytic
pha
microorganism
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PCT/ES2010/070858
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Virginia MARTÍNEZ LÓPEZ
Eduardo DÍAZ FERNÁNDEZ
Pedro GARCÍA GONZÁLEZ
José Luís GARCÍA LÓPEZ
Estrella DUQUE MARTÍN DE OLIVA
Juan Luís RAMOS MARTÍN
María Auxiliadora PRIETO JIMÉNEZ
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/78—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Pseudomonas
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a bacterial strain of Pseudomonas putida KT2440, which comprises a lytic heterologous genetic system where said system in turn comprises the nucleotide sequence encoding the lytic cell wall enzyme endolysin Ejl, the nucleotide sequence encoding holina Ejh , and a nucleotide sequence encoding a gene regulation system, which in turn comprises a nucleotide sequence promoting gene expression, and a nucleotide sequence encoding and expressing a regulatory protein for said gene expression.
  • the strain is the microorganism with CECT deposit number 7659.
  • the present invention also relates to said strain where the Pseudomonas putida KT2440 microorganism is mutant in one or more of the tol-pal genes.
  • said strain is the microorganism with deposit number CECT 7658.
  • the present invention relates to the use of any of the strains described for the extraction of polyhydroxyalkanoate (PHA) synthesized by said bacterium as well as to a method for the extraction of said compound.
  • PHA polyhydroxyalkanoate
  • Bioprocess technology has undergone considerable progress in recent years trying to improve and adapt modern biotechnology to classical fermentation technologies. In this sense, recombinant DNA technology or, in a broader concept, molecular biology techniques, have been decisive so that a large number of organisms can be exploited and manipulated for the production of compounds of interest. To a large extent, this success has been possible thanks to the development of gene expression systems in heterologous organisms that are easier to manipulate and multiply.
  • PHAs commonly known as “bioplastics” are biodegradable polymers produced by certain bacteria, which accumulate inside the cell in the form of carbon source reserve granules when culture conditions are not optimal for growth (Madison and Huisman , 1999. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63: 21-53; Prieto et al. 2007. Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Model System in Biology. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, JL and Filloux, A. Springer, 397-428).
  • biopolymers are biodegradable and the bacteria synthesize them from renewable sources such as glucose, fructose or fatty acids that are part of vegetable oils. Therefore, the term bioplastic can be defined as a biopolymer synthesized from renewable sources, which can be biodegraded under controlled conditions and that presents physicochemical characteristics similar to plastics derived from the petrochemical industry (Sarasa et al. 2009. Bioresour. Technol. 100: 3764-3768).
  • PHA granules are composed of a polyester (93-97% of the dry weight of the granule [PSG]) surrounded by phospholipids (1-6% of PSG) and granule-associated proteins (GAPs) (1 -2% of PSG), which form a thin layer on the surface of the granule (Steinbüchel et al. 1995. Can. J. Microbio /., 41: 94-105).
  • GAPs three classes of GAPs have been defined in bacteria: i) PHA synthases, involved in the polymerization of PHA, ii) PHA depolymerases, responsible for bioplastic degradation and iii) fasines, the most abundant GAPs, with a structural or regulatory function (Prieto et al. 1999a. Appl. Environ. Microbio!., 65: 3265-3271; Moldes et al., 2004. Appl. Environ. Microbio!., 70: 3205-3212).
  • PHAs are classified into two main types according to their chemical structure: short chain PHAs (scl-PHAs) obtained from monomers with 4 or 5 carbon atoms and medium chain (mcl-PHAs) monomers from monomers with 6 to 14 carbon atoms.
  • the different PHAs identified to date are linear polymers composed of fatty 3- hydroxy acids exclusively of the R (RHAs) configuration.
  • the molecular weight of these polymers varies between 50,000-1,000,000 and their diversity lies in the substitutions in the asymmetric carbon in position 3, which gives the polymer the chiral character (Prieto et al. (1999b) J. Bacterium !. 181 : 858-868).
  • composition of the polymer depends on the source of carbon present in the culture medium used during the fermentation of the producing bacteria (Durner, et al. 2001. Biotechnol. Bioeng., 72: 278-288, Jung et al. 2001. Biotechnol. Bioeng., 72: 19-24).
  • PHAs can also be useful for biomedical applications such as biomaterials (Zinn et al. 2001. Adv. Drug. Deliv. Rev., 53: 5-21).
  • PHA can be considered as a source of new chiral compounds (synthons) of great utility as precursors in the pharmaceutical industry, since they are difficult to achieve in pure state by conventional chemical processes.
  • bacteriophages or phage abbreviated
  • filamentous ones are lithic and break the wall of the host bacteria until their complete lysis.
  • phages use two proteins that act in a perfectly coordinated way: a holine and an endolysin.
  • the genes that encode these proteins are usually contiguous and their transcription and translation is late, starting only when the virions are in their final phase of packaging within the bacterial cytoplasm.
  • the holines constitute a group of phage proteins of very varied primary structure but which are grouped into three classes and functionally are very similar in their mode of action.
  • Endolysins are lytic enzymes encoded by phages, do not have a secretion signal peptide, accumulate in the cytoplasm during the vegetative cycle and are translocated to the cell wall through the pore formed by the oligomerization of holine.
  • the endolisins can be muramidases, glucosaminidases, transglycosylases, amidases or endopeptidases (Hermoso et al. (2007) Curr. Op. Microbiol .10: 461-472).
  • the Tol-Pal complex of bacteria is organized into two protein complexes: an inner membrane complex consisting of TolQ, TolA and ToIR proteins that interact with each other through transmembrane domains, and another membrane-associated complex external composed of TolB and Pal proteins, which also interacts with Lpp, OmpA and peptidoglycan (Lazzaroni et al. 1999. FEMS Microbiol. Lett., 177: 191-197). These proteins are located forming complexes in the cell envelope of Gram-negative bacteria, and are critical for maintaining the structure of the envelope. The alteration of the same leads to situations of weakening of the cell and increased sensitivity to detergents or chelating agents (Llamas et al. 2000. J. Bacterium!., 182: 4764-4772).
  • the present invention relates to a bacterial strain of Pseudomonas putida KT2440, which comprises a lytic heterologous genetic system where said system in turn comprises the nucleotide sequence encoding the lytic cell wall enzyme endolysin Ejl, the nucleotide sequence encoding holina Ejh , and a nucleotide sequence encoding a gene regulation system, which in turn comprises a nucleotide sequence promoting gene expression, and a nucleotide sequence encoding and expressing a regulatory protein for said gene expression.
  • the strain is the microorganism with deposit number CECT 7659.
  • the present invention also relates to said strain where the microorganism Pseudomonas putida KT2440 is mutant in one or more of the tol-pal genes.
  • said strain is the microorganism with deposit number CECT 7658.
  • the present invention relates to the use of any of the strains described for the extraction of polyhydroxyalkanoate (PHA) synthesized by said bacterium as well as to a method for the extraction of said compound.
  • PHA polyhydroxyalkanoate
  • a solution is offered to the extraction of compounds produced by the bacteria Pseudomonas putida KT2440, and particularly the extraction of polyhydroxylacanoates thereby decreasing the use of contaminating chemicals used to lyse the producing cells.
  • the results of the cell autolysis in two bacterial strains deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT) are shown in the examples of the present invention.
  • the two strains comprise a lytic heterologous genetic system that expresses genes involved in the degradation of the cell wall and in the permeability of the cell membrane, whose expression is controlled by a regulator system of expression dependent on an inducer.
  • the two strains described above and deposited in the CECT carry the lytic heterologous genetic system in monocopy.
  • the recombinant strain CECT 7659 that carried the lytic heterologous genetic system in monocopy was more stable than the native strain transformed with the plasmid carrying the lithic system in multicopy.
  • mutations in the tol-pal genes cause instability of the outer cell membrane in the Pseudomonas putida KT2440 bacteria and allows the periplasmic proteins to be secreted and the bacteria lysed in the presence of some detergents and EDTA.
  • this mutation could be useful for inducing lysis by detergent and EDTA in PHA producing cells.
  • the presence of PHA instead of destabilizing the mutant cell in the tol-pal genes made the cell more stable and insensitive to lysis by the detergent and the EDTA chelating agent. Therefore, this mutation was unusable for the proposed purpose.
  • the mutant Pseudomonas putida KT2440 bacteria in the tol-pal genes was not individually useful for the proposed purpose, it was analyzed whether the combination of this lysis system of the mutant strain in the tol-pal genes with the lytic heterologous genetic system in monocopy of the present invention, generated some unexpected synergistic effect that would propitiate cell lysis under the desired conditions.
  • a synergic effect of the threshold type is generated, a priori unpredictable, in such a way that until all elements are not combined in a precise way, the threshold of de-structuring of the cell envelope necessary for lysis and therefore the cell is not exceeded. It remains perfectly viable. Under these conditions, the release of the compounds contained in the cell cytoplasm occurs with high efficiency in the presence of a detergent and a chelating agent only when the lytic heterologous genetic system is induced in monocopy, thus becoming the new recombinant strain created (CECT 7658 ) in a new body very useful for the proposed objective.
  • one aspect of the present invention relates to a bacterial strain of Pseudomonas putida KT2440, which comprises a lytic heterologous genetic system where said system in turn comprises the nucleotide sequence encoding a lytic cell wall enzyme, the nucleotide sequence that encodes a holine, and a regulatory system of gene expression.
  • the lytic cell wall enzyme is a protein capable of breaking the cell wall or the substances that make up that wall.
  • Said lithic enzyme can come from bacteria, fungi, yeasts, plants, animals or bacteriophages.
  • the lytic cell wall enzyme is selected from the list comprising, but not limited to, Exl of the bacteriophage EJ-1 of Streptococcus pneumoniae, Cpl-1 of the bacteriophage Cp-1 of Streptococcus pneumoniae, transglicosidase R of the bacteriophage ⁇ of Escherichia coli, lysozymes of bacteriophage P22 from Salmonella and bacteriophage T4 from Escherichia coli, protein E from bacteriophage 0X174 from E. coli, Sgl transglicosidase and AmiA amidase from Escherichia coli (Young, R. 1992. Microbiol. Rev. 56: 430-481).
  • Holin is a phageal protein with transmembrane domains that is located in the cytoplasmic membrane forming a pore that allows the passage of the lytic enzyme responsible for breaking the bacterial wall and causing lysis.
  • Holines have a very varied primary structure but are grouped into three classes and functionally they are very similar in their mode of action. Said holina comes from a bacteriophage.
  • said holina is selected from the list comprising, but not limited to, Exh of bacteriophage EJ-1 of Streptococcus pneumoniae, Cph-1 of bacteriophage Cp-1 of Streptococcus pneumoniae, holina of bacteriophage 06 of Pseudomonas phaseolicola, holina S of bacteriophage ⁇ of Escherichia coli, holina from bacteriophage P22 from Salmonella (Young, R. 1992. Microbiol. Rev. 56: 430-481).
  • the scientific classification of the bacteria of the present invention is: Kingdom: Bacteria I Division: Proteobacteria I Order: Pseudomonadales I Family: Pseudomonadaceae Genus: Pseudomonas Species: Pseudomonas putida.
  • the complete genome sequence of Pseudomonas putida KT2440 has been disclosed by Nelson et al., (2002) (Nelson et al., 2002. Environ Microbiol., 4 (12): 799-808).
  • the access number of the complete sequence of Pseudomonas putida KT2440 is AE015451 .1 and its taxonomic identification (Taxonomy ID) is 160488.
  • lytic heterologous genetic system refers to a genetic construct that comprises nucleotide sequences that correspond to one or more different organisms of Pseudomonas putida.
  • the lytic cell wall enzyme and holine may be the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence of the proteins that have such activity, from phage of Streptococcus pneumoniae, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Bacillus subtilis or Bacillus megaterium.
  • said sequences come from phage EJ-1 of Streptococcus pneumoniae.
  • gene expression regulation system refers to a set of nucleotide sequences that regulate the expression of the "lytic heterologous genetic system” and can be heterologous or not, that is, these sequences may or may not come from Pseudomonas putida. That is, said term refers to a set of nucleotide sequences that have an effect on the functionality of a nucleotide sequence with respect to the beginning of transcription or the start of translation of an RNA sequence or other sequences.
  • genes of gene expression are those that are called inducible regulatory systems that are constituted by one or more nucleotide sequences called promoters / operators and by one or more nucleotide sequences that encode and express one or more proteins.
  • regulators that activate or repress gene expression in the presence of one or more compounds called inducers.
  • An example of gene expression activator is the Pseudomonas putida XyIS protein that belongs to a family of transcriptional regulators called XyIS / AraC, involved in stimulating the transcription of at least 90 different proteins involved in different cellular processes such as the metabolism of carbon, pathogenesis and the response to alkylating agents in bacteria.
  • the gene expression regulatory protein is selected from the list comprising, but not limited to, any protein that can act as a regulator of gene expression in Pseudomonas putida.
  • a preferred embodiment relates to the bacterial strain of Pseudomonas putida KT2440, which comprises a lytic heterologous genetic system, where the lytic cell wall enzyme is the endolysin Ejl, the holine is the Ejh protein, and the gene expression regulatory system is xyl / Pm.
  • Nucleotide sequences encoding Ejl endolysin and Ejh holine may, for example, but not be limited to, from phage of Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis or Bacillus megaterium. Preferably said sequences come from phage EJ-1 of Streptococcus pneumoniae. Said nucleotide sequences may be part of a cassette in which the ejl sequence precedes the ejh sequence, in the 5 ' to 3 ' direction .
  • the gene expression regulatory sequence, xyl / Pm consists of a nucleotide sequence that encodes and expresses the XyIS protein, a transcription regulator of the TOL plasmid promoter that regulates the expression of the Pm promoter of the target degradation pathway.
  • the XyIS protein belongs to the family of XyIS / AraC transcription regulators.
  • Pm has two motifs called A and B, whose sequences are TGCA and GGNTA, respectively. These motifs are repeated in the Pm promoter and as a consequence the XyIS protein monomers bind to said repetitions, activating transcription.
  • an activator such as, but not limited to, 3- methylbenzoic acid (hereinafter 3-MB).
  • the lytic heterologous genetic system described in previous paragraphs may also comprise a resistance marker that allows the selection of the bacteria that contain said system.
  • antibiotic resistance genes are an important tool in genetic engineering in general. Antibiotic resistance genes have the ability to deactivate selectively certain antibiotics and, consequently, protect the cells against those antibiotics. An antibiotic resistance gene, therefore, can be used to betray the existence of the lytic heterologous genetic system of the present invention.
  • the antibiotic gene is linked to said system before being transformed into the recipient bacterial cell. These cells are then incubated in the presence of the antibiotic. Only the cells that reproduce under these conditions are the ones that will have incorporated the antibiotic resistance gene along with that genetic system.
  • the marker confers resistance to the cells against the antibiotic kanamycin.
  • the marker can confer resistance against chemicals or against the presence of unusual nutrients.
  • a preferred embodiment of the present invention relates to any bacterial strain derived from Pseudomonas putida KT2440, described in previous paragraphs, where said strain is the microorganism with CECT deposit number 7659. Said microorganism has been deposited in the Spanish Type Culture Collection ( CECT) on December 16, 2009, the deposit number CECT 7659 corresponded to it. The address of said International Deposit Authority is: University of Valencia / Research building / Campus of Burjassot / 46100 Burjassot (Valencia).
  • the strain CECT 7659 comprises a lytic heterologous genetic system.
  • This strain has the ejh and ejl genes that encode a holine (Ejh) and a lytic enzyme (Ejl) of the bacteriophage EJ-1, respectively, under the transcriptional control of the Pm promoter (ejh-ejl cassette, xyIS regulatory construction) / Pm and a kanamycin resistance gene).
  • the nucleotide sequence that codes for holina Ejh is SEQ ID NO: 1 and the sequence that codes for endolysin Ejl is SEQ ID NO: 2 (get ejh-ejl; Accession number NC_005294.1), and the nucleotide sequence of components of the xyl / Pm gene expression regulatory system is SEQ ID NO: 5 for Xyl (Accession number NP_542858) and SEQ ID NO: 6 for Pm (Accession number X01 103).
  • KTHL can be used interchangeably.
  • strain CECT 7659 The culture and maintenance conditions of strain CECT 7659, communicated to the International Deposit Authority, are:
  • Another preferred embodiment refers to any strain derived from the strain Pseudomonas putida KT2440 comprising said lithic heterologous system, wherein said bacterial strain of Pseudomonas putida KT2440, described in previous paragraphs, is mutant in one or more of the tol-pal genes.
  • the term "mutant" as used in the present invention refers to the sequence resulting from the deletion of the tol-pa genes.
  • the Pseudomonas putida KT2440 cell mutant in at least one or more of the tolpalar genes is selected from the lysia comprising Pseudomonas putida KT2440 AX (tolA :: xylE which generates a TolA protein shortened to 94 amino acids), Pseudomonas putida KT2440 BX (tolB :: xylE that generates a TolB protein shortened to 29 amino acids), Pseudomonas putida KT2440 QX ⁇ tolQr.xylE that generates a TolQ protein shortened to 17 amino acids) or Pseudomonas putida KT2440 RX (tolR :: xylE that does not generate a ToIR protein because the toIR gene is deleted).
  • a more preferred embodiment refers to the strain described in the previous paragraph, mutant in one or more of the tol-pal genes, wherein said strain is the microorganism with deposit number CECT 7658.
  • the strain CECT 7658 corresponds to the strain of Pseudomonas putida KT2440 BX (tolB :: xylE that generates a TolB protein shortened to 29 amino acids).
  • This strain has mutated the gene that encodes the TolB protein of the Tol-Pal system (P. putida KT2440 tolB :: xylE, with TolB shortened to 29 amino acids).
  • the promoter Pm cassette ejh-ejl, regulatory construction xylS / Pm and a kanamycin resistance gene.
  • strain CECT 7658 in addition to presenting the mutation of the tol-pal genes comprises the lytic heterologous genetic system where the nucleotide sequence that codes for holina Ejh is SEQ ID NO: 1, the sequence that codes for endolysin Ejl ( marry ejh-ejl) is SEQ ID NO: 2, and the nucleotide sequence encoding the regulatory sequence of gene expression xyl / Pm is SEQ ID NO: 5 for Xyl and SEQ ID NO: 6 for Pm.
  • BXHL can be used interchangeably.
  • strain CECT 7658 The culture and maintenance conditions of strain CECT 7658, communicated to the International Deposit Authority, are:
  • the lytic heterologous genetic system can be introduced into cells by transforming vectors that contain said genetic system.
  • the transformation may result in a transient expression of the genes of interest or a stable expression.
  • the stable expression allows that, after successive divisions of the cell, the incorporated sequence continues to be expressed.
  • Another preferred embodiment refers to any strain described in previous paragraphs, where the lytic heterologous genetic system is inserted into its chromosomal DNA.
  • a more preferred embodiment refers to said strain where the lytic heterologous genetic system inserted in its chromosomal DNA is in a single copy.
  • Another aspect of the present invention is a microbial population comprising any strain described in previous paragraphs.
  • microorganism of the present invention or "microorganism of the invention” can be used.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the microorganism of the invention for the extraction of at least one compound synthesized by said bacterium. Since the present invention focuses on the insertion of a heterologous genetic system capable of inducing, in an induced manner, the lysis of the cells that contain it, the microorganism of the invention can be used for the extraction of any compound synthesized by said bacterium. .
  • the fact that the amount of PHA synthesized by said bacterium has been measured in the present invention does not limit the type of compound synthesized by it.
  • a preferred embodiment relates to the use of the microorganism of the invention for the extraction of at least one compound synthesized by said bacterium, wherein the synthesized compound is polyhydroxyalkanoate (PHA).
  • PHA polyhydroxyalkanoate
  • Another aspect of the present invention relates to a method for the extraction of PHA synthesized by the microorganism of the invention, comprising: a) culturing the microorganism of the invention in a minimal culture medium,
  • step (a) adding an effector compound of the expression of the lytic heterologous genetic system to the culture of step (a), and
  • minimum medium refers to a culture medium with a defined composition of mineral salts and a compound that the Pseudomonas putida bacteria can use as a carbon source.
  • a preferred embodiment refers to the use of the medium designated 0.1 N M63, composed of 13.6 g KH 2 PO 4 ; 0.2 g (NH 4 ) 2 SO 4 ; 0.5 mg SO 4 Fe ⁇ 7 h O per liter, buffered to pH 7, and supplemented with 1 mM MgSO 4 and a trace element solution (Moldes et al., 2004. Appl. Environ. Microbio!., 70: 3205 -3212).
  • the carbon source can be any compound that the Pseudomonas putida bacteria can use as a carbon source.
  • a carbon source Preferably, but not limited to, any molecule capable of being transformed into hydroxyalkanoyl-CoA by bacterial metabolism.
  • Said medium is appropriate for the cells to produce the compound of interest.
  • effector compound refers to a compound capable of inducing the expression of said genetic system by means of the gene expression regulatory system.
  • the expression of the cassette with the two lithic genes is induced by the addition to the culture medium of said effector compound. In this way the joint action of the lytic enzyme and holine leads to spontaneous rupture of the bacterial cell envelope and the release of the compounds of interest contained in the cell cytoplasm.
  • the isolation of the compound synthesized by said bacterium, according to step (c) of the method is carried out by techniques that are part of the common general knowledge and are therefore available to a person skilled in the art.
  • the isolation or recovery of the enzymatic product is carried out, for example, but not limited, by precipitation of said product with saline fractionation, heat precipitation, isoelectric precipitation, with organic solvents or with polymers, with cold acetone or by chromatography .
  • a preferred embodiment refers to the method for the extraction of at least one compound synthesized by the microorganism of the invention, where it also comprises a step prior to step (a) where the strain or bacterial population is grown in a rich culture medium.
  • the term "rich medium” as used in the present invention refers to a medium containing yeast extract or other substances of complex and poorly defined composition that can serve as a source of nutrients and energy for the growth of the microorganism.
  • the rich medium is Luria-Bertani (LB) (Sambrook and Rusell, 2001. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York).
  • Said rich medium is appropriate for the cells to divide but not produce the compound of interest. That is, the method described in this preferred embodiment consists of the following sequential steps:
  • the microorganism of the invention can be isolated or not.
  • the microorganism of the invention is isolated by techniques known to those skilled in the art and transferred to said minimum culture medium, - adding an effector compound of the expression of the lytic heterologous genetic system to the culture of the previous step,
  • Another preferred embodiment relates to the method for the extraction of at least one compound synthesized by the microorganism of the invention, where the effector compound of the expression of the lytic heterologous genetic system is 3-MB acid.
  • Another preferred embodiment relates to the method for the extraction of at least one compound synthesized by the microorganism of the invention, where in addition, after cultivation of the microorganism of the invention, one or more chemical compounds are added to the minimum culture medium, with detergent and chelating properties, in small amounts that accelerate cell lysis mediated by the lytic heterologous genetic system, but which in these quantities are not capable of producing on their own the lysis of a native bacterium unmodified by the lytic heterologous genetic system.
  • the amounts of chemical compounds used as lysis accelerators are much lower than the amounts that would be needed to lyse the bacteria if it were not genetically modified, and therefore are less polluting.
  • a PHA precursor is added to the minimum culture medium.
  • the PHA precursor is a fatty acid or any molecule capable of being transformed into hydroxyalkanoyl-CoA by bacterial metabolism.
  • FIG. 1 It shows a scheme of the cloning of the ejh-ejl cassette on the Pseudomonas putida KT2440 chromosome under the transcriptional control of the Pm promoter.
  • FIG. 2. Shows the distribution profiles obtained by ultracentrifugation with sucrose gradient.
  • Tube 1 wild strain Pseudomonas putida KT2440 without inductor
  • tube 2 wild strain Pseudomonas putida KT2440 with inductor
  • tube 3 recombinant strain Pseudomonas putida KTHL without inducer
  • tube 4 recombinant strain Pseudomonas putida KTHL with inductor.
  • the white band located at the gradient interface of this last tube corresponds to the PHA granules released to the extracellular medium.
  • FIG. 3. It shows the count of viable cells (cfu / ml) at 0, 6 and 24 h of the Pseudomonas putida KTHL and Pseudomonas putida BXHL strains in the presence and absence of 3-MB.
  • FIG. 4. Shows the distribution profiles obtained by ultracentrifugation with sucrose gradient.
  • Tube 1 Pseudomonas wild strain. putida KT2440 incubated with 10 mM EDTA and 0.1% SDS; tube 2: recombinant strain Pseudomonas putida BXHL with 3-MB incubated with 10 mM EDTA and 0.1% SDS.
  • FIG. 5 Shows the intracellular PHA content of the Pseudomonas putida BXHL strain in the presence of 3-MB and in the presence of 3-MB, 10 mM EDTA and 0.1% SDS.
  • the invention will now be illustrated by illustrative and non-limiting tests, carried out by the inventors describing the use of the strain of the invention for the extraction of any compound synthesized by the strains of Pseudomonas putida KTHL and Pseudomonas putida BXHL, mutant in the Tol-pal system, carriers of the lithic system of the KTHL strain.
  • EXAMPLE 1 Construction of the strain of Pseudomonas putida KTHL and extraction of compounds (PHA) synthesized by them.
  • Pseudomonas putida KTHL strain carrying the ejh-ejl lithic cassette in monocopy A cell autolysis system in Pseudomonas putida KT2440 has been designed by constructing a carrier strain on the chromosome of the genes encoding a holine (Ejh) and an endolysin (Ejl). The resulting strain has been called Pseudomonas putida KTHL. To control the expression of the lytic system in Pseudomonas putida KT2440, a monocopy expression system of the ejh-ejl cassette was constructed in order to introduce it into the genome of the strain by triparental conjugation.
  • 1,209 bp fragment was amplified by PCR using plasmid pEDF12 as a template (Table 4) and V08 and V09 as oligonucleotides (Table 5). Said fragment was digested with Xba ⁇ and BamH ⁇ and after cloning it into plasmid pUC18Not it was cloned into pCNB1 causing plasmid pCNBHL (FIG. 1).
  • the Pseudomonas putida KTHL cells were centrifuged at 31,000 * g for 1 h in a Sorvall centrifuge and the pellets were resuspended in pH 8 phosphate buffer to preserve cell integrity. 50% of each sample was lyophilized and analyzed by GC-MS to quantify the total PHA content. The rest of the sample was subjected to fractionation in a gradient of preformed sucrose with a first volume of 20% sucrose (11 ml) and a second volume of 15% sucrose (11 ml). The samples were placed on top of the gradient and ultracentrifuged at 126,000 ⁇ g for 20 h in an XL-90 ultracentrifuge (Beckman).
  • the growth of the different strains in plastic production conditions in a single fermentative phase allows to grow from a single source of carbon (octanoic acid) and achieve a high biomass / PHA yield.
  • Table 1 Shows the optical density value (at 6 oo nm); the intracellular content of PHA; the viable cell count (cfu / ml) and the biomass (g / l) corresponding to cells grown in a fermentative phase at 23h of culture of the wild strain Pseudomonas putida KT2440 and of the recombinant strain Pseudomonas putida KTHL in the presence and absence of 3-MB.
  • the growth in two fermentative phases consists of a new fermentation / production system that allows an improvement in the production of PHA in Pseudomonas putida KTHL and in the functioning of the lysis system.
  • the procedure consists in culturing the cells in a rich medium (LB medium) and then transferring them to a specific PHA production medium, where they will be lysed after activation of the lytic system.
  • LB medium rich medium
  • Pseudomonas putida KTHL is able to grow and accumulate PHA in a manner similar to the wild strain in terms of ⁇ levels reached by both strains (Table 2).
  • Table 2 Shows the optical density value ( ⁇ 6 ⁇ nm); the intracellular content of PHA; viable cell count (cfu / ml) and biomass (g / l) corresponding to cells grown in two fermentative phases at 23h of culture of the wild strain Pseudomonas putida KT2440 and of the recombinant strain Pseudomonas putida KTHL in the presence and absence of 3-MB.
  • the degrees of sensitivity of the strain Pseudomonas putida KTHL against the chemical agents sodium dodecyl sulfate (SDS), deoxycholate (DOC) or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) were analyzed in order to improve the performance of the bioplastic extraction process.
  • the cells were incubated for 18 h at 30 ° C in LB medium and in LB medium supplemented with 0.2 mM EDTA, 0.1% DOC -0.05% (w / v) or 0.01% SDS (w / v ).
  • the minimum concentrations of EDTA, DOC and SDS that do not alter the growth of Pseudomonas putida KTHL induced with 3-MB were determined, these being the following: EDTA 0.05-01 mM, DOC 0.01% ( p / v) and SDS 0.005% (p / v).
  • the concentrations of EDTA and DOC that alter the growth of the wild Pseudomonas strain were also determined. putida KT2440, these being the following: EDTA 0.4 mM and DOC 0.1-0.2% (w / v).
  • the sensitivity levels of the recombinant strain Pseudomonas putida KTHL against EDTA, DOC and SDS in plastic production medium were analyzed. After the fermentation in two phases, the cells were incubated for 7 h at room temperature with 10 mM EDTA and 0.1% SDS simultaneously. At these concentrations, the recombinant strain Pseudomonas putida KTHL induced with 3-MB presented a similar sensitivity that in the absence of inducer and that the wild strain. The fact of not achieving the lysis of any of the strains despite the high concentration of the chemical agents used, suggests that the presence of the PHA granule inside the cell confers resistance to the bacteria.
  • EXAMPLE 2 Construction of mutant Pseudomonas putida strains in the Tol-pal system, carriers of the lytic system of the KTHL strain, and extraction of compounds (PHA) synthesized by them. 2.1. Study of the expression of the cell autolysis system in the mutant strains in the Tol-pal, Pseudomonas putida AX, BX, QX and RX system.
  • mutant strains were tested in the Tol-pal complex, which have the unstructured cell envelope.
  • the intracellular PHA content of the described strains grown in two fermentative phases was quantified, this being less than 0.2 g / l in the Pseudomonas putida AXHL, Pseudomonas putida RXHL and Pseudomonas putida QXHL strains.
  • the PHA content of Pseudomonas putida BXHL (0.88 g / l) is similar, and even greater, to that of the strain Pseudomonas putida KTHL (0.78 g / l).
  • mutant strain was selected in the TolB protein carrying the autolysis system, Pseudomonas putida BXHL.
  • the PHA content present in the cell sediments resulting from the sucrose gradient ultracentrifugation after inducing cell lysis was compared.
  • the quantification of the PHA present in the sediments resulting from the ultracentrifugation allows us to conclude that the percentage of rupture obtained after induction of the lytic system in the strain Pseudomonas putida BXHL is significantly lower than that obtained with the French press, where the cell rupture was practically total (results not shown).
  • Pseudomonas Pseudomonas putida mt-2 cured from plasmid 2002. Environ putida KT2440 TOL, hsdR Microbe !. 4: 782-786.
  • Oligonucleotides used the amplification of products by PCR.
  • the underlined sequences correspond to the restriction targets created.
  • the rich medium used to grow E. coli and Pseudomonas putida cells was Luria-Bertani (LB) (Sambrook and Rusell, 2001. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York).
  • the minimum medium used to grow the cells was the medium named 0.1 N M63 (13.6 g KH 2 P0 4 ; 0.2 g (NH 4 ) 2 S0 4 ; 0.5 mg S0 4 Fe ⁇ 7 H 2 0 per liter, pH 7) supplemented with 1 mM MgS0 4 and a trace element solution (Moldes et al., 2004. Appl. Environ. Microbiol., 70: 3205-3212).
  • the strains were stored at 4 ° C in LB plates or minimum medium.
  • the bacteria were frozen in the corresponding culture medium with 15% (v / v) glycerol and kept at -80 ° C.
  • the Pseudomonas putida KT2440 cells were cultured for 24 h in M63 0.1 N medium whose composition is similar to that of M63 but with 0.2 g / l of (NH 4 ) 2 S0 instead of 2 g / l, using 15 mM octanoate as the sole source of carbon (Moldes et al., 2004. Appl. Environ. Microbio /., 70: 3205-3212).
  • E. coli cells were genetically modified by transformation after making them competent by the RbCI method (Sambrook and Rusell, 2001. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York.), Or by electroporation ( Wirth et al., 1989 Mol Gen Genet 216: 175-177).
  • Pseudomonas putida cells were genetically modified by electroporation transformation.
  • To electroporate the Pseudomonas putida cells cells were collected in liquid culture or cell mass from agar plates and five washes were performed with sterile water at 4 ° C.
  • the conditions of the Gene Pulser / Pulse Controller electroporation equipment (Bio-Rad) were 2.5 kV, 25 ⁇ and 200 ⁇ .
  • the plasmids were mobilized to Pseudomonas putida by bi- or tri-parental conjugation following the method described by de Lorenzo and Timmis, (1994) Methods Enzymol 235: 386-405) and using E. coli strain HB101 (pRK600) As auxiliary strain.
  • the transconjugants of Pseudomonas putida were selected in LB medium plates with the corresponding antibiotics or in minimum medium plates with 0.2% citrate and the corresponding antibiotic.
  • Plasmid DNA extraction was carried out using the High Puré Plasmid Purification Kit (Roche) system, according to the manufacturer's protocol.
  • Genomic DNA extraction was carried out using the GenomicPrepTM Cells and Tissue DNA Isolation Kit (GE Healthcare) according to the manufacturer's instructions. DNA amplification was performed on a Mastercycler Gradient device from Eppendorf. The reaction mixtures contained 1.5 mM MgC ⁇ , 0.2 mM dNTPs, 10% dimethylsulfoxide, 0.5 units of DNA polymerase, 100 ng of template DNA and oligonucleotides at a final concentration of 0.5 ⁇ . The DNA fragments were purified using agarose gels, using the GeneClean kit (BIO 101) or the "High Puré TM PCR Product Purification Kit" (Boehringer Mannheim).
  • the different oligonucleotides used in the PCR reactions were acquired in Sigma-Genosys and are indicated in Table 5.
  • Quantitative analysis was carried out by calculating the response factors of the monomers with respect to 3-MB. For the calculation of the factors, mixtures of known concentrations of PHA were used, obtaining a response factor for each of the quantified monomers whose coefficient of variation did not exceed 5%.
  • the strains were inoculated in LB medium at DO600 0.5. After 6 h of incubation under orbital agitation different concentrations of the chemical agents mentioned above were added for 18 h. The growth of these cultures was carried out in 96-well plates at 30 ° C with 2 min of strong orbital agitation every 15 min (Multiskan Ascent, Thermo). The growth values shown are the average of 3 replicates.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • DOC deoxycholate
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid

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Abstract

La presente invención se refiere a una cepa bacteriana de Pseudomonas putida KT2440, que comprende un sistema genético heterólogo lítico donde dicho sistema a su vez comprende la secuencia nucleotídica que codifica la enzima lítica de pared celular endolisina Ejl, la secuencia nucleotídica que codifica la holina Ejh, y una secuencia nucleotídica que codifica un sistema de regulación génica, que a su vez comprende una secuencia nucleotídica promotora de la expresión génica, y una secuencia nucleotídica que codifica y expresa una proteína reguladora de dicha expresión génica. Preferiblemente la cepa es el microorganismo con número de depósito CECT 7659. Además, la presente invención también se refiere a dicha cepa donde el microorganismo Pseudomonas putida KT2440 es mutante en uno o más de los genes tol-pal. Preferiblemente dicha cepa es el microorganismo con número de depósito CECT 7658. Además, la presente invención se refiere al uso de cualquiera de las cepas descritas para la extracción de polihidroxialcanoato (PHA) sintetizado por dicha bacteria así como a un método para la extracción de dicho compuesto.

Description

SISTEMA DE AUTOLISIS CELULAR PARA EL PROCESADO DE LA BIOMASA BACTERIANA EN LA PRODUCCIÓN DE POLIHIDROXIALCANOATOS EN PSEUDOMONAS PUTIDA KT2440. La presente invención se refiere a una cepa bacteriana de Pseudomonas putida KT2440, que comprende un sistema genético heterologo lítico donde dicho sistema a su vez comprende la secuencia nucleotídica que codifica la enzima lítica de pared celular endolisina Ejl, la secuencia nucleotídica que codifica la holina Ejh, y una secuencia nucleotídica que codifica un sistema de regulación génica, que a su vez comprende una secuencia nucleotídica promotora de la expresión génica, y una secuencia nucleotídica que codifica y expresa una proteína reguladora de dicha expresión génica. Preferiblemente la cepa es el microorganismo con número de depósito CECT 7659. Además, la presente invención también se refiere a dicha cepa donde el microorganismo Pseudomonas putida KT2440 es muíante en uno o más de los genes tol-pal. Preferiblemente dicha cepa es el microorganismo con número de depósito CECT 7658. Además, la presente invención se refiere al uso de cualquiera de las cepas descritas para la extracción de polihidroxialcanoato (PHA) sintetizado por dicha bacteria así como a un método para la extracción de dicho compuesto.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La tecnología de los bioprocesos ha experimentado en los últimos años un avance considerable tratando de mejorar y adaptar la moderna biotecnología a las tecnologías clásicas de fermentación. En este sentido, la tecnología del DNA recombinante o, en un concepto más amplio, las técnicas de biología molecular, han sido determinantes para que se pueda explotar y manipular un gran número de organismos para la producción de compuestos de interés. En gran medida, este éxito ha sido posible gracias al desarrollo de sistemas de expresión de genes en organismos heterologos más fáciles de manipular y multiplicar. Dentro de las diferentes opciones que se pueden estudiar, cabe destacar aquéllas que no sólo pretenden la expresión de un gen o conjunto de genes sino que, además, tratan de facilitar la obtención de un producto de interés biotecnológico y de alto valor añadido, como son los biopolímeros plásticos o bioplásticos. Sin embargo, el uso de este tipo de biopolímeros no se ha implantado hasta ahora en el mercado de forma competitiva debido al bajo coste que aún mantiene la síntesis de los polímeros plásticos derivados del petróleo (Prieto et al. 2007. Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Model System in Biology. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. y Filloux, A. Springer. 397-428). Actualmente, como consecuencia del problema de contaminación medioambiental que ha generado el uso del plástico convencional y el incremento del precio del petróleo, se está haciendo una apuesta clara por la implantación de procesos de tipo sostenible para la obtención de energía y la producción de materiales de alto consumo como son los biopolímeros plásticos, y en particular los polihidroxialcanoatos (PHAs) (Gavrilescu et al. (2005). Biotechnology Advances, 23: 471 -499).
Los PHAs, conocidos comúnmente como "bioplásticos", son polímeros biodegradables producidos por ciertas bacterias, que se acumulan en el interior celular en forma de gránulos de reserva de fuente de carbono cuando las condiciones de cultivo no son óptimas para el crecimiento (Madison y Huisman, 1999. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63: 21 -53; Prieto et al. 2007. Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Model System in Biology. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. y Filloux, A. Springer, 397- 428). Estos biopolímeros son biodegradables y las bacterias los sintetizan a partir de fuentes renovables como por ejemplo la glucosa, la fructosa o los ácidos grasos que forman parte de los aceites vegetales. Por tanto, se puede definir el término bioplástico como biopolímero sintetizado a partir de fuentes renovables, que puede ser biodegradado en condiciones controladas y que presenta características físico-químicas similares a los plásticos derivados de la industria petroleoquímica (Sarasa et al. 2009. Bioresour. Technol. 100: 3764- 3768). En general, los gránulos de PHA están compuestos por un poliéster (93-97% del peso seco del gránulo [PSG]) rodeado por fosfolípidos (1 -6% del PSG) y proteínas asociadas al gránulo (GAPs) (1 -2% del PSG), las cuales forman una fina capa en la superficie del gránulo (Steinbüchel et al. 1995. Can. J. Microbio/., 41 : 94-105). Hasta el momento se han definido tres clases de GAPs en bacterias: i) las PHA sintasas, involucradas en la polimerización del PHA, ii) las PHA despolimerasas, responsables de la degradación del bioplástico y iii) las fasinas, las GAPs más abundantes, con una función estructural o reguladora (Prieto et al. 1999a. Appl. Environ. Microbio!., 65: 3265-3271 ; Moldes et al., 2004. Appl. Environ. Microbio!., 70: 3205-3212).
Los PHAs se clasifican en dos tipos principales de acuerdo a su estructura química: los PHAs de cadena corta (scl-PHAs) obtenidos a partir de monómeros con 4 o 5 átomos de carbono y los de cadena media (mcl-PHAs) procedentes de monómeros con 6 a 14 átomos de carbono. Los diferentes PHAs identificados hasta la fecha son polímeros lineales compuestos de 3- hidroxiácidos grasos exclusivamente de la configuración R (RHAs). El peso molecular de estos polímeros varía entre 50.000-1 .000.000 y su diversidad radica en las sustituciones en el carbono asimétrico en posición 3, que le confiere al polímero el carácter quiral (Prieto et al. (1999b) J. Bacterio!. 181 : 858-868).
Es conocido que la composición del polímero depende de la fuente de carbono presente en el medio de cultivo utilizado durante la fermentación de la bacteria productora (Durner, et al. 2001 . Biotechnol. Bioeng., 72: 278-288, Jung et al. 2001 . Biotechnol. Bioeng., 72: 19-24). Por otra parte, es importante resaltar que las características fisico-químicas de los polímeros varían según la naturaleza química de los monómeros que los componen (Madison y Huisman, 1999. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63: 21 -53; Kessler et al, 2001 . J. Biotechnol., 86: 97- 104). Teniendo en cuenta que se han descrito más de 140 RHAs diferentes como componentes de los PHAs producidos por bacterias (Steinbüchel et al. 1995. Can. J. Microbiol., 41 : 94-105; Sudesh et al. 2000. Prog. Polym. Sci., 25: 1503-1555), y que el biopolímero después de su obtención por fermentación puede ser sometido a posteriores modificaciones químicas, como a su entrecruzamiento y a la adición de grupos funcionales (Lageveen, R. G. et al., 1988. Appl. Environ. Microbio!., 54: 2924-2932.), es fácil imaginar la gran diversidad de bioplásticos y RHAs diferentes que pueden generarse mediante la combinación de todos estos procesos. Es importante señalar que los PHAs también pueden ser útiles para aplicaciones biomédicas como biomateriales (Zinn et al. 2001 . Adv. Drug. Deliv. Rev., 53: 5-21 ). Además, el PHA puede ser considerado como una fuente de nuevos compuestos quirales (sintones) de gran utilidad como precursores en la industria farmacéutica, ya que son difíciles de conseguir en estado puro mediante procesos químicos convencionales.
En la producción de los PHAs mediante fermentación bacteriana, el proceso de extracción de los mismos es probablemente el paso más importante desde el punto de vista del ahorro de costes de producción y del desarrollo de un proceso de fabricación respetuoso con el medio ambiente. Hasta ahora se han desarrollado diferentes métodos para extraer el PHA de las bacterias productoras pero en su mayoría requieren el uso de grandes cantidades de disolventes orgánicos, cócteles enzimáticos o detergentes (Elbahloul Y, Steinbüchel A, 2009. Appl Environ Microbio!., 75: 643-51 ).
Por otra parte, la mayoría de los bacteriófagos (o fagos abreviadamente), con excepción de los filamentosos, son líticos y rompen la pared de la bacteria huésped hasta su lisis completa. Aunque hay más de una estrategia para llevar a cabo este proceso, la gran mayoría de los fagos se valen de dos proteínas que actúan de manera perfectamente coordinada: una holina y una endolisina. Los genes que codifican estas proteínas suelen estar contiguos y su transcripción y traducción es tardía, iniciándose sólo cuando los viriones están en su última fase de empaquetamiento dentro del citoplasma bacteriano. Las holinas constituyen un grupo de proteínas fágicas de estructura primaria muy variada pero que se agrupan en tres clases y funcionalmente son muy similares en su modo de acción. Son proteínas pequeñas, con dominios transmembranales que se localizan en la membrana citoplásmica formando un poro o agujero ("hole") que en un momento genéticamente programado permite el paso de la enzima lítica (endolisina) encargada de romper la pared bacteriana y provocar la lisis (Wang et al. (2000) Annu. Rev. Microbiol 54: 799- 825). Las endolisinas son enzimas líticas codificadas por los fagos, no tienen péptido señal de secreción, se acumulan en el citoplasma durante el ciclo vegetativo y se translocan a la pared celular a través del poro formado por la oligomerización de la holina. Una vez en la pared celular, se unen al peptidoglicano, rompen enlaces específicos y desencadenan la lisis bacteriana y la posterior liberación de la progenie fágica. Dependiendo del tipo de enlace que hidrolicen, las endolisinas pueden ser muramidasas, glucosaminidasas, transglicosilasas, amidasas o endopeptidasas (Hermoso et al. (2007) Curr. Op. Microbiol .10: 461 -472). Por otra parte, el complejo Tol-Pal de las bacterias está organizado en dos complejos proteicos: un complejo de la membrana interna que consiste en las proteínas TolQ, TolA y ToIR que interaccionan entre ellas mediante dominios transmembrana, y otro complejo asociado a la membrana externa compuesto por las proteínas TolB y Pal, que también interacciona con Lpp, OmpA y el peptidoglicano (Lazzaroni et al. 1999. FEMS Microbiol. Lett., 177: 191-197). Estas proteínas se localizan formando complejos en la envoltura celular de las bacterias Gram-negativas, y son críticas para el mantenimiento de la estructura de la envuelta. La alteración de las mismas, conduce a situaciones de debilitamiento de la célula e incrementada sensibilidad a detergentes o agentes quelantes (Llamas et al. 2000. J. Bacterio!., 182: 4764-4772).
Es conocido que la extracción de los polihidroxialcanoatos producidos por una bacteria puede hacerse directamente sin lisar previamente la bacteria mediante el empleo de solventes orgánicos a elevada temperatura. Sin embargo este proceso es peligroso, energéticamente poco eficiente y medioambientalmente muy contaminante. Por este motivo para liberar los gránulos de bioplástico antes de su extracción se recurre también a la lisis previa de la bacteria mediante procedimientos físicos de ruptura de las células bacterianas o mediante procedimientos químicos de lisis celular con la ayuda de detergentes. Sin embargo, los procedimientos físicos de ruptura requieren del empleo de un equipamiento complejo y costoso además de un gasto de energía, y los procedimientos químicos necesitan del uso de altas cantidades de detergente que son medioambientalmente contaminantes. Por consiguiente un objetivo de esta invención consistió en desarrollar un procedimiento de lisis celular confiriendo nuevas propiedades a los microorganismos productores del polihidroxialcanoato de tal manera que la extracción de estos compuestos fuera menos costosa energéticamente y medioambientalmente menos contaminante.
La complejidad de los procesos de extracción resultantes de la fermentación de las bacterias supone un obstáculo a la hora de reducir tanto los costes de producción como la contaminación medioambiental a la hora de escalar el proceso a nivel industrial. Por todo ello, el desarrollo de nuevos métodos o procesos para la producción y extracción de PHAs de las bacterias de forma competitiva y ecológica, se ha convertido en un objetivo fundamental para esta actividad industrial.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una cepa bacteriana de Pseudomonas putida KT2440, que comprende un sistema genético heterologo lítico donde dicho sistema a su vez comprende la secuencia nucleotídica que codifica la enzima lítica de pared celular endolisina Ejl, la secuencia nucleotídica que codifica la holina Ejh, y una secuencia nucleotídica que codifica un sistema de regulación génica, que a su vez comprende una secuencia nucleotídica promotora de la expresión génica, y una secuencia nucleotídica que codifica y expresa una proteína reguladora de dicha expresión génica. Preferiblemente la cepa es el microorganismo con número de depósito CECT 7659. Además, la presente invención también se refiere a dicha cepa donde el microorganismo Pseudomonas putida KT2440 es muíante en uno o más de los genes tol-pal. Preferiblemente dicha cepa es el microorganismo con número de depósito CECT 7658. Además, la presente invención se refiere al uso de cualquiera de las cepas descritas para la extracción de polihidroxialcanoato (PHA) sintetizado por dicha bacteria así como a un método para la extracción de dicho compuesto.
En la presente invención, se ofrece una solución a la extracción de compuestos producidos por la bacteria Pseudomonas putida KT2440, y particularmente la extracción de polihidroxilacanoatos disminuyendo con ello el uso de productos químicos contaminantes utilizados para lisar las células productoras. En los ejemplos de la presente invención se muestran los resultados de la autolisis celular en dos cepas bacterianas depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Las dos cepas comprenden un sistema genético heterólogo lítico que expresa genes implicados en la degradación de la pared celular y en la permeabilidad de la membrana celular, cuya expresión se encuentra controlada por un sistema regulador de la expresión dependiente de un inductor. Es conocido que cuando las células bacterianas portan un sistema genético heterólogo lítico en multicopia, principalmente en forma de plásmido, las células se hacen muy inestables porque se lisan incluso en ausencia de inductor, crecen poco y lo hacen lentamente, y por lo tanto son poco útiles para la producción de sustancias de interés. Por consiguiente, una parte de esta invención consistió en estudiar el comportamiento de estas cepas cuando portan este sistema genético heterólogo lítico en una única copia integrada en el cromosoma. En este caso el comportamiento de la cepa bacteriana no se conocía y por consiguiente no se podía predecir con exactitud el resultado. Al reducir el número de copias del sistema lítico podría esperarse que el sistema lítico se volviese menos agresivo para la célula y por lo tanto la célula fuese más estable. Pero también podría esperarse que la célula no se lisara y por consiguiente el sistema fuese inservible para el objetivo propuesto. Al mismo tiempo, dada la naturaleza heterologa del sistema y teniendo en cuenta que podría insertarse en cualquier parte del cromosoma, también podría esperarse que aun reduciendo a una sola copia el número de copias del sistema lítico heterólogo, la célula fuese igualmente inestable.
En el caso de esta invención las dos cepas anteriormente descritas y depositadas en la CECT portan el sistema genético heterólogo lítico en monocopia. Dentro de las distintas opciones de comportamiento que cabría esperar se observó que la cepa recombinante CECT 7659 que portaba el sistema genético heterólogo lítico en monocopia era más estable que la cepa nativa transformada con el plásmido que portaba el sistema lítico en multicopia. Es conocido que las mutaciones en los genes tol-pal causan inestabilidad de la membrana celular externa en la bacteria Pseudomonas putida KT2440 y permite que las proteínas periplásmicas se secreten y la bacteria se lise en presencia de algunos detergentes y EDTA. Por ello se pensó que esta mutación podría ser útil para inducir la lisis por detergente y EDTA en las células productoras de PHAs. Sin embargo, la presencia de PHA en lugar de desestabilizar la célula mutante en los genes tol-pal hacía que la célula fuese más estable e insensible a la lisis por el detergente y el agente quelante EDTA. Por lo tanto dicha mutación resultaba inservible para el objetivo propuesto. Aunque la bacteria Pseudomonas putida KT2440 mutante en los genes tol-pal no resultaba ser útil individualmente para el objetivo propuesto, se analizó si la combinación de este sistema de lisis de la cepa mutante en los genes tol-pal con el sistema genético heterólogo lítico en monocopia de la presente invención, generaba algún efecto sinérgico inesperado que propiciara la lisis celular en las condiciones deseadas. Por este motivo se construyó una cepa de Pseudomonas putida KT2440 y en concreto la cepa recombinante CECT 7658 que portaba el sistema genético heterólogo lítico en monocopia en la cepa de Pseudomonas putida KT2440 muíante en uno de los genes tol-pal. De forma inesperada en esta nueva cepa recombinante se consiguió mejorar la lisis de forma controlada y por lo tanto se mejoró el proceso de extracción de los compuestos producidos, y en concreto la extracción del PHA.
Las razones precisas que explican este comportamiento son aun desconocidas, pero se puede especular con la posibilidad de que dicha mutación tol-pal provoca un debilitamiento de la membrana celular externa, que en condiciones normales no es suficiente para inducir la lisis, pero que en presencia del sistema genético herterólogo en monocopia, que por si solo tampoco es capaz de inducir la lisis, complementa de forma sinérgica la acción de este último sobre la pared celular y la membrana celular interna. De esta manera, en presencia de ambos sistemas y tras la adición de un inductor, de una pequeña cantidad de un detergente y de un agente químico quelante, la lisis se produce de forma más rápida y contundente, y además de forma controlada por el inductor. Se genera así un efecto sinérgico de tipo umbral, a priori imprevisible, de tal manera que hasta que no se combinan todos los elementos de forma precisa no se supera el umbral de desectructuración de la envoltura celular necesario para la lisis y por lo tanto la célula permanece perfectamente viable. En estas condiciones, la liberación de los compuestos contenidos en el citoplasma celular se produce con una alta eficiencia en presencia de un detergente y un agente quelante sólo cuando se induce el sistema genético heterólogo lítico en monocopia convirtiéndose así la nueva cepa recombinante creada (CECT 7658) en un nuevo organismo muy útil para el objetivo propuesto.
Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se refiere a una cepa bacteriana de Pseudomonas putida KT2440, que comprende un sistema genético heterólogo lítico donde dicho sistema a su vez comprende la secuencia nucleotídica que codifica una enzima lítica de pared celular, la secuencia nucleotídica que codifica una holina, y un sistema regulador de la expresión génica. La enzima lítica de pared celular es una proteína capaz de romper la pared de la célula o las sustancias que componen dicha pared. Dicha enzima lítica puede proceder de bacterias, hongos, levaduras, plantas, animales o bacteriófagos. Preferiblemente la enzima lítica de pared celular se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, Ejl del bacteriófago EJ-1 de Streptococcus pneumoniae, Cpl-1 del bacteriófago Cp-1 de Streptococcus pneumoniae, transglicosidasa R del bacteriófago λ de Escherichia coli, lisozimas del bacteriófago P22 de Salmonella y del bacteriófago T4 de Escherichia coli, proteína E del bacteriófago 0X174 de E. coli, transglicosidasa Slt y amidasa AmiA de Escherichia coli (Young, R. 1992. Microbiol. Rev. 56:430-481 ).
La holina es una proteína fágica con dominios transmembranales que se localiza en la membrana citoplásmica formando un poro que permite el paso de la enzima lítica encargada de romper la pared bacteriana y provocar la lisis. Las holinas tienen una estructura primaria muy variada pero se agrupan en tres clases y funcionalmente son muy similares en su modo de acción. Dicha holina procede de un bacteriófago. Preferiblemente dicha holina se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, Ejh del bacteriófago EJ-1 de Streptococcus pneumoniae, Cph-1 del bacteriófago Cp-1 de Streptococcus pneumoniae, holina del bacteriófago 06 de Pseudomonas phaseolicola, holina S del bacteriófago λ de Escherichia coli, holina del bacteriófago P22 de Salmonella (Young, R. 1992. Microbiol. Rev. 56:430-481 ). La clasificación científica de la bacteria de la presente invención es: Reino: Bacteria I División: Proteobacteria I Orden: Pseudomonadales I Familia: Pseudomonadaceae ¡ Género: Pseudomonas ¡ Especie: Pseudomonas putida.
La secuencia completa del genoma de Pseudomonas putida KT2440 ha sido divulgada por Nelson et al., (2002) (Nelson et al., 2002. Environ Microbiol., 4(12): 799-808). El N° de acceso de la secuencia completa de Pseudomonas putida KT2440 es AE015451 .1 y su identificación taxonómica (Taxonomy ID) es 160488.
El término "sistema genético heterólogo lítico" se refiere a una construcción genética que comprende secuencias nucleotídicas que corresponden a uno o más organismos diferentes de Pseudomonas putida. Por ejemplo, pero sin limitarse, la enzima lítica de pared celular y la holina pueden ser las secuencias nucleotídicas que codifican la secuencia aminoacídica de las proteínas que tienen dicha actividad, procedentes de fagos de Streptococcus pneumoniae, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Bacillus subtilis o Bacillus megaterium. Preferiblemente dichas secuencias proceden del fago EJ-1 de Streptococcus pneumoniae.
El término "sistema de regulación de la expresión génica" se refiere a un conjunto de secuencias nucleotídicas que regulan la expresión del "sistema genético heterólogo lítico" y pueden ser heterólogas o no, es decir, dichas secuencias pueden proceder o no de Pseudomonas putida. Es decir, dicho término hace referencia a un conjunto de secuencias nucleotídicas que tenga efecto sobre la funcionalidad de una secuencia nucleotídica respecto del comienzo de la transcripción o al inicio de traducción de una secuencia de ARN u otras secuencias. A modo de ejemplo, entre los sistemas reguladores de la expresión génica se encuentran los que se denominan sistemas reguladores inducibles que están constituidos por una o más secuencias nucleotídicas denominadas promotoras/operadoras y por una o más secuencias nucleotídicas que codifican y expresan una o más proteínas reguladoras que activan o reprimen la expresión génica en presencia de uno o más compuestos denominados inductores. Un ejemplo de activador de la expresión génica es la proteína XyIS de Pseudomonas putida que pertenece a una familia de reguladores transcripcionales denominada XyIS/AraC, implicadas en la estimulación de la transcripción de al menos 90 proteínas diferentes implicados en diferentes procesos celulares como el metabolismo del carbono, patogénesis y la respuesta ante agentes alquilantes en bacterias. Preferiblemente la proteína reguladora de la expresión génica se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, cualquier proteína que pueda actuar como regulador de la expresión génica en Pseudomonas putida. Una realización preferida se refiere a la cepa bacteriana de Pseudomonas putida KT2440, que comprende un sistema genético heterólogo lítico, donde la enzima lítica de pared celular es la endolisina Ejl, la holina es la proteína Ejh, y el sistema regulador de la expresión génica es xyl/Pm. Las secuencias nucleotídicas que codifican la endolisina Ejl y la holina Ejh, pueden proceder, por ejemplo, pero sin limitarse, de fagos de Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis o Bacillus megaterium. Preferiblemente dichas secuencias proceden del fago EJ-1 de Streptococcus pneumoniae. Dichas secuencias nucleotídicas pueden formar parte de un cásete en el que la secuencia de ejl precede a la secuencia ejh, en el sentido 5' a 3'. La secuencia reguladora de la expresión génica, xyl/Pm, consiste en una secuencia nucleotídica que codifica y expresa la proteína XyIS, un regulador de la transcripción del promotor del plásmido TOL que regula la expresión del promotor Pm de la ruta de degradación meta. La proteína XyIS pertenece a la familia de reguladores de la transcripción XyIS/AraC. En consonancia con la organización estructural de la proteína XyIS, Pm tiene dos motivos llamados A y B, cuyas secuencias son TGCA y GGNTA, respectivamente. Estos motivos se repiten en el promotor Pm y como consecuencia los monómeros de la proteína XyIS se unen a dichas repeticiones, activando la transcripción. Para la activación de la transcripción de la secuencia nucleotídica que quede aguas abajo de xyl/Pm es necesario el uso de un activador como por ejemplo, pero sin limitarse, el ácido 3- metilbenzoico (en lo sucesivo 3-MB).
El sistema genético heterólogo lítico descrito en párrafos anteriores puede comprender además un marcador de resistencia que permita la selección de las bacterias que contienen dicho sistema. El uso de genes de resistencia antibiótica es una herramienta importante en la ingeniería genética en general. Los genes de resistencia a los antibióticos tienen la habilidad de desactivar selectivamente ciertos antibióticos y, en consecuencia, proteger las células contra esos antibióticos. Un gen de resistencia antibiótica, por tanto, puede ser utilizado para delatar la existencia del sistema genético heterólogo lítico de la presente invención. En la práctica, el gen antibiótico es ligado a dicho sistema antes de ser transformado en la célula bacteriana receptora. Estas células son entonces incubadas en presencia del antibiótico. Sólo las células que se reproduzcan en estas condiciones son las que habrán incorporado el gen de resistencia al antibiótico junto con dicho sistema genético. Preferiblemente el marcador confiere resistencia a las células frente al antibiótico kanamicina. Además, el marcador puede conferir resistencia contra productos químicos o frente a la presencia de nutrientes no usuales.
Una realización preferida de la presente invención se refiere a cualquier cepa bacteriana derivada de Pseudomonas putida KT2440, descrita en párrafos anteriores, donde dicha cepa es el microorganismo con número de depósito CECT 7659. Dicho microorganismo ha sido depositado en la Colección Española de Cultivos tipo (CECT) el día 16 de diciembre de 2009 le correspondió el n° de depósito CECT 7659. La dirección de dicha Autoridad Internacional de depósito es: Universidad de Valencia / Edificio de investigación / Campus de Burjassot / 46100 Burjassot (Valencia).
La cepa CECT 7659 comprende un sistema genético heterólogo lítico. Esta cepa posee integrados en el cromosoma los genes ejh y ejl que codifican una holina (Ejh) y una enzima lítica (Ejl) del bacteriófago EJ-1 , respectivamente, bajo el control transcripcional del promotor Pm (cassette ejh-ejl, construcción reguladora xyIS/Pm y un gen de resistencia a la kanamicina). La secuencia nucleotídica que codifica para la holina Ejh es SEQ ID NO: 1 y la secuencia que codifica para la endolisina Ejl es SEQ ID NO: 2 (cásete ejh-ejl; Número de acceso NC_005294.1 ), y la secuencia nucleotídica de los componentes del sistema regulador de la expresión génica xyl/Pm es SEQ ID NO: 5 para Xyl (Número de acceso NP_542858) y SEQ ID NO: 6 para Pm (Número de acceso X01 103). En adelante, para referirse a dicha cepa CECT 7659 puede emplearse de forma indistinta el término KTHL.
Las condiciones de cultivo y de mantenimiento de la cepa CECT 7659, comunicadas a la Autoridad Internacional de depósito, son:
Condiciones de cultivo:
Crecimiento en medio rico LB (número 48 de medios de la CECT) suplido con kanamicina 50 Mg/ml. Incubar en un agitador orbital a 300 rpm y a 30°C.
Condiciones de mantenimiento:
Crecer en medio rico LB suplido con kanamicina 50 μg/ml durante 14 h en agitación a 30°C y guardar la cepa a - 80°C con glicerol 15 %. Otra realización preferida se refiere a cualquier cepa derivada de la cepa Pseudomonas putida KT2440 que comprende dicho sistema heterólogo lítico, donde dicha cepa bacteriana de Pseudomonas putida KT2440, descrita en párrafos anteriores, es muíante en uno o más de los genes tol-pal. El término "muíante" íal como se emplea en la présenle invención se refiere a la secuencia resultante de la deleción de los genes tol-pa\. La célula de Pseudomonas putida KT2440 muíante en al menos uno o más de los genes tol- pal se selecciona de la lisia que comprende Pseudomonas putida KT2440 AX (tolA::xylE que genera una proíeína TolA acortada a 94 aminoácidos), Pseudomonas putida KT2440 BX (tolB::xylE que genera una proteína TolB acortada a 29 aminoácidos), Pseudomonas putida KT2440 QX {tolQr.xylE que genera una proteína TolQ acortada a 17 aminoácidos) o Pseudomonas putida KT2440 RX (tolR::xylE que no genera una proteína ToIR porque el gen toIR está delecionado). Una realización más preferida se refiere a la cepa descrita en el párrafo anterior, muíante en uno o más de los genes tol-pal, donde dicha cepa es el microorganismo con número de depósiío CECT 7658. La cepa CECT 7658 corresponde a la cepa de Pseudomonas putida KT2440 BX (tolB::xylE que genera una proteína TolB acortada a 29 aminoácidos). Dicha cepa posee mutado el gen que codifica la proteína TolB del sistema Tol-Pal (P. putida KT2440 tolB::xylE, con TolB acortado a 29 aminoácidos). Además, posee integrados en el cromosoma los genes ejh y ejl que codifican una holina (Ejh) y una enzima lítica (Ejl) del bacteriófago EJ-1 , respectivamente, bajo el control transcripcional del promotor Pm (cassette ejh-ejl, construcción reguladora xylS/Pm y un gen de resistencia a la kanamicina). Es decir, la cepa CECT 7658 además de presentar la mutación de los genes tol-pal comprende el sistema genético heterólogo lítico donde la secuencia nucleotídica que codifica para la holina Ejh es SEQ ID NO: 1 , la secuencia que codifica para la endolisina Ejl (cásete ejh-ejl) es SEQ ID NO: 2, y la secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia reguladora de la expresión génica xyl/Pm es SEQ ID NO: 5 para Xyl y SEQ ID NO: 6 para Pm. En adelante, para referirse a dicha cepa CECT 7658 puede emplearse de forma indistinta el término BXHL. Dicho microorganismo ha sido depositado en la Colección Española de Cultivos tipo (CECT) el día 16 de diciembre de 2009 y le correspondió el n° de depósito CECT 7658. En adelante, para referirse a dicha cepa CECT 7658 puede emplearse de forma indistinta el término BXHL.
Las condiciones de cultivo y de mantenimiento de la cepa CECT 7658, comunicadas a la Autoridad Internacional de depósito, son:
Condiciones de crecimiento:
Crecimiento en medio rico LB (número 48 de medios de la CECT) suplido con kanamicina 50 μg/ml. Incubar en un agitador orbital a 300 rpm y a 30°C.
Condiciones de mantenimiento
Crecer en medio rico LB suplido con kanamicina 50 μg/ml durante 14 h en agitación a 30°C y guardar la cepa a - 80°C con glicerol 15 %. El sistema genético heterologo lítico se consigue introducir en las células mediante la transformación de vectores que contienen dicho sistema genético. La transformación puede dar lugar a una expresión transitoria de los genes de interés o a una expresión estable. La expresión estable permite que, tras sucesivas divisiones de la célula, la secuencia incorporada siga expresándose.
Otra realización preferida se refiere a cualquier cepa descrita en párrafos anteriores, donde el sistema genético heterologo lítico está insertado en su ADN cromosómico. Una realización más preferida se refiere a dicha cepa donde el sistema genético heterologo lítico insertado en su ADN cromosómico se encuentra en una sola copia.
Otro aspecto de la presente invención es una población microbiana que comprende cualquier cepa descrita en párrafos anteriores.
En adelante, para referirse a cualquier cepa descrita en párrafos anteriores o a la población microbiana que la comprende, se puede usar el término "microorganismo de la presente invención" o "microorganismo de la invención". Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del microorganismo de la invención para la extracción de al menos un compuesto sintetizado por dicha bacteria. Puesto que la presente invención se centra en la inserción de un sistema genético heterologo capaz de producir, de forma inducida, la lisis de las células que lo contienen, el microorganismo de la invención puede ser usado para la extracción de cualquier compuesto sintetizado por dicha bacteria. El hecho de que en la presente invención se haya medido la cantidad de PHA sintetizada por dicha bacteria no limita el tipo de compuesto sintetizado por la misma. Una realización preferida se refiere al uso del microorganismo de la invención para la extracción de al menos un compuesto sintetizado por dicha bacteria, donde el compuesto sintetizado es polihidroxialcanoato (PHA). Cualquier microorganismo de la presente invención puede es utilizado para la producción de PHA. El PHA producido es extraído de forma eficiente gracias a las características técnicas intrínsecas de cada una de las cepas descritas.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para la extracción de PHA sintetizado por el microorganismo de la invención, que comprende: a) cultivar el microorganismo de la invención en un medio mínimo de cultivo,
b) añadir un compuesto efector de la expresión del sistema genético heterólogo lítico al cultivo del paso (a), y
c) aislar el compuesto sintetizado por dicha bacteria.
El término "medio mínimo" tal como se emplea en la presente invención se refiere a un medio de cultivo con composición definida de sales minerales y un compuesto que la bacteria Pseudomonas putida pueda utilizar como fuente de carbono. Una realización preferida se refiere al uso del medio denominado 0.1 N M63, compuesto por 13.6 g KH2PO4; 0.2 g (NH4)2SO4; 0.5 mg SO4Fe χ 7 h O por litro, tamponado a pH 7, y suplementado con 1 mM de MgSO4 y una solución de elementos traza (Moldes et al., 2004. Appl. Environ. Microbio!., 70: 3205-3212). La fuente de carbono puede ser cualquier compuesto que la bacteria Pseudomonas putida pueda utilizar como fuente de carbono. Preferiblemente, pero sin limitarse, cualquier molécula susceptible de ser transformada en hidroxialcanoil-CoA mediante el metabolismo bacteriano. Dicho medio es apropiado para que las células produzcan el compuesto de interés.
El "compuesto efector" tal como se emplea en la presente invención se refiere a un compuesto capaz de inducir la expresión de dicho sistema genético por medio del sistema regulador de la expresión génica. Al final de la etapa de crecimiento cuando ya se ha acumulado la suficiente biomasa y la bacteria ha producido el compuesto de interés se induce la expresión del cásete con los dos genes líticos mediante la adición al medio de cultivo de dicho compuesto efector. De esta manera la actuación conjunta de la enzima lítica y la holina conduce a la ruptura espontánea de la envoltura celular de la bacteria y la liberación de los compuestos de interés contenidos en el citoplasma celular.
El aislamiento del compuesto sintetizado por dicha bacteria, según el paso (c) del método, se lleva a cabo mediante técnicas que forman parte del conocimiento general común y por tanto, están disponibles a un experto en la materia. Por ejemplo, el aislamiento o recuperación del producto enzimático se lleva a cabo por ejemplo, pero sin limitarse, mediante precipitación de dicho producto con fraccionamiento salino, precipitación por calor, precipitación isoeléctrica, con disolventes orgánicos o con polímeros, con acetona fría o mediante cromatografía.
Una realización preferida se refiere al método para la extracción de al menos un compuesto sintetizado por el microorganismo de la invención, donde además comprende un paso previo al paso (a) donde la cepa o población bacteriana se cultiva en un medio rico de cultivo. El término "medio rico" tal como se emplea en la presente invención se refiere a un medio que contiene extracto de levadura u otras sustancias de composición compleja y poco definida que puedan servir como fuente de nutrientes y energía para el crecimiento del microorganismo. En una realización más preferida el medio rico es Luria-Bertani (LB) (Sambrook y Rusell, 2001. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. CSHL Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).
Dicho medio rico es apropiado para que las células se dividan pero no produzcan el compuesto de interés. Es decir, el método que se describe en esta realización preferida consiste en las siguientes etapas secuenciales:
- cultivar el microorganismo de la invención un medio rico de cultivo,
- cultivar los microorganismos obtenidos en el paso anterior en un medio mínimo de cultivo. Para ello puede aislarse el microorganismo de la invención o no. Preferiblemente el microorganismo de la invención se aisla por técnicas conocidas por el experto en la materia y se trasvasa a dicho medio mínimo de cultivo, - añadir un compuesto efector de la expresión del sistema genético heterólogo lítico al cultivo del paso anterior,
- añadir compuestos químicos aceleradores de la lisis y
- aislar el compuesto sintetizado por dicha bacteria.
Otra realización preferida se refiere al método para la extracción de al menos un compuesto sintetizado por el microorganismo de la invención, donde el compuesto efector de la expresión del sistema genético heterólogo lítico es el ácido 3-MB.
Otra realización preferida se refiere al método para la extracción de al menos un compuesto sintetizado por el microorganismo de la invención, donde además, después del cultivo del microorganismo de la invención, se adiciona al medio mínimo de cultivo, uno o más compuestos químicos, con propiedades detergentes y quelantes, en pequeñas cantidades que aceleran la lisis celular mediada por el sistema genético heterólogo lítico, pero que en dichas cantidades no son capaces de producir por sí solos la lisis de una bacteria nativa no modificada mediante el sistema genético heterólogo lítico. Las cantidades de compuestos químicos utilizados como aceleradores de la lisis son mucho más bajas que las cantidades que se necesitarían para lisar la bacteria si ésta no estuviese modificada genéticamente, y por lo tanto son menos contaminantes.
Según otra realización preferida del método para la extracción de PHA, donde además, después del cultivo del microorganismo de la invención, se adiciona un precursor de PHA al medio mínimo de cultivo. Una realización más preferida de la presente invención se refiere al método para la extracción de PHA, donde el precursor de PHA es un ácido graso o cualquier molécula susceptible de ser transformada en hidroxialcanoil-CoA mediante el metabolismo bacteriano.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Con la intención de complementar la descripción que se ha llevado a cabo, así como de ayudar a un mejor entendimiento de las características de la invención, de acuerdo con algunos ejemplos realizados, se muestran aquí, con carácter ilustrativo y no limitante, las siguientes figuras:
FIG. 1. Muestra un esquema de la clonación del cásete ejh-ejl en el cromosoma de Pseudomonas putida KT2440 bajo el control transcripcional del promotor Pm.
FIG. 2. Muestra los perfiles de distribución obtenidos por ultracentrifugación con gradiente de sacarosa.
Tubo 1 : cepa salvaje Pseudomonas putida KT2440 sin inductor; tubo 2: cepa salvaje Pseudomonas putida KT2440 con inductor; tubo 3: cepa recombinante Pseudomonas putida KTHL sin inductor; tubo 4: cepa recombinante Pseudomonas putida KTHL con inductor. La banda blanca localizada en la interfase del gradiente de este último tubo corresponde a los gránulos de PHA liberados al medio extracelular.
FIG. 3. Muestra el recuento de células viables (ufc/ml) a las 0, 6 y 24 h de las cepas Pseudomonas putida KTHL y Pseudomonas putida BXHL en presencia y ausencia de 3-MB. FIG. 4. Muestra los perfiles de distribución obtenidos por ultracentrifugación con gradiente de sacarosa.
Tubo 1 : cepa salvaje Pseudomonas. putida KT2440 incubada con EDTA 10 mM y SDS 0.1 %; tubo 2: cepa recombinante Pseudomonas putida BXHL con 3-MB incubada con EDTA 10 mM y SDS 0.1 %.
FIG. 5. Muestra el contenido intracelular de PHA de la cepa Pseudomonas putida BXHL en presencia de 3-MB y en presencia de 3-MB, EDTA 10 mM y SDS 0.1 %.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos ilustrativos y de carácter no limitante, realizados por los inventores que describen el uso de la cepa de la invención para la extracción de cualquier compuesto sintetizado por las cepas de Pseudomonas putida KTHL y Pseudomonas putida BXHL, muíante en el sistema Tol-pal, portadoras del sistema lítico de la cepa KTHL.
EJEMPLO 1. Construcción de la cepa de Pseudomonas putida KTHL y extracción de compuestos (PHA) sintetizados por las mismas.
1.1. Construcción de la cepa Pseudomonas putida KTHL portadora del cásete lítico ejh-ejl en monocopia. Se ha diseñado un sistema de autolisis celular en Pseudomonas putida KT2440 mediante la construcción de una cepa portadora en el cromosoma de los genes que codifican una holina (Ejh) y una endolisina (Ejl). La cepa resultante se ha denominado Pseudomonas putida KTHL. Para controlar la expresión del sistema lítico en Pseudomonas putida KT2440, se construyó un sistema de expresión en monocopia del cásete ejh-ejl con el fin de introducirlo en el genoma de la cepa mediante conjugación triparental. Para ello, se amplificó por PCR el fragmento de 1 .209 pb utilizando el plásmido pEDF12 como molde (Tabla 4) y V08 y V09 como oligonucleótidos (Tabla 5). Dicho fragmento se digirió con Xba\ y BamH\ y tras clonarlo en el plásmido pUC18Not se clonó en pCNB1 originando el plásmido pCNBHL (FIG. 1 ). Mediante conjugación triparental con la cepa CC1 18 pir (pCNBHL) se insertó en el cromosoma de Pseudomonas putida KT2440 un fragmento de DNA conteniendo el cásete ejh-ejl, la construcción reguladora xyIS/Pm y un gen de resistencia a la kanamicina, dando lugar a la cepa Pseudomonas putida KTHL. 1.2. Cuantificación de la eficacia del sistema de lisis mediante ultracentrifugación en gradiente de sacarosa para el aislamiento del gránulo (PHA).
Una vez finalizada la fermentación, las células de Pseudomonas putida KTHL se centrifugaron a 31 .000 * g durante 1 h en una centrifuga Sorvall y los sedimentos se resuspendieron en tampón fosfato pH 8 para preservar la integridad celular. El 50% de cada muestra se liofilizó y se analizó por GC-MS para cuantificar el contenido total en PHA. El resto de la muestra se sometió a fraccionamiento en un gradiente de sacarosa preformado con un primer volumen de sacarosa al 20% (1 1 mi) y un segundo volumen de sacarosa al 15% (1 1 mi). Las muestras se colocaron en la parte superior del gradiente y se ultracentrifugaron a 126.000 χ g durante 20 h en una ultracentrífuga XL-90 (Beckman). Los extractos se mantuvieron a 4°C durante todo el proceso (Moldes et al., 2004). Tras esta ultracentrifugación, se recogió con pipeta Pasteur la banda blanca que aparece en el tercio superior del tubo; se observó al microscopio, se liofilizó y se analizó por GC-MS para determinar el contenido en PHA. Para cuantificar la cantidad de PHA presente en el interior celular, se recuperó el sedimento resultante de la ultracentrifugación, se liofilizó y se analizó por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC- MS). Se cuantificó también el número de células viables (unidades formadoras de colonias por mililitro, ufc/ml) y la biomasa (gramos de PHA por litro, g/l). Todas las centrifugaciones y ultracentrifugaciones se llevaron a cabo a 4°C. 1.3. Estudio del comportamiento de la cepa Pseudomonas putida
KTHL.
Para estudiar el efecto de la expresión de los genes líticos en el crecimiento y la integridad celular de Pseudomonas putida KTHL, se siguieron dos protocolos de crecimiento diferentes: i) crecimiento en una fase: la cepa se creció en un solo paso en condiciones de producción de PHA. Para ello, Pseudomonas putida KTHL y su cepa parental, Pseudomonas putida KT2440 se cultivaron en LB durante 14 h. Tras ese tiempo se lavaron con solución salina y se inocularon a ϋθβοο 0,3 en 100 mi de M63 0,1 N con octanoato 15 mM como única fuente de carbono y con el inductor (3-MB, 5 mM); ii) crecimiento en dos fases: Se inocularon 50 mi de LB a ϋθβοο- 0,3 con preinóculos de ambas cepas. Después de 14 h de incubación los cultivos se centrifugaron y se resuspendieron en 100 mi de M63 0, 1 N con octanoato 15 mM como única fuente de carbono y con el inductor (3-MB, 5 mM). Los cultivos se incubaron durante 23 h.
El crecimiento de las distintas cepas en condiciones de producción de plástico en una sola fase fermentativa permite crecer a partir de una única fuente de carbono (ácido octanoico) y alcanzar un alto rendimiento biomasa/PHA.
Antes de analizar la expresión de los genes líticos en Pseudomonas putida KTHL, se comprobó la capacidad de dicha cepa para crecer y producir PHA en un medio mínimo limitado en nitrógeno, con ácido octanoico como única fuente de carbono. Pseudomonas putida KTHL es capaz de crecer y acumular PHA en esas condiciones fermentativas a niveles de ϋθβοο similares a los de la cepa salvaje ¡Tabla 1 ). Este resultado fue confirmado mediante la cuantificación por GC-MS del contenido intracelular de PHA en las dos cepas. Esto demostró que la cepa recombinante Pseudomonas putida KTHL acumula similar a la producida por la cepa salvaje en las condiciones de crecimiento probadas (Tabla 1 ). Cuando el inductor del sistema lítico (3-MB) está presente en el medio de cultivo se observó una inhibición en el crecimiento a niveles de ϋθβοο de Pseudomonas putida KTHL, que no se observó en la cepa salvaje bajo las mismas condiciones. Estos resultados se confirmaron mediante la estimación de la viabilidad celular (ufc/ml) y de la biomasa (g/l) de la cepa salvaje y de la cepa recombinante sin y con 3-MB (Tabla 1 ).
Tabla 1. Muestra el valor de densidad óptica (A6oo nm); el contenido intracelular de PHA; el recuento de células viables (ufc/ml) y la biomasa (g/l) correspondientes a células crecidas en una fase fermentativa a las 23h de cultivo de la cepa salvaje Pseudomonas putida KT2440 y de la cepa recombinante Pseudomonas putida KTHL en presencia y ausencia de 3-MB.
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Para determinar el rendimiento del sistema lítico en Pseudomonas putida KTHL, una vez finalizada la fermentación en una fase, las células se sometieron a fraccionamiento en un gradiente de sacarosa. En el tubo con la muestra de Pseudomonas putida KTHL inducida con 3-MB se observó una banda blanca en la interfase del gradiente, indicando la secreción del plástico al medio extracelular. En ausencia del inductor, los gránulos de PHA no se secretaron al medio y sedimentaron junto con la fracción celular. En el caso de la cepa salvaje, no se secretaron gránulos en ningún caso. Estos resultados demuestran que los gránulos de PHA solo se liberan al medio extracelular en la cepa recombinante con el sistema lítico integrado en el cromosoma (Pseudomonas putida KTHL) y en presencia del inductor de dicho sistema, demostrando la potencialidad de este sistema para los procesos de producción de PHA. Un inconveniente de este método de crecimiento y extracción de PHA es la incapacidad que presentan las células para sedimentar en el proceso de separación del plástico que ha sido secretado al medio, lo cual impide la cuantificación de la cantidad de PHA obtenido mediante GC-MS.
El crecimiento en dos fases fermentativas consiste en un nuevo sistema de fermentación/producción que permite una mejora en cuanto a la producción de PHA en Pseudomonas putida KTHL y en el funcionamiento del sistema de lisis. El procedimiento consiste en cultivar las células en un medio rico (medio LB) y a continuación traspasarlas a un medio específico de producción de PHA, donde se lisarán tras la activación del sistema lítico. Bajo las condiciones de fermentación anteriormente descritas, Pseudomonas putida KTHL es capaz de crecer y acumular PHA de manera similar a la cepa salvaje en cuanto a los niveles de ϋθβοο alcanzados por ambas cepas (Tabla 2). Este resultado fue confirmado mediante la cuantificación por GC-MS del contenido intracelular de PHA en las dos cepas, en presencia y ausencia del inductor (Tabla 2). Este resultado demostró nuevamente que la cepa recombinante Pseudomonas putida KTHL acumula una cantidad de PHA similar a la producida por la cepa salvaje.
Al igual que ocurre en las fermentaciones de una sola fase, cuando el inductor del sistema lítico está presente en el medio de cultivo se observa una inhibición en el crecimiento de Pseudomonas putida KTHL, que no se observa en la cepa salvaje bajo las mismas condiciones. Estos resultados también se confirmaron mediante la estimación de la viabilidad celular (ufc/ml) y la biomasa (g/l) de los cultivos (Tabla 2).
Tabla 2. Muestra el valor de densidad óptica (Δ6οο nm); el contenido intracelular de PHA; el recuento de células viables (ufc/ml) y la biomasa (g/l) correspondientes a células crecidas en dos fases fermentativas a las 23h de cultivo de la cepa salvaje Pseudomonas putida KT2440 y de la cepa recombinante Pseudomonas putida KTHL en presencia y ausencia de 3-MB.
Figure imgf000028_0001
Para determinar el rendimiento del sistema lítico en Pseudomonas putida KTHL, una vez finalizada la fermentación, las células se sometieron a fraccionamiento en un gradiente de sacarosa (FIG. 2). En el tubo con la muestra de Pseudomonas putida KTHL inducida con 3-MB (tubo 4) se observó una banda blanca en la interfase del gradiente, indicando la secreción del plástico al medio extracelular. En ausencia del inductor (tubo 3), los gránulos de PHA no se secretaron al medio y sedimentaron junto con la fracción celular. En el caso de la cepa salvaje, no se secretaron gránulos en ningún caso (tubos 1 y 2). Estos resultados demuestran que los gránulos de PHA sólo se liberan al medio extracelular en la cepa recombinante con el sistema lítico integrado en el cromosoma (Pseudomonas putida KTHL) y en presencia del inductor de dicho sistema, demostrando la potencialidad de este sistema para los procesos de producción de PHA. Este mismo experimento se repitió de manera similar incluyendo una rotura total de la cepa recombinante Pseudomonas putida KTHL empleando la prensa de French (Aminco Corp.) a una presión de 20.000 psi., para comparar el porcentaje de lisis obtenido mediante el sistema lítico con el porcentaje de lisis obtenido empleando la prensa de French. Para llevar a cabo la cuantificación del sistema lítico desarrollado en esta patente se comparó el contenido en PHA presente en los sedimentos celulares resultantes de la ultracentrifugación tras inducir lisis celular. Este experimento permite la cuantificación indirecta del gránulo secretado al medio extracelular debida al sistema lítico o a la prensa de French.
Los resultados obtenidos permiten concluir que el porcentaje de rotura obtenido tras la inducción del sistema lítico en la cepa recombinante es menor al 10% del obtenido con la prensa de French, donde la ruptura celular es prácticamente total. Con el objetivo de mejorar este rendimiento del sistema de lisis, se estudió la sensibilidad de las cepas a distintos agentes químicos.
1.4. Sensibilidad de Pseudomonas putida KTHL frente a agentes químicos
Los grados de sensibilidad de la cepa Pseudomonas putida KTHL frente a los agentes químicos dodecilsulfato sódico (SDS), desoxicolato (DOC) o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) fueron analizados con el objetivo de mejorar el rendimiento del proceso de extracción del bioplástico. Las células se incubaron durante 18 h a 30°C en medio LB y en medio LB suplido con EDTA 0,2 mM, DOC 0, 1 %-0,05% (p/v) ó SDS 0,01 % (p/v). A estas concentraciones, la cepa recombinante Pseudomonas putida KTHL inducida con 3-MB presentó una sensibilidad frente a los agentes químicos, mientras que en esta misma cepa sin inductor y la cepa salvaje Pseudomonas putida KT2440 (sin y con inductor) no se observó ningún efecto en el crecimiento. Estos resultados indican una alteración significativa en la permeabilidad de la membrana externa de Pseudomonas putida KTHL, debida a la expresión de la holina y la enzima lítica. De la misma manera, se determinaron las concentraciones mínimas de EDTA, DOC y SDS que no alteran el crecimiento de Pseudomonas putida KTHL inducida con 3-MB, siendo éstas las siguientes: EDTA 0,05-01 mM, DOC 0,01 % (p/v) y SDS 0.005% (p/v). También se determinaron las concentraciones de EDTA y DOC que alteran el, crecimiento de las cepa salvaje Pseudomonas putida KT2440, siendo éstas las siguientes: EDTA 0,4 mM y DOC 0,1-0,2% (p/v).
Con el objetivo de mejorar el rendimiento del proceso de extracción del PHA, se analizaron los grados de sensibilidad de la cepa recombinante Pseudomonas putida KTHL frente a EDTA, DOC y SDS en medio de producción de plástico. Una vez finalizada la fermentación en dos fases, las células se incubaron durante 7 h a temperatura ambiente con EDTA 10 mM y SDS 0,1 % simultáneamente. A estas concentraciones, la cepa recombinante Pseudomonas putida KTHL inducida con 3-MB presentó una sensibilidad similar que en ausencia de inductor y que la cepa salvaje. El hecho de no lograr la lisis de ninguna de las cepas a pesar de la alta concentración de los agentes químicos empleados, sugiere que la presencia del gránulo de PHA en el interior celular confiere resistencia a la bacteria.
EJEMPLO 2. Construcción de cepas de Pseudomonas putida mutantes en el sistema Tol-pal, portadoras del sistema lítico de la cepa KTHL, y extracción de compuestos (PHA) sintetizados por las mismas. 2.1. Estudio de la expresión del sistema de autolisis celular en las cepas mutantes en el sistema Tol-pal, Pseudomonas putida AX, BX, QX y RX.
Para mejorar la eficacia del sistema lítico en la producción de PHA, se testaron cepas mutantes en el complejo Tol-pal, que presentan la envoltura celular desestructurada.
En primer lugar se comprobó la capacidad de estas cepas mutantes {Pseudomonas putida AX, Pseudomonas putida BX, Pseudomonas putida QX y Pseudomonas Pseudomonas putida RX) para crecer y acumular PHA de la misma manera que la cepa parental Pseudomonas putida KT2440. La cuantificación del contenido intracelular de PHA mediante GC-MS de las cepas anteriormente descritas crecidas en dos fases fermentativas es similar, e incluso mayor, que la de la cepa parental. Los valores de contenido intracelular de PHA obtenidos para Pseudomonas putida KT2440, Pseudomonas putida KTHL, Pseudomonas putida AX, Pseudomonas putida BX, Pseudomonas putida QX y Pseudomonas. putida RX fueron 0.71 g/l, 0.88 g/l, 1.0 g/l, 0.82 g/l, 1 .03 g/l y 0.87 g/l, respectivamente.
2.2. Construcción de cepas de Pseudomonas putida KT2440 mutantes en el sistema tol-pal portadoras del sistema de autolisis {Pseudomonas putida AXHL, Pseudomonas putida BXHL, Pseudomonas putida QXHL y Pseudomonas putida RXHL).
Mediante conjugación triparental con la cepa CC1 18 pir (pCNBHL) (Tabla 4) se introdujo el cásete ejh-ejl en el genoma de la cepa Pseudomonas putida AX, generando la cepa Pseudomonas putida AXHL, siguiendo el mismo protocolo que el descrito en el ejemplo 1 .1 . De forma similar, se construyó el resto de mutantes en el sistema Tol-pal portadores del sistema lítico: Pseudomonas putida BXHL, Pseudomonas putida QXHL y Pseudomonas putida RXHL (Tabla 3).
A continuación, se comprobó la capacidad de estos mutantes en el sistema Tol- pal portadores del sistema lítico (Pseudomonas putida AXHL, Pseudomonas putida BXHL, Pseudomonas putida QXHL y Pseudomonas putida RXHL) para crecer en medio de producción de PHA en dos fases fermentativas. Se observó que Pseudomonas putida BXHL era la única cepa capaz de alcanzar una densidad óptica similar a la de la cepa Pseudomonas putida KTHL, mientras que los demás mutantes no crecieron de manera óptima.
Para corroborar estos resultados, se cuantificó el contenido intracelular de PHA de las cepas descritas crecidas en dos fases fermentativas, siendo éste menor a 0.2 g/l en las cepas Pseudomonas putida AXHL, Pseudomonas putida RXHL y Pseudomonas putida QXHL. Sin embargo, el contenido de PHA de Pseudomonas putida BXHL (0.88 g/l) es similar, e incluso mayor, al de la cepa Pseudomonas putida KTHL (0.78 g/l).
Teniendo en cuenta todos estos resultados, se seleccionó la cepa muíante en la proteína TolB portadora del sistema de autolisis, Pseudomonas putida BXHL.
2.3. Estudio de la expresión del sistema de autolisis celular en la cepa recombinante Pseudomonas putida BXHL. Una vez comprobada la capacidad de la cepa muíante en la proteína TolB del sisíema Tol-pal portadora del sisíema lííico en monocopia (Pseudomonas putida BXHL) para crecer y producir PHA en un medio mínimo limiíado en niírógeno y con acido ocíanoico como única fueníe de carbono, se deíerminaron oíros parámeíros de fermeníación concluyéndose que, en esías condiciones, la íasa de crecimienío de la cepa muíanle fue inferior al índice de crecimienío de la cepa pareníal Pseudomonas putida KT2440. Pseudomonas putida BXHL solo fue capaz de crecer y acumular PHA de la misma manera que la cepa pareníal cuando el crecimienío se llevó a cabo en dos fases fermeníaíivas.
La cuaníificación del coníenido iníracelular de PHA de la cepa Pseudomonas putida BXHL en presencia y ausencia de 3-MB crecida en dos fases fermeníaíivas en comparación con la cepa recombinaníe Pseudomonas putida KTHL, mosíró que la producción de polímero es similar en ambas cepas. Los valores de coníenido iníracelular de PHA obíenidos para Pseudomonas putida KTHL en presencia y ausencia de 3-MB fueron 0.68 y 0.77 g/l, respecíivameníe. Los valores obíenidos para Pseudomonas putida BXHL en presencia y ausencia de 3-MB fueron 0.72 y 0.79 g/l, respecíivameníe. La esíimación de la viabilidad celular confirmó que, al igual que ocurría en las fermeníaciones de Pseudomonas putida KTHL, cuando el inducíor del sisíema lííico (3-MB) esíá présenle en el medio de culíivo se observa una inhibición en el crecimiento de Pseudomonas putida BXHL, que no se observa en la cepa salvaje bajo las mismas condiciones (FIG. 3). Además, con esta cepa la ruptura celular observada es significativamente mayor que la obtenida con la cepa Pseudomonas putida KTHL.
Para llevar a cabo la cuantificación indirecta de la ruptura celular obtenida mediante el sistema lítico en Pseudomonas putida BXHL, se comparó el contenido en PHA presente en los sedimentos celulares resultantes de la ultracentrifugación en gradiente de sacarosa tras inducir la lisis celular. La cuantificación del PHA presente en los sedimentos resultantes de la ultracentrifugación permite concluir que el porcentaje de ruptura obtenido tras la inducción del sistema lítico en la cepa Pseudomonas putida BXHL es significativamente menor que el obtenido con la prensa de French, donde la ruptura celular era prácticamente total (resultados no mostrados).
Con el objetivo de mejorar este rendimiento del sistema de lisis en la cepa Pseudomonas putida BXHL, una vez crecidas las células se incubaron con EDTA 10 mM y SDS 0, 1 %, y se sometieron a fraccionamiento en un gradiente de sacarosa (FIG. 4). La muestra de Pseudomonas putida BXHL inducida con 3-MB (tubo 2) presenta una banda blanca de PHA en la interfase del gradiente significativamente mayor que la banda de la cepa la cepa parental Pseudomonas putida KT2440 bajo las mismas condiciones (tubo 1 ). La centrifugación en gradiente indica una lisis prácticamente total del cultivo, similar a la obtenida mediante la prensa de French.
Para corroborar estos resultados, se cuantificó el contenido intracelular de PHA de la cepa BXHL cultivada en presencia de 3-MB siendo del orden de 1 ,05 g/l. Cuando esta cepa se incuba con 3-MB, EDTA y SDS, no se detecta PHA en la fracción intracelular (FIG. 5). 3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Descripción de los microorganismos, plásmidos y cebadores empleados.
Las cepas de Pseudomonas putida y de Escherichia coli utilizadas en este trabajo se detallan en la Tabla 3.
Tabla 3. Cepas empleadas.
Cepa Genotipo/fenotipo relevante Referencia
A(ara-leu) araD, NacX74, galE, galK, phoA20, Herrero et al., 1990.
Escherichia
thi-1, rpsE, rpoB, argE (Am), recA1 Rf, Spr, J. Bacterio!, 172: ∞//Ό01 18λρϊΓ
contiene el fago λρίτ 6557-6567
Nakazawa et al.,
Pseudomonas Pseudomonas putida mt-2 curada del plásmido 2002. Environ putida KT2440 TOL, hsdR Microbio!. 4: 782- 786.
Pseudomonas Pseudomonas putida KT2440 portadora en
Este trabajo putida KTHL cromosoma de los genes ejh y ejl, Kmr
Llamas et al. 2000
Pseudomonas Pseudomonas putida KT2440 tolA::xylE (con J. Bacterio/., 182: putida AX TolA acortado a 94 aminoácidos) 4764-4772 (Llamas et al. 2000)
Pseudomonas Pseudomonas putida KT2440 tolB::xylE (con
Llamas et al. 2000 putida BX TolB acortado a 29 aminoácidos)
Pseudomonas Pseudomonas putida KT2440 tolQ::xylE (con
Llamas et al. 2000 putida QX TolQ acortado a 17 aminoácidos)
Pseudomonas Pseudomonas putida KT2440 tolR::xylE (con
Llamas et al. 2000 putida RX ToIR delecionado)
Pseudomonas putida KT2440 tolA::xylE
Pseudomonas
portadora en cromosoma de los genes ejh y ejl, Este trabajo putida AXHL
Kmr
Pseudomonas Pseudomonas putida KT2440 tolB::xylE Este trabajo putida BXHL portadora en cromosoma de los genes ejh y ejl,
Kmr
Pseudomonas putida KT2440 tolQ::xylE
Pseudomonas
portadora en cromosoma de los genes ejh y ejl, Este trabajo putida QXHL
Kmr
Pseudomonas putida KT2440 tolR::xylE
Pseudomonas
portadora en cromosoma de los genes ejh y ejl, Este trabajo putida RXHL
Kmr
Tabla 4. Plásmidos utilizados.
Plásmido Características relevantes Referencia
Mermod et al., pNM185 pKT231 , xyIS/Pm, Apr, Kmr 1986. J. Bacterio!.
167: 447-454
Díaz et al., 1994. pNM185 con los genes ejh y ejl del bacteriófago
pEDF12 Mol. Microbio!.
EJ-1
13: 855-861
De Lorenzo et al., pCNB1 pUTmini-Tn5, xylS/Pm,Apr, Kmr 1993. Gene. 130:
41-46
Equivalente a pUC18 (Yanish-Perron et al. 1985) Herrero et al., pUC18Not pero con el sitio de clonación múltiple flanqueado 1990. J. Bacterio! por sitios Not\ 172: 6557-6567 pCNB1 con los genes ejh y ejl del bacteriófago
pCNBHL Este trabajo
EJ-1
Tabla 5. Oligonucleótidos utilizados la amplificación de productos por PCR. Las secuencias subrayadas corresponden con las dianas de restricción creadas.
Figure imgf000036_0001
3.2. Medios y condiciones de cultivo empleados.
El medio rico utilizado para cultivar las células de E. coli y Pseudomonas putida fue el Luria-Bertani (LB) (Sambrook y Rusell, 2001 . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. CSHL Press, Cold Spring Harbor, Nueva York). El medio mínimo utilizado para cultivar las células fue el medio denominado 0.1 N M63 (13,6 g KH2P04; 0,2 g (NH4)2S04; 0,5 mg S04Fe χ 7 H20 por litro, pH 7) suplementado con 1 mM de MgS04 y una solución de elementos traza (Moldes et al., 2004. Appl. Environ. Microbiol., 70: 3205-3212). Los cultivos en medio líquido se realizaron en matraces en un agitador orbital (New brunswick scientific) a 200 rpm. Las células de E. coli y Pseudomonas putida se incubaron a 37°C y 30°C, respectivamente.
El crecimiento en medio líquido se determinó por turbidimetría a 600 nm (DO600) empleando un espectrofotómetro Beckman DU-520.
Durante periodos inferiores a un mes las cepas se conservaron a 4°C en placas de LB o medio mínimo. Para la conservación a largo plazo, las bacterias se congelaron en el medio de cultivo correspondiente con glicerol al 15% (v/v) y se mantuvieron a -80°C.
Para producir PHA se cultivaron las células de Pseudomonas putida KT2440 durante 24 h en medio M63 0, 1 N cuya composición es similar a la del M63 pero con 0,2 g/l de (NH4)2S0 en lugar de 2 g/l, utilizando 15 mM de octanoato como única fuente de carbono (Moldes et al., 2004. Appl. Environ. Microbio/., 70: 3205-3212).
3.3. Transformación genética de las células utilizadas.
Las células de E. coli fueron modificadas genéticamente por transformación tras hacerlas competentes mediante el método de RbCI (Sambrook y Rusell, 2001 . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. CSHL Press, Cold Spring Harbor, Nueva York.), o bien mediante electroporación (Wirth et al., 1989 Mol Gen Genet 216: 175-177).
Las células de Pseudomonas putida se modificaron genéticamente por transformación por electroporación. Para electroporar las células de Pseudomonas putida se recogieron células en cultivo líquido o masa celular proveniente de placas de agar y se realizaron cinco lavados con agua estéril a 4°C. Las condiciones del equipo de electroporación Gene Pulser/Pulse Controller (Bio-Rad) fueron 2,5 kV, 25 μΡ y 200 Ω.
En algunas circunstancias los plásmidos se movilizaron a Pseudomonas putida por conjugación bi- o tri-parental siguiendo el método descrito por de Lorenzo y Timmis, (1994) Methods Enzymol 235: 386-405) y utilizando la cepa E. coli HB101 (pRK600) como cepa auxiliar. Los transconjugantes de Pseudomonas putida fueron seleccionados en placas de medio LB con los correspondientes antibióticos o en placas de medio mínimo con citrato al 0,2% y el correspondiente antibiótico.
3.4. Técnicas de manipulación de DNA utilizadas.
Las técnicas utilizadas para la preparación y manipulación del DNA han sido descritas por Sambrook y Rusell (2001 ). Las enzimas de restricción se obtuvieron de Amersham, Takara y New England Biolabs. La enzima T4 DNA ligasa fue proporcionada por USB (Amersham), la DNA polimerasa I de Thermus sp. y la Pfu polimerasa fueron suministradas por Biotools B&M Labs. S. A. Todas las enzimas se emplearon atendiendo a las especificaciones de las diferentes casas comerciales. Los fragmentos de DNA se purificaron empleando geles de agarosa, mediante el kit GeneClean (BIO 101 ) o el High Puré PCR Product Purication Kit (Roche).
La extracción de DNA plasmídico se llevó a cabo empleando el sistema High Puré Plasmid Purification Kit (Roche), de acuerdo con el protocolo del fabricante.
La extracción de DNA genómico se llevó a cabo empleando el GenomicPrepTM Cells and Tissue DNA Isolation Kit (GE Healthcare) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La amplificación del DNA se realizó en un equipo Mastercycler Gradient de Eppendorf. Las mezclas de reacción contenían MgC^ 1 ,5 mM, dNTPs 0,2 mM, dimetilsulfóxido al 10%, 0,5 unidades de DNA polimerasa, 100 ng de DNA molde y oligonucleótidos a una concentración final de 0,5 μΜ. Los fragmentos de DNA se purificaron empleando geles de agarosa, usando el kit GeneClean (BIO 101 ) o el kit "High Puré™ PCR Product Purification Kit" (Boehringer Mannheim).
Los distintos oligonucleótidos empleados en las reacciones de PCR fueron adquiridos en Sigma-Genosys y se indican en la Tabla 5.
3.5. Cuantificación de PHA.
Para cuantificar el PHA presente en los sedimentos celulares se tomaron de 5 a 10 mg de muestra liofilizada que se metanolizaron durante 4 h a 100°C en presencia de 2 mi de cloroformo y 2 mi de metanol:ácido sulfúrico (85: 15, v:v) con 0,5 mg/ml de ácido metil benzoico como estándar interno. Tras enfriar los tubos, se añadió 1 mi de agua, se mezcló por agitación vigorosa (vórtex) y se separaron las fases centrifugando suavemente. La fase orgánica obtenida se analizó en un sistema cromatográfico compuesto por un cromatografo de gases Agilent (Waldbronn, Alemania) serie 7890 A acoplado a un detector de masas 5975.
1 μΙ de la fase orgánica fue inyectada en el cromatografo con un split 50: 1 . La separación de los compuestos se llevó a cabo en una columna capilar HP5 MS (5% fenil-95% metil siloxano, 30 m x 0,25 mm i.d. x 0,25 mm). Como gas portador se utilizó helio a un flujo de 0,9 ml/min. Las temperaturas del inyector y la línea de transferencia fueron de 275 y 300°C, respectivamente. El programa de temperatura de la columna fue el siguiente: temperatura inicial 80°C durante 2 min tras lo cual se aplicó una rampa de 10°C/min hasta alcanzar los 200°C. El espectro de masas se recogió en modo full sean (m/z 40-550). El análisis cuantitativo se llevó a cabo calculando los factores de respuesta de los monómeros con respecto al 3-MB. Para el cálculo de los factores se utilizaron mezclas de concentraciones conocidas de PHA, obteniéndose para cada uno de los monómeros cuantificados un factor de respuesta cuyo coeficiente de variación no superó el 5%.
3.6. Determinación de la sensibilidad de las bacterias a aceleradores de lisis.
Para determinar la sensibilidad de las bacterias a dodecilsulfato sódico (SDS), desoxicolato (DOC) o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) se inocularon las cepas en medio LB a DO600 0,5. Tras 6 h de incubación en agitación orbital se añadieron distintas concentraciones de los agentes químicos anteriormente mencionados durante 18 h. El crecimiento de estos cultivos se llevó a cabo en placas de 96 pocilios a 30°C con 2 min de agitación orbital fuerte cada 15 min (Multiskan Ascent, Thermo). Los valores de crecimiento que se muestran son la media de 3 replicados.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Cepa recombinante bacteriana Pseudomonas putida KT2440, que comprende un sistema genético heterologo lítico donde dicho sistema a su vez comprende las secuencias nucleotídicas que codifican:
a) una enzima lítica de pared celular,
b) una holina, y
c) un sistema regulador de la expresión génica
Cepa según la reivindicación 1 , donde:
a) la enzima lítica de pared celular es la endolisina Ejl,
b) la holina es la proteína Ejh, y
c) el sistema regulador de la expresión génica es XyIS/P
Cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicha cepa es el microorganismo con número de depósito CECT 7659.
Cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha cepa de Pseudomonas putida KT2440 es mutante en uno o más de los genes tol-pal.
Cepa según la reivindicación 4, donde dicha cepa es el microorganismo con número de depósito CECT 7658.
Cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el sistema genético heterologo lítico está insertado en su ADN cromosómico.
7. Cepa según la reivindicación 6, donde el sistema genético heterologo lítico insertado en su ADN cromosómico se encuentra en una sola copia.
8. Uso de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la extracción de polihidroxialcanoato (PHA).
9. Método para la extracción de polihidroxialcanoato (PHA) sintetizado por la bacteria según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende:
a) cultivar dicha cepa en un medio mínimo de cultivo,
b) añadir un compuesto efector de la expresión del sistema genético heterólogo lítico al cultivo del paso (a), y
c) aislar el compuesto sintetizado por dicha bacteria.
10. Método según la reivindicación 9, donde además comprende un paso previo al paso (a) donde la cepa o población bacteriana se cultiva en un medio rico de cultivo.
1 1 . Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, donde el compuesto efector de la expresión del sistema genético heterólogo lítico es ácido 3-metilbenzoico.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 1 1 , donde además, tras el paso (b), se adiciona una sustancia química que produce lisis celular o que acelera la lisis celular mediada por el sistema genético heterólogo lítico.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 1 1 , donde además, después del paso (a), se adiciona un precursor de PHA.
14. Método según la reivindicación 13, donde el precursor de PHA es un ácido graso o cualquier molécula susceptible de ser transformada en hidroxialcanoil-CoA mediante el metabolismo bacteriano.
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