WO2011069486A1 - Rna-aptamere, die den löslichen interleukin-6-rezeptor spezifisch binden - Google Patents

Rna-aptamere, die den löslichen interleukin-6-rezeptor spezifisch binden Download PDF

Info

Publication number
WO2011069486A1
WO2011069486A1 PCT/DE2010/001412 DE2010001412W WO2011069486A1 WO 2011069486 A1 WO2011069486 A1 WO 2011069486A1 DE 2010001412 W DE2010001412 W DE 2010001412W WO 2011069486 A1 WO2011069486 A1 WO 2011069486A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
aptamer
rna
binding
sil
rna aptamer
Prior art date
Application number
PCT/DE2010/001412
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ulrich Hahn
Stefan Rose-John
Cindy Meyer
Tijana Zivkovic
Original Assignee
Universität Hamburg
Christian-Albrechts-Universität Zu Kiel
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universität Hamburg, Christian-Albrechts-Universität Zu Kiel filed Critical Universität Hamburg
Publication of WO2011069486A1 publication Critical patent/WO2011069486A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification

Definitions

  • the invention relates to aptamers which specifically bind a target molecule.
  • cytokine interleukin-6 IL-6
  • IL-6 interleukin-6
  • Cytokine IL-6 is known to be involved in a variety of diseases, e.g. inflammatory autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis.
  • inflammatory autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis.
  • membrane-bound cytokine receptors soluble forms also exist which consist of the extracellular domains of the membrane-like forms and also possess the ability to bind ligand, albeit at a reduced affinity to the membrane-like form. Soluble receptors can neutralize ligands, for example, by their comparatively high concentration and act in this way
  • soluble interleukin-6 receptor sIL-6R
  • the complex of EL-6 and sIL-6R causes dimerization of the membrane-bound gpl30 (Taga, T. et al. (1989) Cell, 58, 573-581 Mackiewicz, A. et al., (1992) J. Immunol., 149, 2021-2027; Scheller and Rose-John, Med. Microbiol Immunol. (2006), 195, 173-183; Rose-John et al. , (2006), JJ Leukocyte Biol. 80, 227-235; Jones et al.
  • gpl30 is present in almost all organs, e.g. Heart, kidneys, spleen, liver, lung, placenta, and brain (Saito, M. et al., 1992, J. Immunol., 148, 4066-4071) .
  • interleukin-6 may therefore also act on cells which do not express the membrane-bound mterleukin-6 receptor but the glycoprotein gp 130 (Hirota, H. et al., (1995) Proc Natl Acad., USA, 92, 4862-4866).
  • tocilizumab (Actemra®) is a monoclonal antibody currently used to treat rheumatoid arthritis. Tocilizumab (Actemra®) exerts its action via the blockade of the human IL-6 receptor, resulting in the binding of IL-6 to the receptor and a consequent
  • Other side effects include gastrointestinal perforation, hypersensitivity reactions including anaphylaxis, headache and
  • Aptamers are artificial DNA or RNA molecules that contain another molecule, e.g. a protein, specifically bind. With high specificity and affinity as well as chemical
  • aptamers have a low immunogenicity compared to antibodies.
  • aptamers may be selected by a method termed SELEX (Evolutionary Evolutionary Ligations by Exponential Enrichment) (Ellington and Szostak (1990), Nature 346, 818-822, Gopinath (2007), Anal. Bioanal Chem 387, 171-182, WO 91/19813).
  • the invention provides an RNA aptamer that specifically binds the human soluble interleukin-6 receptor.
  • the soluble human mlelevikin-6 receptor (sIL-6R) has a molecular weight of about 50 kDa at 339 amino acids (AA).
  • the amino acid sequence of sIL-6R is shown in SEQ ID NO: 11.
  • Amino acid sequence of the sEL-6R is identical to that of the extracellular domain of the membrane-bound interleukin-6 receptor (IL-6R), so that the inventive
  • aptamer also specifically binds the IL-6R. Any reference to the sIL-6R should therefore also include the IL-6R, unless expressly stated otherwise.
  • the RNA aptamer according to the invention is affine and specific for the human sIL-6 receptor and is unlikely or not immunogenic. It provides a promising means to treat or prevent diseases involving the soluble IL-6 receptor. It is also simple and inexpensive to produce, durable and storable.
  • the RNA aptamer of the invention can be used in a variety of ways to
  • IL-6 and / or the soluble and / or the membrane-bound interleukin-6 receptor are directly or indirectly involved, to diagnose or influence. It can be used, for example, to prepare a drug or diagnostic agent that can be used to diagnose, prevent and / or treat inflammatory conditions or diseases, cancers or infections. Examples of diseases in which the inventive RNA aptamer
  • RNA aptamer according to the invention can also be used to introduce other molecules, for example peptides, proteins, oligonucleotides, dyes, diagnostic agents, etc. into a cell. To do this, these molecules are prepared using techniques that are familiar to those skilled in the art are common, coupled to the RNA aptamer.
  • the molecule coupled to the RNA aptamer according to the invention can then be introduced into the cell by means of the sIL-6R or the IL-6R and be released intracellularly.
  • the molecules can also be biologically or medically active substances, so that the RNA aptamer can also have a function as part of a prodrug.
  • RNA aptamer an isolated single-stranded RNA (ssRNA) comprising a target molecule, e.g. a protein that specifically binds.
  • ssRNA isolated single-stranded RNA
  • RNA aptamer ssRNA oligonucleotides having at most 150, preferably at most 130, at most 110, at most 100, at most 90, at most 80, at most 70, at most 60, at most 50, at most 40, at most 30, at most 20 , at most 15 or at most 10 nucleotides understood.
  • nucleotide are here in particular the basic building blocks of nucleic acids, i. organic molecules derived from a sugar residue, usually a pentose, e.g. Deoxyribose or ribose, an organic base (nucleobase) and phosphoric acid.
  • a pentose e.g. Deoxyribose or ribose
  • an organic base e.g. Deoxyribose or ribose
  • phosphoric acid is regularly linked to the sugar via an ester bond, the sugar to the nucleobase via an N-glycosidic bond.
  • RNA ribonucleic acid
  • the phosphoric acid is usually present in RNA and DNA as monophosphate.
  • a “target molecule” is understood here preferably to be non-RNA and non-DNA molecules, for example proteins, peptides and glycoproteins.
  • binding is meant a bond that does not rely on the Watson-Crick pairing between nucleotides. It is preferably a non-covalent bond.
  • a human sIL-6 receptor specifically binding RNA aptamer or a fragment thereof is here understood an RNA aptamer or RNA aptamer fragment, a related
  • RNA aptamer or RNA aptamer fragment understood that has a dissociation constant of at most 1000 nM (nmol / 1), preferably at most 500 nM, more preferably at most 250 nM and particularly preferably at most 150 nM. this preferably refers to averages of a size determined using the one-site binding model described below using filter binding studies.
  • the notion of hsIL-6 receptor specific binding also encompasses specific binding to the hIL-6 receptor, ie the membrane-bound human IL-6 receptor.
  • a “diagnostic emitter 1" is understood here to mean a product that can be used in a diagnostic method.
  • the term also encompasses products, for example
  • RNA aptamer according to the invention comprises
  • Nucleotide sequence ggkgnggcwguggwgwggg (SEQ ID NO: 1).
  • the RNA aptamer according to the invention comprises the nucleotide sequence ggkgnggcwguggwgwggg (SEQ ID NO: 2), ggggnggcwguggwgwggg (SEQ ID NO: 3) or ggggnggcwguggwgwggg (SEQ ID NO: 4).
  • the letters k, n and w are as defined above, h is a, c or u.
  • sequence of SEQ ID NO: 2 differs from the sequence according to SEQ ID NO: 1 in that there is no g at position 5
  • sequence of SEQ ID NO: 3 differs from the sequence according to SEQ ID NO: 1 in that that at position 3 is a g
  • sequence of SEQ ID NO: 4 differs of the sequence according to SEQ ID NO: 1, characterized in that at position 3 is a g and at position 5 no g.
  • the RNA aptamer according to the invention comprises one of the sequences indicated in SEQ ID NO: 5-10 or SEQ ID NO: 13-18 or a fragment thereof which specifically binds the human soluble interleukin-6 receptor.
  • One or more, possibly also all bases of the nucleotides of the RNA aptamer or of the RNA aptamer fragment can be modified. This can be beneficial to
  • the modification may be, for example, that the 2'-OH group of a nucleotide base is replaced by a fluoro, amino or methoxy group.
  • the 2-OH group is advantageous by a methoxy group, in a pyrimidine base by a fluoro or
  • RNA aptamer of the invention may also be combined with other compounds, e.g. Cholesterol or polyethylene glycol (PEG), or may be timed, for example, to increase bioavailability, reduce degradation or excretion.
  • other compounds e.g. Cholesterol or polyethylene glycol (PEG)
  • PEG polyethylene glycol
  • dT deoxythymidine
  • a fragment of an RNA aptamer according to the invention preferably comprises at least 14, 15, 16, 17, 18, 19 or at least 20, more preferably at least 25, at least 30, at least 35, at least 40, at least 45, at least 50, at least 55 and particularly preferably 60 consecutive nucleotides of any of the sequences given in SEQ ID NO: 5-10 or SEQ ID NO: 13-18.
  • the fragment may also comprise at least 70, 80, 90, 100 or 106 contiguous nucleotides.
  • a fragment comprises at least one of the sequences according to SEQ ID NO: 1-4. Examples of fragments within the meaning of the present invention are given in the sequences with SEQ ID NO: 19-21.
  • the aptamer of the present invention non-competitively binds to human sIL-6R. This does not affect the binding of mterleukin 6 (IL-6) to sIL-6R.
  • the signal transduction can be modified or prevented. This can be effected, for example, by attaching the gpl30 or the IL6 sterically or otherwise by means of an antibody directed against the RNA aptamer or, for example, by a molecule coupled to the RNA aptamer, for example a peptide, a nucleic acid or another compound, is hampered.
  • the aptamer bound to the receptor in turn is bound by a binding molecule, for example an antibody directed against the aptamer.
  • a binding molecule for example an antibody directed against the aptamer.
  • an indirect mechanism can also be used so that, for example, a molecule coupled to the RNA aptamer (eg biotin or an antigen) is in turn bound by another molecule (eg avidin or an antibody). It may also be advantageous in diagnostic methods if the RNA aptamer binds non-competitively to the sIL-6R.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an aptamer of the invention.
  • the pharmaceutical composition moreover preferably comprises suitable carrier material, excipients and the like.
  • the drug may also contain one or more other active ingredients.
  • the active ingredients may also be coupled to the RNA aptamer, i. covalently or non-covalently bound.
  • Suitable formulations and dosage forms are known to those skilled in the art or may be routinely prepared according to the prior art.
  • Aptamers according to the invention can, for example, also be bound to nanoparticles which are loaded with other active substances, thereby allowing a targeted delivery of the active substances.
  • the invention also relates to the use of a
  • Aptamers according to the invention for the preparation of a medicament for the preparation of a medicament, as indicated above, preferably a medicament for the treatment of a condition or a disease associated with non-normal concentrations of the sIL-6R in body fluid, eg blood, or with a non-normal occurrence of IL-6R , or a diagnostic agent, for example, to diagnose a disease with the normal state deviating concentrations of sIL-6R in body fluid, such as blood, or are associated with a non-normal occurrence of IL-6R.
  • the medicament is thereby preferably intended for the treatment of inflammatory conditions, cancer or infections, for example rheumatoid arthritis, sepsis, asthma, Crohn's disease, multiple sclerosis, depression, breast cancer, multiple myeloma or an HTV infection.
  • inflammatory conditions for example rheumatoid arthritis, sepsis, asthma, Crohn's disease, multiple sclerosis, depression, breast cancer, multiple myeloma or an HTV infection.
  • Fig. 1 Binding of the aptamer 16-3 to the target molecule sEL-6R.
  • the proportion of bound RNA aptamer 16-3 (in%) was at defined sIL-6R concentrations in
  • Filter binding studies were determined and plotted as a function of the sIL-6R concentration (logarithmic plot). The measurement points and error bars shown result from the averages and standard deviations of ten independent studies. The dissociation constants were calculated using a "one-site-modeling" model.
  • Fig. 2 Gel shift assay for analyzing the interaction between aptamer 16-3 and sIL-6R.
  • Fig. 3 Gel shift assay to analyze the specific interaction between aptamer 16-3 and the target molecule sIL-6R using two control proteins.
  • the aptamer 16-3 was tested for interaction with the control proteins CEACAM1 (lanes 2-5: 10 nM - 300 nM) and lysozyme (lanes 7-10: 10 nM - 300 nM) by gel shift assay in a 5% , native PAA gel analyzed.
  • the positive control used was an approach with sIL-6R (75 nM, lane 6).
  • Fig. 4 gel-shift analysis of the specific interaction between aptamer 16-3 and the
  • Target molecule sIL-6R with associated controls.
  • additional competition between labeled and unlabelled aptamer (lanes 3 and 7) and labeled aptamer and unlabeled control RNA R24 (lane 8).
  • Lane 4 shows the binding of an anti-His-AK to sIL-6R aptamer complexes
  • lane 9 the interaction between aptamer and anti-His-AK.
  • FIG. 5 Filter binding study of RNA aptamer 16-3 on sIL-6R in the presence and absence of IL-6.
  • A The protein sIL-6R was in increasing concentration (0-300 nM) with radiolabelled aptamer 16-3 in the presence of 740 nM IL-6 (+ IL-6) or in the absence of IL-6 (-IL- 6) and filtered. The amounts of labeled RNA remaining on the filter are illustrated. To calculate the percentage of bound RNA, a defined amount (125%) of RNA was applied to the membrane in each case.
  • RNA aptamer 16-3 The proportion of bound RNA aptamer 16-3 (in%) at defined sIL-6R concentrations in the presence of 740 nM IL-6 (+ IL-6) or in the absence of IL-6 (-IL-6 ) was determined by filter binding studies and plotted (logarithmic plot). The dissociation constants were calculated using a one-site binding model. It was a double determination.
  • Fig. 6 Gel-shift assay for analysis of possible competition between aptamer 16-3 and IL-6 for binding to sIL-6R.
  • the separation of the aptamer-protein mixtures was carried out in 5% native PAA gel. Detection was by autoradiography.
  • Fig. 7 The fusion protein Hyper-IL-6. Schematically shown is the hyper IL-6 fusion construct consisting of the N- and C-terminal truncated sIL-6R (AS 113-323) and IL 6, which are linked together via a flexible linker. Linker amino acids are given in single letter code.
  • Hyper-IL-6 and sgpl30Fc Interaction partners Hyper-IL-6 and sgpl30Fc.
  • Hyper-IL-6 (lane 2), sgpl30Fc (lane 3) and both proteins in mixture (lane 4) were radiolabeled with aptamer 16-3 ( ⁇ 1 nM). incubated. After gel electrophoresis (5%, native PAA gel) and drying of the gel, the bands were detected by autoradiography.
  • Fig. 9 Shortening of the aptamer 16-3 on the basis of the predicted secondary structure using the mfold web server program.
  • A. In addition to the secondary structure of the "wild type" aptamer 16-3 (SEQ ID NO: 17), the variants 16-3 A, 16-3_B and 16-3_C (SEQ ID NO 19-21) based thereon are abbreviated.
  • B. RNA sequences of the truncated variants of the sIL-6R-specific aptamer 16-3 in the 5 '-3' direction.
  • Fig. 10 Binding of the aptamer 16-3 and truncated variants of sIL-6R. The proportion of bound RNA (in%) at defined sIL-6R concentrations was in
  • Filter binding studies determined and presented as a function of the sIL-6R concentration (logarithmic plot). The measurement points and error bars shown represent mean values and standard deviations from at least three independent studies. The dissociation constants were calculated using a one-site binding model.
  • variant 16 3B guanine residues possibly involved in the consensus sequence (in 16 3 B in normal writing) were replaced by uracil residues (bold).
  • the mutation of the G at position 15 characterizes variant 16 3 B M1.
  • additional variants were created: 16 3 B M2 - 16-3_B_M5.
  • Subscript numbers exemplify the position of the individual bases.
  • Fig. 12 Mutation analysis for the binding of aptamers 16-3, 16-3 B and five variants of hyper-IL-6. The proportion of relative RNA binding (in%) was determined at a defined sIL-6R concentration of 300 nM using filter binding studies. The measurement points and error bars shown represent mean values and standard deviations from two independent studies. The relative binding of the aptamer 16-3 B and the variants relates to the binding of the "wild-type" aptamer 16-3. Fig. 13 Gel shift assay for analysis of variants of aptamer 16-3B.
  • Ligands by exponential enrichment in vitro selection process (Tuerk, C. and L. Gold, Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, Science, 1990. 249 (4968): p. 10) used.
  • this process in steps of iterative cycles, (1) incubation of a nucleic acid library with the target molecule, (2) separation of binding from non-binding nucleic acids, and (3) amplification of binding species, i. an accumulation of binding
  • RNA library high diversity about 10 13 different molecules
  • on magnetic particles the on magnetic particles (Dynabeads ®) immobilized sIL-6R (the amino acid sequence of sIL-6R see SEQ ID NO: 11) soluble variant of the membrane-bound interleukin-6 receptor (IL-6R).
  • Immobilization was biotinylated of sIL-6R and then immobilized interaction on the surface of streptavidin-coupled Dynabeads ® via a biotin-streptavidin.
  • the protein-coupled particles were used for aptamer selection. After separation of non-binding nucleic acids by means of magnetic separation and washing steps, binding RNA species were eluted by heating and amplified by means of an RT-PCR reaction. Subsequent T7 transcription formed the transition to the following round of selection. After about 6-20 of these iterative cycles, the enriched library was cloned and sequenced. An RNA start library of sufficiently high sequence diversity was produced. A synthetically prepared ssDNA library Rl (Metabion, Kunststoff) was used for this purpose
  • the ssDNA library Rl had the following basic structure: 5'-AATGCTAATACGACTCACTATAGGAAGAAAGAGGTCTGAGACATTCT-N60- CnCTGGAGTTGACGnGCTT-3 '
  • the sequence of the ssDNA library Rl was characterized by a randomized region of 60 nucleotides flanked by 47 and 21 nucleotide constant regions at both the 3 'and 5' ends. These served to attach two
  • the T7 primer region included the sequence of the T7 promoter (TAATACGACTCACTATAGG), which served as the recognition sequence of the T7 RNA polymerase, and transcribed the dsDNA into the ssRNA start library (106 nt, -3.6 x 10 13 molecules ) with the basic structure
  • RNA molecules were transcribed into cDNA after addition of the RT primer RI by means of reverse transcription and in a
  • RNA starting library Rl 500 pmol
  • Dynabeads ® sIL-6R 100 pmol
  • Selection Buffer B (10x PBS (0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, 6.5 mM Na 2 HP0 4 , 15 mM KH 2 PO 4 ); 3 mM MgCl 2 ; pH 7.4) for 30 min at room temperature (RT ).
  • the binding to the target RNA molecules were separated by magnetic separation of non-binding molecules, discarded the supernatant and the RNA-target complexes washed once with 100 .mu.l x selection buffer B.
  • the elution of binding nucleic acids was carried out after careful resuspension in 55 ⁇ aqua dest. under heat at 80 ° C for 3 min. This eluate was subjected directly to RT-PCR without further purification steps.
  • RT-PCR was monitored by PAGE (10% native polyacrylamide (PAA) gel).
  • PAGE 100% native polyacrylamide (PAA) gel.
  • the RT-PCR product was directly subjected to in vitro T7 transcription using T7 RNA polymerase. Without further purification, 20 were incubated ⁇ of the transcription approach with the immobilized on Dynabeads ® sIL-6R. After separation of non-binding RN A molecules, the beads were washed twice with 100 ⁇ l lx selection buffer B, the number of washing steps increasing to four with increasing round of selection. After sixteen rounds, the selection was ended. The dsDNA library of round 9 and final round 16 decreased
  • sequences given include both the 60 nucleotide randomized region and the flanking 5 'and 3' primer regions, except for the T7 promoter sequence (TAATACGACTCACTATAGG), of which only the two terminal G nucleotides are included.
  • T7 promoter sequence TAATACGACTCACTATAGG
  • the number in front of the hyphen indicates the selection round (9 or 16).
  • Target molecule sIL-6R and to determine dissociation constants (Kd values) Filter binding studies performed under radioactive conditions. In addition, gel-shift studies using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and
  • Dissociation constants were carried out by means of filter binding studies. For this purpose, a constant amount ( ⁇ 1 nM) of radioactively labeled RNA (the labeling was carried out by incorporation of ⁇ x- [ 32 P] -ATP (0.1 ⁇ / ⁇ , 100 nM) during T7 transcription) with increasing concentrations (1 nM to 300 nM) of protein incubated for 20 min at RT. Unless otherwise stated, the buffer used was the lx selection buffer B (1 ⁇ PBS (0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, 6.5 mM Na 2 HPO 4 , 15 mM KH 2 PO 4 ), 3 mM MgCl 2 ; pH 7.4).
  • a nitrocellulose membrane was pretreated for 10 minutes with aminohexanoic acid buffer (20% methanol, 40 mM aminohexanoic acid (C 6 H 13 N0 2 )), clamped in a 96-well dot blot apparatus (Schleicher & Schull) and under vacuum twice with 200 ⁇ lx selection buffer B washed.
  • aminohexanoic acid buffer (20% methanol, 40 mM aminohexanoic acid (C 6 H 13 N0 2 )
  • the reactions were filtered through the nitrocellulose membrane. Protein binding RNA molecules were retained on the membrane. Non-binding RNA molecules were removed by washing four times with lx Selection Buffer B.
  • the nitrocellulose membrane was dried and the amounts of radioactively labeled substances remaining on the membrane were quantified using a phosphorimager (BioRad). The evaluation of the data obtained was carried out using the software Quantity One ® (BioRad). For the plot of binding curves the program GraphPad Prism® (GraphPad Software, Inc., USA) was used. The dissociation constant (K d ) was determined according to a one-site binding model based on the following equation:
  • Nitrocellulose membrane remaining amount of radiolabeled nucleic acids was quantified as described above and used to determine the dissociation constant.
  • Table 1 Characteristics of aptamers 16-1, 16-2, 16-3 and 16-8.
  • the aptamer 16-3 exhibited a very affinity binding to the sIL-6R with a significantly lower dissociation constant (K d ).
  • K d dissociation constant
  • PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis Due to their size, aptamer-protein complexes formed under native conditions have a delayed migration behavior in the gel. The complexes therefore migrate more slowly than the corresponding free RNA molecules and are therefore detectable as so-called "shift" in the gel.
  • Equal amounts ( ⁇ 1 nM) a- [ 32 P] radiolabelled RNA were incubated with increasing amounts of protein (1 nM - 300 nM) in lx selection buffer B (see above) for 30 min at RT. Samples were seeded with 6x DNA sample buffer (50% (w / v) sucrose; 1% (w / v) SDS; 0.1% (w / v) orange
  • TEMED ( ⁇ , ⁇ , ⁇ ⁇ ⁇ '-tetramemyl-enylenediamine) 0.1% (v / v); APS (ammonium persulfate) 0.1% (w / v)).
  • the electrophoretic separation was carried out at 80 V and 4 ° C in lx TBE. After completion of the electrophoresis, the gel was dried by applying a vacuum. The radioactive bands were detected by autoradiography.
  • the aptamer 16-3 clearly showed an interaction with the sIL-6R, since the gel showed a "shift” caused by the complex formation (see Fig. 2).
  • the intensity of this slowed band increased with increasing concentration of sIL-6R ( Figure 2, from left to right).
  • Figure 2 In the area of gelatine is also a concentration-dependent
  • RNA aptamers were specific for the target molecule sIL-6R.
  • these proteins were, on the one hand, CEACAM1, a cell adhesion molecule which carried a C-terminal His tag analogously to sIL-6R.
  • the other protein was lysozyme, an enzyme that can cleave polysaccharides of prokaryotic cell walls. Both proteins should not interact with the sIL-6R specific ribonucleic acids.
  • RNA band retarded in their behavior was indeed due to a specific interaction between aptamer and sIL-6R.
  • a> 1000-fold molar excess of unlabelled aptamer was added (lane 3, lane 7) ).
  • the labeled and unlabeled RNA molecules competed for binding to the soluble IL-6R, resulting in the weakening of the retarded band (competition).
  • Antibody complexes were evident in the gel by a supershift, ie an even stronger one delayed band compared to the aptamer-protein complex (lane 4).
  • the anti-His antibody showed no interaction with the aptamer 16-3 alone ( Figure 4, lane 9).
  • RNA aptamers In in vitro competition studies, the interaction between the selected RNA aptamers and the sIL-6R was investigated in the presence of its natural ligands IL-6 and gpl30 as well as of hyper-IL-6. 2.3.1 Competition analysis between aptamer 16-3 and interleukin-6 (IL-6)
  • the aptamer 16-3 and IL-6 thus did not have the same binding site on the receptor.
  • the concentration of IL-6 was increased to 1.5 ⁇ . Also, this high ligand concentration had no influence on the aptamer bond.
  • Hyper-IL-6 is a bioactive fusion protein of IL-6 and sIL-6R, where both interaction partners are linked by a flexible polypeptide linker.
  • This linker is composed of the 16 N-terminal non-helical amino acids of IL-6 and thirteen other amino acids, predominantly glycine and serine.
  • the N-terminal immunoglobulin-like domain Dl and the C-terminus of the sIL-6R have been omitted, since both are not suitable for the
  • the aptamer thus interacted with hyper-IL-6 at a region unequal to the sgpl30Fc binding site.
  • the aptamer did not interact with sgpl30Fc alone ( Figure 8, lane 3).
  • aptamer 16-3 was truncated to a 19mer (16-3A; SEQ ID NO: 19) which retained only the conserved, G-rich region of the aptamer.
  • the truncated RNA 16-3B (47 nt; SEQ ID NO: 20) included, in addition to the G-rich region, the stabilizing, double-stranded region consisting of nine base pairs.
  • the third truncated RNA, 63mer 16-3C (SEQ ID NO: 20), was characterized by the absence of the constant primer regions of the original sequence (the sequence contained three additional G nucleotides at the 5 'end of the randomized region of 60 nucleotides in length ). 16-3_A (19 nucleotides, see SEQ ID NO: 19):
  • variant 16-3 B a Ka value of about 26.4 nM (Table 2) could be determined.
  • the affinity of the 47mer 16-3 B was in the range of the "wild-type" aptamer. This significant shortening thus had no influence on the affinity for the receptor.
  • the variant 16-3 A reduced to the G-rich region, which only consisted of 19 nucleotides, could bind the protein, but with reduced binding affinity (Kd ⁇ 446 nM) compared to 16-3.
  • the absence of the primer regions in 16 3_C also weakened the affinity for the target protein (Kd - 117 nM).
  • Mutation within the GG pairs involved in the quadruplex formation should result in loss of binding to the hyper-IL-6 protein.
  • the mutational analyzes were in the form of filter binding studies as described above. The binding of the truncated variants was compared in each case with the binding portion of the aptamer 16-3. The result of the analysis is shown in FIG. 12.
  • the aptamers 16-3 and 16-3 B resembled each other in their strong binding behavior towards hyper-IL-6.
  • the exchange of defined guanine residues within the three mutants 16-3_B_ M3, 16-3_B_M4 and 16-3 B M5 led to one
  • the results of the mutation analyzes are consistent with the assumption of a possible formation of a G-Quaclmplex Srruktur.
  • the loss of function of the four mutants 16-3 B M1, 16-3_B_M3, 16-3_B_M4 and 16-3JB M5 indicates that the guanine residues 15, 21, 27 and 32 of the aptamer 16-3 B are essential for the aptamer bond and perhaps in the
  • BAF / gpl30 / IL6R / TNF examined.
  • the cell lines BAF / gpl30 and BAF / gp 130 / IL6R / TNF were derived from the murine pre-B cell line BAF / 3, an immortalized, the
  • Bone marrow-derived pro-B cell line whose growth and proliferation depends on the presence of the cytokine IL-3. The growth of the BAF / 3 cells used here was dependent on IL-6. Cells of this cell line were probed with cDNA for gp 130
  • BAF / gpl30 or the cDNAs for gpl30, TNF and IL-6R (BAF / gp 130 / IL6R / TNF) stably transfected.
  • the BAF / gp 130 / IL-6R TNF cells were able to produce TNF, in addition to the production of gpl30 and IL-6R, but this was not essential in the context of subsequent aptamer studies.
  • the BAF / gpl30 and BAF / gpl30 / IL-6R / TNF cell lines were cultured in 25 cm 2 bottles and kept in the incubator at 37 ° C.
  • the culture medium DMEM Dulbecco's
  • Hyper IL 6 (10 ng / ml) was additionally added to the BAF / gpl30 cells, the BAF / gpl30 / IL-6R / TNF cells additionally the cytokine IL 6 (10 ng / ml) and the antibiotic puromycin (12 ⁇ g / ml). ml).
  • the growth of the cells was also observed in the absence of the cytokines, since without these stimuli cell growth was not possible.
  • the presence of the interleukin 6 receptor on the surface of the BAF / gp 130 / IL6R / TNF cells was controlled using a murine monoclonal IL-6R specific IgG1 antibody (not shown).
  • RNA molecules for 5 min at RT. Separation of unbound RNA molecules was followed by centrifugation of the cells at 500 g for 5 min. The pellet was washed twice with 500 ⁇ l of Selection Buffer B.
  • Resuspension in 350 ⁇ l lx selection buffer B was the aptamer binding on
  • BAF / gpl30 / IL6R / TNF cells were cultured in 25 cm 2 culture bottles (see above). For harvest, the cells were centrifuged for 5 min at 500 g and RT. The supernatant was discarded, the pellet was taken up in 5 ml of DMEM (without FCS) and the cell count determined using a Neubauer counting chamber.
  • Fluorescence labeling of the RNA was carried out here with AlexaFluor® 647 (Invitrogen).
  • the anti-hIL-6R antibody in combination with the goat anti-mouse secondary AK blocked the specific interaction of the aptamer with the BAF / gpl30 / IL6R / TNF cells.
  • This result demonstrates simultaneously the specific binding of the aptamer to the native IL-6R on the surface of BAF / gpl30 / IL6R TNF cells, since the anti-hIL-6R antibody was directed against the IL-6R.
  • Nonspecific binding to IL-6R deficient BAF / gpl30 control cells was not observed.
  • RNA aptamer RNA aptamer
  • randomized region plus 5 'and 3' primer regions randomized area plus 5 'and 3'

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Zielmolekül spezifisch bindende Aptamere. Aufgabe der Erfindung ist es, diagnostische und/oder therapeutische Mittel zur Anwendung bei der Erkennung und/oder Prävention bzw. Behandlung von Entzündungsprozessen, Krebserkrankungen und Infektionen bereitzustellen. Zur Lösung dieser Aufgabe stellt die RNA-Aptamere bereit, die den menschlichen löslichen Interleukin-6-Rezeptor (sIL-6R) spezifisch binden.

Description

RNA-APTAMERE, DIE DEN LÖSLICHEN INTERLEUKIN-6-REZEPTOR SPEZIFISCH BINDEN
Die Erfindung betrifft Aptamere, die ein Zielmolekül spezifisch binden.
Es ist bekannt, dass Zytokine, beispielsweise Interleukine wie Interleukin-6 (IL-6), eine bedeutende Rolle bei der Informationsvermittlung zwischen verschiedenen Zellen eines Organismus spielen. Die biologische Wirkung von Zytokinen auf die Zielzellen wird dabei durch spezifische, meist membrangebundene Rezeptoren vermittelt Das Zytokin Interleukin-6 (IL-6) beispielsweise wirkt auf eine Vielzahl unterschiedlicher Zellen und spielt insbesondere bei Entzündungsprozessen eine zentrale Rolle. Von Zytokin IL-6 ist bekannt, dass es an einer Reihe von Erkrankungen, z.B. entzündlichen Autoimmunkrankheiten wie rheumatoider Arthritis, beteiligt ist. Von vielen membrangebundenen Zytokin-Rezeptoren existieren auch lösliche Formen, die aus den extrazellulären Domänen der membranständigen Formen bestehen und ebenfalls die Fähigkeit zur Ligandenbindung, wenn auch bei verminderter Affinität gegenüber der membranständigen Form, besitzen. Lösliche Rezeptoren können Liganden beispielsweise durch ihre vergleichsweise hohe Konzentration neutralisieren und wirken auf diese Weise
antagonistisch. Für die löslichen Rezeptoren einiger Zytokine wird aber auch eine agonistische Wirkung beschrieben. Im Falle des löslichen Interleukin-6-Rezeptors (sIL-6R) bewirkt beispielsweise der Komplex aus EL-6 und sIL-6R eine Dimerisation des membranständigen gpl30 (Taga, T. et al. (1989), Cell, 58, 573-581; Mackiewicz, A. et al. (1992) J. Immunol., 149, 2021-2027; Scheller und Rose- John, Med. Microbiol. Immunol. (2006), 195, 173-183; Rose- John et al., (2006), J. J. Leukocyte Biol. 80, 227-235; Jones et al. (2001), The FASEB Journal 15, 43-57), wodurch die Signaltransduktion initiiert wird. Anders als der membrangebundene IL-6-Rezeptor wird gpl30 in fast allen Organen, z.B. Herz, Nieren, Milz, Leber, Lunge, Plazenta und Gehirn, exprimiert (Saito, M. et al. (1992 J. Immunol., 148, 4066-4071). In Gegenwart von sIL6-R kann das Interleukin-6 daher auch auf Zellen wirken, die nicht den membranständigen mterleukin-6-Rezeptor, j edoch das Glykoprotein gp 130 exprirnieren (Hirota, H. et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A, 92, 4862-4866).
BESTÄTIGUNGSKOPIE Aufgrund der oben skizzierten Bedeutung von Zytokinen sind im Stand der Technik bereits Ansätze verfolgt worden, durch gezielte Hemmung von Zytoldnrezeptoren auf
Krankheitsverläufe Einfiuss zu nehmen. Ein Ansatz besteht beispielsweise in der Verwendung von Antikörpern gegen Zytokinrezeptoren. Tocilizumab (Actemra®) ist beispielsweise ein monoklonaler Antikörper, der derzeit zur Behandlung von rheumatoider Arthritis eingesetzt wird. Tocilizumab (Actemra®) entfaltet seine Wirkung über die Blockade des humanen IL-6- Rezeptors, wobei die Bindung von IL-6 an den Rezeptor und eine daraus resultierende
Entzündungsreaktion verhindert wird. Die Verwendung von Antikörpern ist aber häufig mit unerwünschten Nebenwirkungen verbunden. Die häufigsten unerwünschten Nebenwirkungen bei Behandlung mit Antikörpern sind Infektionen, überwiegend Infektionen des oberen Respirationstraktes. Außerdem wurde bei deren Anwendung häufig ein leichter Anstieg der Leberfunktionswerte und des
Lipidstoffwechsels beobachtet. Weitere Nebenwirkungen sind Magen-Darm-Perforationen, Überempfindlichkeitsreaktionen einschließlich Anaphylaxie, Kopfschmerzen und
Bluthochdruck.
Seit einiger Zeit wird auch versucht, so genannte Aptamere als therapeutische und
diagnostische Mittel einzusetzen (s. z.B. Osborne et al. (1997), Curr. Opin. Chem. Biol. 1, 5-9). Aptamere sind künstliche DNA- oder RNA-Moleküle, die ein anderes Molekül, z.B. ein Protein, spezifisch binden können. Bei hoher Spezifität und Affinität sowie chemischer
Stabilität weisen Aptamere im Vergleich zu Antikörpern eine niedrige Immunogenität auf. Aptamere können zum Beispiel mit Hilfe eines Verfahrens selektiert werden, das als SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) bezeichnet wird (Ellington und Szostak (1990), Nature 346, 818-822; Gopinath (2007), Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182; WO 91/19813).
Trotz der bisherigen intensiven Bemühungen besteht allerdings nach wie vor ein hoher Bedarf an diagnostischen und/oder therapeutischen Mitteln zur Anwendung bei der Erkennung und/oder Prävention bzw. Behandlung von Entzündungsprozessen, Krebserkrankungen und Infektionen. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, solche Mittel bereitzustellen. Gelöst wird die Aufgabe durch die Gegenstände des Anspruchs 1 und der weiteren nebengeordneten Ansprüche. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den
Unteransprüchen angegeben. In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein RNA- Aptamer bereit, das den menschlichen löslichen Interleukin-6-Rezeptor spezifisch bindet. Der lösliche Human-mterlevikin-6-Rezeptor (sIL-6R) weist bei 339 Aminosäuren (AS) ein Molekulargewicht von ca. 50 kDa auf. Die Aminosäuresequenz des sIL-6R ist in der SEQ ID NO: 11 wiedergegeben. Die
Aminosäuresequenz des sEL-6R stimmt mit derjenigen der extrazellulären Domäne des membranständigen Interleukin-6-Rezeptors (IL-6R) überein, so dass das erfindungsgemäße
Aptamer selbstverständlich auch den IL-6R spezifisch bindet. Jede Bezugnahme auf den sIL-6R soll daher auch den IL-6R mit erfassen, sofern dies nicht ausdrücklich anders angegeben ist.
Das erfindungsgemäße RNA- Aptamer ist affin und spezifisch für den humanen sIL-6-Rezeptor und dabei voraussichtlich nicht oder wenig immunogen. Es stellt ein viel versprechendes Mittel bereit, um Erkrankungen, an denen der lösliche IL-6-Rezeptor beteiligt ist, zu behandeln oder zu verhindern. Es ist darüber hinaus einfach und kostengünstig herzustellen, gut haltbar und lagerungsfähig. Das erfindungsgemäße RNA- Aptamer kann auf vielfältige Weise eingesetzt werden, um
Zustände oder Erkrankungen des Menschen, an denen IL-6 und/oder der lösliche und/oder der membranständige Interleukin-6-Rezeptor direkt oder indirekt beteiligt sind, zu diagnostizieren oder zu beeinflussen. Es kann beispielsweise dazu verwendet werden, ein Arzneimittel oder ein Diagnosemittel herzustellen, mit dessen Hilfe inflammatorische Zustände oder Erkrankungen, Krebserkrankungen oder Infektionen diagnostiziert, verhindert und/oder behandelt werden können. Beispiele für Erkrankungen, bei denen das erfindungsgemäße RNA-Aptamer
Anwendung finden kann, umfassen rheumatoide Arthritis, Sepsis, Asthma, Morbus Crohn, Multiple Sklerose, Depression, Brustkrebs, Multiples Myelom und HIV-Infektion. Das erfindungsgemäße RNA-Aptamer kann auch verwendet werden, um andere Moleküle, beispielsweise Peptide, Proteine, Oligonukleotide, Farbstoffe, Diagnosemittel etc., in eine Zelle einzuführen. Hierzu werden diese Moleküle mit Hilfe von Techniken, die dem Fachmann geläufig sind, an das RNA-Aptamer gekoppelt. Das an das erfindungsgemäße RNA-Aptamer gekoppelte Molekül kann dann mittels des sIL-6R oder des IL-6R in die Zelle geschleust und intrazellulär wieder freigesetzt werden. Bei den Molekülen kann es sich auch um biologisch bzw. medizinisch wirksame Substanzen handeln, so dass das RNA-Aptamer auch eine Funktion als Bestandteil eines Propharmakon haben kann.
Unter einem "RNA-Aptamer" wird hier eine isolierte Einzelstrang-RNA (ssRNA) verstanden, die ein Zielmolekül, z.B. ein Protein, spezifisch bindet. Insbesondere werden unter dem Begrifif "RNA-Aptamer" ssRNA-Oligonukleotide mit höchstens 150, vorzugsweise höchstens 130, höchstens 110, höchstens 100, höchstens 90, höchstens 80, höchstens 70, höchstens 60, höchstens 50, höchstens 40, höchstens 30, höchstens 20, höchstens 15 oder höchstens 10 Nukleotiden verstanden.
Unter einem "Nukleotid" werden hier insbesondere die Grundbausteine von Nukleinsäuren, d.h. organische Moleküle verstanden, die aus einem Zuckerrest, in der Regel einer Pentose, z.B. Desoxyribose oder Ribose, einer organischen Base (Nukleobase) und Phosphorsäure bestehen. Die Phosphorsäure ist mit dem Zucker regelmäßig über eine Esterbindung, der Zucker mit der Nukleobase über eine N-glykosidische Bindung verbunden. In Desoxyriboukleinsäure (DNA) kommen regelmäßig die Nukleobasen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T) vor, während in Ribonukleinsäure (RNA) anstelle des Thymins die Base Uracil (U) vertreten ist. Die Phosphorsäure liegt in RNA und DNA in der Regel als Monophosphat vor. Die
Verknüpfung von Nukleotiden untereinander erfolgt meistens über eine
Phosphordiesterbindung zwischen dem 5'-C-Atom einer Pentose und dem 3'-C-Atom einer benachbarten Pentose.
Unter einem "Zielmolekül" werden hier vorzugsweise Nicht-RNA- und Nicht-DNA-Moleküle, beispielsweise Proteine, Peptide und Glykoproteine, verstanden. Unter "Bindung" wird hier eine Bindung verstanden, die nicht auf der Watson-Crick-Paarung zwischen Nukleotiden beruht. Es handelt sich bevorzugt um eine nicht-kovalente Bindung. Unter einem den humanen sIL-6-Rezeptor spezifisch bindenden RNA-Aptamer oder einem Fragment davon wird hier ein RNA-Aptamer oder RNA-Aptamer-Fragment verstanden, das eine diesbezügliche
Dissoziationskonstante (K<j) von maximal 7Ί0"6 M (mol/1), bevorzugt maximal 5'IGT6 M, bevorzugt maximal 3· KT6 M, bevorzugt maximal 2· KT6 M, bevorzugt maximal KT6 M, maximal 8· KT7 M, maximal 5·1(Γ7 M, maximal 3·10~7 M, maximal 10~7 M, maximal 8·1(Γ8 M, maximal 5·10-8 M oder maximal 3· KT8 M aufweist. Insbesondere wird unter einem den humanen sIL-6-Rezeptor spezifisch bindenden RNA- Aptamer oder RNA-Aptamer-Fragment ein RNA- Aptamer oder RNA-Aptamer-Fragment verstanden, das eine Dissoziationskonstante von maximal 1000 nM (nmol/1), vorzugsweise maximal 500 nM, weiter bevorzugt maximal 250 nM und besonders bevorzugt maximal 150 nM aufweist. Wenn hier auf Dissoziationskonstanten Bezug genommen wird, bezieht sich dies vorzugsweise auf Mittelwerte einer mit Hilfe des unten näher beschriebenen "One-Site-Binding"-Modells unter Verwendung von Filterbindungsstudien ermittelten Größe. Wie oben bereits angegeben, umfasst der Begriff einer hsIL-6-Rezeptor-spezifischen Bindung auch die spezifische Bindung an den hIL-6-Rezeptor, d.h. den membranständigen menschlichen IL-6-Rezeptor.
Unter einem "Diagnosemitter1 wird hier ein Erzeugnis verstanden, das in einem diagnostischen Verfahren verwendet werden kann. Der Begriff umfasst auch Erzeugnisse, beispielsweise
Reagenzien oder Reagenzienkits, mit deren Hilfe außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers ein bestimmter Zustand und/oder die Abweichung von einem Normalzustand, z.B. eine abweichende sIL-6R-Konzentration, detektiert werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße RNA- Aptamer die
Nukleotidsequenz ggkgnggcwguggwgwggg (SEQ ID NO: 1). Die Buchstaben geben die Basen der Nukleotide in der üblichen Kodierung an: a = Adenin, c = Cytosin, g = Guanin, u = Uracil, n = beliebiges Nukleotid, vorzugsweise a, c, g oder u, k = g oder u, w = a oder u. In weiteren bevorzugten Amfuhrungsformen umfasst das erfindungsgemäße RNA- Aptamer die Nukleotidsequenz ggkgnggcwguggwgwggg (SEQ ID NO: 2), ggggnggcwguggwgwggg (SEQ BD NO: 3) oder ggggnggcwguggwgwggg (SEQ ID NO: 4). Die Buchstaben k, n und w haben die oben angegebene Bedeutung, h bedeutet a, c oder u. Die Sequenz der SEQ TD NO: 2 unterscheidet sich von der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 dadurch, dass an Position 5 kein g steht, die Sequenz der SEQ ID NO: 3 unterscheidet sich von der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 dadurch, dass an Position 3 ein g steht, und die Sequenz der SEQ ID NO: 4 unterscheidet sich von der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 dadurch, dass an Position 3 ein g und an Position 5 kein g steht.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform umfasst das erfindungsgemäße RNA-Aptamer eine der in den SEQ ID NO: 5-10 oder SEQ ED NO: 13-18 angegebenen Sequenzen oder ein Fragment davon, welches den menschlichen löslichen Interleukin-6-Rezeptor spezifisch bindet. Eine oder mehrere, gegebenenfalls auch alle Basen der Nukleotide des RNA-Aptamers oder des RNA-Aptamer-Fragments können modifiziert sein. Dies kann vorteilhaft sein, um
beispielsweise die Empfindlichkeit gegenüber Nukleasen in vivo zu verringern, die Aufnahme in die Zelle zu verbessern oder eine schnelle renale Resorption zu verhindern. Die Modifikation kann beispielsweise darin bestehen, dass die 2'-OH-Gruppe einer Nukleotid-Base durch eine Fluoro-, Amino- oder Methoxygruppe ersetzt ist. Vorteilhaft ist bei einer Purinbase die 2 -OH- Gruppe durch eine Methoxygruppe, bei einer Pyrimidinbase durch eine Fluoro- oder
Aminogruppe ersetzt. Auch andere Modifikationen sind möglich und liegen im Bereich des Fachkönnens des Durchschnittsfachmanns.
Das erfindungsgemäße RNA-Aptamer kann auch mit anderen Verbindungen, z.B. Cholesterol oder Polyethylenglykol (PEG), gekoppelt oder auch m timerisiert werden, um beispielsweise die Bioverfügbarkeit zu erhöhen, den Abbau oder die Ausscheidung zu vermindern. Zum Schutz vor dem Angriff von Exonukleasen kann beispielsweise am 3 ' -Ende eine 3 ' -3 ' -dT- Kappe (dT = Desoxythymidin) vorgesehen sein.
Ein Fragment eines erfindungsgemäßen RNA-Aptamers umfasst bevorzugt mindestens 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder mindestens 20, weiter bevorzugt mindestens 25, mindestens 30, mindestens 35, mindestens 40, mindestens 45, mindestens 50, mindestens 55 und besonders bevorzugt 60 aufeinander folgende Nukleotide von einer der in den SEQ ID NO: 5-10 oder SEQ BD NO: 13- 18 angegebenen Sequenzen. Im Falle der SEQ ID NO: 13-18 kann das Fragment auch mindestens 70, 80, 90, 100 oder 106 aufeinander folgende Nukleotide umfassen. Besonders bevorzugt umfasst ein Fragment mindestens eine der Sequenzen gemäß SEQ DD NO: 1-4. Beispiele für Fragmente im Sinne der vorliegenden Erfindung sind in den Sequenzen mit den SEQ TD NO: 19-21 angegeben. In einer bevorzugten Ausruhrungsform bindet das erfindungsgemäße Aptamer nicht-kompetitiv an den menschlichen sIL-6R. Dadurch wird die Bindung von mterleukin 6 (IL-6) an den sIL-6R grundsätzlich nicht beeinträchtigt. Gegebenenfalls kann jedoch die Signaltransduktion modifiziert oder verhindert werden kann. Dies kann beispielsweise bewirkt werden, indem die Anlagerung des gpl30 oder auch des IL6 sterisch oder anderweitig mittels eines gegen das RNA-Aptamer gerichteten Antikörpers oder beispielsweise durch ein an das RNA-Aptamer gekoppeltes Molekül, z.B. ein Peptid, eine Nukleinsäure oder eine andere Verbindung, behindert wird. Eine andere Möglichkeit besteht beispielsweise darin, dass das an den Rezeptor gebundene Aptamer seinerseits von einem Bindungsmolekül, z.B. einem gegen das Aptamer gerichteten Antikörper, gebunden wird. Dabei kann auch ein indirekter Mechanismus eingesetzt werden, so dass beispielsweise ein an das RNA-Aptamer gekoppeltes Molekül (z.B. Biotin oder ein Antigen) wiederum von einem anderen Molekül (z.B. Avidin oder ein Antikörper) gebunden wird. Auch bei diagnostischen Verfahren kann es vorteilhaft sein, wenn das RNA- Aptamer nicht-kompetitiv an den sIL-6R bindet.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel bereit, das ein erfindurigsgemäßes Aptamer umfasst. Das Arzneimittel umfasst darüber hinaus bevorzugt geeignetes Trägermaterial, Exzipientien und dergleichen. Gegebenenfalls kann das Arzneimittel auch einen oder mehrere weitere Wirkstoffe enthalten. Die Wirkstoffe können dabei auch an das RNA-Aptamer gekoppelt, d.h. kovalent oder nicht-kovalent gebunden sein. Geeignete Formulierungen und Darreichungsformen sind dem Fachmann bekannt oder können auf routinemäßige Weise gemäß dem Stand der Technik hergestellt werden. Die
erfindungsgemäßen Aptamere können beispielsweise auch an Nanopartikel gebunden werden, die mit anderen Wirkstoffen beladen sind, wodurch eine gezielte Zufuhr der Wirkstoffe ermöglicht wird.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch die Verwendung eines
erfindungsgemäßen Aptamers zur Herstellung eines Arzneimittels, wie oben angegeben, vorzugsweise eines Arzneimittels zur Behandlung eines Zustandes oder einer Erkrankung, die mit vom Normalzustand abweichenden Konzentrationen des sIL-6R in Körperflüssigkeit, z.B. Blut, oder mit einem vom Normalzustand abweichenden Vorkommen des IL-6R einhergeht, oder eines Diagnosemittels, z.B. zur Diagnose einer Erkrankung, die mit vom Normalzustand abweichenden Konzentrationen des sIL-6R in Körperflüssigkeit, z.B. Blut, oder mit einem vom Normalzustand abweichenden Vorkommen des IL-6R verbunden sind. Das Arzneimittel ist dabei bevorzugt zur Behandlung von Entzündungszuständen, Krebs oder Infektionen, z.B. Rheumatoider Arthritis, Sepsis, Asthma, Morbus Crohn, Multipler Sklerose, Depression, Brustkrebs, Multiplem Myelom oder einer HTV-Infektion, vorgesehen.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen und der beigefügten Figuren zu Veranschaulichungszwecken näher erläutert. Fig. 1 Bindung des Aptamers 16-3 an das Zielmolekül sEL-6R. Der Anteil des gebundenen RNA-Aptamers 16-3 (in %) wurde bei definierten sIL-6R-Konzentrationen in
Filterbindungsstudien ermittelt und in Abhängigkeit von der sIL-6R-Konzentration graphisch dargestellt (logarithmische Auftragung). Die gezeigten Messpunkte und Fehlerbalken ergeben sich aus den Mittelwerten und Standardabweichungen zehn voneinander unabhängiger Studien. Die Berechnung der Dissoziationskonstanten erfolgte unter Verwendung eines "One-Site- Bmding"-Modells.
Fig. 2 Gel-Shift-Assay zur Analyse der Interaktion zwischen Aptamer 16-3 und sIL-6R. Die Interaktion von radioaktiv markiertem Aptamer 16-3 mit steigenden Konzentrationen an sIL-6R (0 nM - 300 nM) wurde mittels Gel-Shift-Assay (5%iges, natives PAA-Gel) nachgewiesen.
Fig. 3 Gel-Shift-Assay zur Analyse der spezifischen Interaktion zwischen Aptamer 16-3 und dem Zielmolekül sIL-6R unter Verwendung zweier Kontrollproteine. Das Aptamer 16-3 wurde auf eine Interaktion mit den Kontrollproteinen CEACAM1 (Spuren 2-5: 10 nM - 300 nM) und Lysozym (Spuren 7-10: 10 nM - 300 nM) mittels Gel-Shift-Assay in einem 5%igen, nativen PAA-Gel analysiert. Als Positivkontrolle diente ein Ansatz mit sIL-6R (75 nM, Spur 6).
Fig. 4 Gel-Shift- Analyse der spezifischen Interaktion zwischen Aptamer 16-3 und dem
Zielmolekül sIL-6R mit dazugehörigen Kontrollen. Neben der Interaktion des markierten Aptamers 16-3 (<1 nM, Spuren 1 und 5) mit dem sIL-6R (75 nM, Spuren 2 und 6) wurden zusätzlich Kompetitionen zwischen markiertem und nicht markiertem Aptamer (Spuren 3 und 7) bzw. markiertem Aptamer und nicht markierter Kontroll-RNA R24 (Spur 8) untersucht. In Spur 4 ist die Bindung eines Anti-His-AK an sIL-6R-Aptamer-Komplexe gezeigt, in Spur 9 die Interaktion zwischen Aptamer und Anti-His-AK. Nach Inkubation und erfolgter
Gelelektrophorese (5%iges, natives ΡΑΑ-Gel;) konnten die Banden mittels Autoradiographie detektiert werden. Es sind die Gele zweier voneinander unabhängiger Assays zusammengefügt.
Fig. 5 Filterbindungsstudie des RNA-Aptamers 16-3 an sIL-6R in An- bzw. Abwesenheit von IL-6. A: Das Protein sIL-6R wurde in steigender Konzentration (0-300 nM) mit radioaktiv markiertem Aptamer 16-3 in Anwesenheit von 740 nM IL-6 (+IL-6) bzw. in Abwesenheit von IL-6 (-IL-6) inkubiert und filtriert. Die auf dem Filter verbliebenen Mengen der markierten RNA sind veranschaulicht. Zur Berechnung des prozentualen Anteils an gebundener RNA wurde jeweils eine definierte Menge (125 %) an RNA auf die Membran aufgetragen. B: Der Anteil des gebundenen RNA-Aptamers 16-3 (in %) bei definierten sIL-6R-Konzentrationen in Anwesenheit von 740 nM IL-6 (+IL-6) bzw. in Abwesenheit von IL-6 (-IL-6) wurde anhand von Filterbindungsstudien ermittelt und graphisch dargestellt (logarithmische Auftragung). Die Berechnung der Dissoziationskonstanten erfolgte unter Verwendung eines "One-Site-Binding"- Modells. Es handelte sich hierbei um eine Doppelbestimmung.
Fig. 6 Gel-Shift-Assay zur Analyse einer möglichen Kompetition zwischen Aptamer 16-3 und IL-6 um die Bindung an sIL-6R. Der sIL-6R (75 nM) und das Aptamer 16-3 (<1 nM) wurden in Gegenwart steigender Konzentrationen an IL-6 (0 nM - 150 nM) auf eine Interaktion getestet. Die Trennung der Aptamer-Protein-Gemische erfolgte im 5%igen, nativen PAA-Gel. Die Detektion erfolgte mittels Autoradiographie.
Fig. 7 Das Fusionsprotein Hyper-IL-6. Schematisch gezeigt ist das Hyper-IL-6- Fusionskonstrukt bestehend aus dem N-und C-terminal verkürzten sIL-6R (AS 113-323) und IL 6, welche über einen flexiblen Linker miteinander verbunden sind. Linker- Aminosäuren sind im Einbuchstaben-Code angegeben.
Fig. 8 Gel-Shift-Studie zur Analyse der Interaktion zwischen Aptamer 16-3 und den
Interaktionspartnern Hyper-IL-6 und sgpl30Fc. Hyper-IL-6 (Spur 2), sgpl30Fc (Spur 3) und beide Proteine im Gemisch (Spur 4) wurden mit radioaktiv markiertem Aptamer 16-3 (<1 nM) inkubiert. Nach erfolgter Gelelektrophorese (5%iges, natives PAA-Gel) und Trocknen des Gels wurden die Banden mittels Autoradiographie detektiert.
Fig. 9 Verkürzung des Aptamers 16-3 anhand der vorhergesagten Sekunclarstruktur unter Verwendung des Programms mfold web server. A. Gezeigt sind neben der Sekündärstruktur des "Wildtyp"-Aptamers 16-3 (SEQ ID NO: 17) die darauf basierend verkürzten Varianten 16-3 A, 16-3_B und 16-3_C (SEQ ID NO 19-21). B. RNA-Sequenzen der verkürzten Varianten des sIL-6R-spezifischen Aptamers 16-3 in 5 '-3 '-Richtung. Fig. 10 Bindung des Aptamers 16-3 und verkürzter Varianten an sIL-6R. Der Anteil an gebundener RNA (in %) bei definierten sIL-6R-Konzentrationen wurde in
Filterbindungsstudien ermittelt und in Abhängigkeit zur sIL-6R-Konzentration dargestellt (logarithmische Auftragung). Die gezeigten Messpunkte und Fehlerbalken stellen Mittelwerte und Standardabweichungen aus mindestens drei voneinander unabhängigen Studien dar. Die Berechnung der Dissoziationskonstanten erfolgte unter Verwendung eines "One-Site-Binding"- Modells.
Fig. 11 Sequenzen des verkürzten sIL-6R-spezifischen Aptamers 16-3 B und mutierte
Varianten. Ausgehend von der sIL-6R-bindenden Variante 16 3_B wurden innerhalb der Konsensussequenz (in 16 3 B in normaler Schriftstärke) am G-Quartett möglicherweise beteiligte Güaninreste durch Uracilreste (fett) ersetzt. Die Mutation des G an Position 15 charakterisiert die Variante 16 3 B M1. Um die anderen vier GG-Paare auszuschalten, wurden zusätzliche Varianten erzeugt: 16 3 B M2 - 16-3_B_M5. Tiefgestellte Zahlen nummerieren beispielhaft die Position der einzelnen Basen.
Fig. 12 Mutationsanalyse zur Bindung der Aptamere 16-3, 16-3 B und von fünf Varianten an Hyper-IL-6. Der Anteil relativer RNA-Bindung (in %) wurde bei einer definierten sIL-6R- Konzentration von 300 nM mit Hilfe von Filterbindungsstudien ermittelt. Die gezeigten Messpunkte und Fehlerbalken stellen Mittelwerte und Standardabweichungen aus zwei voneinander unabhängigen Studien dar. Die relative Bindung des Aptamers 16-3 B und der Varianten bezieht sich auf die Bindung des "Wildtyp"- Aptamers 16-3. Fig. 13 Gel-Shift-Assay zur Analyse von Varianten des Aptamers 16-3 B. Die Analyse der Interaktion zwischen Hyper-IL-6 (330 nM) und dem Aptamer 16-3 B bzw. dessen Varianten (16-3_B_M1 - 16-3_B_M5) erfolgte mittels nativer PAGE (5%iges PAA-Gel). Die Detektion der Banden erfolgte mittels Autoradiographie.
Beispiele
1. In-vitro-Selektion von RNA-Aptameren mittels magnetischer Beads Zur Selektion von RNA-Aptameren wurde ein als SELEX (Systematische Evolution von
Liganden durch exponentielle Anreicherung) bezeichneter In-vitro-Selektionsprozess (Tuerk, C. und L. Gold, Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA Polymerase. Science, 1990. 249(4968): S. 505-10) eingesetzt. Bei diesem Prozess erfolgt in iterativen Zyklen der Schritte (1) Inkubation einer Nukleinsäure- Bibliothek mit dem Zielmolekül, (2) Abtrennung bindender von nicht-bindenden Nukleinsäuren und (3) Vervielfältigung bindender Spezies, d.h. eine Anreicherung von bindenden
Nukleinsäuren.
Zu Beginn der ersten Selektionsrunde erfolgte die Inkubation einer RNA-Bibliothek hoher Diversität (etwa 1013 verschiedene Moleküle) mit dem an magnetischen Partikeln (Dynabeads®) immobilisierten sIL-6R (zur Aminosäuresequenz des sIL-6R siehe SEQ ID NO: 11), der löslichen Variante des membranständigen Interleukin-6-Rezeptors (IL-6R). Zur
Immobilisierung wurde der sIL-6R biotinyliert und anschließend über eine Biotin-Streptavidin- Interaktion auf der Oberfläche Streptavidin-gekoppelter Dynabeads® immobilisiert. Die proteingekoppelten Partikel wurden für die Aptamerselektion eingesetzt. Nach Abtrennung nicht-bindender Nukleinsäuren mittels magnetischer Separation und Waschschritten wurden bindende RNA-Spezies durch Erhitzen eluiert und mit Hilfe einer RT-PCR-Reaktion amplifiziert. Eine sich anschließende T7-Transkription bildete den Übergang zur folgenden Selektionsrunde. Nach etwa 6-20 dieser iterativen Zyklen wurde die angereicherte Bibliothek kloniert und sequenziert. Es wurde eine RNA-Startbibliothek genügend hoher Sequenzvielfalt hergestellt. Eine synthetisch hergestellte ssDNA-Bibliothek Rl (Metabion, München) diente hierfür als
Grundlage. Die ssDNA der Bibliothek Rl wies folgende Grundstruktur auf: 5'-AATGCTAATACGACTCACTATAGGAAGAAAGAGGTCTGAGACATTCT-N60- CnCTGGAGTTGACGnGCTT-3'
Die Sequenz der ssDNA-Bibliothek Rl war charakterisiert durch einen randomisierten Bereich von 60 Nukleotiden, welcher sowohl am 3'- als auch am 5 '-Ende von konstanten Regionen mit 47 bzw. 21 Nukleotiden Länge flankiert war. Diese dienten der Anlagerung zweier
komplementärer Oligonukleotide, des T7-Primer-Rl und des RT-Primer-Rl, zur Erzeugung einer Bibliothek aus dsDNA-Molekülen mit einer Länge von 128 Basenpaaren (bp). Die T7- Primer-Region beinhaltete die Sequenz des T7-Promotors (TAATACGACTCACTATAGG), welcher als Erkennungssequenz der T7-RNA-Polymerase fungierte und eine Transkription der dsDNA in die ssRNA-Startbibliothek (106 nt, (-3,6 x 1013 Moleküle) mit der Grundstruktur
S'-GGAAGAAAGAGGUCUGAGACAUUCU-NeQ-CUUCUGGAGUUGACGUUGCUU-S' ermöglichte, die im SELEX- Verfahren eingesetzt wurde.
Nach jedem Selektionszyklus wurden die eluierten RNA-Moleküle nach Anlagerung des RT- Primers-Rl mittels reverser Transkription in cDNA umgeschrieben und in einer sich
anschließenden PCR zu dsDNA aufgefüllt und amplifiziert. In der ersten Selektionsrunde wurde eine definierte Menge der RNA- Ausgangsbibliothek Rl (500 pmol) direkt mit dem an Dynabeads® immobilisierten sIL-6R (100 pmol) in lx
Selektionspuffer B (lx PBS (0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl, 6,5 mM Na2HP04, 15 mM KH2P04); 3 mM MgCl2; pH 7,4) für 30 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Die an das Target bindenden RNA-Moleküle wurden mittels magnetischer Separation von nicht bindenden Molekülen abgetrennt, der Überstand verworfen und die RNA-Target-Komplexe einmal mit 100 μΐ lx Selektionspuffer B gewaschen. Die Elution bindender Nukleinsäuren erfolgte nach vorsichtigem Resuspendieren in 55 μΐ aqua dest. unter Hitzeeinwirkung bei 80 °C für 3 min. Dieses Eluat wurde direkt ohne weitere Reinigungsschritte einer RT-PCR unterzogen. Der Erfolg der RT-PCR wurde mittels PAGE (10%iges, natives Polyacrylamid(PAA)-Gel) kontrolliert. Ab der zweiten Selektionsrunde wurde das RT-PCR-Produkt direkt einer In-vitro- T7-Transkription unter Einsatz der T7-RNA-Polymerase unterzogen. Ohne weitere Reinigung wurden 20 μΐ des Transkriptionsansatzes mit dem an Dynabeads® immobilisierten sIL-6R inkubiert. Nach Abtrennung nicht bindender RN A-Moleküle wurden die Beads zweimal mit 100 μΐ lx Selektionspuffer B gewaschen, wobei sich mit steigender Selektionsrunde die Anzahl der Waschschritte auf vier erhöhte. Nach sechzehn Runden wurde die Selektion beendet. Die dsDNA-Bibliothek der Selektionsrunde 9 sowie der finalen Runde 16 wurden nach
Herstellerangaben in den Vektor pCR®2.1-TOPO* des TA Cloning® Kits (Invitrogen) kloniert. Anschließend wurden acht Klone der 9. Selektionsrunde und zwölf Klone der 16.
Selektionsrunde sequenziert. Die Sequenzierung ergab die folgenden sechs Aptamersequenzen: Aptamer SEQ ED NO:
9-5 13
9-6 14
16-1 15
16-2 16
16-3 17
16-8 18
Die angegebenen Sequenzen umfassen sowohl den 60 Nukleotide langen randomisierten Bereich als auch die flankierenden 5'- und 3 '-Primerbereiche, abgesehen von der T7- Promotorsequenz (TAATACGACTCACTATAGG), von der lediglich die zwei endständigen G-Nukleotide enthalten sind. Die Ziffer vor dem Bindestrich weist auf die Selektionsrunde (9 oder 16) hin.
2. Charakterisierung und Analyse der Aptamer-sIL-6R- Wechselwirkung
Zur Untersuchung der Wechselwirkung der angereicherten RNA-Bibliothek mit dem
Zielmolekül sIL-6R und zur Ermittlung von Dissoziationskonstanten (Kd- Werten) wurden Filterbindungsstudien unter radioaktiven Bedingungen durchgeführt. Darüber hinaus wurden Gel-Shift-Untersuchungen mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) sowie
Kompetitionsstudien unter Einsatz der Filterbmdungstechnik durchgeführt. 2.1 Analytische Filterbindungsstudien
Die Untersuchung von Aptamer-Protein-Interaktionen und die Bestimmung von
Dissoziationskonstanten (Kd- Werte) erfolgten mittels Filterbindungsstudien. Dazu wurde eine konstante Menge (< 1 nM) an radioaktiv markierter RNA (die Markierung erfolgte durch Einbau von <x-[32P]-ATP (0,1 μθ/μΐ; 100 nM) während der T7-Transkription) mit steigenden Konzentrationen (1 nM bis 300 nM) an Protein für 20 min bei RT inkubiert. Als Puffer diente dabei, soweit nicht anders erwähnt, der lx Selektionspuffer B (lx PBS (0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl, 6,5 mM Na2HP04, 15 mM KH2P04); 3 mM MgCl2; pH 7,4). Eine Nitrozellulosemembran wurde 10 min mit Aminohexansäure-Puffer (20% Methanol; 40 mM Aminohexansäure (C6H13N02)) vorbehandelt, in eine 96-Napf-Dot-Blot- Apparatur (Schleicher&Schüll) eingespannt und unter Vakuum zweimal mit 200 μΐ lx Selektionspuffer B gewaschen.
Die Reaktionsansätze wurden über die Nitrozellulosemembran filtriert. An das Protein bindende RNA-Moleküle wurden auf der Membran zurück gehalten. Nicht-bindende RNA- Moleküle wurden durch viermaliges Waschen mit lx Selektionspuffer B entfernt. Die
Nitrozellulosemembran wurde getrocknet und die auf der Membran verbliebenen Mengen an radioaktiv markierten Substanzen mit Hilfe eines Phosphorimagers (BioRad) quantifiziert. Die Auswertung der erhaltenen Daten erfolgte unter Verwendung der Software Quantity One® (BioRad). Zur graphischen Darstellung von Bindungskurven wurde das Programm GraphPad Prism® (GraphPad Software, Inc., USA) genutzt. Die Bestimmung der Dissoziationskonstanten (Kd) erfolgte nach einem "One-Site-Binding"-Modell auf Grundlage der folgenden Gleichung:
B.max * Q Protein
RNA,gebunden
^d + cProtein wobei Bmax den maximal möglichen Anteil gebundener RNA darstellt. Für die vier Aptamere 16-1, 16-2, 16-3 und 16-8 (SEQ DD NO: 15-18) wurde die Bindung an den sIL-6R analysiert. Für das Aptamer 16-3 (SEQ ID NO: 17) ist exemplarisch das Ergebnis der Studie in Fig. 1 dargestellt. Die nach Durchführung der Bindungsstudie auf der
Nitrozellulosemembran verbleibende Menge an radioaktiv markierten Nukleinsäuren wurde wie oben beschrieben quantifiziert und zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten herangezogen.
Anhand der Filterbindungsstudien konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten RNA- Aptamere ihr Zielmolekül in Lösung binden konnten und ähnliche Bindungseigenschaften aufwiesen. Die ermittelten zugehörigen Dissoziationskonstanten lagen in etwa im Bereich einer Größenordnung (s. Tabelle 1).
Tabelle 1: Charakteristika der Aptamere 16-1, 16-2, 16-3 und 16-8. Wiedergegeben sind die Dissoziationskonstanten (Kd) und der Anteil an maximal gebundener RNA, ermittelt in jeweils zwei (16-1, 16-2, 16-8) bzw. zehn (16-3) unabhängigen Filterbindungsstudien.
Aptamer SEQ DD NO: Anteil maximaler Bindung [%] Kd [nM] Anzahl Studien 16-1 15 61,4 125 ± 32 2
16-2 16 74,5 420 ± 290 2
16-3 17 47,9 ± 2,8 % 19,8 ± 4,2 10
16-8 18 68,2 106 ± 47 2
Das Aptamer 16-3 wies mit einer im Vergleich deutlich niedrigeren Dissoziationskonstante (Kd) eine sehr affine Bindung an den sIL-6R auf. Der maximal an den sIL-6R bindende Anteil an RNA ist für jedes Aptamer in Tabelle 1 angegeben. Da zur Untersuchung der Interaktion zwischen RNA und Protein die RNA in deutlichem Unterschuss vorlag, wird angenommen, dass maximal ein RNA-Molekül pro sIL-6R band.
2.2 Analyse von Aptamer-Protein-Interaktionen mittels Gel-Shift
Zur weiteren Analyse der spezifischen Aptamer-sIL-6R-Interaktion wurden Gel-Shift- Experimente exemplarisch mit dem Aptamer 16-3 (SEQ ID NO: 17) durchgeführt. Dazu wurde das radioaktiv markierte Aptamer 16-3 mit steigenden Mengen an rekombinantem sD_--6R (0 nM - 300 nM) in lx Selektionspuffer B (lx PBS (0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl, 6,5 mM
Na2HP04, 15 mM KH2P04); 3 mM MgCl2; pH 7,4) inkubiert. Die Trennung der Aptamer- Protein-Gemische erfolgte über ein 5%iges natives Polyacrylamid(PAA)-Gel mittels
Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE). Unter nativen Bedingungen gebildete Aptamer- Protein-Komplexe weisen aufgrund ihrer Größe ein verzögertes Migrationsverhalten im Gel auf. Die Komplexe wandern daher langsamer als die entsprechenden freien RNA-Moleküle und werden dadurch als so genannter„Shift" im Gel detektierbar.
Gleiche Mengen (~1 nM) a-[32P] -radiomarkierter RNA wurden mit steigenden Proteinmengen (1 nM - 300 nM) in lx Selektionspuffer B (s.o.) für 30 min bei RT inkubiert. Die Proben wurden mit 6x DNA-Probenpuffer (50% (w/v) Saccharose; 1% (w/v) SDS; 0,1% (w/v) Orange
G) versetzt und mittels nativer PAGE unter Verwendung eines 5%igen PAA-Gels (lx TBE (89 mM Tris-HCl, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA); AcrylamidrBisacrylamid 37,5:1 5% (w/v);
TEMED (Ν,Ν,Ν^Ν'-Tetramemyl-emylendiamin) 0,1% (v/v); APS (Ammoniumpersulfat) 0,1% (w/v)) analysiert. Die elektrophoretische Trennung erfolgte bei 80 V und 4 °C in lx TBE. Nach beendeter Elektrophorese wurde das Gel unter Anlegen von Vakuum getrocknet. Die radioaktiven Banden wurden mittels Autoradiographie detektiert.
Die spezifische Bindung der RNA an das Targetmolekül verlangsamte das Laufverhalten im Vergleich zum Aptamer allein durch Formation der Aptamer-Protein-Komplexe. Diese
Komplexe wurden im Gel als so genannter„Shift" deutlich. Mittels Autoradiographie konnten die resultierenden Banden visualisiert werden (s. Fig. 2).
Das Aptamer 16-3 zeigte deutlich eine Interaktion mit dem sIL-6R, da im Gel ein durch die Komplexbildung hervorgerufener "Shift" zu erkennen war (s. Fig. 2). Die Intensität dieser verlangsamten Bande wurde mit zunehmender sIL-6R-Konzentration stärker (Fig. 2, von links nach rechts). Im Bereich der Geltaschen ist ebenfalls eine konzentrationsabhängige
Signalzunahme erkennbar. Vermutlich handelte es sich dabei um das Aptamer 16-3, welches mit präzipitiertem sIL-6R komplexiert vorlag.
Um zu zeigen, dass die Wechselwirkung der selektierten RNA-Aptamere spezifisch für das Zielmolekül sIL-6R war, wurde ein Gel-Smft-Experiment unter nativen Bedingungen mit zwei rekombinant-produzierten Kontrollproteinen durchgeführt. Bei diesen Proteinen handelte es sich zum einen um CEACAM1, ein Zelladhäsionsmolekül, welches analog zum sIL-6R einen C-terminalen His-Tag trug. Das andere Protein war Lysozym, ein Enzym, das Polysaccharide prokaryotischer Zellwände spalten kann. Beide Proteine sollten keine Interaktion mit den sIL- 6R-spezifischen Ribonukleinsäuren eingehen.
Zur Analyse der Spezifität wurden steigende Mengen (10 nM - 300 nM) an CEACAM1 (Fig. 3 5.21, Spuren 2-5) bzw. Lysozym (Fig. 3, Spuren 7-10) mit dem radioaktiv markierten Aptamer 16-3 (<1 nM) in lx Selektionspuffer B (s.o) inkubiert und über ein 5%iges, natives PAA-Gel getrennt. Als Positivkontrolle diente ein Ansatz mit 75 nM sEL 6R (Fig. 3, Spur 6). Keines der untersuchten Kontrollproteine wies eine Interaktion mit dem RNA- Aptamer 16-3 auf. Im Gegensatz dazu erfolgte eine Komplexbildung zwischen sIL-6R und dem Aptamer, was durch den Shift zu erkennen war (Fig. 3, Spur 6). Der Nachweis, dass die in ihrem LaufVerhalten verzögerte RNA-Bande wirklich auf einer spezifischen Interaktion zwischen Aptamer und sIL-6R zurückzuführen war, erfolgte durch zwei weitere Gel-Shift-Experimente (s. Fig. 4). Neben dem radioaktiv markierten Aptamer 16-3 (Fig. 4, Spur 1 und Spur 5) im Komplex mit sIL-6R (Spur 2, Spur 6) wurde ein >1.000fach molarer Überschuss an nicht markiertem Aptamer zugesetzt (Spur 3, Spur 7). Die markierten und unmarkierten RNA-Moleküle konkurrierten dabei um die Bindung an den löslichen IL-6R, wodurch es zur Abschwächung der retardierten Bande kam (Kompetition). Zur Kontrolle wurde eine Kompetition zwischen Aptamer 16-3 und unmarkierter, unspezifischer RNA R24
(GGGAGGACGAUGCGGGAUUGUUGAGUGGUGCGAAACGCUUUUGCCCCACUUCG CGUCGGGCGAGUCGUCUG-3', SEQ ID NO: 12; >1.000fach molarer Überschuss) untersucht (Spur 8). Diese RNA konnte keine Abschwächung der Aptamer-sIL-6R-Interaktion hervorrufen.
Zur Identifizierung des vom Aptamer gebundenen Proteins wurden des Weiteren Versuche mit einem spezifischen Anti-His- Antikörper durchgeführt. Da das Targetprotein sIL-6R einen His- Tag trug, konnte der Antikörper das Protein am His-Tag binden. Die Aptamer-Protein-
Antikörper-Komplexe wurden im Gel durch einen Supershift deutlich, d.h. eine noch stärker verzögerte Bande im Vergleich zum Aptamer-Protein-Komplex (Spur 4). Der Anti His- Antikörper zeigte keine Interaktion mit dem Aptamer 16-3 allein (Fig. 4, Spur 9).
2.3 Kompetitionsstudien
In In-vitro-Kompetitionsstudien wurde die Wechselwirkung zwischen den selektierten RNA- Aptameren und dem sIL-6R in Anwesenheit seiner natürhchen Liganden IL-6 und gpl30 sowie von Hyper-IL-6 untersucht. 2.3.1 Kompetitionsanalyse zwischen Aptamer 16-3 und Interleukin-6 (IL-6)
Die Fähigkeit des Aptamers 16-3 (SEQ ID NO: 17), mit dem natürlichen Liganden des sIL-6R, dem Interleukin 6, um eine Bindungsstelle kompetieren zu können, wurde in
Filterbindungsstudien, die wie oben beschrieben durchgeführt wurden, analysiert (Fig. 5).
In den Filterbindungsstudien wurde die Wechselwirkung des sIL-6R mit dem Aptamer 16-3 in An- bzw. Abwesenheit des Liganden IL-6 untersucht. Zur Bestimmung der prozentualen RNA- Bindung wurde eine definierte Menge an Aptamer 16-3 (125 %) auf die Nitrozellulosemembran aufgetragen (Fig. 5 A). Die Auswertung dieses Experiments zeigte, dass IL-6 auf die
Interaktion zwischen dem Aptamer 16-3 und sIL-6R keinen nennenswerten Einfluss hatte. Die Ermittlung der jeweiligen Dissoziationskonstanten führte zu vergleichbaren Werten.
Der Befund, dass zwischen dem Aptamer 16-3 und IL-6 keine Kompetition stattfand, wurde mit Gel-Shift-Assays überprüft. Dazu wurde das Aptamer (<1 nM) mit dem sIL-6R (75 nM) inkubiert. Den Bindungsansätzen wurden steigende Mengen des Liganden IL-6 (0-150 nM) als Kompetitor zugesetzt. Die Trennung der Aptamer-Protein-Komplexe erfolgte im nativen PAA- Gel (s.o.). Fig. 6 zeigt deutlich, dass trotz steigender IL-6-Konzentrationen die deutliche Interaktion zwischen Aptamer und sIL-6R erhalten blieb, d.h. die in ihrem Laufverhalten verlangsamten Aptamer-sIL-6R-Komplexe wurden nicht gestört. Das Aptamer 16-3 und IL-6 wiesen somit nicht die gleiche Bindungsstelle am Rezeptor auf. In einem zweiten Gel-Shift-Experiment wurde die Konzentration an IL-6 auf 1,5 μΜ erhöht. Auch diese hohe Liganden-Konzentration hatte keinen Einfluss auf die Aptamerbindung.
2.3.2 Interaktion des Aptamers 16-3 mit Hyper-IL-6 (H-IL-6) und sgpl30Fc
Eine mögliche Kompetition zwischen IL-6 und Aptamer wurde darüber hinaus anhand der Analyse der Interaktion zwischen Aptamer 16-3 (SEQ ID NO: 17) und Hyper-IL-6 (s. Fig. 7) untersucht. Hyper-IL-6 ist ein bioaktives Fusionsprotein aus IL-6 und sIL-6R, wobei beide Interaktionspartner über einen flexiblen Polypeptidlinker miteinander verbunden sind. Dieser Linker setzt sich aus den 16 N-terminalen nicht-helikalen Aminosäuren des IL-6 und dreizehn weiteren Aminosäuren, vorwiegend Glycin und Serin, zusammen. Um die Größe dieses Fusionsproteins so gering wie möglich zu halten, wurde auf die N-terminale Immunglobulin- ähnliche Domäne Dl und den C-Terminus des sIL-6R verzichtet, da beide nicht für die
Bioaktivität des IL 6/sIL-6R-Komplexes benötigt werden (Fischer, M., et al., I. A bioactive designer cytokine for human hematopoietic progenitor cell expansion. Nat Biotechnol, 1997. 15(2): p. 142-5), so dass nur die Aminosäuren 113-323 des sIL-6 in dem Fusionsprotein verwendet wurden. Es resultiert ein 408 Aminosäuren großes Fusionsprotein mit einem
Molekulargewicht von etwa 57 kDa (s. Fig. 7). Des Weiteren wurde der Einfluss der Aptamerbindung auf die Interaktion zwischen Hyper-IL 6 und sgpl30Fc untersucht. Hyper-IL-6 als aktive Form des IL-6/sIL-6R-Komplexes bindet neben gpl30 auch dessen alternativ gespleißte, lösliche Form sgpl30. Durch genetische Fusion dieses Proteins mit dem konstanten Teil eines IgGl -Antikörpers wurde eine stark aktive Form dieser Rezeptoruntereinheit geschaffen: sgpl30Fc (Scheller, J., Grötzinger, J., and Rose- John, Stefan, Zytokinsignale über lösliche und membranständige Rezeptoren. Biospektrum, 2007, 13. Jahrgang: S. 250-253; Jostock, T., et al., Soluble gpl30 is the natural inhibitor of soluble interleukin-6 receptor transsignaling responses. Eur J Biochem, 2001. 268(1): S. 160-7). Diese monomere Form dimerisiert aufgrund des jeweiligen Fc-Teils (-189 kDa). Ein Gel-Shift-Experiment wurde zur Untersuchung der Interaktion zwischen Hyper IL 6 und dem Aptamer 16-3 eingesetzt. Nach Inkubation von Hyper-IL-6 mit radioaktiv markiertem Aptamer und elektrophoretischer Trennung mittels nativer PAGE konnten die Banden mittels Autoradiographie detektiert werden (Fig. 8). Ein deutlich zu erkennender Shift ließ auf eine Interaktion schließen (Fig. 8; Spur 2). Damit wurde erneut bestätigt, dass das Aptamer 16-3 mit dem Rezeptor an einer von der IL-6-Bindestelle anderen Region interagiert. In einem weiteren Reaktionsansatz wurde die Bindung des Aptamers an einen Komplex aus Hyper-IL-6 und sgpl30Fc nachgewiesen (Fig. 8; Spur 4). Eine noch stärker in ihrem
Laufverhalten verlangsamte Bande deutete auf eine Komplexbildung aller drei
Interaktionspartner hin. Das Aptamer interagierte demnach mit Hyper-IL-6 an einer von der sgpl30Fc-Bindestelle ungleichen Region. Das Aptamer interagierte nicht mit sgpl30Fc allein (Fig. 8; Spur 3).
In Filterbindungsstudien konnte eine zum sIL-6R vergleichbar affine Interaktion zwischen dem Aptamer 16-3 und Hyper-IL-6 bestätigt werden. 3. Untersuchung der Bindungsaktivität von RNA-Aptamer-Fragmenten
Basierend auf Sekundärstxukturvorhersagen unter Anwendung des Programms mfold web Server (Version 3.2, Zuker, M., Mfold web Server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research, 2003. 31(13): p. 3406-3415) wurde die Sequenz des Aptamers 16-3 (SEQ ID NO: 17) verkürzt (s. Fig. 9). Zunächst wurden die Primerbereiche entfernt. Das Aptamer wurde weiter verkürzt, wobei eine G-reiche Konsensussequenz (SEQ ID NO: 4) stets erhalten blieb.
Zunächst wurde das Aptamer 16-3 zu einem 19mer (16-3 A; SEQ ID NO: 19) verkürzt, welches nur die konservierte, G-reiche Region des Aptamers behielt. Die verkürzte RNA 16- 3_B (47 nt; SEQ ID NO: 20) beinhaltete zusätzlich zur G-reichen Region den stabilisierenden, doppelsträngigen Bereich bestehend aus neun Basenpaaren. Die dritte verkürzte RNA, das 63mer 16-3 C (SEQ ED NO: 20) war durch das Fehlen der konstanten Primerbereiche der ursprünglichen Sequenz charakterisiert (die Sequenz enthielt am 5'-Ende des randomisierten Bereiches von 60 Nukleotiden Länge drei zusätzliche G-Nukleotide). 16-3_A (19 Nukleotide, s. SEQ ID NO: 19):
S'-GGGGAGGCUGUGGUGAGGG-S'
16-3_B (47 Nukleotide, s. SEQ TD NO: 20)
5'-GGGAUUCUCUUAUAGGGGAGGCUGUGGUGAGGGAAUAUUAAGAGAAU-3'
16-3_C (63 Nukleotide, s. SEQ ID NO: 21)
5'-GGGCUUAUAGGGGAGGCUGUGGUGAGGGAAUAUUAAGAGAAUUAACGGUCUA GUUCACCUCGA-3'
Zur Analyse der Bindungseigenschaften dieser verkürzten RNA-Moleküle wurden
Filterbindungsstudien, wie oben beschrieben, durchgeführt (s. Fig. Fig. 10). Wie anhand der Figur 10 ersichtlich ist, zeigten alle verkürzten RNAs eine Bindung an das Zielmolekül sIL-6R. Darauf basierend wurde diese Variante für weitere Experimente zur Charakterisierung der Aptamer-sIL-6R- Wechselwirkung gewählt.
Für die Variante 16-3 B konnte ein Ka Wert von etwa 26,4 nM (Tabelle 2) ermittelt werden. Trotz einer Verkürzung um 59 Nukleotide lag die Affinität des 47mers 16-3 B im Bereich des "Wildtyp"-Aptamers. Dies deutliche Verkürzung hatte somit keinen Einfluss auf die Affinität zum Rezeptor. Sogar die auf die G-reiche Region reduzierte Variante 16-3 A, welche lediglich aus 19 Nukleotiden bestand, konnte das Protein binden, jedoch mit reduzierter Bindungsaffinität (Kd ~ 446 nM) im Vergleich zu 16-3. Auch das Fehlen der Primerregionen in 16 3_C schwächte die Affinität zum Zielprotein (Kd - 117 nM) ab. Die angegebenen Werte für die Aptamervarianten 16 3_A und 16-3 C sind hier jedoch lediglich als Richtwerte zu sehen, da der zur genauen K^-Bestimmung notwendige Sättigungsbereich der RNA-Protein-Interaktion bei einer maximalen sIL-6R-Konzentration von 300 nM nicht vollständig erreicht werden konnte.
Tabelle 2 Ka- Werte und Anteile maximaler Bindung (Bmax) des Aptamers 16-3 und verkürzter Varianten an sIL-6R ermittelt in Filterbindungsstudien. Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus mindestens drei voneinander unabhängigen Messungen berechnet. Aptamer SEQ ID NO: Kd [nM] Anteil maximaler Bindung [%]
16-3 17 19,7 ± 4,2 47,9 ±2,8
16-3 A 19 446 ± 200 54,4 ± 16,4
16-3 B 20 26,4 ± 7,1 43,1 ± 3,4
16-3 C 21 117 ± 30 34,7 ± 4,0
Mit dem Aptamers 16-3 B wurden in weiteren Versuchen Mutationsanalysen durchgeführt, um festzustellen, ob die im Konsensusmotiv der Aptamere auffällig häufigen Guaninbasen möglicherweise die RNA-Moleküle stabilisierende G-Quadruplex-Strukturen ausbilden konnten. Bei den Studien wurden wichtige, eventuell am G-Quartett beteiligte Guaninbasen durch Uracil ersetzt. Innerhalb des Konsensusmotivs der selektierten RNA- Aptamere existierten fünf potentielle GG-Paare. Sofern die G-reiche Region tatsächlich zur Ausbildung von G-Quartetten befähigt wäre, dürften vier der fünf G-Dupletten für die Bindung unentbehrlich sein.
Ausgehend vom 47mer 16-3 B (SEQ ID NO: 20), das neben der konservierten G-reichen Region durch einen möglicherweise stabilisierenden, doppelsträngigen Stamm charakterisiert war (s. Fig. 10), wurden im Bereich der konservierten Region Mutationen eingefügt. Die Guaninreste an den Positionen 15, 17, 21, 27 und 32. wurden jeweils durch Uracilreste ersetzt und somit fünf verschiedene Mutanten erzeugt, 16 3 B M1 bis 16 3 B M5 (s Fig. 10).
Eine Mutation innerhalb der an der Quadruplex-Formation beteiligten GG-Paare sollte zum Verlust der Bindung an das Protein Hyper-IL-6 führen. Die Mutationsanalysen erfolgten in Form von Filterbindungsstudien, wie oben beschrieben. Die Bindung der verkürzten Varianten wurde jeweils mit dem bindenden Anteil des Aptamers 16-3 verglichen. Das Ergebnis der Analyse ist Fig. 12 zu entnehmen.
Die Aptamere 16-3 und 16-3 B ähnelten einander in ihrem starken Bindungsverhalten gegenüber Hyper-IL-6. Im Verglich dazu führte der Austausch definierter Guaninreste innerhalb der drei Mutanten 16-3_B_ M3, 16-3_B_M4 und 16-3 B M5 zu einem
Funktionsverlust. Die Fähigkeit, mit Hyper-IL-6 zu interagieren, war deutlich reduziert. Die Mutante 16-3 B Ml war durch eine stark verringerte Bindung charakterisiert. 16-3 B M2 dagegen schien unbeeinflusst von dem Basenaustausch zu sein und zeigte eine vergleichbare bzw. sogar bessere Bindung an Hyper-IL-6.
Die Ergebnisse der Mutationsanalysen stehen im Einklang mit der Annahme einer möglichen Ausbildung einer G-Quaclmplex-Srruktur. Der Funktionsverlust der vier Mutanten 16-3 B M1 , 16-3_B_M3, 16-3_B_M4 und 16-3JB M5 weist daraufhin, dass die Guaninreste 15, 21, 27 und 32 des Aptamers 16-3 B für die Aptamerbindung essentiell und vielleicht in die
Ausbildung von G-Quartetten involviert sind. Zur Überprüfung dieses Ergebnisses erfolgte die Analyse der Interaktionen zwischen Hyper-IL- 6 und den Aptamer- Varianten in einem Gel-Shift-Assay (Fig. 13). Auch dieses Experiment zeigte, dass das Aptamer 16-3 B und die Mutante 16-3 B M2 deutlich mit Hyper-IL-6 interagieren konnten. So führte eine Mutation des Guanins an Position 17 nicht zu einem Funktionsverlust des Aptamers. Die anderen vier Mutanten zeigten im Vergleich dazu eine deutlich reduzierte mteraktionsfähigkeit.
4. Bindung fluoreszenzmarkierter Aptamere an IL-6R-tragende Zellen
Mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurde die Bindung der sIL-6R-spezifischen Aptamere 16-3 und 16-3 B an den nativen IL-6R untersucht. Als Kontrolle dienten der unselektierte RNA-
Pool Rl und die nicht-bindende Variante 16-3 B M5 (s.o.). Hierzu wurde die Wechselwirkung der fluoreszenzmarkierten RNAs mit den beiden Zelllinien BAF/gpl30 und
BAF/gpl30/IL6R/TNF untersucht. Die Zelllinien BAF/gpl30 und BAF/gp 130/IL6R/TNF waren abgeleitet von der murinen Prä-B-Zelllinie BAF/3, einer immortalisierten, dem
Knochenmark entstammenden Pro-B-Zelllinie, deren Wachstum und Proliferation von der Anwesenheit des Zytokins IL-3 abhängig ist. Das Wachstum der hier verwendeten BAF/3 - Zellen war von IL-6 abhängig. Zellen dieser Zelllinie wurden mit cDNA für gp 130
(BAF/gpl30) bzw. den cDNAs für gpl30, TNF und IL-6R (BAF/gp 130/IL6R/TNF) stabil transfiziert. Die BAF/gp 130/IL-6R TNF-Zellen waren neben der Produktion von gpl30 und dem IL-6R auch zur Produktion des TNF befähigt, was in Zusammenhang mit den folgenden Aptameruntersuchungen jedoch nicht essentiell war. Die BAF/gpl30- und BAF/gpl30/IL-6R/TNF-Zelllinien wurden in 25 cm2-Flaschen kultiviert und im Brutschrank bei 37 °C gehalten. Als Kulturmedium diente DMEM (Dulbecco's
Modified Eagle Medium l , Invitrogen), versetzt mit fetalem Kälberserum FKS (10 %) und lx Pen/Strep (62,5 μg Penicillin G Natriumsalz ml; 100 μg Streptomycin/ml; 90 μg NaCl/ml in aqua des ). Den BAF/gpl30-Zellen wurde zusätzlich Hyper IL 6 (10 ng/ml) zugesetzt, den BAF/gpl30/IL-6R/TNF-Zellen zusätzlich das Zytokin IL 6 (10 ng/ml) und das Antibiotikum Puromycin (12 μg/ml). Als Kontrolle wurde das Wachstum der Zellen auch in Abwesenheit der Zytokine beobachtet, da ohne diese Stimuli ein Zellwachstum nicht möglich war. Das Vorhandensein des Interleukin 6-Rezeptors auf der Oberfläche der BAF/gp 130/IL6R/TNF- Zellen wurde unter Einsatz eines murinen monoklonalen IL-6R-spezifischen IgGl -Antikörpers kontrolliert (nicht dargestellt).
500.000 BAF/gpl30-Zellen bzw. IL-6R-tragende BAF/gp 130/IL6R/TNF-Zellen wurden zweimal mit 500 μΐ lx Selektionspuffer B (s.o.) gewaschen, in 350 μΐ des gleichen Puffers resuspendiert und mit 8-10 pmol der zu untersuchenden, fluoreszenzmarkierten RNA
(Fluorophor: Alexa Fluor® 488 C5-Maleimid, Invitrogen) für 5 min bei RT inkubiert. Zur Abtrennung ungebundener RNA-Moleküle folgte eine Zentrifugation der Zellen bei 500 g für 5 min. Das Pellet wurde zweimal mit 500 μΐ lx Selektionspuffer B gewaschen. Nach
Resuspension in 350 μΐ lx Selektionspuffer B wurde die Aptamerbindung am
Durchflusszytometer durch Messung von jeweils 10.000 Zellen analysiert.
Für die AlexaFluor® 488-markierten Aptamere 16-3 und 16-3 B konnte eine Wechselwirkung mit den IL-6R-tragenden BAF/gp 130/IL6R/TNF-Zellen nachgewiesen werden, da es zu einer Verschiebung der Fluoreszenzintensität kam. Die Kontroll-RNAs Pool Rl und 16 3 B M5 zeigten keine Bindung an die BAF/gpl30/IL6R/TNF-Zellen. Die Tatsache, dass keine der markierten Nukleinsäuren eine unspezifische Bindung an die IL-6R-defizienten BAF/gpl30 Zellen zeigte, bestätigte, dass die Aptamere ausschließlich an die Oberfläche der
BAF/gpl30/IL6R TNF-Zellen banden.
5. Kompetition zwischen Aptamer 16-3 und einem Anti-hIL-6R- Antikörper Zur Spezifität der erfindungsgemäßen Aptamere wurden Kompetitionsversuche durchgeführt, wobei eine mögliche Kompetition zwischen den erfindungsgemäßen Aptameren und einem Anti-hIL-6R- Antikörper um die Bindung an den IL-6R mittels Durchflusszytometrie untersucht wurde. Hierzu wurde die Bindung an BAF/gpl30/IL6R TNF-Zellen, die zuvor mit einem spezifischen murinen Anti-hIL-6R- Antikörper und einem sekundären FITC-konjugierten Ziege- anti-Maus- AK inkubiert worden waren, analysiert.
BAF/gpl30/IL6R/TNF-Zellen wurden in 25 cm2-Kulrurflaschen kultiviert (s.o). Zur Ernte wurden die Zellen für 5 min bei 500 g und RT zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet in 5 ml DMEM (ohne FKS) aufgenommen und die Zellzahl mit Hilfe einer Neubauer Zählkammer bestimmt. Anschließend wurden je 500.000 BAF/gpl30/IL6R/TNF-Zellen einmal mit 500 μΐ lx Selektionspuffer B (s.o) gewaschen, in 250 μΐ des gleichen Puffers resuspendiert und mit einem hIL-6R-spezifischen murinen Antikörper (2 μg ml) für 30 min bei 4 °C inkubiert. Überschüssiger Antikörper wurde durch Zentrifugation bei 500 g für 5 min abgetrennt. Das Pellet wurde einmal mit 500 μΐ lx Selektionspuffer B gewaschen. Nach
Resuspension in 250 μΐ Puffer folgte die Zugabe eines sekundären FITC-konjugierten Ziege- anti-Maus-Antikörpers (Sigma) und eine Inkubation für 30 min bei 4 °C. Nach Entfernen des überschüssigen Antikörpers (AK) wurden die Zellen in geeignete Messröhrchen pipettiert. Die Analyse der Aptamer-Bindung an die BAF/gpl30/IL6R/TNF-Zellen erfolgte wie oben beschrieben, wobei das fluoreszenzmarkierte Aptamer 16-3 eingesetzt wurde. Die
Fluoreszenzmarkierung der RNA erfolgte hier mit AlexaFluor® 647 (Invitrogen).
Der Anti-hIL-6R- Antikörper in Kombination mit dem sekundären Ziege-anti-Maus- AK blockierte die spezifische Wechselwirkung des Aptamers mit den BAF/gpl30/IL6R/TNF- Zellen. Dieses Ergebnis belegt gleichzeitig die spezifische Bindung des Aptamers an den nativen IL-6R auf der Oberfläche von BAF/gpl30/IL6R TNF-Zellen, da der Anti-hIL-6R- Antikörper gegen den IL-6R gerichtet war. Eine unspezifische Bindung an IL-6R-defiziente BAF/gpl30-Kontrollzellen wurde nicht beobachtet. Sequenzprotokoll - freier Text und Übersetzung englischer Ausdrücke
Artificial Sequence = Künstliche Sequenz
consensus sequence = Konsensussequenz
miscjfeature - sonstiges Merkmal
k is g or u = k ist g oder u
n is any nucleotide, preferably a, c, g or u = n ist ein beliebiges Nukleotid, vorzugsweise a, c, g, oder u
h is a, c or u = h ist a, c oder u
w is a or u = w ist a oder u
RNA aptamer = RNA-Aptamer
randomised region = randomisierter Bereich
3* primer region = 3'-Primer-Bereich
5' primer region = 5'-Primer-Bereich
randomised region plus 5' and 3' primer regions = randomisierter Bereich plus 5'- und 3'-
Primerbereiche

Claims

RNA-Aptamer, das den menschlichen löslichen Interleukin-6-Rezeptor spezifisch bindet.
RNA-Aptamer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das RNA-Aptamer die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 umfasst.
RNA-Aptamer nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das RNA-Aptamer eine der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 2-4 umfasst.
RNA-Aptamer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das RNA-Aptamer eine der in den SEQ ID NO: 5-10 oder der in den SEQ ID NO: 13-18 angegebenen Sequenzen oder ein Fragment davon, das den menschlichen löslichen Interleukin-6-Rezeptor spezifisch bindet, umfasst.
RNA-Aptamer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die 2'-OH-Gruppe von mindestens einer der Nukleotid-Basen des RNA-Aptamers oder des RNA-Aptamer-Fragments durch eine Fluoro-, Amino- oder Methoxygruppe ersetzt ist.
RNA-Aptamer nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment mindestens 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder mindestens 20, weiter bevorzugt mindestens 25, mindestens 30, mindestens 35, mindestens 40, mindestens 45, mindestens 50 oder mindestens 55 und besonders bevorzugt mindestens 60 aufeinander folgende Nukleotide der in den SEQ ID NO: 5-10 oder der in den SEQ ID NO: 13-18 angegebenen Sequenzen umfasst.
RNA-Aptamer nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment mindestens eine der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1-4 umfasst.
8. RNA-Aptamer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das RNA-Aptamer nicht-kompetitiv an den menschlichen löslichen Interleukin-6- Rezeptor bindet.
9. Arzneimittel, umfassend ein RNA-Aptamer nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
10. Verwendung eines Aptamers nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Arzneimittels oder eines Diagnosemittels.
11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel zur
Behandlung von Entzündungszuständen, Krebs oder Infektionen vorgesehen ist.
12. Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel zur Behandlung von Rheumatoider Arthritis, Sepsis, Asthma, Morbus Crohn, Multipler Sklerose, Depression, Brustkrebs, Multiplem Myelom oder einer HIV-Infektion vorgesehen ist.
PCT/DE2010/001412 2009-12-07 2010-12-06 Rna-aptamere, die den löslichen interleukin-6-rezeptor spezifisch binden WO2011069486A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE200910056944 DE102009056944A1 (de) 2009-12-07 2009-12-07 RNA-Aptamere, die den löslichen Interleukin-6-Rezeptor spezifisch binden
DE102009056944.8 2009-12-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011069486A1 true WO2011069486A1 (de) 2011-06-16

Family

ID=43708793

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE2010/001412 WO2011069486A1 (de) 2009-12-07 2010-12-06 Rna-aptamere, die den löslichen interleukin-6-rezeptor spezifisch binden

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102009056944A1 (de)
WO (1) WO2011069486A1 (de)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991019813A1 (en) 1990-06-11 1991-12-26 The University Of Colorado Foundation, Inc. Nucleic acid ligands

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991019813A1 (en) 1990-06-11 1991-12-26 The University Of Colorado Foundation, Inc. Nucleic acid ligands

Non-Patent Citations (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B. OSBORNE ET AL., CURR. OPIN. CHEM. BIOL., vol. 1, 1997, pages 5 - 9
CINDY MEYER: "Interleukin-6-Rezeptor-spezifische RNA-Aptamere", 28 January 2010 (2010-01-28), XP002631143, Retrieved from the Internet <URL:http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2010/4459/pdf/Dissertation_Cindy_Meyer.pdf> [retrieved on 20110317] *
DAUSSE E ET AL: "Aptamers: a new class of oligonucleotides in the drug discovery pipeline?", CURRENT OPINION IN PHARMACOLOGY, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, NL, vol. 9, no. 5, 1 October 2009 (2009-10-01), pages 602 - 607, XP026665554, ISSN: 1471-4892, [retrieved on 20090828], DOI: DOI:10.1016/J.COPH.2009.07.006 *
ELLINGTON, SZOSTAK, NATURE, vol. 346, 1990, pages 818 - 822
FISCHER, M. ET AL.: "I. A bioactive designer cytokine for human hematopoietic progenitor cell expansion", NAT BIOTECHNOL, vol. 15, no. 2, 1997, pages 142 - 5
GOPINATH, ANAL. BIOANAL. CHEM., vol. 387, 2007, pages 171 - 182
HIROTA, H. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A, vol. 92, 1995, pages 4862 - 4866
JONES ET AL., THE FASEB JOURNAL, vol. 15, 2001, pages 43 - 57
JOSTOCK, T. ET AL.: "Soluble gp130 is the natural inhibitor of soluble interleukin-6 receptor transsignaling responses", EUR J BIOCHEM, vol. 268, no. 1, 2001, pages 160 - 7
MACKIEWICZ, A. ET AL., J. IMMUNOL., vol. 149, 1992, pages 2021 - 2027
MAJUMDER PAROMITA ET AL: "Aptamers: from bench side research towards patented molecules with therapeutic applications.", EXPERT OPINION ON THERAPEUTIC PATENTS NOV 2009 LNKD- PUBMED:19852719, vol. 19, no. 11, November 2009 (2009-11-01), pages 1603 - 1613, XP002628467, ISSN: 1744-7674 *
ROSE-JOHN ET AL., J. J. LEUKOCYTE BIOL., vol. 80, 2006, pages 227 - 235
SAITO, M. ET AL., J. IMMUNOL., vol. 148, 1992, pages 4066 - 4071
SCHELLER, J., GRÖTZINGER, J., ROSE-JOHN, STEFAN: "Zytokinsignale über lösliche und membranständige Rezeptoren", BIOSPEKTRUM, vol. 13, 2007, pages 250 - 253
SCHELLER, ROSE-JOHN, MED. MICROBIOL. IMMUNOL., vol. 195, 2006, pages 173 - 183
SHINRIKI SATORU ET AL: "Humanized Anti-Interleukin-6 Receptor Antibody Suppresses Tumor Angiogenesis and In vivo Growth of Human Oral Squamous Cell Carcinoma", CLINICAL CANCER RESEARCH, vol. 15, no. 17, September 2009 (2009-09-01), pages 5426 - 5434, XP002628465, ISSN: 1078-0432 *
TAGA, T. ET AL., CELL, vol. 58, 1989, pages 573 - 581
TUERK, C., L. GOLD: "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase", SCIENCE, vol. 249, no. 4968, 1990, pages 505 - 10
YAMAGUCHI JUNICHI ET AL: "cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 37, no. 16, September 2009 (2009-09-01), XP002631169, ISSN: 0305-1048 *
YOKOTA SHUMPEI ET AL: "Clinical study of tocilizumab in children with systemic-onset juvenile idiopathic arthritis.", CLINICAL REVIEWS IN ALLERGY & IMMUNOLOGY JUN 2005 LNKD- PUBMED:16129907, vol. 28, no. 3, June 2005 (2005-06-01), pages 231 - 237, XP002628466, ISSN: 1080-0549 *
ZUKER, M.: "Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 31, no. 13, 2003, pages 3406 - 3415

Also Published As

Publication number Publication date
DE102009056944A1 (de) 2011-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0934331B1 (de) Spiegelselektion und spiegelevolution von nucleinsäuren
EP4008784A1 (de) Giude-rna für target-editierung mit hinzugefügter funktioneller basensequenz
WO2021060527A1 (ja) オリゴヌクレオチド及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法
US9044495B2 (en) Nucleic acid ligands to LL37
WO2003093504A1 (de) Verfahren zur amplifikation von nukleinsäuren
WO1999027133A1 (en) Improved selex procedure and an anti-cd4 aptamer
CN108368509A (zh) 改善了血中滞留性的抗il－17适体
US20220251562A1 (en) Anti-CD3 Aptamers for Use in Cell Targeting and Labeling
JP7333508B2 (ja) オリゴヌクレオチド、その製造方法及び標的ｒｎａの部位特異的編集方法
EP1306382A1 (de) Modifizierte L-Nukleinsäure
DE102007041476A1 (de) Aptamere, die an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül binden
WO2011069486A1 (de) Rna-aptamere, die den löslichen interleukin-6-rezeptor spezifisch binden
DE69929699T2 (de) Nukleinsäure, die spezifisch an ein ras zielprotein binden kann
CN116981773A (zh) 用于编辑靶标rna的多聚腺苷酸化信号序列的指导rna
WO2011069487A2 (de) Dna-aptamere, die den löslichen interleukin-6-rezeptor spezifisch binden
WO2020181130A2 (en) Polynucleotide conjugates and uses thereof
EP2876163A1 (de) DNA-Aptamere, die E- und P-Selektine spezifisch binden
US20110092575A1 (en) Sirna of human osteopontin
US9850492B2 (en) Aptamer to IL-17 and use thereof
US20240218351A1 (en) Single stranded rna purification methods
KR20180119758A (ko) 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도
WO2017118458A1 (de) α6-INTEGRIN BINDENDES DNA-APTAMER
EP1692284B1 (de) Anti-apoptotisch wirksame apatamere
DE10122847A1 (de) Enterotoxin B bindende Nukleinsäure
WO2024123646A2 (en) Modified oligonucleotides

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10803357

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1120100046964

Country of ref document: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10803357

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1