WO2011071078A1 - 芳香族化合物、並びに、それを用いたオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体、オリゴヌクレオチド誘導体及びオリゴヌクレオチド構築物 - Google Patents

芳香族化合物、並びに、それを用いたオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体、オリゴヌクレオチド誘導体及びオリゴヌクレオチド構築物 Download PDF

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幸夫 北出
徳昭 喜多村
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国立大学法人岐阜大学
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    • C12N2310/351—Conjugate

Definitions

  • the present invention relates to an aromatic compound and a urea-modified carrier for synthesizing an oligonucleotide derivative, an oligonucleotide derivative, and an oligonucleotide construct using the aromatic compound.
  • oligonucleotides such as DNA and RNA have been used for therapeutic and diagnostic purposes.
  • a DNA chip and a DNA microarray can be mentioned.
  • expression suppression by knockdown of a disease-related gene can be mentioned.
  • aptamers that are nucleic acid molecules or peptides that specifically bind to specific molecules as therapeutic agents.
  • RNAi refers to a phenomenon in which the action of a gene whose sequence is homologous to it is suppressed by the action of double-stranded RNA (dsRNA).
  • dsRNA double-stranded RNA
  • Dicer a member of the RNase III family
  • siRNAs short interfering RNAs
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • RNA is easily degraded by nucleases, so that the intended knockdown effect cannot be obtained sufficiently or the knockdown effect is stable. There was a problem that it was difficult to maintain.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 For example, with respect to siRNA, as shown in FIG. 1, attempts have been made to chemically modify sugar, base, and phosphate ester sites with various substituents (Non-Patent Document 4).
  • the inventor modified an amidite reagent for introducing a benzene skeleton or a pyridine skeleton into a CPG resin as described in Patent Document 1 (see, for example, FIGS. 2 and 3), Two units having a benzene skeleton or a pyridine skeleton at the 3 ′ end have been successfully introduced.
  • This technology was developed in consideration of the important role of the 3 ′ end dangling end in RNAi, as shown below, and improves the nuclease resistance of oligonucleotides without reducing the effect of knockdown. Can be made.
  • RISC is known as a multidomain protein involved in the process of degradation of RNAi target mRNA, but recently, co-crystal X-ray crystal structure analysis of PAZ domain and siRNA in RISC has been carried out (JB.Ma). K. Ye and DJ Patel., Nature., 429, 318-322 (2004).). As a result, it was revealed that the PAZ domain recognized the 3 ′ end dangling end of siRNA, and two nucleotides at the 3 ′ end dangling end were recognized by entering the hydrophobic pocket of the PAZ domain. (JJ. Song., J. Liu., NH. Tolia., J. Schneiderman., SK. Smith., RA.
  • the present inventors converted the phosphodiester bond portion of the 3 ′ end dangling end of siRNA into a carbamate bond or a urea bond, thereby eliminating the negative charge of the bond portion, It has also succeeded in enhancing the nuclease resistance and silencing activity of siRNA by improving the permeability of the cell nucleus to the membrane (Non-patent Document 5).
  • the present invention has been made in view of the above-described conventional situation, and it is possible to easily synthesize an oligonucleotide derivative in which two skeletons among a benzene skeleton and a pyridine skeleton are chemically modified at the 3 ′ end, Furthermore, it is an object to provide a modified carrier for synthesizing oligonucleotide derivatives that can be easily synthesized with a small number of steps, and an aromatic compound that serves as a precursor for preparing the modified carrier for synthesizing oligonucleotide derivatives. .
  • an oligonucleotide derivative in which two of the benzene skeleton and the pyridine skeleton are chemically modified at the 3 ′ end has good permeability to the cell membrane, and has excellent nuclease resistance and oligonucleotide construct The purpose is to provide.
  • connection of aromatic rings by a urea bond can be very easily and quantitatively formed by coupling with carbonyldiimidazole.
  • a thiourea bond can be formed very easily and quantitatively from the same raw material via the corresponding isothiocyanate.
  • the modified carrier for synthesizing oligonucleotide derivatives of the present invention is characterized in that the unit represented by the following structural formula (a) is chemically modified to the carrier directly or via a linker (provided that R in the formula: 1 to R 6 each independently represent hydrogen or a substituent other than hydrogen, wherein Z 1 and Z 2 each independently represent CH or nitrogen, and X represents oxygen or sulfur.
  • R in the formula: 1 to R 6 each independently represent hydrogen or a substituent other than hydrogen, wherein Z 1 and Z 2 each independently represent CH or nitrogen, and X represents oxygen or sulfur.
  • the substituent other than hydrogen in R 1 to R 6 include an alkyl group, an aryl group, a haloalkyl group, and a halogen group.
  • the aromatic rings are linked by a urea bond or a thiourea bond, and a hydroxymethyl group is bound to the terminal aromatic ring.
  • a urea bond or a thiourea bond
  • a hydroxymethyl group is bound to the terminal aromatic ring.
  • the carrier is not particularly limited as long as it has a functional group capable of binding to the unit represented by the structural formula (a) (chemical formula 1) or the linker.
  • examples of such carriers include glass such as microporous glass and porous glass, and plastic (for example, polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, acrylonitrile butadiene styrene resin, nylon, acrylic resin, fluororesin, polycarbonate resin, polyurethane resin). Methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, vinyl chloride resin) and the like.
  • the shape of the carrier may be any shape such as beads, plates (substrates), threads, spheres, polygons, powders, and the like.
  • the linker is not particularly limited as long as it can chemically bond the unit represented by the structural formula (a) (chemical formula 1) and the carrier via the linker.
  • the linker of DNA or RNA A linker commonly used in automatic synthesis can be used. More specifically, the following succinic acid ester linker, oxalic acid ester linker, silanediyl linker, silyl linker, and the like can be used.
  • the modified carrier for synthesizing oligonucleotide derivatives of the present invention can be easily prepared by using an aromatic compound represented by the following structural formula (A) as a precursor (wherein R 1 to R 6 in the formula are independent of each other).
  • A aromatic compound represented by the following structural formula (A) as a precursor (wherein R 1 to R 6 in the formula are independent of each other).
  • Z 1 and Z 2 each independently represent CH or nitrogen
  • X represents oxygen or sulfur
  • Pr 1 and Pr 2 each independently represent A protecting group for a hydroxyl group).
  • the unit represented by the following structural formula (a 1 ) may be chemically modified to the carrier directly or via a linker (provided that R 1 and R 2 in the formula are Are each independently an alkyl group, aryl group, haloalkyl group or halogen group, Z 1 and Z 2 each independently represent CH or nitrogen, and X represents oxygen or sulfur). Particularly preferred for R 1 and R 2 is an alkyl group or a haloalkyl group such as a fluoroalkyl group.
  • R 1 and R 2 is an alkyl group or a haloalkyl group such as a fluoroalkyl group.
  • This modified carrier for synthesizing oligonucleotide derivatives can be easily prepared by using an aromatic compound represented by the following structural formula (A 1 ) as a precursor (wherein R 1 and R 2 are each independently an alkyl group) , An aryl group, a haloalkyl group and a halogen group, Z 1 and Z 2 each independently represent CH or nitrogen, X represents oxygen or sulfur, and Pr 1 and Pr 2 each independently A hydroxyl protecting group). Particularly preferred for R 1 and R 2 is an alkyl group or a haloalkyl group such as a fluoroalkyl group.
  • the unit represented by the following structural formula (a 2 ) may be chemically modified to the carrier directly or via a linker.
  • the present inventors have confirmed that even when such a modified carrier for synthesizing oligonucleotide derivatives is used, it is possible to synthesize oligonucleotide derivatives easily and in high yield with a small number of steps.
  • This modified carrier for oligonucleotide derivative synthesis can be easily prepared using an aromatic compound represented by the following structural formula (A 2 ) as a precursor.
  • the oligonucleotide derivative of the present invention is a unit wherein the 3 ′ end of the oligonucleotide is represented by the following structural formula (a) (wherein R 1 to R 6 are each independently hydrogen or a substituent other than hydrogen) In the formula, each of Z 1 and Z 2 independently represents CH or nitrogen, and X represents oxygen or sulfur).
  • the oligonucleotide derivative of the present invention can be easily synthesized by the oligonucleotide synthesis method conventionally used for the synthesis of DNA and RNA, using the modified carrier for synthesizing the oligonucleotide derivative of the present invention as a starting material.
  • this oligonucleotide derivative has two aromatic rings at the 3 ′ end, and the aromatic rings are bonded to each other by a urea bond or a thiourea bond. For this reason, the 3 ′ end exhibits hydrophobicity, the permeability to the cell membrane is good, and the nuclease resistance is excellent.
  • oligonucleotide derivative of the present invention when placed in a cell, the effect can be maintained for a longer time. Furthermore, when used for RNAi, it is thought that it can easily enter the hydrophobic pocket of the PAZ domain in RISC, and the effect of knockdown can be enhanced.
  • the 3 ′ end of the oligonucleotide may be modified with a unit represented by the following structural formula (a 1 ) (wherein R 1 and R 2 are each independently alkyl Any one of a group, an aryl group, a haloalkyl group and a halogen group, Z 1 and Z 2 each independently represent CH or nitrogen, X represents oxygen or sulfur, and Pr 1 and Pr 2 each independently A protective group for a hydroxyl group). Particularly preferred for R 1 and R 2 is an alkyl group or a haloalkyl group such as a fluoroalkyl group.
  • the present inventors have confirmed that such an oligonucleotide derivative has an excellent nuclease resistance and can sustain a knockdown effect in RNAi for a longer time when placed in a cell.
  • the 3 ′ end of the oligonucleotide may be modified with a unit represented by the following structural formula (a 2 ).
  • the present inventors have confirmed that such an oligonucleotide derivative has an excellent nuclease resistance and can sustain a knockdown effect in RNAi for a longer time when placed in a cell.
  • the oligonucleotide portion may have a partial sequence of a predetermined gene mRNA or a complementary sequence thereof.
  • the chain length of the oligonucleotide may be 10 or more and 35 or less.
  • the oligonucleotide may be an oligoribonucleotide.
  • the oligonucleotide construct of the present invention is an oligonucleotide construct for regulating gene expression, characterized by having any of the above-described oligonucleotide derivatives.
  • This oligonucleotide construct can be an oligonucleotide construct selected from single and double stranded DNA, single and double stranded RNA, DNA / RNA chimeras and DNA / RNA hybrids, and its function. From the aspect, it can be selected from antigene, antisense, aptamer, siRNA, miRNA, shRNA and lipozyme.
  • an oligonucleotide construct for gene diagnosis having any of the above-described oligonucleotide derivatives can be obtained.
  • the construct can be a probe or primer.
  • the modified carrier for synthesizing oligonucleotide derivatives of the present invention can be prepared as follows.
  • the nucleotide referred to here is a nucleotide that may be modified.
  • a method for preparing an oligonucleotide derivative by various nucleic acid synthesis methods including the amidite method using the modified carrier for synthesis of oligonucleotide derivative of the present invention can be used.
  • the hydroxyl protecting group is not particularly limited, and various conventionally known hydroxyl protecting groups can be used. Specific examples of such a protecting group include a benzyl group, an acetyl group, and a benzoyl group, and a particularly preferred protecting group is a benzyl group.
  • Specific examples of the amino-protecting group include a phthalic acid group and a benzoyl group, with a phthalic acid group being particularly preferred.
  • a unit represented by the formula (a) may be provided.
  • a unit represented by the formula (a) can be provided on the free end side.
  • the primer may be appropriately provided with a unit represented by the formula (a) as necessary.
  • oligonucleotide generally means a polymer having a plurality of monomer units, each of which is a monomer that constitutes an oligonucleotide or a polynucleotide.
  • the oligonucleotide means deoxyribonucleotide and / or ribonucleotide as a monomer unit.
  • a polymer having deoxyribonucleotides as monomer units as nucleotides is referred to as DNA
  • a polymer having ribonucleotides as monomer units is referred to as RNA
  • the oligonucleotide derivative of the present invention is generally used for DNA and RNA
  • Oligonucleotides also include RNA / DNA chimeras.
  • oligonucleotides which may be modified include purine and pyrimidines such as guanine, cytosine, thymine, adenine, uracil or methylcytosine. That is, oligonucleotides having one or more nucleotides with some chemical modification in the base, sugar moiety and phosphate ester moiety.
  • the oligonucleotide derivative of the present invention can have a sense strand of DNA of a predetermined gene, an antisense strand thereof, a partial sequence of mRNA, or a complementary sequence thereof. By having such complementarity, it is possible to hybridize with various target nucleic acids, thereby expressing the intended function of the oligonucleotide derivative.
  • the length of the oligonucleotide is not particularly limited and can be a length according to the use. However, considering the ease of oligonucleotide synthesis and the expected effect, it is 10 or more. It is preferable to be 35 or less.
  • antisense it can be about 10 or more and 30 or less.
  • siRNA the total chain length of A and B is preferably 15 or more and 35 or less, more preferably 30 or less.
  • a primer it is preferably 10 or more and 30 or less, and in the case of a probe, it is preferably 10 or more and 30 or less.
  • the monomer unit can be an oligoribonucleotide which may be modified.
  • the oligonucleotide construct of the present invention has the oligonucleotide derivative of the present invention.
  • the construct can be in the form of single-stranded DNA, double-stranded DNA, single-stranded RNA, double-stranded RNA, DNA / RNA chimera, DNA / RNA hybrid, etc. Each or a combination can be used.
  • the oligonucleotide construct may also contain a modified form of the oligonucleotide.
  • the oligonucleotide construct of the present invention can be used for gene expression regulation or for various uses for research and diagnosis.
  • gene expression regulation applications include antigene, antisense, aptamer, siRNA, miRNA, shRNA and ribozyme.
  • siRNA and shRNA by introducing the unit represented by the formula (a) into dT at the 3′-terminal overhang site in siRNA and shRNA, both nuclease resistance and silencing activity can be improved.
  • Probes are oligonucleotides that have, by design or selection, a sequence that is specifically defined for the target nucleic acid and that allow them to hybridize under a given stringency. Nuclease resistance is improved by using this oligonucleotide derivative as a probe, so the effect of nuclease mixed in the sample containing the target nucleic acid is suppressed or avoided, and even if the degree of nuclease removal is low or nuclease removal treatment Sample preparation without omission becomes possible. As a result, genetic diagnosis and testing can be performed easily.
  • Such hybridization between the probe and the target can be performed by immobilizing the probe on an appropriate glass substrate, a plastic substrate, or a solid phase carrier such as beads.
  • the present invention also includes a solid phase carrier on which a probe containing the present oligonucleotide derivative is immobilized.
  • the oligonucleotide derivative of the present invention can be used as a gene expression inhibitor by being constructed so as to function as siRNA or antisense. Further, the oligonucleotide derivative of the present invention can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for prevention / treatment of diseases in humans and non-human animals. For example, for a disease associated with gene expression, the oligonucleotide derivative of the present invention constructed as a gene expression inhibitor is effective for the prevention and treatment of such diseases.
  • the oligonucleotide derivative of the present invention can be used as a test reagent or a diagnostic reagent such as a probe or a primer by constructing it so as to exhibit its hybridization function. Furthermore, what hold
  • the oligonucleotide derivative of the present invention can also be used in a gene expression suppression method using the gene expression suppression action of an oligonucleotide construct containing the oligonucleotide derivative of the present invention. Furthermore, it can also be used in a gene detection method using the hybridization function of the oligonucleotide construct of the present invention.
  • Example 1 ⁇ Synthesis of modified carrier for synthesis of oligonucleotide derivative in which benzene ring and pyridine ring are urea-bonded>
  • a modified carrier for synthesizing oligonucleotide derivatives using a benzene-pyridine skeleton as a mother nucleus was synthesized as follows. By using 2,6-pyridinedimethanol as a starting material and reacting with tert-butyldimethylsilyl chloride (TBDMSCl) in the presence of sodium hydride, a silyl compound 1 in which one hydroxyl group is protected with a TBDMS group is obtained in a yield of 49 % Was synthesized.
  • TBDMSCl tert-butyldimethylsilyl chloride
  • dimethoxytritylated compound 4 was obtained with a yield of 91% using 4,4′-dimethoxytrityl chloride (DMTrCl) using 3-cyanobenzyl alcohol as a starting material, and then aluminum hydride.
  • the cyano group was reduced with lithium to obtain benzylamino compound 5 in a yield of 69%.
  • the pyridine derivative 3 and the benzylamino compound 5 were coupled using carbonyldiimidazole to obtain the urea derivative 6 in a yield of 43%.
  • the corresponding thiourea derivative can be easily and quantitatively formed from the same raw material via the corresponding isothiocyanate.
  • an oligonucleotide derivative-modified carrier having a thiourea bond can be synthesized in the same manner as the modified carrier for synthesizing oligonucleotide derivatives having a urea bond shown below.
  • the urea derivative 6 obtained as described above was treated with TBAF to obtain the desilylated product 7 shown below in a yield of 98%, and then subjected to succinylation with succinic anhydride according to a conventional method.
  • the modified carrier 9 for synthesizing oligonucleotide derivatives of Example 1 was obtained with an activity of 38.5 ⁇ mol / g.
  • the reaction solution was washed with pyridine, EtOH, and MeCN and vacuum-dried for 12 hours, and then the activity of the obtained resin was measured.
  • Comparative Example 1 Based on the technique described in Patent Document 1 previously developed by the present inventors, a modified carrier (19) for synthesizing an oligonucleotide derivative of Comparative Example 1 was synthesized according to the synthetic route of Chemical Formula 9 below. Details are described below.
  • Example 2 Synthesis of modified carrier for synthesis of oligonucleotide derivative in which benzene ring and pyridine ring are thiourea-bonded>
  • a modified carrier for synthesizing oligonucleotide derivatives in which a benzene ring and a pyridine ring are thiourea-bonded was synthesized according to the following synthesis route.
  • the organic layer was washed with sat NaCl aq and dried over anhydrous Na 2 SO 4 , and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a succinyl compound (24).
  • the succinyl compound (14) vacuum-dried overnight was dissolved in DMF (6 mL, 0.01 M against CPG), and then CPG resin (119 ⁇ mol / g) (480 mg, 0.058 mmol) was added to blend with the solution . Then, EDC-HCl (44 mg, 0.23 mmol) was added and shaken for 48 hours.
  • the reaction solution was washed with Pyridine, EtOH, and MeCN and vacuum dried for 12 hours, and then the activity of the obtained thiourea type CPG resin (25) was measured. Its activity value was 48.3 ⁇ mol / g.
  • Put 6 mg of dried CPG resin on a glass filter, pour a solution of HClO 4 : EtOH 3: 2, determine the absorbance of the UV wavelength of 498 nm (wavelength of DMTr group) of the filtrate, and substitute it into the following formula Was calculated.
  • Example 3 ⁇ Synthesis of Modified Carrier for Synthesis of Oligonucleotide Derivatives with Pyridine Rings Linked to Thiourea>
  • a modified carrier 31 for synthesizing oligonucleotide derivatives in which pyridine rings are thiourea bonded to each other was synthesized according to the following synthesis route.
  • N, N'-Bis ⁇ [6- (hydroxymethyl) pyridin-2-yl] methyl ⁇ urea (28) N, N'-Bis ⁇ [6- (tert-butyldimethylsilyloxy) methylpyridin-2-yl] methyl ⁇ urea (27) (855 mg, 1.61 mmol) was suspended in THF (8.1 mL), degassed, and replaced with Ar And stirred at room temperature. TBAF 1.0M THF (3.7 mL) was added dropwise and further stirred. After 5 hours, the disappearance of the raw materials was confirmed by TLC, and then the reaction solution was distilled under reduced pressure.
  • reaction solution was extracted with sat NaHCO 3 aq ⁇ 1, EtOAc ⁇ 2, H 2 O ⁇ 1, sat NaCl aq ⁇ 1, and then the organic layer was dried over anhydrous Na 2 SO 4 and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • oligonucleotide synthesis method and purification method in the synthesis of siRNA are shown below.
  • the phosphoramidite method shown below was used with an automatic nucleic acid synthesizer. 1.
  • the 3′-end protecting group and dimethoxytrityl (DMTr) group of the oligonucleotide chain (fixed to the supporting solid CPG via the 3′-end linking group) are removed with an acid. 2.
  • DMTr dimethoxytrityl
  • Tetrazole was used as the amidite activator.
  • Oxidation of the phosphite triester produced by coupling to a phosphotriester results in a chain with one extended nucleotide.
  • each phosphoramidite of AGCU was dissolved in MeCN solution so as to be 0.1M, and the synthesized pseudo dangling end resin was dissolved in MeCN solution so as to be 0.12M.
  • the synthesis was completed with the DMTr group removed at the 5 'end of the oligonucleotide.
  • the CPG resin was dried through Ar gas.
  • siRNA (BuP) siRNA chain synthesized using the modified oligonucleotide derivative synthesis carrier (9) of Example 1 as described above, and the modified oligonucleotide derivative synthesis carrier of Comparative Example 1 ( 18) is used to anneal the siRNA strand synthesized with the complementary strand to form double strands (TT-antisense and TT-sense, BUP-antisense and BUP-sense).
  • Tm (° C.) was measured.
  • SiRNA synthesized using the modified carrier (9) for synthesizing oligonucleotide derivatives of Example 1 siRNA (BuP)
  • siRNA synthesized using the modified carrier for synthesizing oligonucleotide derivatives (18) of Comparative Example 1 below
  • BP protein expression inhibitory effect
  • the synthesized siRNA targets Renilla Luciferase, and the knockdown effect was measured by simultaneously transfecting a HeRNA cell with a vector expressing this gene and a control gene (firefly Luciferase) and siRNA.
  • This method uses a vector that expresses the photoproteins Firefly luciferase and Renilla luciferase, and evaluates inhibition of protein expression of Renilla luciferase by siRNA based on the ratio of the respective luminescence (see FIG. 6). .
  • HeLa cells were adjusted to 4000 cells / ml, and 100 ⁇ l each was added to each well of a 96-well plate and cultured for 24 hours.
  • Each strand of the synthesized siRNA was dissolved in TE buffer (100 mM NaCl) and annealed.
  • transfast transfection transfection reagent 1.5 ⁇ ⁇ ⁇ l to a total volume of 175 ⁇ l
  • 35 ⁇ l of each medium was put into each well of the 96-well plate from which the medium was sucked out, and after 1 hour, 100 ⁇ l of the medium was added and cultured for 24 hours. After 24 hours, the medium was aspirated and stored frozen.
  • Dual-globula substrate (Firefly substrate) was added and allowed to stand for 10 minutes, and then 23 ⁇ l of the sample was transferred to a 96-well plate for luminescence measurement, and Firefly-luciferase was measured. Then, Stop and glo substrate 23 ⁇ l was added and allowed to stand for 10 minutes, and then Renilla luciferase was measured. The value of Renillaaseluciferase was divided by the value of Firefly luciferase and compared using% of control. In addition, Luminescenser JNR was used for luciferase measurement.
  • siRNA (BuP) has the same level of protein expression suppression ability as siRNA (BP) having a benzene-pyridine moiety.
  • a fluorescent substituent was modified at the 5 ′ end of siRNA (BuP), siRNA (BP) and natural siRNA (TT) synthesized as described above, and their 3 ′ exonuclease resistance was examined.
  • the fluorescent substituent was fluorescein, and a phosphoramidite form of fluorescein was introduced into the 5 'end by a phosphoramidite method using a DNA / RNA automatic synthesizer.
  • siRNA modified with a fluorescent substituent at the 5 ′ end was examined. That is, oligonucleotides fluorescently labeled with Fluoresein (siRNA (TT), siRNA (BP) and siRNA (BuP) 300 pmol, SVP 5.0 ⁇ 10 ⁇ 3 unit / mL 100 ⁇ L were added, incubated at 37 ° C., and incubated for 0 min.
  • TT Fluoresein
  • BP siRNA
  • BuP siRNA
  • reaction stop solution (0.1% BPB, XC in 7 M Urea) previously dispensed into a separate Eppendorf tube 15 5 ⁇ L of the reaction solution was added to ⁇ L to prepare a reaction solution for each time, and the 0 min sample was not added with enzyme. These were separated by 20% PAGE, and then the degree of nuclease resistance was examined by measuring the fluorescence intensity of fluorescein using a fluorescence scanner (Lumino Image Analyzer LAS-4000).
  • siRNA synthesized using the modified carrier (9) for synthesizing oligonucleotide derivatives of Example 1 (hereinafter “siRNA (BuP) is composed of single-stranded and double-stranded DNA, single-stranded and double-stranded DNA”. It has also been clarified to have similar nuclease resistance when used for strand RNA, DNA / RNA chimera, DNA / RNA hybrid and the like.
  • the modified carrier for synthesizing oligonucleotide derivatives of the examples can easily synthesize oligonucleotide derivatives in which two skeletons of the benzene skeleton and the pyridine skeleton are chemically modified at the 3 ′ end.
  • the pyridine ring and the benzene ring are connected by a urea bond, and the connection of aromatic rings by the urea bond can be very easily and quantitatively formed by coupling with carbonyldiimidazole.
  • the synthesis is easy as compared with a modified carrier for synthesizing a ribonucleotide derivative in which a phosphate ester bond is formed using an amidite reagent.
  • Example 4 ⁇ Synthesis of modified carrier for synthesis of oligonucleotide derivatives in which fluoromethylbenzene rings are urea-bonded>
  • a modified carrier for synthesizing oligonucleotide derivatives in which fluoromethylbenzene rings were urea-bonded was synthesized according to the following synthesis route.
  • Dimethyl 5-fluoromethylisophthalate (33) Dimethyl 5-hydroxymethylisophthalate (32) (3.36 g, 15.0 mmol) is dissolved in CH 2 Cl 2 (150 mL, 0.1M solution) under an Ar atmosphere, and ice-cooled (diethylamino) sulfur trifluoride (4.00 mL, 30.5 mmol) was slowly added dropwise and stirred at room temperature for 2 hours. After confirming the progress of the reaction by TLC, MeOH (150 mL) was added to stop the reaction.
  • Methyl 3-azidomethyl-5-fluoromethylbenzoate (35) Methyl 3-fluoromethyl-5-hydroxymethylbenzoate (34) (2.30 g, 11.6 mmol) was dried for 24 hours, sodium azide (3.77 g, 58.1 mmol), carbontetrabromide (4.24 g, 12.1 mmol), triphenylphosphine (3.66 g, 13.9 mmol) ) was dried for 48 hours. Under Ar atmosphere, triethylamine (3.6 mL) was added, and then dissolved in DMF (88 mL), followed by stirring at room temperature for 93 hours.
  • a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added to the aqueous layer during extraction to make it basic, followed by extraction with ethyl acetate, dehydration with saturated brine, and drying over anhydrous sodium sulfate, and then the solvent was distilled off under reduced pressure. Then, methyl 3-aminomethyl-5-fluoromethylbenzoate (37) (33.1 mg, 8%) was obtained as a yellow transparent oil.
  • the present invention can provide a useful means in the medical field using nucleic acid oligomers such as RNA drug discovery that is expected to develop into individualized medicine.

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Abstract

【課題】３´ 末端にベンゼン骨格及びピリジン骨格のうち２つの骨格が化学修飾されたオリゴヌクレオチド誘導体を容易に合成することが可能であり、しかも少ない工程数で容易に合成することができるオリゴヌクレオチド誘導体、及び、そのオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体を調製するための前駆体となる芳香族化合物を提供する。また、３´ 末端ダングリングエンドにベンゼン骨格及びピリジン骨格のうち２つの骨格が化学修飾されたオリゴヌクレオチド誘導体であって、細胞膜への透過性が良好で、優れたヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチド誘導体及びオリゴヌクレオチド構築物を提供する。 【解決手段】下記構造式（ａ）で示されるユニットがリンカーを介して担体に化学修飾されていることを特徴とするオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体（ただし、式中のＲ１～Ｒ６はそれぞれ独立して水素又は水素以外の置換基を示す。また、式中Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立してＣＨ又は窒素を示し、Ｘは酸素又はイオウを示す）。

Description

芳香族化合物、並びに、それを用いたオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体、オリゴヌクレオチド誘導体及びオリゴヌクレオチド構築物
  本発明は、芳香族化合物、並びに、それを用いたオリゴヌクレオチド誘導体合成用ウレア修飾型担体、オリゴヌクレオチド誘導体、及びオリゴヌクレオチド構築物に関する。
  近年、ＤＮＡやＲＮＡなど各種のオリゴヌクレオチドが治療、診断等の用途に用いられるようになってきている。例えば、診断用途においては、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイが挙げられ、治療用途では、治療関連遺伝子の導入ほか、疾患関連遺伝子のノックダウンによる発現抑制等が挙げられる。また、特定の分子と特異的に結合する核酸分子やペプチドであるアプタマーを治療薬として用いる試みもなされている。
  特に注目される核酸技術としては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した、特定遺伝子のノックダウン法が挙げられる。ＲＮＡｉとは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の働きによって、それと配列の相同な遺伝子の働きが抑制される現象をいう。ＲＮＡｉによる遺伝子発現の抑制は、ｄｓＲＮＡがＲＮａｓｅIIIファミリーの一種であるＤｉｃｅｒによって認識され、切断されて２１～２３量体のｓｉＲＮＡｓ（short  interfering  RNAs）となり、このｓｉＲＮＡがＲＩＳＣ（RNA－induced  silencing  complex）に取り込まれ、続いて取り込まれたｓｉＲＮＡに相同的なｍＲＮＡが中央部で切断され、分解されることによる。
  しかしながら、生体内において外来性のＤＮＡやＲＮＡは、各種のヌクレアーゼに曝されており、特にＲＮＡはヌクレアーゼにより分解されやすいため、意図したノックダウン効果が充分得られなかったり、ノックダウン効果を安定的に維持させるのが困難であったりするという問題があった。
  この問題を解決するため、オリゴヌクレオチドを化学修飾してヌクレアーゼ耐性を向上させることが検討されている（非特許文献１～３）。例えば、ｓｉＲＮＡについても、図１に示すように、糖や塩基やリン酸エステルの部位を様々な置換基で化学修飾することが試みられている（非特許文献４）。
  こうした状況下、本発明者は、特許文献１に記載されているように、ベンゼン骨格やピリジン骨格を導入するためのアミダイト試薬をＣＰＧ樹脂に修飾し（例えば図２及び図３参照）、ヌクレオチドの３´末端にベンゼン骨格やピリジン骨格を有するユニットを２つ導入することに成功している。この技術は、以下に示すような、ＲＮＡｉにおける３´末端ダングリングエンドの重要な役割を考慮して開発されたものであり、ノックダウンの効果を低下させることなく、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を向上させることができる。
  すなわち、ＲＮＡｉの標的ｍＲＮＡの分解の過程に関与するマルチドメインタンパクとしてＲＩＳＣが知られているが、近年、ＲＩＳＣ中のＰＡＺドメインとｓｉＲＮＡの共結晶Ｘ線結晶構造解析が行われた（J.B．Ma.，K．Ye  and  D.J．Patel.，Nature.,429，318-322（2004).）。その結果、ＰＡＺドメインはｓｉＲＮＡの３´末端ダングリングエンドを認識しており、３´末端ダングリングエンドの２つのヌクレオチドがＰＡＺドメインの疎水性ポケットに入り込んで認識されていることが明らかとなった（J.J．Song.，J．Liu.，N.H．Tolia.，J．Schneiderman.，S.K．Smith.，R.A．Martienssen.，G.J．Hannon  and  L．Joshua-Tor.，Nat．Struct．Biol.，10，1026-1032  （2003)、K.S．Yan.，S．Yan.，A．Farooq.，A．Han.，L．Zeng  and  M.M．Zhou.，Nature.，426，468-474  （2003)、Zhang.，F.A．Kolb.，L．Jaskiewicz.，E．Westhof  and  W.Filipowicz.，Cell.，118，57-68  （2003)及びA．Lingel.，B．Simon.，E．Izaurralde  and  M．Sattler.，Nature.，426，465-469  （2003)）。このため、３´末端ダングリングエンドの２つのヌクレオチドの代わりに、疎水性を有するベンゼン骨格やピリジン骨格を２つ化学修飾すれば、ノックダウンの効果を高めることができるのではないかという発想のもと、特許文献１に記載されたオリゴヌクレオチド誘導体が開発されたのである。
  なお、本発明に関連する技術として、本発明者らは、ｓｉＲＮＡの３´末端ダングリングエンドのリン酸ジエステル結合部分をカルバメート結合やウレア結合に変換し、これによって結合部分の負電荷をなくし、細胞核の膜への透過性を良好にすることにより、ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性とサイレンシング活性とを高めることにも成功している（非特許文献５）。
ＷＯ２００７／０９４１３５
L.Beigelman.,J.A  McSwiggen．，K.G.Draper  et  al.,J  Biolchem  270，25702－25708（1995）27 S.P.Zinnen  K.Domenico.,  M.  Wilson  et  al.,  RNA  8,214-228(2002) S.Agrawaland  E.R.KandimaIla.,  Curr.  Cancer  Drug  Targets.,1,197-209（2001） H．Hoshi,  FEBS  Letters  521，197-199（2002） Y.Ueno,T.Naito,K.Kawada,A.Shibata,Hye-Sook  Kim  Y.Wataya,Y.Kidade,Biochem  Biophys  Res  Commun330,1168-1175(2005)
  しかし、上記特許文献１に記載されている、３´末端にベンゼン骨格やピリジン骨格を２つ化学修飾させたオリゴヌクレオチド誘導体を合成する際に使用する担体の調製には多くの工程が必要であり、極めて手間がかかるものであった（例えば図２及び図３参照）。また、この担体の調製には、化学的に不安定なアミダイト体と、リンカーを介して担体に結合したベンゼン骨格やピリジン骨格に結合しているヒドロキシメチル基とを反応させなければならず、この一連の反応を成功させるためには、高度に訓練された技術者によって注意深く行わなければならないという問題があった。
  本発明は、上記従来の実情に鑑みてなされたものであり、３´末端にベンゼン骨格及びピリジン骨格のうち２つの骨格が化学修飾されたオリゴヌクレオチド誘導体を容易に合成することが可能であり、しかも少ない工程数で容易に合成することができるオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体、及び、そのオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体を調製するための前駆体となる芳香族化合物を提供することを目的とする。
  また、３´末端にベンゼン骨格及びピリジン骨格のうち２つの骨格が化学修飾されたオリゴヌクレオチド誘導体であって、細胞膜への透過性が良好で、優れたヌクレアーゼ耐性を有するオリゴヌクレオチド誘導体及びオリゴヌクレオチド構築物を提供することを目的とする。
  上記特許文献１に記載されている、３´末端にベンゼン骨格やピリジン骨格を２つ化学修飾させたオリゴヌクレオチド誘導体を合成する際に使用する担体の調製では、ＤＮＡやＲＮＡの合成に用いられているアミダイト体と同様の手法により、芳香族環どうしがリン酸ジエステル結合によって連結される。このため、中間体として化学的に不安定なアミダイト体を用いることとなり、これが合成のための工程数の増加や合成の困難性の原因となっていた。このため、本発明者らは、芳香族環どうしをリン酸ジエステル結合で連結するのではなく、尿素結合により連結することとした。尿素結合による芳香族環どうしの連結はカルボニルジイミダゾールを用いてカップリングすることにより極めて容易かつ定量的に形成させることができるからである。また、チオ尿素結合による連結においても、同様の原料から対応するイソチオシアネートを経由して、極めて容易かつ定量的にチオ尿素結合を形成させることができる。
 すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体は、下記構造式（ａ）で示されるユニットが直接又はリンカーを介して担体に化学修飾されていることを特徴とする（ただし、式中のＲ１～Ｒ６はそれぞれ独立して水素又は水素以外の置換基を示す。また、式中Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立してＣＨ又は窒素を示し、Ｘは酸素又はイオウを示す）。Ｒ１～Ｒ６において水素以外の置換基としては、例えばアルキル基、アリール基、ハロアルキル基及びハロゲン基等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
  本発明のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体では、芳香族環どうしが尿素結合又はチオ尿素結合により連結しており、末端の芳香族環にはヒドロキシメチル基が結合している。このため、ＤＮＡやＲＮＡの合成に多用されているアミダイト体を、このヒドロキシメチル基に結合させることにより、任意の配列のオリゴヌクレオチドを連結させることができる。また、この尿素結合による芳香族環どうしの連結は、カルボニルジイミダゾールを用いてカップリングすることにより極めて容易かつ定量的に形成させることができる。また、チオ尿素結合による連結においても、同様の原料から対応するイソチオシアネートを経由して、極めて容易かつ定量的にチオ尿素結合を形成させることができる。
  ここで担体は、上記構造式（ａ）（化１）で示されるユニットやリンカーと結合できる官能基を有するものであれば、特に限定はされない。このような担体として、例えば、微小多孔質ガラスやポーラスガラス等のガラス、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）等が挙げられる。担体の形状としては、ビーズ状、板状（基板状）、糸状、球状、多角形状、粉末状等、どのような形状のものであってもよい。
  また、リンカーは、上記構造式（ａ）（化１）で示されるユニットと担体とをリンカーを介して化学結合できるものであれば、特に限定はされることはなく、例えば、ＤＮＡやＲＮＡの自動合成において通常用いられているリンカーを用いることができる。さらに具体的には、以下に示すコハク酸エステルリンカー、シュウ酸エステルリンカー、シランジイルリンカー、シリルリンカーなどを用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 上記本発明のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体は、下記構造式（Ａ）で示される芳香族化合物を前駆体として容易に調製することができる（ただし、式中のＲ１～Ｒ６はそれぞれ独立して水素又は水素以外の置換基を示す。また、式中Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立してＣＨ又は窒素を示し、Ｘは酸素又はイオウを示す。Ｐｒ１及びＰｒ２はそれぞれ独立して水酸基の保護基を示す。）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
  本発明のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体は、下記構造式（ａ１）で示されるユニットが直接又はリンカーを介して担体に化学修飾されていてもよい（ただし、式中のＲ１及びＲ２はそれぞれ独立してアルキル基、アリール基、ハロアルキル基及びハロゲン基のいずれかであり、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立してＣＨ又は窒素を示し、Ｘは酸素又はイオウを示す）。Ｒ１及びＲ２において特に好ましいのはアルキル基又はフルオロアルキル機等のハロアルキル基である。本発明者らは、このようなオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体を用いれば、少ない工程数で容易かつ高い収率でオリゴヌクレオチド誘導体を合成できることを確認している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 このオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体は、下記構造式（Ａ１）で示される芳香族化合物を前駆体として容易に調製することができる（ただし、式中のＲ１及びＲ２はそれぞれ独立アルキル基、アリール基、ハロアルキル基及びハロゲン基のいずれかであり、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立してＣＨ又は窒素を示し、Ｘは酸素又はイオウを示す。また、Ｐｒ１及びＰｒ２はそれぞれ独立して水酸基の保護基を示す。）。Ｒ１及びＲ２において特に好ましいのはアルキル基又はフルオロアルキル機等のハロアルキル基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
  本発明のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体は、下記構造式（ａ２）で示されるユニットが直接又はリンカーを介して担体に化学修飾されていてもよい。本発明者らは、このようなオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体を用いても、少ない工程数で容易かつ高い収率でオリゴヌクレオチド誘導体を合成できることを確認している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 このオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体は、下記構造式（Ａ２）で示される芳香族化合物を前駆体として容易に調製することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
  また、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、オリゴヌクレオチドの３´末端が下記構造式（ａ）で示されるユニット（ただし、式中のＲ１～Ｒ６はそれぞれ独立して水素又は水素以外の置換基を示す。また、式中Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立してＣＨ又は窒素を示し、Ｘは酸素又はイオウを示す）で修飾されていることを特徴とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
  本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体を出発物質として、従来からＤＮＡやＲＮＡの合成に用いられているオリゴヌクレオチドの合成法によって、容易に合成することができる。また、このオリゴヌクレオチド誘導体は、３´末端に２つの芳香族環を有しており、尿素結合又はチオ尿素結合で芳香族環どうしが結合されている。このため、３´末端が疎水性を示すこととなり、細胞膜への透過性が良好となるとともに、優れたヌクレアーゼ耐性を有することとなる。このため、細胞内に本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を入れた場合においても、その効果をより長い時間持続させることができる。さらには、ＲＮＡｉに利用した場合、ＲＩＳＣ中のＰＡＺドメインの疎水性ポケットに入り込み易く、ノックダウンの効果を高めることができると考えられる。
  本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、オリゴヌクレオチドの３´末端が下記構造式（ａ１）で示されるユニットで修飾されていてもよい（ただし、式中のＲ１及びＲ２はそれぞれ独立してアルキル基、アリール基、ハロアルキル基及びハロゲン基のいずれかであり、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立してＣＨ又は窒素を示し、Ｘは酸素又はイオウを示す。また、Ｐｒ１及びＰｒ２はそれぞれ独立して水酸基の保護基を示す。）。Ｒ１及びＲ２において特に好ましいのはアルキル基又はフルオロアルキル機等のハロアルキル基である。本発明者らは、このようなオリゴヌクレオチド誘導体が優れたヌクレアーゼ耐性を有し、細胞内に入れた場合において、ＲＮＡｉにおけるノックダウン効果をより長い時間持続させることができることを確認している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
  さらには、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、オリゴヌクレオチドの３´末端が下記構造式（ａ２）で示されるユニットで修飾されていてもよい。本発明者らは、このようなオリゴヌクレオチド誘導体が優れたヌクレアーゼ耐性を有し、細胞内に入れた場合において、ＲＮＡｉにおけるノックダウン効果をより長い時間持続させることができることを確認している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
  また、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、オリゴヌクレオチド部分が所定の遺伝子ｍＲＮＡの部分配列又はその相補配列を有するものであってもよい。また、オリゴヌクレオチドの鎖長は、１０以上３５以下であってもよい。さらに、オリゴヌクレオチドはオリゴリボヌクレオチドであってもよい。
  本発明のオリゴヌクレオチド構築物は、遺伝子発現調節用オリゴヌクレオチド構築物であって、上記いずれかのオリゴヌクレオチド誘導体を有することを特徴とする。このオリゴヌクレオチド構築物は、１本鎖及び２本鎖ＤＮＡ、１本鎖及び２本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ並びにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドから選択されるオリゴヌクレオチド構築物とすることができ、また、その機能面からは、アンチジーン、アンチセンス、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びリポザイムから選択することができる。
  また、本発明によれば、上記いずれかのオリゴヌクレオチド誘導体を有する遺伝子診断用オリゴヌクレオチド構築物とすることができる。さらに、本構築物はプローブ又はプライマーとすることができる。
（オリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体）
  本発明のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体は、次のようにして調製することができる。なお、ここでいうヌクレオチドとは、改変されてもよいヌクレオチドである。
（オリゴヌクレオチド誘導体）
  本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を得るには、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体を用い、アミダイト法をはじめとする各種核酸合成法によりオリゴヌクレオチド誘導体とする方法を用いることができる。水酸基の保護基としては、特に限定しないで従来公知の各種のヒドロキシル保護基を用いることができる。このような保護基としては、具体的にはベンジル基、アセチル基、ベンゾイル基等が挙げられ、特に好ましい保護基はベンジル基である。また、アミノ基の保護基として、具体的にはフタル酸基、ベンゾイル基等が挙げられ、特に好ましいのはフタル酸基である。
  また、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を利用してアンチジーン、アンチセンス、アプタマー、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムを構築するときには式（ａ）で表されるユニットを備えるようにすればよい。また、プローブが固相担体に固定化されている場合には、自由端側となる側に式（ａ）で表されるユニットを備えるようにすることができる。さらに、プライマーにおいては必要に応じて適宜式（ａ）で表されるユニットを備えていてもよい。
  本明細書においてオリゴヌクレオチドとは、一般にオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドを構成するモノマーであるヌクレオチドをモノマー単位として該モノマー単位を複数有するポリマーを意味するものとする。また、オリゴヌクレオチドとは、モノマー単位として、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを意味するものである。一般に、ヌクレオチドとしてデオキシリボヌクレオチドをモノマー単位とするポリマーをＤＮＡと称し、リボヌクレオチドをモノマー単位とするポリマーをＲＮＡと称するが、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、－般に挿されるＤＮＡ及びＲＮＡのほか、これらのモノマー単位のオリゴマーを含むものとする。また、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラも包含している。また、改変されていてもよいオリゴヌクレオチドとは、プリン及びピリミジンであるグアニン、シトシン、チミン、アデニン、ウラシル又は メチルシトシンなどの天然塩基を含むヌクレオチドのみからなるオリゴヌクレオチドのほか、オリゴヌクレオチドの各種部分、すなわち、塩基、糖部分及びリン酸エステル部分において何らかの化学修飾が施された１又は２以上のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを包含している。
  本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、所定の遺伝子のＤＮＡのセンス鎖、そのアンチセンス鎖又はｍＲＮＡの部分配列若しくはその相補配列を有することができる。こうした相補性を有することにより各種の標的核酸にハイブリダイズさせ、それによりオリゴヌクレオチド誘導体に意図した機能を発現させることができる。本発明のオリゴヌクレオチド誘導体において、オリゴヌクレオチドの長さは特に限定しないで、用途に応じた長さとすることができるが、オリゴヌクレオチドの合成の容易性及び期待する効果の発揮を考慮すると、１０以上３５以下とすることが好ましい。また、アンチセンスの場合には、１０以上３０以下程度にすることができ、ｓｉＲＮＡの場合には、Ａ及びＢの合計の鎖長は、好ましくは１５以上３５以下、より好ましくは３０以下である。また、プライマーの場合には、１０以上３０以下であり、プローブの場合には１０以上３０以下であることが好ましい。
  本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、リボザイム及びアプタマーに用いる場合には、モノマー単位は改変されていてもよいオリゴリボヌクレオチドとすることができる。
（オリゴヌクレオチド構築物）
  本発明のオリゴヌクレオチド構築物は、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を有している。本オリゴヌクレオチド構築物における本オリゴヌクレオチド誘導体の種類により、本構築物は、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド等の形態をそれぞれあるいは組み合わせた形態とすることができる。なお、既に説明したように、本オリゴヌクレオチド誘導体を構成するオリゴヌクレオチド部分は、改変されたオリゴヌクレオチドを含んでいるため、本オリゴヌクレオチド構築物においても改変形態のオリゴヌクレオチドが含まれることがある。
  本発明のオリゴヌクレオチド構築物は、ヌクレアーゼ耐性が向上されているため、遺伝子発現調節用、又は研究用、診断用の各種用途に用いることができる。遺伝子発現調節用途としては、アンチジーン、アンチセンス、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びリボザイム等が挙げられる。特に、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡにおいて３´ 末端オーバーハング部位のｄＴに対し式（ａ）で表されるユニットを導入することでヌクレアーゼ耐性とサイレンシング活性の双方を向上させることができる。
  診断用途又は研究用途としては、プローブ及びプライマーが挙げられる。プローブは、設計又は 選択により、ターゲット核酸に特異的に規定された配列を有しており、所定のストリンジェンシーの下で、それらがハイブリダイズするようにするに取得されたオリゴヌクレオチドである。プローブに本オリゴヌクレオチド誘導体を用いることでヌクレアーゼ耐性が向上されるため、ターゲット核酸を含有するサンプル中に混在するヌクレアーゼの影響を抑制又は回避して、ヌクレアーゼの除去程度が低くてもあるいはヌクレアーゼ除去処理を省略したサンプル調製が可能になる。これにより簡易に遺伝子診断や検査をすることができるようになる。なお、こうしたプローブとターゲットとのハイブリタイゼーションは、プローブを適当なガラス基板や、プラスチック製基板や、ビーズ等の固相担体に固定化して行なうことができる。本発明には、本オリゴヌクレオチド誘導体を含むプローブを固定化した固相担体も含まれる。
（オリゴヌクレオチド誘導体の利用）
  本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、ｓｉＲＮＡやアンチセンス等として機能するように構築することで、遺伝子発現抑制剤として利用できる。また、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、ヒト及び非ヒト動物における疾患の予防・治療用医薬組成物の有効成分として用いることができる。例えば、遺伝子発現に伴う疾患に対して、遺伝子発現抑制剤として構築した本発明のオリゴヌクレオチド誘導体はこうした疾患の予防や治療に有効である。
  さらに、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、そのハイブリダイゼーション機能を発揮させるように構築することで、プローブ、プライマー等の検査試薬や診断試薬として用いることができる。さらに、これらオリゴヌクレオチド構築物をチップやビ－ズ等の固体担体等に保持したものは、検査装置や診断装置又はこれらの一部として利用することができる。さらには、こうした検査試薬や診断薬は、他の試薬や診断薬あるいは装置等と組み合わせた検査用又は診断用キットとしても用いることができる。
  本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチド構築物の遺伝子発現抑制作用を利用した、遺伝子発現抑制方法にも利用できる。さらには、本発明のオリゴヌクレオチド構築物のハイブリダイゼーション機能を利用した遺伝子検出方法にも利用できる。
  以下、本発明を具体化した実施例を以下に詳細に示す。
  なお、下記実施例において使用した機器は以下のとおりである。
（使用機器）
NMRスペクトル               JEOL  JNM-α400
GC/MS                       SHIMADZU  GCMS-QP  2010A
吸光度計      HITACHI  U-2001  spectrophotometer,
GEヘルスサイエンス  Nano  Vue
DNA/RNA  synthesizer Applied  Biosystems  Model  3400
Tm測定機                    SHIMADZU  UV  2400
HPLC                        SPD-10AVP,  SCL-10AVP,  LC-10AVP,  DGU-10A,  
CTO-10AVP,  C-R8A
MALDI-TOF/MS                SHIMADZU  AXIMA-CFR  plus
発光計測用プレートリーダー  ATTO  Luminescenser  JNRII  
また、本明細書の実施例の説明の中では、以下に示す略号を用いることがある。
（略  語）
APS               ammonium  peroxodisulfate
CPG               controlled  pore  glass
DMAP              4-dimethylaminopyridine
DMTrCl            4.4’-dimethoxytritylchloride
EDC               1-ethyl-3-  (  3-dimethylaminopropyl  )  carbodiimide  
EDTA              ethylenediamine-N,N,N’,N’-tetraacetic  acid
MALDI-TOF         matrix  assisted  laser  desorption  ionization  -  time  of  flight
PAGE              polyacrylamide  gel  electrophoresis
TBAF              tetrabutylammonium  fluoride
TBE               tris-borate-EDTA
TEAA              triethylammonium  acetate
TEMED             N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine
Tm                melting  temperature
Tris              tris(hydroxymethyl)aminomethane
（実施例１）
＜ベンゼン環とピリジン環とが尿素結合したオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体の合成＞
  実施例１では、以下のようにしてベンゼン－ピリジン骨格を母核としたオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体を合成した。
  ２，６－ピリジンジメタノールを出発原料に用い、水素化ナトリウム存在下、tert-ブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＤＭＳＣｌ）と反応させることにより、片方の水酸基をＴＢＤＭＳ基で保護したシリル体１を収率４９％で合成した。さらに四臭化炭素、アジ化ナトリウムを共存させ、臭素化、アジド化を一工程で行いアジド体２を収率７６％で得た後、５％パラジウムエチレンジアミン複合体触媒を用いてアジド選択的に水素接触還元反応を行い、ピリジン誘導体３を収率８０％で合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
  一方、下式に示すように、３－シアノベンジルアルコールを出発物質として4,4'-ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴｒＣｌ）を用いてジメトキシトリチル化体４を収率９１％で得た後、水素化アルミニウムリチウムでシアノ基を還元し、ベンジルアミノ体５を収率６９％で得た。そして、上記のピリジン誘導体３とベンジルアミノ体５とをカルボニルジイミダゾールを用いてカップリングさせ、ウレア誘導体６を収率４３％で得た。なお、ここで同様の原料から対応するイソチオシアネートを経由して、対応するチオ尿素誘導体を容易かつ定量的に形成させることができる。そして、このチオ尿素誘導体から、以下に示す尿素結合を有するオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体と同様に、チオ尿素結合を有するオリゴヌクレオチド誘導体修飾担体を合成することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
  上記のようにして得たウレア誘導体６をＴＢＡＦで処理し、下記に示す脱シリル体７を収率９８％で得た後、従来法に従い、無水コハク酸を用いてスクシニル化を行った後、脱水縮合剤存在下ＣＰＧ樹脂と反応させることにより、実施例１のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体９を３８．５μｍｏｌ／ｇの活性で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
  さらに詳細なオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体（９）の合成手順を以下に示す。
2-[(tert-Butyldimethylsilyloxy)methyl]-6-hydroxymethylpyridine（１）の合成
60%NaH（1.45  g,  35.9  mmol）をDMF（60  mL）に溶解し、氷冷下で撹拌しながら、2,6-pyridinedimethanol（5.00  g,  35.9  mmol）のDMF（30  mL）溶液を滴下した。Ar雰囲気下室温で1時間撹拌した後、tert-buthyldimethylchlorosilane（6.54  g,  43.3  mmol）のDMF  (40  mL)  溶液を加え、さらに12時間撹拌した。TLCで原料の消失を確認した後、EtOAcと10%NaHCO3  aqで抽出し、有機層をsat  NaCl  aqで洗浄、無水Na2SO4を加え乾燥させた。溶媒を減圧留去後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（Hex：EtOAc  =  5：1）にて精製し、2-[(tert-butyldimethylsilyloxy)methyl]-6-hydroxymethylpyridine（１）（4.46  g,  49%）を無色オイルとして得た。
1H-NMR（CDCl3,  400  MHz）
δ  =  7.66  (1H,  d,  J  =  7.6Hz,  Ar-H),  7.39  (1H,  d,  J  =  7.6Hz,  Ar-H),  7.10  (1H,  d,  J  =  7.6Hz,  Ar-H),  4.80  (2H,  s,  CH2O),  4.71  (2H,  s,  CH2O),  0.95  (9H,  s,  t-C4H9Si),  0.11  (6H,  s,  (CH3)2Si)
13C-NMR（CDCl3,  100  MHz）
δ =  160.3,  157.9,  157.9,  137.3,  118.5,  65.8,  63.9,  25.9,  18.3,  -5.4
2-Azidomethyl-6-[(tert-butyldimethylsilyloxy)methyl]pyridine（２）の合成
  予め真空乾燥させておいた2-[(tert-Butyldimethylsilyloxy)methyl]-6-hydroxymethylpyridine（１）（2.14  g,  8.42  mmol）、sodium  azide（2.73  g,  42.0  mmol）、Triphenylphosphine（2.65  g,  10.10  mmol）、carbontetrabromide（3.07  g,  9.29  mmol）の混合物をDMF（64  mL）に溶解し、Triethylamine（2.64  mL）を加え、Ar雰囲気下で25時間撹拌した。TLCで原料の消失を確認した後、EtOAcと水で抽出し、有機層をsat  NaCl  aqで洗浄、無水Na2SO4を加え乾燥させた。溶媒を減圧留去後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（Hex：EtOAc  =  50：1）にて精製し、2-azidomethyl-6-[(tert-butyldimethyl-silyloxy)methyl]pyridine（２）（1.77  g,  76%）を薄黄色オイルとして得た。
1H-NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ =  7.73  (1H,  t,  J  =  7.6Hz,  Ar-H),  7.47  (1H,  d,  J  =  7.6Hz,  Ar-H),  7.20  (1H,  d,  J  =  7.6Hz,  Ar-H),  4.83  (2H,  s,  CH2O),  4.44  (2H,  s,  CH2O),  0.96  (9H,  s,  t-C4H9Si),  0.12  (6H,  s,  (CH3)2Si)
13C-NMR  (CDCl3,  100  MHz)  
δ =  161.6,  154.4,  137.6,  120.0,  119.2,  65.9,  55.6,  25.9,  18.3,  -5.4
2-Aminomethyl-6-[(tert-butyldimethylsilyloxy)methyl]pyridine（３）の合成
2-Azidomethyl-6-[(tert-butyldimethylsilyloxy)methyl]pyridine（２）（0.83  g,  2.98  mmol）、5%  Pd/C(en)（83.0  mg,  10  wt  %）をMeOH（20  mL）に懸濁させ、水素雰囲気下室温で5時間激しく撹拌した。TLCで原料の消失を確認した後、触媒を桐山ロートで吸引濾去した。ろ液を減圧留去後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（CHCl3  :  MeOH  =  30  :  1  →  10：1）にて精製し、2-aminomethyl-6-[(tert-butyldimethylsilyloxy)methyl]pyridine（３）（603  mg,  80%）を黄色オイルとして得た。
1H-NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ =  7.66  (1H,  t,  J  =  7.8Hz,  Ar-H),  7.37  (1H,  d,  J  =  7.8Hz,  Ar-H),  7.13  (1H,  d,  J  =  7.6Hz,  Ar-H),  4.82  (2H,  s,  CH2O),  3.94  (2H,  s,  CH2N),  0.96  (9H,  s,  t-C4H9Si),  0.12  (6H,  s,  (CH3)2Si)
13C-NMR  (CDCl3,  100  MHz)  
δ =  160.8,  160.7,  136.9,  119.0,  117.8,  65.9,  47.6,  25.7,  18.2,  -5.4
3-(4,4’-Dimethoxytrityloxymethyl)benzonitrile（４）の合成
  3-Hydroxymethylbenzonitrile（1.12  g,  8.38  mmol）と4,4’-dimethoxytritylchloride（3.41  g,  10.06  mmol）をDMF（23  mL）及びPyridine（23  mL）に懸濁し、Ar雰囲気下室温で12時間撹拌した。TLCで原料の消失を確認した後、氷水（20  mL）を加えた後、EtOAcと水で抽出し、有機層をsat  NaCl  aqで洗浄、無水Na2SO4を加え乾燥させた。溶媒を減圧留去後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（Hex：EtOAc  =  10：1）にて精製し、3-(4,4’-dimethoxytrityloxymethyl)benzonitrile（４）（3.31  mg,  91%）を無色オイルとして得た。
1H-NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ =  7.23-7.68  (17H,  m,  Ar-H),  6.84  (4H,  d,  J  =  8.8Hz,  Ar-H),  4.21  (2H,  s,  CH2O),  3.79  (6H,  s,  CH3O)
13C-NMR  (CDCl3,  100  MHz)
δ =  158.3,  144.4,  135.4,  130.5,  130.4,  129.5,  128.9,  128.5,  126.9,  118.6,  113.7,  112.1,  111.9,  111.8,  86.4,  56.9,  55.5,  54.0
3-(4,4’-Dimethoxytrityloxymethyl)benzylamine（５）の合成
  LiAlH4（238  mg,  6.28  mmol）をジエチルエーテル（30  mL）に懸濁し、氷冷下撹拌しながら、3-(4,4’-Dimethoxytrityloxymethyl)benzonitrile（４）（0.86  g,  1.98  mmol）のジエチルエーテル（90  mL）溶液を滴下した。Ar雰囲気下室温で16時間撹拌した。TLCで原料の消失を確認した後、水（1.2  mL）及びMeOH（7.2  mL）を加えた。さらに30分撹拌した後、塩を吸引濾去した。ろ液を減圧留去後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（CHCl3：MeOH  =  100：1）にて精製し、3-(4,4’-dimethoxytrityloxymethyl)benzylamine（５）を（0.58  g,  69%）を無色オイルとして得た。
1H-NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ =  7.21-7.52  (17H,  m,  Ar-H),  6.83  (4H,  d,  J  =  8.8Hz,  Ar-H),  4.16  (2H,  s,  CH2O),  3.86  (2H,  s,  CH2N),  3.79  (6H,  s,  CH3O)
13C-NMR  (CDCl3,  100  MHz)
δ =  158.4,  145.0,  143.2,  139.6,  136.2,  130.0,  128.4,  128.2,  127.8,  126.7,  125.7,  125.6,  125.4,  113.1,  86.3,  65.5,  55.1,  46.5
N-[3-(4,4’-Dimethoxytrityloxymethyl)benzyl]-N’-{[6-(tert-butyldimethylsilyloxy)methyl  pyridin-2-yl]methyl}urea  (６)の合成
  3-(4,4’-Dimethoxytrityloxymethyl)benzylamine（５）（455  mg,  1.04  mmol）、1,1’-
carbonyldiimidazole（170  mg,  1.05  mmol）をTHF（52  mL）に懸濁し、Ar雰囲気下室温で24時間撹拌した。TLCで原料の消失を確認した後、2-aminomethyl-6-[(tert-butyl-dimethylsilyloxy)methyl]pyridine（３）（593  mg,  2.35  mmol）のTHF（13  mL）溶液を滴下した後、さらに48時間撹拌した。反応溶液を減圧留去後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー  （CHCl3：MeOH  =  100：1）にて精製し、N-[3-(4,4’-Dimethoxytrityloxymethyl)benzyl]-N’-{[6-(tert-butyldimethylsilyloxy)methylpyridin-2-yl]methyl}urea（６）（406  mg,  54%）を無色オイルとして得た。
1H-NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ =  7.61-7.07  (16H,  m,  Ar-H),  6.85-6.83  (4H,  d,  J  =  8.8Hz,  Ar-H),  4.71  (2H,  s,  CH2)  ,  4.43  (2H,  s,  CH2),  4.37  (2H,  s,  CH2)  ,  4.16  (2H,  s,  CH2)  ,  3.78  (6H,  s,  CH3O)  ,  0.95  (9H,  s,  t-C4H9Si),  0.10  (6H,  s,  (CH3)2  Si)
13C-NMR  (CDCl3,  100  MHz)
δ =  160.6,  158.4,  158.2,  156.4,  145.0,  139.7,  139.1,  137.4,  136.2,  130.0,  128.5,  128.1,  127.8,  126.7,  126.2,  126.0,  125.9,  120.0,  118.3,  113.1,  86.4,  65.8,  65.4,  55.2,  45.6,  44.5,  25.9,  18.3,  -5.4
Mass  (EI)  m/z：717  (M+)
N-[3-(4,4’-Dimethoxytrityloxymethyl)benzyl]-N’-[(6-hydroxymethylpyridin-2-yl)methyl]urea（７）の合成
  N-[3-(4,4’-Dimethoxytrityloxymethyl)benzyl]-N’-{[6-(tert-butyldimethylsilyloxy)methylpyridin-2-yl]methyl}urea（６）（410  mg,  0.57  mmol）をTHF（2.2  mL）に懸濁し、撹拌しながら、TBAF-1.0M  THF（0.64  mL）溶液を滴下した後、Ar雰囲気下室温で4時間撹拌した。TLCで原料の消失を確認した後、反応溶液を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：MeOH  =  20：1）にて精製し、N-[3-(4,4’-Di-  methoxytrityloxymethyl)benzyl]-N’-[(6-hydroxymethylpyridin-2-yl)methyl]urea（７）（336  mg,  98%）を無色結晶として得た。
1H-NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ =  7.52-7.02  (16H,  m,  Ar-H),  6.82-6.80  (4H,  d,  J  =  8.8Hz,  Ar-H),  4.59  (2H,  s,  CH2)  ,  4.39  (2H,  s,  CH2),  4.29  (2H,  s,  CH2),  4.13  (2H,  s,  CH2),  3.76  (6H,  s,  CH3O)
13C-NMR  (CDCl3,  100  MHz)
δ =  158.6,  158.4,  157.1,  144.9,  139.5,  139.2,  137.3,  136.1,  130.0,  128.5,  128.1,  127.8,  126.7,  126.0,  125.8,  125.7,  120.2,  118.9,  113.1,  86.4,  65.4,  64.1,  55.1,  45.3,  44.2
オリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体（９）の合成
  N-[3-(4,4’-Dimethoxytrityloxymethyl)benzyl]-N’-[(6-hydroxymethylpyridin-2-yl)methyl]urea（７）（290  mg,  0.47  mmol）をpyridine（4.7  mL）に溶解し、DMAP（1.24  mg,  1.42  mmol）を加え、Ar雰囲気下室温で72時間撹拌した。TLCで原料の消失を確認した後、EtOAcとsat  NaHCO3  aqで抽出し、有機層をsat  NaCl  aqで洗浄、無水Na2SO4を加え乾燥させた。溶媒を減圧留去してスクシニル化合物（８）を得た。一晩真空乾燥したスクシニル化合物（８）をDMF（12  mL,  CPGに対して0.01  M）に溶解し、CPG樹脂（120  μmol/g）（979mg,  0.118  mmol）を加えて溶液となじませた。その後、EDC・HCl（90  mg,  0.47  mmol）を加え、室温下48時間振とうした。反応溶液をpyridineで洗浄した後、0.1  M  DMAP溶液（pyridine：Ac2O  =  9：1）（15  mL）を加え、さらに室温下12時間振とうした。反応溶液をpyridine、EtOH、MeCNで洗浄し、12時間真空乾燥した後、得られた樹脂の活性測定を行った。活性測定は乾燥したCPG樹脂6  mgをガラスフィルターにのせ、HClO4：EtOH  =  3：2の溶液を流し込み、その濾液のUV  498  nmの波長（DMTr基の波長）の吸光度を求め、以下の式に代入することにより算出した。その結果、活性値は38.5  μmol/gであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000023
（比較例１）
  本発明者らが以前に開発した、特許文献１に記載されている手法に基づき、下記化９の合成ルートに従って比較例１のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体（１９）を合成した。以下にその詳細を述べる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
（化合物１１：1,3-bis-hydroxymethylbenzene  の製造例）
イソフタル酸ジメチル(2.00  g，10.30mmol）にAr雰囲気下、dry  THF  （51.5mL，0.2M  solution）を加え、水素化ホウ素リチウム(1.12g，51.5mmol，5eq)を加えた。23時間攪拌した後、氷浴で酢酸を数滴加えて反応液を中性にし、反応を停止した。しばらく攪拌した後、析出した結晶をMeOHで溶解した。反応中のTLC  （Hex:EtOAc=1:1)では生成物は1スポットであったが、反応を停止すると2スポットに分かれた。溶媒を減圧留去後、シリカゲルクロマトグラフィー（EtOAc  only）で単離し、化合物(１１)（1.36g,9.82mmol,95％)を得た。
1H  NMR(400MHz，CDCl3）δ[ppm]：7.39-7.26  （4H，m，aromatic  protons)，4.71（4H，s,-CH2-O-），1.70  （2H，d，J=76.8  Hz，OH）
13C  NMR(100MHz，CDCl3）δ[ppm]：139.28，129.62，128.47，63.90
Mass（EI）m/z：138  （M＋)，120，107，79，65，51.
HRMS（EI）Calcd  for  C8H10O2138.06808  Found  138.06765.
Anal．Calcd  for  C8H10O2：C，69.54;  H，7.30．Found：C，69.45;  H，7.23.
（化合物１２：1-（4,4’-dimethoxytrityloxy）methyl-3-hydroxymethylbenzeneの製造例）予め真空乾燥させておいた化合物（１１)（0.5g，3.62mmol）をpyridine  （18mL)に溶解し、DMAP（22.1mg，0.18mmol，0.05eq）と4,4’-Dimethoxytrityl  chloride  （1.23g，3.62mmol，1eq)を加え、Ar雰囲気下で17時間攪拌した。TLC  （Hex:EtOAc=3:1)により原料の消失を確認した。EtOAcとsat  NaHCO3  aqで抽出し、有機層をsat  NaCl  aqで洗浄、無水Na2SO4を加え乾燥させた。溶媒を減圧留去後、シリカゲルクロマトグラフィー（Hex:EtOAc=4:1)で単離し、化合物(１２)（0.82g，1.86mmol，51％)を得た。
1H  NMR(400MHz，CDCl3）δ[ppm]：7.52-6.82  （17H，m，DMTr  and  aromatic  protons)，4.70  and  4.18  （4H，s，-CH2-O-），3.80  （6H，t，J=4.0  Hz，H-methoxy)，1.62  （2H，s，OH）
13C  NMR(100MHz，CDCl3）δ[ppm]：158.42，145.00，140.76，139.68，136.24，130.06，128.50，128.16，127.83，126.73，126.31，125.71，125.55，113.10，86.39，65.43，55.20
Mass（EI）m/z：440  （M＋)，303，273，227，138，121，107，79，45.
HRMS（EI）Calcd  for  C29H28O4440.19876
Found  440.19806．Anal．Calcd  for  C29H28O4・1/5H2O:  C，78.27;  H，6.45．Found：C，78.33；H，6.59.
（化合物１３：1-（4,4’-dimethoxytrityloxy）methyl-3-O-[(2-cyanoethyl）-（N,N-diisopropyl)]-phosphoamidicmethyl-hydroxymethylbenzeneの製造例）
予め真空乾燥させておいた化合物(１２）（0.35g，0.80mmol）をdry  THF  （8mL）に溶解し、DIPEA(0.4mL，4.00mmol，5eq)と亜リン酸化試薬（0.29mL，1.60mmol，2eq)を加え、Ar雰囲気下で1.5時間攪拌した。TLC（EtOAc  only）により原料の消失を確認した。EtOAcとsat  NaHCO3aqで抽出し、有機層をsat  NaCl  aqで洗浄、無水Na2SO4を加え乾燥させた。溶媒を減圧留去後、中性シリカゲルクロマトグラフィー（Hex:EtOAc=1:1)で単離し、化合物(１３)（0.48g，0.75mmol，94％)を得た。
32P  NMR  （162MHz，CDCl3）δ[ppm]：148.8
Mass（FAB）  m/z：641（［M++H］），303，201，154.
HRMS（FAB）  Calcd  for  C38H46N2O5P  641.31443  Found  641.31292.
（化合物１５：2,6-bis-hydroxymethylpyridineの製造例）
2,6ピリジンカルボン酸ジメチル（１４）（2.00  g，10.25mmol）にAr雰囲気下、無水THF  （51.3mL，0.2M  solution）を加え、水素化ホウ素リチウム(1.16g，51.3mmol，5eq)を加えた。16時間攪拌した後、氷浴で酢酸を数滴加えて反応液を中性にし、反応を停止した。しばらく攪拌した後、析出した結晶をメタノールで溶解した。反応中のTLC  （クロロホルム：メタノール=3:1)では生成物は1スポットであったが、反応を停止すると2スポットに分かれた。溶媒を減圧留去後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール=10:1~3:1)で単離し、化合物(１５）(0.40g，2.88mmol，28％)を得た。
1H  NMR(400MHz，CDCl3）δ[ppm]：7.72-7.00  （3H，m，aromatic  protons)，4.79
（4H，s,-CH2-）  
13C  NMR(100MHz，CDCl3）δ[ppm]：158.37，137.44，119.12，64.33
Mass  （FAB）  m/z：140（［M++H］），277，185，93，57.
HRMS  （FAB）  Calcd  for  C7H10NO2
140.07115  Found  140.07054.
Anal．Calcd  for  C7H10NO2:
C，60.42;  H，6.52;  N，10.07．Found：C，60.28;  H，6.50;  N，9.95.
（化合物１６：2-（4,4’-dimethoxytrityloxy）methyl-6-hydroxymethylpyridineの製造例）
予め真空乾燥させておいた化合物（１５)(0.5g，3.60mmol）をピリジン（18mL)に溶解し、DMAP  （22.1mg，0.18mmol，0.05eq）と4,4’-ジメトキシトリチルクロライド（1.22g，3.60mmol，1eq)を加え、Ar雰囲気下で16時間攪拌した。TLC  （Hex:EtOAc=1:1)により原料の消失を確認した。酢酸エチルとsat  NaHCO3  aqで抽出し、有機層をsat  NaCl  aqで洗浄、無水Na2SO4を加え乾燥させた。溶媒を減圧留去後、シリカゲルクロマトグラフィー（へキサン：酢酸エチル  =4:1～3:1)で単離し、化合物(１６）(0.27g，0.61mmol，43％)を得た。
1H  NMR(400MHz，CDCl3）δ[ppm]：7.76-6.82  （16H，m，DMTr  and  aromatic  protons)，4.69  and  4.34  （4H，s，-CH2-O-），3.79  （6H，s，H-methoxy)，1.58  （2H，s，OH）
13C  NMR(100MHz，CDCl3）δ[ppm]：158.51，158.38，157.59，144.77，137.27，135.93，130.01，128.07，127.89，126.85，119.35，118.56，113.18，86.67，66.56，63.62，55.20
Mass  （FAB）  m/z：442（［M++H］），303，277，185，93，57.
HRMS  （FAB）  Calcd  for  C28H28NO4
442.20183  Found  442.20332.
（化合物１７、１８：ピリジンカルボン酸ジメチル誘導体のCPG樹脂の製造例）
化合物(１６)(0.20g，0.45mmmol)をピリジン(4.5mL)に溶解し、そこにDMAP  （1.1mg，0.009mmol，0.02eq）と無水コハク酸（136mg，1.36mmol，3eq)を加えAr雰囲気下で攪拌した。17時間攪拌した後、TLC  （ヘキサン：酢酸エチル=1:1)により反応の進行を確認し、酢酸エチルとsat  NaHCO3  aqで抽出し、有機層をsat  NaCl  aqで洗浄、無水硫酸ナトリウムを加え乾燥させた。溶媒を減圧留去後、真空乾燥させた。この濃縮物(１７）(0.16g，0.30mmol，66％)にdry  DMF  （7.5mL)を加え溶解させ、CPG  （338mg，0.075mmol)を加え30分間静置して反応液となじませた。その後、WSC  （71mg，0.37mmol，4.9eq)を加え室温で一日振とうさせた。後処理として、ピリジンで洗浄した後に0.1M  DMAP  ピリジン溶液：無水酢酸  （9:1)溶液（6mL）を加え、16時間振とうさせた。こうして比較例１のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体(１８）を得た。このものをメタノール、アセトンで洗浄し乾燥させ活性を測定し結果、活性は73.94μmol/gであった。
（実施例２）
＜ベンゼン環とピリジン環とがチオ尿素結合したオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体の合成＞
  実施例２では、次に示す合成ルートにしたがってベンゼン環とピリジン環とがチオ尿素結合したオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
3-(4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl)benzylisothiocyanate  (21)  の合成
3-(4,4’-Dimethoxytrityloxymethyl)benzylamine  (5)  (613  mg,  1.39  mmol),  carbon  disulfide  (0.85  mL,  13.9  mmol,  10  eq),  triethylamine  (0.20  mL,  1.39  mmol)  をEtOH  (2  mL)  で溶解し、脱気後、Ar置換して室温下2時間撹拌した。その後、氷浴下di-tert-butyl  dicarbonate  (3.06  mg,  1.40  mmol)  のEtOH  (0.6  mL)  溶液、DMAP  (6.12  mg,  6  mol%)  のEtOH  (0.6  mL)  溶液を滴下し、室温下さらに撹拌した。4時間後、TLCにより原料の消失を確認した後、反応溶液を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（Hexane  :  EtOAc  =  10  :  1）で単離精製し、3-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)benzylisothiocyanate  (21)  (640  mg,  96%)  を薄黄色オイルとして得た。
1H-NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ=  7.23-7.68  (17H,  m,  Ar-H),  6.84  (4H,  d,  J  =  8.8Hz,  Ar-H),  4.67  (2H,  s,  CH2),  4.15  (2H,  s,  CH2),  3.79  (6H,  s,  CH3O)
13C-NMR  (CDCl3,  100  MHz)
δ=  158.3,  144.4,  135.4,  130.5,  130.4,  129.5,  128.9,  128.5,  126.9,  118.6,  113.7,  112.1,  111.9,  111.8,  86.4,  56.9,  55.5,  54.0
N-[3-(4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl)benzyl]-N'-{[6-(tert-butyldimethylsilyloxymethyl)pyridin-2-yl]methyl}thiourea  (22)  の合成
3-(4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl)benzylisothiocyanate  (21)  (332  mg,  0.69  mmol)  をCDCl3  (4.6  mL)  で溶解し、2-aminomethyl-6-[(tert-butyldimethylsilyloxy)methyl]pyridine  (3)  (63.10  mg,  0.39  mmol)  のCDCl3  (3  mL)  溶液を加え、脱気後、Ar置換してrefluxした。5時間後  TLCで原料の消失を確認した後、反応溶液を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー  (Hexane  :  EtOAc  =  3  :  1~2  :  1)  にて精製し、N-[3-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)benzyl]-N'-{[6-(tert-butyldimethylsilyloxymethyl)pyridin-2-yl]methyl}thiourea  (22)  (316  mg,  62%)  を黄色オイルとして得た。
1H-NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ =  7.08-7.69  (17H,  m,  Ar-H),  6.82  (4H,  d,  J  =  6.8Hz,  Ar-H),  4.69  (4H,  s,  CH2),  4.51  (2H,  s,  CH2),  4.16  (2H,  s,  CH2),  3.78  (6H,  s,  CH3O),  0.92  (9H,  s,  t-C4H9Si),  0.05  (6H,  s,  (CH3)2Si)
13C-NMR  (CDCl3,  100  MHz)  
δ=  160.6,  158.3,  154.3,  144.8,  140.0,  137.7,  136.0,  129.9,  128.5,  128.0,  127.7,  126.6,  126.3,  126.2,  126.1,  120.3,  118.8,  113.0,  86.3,  65.3,  65.2,  55.1,  49.3,  25.7,  18.1,  -5.4
N-[3-(4,4’-Dimethoxytrityloxymethyl)benzyl]-N’-[(6-hydroxymethylpyridin-2-yl)  methyl]thiourea  (23)  の合成
N-[3-(4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl)benzyl]-N'-{[6-(tert-butyldimethylsilyloxymethyl)pyridin-2-yl]methyl}thiourea  (22)  (316  mg,  0.43  mmol)  をTHF  (2.2  mL)  に懸濁し、脱気後、Ar置換して室温下撹拌した。TBAF  1.0M  THF  (0.48  mL)  を滴下し、さらに撹拌した。12時間後TLCで原料の消失を確認した後、反応溶液を減圧蒸留した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー  (CDCl3  :  MeOH  =  200  :  1~50  :  1)  にて精製し、N-[3-(4,4’-dimethoxytrityloxymethyl)benzyl]-N’-[(6-hydroxymethylpyridin-2-yl)methyl]thiourea  (13)  (141  mg,  54%)  を黄色結晶として得た。
1H-NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ  =  7.04-7.55  (17H,  m,  Ar-H),  6.75  (4H,  d,  J  =  9.0Hz,  Ar-H),  4.60  (4H,  s,  CH2),  4.38  (2H,  s,  CH2),  4.08  (2H,  s,  CH2),  3.71  (6H,  s,  CH3O)
13C-NMR  (CDCl3,  100  MHz)
δ=  183.4,  158.8,  158.4,  155.0,  144.8,  139.8,  137.7,  136.0,  130.0,  128.7,  128.0,  127.8,  126.7,  126.3,  126.1,  120.8,  119.4,  113.1,  86.4,  65.34,  64.3,  59.5,  55.1,  49.3
ベンゼン－ピリジン骨格を有するチオウレア型CPG樹脂(25)  の合成
N-[3-(4,4’-Dimethoxytrityloxymethyl)benzyl]-N’-[(6-hydroxymethylpyridin-2-yl)methyl]thiourea  (23)  (141  mg,  0.23  mmol)  をpyridine  (3  mL)  に溶解した後、succinic  anhydride  (71  mg,  3  eq)  、DMAP  (0.62  mg,  0.02  eq)  を加え、室温下撹拌した。72時間後TLCで原料の消失を確認した後、EtOAc×2、H2O×1、sat  NaHCO3  aq×1で抽出した。有機層をsat  NaCl  aqで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥後、溶媒を減圧留去してスクシニル化合物  (24)  を得た。一晩真空乾燥したスクシニル化合物  (14)  をDMF  (6  mL,  CPGに対して0.01  M)  に溶解した後、CPG樹脂  (119  μmol/g)  (480mg,  0.058  mmol)  を加えて溶液となじませた。その後、EDC-HCl  (44  mg,  0.23  mmol)  を加え、48時間振とうした。反応溶液をpyridine×3で洗浄した後、0.1  M  DMAP溶液  (pyridine  :  Ac2O  =  9  :  1)  (15  mL)  を加え、室温下12時間振とうした。
反応溶液をPyridine、EtOH、MeCNで洗浄し、12時間真空乾燥した後、得られたチオウレア型CPG樹脂(25)の活性測定を行った。その活性値は48.3  μmol/gであった。
乾燥したCPG樹脂6  mgをガラスフィルターにのせ、HClO4  :  EtOH  =  3  :  2の溶液を流し込み、その濾液のUV  498  nmの波長  (DMTr基の波長)の吸光度を求め、以下の式に代入することにより算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000026
（実施例３）
＜ピリジン環どうしがチオ尿素結合したオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体の合成＞
  実施例３では、次に示す合成ルートにしたがってピリジン環どうしがチオ尿素結合したオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体３１を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
N,N’-Bis{[6-(tert-butyldimethylsilyloxy)methylpyridin-2-yl]methyl}urea  (27)  の合成
2-Aminomethyl-6-[(tert-butyldimethylsilyloxy)methyl]pyridine  (26)  (380  mg,  1.50  mmol)  、1,1’-caｒbonyldiimidazole  (150  mg,  0.92  mmol)  をTHF  (10  mL)  に懸濁し、脱気後、Ar置換して室温下撹拌した。24時間後  TLCで原料の消失を確認した後、反応溶液を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー  (CHCl3  :  MeOH  =  50  :  1)  にて精製し、N,N’-bis{[6-(tert-butyldimethylsilyloxy)methylpyridin-2-yl]methyl}urea  (27)  (384  mg,  96%)  を黄色結晶として得た。
1H-NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ =  7.66  (2H,  t,  J  =  8.0Hz,  Ar-H),  7.38  (2H,  d,  J  =  7.6Hz,  Ar-H),  7.14  (2H,  d,  J  =  7.2Hz,  Ar-H),  4.78  (4H,  s,  CH2O),  4.49  (4H,  s,  CH2N),  0.96  (18H,  s,  t-C4H9Si),  0.12  (12H,  s,  (CH3)2Si)
13C-NMR  (CDCl3,  100  MHz)  
δ=  160.7,  158.2,  156.6,  137.3,  119.8,  118.3,  65.9,  45.6,  25.8,  18.3,  -5.4
N,N’-Bis{[6-(hydroxymethyl)pyridin-2-yl]methyl}urea  (28)  の合成
N,N’-Bis{[6-(tert-butyldimethylsilyloxy)methylpyridin-2-yl]methyl}urea  (27)  (855  mg,  1.61  mmol)  をTHF  (8.1  mL)  に懸濁し、脱気後、Ar置換して室温下撹拌した。TBAF  1.0M  THF  (3.7  mL)  を滴下し、さらに撹拌した。5時間後TLCで原料の消失を確認した後、反応溶液を減圧蒸留した。残渣を吸引ろ過し、N,N’-bis{[6-(hydroxymethyl)pyridin-2-yl]methyl}urea  (28)  (812  mg)  を白色結晶として得た。
1H-NMR  (DMSO-d6,  400  MHz)
δ =  7.73  (2H,  t,  J  =  7.8Hz,  Ar-H),  7.30  (2H,  d,  J  =  7.8Hz,  Ar-H),  7.13  (2H,  d,  J  =  7.6Hz,  Ar-H),  6.72  (2H,  t,  J  =  5.8Hz,  NH),  5.38  (2H,  t,  J  =  5.8Hz,  OH),  4.53  (4H,  d,  J  =  5.6Hz,  CH2),  4.28  (4H,  d,  J  =  5.8Hz,  CH2)
13C-NMR  (DMSO-d6,  100  MHz)  
δ =  161.1,  158.7,  158.0,  137.0,  118.7,  118.1,  64.1,  44.8
N-{[3-(4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl)pyridin-2-yl]methyl}-N'-[(6-hydroxymethylpyridin-2-yl)methyl]urea  (29)  の合成
N,N’-Bis{[6-(hydroxymethyl)pyridin-2-yl]methyl}urea  (28)  (812  mg)  、DMTrCl  (271  mg,  0.8  mmol)  をpyridine  (6  mL)、DMSO  (1.2  mL)  を加え、加熱（40℃）により懸濁し、脱気後、Ar置換して室温下攪拌した。12時間後、TLCにより反応がほとんど進行していない（原料がほぼ残っていた）のを確認した後、DMTrCl  (405  mg,  1.2  mmol)  を追加し、攪拌を続けた。さらに12時間後、TLCにて反応の進行を確認したが、原料の消失は確認できなかった。（生成物のスポットは濃くなったが、原料がまだ残っていた。）さらに、DMTrCl  (405  mg,  1.2  mmol)  を追加し、攪拌を続けた。26時間後、反応の進行が確認されたため反応を停止させた。反応溶液をsat  NaHCO3  aq×1,  EtOAc×2,  H2O×1,  sat  NaCl  aq×1で抽出した後、有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー  (CHCl3  :  MeOH  =  20  :  1)  にて単離精製し、N-{[3-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)pyridin-2-yl]methyl}-N'-[6-hydroxymethylpyridin-2-yl)methyl]urea  (29)  (424  mg,  43%)  を薄黄色結晶として生成した。
1H  NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ ＝  7.62-6.96  (m,  15H,  Ar-H）,  6.74  (d,  4H,  J=9.0Hz,  Ar-H),  4.52  (s,  2H,  CH2),  4.33  (d,  4H,  J=5.6Hz,  CH2),  4.20  (s,  2H,  CH2),  3.70  (s,  6H,  CH3O)

ピリジン環どうしがチオ尿素結合したオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体(31)  の合成
N-{[3-(4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl)pyridin-2-yl]methyl}-N'-[6-hydroxymethylpyridin-2-yl)methyl]urea  (29)  (363  mg,  0.60  mmol)  をpyridine  (7.8  mL)  に溶解した後、succinic  anhydride  (185  mg,  3  eq)  、DMAP  (1.62  mg,  0.02  eq)  を加え、室温下撹拌した。72時間後TLCで原料の消失を確認した後、EtOAc×2、H2O×1、sat  NaHCO3  aq×1で抽出した。有機層をsat  NaCl  aqで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥後、溶媒を減圧留去してスクシニル化合物  (24)  を得た。一晩真空乾燥したスクシニル化合物  (30)  をDMF  (15.6  mL,  CPGに対して0.01  M)  に溶解した後、CPG樹脂  (119  μmol/g)  (1.25  g,  0.15  mmol)  を加えて溶液となじませた。その後、EDC-HCl  (115  mg,  0.60  mmol)  を加え、48時間振とうした。反応溶液をpyridine×3で洗浄した後、0.1  M  DMAP溶液  (pyridine  :  Ac2O  =  9  :  1)  (15  mL)  を加え、室温下12時間振とうした。
反応溶液をpyridine、EtOH、MeCNで洗浄し、12時間真空乾燥した後、得られた樹脂の活性測定を行った。その活性値は79.91  μmol/gであった。
乾燥したCPG樹脂6  mgをガラスフィルターにのせ、HClO4  :  EtOH  =  3  :  2の溶液を流し込み、その濾液のUV  498  nmの波長  (DMTr基の波長)の吸光度を求め、実施例１において用いた前述の数式１より活性値を算出した。
＜ｓｉＲＮＡの合成＞
  以上のようにして得られた、実施例１～３及び比較例１のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体を用い、固相ホスホロアミダイト法により３´末端に擬似ダングリングエンドを有する下記表1に示した配列（この配列はRenilla  Luciferaseをターゲットにするものである）のオリゴヌクレオチド誘導体を核酸自動合成により合成した。また、３´末端にＴＴを有する天然型のｓｉＲＮＡも同様に合成した。合成したオリゴヌクレオチドの配列を図４に示す。
  ｓｉＲＮＡの合成におけるオリゴヌクレオチドの合成法及び精製法の詳細を以下に示す。
  オリゴヌクレオチドの合成には、核酸自動合成機により、以下に示すホスホロアミダイト法を用いた。
1,  オリゴヌクレオチド鎖  (３´末端の連結基を介し、支持固体CPGに固定しておく)  の３´末端保護基、ジメトキシトリチル  (DMTr)  基を酸で除去する。
2,  新たに遊離した５´末端に、デオキキシヌクレオシドの３´-ホスホロアミダイト誘導体をつなぐ。アミダイト体活性化剤はテトラゾールを用いた。
3,  未反応の５´末端をアセチル化でふさぎ、以降のカップリングを阻止する。これで間違ったオリゴヌクレオチドは延びないと考えられる。
4,  カップリングで生じた亜リン酸トリエステルを酸化し、リン酸トリエステルにすると、ヌクレオチドが1つ延びた鎖ができる。
  合成はホスホロアミダイト法に従い、1μmolスケールで行った。3400DNA自動合成機を用いてAGCUの各ホスホロアミダイトは0.1MになるようMeCN溶液に溶解し、合成した擬似ダングリングエンド樹脂は0.12MになるようMeCN溶液に溶解させ調整した。オリゴヌクレオチドの  ５´末端は  DMTr  基を除去した状態で合成を終了した。Ar  ガスを通してCPG  樹脂を乾燥させた。合成終了後、CPG樹脂に結合したオリゴヌクレオチドをエッペンドルフチューブに移し、EtOH：NH4OH  ＝  3：1水溶液1.2  ｍLを加えて室温で12時間振とうし、樹脂からの切り出し及びベンゾイル基などの脱保護処理を行った。その後、溶液を減圧下乾固した。残渣に1M  TBAF  in  THF溶液1  mLを加え溶解させ、12時間振とうし、シリル基の脱保護を行った。この反応液を(*1)0.1M  TEAA  bufferで希釈して30  mLとし、平衡化したC-18逆相カラム(Sep-Pak)  に通し、カラムに吸着させた。（最初にコンディショニングとしてCH3CN  10  mL、0.1  M  TEAA  buffer  15  mLを流し、その後に濾液を流した。）
  ここでカラムを滅菌水で洗浄して塩を取り除き50％  CH3CN  in  H2O  3  mLで溶出し、減圧下乾固した。残渣にloading  solution  (1×TBE  in  90%  formamide)  200  μLを加え(*2)20％PAGE電気泳動  (500V,20mA)  を行った。目的のオリゴヌクレオチドのある部分のゲルを切り出し、溶出液（2  N  TEAA  buffer１mL、  0.1  mM  EDTA水溶液0.2  mLとH2Oを加え20  mLとした。）に浸し、一晩振とうした。この濾液をもう一度平衡化したC-18逆相カラム  (Sep-Pak)  に通し、精製した。
 
(*1)  7  M尿素を含む20%ポリアクリルアミドゲルの調整
40%アクリルアミド溶液  (*1-1)  45  mL、尿素37.8  g、10×TBE  buffer  (*1-2)  8  mLを加えて溶かしH2Oを加え、80  mLとした。最後にAPS  55  mgを加え溶かした後、TEMED  40  μLを加えて混ぜ合わせスペーサー  (1.5  mm)  をはさんで固定させた2枚のガラス板の間に流し込み、1時間以上静置して固化させた。1×TBE  buffer  (*1-3)  を泳道動用緩衝液として用いた。
 
(*1-1)  40%アクリルアミド;  アクリルアミド190  g、N,N’-ビスアクリルアミド10  gをH2Oに溶かして500  mLとした。
(*1-2)  10×TBE  buffer;  Tris  108  g、ホウ酸  55  g、EDTA・2Na  7.43  gをH2Oに溶かして1  Lとした。
(*1-3)  10×TBE  bufferを使用時10倍に希釈して用いた。
 
(*2)  
・2N  TEAA  buffer  (トリエチルアミン  277.6  mLを水に溶解させ、酢酸でpH  7.0に調整し1  Lとした。)  
・0.1  M  TEAA  buffer  (2N  TEAA  bufferを使用時20倍に希釈した。)
・0.1  M  EDTA水溶液  (EDTA・4Na  1.81  gを水で40  mLに調整した。)  を使用時100倍に希釈した。
  こうして得られた各サンプルをH2O  1  mLに溶解し、このものの希釈液の260  nmにおける吸光度を測定し、その収量を求めた。
また、各サンプルの分子量をMALDI－TOF/MASSにより確認した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
  そして、さらにHPLCにて単離精製した。bufferは以下の通り、カラムはC-18を用いた。
・buffer組成
      A  buffer  :  5%  MeCN  in  0.1M  TEAA  (pH  7.0)
      B  buffer  :  50%  MeCN  in  0.1M  TEAA  (pH  7.0)
＜ｓｉＲＮＡの評価＞
（熱的安定性）
  上記のようにして実施例１のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体（９）を用いて合成したｓｉＲＮＡ（以下「ｓｉＲＮＡ（ＢｕＰ）」という）鎖、及び比較例１のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体（１８）を用いて合成したｓｉＲＮＡ鎖を相補鎖とアニーリングして二本鎖（ＴＴ－ａｎｔｉｓｅｎｓｅとＴＴ－ｓｅｎｓｅ，ＢＵＰ－ａｎｔｉｓｅｎｓｅとＢＵＰ－ｓｅｎｓｅの二組）を組み、二組の二本鎖ｓｉＲＮＡの５０％融解温度Ｔｍ（℃）を測定した。すなわち、合成したオリゴヌクレオチドの相補鎖同士を600  pmol分量り取り乾固させ、測定用緩衝液  (10  mM  NaH2PO4-  Na2HPO4,  100  mM  NaCl  (pH  7.0))  200  μLに溶解させ、3μMとした。そして、90℃で5分間加熱後、1時間以上放置しハイブリダイズさせた。その後、脱気を行い、得られたサンプルのうち170μLを専用セルに入れ、Tm測定機で260  nmの吸光度の温度変化を測定した。測定終了後、得られたグラフから、50%融解温度（Tm）を中線法により算出した。その結果、結果を図５及び表２に示すように、ＢＰ、ＢｕＰ、ＰｕＰ及びＢｔｕＰは天然型とほぼ同程度の熱的安定性が示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
（タンパク発現抑制効果の測定）
  上記実施例１のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体（９）を用いて合成したｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ（ＢｕＰ））、比較例１のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体（１８）を用いて合成したｓｉＲＮＡ（以下「ｓｉＲＮＡ（ＢＰ）」という）のタンパク発現抑制効果を評価するため、0.1nM,  1.0nM,  10nMの濃度でDual  Luciferase  Assayを行い、ノックダウン効果を評価した。合成したｓｉＲＮＡはRenilla  Luciferaseをターゲットにしており、この遺伝子とコントロール遺伝子（firefly  Luciferase）を発現するベクターとｓｉＲＮＡを同時にHeLa細胞にトランスフェクションすることで、そのノックダウン効果を測定した。
  この方法は発光タンパクであるFirefly  luciferase、及びRenilla  luciferaseを発現するベクターを用いて、ｓｉＲＮＡによるRenilla  luciferaseのタンパク発現抑制を、それぞれの発光の割合から算出して評価する方法である（図６参照）。
  すなわち、HeLa細胞を4000  cell/mlになるように調整し、96  well  plateの各wellに100  μlずつ入れ、24時間培養した。合成したｓｉＲＮＡのそれぞれの鎖をTE  buffer  (100  mM  NaCl)  に溶解し、アニーリングを行なった。このｓｉＲＮＡ各量、培地(OPTI-MEM)  各量、0.1  μg/μL  psi-CHECK  (Firefly,  Renilla各々のsequenceを持つベクター)  1  μl、transfast  (transfection試薬)  1.5  μlを総量175  μlになるように混合し、培地を吸い出した96  well  plateの各wellに  35  μlずつ入れ、1時間後培地を100  μl加えて24時間培養した。24時間後、培地を吸い出し、冷凍保存した。測定時には、解凍後、Dual  glo  substrate  (Fireflyの基質)  24  μlを加え10分放置後、サンプル23  μlを発光測定用の96  well  plateに移し、Firefly  luciferaseを測定した。その後、Stop  and  glo  substrate  23  μlを加え10分放置後、Renilla  luciferaseを測定した。Renilla  luciferaseの値をFirefly  luciferaseの値で割り、%  of  controlを用いて比較した。なお、luciferase測定には、Luminescenser  JNRを使用した。
  その結果、図７に示すように、ｓｉＲＮＡ（ＢｕＰ）はベンゼン-ピリジン部位を有するｓｉＲＮＡ（ＢＰ）と同程度のタンパク発現抑制能を有することがわかった。
（ヌクレアーゼ耐性の測定）
  前述のようにして合成したｓｉＲＮＡ（ＢｕＰ）、ｓｉＲＮＡ（ＢＰ）及び天然型のｓｉＲＮＡ（ＴＴ）の５´末端に蛍光性置換基を修飾し、その３´エキソヌクレアーゼ耐性を調べた。蛍光性置換基はフルオレセインであり、フルオロセインのホスホロアミダイト体を、DNA/RNA自動合成機によりホスホロアミダイト法により５´末端に導入した。
  こうして５´末端に蛍光性置換基を修飾したｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を調べた。
  すなわち、Fluoresein  で蛍光標識したオリゴヌクレオチド  (ｓｉＲＮＡ（ＴＴ）,  ｓｉＲＮＡ（ＢＰ）及びｓｉＲＮＡ（ＢｕＰ）を300  pmol、SVP  5.0×10-3  unit  /  mLを100  μL加え、37℃でインキュベートし、0  min、1  min、5  min、10  min、15  min、30  min、1  h、3  hおきにあらかじめ別のエッペンドルフチューブに分注しておいた反応停止液  (0.1%  BPB,  XC  in  7  M  Urea)  15  μL中に、反応液を5  μL加え、各時間の反応溶液とした。なお、0minのサンプルは酵素を加えていないものとした。
これらを20%  PAGEにて分離した後、蛍光スキャナ（ルミノ・イメージアナライザーLAS-4000）を用いてフルオロセインの蛍光強度を測定することにより、ヌクレアーゼ耐性の程度を調べた。
  結果を図８及び図９に示す。図９から、天然型ｓｉＲＮＡ（ＴＴ）は１分後にヌクレアーゼ耐性活性がほぼ消失するのに対し、ベンゼン-ピリジン部位を有するｓｉＲＮＡ（ＢｕＰ）及びｓｉＲＮＡ（ＢＰ）は３０分程度経過しても、まだヌクレアーゼ耐性活性は５０％程度残っていた。このことから、ベンゼン-ピリジン部位を有するｓｉＲＮＡ（ＢｕＰ）及びｓｉＲＮＡ（ＢＰ）は天然型ｓｉＲＮＡ（ＴＴ）と比較して優れた３´エキソヌクレアーゼ耐性を有していることが分かった。
  また、以上の結果から、実施例１のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体（９）を用いて合成したｓｉＲＮＡ（以下「ｓｉＲＮＡ（ＢｕＰ）を１本鎖及び２本鎖ＤＮＡ、１本鎖及び２本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ並びにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド等に利用した場合にも、同様のヌクレアーゼ耐性を有することが明白となった。
  以上のように、実施例のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体は、３´末端にベンゼン骨格及びピリジン骨格のうち２つの骨格が化学修飾されたオリゴヌクレオチド誘導体を容易に合成することができる。また、ピリジン環とベンゼン環どうしが尿素結合によって連結しており、尿素結合による芳香族環どうしの連結はカルボニルジイミダゾールを用いてカップリングすることにより極めて容易かつ定量的に形成させることができる。このため、アミダイト試薬を用いてリン酸エステル結合させたリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体と比較して、合成が容易である。
（実施例４）
＜フルオロメチルベンゼン環どうしが尿素結合したオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体の合成＞
  実施例４では、次に示す合成ルートにしたがってフルオロメチルベンゼン環どうしが尿素結合したオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
Dimethyl  5-hydroxymethylisophthalate  (32)  の合成
Trimethyl  1,3,5-benzenetricarboxylate  (5.02  g,  19.9  mmol)  をTHF  (15  mL)  に溶解し、脱気後、Ar置換してさらにNaBH4  (901  mg,  23.8  mmol)  を加えた後、THF  :  MeOH  (12.5  mL  :  3.7  mL)  溶液をゆっくり滴下しながら加え、30分間refluxした。TLCで反応の進行を確認した後、HCl  (1  N,  20  mL)  を加えて反応を停止した。酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー  (hexane  :  EtOAc  =  4  :  1  →  3  :  1)  にて単離精製し、dimethyl  5-hydroxymethylisophthalate  (32)  (2.73  g,  61%)  を白色結晶として得た。
1H-NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ =  8.60  (1H,  s,  Ar-H),  8.24  (2H,  s,  Ar-H),  4.82  (2H,  d,  J  =  6.3  Hz,  CH2O),  3.95  (6H,  s,  CH3CO2),  1.98  (1H,  t,  J  =  6.3  Hz,  OH)
13C-NMR  (CDCl3,  100  MHz)
δ =  166.2,  142.0,  131.9,  130.7,  129.7,  64.05,  52.37
Dimethyl  5-fluoromethylisophthalate  (33) の合成
Dimethyl  5-hydroxymethylisophthalate  (32)  (3.36  g,  15.0  mmol)  をAr雰囲気下、CH2Cl2  (150  mL,  0.1M  solution)  に溶解し、氷冷下  (diethylamino)sulfur  trifluoride  (4.00  mL,  30.5  mmol)  をゆっくり滴下しながら加え、室温で2時間撹拌した。TLCで反応の進行を確認した後、MeOH  (150  mL)  を加えて反応を停止した。溶媒を減圧留去した後、酢酸エチルと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液  (×3)  で抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー  (hexane  :  EtOAc  =  10  :  1)  で単離精製し、dimethyl  5-fluoromethylisophthalate  (33)  (2.57  g,  78%)  を白色結晶として得た。
1H-NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ =  8.67  (1H,  s,  Ar-H),  8.24  (2H,  s,  Ar-H),  5.48  (2H,  d,  J  =  48.1  Hz,  CH2F),  3.97  (6H,  s,  CH3CO2)
13C-NMR  (CDCl3,  100  MHz)
δ =  165.8,  137.3  (d,  J  =  19.1  Hz),  132.2  (d,  J  =  6.7  Hz),  131.1,  130.8,    83.2  (d,  J  =  171.7  Hz),  52.5
Methyl  3-fluoromethyl-5-hydroxymethylbenzoate  (34)  の合成
Dimethyl  5-fluoromethylisophthalate  (33)  (3.16  g,  14.0  mmol)  をTHF  (10.5  mL)  に溶解し、脱気後、Ar置換してさらにNaBH4  (638  mg,  16.9  mmol)  を加えた後、THF  :  MeOH  (8.8  mL  :  2.6  mL)  溶液をゆっくり滴下しながら加え、1時間refluxした。TLCで反応の進行を確認した後、HCl  (1  N,  14  mL)  を加えて反応停止した。酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー  (hexane  :  EtOAc  =  5  :  1  →2  :  1)  にて単離精製し、methyl  3-fluoromethyl-5-hydroxymethylbenzoate  (34)  (2.21  g,  80%)  を白色結晶として得た。
 
1H-NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ =  7.93  (1H,  s,  Ar-H),  7.87  (1H,  s,  Ar-H),  7.52  (1H,  s,  Ar-H),  5.36  (2H,  d,  J  =  48.6Hz,  CH2F),  4.67  (2H,  s,  CH2O),  3.88  (3H,  s,  CH3CO2)
13C-NMR  (CDCl3,  100  MHz)
δ  =  166.6,  141.9,  136.7  (d,  J  =  18.1  Hz),  130.3,  129.8  (d,  J  =  5.7  Hz),  127.8  (d,  J  =  1.9  Hz),  127.1  (d,  J  =  6.7  Hz),  83.6  (d,  J  =  169.8  Hz),  63.8,  52.1
Methyl  3-azidomethyl-5-fluoromethylbenzoate  (35)  の合成
Methyl  3-fluoromethyl-5-hydroxymethylbenzoate  (34)  (2.30  g,  11.6  mmol)  を24時間乾燥させ、sodium  azide  (3.77  g,  58.1  mmol)、carbontetrabromide  (4.24  g,  12.1  mmol)、triphenylphosphine  (3.66  g,  13.9  mmol)  を48時間乾燥させた。Ar雰囲気下、triethylamine  (3.6  mL)  を加えた後、DMF  (88  mL)  に溶解して、室温で93時間撹拌した。TLCにて反応の進行を確認した後、酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー  (hexane  :  EtOAc  =  10  :  1)  にて単離精製し、methyl  3-azidomethyl-5-fluoromethylbenzoate  (35)  (1.37g,  53%)  を淡黄色オイルとして得た。
1H-NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ =  8.02  (1H,  s,  Ar-H),  8.00  (1H,  s,  Ar-H),  7.55  (1H,  s,  Ar-H),  5.45  (2H,  d,  J  =  48.1Hz,  CH2F),  4.45  (2H,  s,  CH2N3),  3.95  (3H,  s,  CH3CO2)
13C-NMR  (CDCl3,  100  MHz)
δ =  166.2,  137.5  (d,  J  =  18.1  Hz),  136.5,  131.2,  130.9  (d,  J  =  5.7  Hz),  129.3,  128.0  (d,  J  =  6.7  Hz),  84.0  (d,  J  =  171.7  Hz),  77.50,  54.1,  52.4
3-Azidomethyl-5-fluoromethylbenzylalcohol  (36)  の合成
Methyl  3-azidomethyl-5-fluoromethylbenzoate  (35)  (468  mg,  2.10  mmol)  をTHF  (1.5  mL)  に溶解し、脱気後、Ar置換してさらにNaBH4  (97.5  mg,  2.58  mmol)  を加えた後、THF  :  MeOH  (1.3  mL  :  0.4  mL)  溶液をゆっくり滴下しながら加え、20時間refluxした。TLCで反応の進行を確認した後、1  N塩酸  (2.5  mL)  を加えて反応を停止した。その後、酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で脱水、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー  (hexane  :  EtOAc  =  5  :  1  →  EtOAc)  にて単離精製し、3-azidomethyl-5-fluoromethylbenzylalcohol  (36)  (149  mg,  36%)  を無色透明オイルとして得た。また、抽出時の水層に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて塩基性にした後、酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で脱水、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。そして、methyl  3-aminomethyl-5-fluoromethylbenzoate  (37)  (33.1  mg,  8%)  を黄色透明オイルとして得た。
3-Azidomethyl-5-fluoromethylbenzylalcohol  (36)
1H-NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ =  7.36  (1H,  s,  Ar-H),  7.33  (1H,  s,  Ar-H),  7.26  (1H,  s,  Ar-H),  5.40  (2H,  d,  J  =  48.6,  CH2F),  4.75  (2H,  s,  CH2O),  4.38  (2H,  s,  CH2N3)
 
Methyl  3-aminomethyl-5-fluoromethylbenzoate  (37)
1H-NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ =  7.99  (1H,  s,  Ar-H),  7.93  (1H,  s,  Ar-H),  7.56  (1H,  s,  Ar-H),  5.42  (2H,  d,  J  =  48.1,  CH2F),  3.96  (2H,  s,  CH2N),  3.93  (3H,s,  CH3CO2)
3-Aminomethyl-5-fluoromethylbenzylalcohol  (38)  の合成
Methyl  3-azidomethyl-5-fluoromethylbenzoate  (35)  (476  mg,  2.13  mmol)  をTHF  (21.3  mL)  に溶解し、脱気後、Ar置換した。また、別のAr置換したナスフラスコにLiAlH4  (408  mg,  10.7  mmol)  を加え、氷冷下THF  (21.3  mL)  に懸濁し、先程の化合物(3)  をゆっくり滴下しながら加え、0℃で2時間撹拌した。TLCにて原料の消失を確認した後、MeOH  (10  mL)  を加えて反応を停止した。セライト濾過にて金属を除去した後、濾液を減圧留去した。残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー  (hexane  :  EtOAc  =  1  :  1  →  EtOAc  :  MeOH  =  2  :  1)  にて単離精製し、3-aminomethyl-5-fluoromethylbenzylalcohol  (38)  (172  mg,  48%)  を黄色固体として得た。
1H-NMR  (CD3OD,  400  MHz)
δ =  7.43  (2H,  s,  Ar-H),  7.39  (1H,  s,  Ar-H),  5.40  (2H,  d,  J  =  49.0,  CH2F),  4.66  (2H,  s,  CH2O),  4.11  (2H,  s,  CH2N)
13C-NMR  (CD3OD,  100  MHz)
δ =  144.5,  139.0  (d,  J  =  17.2  Hz),  135.4,  128.6,  127.7  (d,  J  =  6.7  Hz),  127.3  (d,  J  =  5.7  Hz),  85.1  (d,  J  =  168.8  Hz),  64.4,  44.0
3-(4,4’-Dimethoxytrityloxy)methyl-5-fluoromethylbenzylazide  (39)  の合成
3-Azidomethyl-5-fluoromethylbenzylalcohol  (36)  (142  mg,  0.73  mmol)  を脱気後、Ar置換し、DMTrCl  (323  mg,  0.95  mmol)  を加えた。これに、DMF  (2.0  mL)  およびピリジン  (2.0  mL)  をそれぞれ加え、室温で22時間撹拌した。TLCにて反応の進行を確認した後、真空中で溶媒を減圧留去した。酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で脱水、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー  (hexane  :  EtOAc  =  20  :  1→  5  :  1)  にて単離精製し、3-(4,4’-dimethoxytrityloxy)methyl-5-fluoromethylbenzylazide  (39)  (346  mg,  95%)  を無色透明オイルとして得た。
1H-NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ =  7.51-7.21  (12H,  m,  Ar-H),  6.84  (4H,  d,  J  =  9.2  Hz,  Ar-H),  5.39  (2H,  d,  J  =  48.6,  CH2F),  4.37  (2H,  s,  CH2N3),  4.21  (2H,  s,  CH2O),  3.80  (6H,  s,  CH3O)
13C-NMR  (CDCl3,  100  MHz)
δ =  158.5,  144.8,  140.6,  136.9  (d,  J  =  18.1  Hz),  136.0,  135.9,  130.0,  128.1,  127.9,  126.8,  125.7,  125.7,  113.2,  86.6,  84.2  (d,  J  =  169.8  Hz),  65.1,  55.2,  54.5
3-(4,4’-Dimethoxytrityloxy)methyl-5-fluoromethylbenzylamine  (40)  の合成
3-(4,4’-Dimethoxytrityloxy)methyl-5-fluoromethylbenzylazide  (39)  (247  mg,  0.50  mmol)  をTHF  (5.00  mL)  に溶解し、水(0.20  mL)、triphenylphosphine  (264  mg,  1.01  mmol)  を順に加え、脱気後、Ar置換し、室温で15時間撹拌した。TLCで反応の進行を確認した後、酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で脱水、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー  (EtOAc  →  EtOAc  :  CH3OH  =  2  :  1)  にて単離精製し、3-(4,4’-dimethoxytrityloxy)methyl-5-fluoromethylbenzylamine  (40)  (234  mg,  100%)  を白濁オイルとして得た。
1H-NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ ＝  7.51-7.20  (12H,  m,  Ar-H),  6.84  (4H,  d,  J  =  8.7  Hz,  Ar-H),  5.38  (2H,  d,  J  =  49.0,  CH2F),  4.18  (2H,  s,  CH2O),  3.89  (2H,  s,  CH2N),  3.79  (6H,  s,  CH3O)
13C-NMR  (CDCl3,  100  MHz)
δ =  158.5,  144.9,  143.4,  140.1,  136.5  (d,  J  =  17.2  Hz),  136.1,  130.0,  128.1,  127.8,  126.8,  126.1,  125.0  (d,  J  =  5.7  Hz),  124.6  (d,  J  =  6.7  Hz),  113.1,  86.5,  84.6  (d,  J  =  168.8  Hz),  65.  3,  55.2,  46.2
3-(t-Butyldimethylsilyloxy)methyl-5-fluoromethylbenzylamine  (41)  の合成
3-Aminomethyl-5-fluoromethylbenzylalcohol  (38)  (520  mg,  3.07  mmol)  およびimidazole  (923  mg,  13.6  mmol)  をDMF  (15.5  mL)  に溶解させ、脱気後、Ar置換した。これに、TBDMSCl  (1.03  g,  6.83  mmol)  を加えて溶解させ、脱気後、再度Ar置換して室温で18時間撹拌した。TLCにて反応の進行を確認した後、酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で脱水、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー  (hexane  :  EtOAc  =  1  :  1)  にて精製し、3-(t-butyldimethylsilyloxy)methyl-5-fluoromethylbenzylamine  (41)  (661  mg,  76%)  を無色オイルとして得た。
1H  NMR  (CDCl3,  400MHz)
δ =  7.21  (1H,  s,  Ar-H),  7.19  (1H,  s,  Ar-H),  7.11  (1H,  s,  Ar-H),  5.35  (2H,  d,  J  =  49.0  Hz,  CH2F),  4.73  (2H,  s,  CH2O),  4.48  (2H,  d,  J  =  6.0  Hz,  CH2N),  0.94  (9H,  s,  t-C4H9Si),  0.10  (6H,  s,  (CH3)2Si)
N-3-(4,4’-Dimethoxytrityloxy)methyl-5-fluoromethylbenzyl-N’-3-(t-Butyldimethylsilyloxy)methyl-5-fluoromethylbenzylurea  (42)  の合成
3-(4,4’-Dimethoxytrityloxy)methyl-5-fluoromethylbenzylamine  (40)  (89.3  mg,  0.19  mmol)  の入ったナスフラスコを脱気後、Ar置換してTHF  (5.0  mL)  を加え溶解した。また、1,1’-carbonyldiimidazole  (33.0  mg,  0.20  mmol)  をTHF  (5.0  mL)  に溶解し、化合物  (10)  にゆっくり滴下しながら加え、室温で9.5時間撹拌した。TLCにて反応の進行を確認した。次に、3-(t-butyldimethylsilyloxy)methyl-5-fluoromethylbenzylamine  (41)  (54.8  mg,  0.19  mmol)  をTHF  (1.6  mL)  に溶解し、反応系内にゆっくり滴下した。室温で13時間撹拌し、TLCにて反応の進行を確認した。溶媒を減圧留去し、残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー  (hexane  :  EtOAc  =  2  :  3  →  EtOAc  :  CH3OH  =  2  :  1)  にて精製し、N-3-(4,4’-Dimethoxytrityloxy)methyl-5-fluoromethylbenzyl-N’-3-(t-Butyldimethylsilyloxy)methyl-5-fluoromethylbenzylurea  (42)  (93.5  mg,  63%)  を無色オイルとして得た。
1H  NMR  (CDCl3,  400  MHz)
δ =  7.47-6.79  (19H,  m,  Ar-H),  5.28  (4H,  d,  J  =  49.0  Hz,  CH2F),  4.34  (2H,  s,  CH2),  4.15  (2H,  s,  CH2),  3.75  (8H,  s,  CH3O  and  CH2),  3.72  (2H,  s,  CH2),  0.93  (9H,  s,  t-C4H9Si),  0.09  (6H,  s,  (CH3)2Si)
 こうして得られたN-3-(4,4’-Dimethoxytrityloxy)methyl-5-fluoromethylbenzyl-N’-3-(t-Butyldimethylsilyloxy)methyl-5-fluoromethylbenzylurea  (42)について、実施例１や実施例２と同様の方法により、実施例３のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体を得ることができる。
  この発明は上記発明の実施の態様及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
ｓｉＲＮＡの化学修飾の例を示す図である。 特許文献１に記載されている、ＣＰＧ樹脂にリン酸ジエステル結合で連結された２つのベンゼン骨格がリンカーを介して化学修飾されているオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体の合成経路を示す図である。 特許文献１に記載されている、ＣＰＧ樹脂にリン酸ジエステル結合で連結された２つのピリジン骨格がリンカーを介して化学修飾されているオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体の合成経路を示す図である。 実施例及び比較例で合成したオリゴヌクレオチドの配列を示す図である。 実施例ｓｉＲＮＡ（BP、BuP、PuP、BtuP）及び比較例ｓｉＲＮＡ（ＴＴ）の熱的安定性を示すグラフである。 ｓｉＲＮＡによるRenilla  luciferaseのタンパク発現抑制効果を測定する方法を示す図である。 実施例ｓｉＲＮＡ（ＢｕＰ）及び比較例ｓｉＲＮＡ（ＢＰ）によるRenilla  luciferaseのタンパク発現抑制を、それぞれの発光の割合から算出したグラフである。 ヌクレアーゼ耐性活性度測定における電気泳動の結果を示す図である。 ヌクレアーゼ耐性活性度と時間との関係を示すグラフである。
  本発明は、個別化医療への展開が期待されているＲＮＡ創薬等、核酸オリゴマーを用いた医療分野において有用な手段を提供することができる。

Claims (17)

  1.   下記構造式（Ａ）で示されることを特徴とする芳香族化合物（ただし、式中のＲ１～Ｒ６はそれぞれ独立して水素又は水素以外の置換基を示す。また、式中Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立してＣＨ又は窒素を示し、Ｘは酸素又はイオウを示す。また、Ｐｒ１及びＰｒ２はそれぞれ独立して水酸基の保護基を示す。）。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  2.   下記構造式（Ａ１）で示されることを特徴とする請求項１に記載の芳香族化合物（ただし、式中のＲ１及びＲ２はそれぞれ独立してアルキル基、アリール基、ハロアルキル基及びハロゲン基のいずれかであり、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立してＣＨ又は窒素を示し、Ｘは酸素又はイオウを示す。また、Ｐｒ１及びＰｒ２はそれぞれ独立して水酸基の保護基を示す。）。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  3.   下記構造式（Ａ２）で示されることを特徴とする請求項１に記載の芳香族化合物（ただし、Ｐｒ１及びＰｒ２はそれぞれ独立して水酸基の保護基を示す。）。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  4.   下記構造式（ａ）で示されるユニットが直接又はリンカーを介して担体に化学修飾されていることを特徴とするオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体（ただし、式中のＲ１～Ｒ６はそれぞれ独立して水素又は水素以外の置換基を示す。また、式中Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立してＣＨ又は窒素を示し、Ｘは酸素又はイオウを示す）。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  5.   下記構造式（ａ１）で示されるユニットが直接又はリンカーを介して担体に化学修飾されていることを特徴とする請求項４に記載のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体（ただし、式中のＲ１及びＲ２はそれぞれ独立してアルキル基、アリール基、ハロアルキル基及びハロゲン基のいずれかであり、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立してＣＨ又は窒素を示し、Ｘは酸素又はイオウを示す）。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  6.   下記構造式（ａ２）で示されるユニットが直接又はリンカーを介して担体に化学修飾されていることを特徴とする請求項４に記載のオリゴヌクレオチド誘導体合成用修飾担体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  7.   オリゴヌクレオチドの３´末端が下記構造式（ａ）で示されるユニット（ただし、式中のＲ１～Ｒ６はそれぞれ独立して水素又は水素以外の置換基を示す。また、式中Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立してＣＨ又は窒素を示し、Ｘは酸素又はイオウを示す）で修飾されていることを特徴とするオリゴヌクレオチド誘導体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  8.   オリゴヌクレオチドの３´末端が下記構造式（ａ１）で示されるユニット（ただし、式中のＲ１及びＲ２はそれぞれ独立してアルキル基、アリール基、ハロアルキル基及びハロゲン基のいずれかであり、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立してＣＨ又は窒素を示し、Ｘは酸素又はイオウを示す）で修飾されていることを特徴とする請求項７に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
  9.   オリゴヌクレオチドの３´末端が下記構造式（ａ２）で示されるユニットで修飾されていることを特徴とする請求項７に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
  10.   前記オリゴヌクレオチドは所定の遺伝子ｍＲＮＡの部分配列又はその相補配列を有する請求項７乃至９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
  11.   前記オリゴヌクレオチドの鎖長は１０以上３５以下である請求項７乃至１０のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
  12.   前記オリゴヌクレオチドはオリゴリボヌクレオチドであることを特徴とする請求項７乃至１１のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
  13.   遺伝子発現調節用オリゴヌクレオチド構築物であって、
      請求項７乃至１２のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体を有する構築物。
  14.   １本鎖及び２本鎖ＤＮＡ、１本鎖及び２本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ並びにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドから選択される遺伝子発現調節用オリゴヌクレオチド構築物であって請求項１２に記載の構築物。
  15.   アンチジーン、アンチセンス、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びリポザイムから選択される請求項１３又は１４に記載の構築物。
  16.   遺伝子診断用オリゴヌクレオチド構築物であって、請求項１３乃至１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド誘導体を有する構築物。
  17.   プローブ又はプライマーであることを特徴とする請求項１６に記載の構築物。
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