WO2011062469A2 - Método de diagnóstico para detectar la lesión renal aguda a través del uso de la proteína de choque térmico de 72 kda como un biomarcador sensible - Google Patents

Método de diagnóstico para detectar la lesión renal aguda a través del uso de la proteína de choque térmico de 72 kda como un biomarcador sensible Download PDF

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    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy

Definitions

  • the present invention falls within the field of clinical medicine and refers to a diagnostic method to detect Acute Renal Failure (ARI) or Acute Renal Injury, more specifically it refers to the demonstration that the 72 kDa thermal shock protein (Hsp72) is a non-invasive, sensitive and early biomarker to detect ARF and methods to detect Hsp72 in urine samples.
  • ARI Acute Renal Failure
  • Hsp72 72 kDa thermal shock protein
  • Acute renal failure is an important cause of morbidity and mortality in patients hospitalized for different causes. It is estimated that the incidence of ARF varies from 5% in patients with normal renal function before surgery, up to 30%, in patients in intensive care units (ICU). Despite advances in diagnosis and therapy, the morbidity and mortality associated with ARF remains very high (40 to 60% in patients in the ICU) and has not been significantly improved in the last four decades, because The tools available for early detection of ARI are not very sensitive and nonspecific (Clin J Am Soc Nephrol 3: 1895-1901, 2008).
  • biomarkers will help timely intervention for an adequate treatment of ARF, in patients exposed to develop it as are patients in intensive care units, those who will undergo major surgeries, those who will receive a kidney transplant or those who have presented ARF and that the biomarker allows stratifying and detecting patients who are at risk of developing chronic renal failure.
  • the diagnosis of ARF in clinical practice is made through the elevation of plasma creatinine and the determination of the glomerular filtration rate (GFR).
  • GFR glomerular filtration rate
  • serum creatinine is useful for determining renal function in patients with chronic renal failure, in the IRA its determination is not a good indicator for three reasons: 1) A large part of the renal tissue can be damaged without frank elevations of serum creatinine, a clear example are donors in renal transplantation, which despite losing 50% of renal mass do not show changes in serum creatinine levels, 2) The plasma concentration of creatinine depends on several factors how; the conversion of creatine to creatinine in skeletal muscle, the release of creatinine into the bloodstream, etc., so that the elevation of creatinine occurs late because it depends on its release and accumulation and 3) Serum creatinine is influenced by other factors such as; weight, race, age, gender, drug use, muscle metabolism and protein intake.
  • GFR renal and non-renal damage.
  • hypovolemia or alterations in the degree of vasoconstriction or vasodilation of the afferent arteriole cause a reduction in GFR with a consequent elevation of plasma creatinine, which does not correlate with tubular or renal damage. All these factors have made the early intervention of patients who are developing ARI difficult and thus improve their prognosis (Clin Trans ⁇ Sci 3,200-208; 2008).
  • a biomarker is a biological molecule that is produced endogenously and that can be an objective indicator to detect an abnormal biological process. In addition to that it can help detect if a treatment Pharmacological is being a useful therapeutic intervention to reduce the damage triggered by a pathological process.
  • a useful biomarker will be one that helps to detect the main structural complication of the ARF that is acute tubular necrosis (NTA) early, accurately and easily.
  • NTA is characterized by severe proximal tubular damage due to the loss of the brush border and the polarity of the epithelium, with necrosis and apoptosis, as well as with a detachment of the tubular epithelium. Due to these characteristics, it is possible to find a biomarker that can be detected in the detached cells that appear in the urine, thus being able to reflect the tubular damage associated with this disease.
  • biomarkers help differentiate NTA from other types of kidney damage, but they can potentially identify the location of tubular damage, the cause and the temporal course.
  • NTA N-acetyl-pD-glucosaminidase
  • NGAL gelatinase-associated neutrophil lipocalin
  • Kim-1 the kidney damage molecule
  • IL-18 Cystatin C and Interleukin 18 (IL-18)
  • Am J Physiol Renal Physiol 290: F517-F529, 2006 J Am Soc Nephrol 18: 904-912, 2007
  • Am Journal of Transplantation 6: 1639-1645; 2006 the diagnostic utility of Kim-1, NAG and NGAL was evaluated.
  • Hsp heat shock proteins
  • the hsp70 family consists of 4 isoforms, Grp78, mHsp75, Hsc70 and the inducible isoform: Hsp72.
  • the latter is expressed in response to cellular stress and its induction can become as high as representing 15% of the total cellular protein (Ce // Stress chaperones 4; 309-316, 2003).
  • the ELISA technique Enzyme linked immunosorbent assay
  • Western Blot analysis have been widely used for the specific detection of proteins through the use of antibodies, in different types of samples ⁇ Immunology 6th edition, 2007).
  • the real-time PCR test is used for the quantitative detection of mRNA levels of a specific gene.
  • This invention helps to solve the problem that currently exists in the clinic of not being able to detect ARI from early stages and the degree of renal damage caused by it so as to be able to intervene in a timely manner to the patient with an effective therapy.
  • the present invention relates to a non-invasive diagnostic method for detecting the development of early acute renal failure by determining the levels of the Hsp72 biomarker in urine samples.
  • This method is non-invasive, reliable and easily performed.
  • the method for detecting the IRA of the present invention comprises obtaining a urine sample from a mammal, preferably the human being, and measuring the concentration of the biomarker that is a heat shock protein known as Hsp72 both at the level of protein like mRNA.
  • the biomarker measurement can be determined at the mRNA level and / or protein levels by immunoassay tests, including ELISA and by Western Blot analysis, without limiting the invention.
  • the result of the biomarker measurement is between 40 and 535 times greater than the control and this increase depends on the intensity of the damage and the measurement of the Hsp72 biomarker in the urine can be detected from the first 3 hours after tissue damage induced renal.
  • the measurement of HSP72 is also capable of stratifying the intensity of the damage caused by different periods of ischemia, which is important in clinical practice since it will allow the detection of patients who have developed severe kidney damage, for timely follow-up and avoid or reduce the complication of chronic kidney disease.
  • Example 1 To demonstrate the usefulness of Hsp72 as a sensitive and early biomarker of ARF, we used the renal ischemia / reperfusion (l / R) model in the rat.
  • Ischemia / Reperfusion Model Male rats of the Wistar strain that were anesthetized with sodium pentobarbital (30 mg / kg ip weight) were used, and through an abdominal incision, the renal arteries were dissected and blood flow to the kidneys was interrupted by placing a clip in each renal artery for 10, 20, 30, 45 and 60 minutes in order to assess different degrees of kidney damage, that is, from insignificant kidney damage to severe kidney damage.
  • a group of rats was included that underwent fake surgery that was used as a control group. Each group consisted of 6 rats. At the end of the ischemia time, the animals were sutured and renal reperfusion was allowed for 24 hr.
  • Hsp72 mRNA As a biomarker, 36 rats divided into 6 groups were used; the control group and the groups with bilateral ischemia of 10, 20, 30, 45 and 60 min, all with 24 h reperfusion. The urine was collected under the conditions described below to prevent its degradation.
  • renal function was analyzed by determining the glomerular filtration rate and renal blood flow. Structural damage was assessed by light microscopy and morphometry. As markers of tubular damage, the levels of NAG and proteinuria were determined. To know if Hsp72 was induced during ischemia, the levels of mRNA and Hsp72 protein in the kidney were evaluated. To determine if Hsp72 is a sensitive and early biomarker to detect different degrees of kidney damage, the levels of Hsp72 in the urine were quantified by ELISA and Western blot.
  • RNAseZap an RNAse inhibitor
  • RNA is extracted by the method of Trizol (Invitrogen). The concentration of RNA is determined by its absorbance in UV light at 260 nm and the integrity of the isolated RNA is electrophoresed in a 1% agarose gel. CDNA is synthesized from 1 ⁇ g of RNA by a reverse transcription reaction (RT) at 37 ° C for 60 min. Hsp72 mRNA levels are detected by real-time PCR. As a control gene, ribosomal 18S RNA is used to correct variations in the efficiency of the amplification reaction.
  • Hsp 72 by ELISA.
  • ELISA Detection of Hsp 72 protein levels 36 rats were used and subjected to bilateral ischemia of 10, 20, 30, 45 and 60 min. One hour after surgery, the rats were placed in metabolic cages for 24 hours and urine was collected, which should be used immediately for ELISA or Western blot tests or else should be stored at -80 C to avoid degradation of Hsp72.
  • Hsp72 by ELISA the commercial case Hsp70 High sensitivity ELISA Kit produced by Stressgene was used as described below in brief form:
  • the plate must be read at a wavelength of 420 nm as set forth in the instructions provided.
  • Each urine is diluted 1: 1000 and only 10 ⁇ of the diluted urine is used, which is mixed with 10 ⁇ of loading buffer (6% SDS, 15% glycerol, 150 mM Tris, 3% bromophenol blue, 2% b-mercaptoethanol pH 7.6).
  • loading buffer 6% SDS, 15% glycerol, 150 mM Tris, 3% bromophenol blue, 2% b-mercaptoethanol pH 7.6
  • the proteins are denatured at 95 ° C for 5 minutes and electrophoretically separated on an 8.5% SDS-PAGE gel and transferred to a polyvinyl difloride membrane (PVDF, Amersham Pharmacia Biotech, Psicataway, NJ, USA), previously equilibrated with 1X transfer buffer (190mM glycine, 2mM Tris base, 0.1% SDS, 200 ml Methanol) in a trans-blot (SD cell, BioRad) for 60 min at 9V and blocked for 90 min at room temperature in TBS-T (Tris buffer in saline and tween) and 5% blocking agent (BIORAD).
  • 1X transfer buffer 190mM glycine, 2mM Tris base, 0.1% SDS, 200 ml Methanol
  • the membranes are incubated with the primary anti-Hsp72 1: 5000 antibody (Stressgen) overnight at 4 ° C. After incubation, the membranes are washed 3 times every 10 minutes with TBS-T. Subsequently they are incubated with the secondary antibody IgG goat-anti-mouse conjugated to peroxidase 1: 5000 (Santa Cruz Biotechnology Inc) for 90 minutes at room temperature and the membranes are washed again for 6 times. The amount of Hsp72 is detected using the commercial ECL plus chemo-luminescence kit (GE Healthcare Life Sciences) and the bands are scanned for densitometric analysis.
  • the primary anti-Hsp72 1 5000 antibody (Stressgen) overnight at 4 ° C. After incubation, the membranes are washed 3 times every 10 minutes with TBS-T. Subsequently they are incubated with the secondary antibody IgG goat-anti-mouse conjugated to peroxidase 1: 5000 (Santa Cruz Bio
  • the lesions were characterized by loss of the brush border, tubular dilation, cell desquamation and cylinder formation. Cylinder count and analysis of the percentage of the affected tubular area, shown in (G) and (H) of Figure 2, revealed that the longer the ischemia time, the greater the degree of tubular damage developed. That is, there was a progressive increase in tubular damage or cylinder count that was proportional to the intensity of the damage.
  • the histological damage assessed by light microscopy is the gold standard for determining the degree of renal damage induced by ischemia / reperfusion. Therefore, the correlation of the biomarker of Hsp72 with tubular damage is shown in the following figures.
  • NAG and H2O2 Some classic markers of tubular damage and oxidative stress were evaluated, such as urinary excretion of proteins, NAG and H2O2. As seen in (A) of Figure 3, the elevation of NAG was only statistically significant after 30 min. , that is, this marker was unable to detect renal damage induced by a period of minor ischemia (10 or 20 min). As for the oxidative stress marker, the urinary excretion of H2O2 rose from 10 min of ischemia, but was not sensitive enough to differentiate different degrees of ischemia, especially between 20 and 60 min of ischemia (B) in Figure 3. Finally, we observed that proteinuria was the best marker to detect different degrees of renal damage (C) in Figure 3.
  • the other strategy we used to detect the levels of Hsp72 protein was its detection by a Western blot analysis in the urine samples of the different groups.
  • the upper image in (A) of Figure 6 shows the autoradiography of the Western blot analysis and the lower graph the densitometric analysis of the bands.
  • reperfusion ischemia induced a significant increase in the urinary levels of Hsp72 in animals that underwent different periods of ischemia.
  • the detection of Hsp72 was statistically significant from 10 min of ischemia and rose proportionally to induced renal damage.
  • Hsp72 messenger RNA in the urine of rats with ischemia.
  • the integrity of RNA extracted from urine is shown in (A) of Figure 7.
  • Urinary levels of Hp72 mRNA were increased in rats with ischemia relative to the control group as seen in (B) of Figure 7.
  • mRNA levels in the urine increased proportionally to induced kidney damage. This was corroborated with the gold standard and as shown in (C) of Figure 7, there was a significant correlation of 0.8509 between the mRNA levels of Hsp72 and the number of cylinders per field.
  • the result of the biomarker measurement is greater than in the control group and the increase observed depends on the intensity of the damage, a result observed using the three different methodologies. It is important to highlight that Hsp72 in the urine can be detected from the first 3 hours after induced damage to the renal tissue.
  • EXAMPLE 5 Evaluation of the urinary levels of Hsp72 in healthy kidney donors and in patients with ARF.
  • Urine samples were taken from five healthy donors (controls) and nine patients with septic ARI from the intensive care unit (UTI) of the National Institute of Medical Sciences and Nutrition.
  • the diagnosis of ARF was defined when there was an increase of 30% or more in serum creatinine compared to baseline, as established by the AKIN classification (Acute Kidney Injury).
  • the first urine sample was collected the day before the nephrectomy, (signed consent). All patients with sepsis in the ICU were monitored every day and when the diagnosis of ARF was established, a fresh urine sample was collected by draining the urine collection bag. All samples were frozen and stored at -80 ° C until Hsp72 levels were determined.
  • Hsp72 is a sensitive biomarker to detect ARI in humans
  • the levels of this protein were determined by Western blot analysis in the urine of normal subjects and were compared with those patients who developed ARF in the intensive care unit.
  • ARF was defined as an increase in serum creatinine of at least 0.3 mg / dL or a urinary volume of less than 0.5 ml / kg / h for 6 hours.
  • Table 1 shows the general characteristics and renal function of five healthy renal donors and 9 patients with septic ARF. Of the patients with ARF 5 were women and 4 men aged between 24 and 84 years.
  • Hsp72 The urinary levels of Hsp72 are shown in Figure 9. In the urine of healthy renal donors, the Hsp72 was almost undetectable (33.7 ⁇ 7.1 arbitrary units), while the levels of Hsp72 were increased in patients with ARF (583.0 ⁇ 85.1 units arbitrary). It should be noted that two patients diagnosed with ARF died during their hospitalization and were among those with the highest levels of urinary Hsp72.
  • FIG. 1 Renal function parameters in rats with false surgery and with ischemia of 10, 20, 30, 45 and 60 min and reperfusion of 24 hours. ARF was evidenced by an increase in serum creatinine (A), along with a reduction in creatinine clearance (B) and renal blood flow (C), without changes in mean arterial pressure (D). * p ⁇ 0.05 vs. control.
  • Figure 2 Subcortical histological sections of the kidney with PAS staining of each of the groups. (AF). Counting the number of cylinders per field; 5 fields were quantified per rat (G). Percentage of affected tubular area determined by the loss of the brush edge and polarity, as well as tubular desquamation. * p ⁇ 0.05 vs. control. Figure 3. Determination of markers of tubular and oxidative damage. An elevation in the urinary levels of NAG (A), proteins (B) and H2O2 (C) is observed, in the groups of l / R with respect to the control. * p ⁇ 0.05 vs. control group.
  • FIG. 4 (A) Hsp72 mRNA levels in the renal cortex of rats subjected to / R. (B) Western blot showing the abundance of Hsp72 in renal cortex and its overexpression in response to different times of l / R. (C) Determination of the urinary concentration of Hsp72. * p ⁇ 0.05 vs. control.
  • FIG. 1 A) Determination of the urinary concentration of Hsp72 in rats with bilateral ischemia using the Western blot technique.
  • FIG. 2 Correlation between the detected amount of Hsp72 and the formation of cylinders.
  • Figure 7. (A) 1% agarose gel electrophoresis showing the integrity of RNA extracted from urine.
  • B Hsp72 mRNA levels in the urine of rats subjected to / R. * p ⁇ 0.01 vs. control (0) Correlation between mRNA levels of Hsp72 in urine and cylinder formation.
  • Figure 8 Determination of the urinary concentration of NAG, proteins and Hsp72 in rats with 30 min bilateral ischemia and different reperfusion times: 3, 6, 9, 12, 18, 24, 48, 72, 96 and 120 h. * p ⁇ 0.05 vs. control.
  • Figure 9. Shows the urinary levels of Hsp72 from healthy renal donors and in patients with ARF.

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Abstract

La presente invención se refiere a un método de diagnóstico, no invasivo, confiable y de fácil realización para detectar insuficiencia renal aguda temprana a través de medir Ia concentración de un biomarcador en muestras de orina, seleccionado a las proteínas de choque térmico de Ia familia 70 KDa, más específicamente se refiere a Ia identificación de Ia proteína de choque térmico 72 y Ia identificación de este biomarcador es detectado mediante ELISA y Western blot o bien el nivel de RNAm mediante RT-PCR en tiempo real. Esta invención contribuye a solucionar el problema que existe actualmente en Ia clínica de no poder detectar desde etapas tempranas a Ia Insuficiencia Renal Aguda y Ia intensidad del daño renal para así y poder intervenir oportunamente al paciente con una terapia efectiva.

Description

MÉTODO DE DIAGNÓSTICO PARA DETECTAR LA LESIÓN RENAL AGUDA A TRAVÉS DEL USO DE LA PROTEINA DE CHOQUE TERMICO DE
72 KDa COMO UN BIOMARCADOR SENSIBLE DESCRIPCIÓN
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se inscribe en el campo de la medicina clínica y se refiere a un método de diagnostico para detectar Insuficiencia Renal Aguda (IRA) o Lesión Renal Aguda, más específicamente se refiere a la demostración de que la proteína de choque térmico de 72 kDa (Hsp72) es un biomarcador no invasivo, sensible y temprano para detectar IRA y a los métodos para detectar a Hsp72 en muestras de orina. ANTECEDENTES
La Insuficiencia renal aguda es una causa importante de morbilidad y mortalidad en los pacientes hospitalizados por diferentes causas. Se calcula que la incidencia de la IRA varía del 5% en pacientes con función renal normal antes de alguna cirugía, hasta un 30%, en pacientes en unidades de terapia intensiva (UTI). A pesar de los avances en el diagnóstico y la terapéutica, la morbi y mortalidad asociada con IRA sigue siendo muy elevada (40 a 60% en pacientes en UTI) y no ha sido mejorada en forma considerable en las últimas cuatro décadas, debido a que las herramientas disponibles para la detección temprana de la IRA son poco sensibles e inespecíficas (Clin J Am Soc Nephrol 3:1895-1901 ,2008). Es por ello que la búsqueda de biomarcadores tempranos cobra cada día mayor importancia, ya que estos marcadores pueden ser herramientas potenciales para detectar la IRA en forma temprana y distinguir diferentes grados de daño renal y poder detectar a los pacientes que hayan desarrollado daño renal severo en un episodio de IRA y que estén expuestos a sufrir insuficiencia renal crónica en años posteriores.
Por lo tanto, el desarrollo de biomarcadores efectivos ayudará a la intervención oportuna para un tratamiento adecuado de la IRA, en los pacientes expuestos a desarrollarla como lo son los pacientes en unidades de terapia intensiva, los que serán sometidos a cirugías mayores, los que recibirán un trasplante renal o bien aquellos que hayan presentado IRA y que el biomarcador permita estratificar y detectar a los pacientes que estén en riesgo de desarrollar insuficiencia renal crónica.
El diagnostico de la IRA en la practica clínica se realiza a través de la elevación de la creatinina plasmática y por la determinación de la tasa de filtrado glomerular (TFG). A pesar de que la creatinina sérica es útil para determinar la función renal en pacientes con insuficiencia renal crónica, en la IRA su determinación no es un buen indicador por tres razones: 1) Una gran parte del tejido renal puede ser dañado sin elevaciones francas de la creatinina sérica, un claro ejemplo son los donadores en el transplante renal, que a pesar de perder el 50% de la masa renal no presentan cambios en los niveles de creatinina sérica, 2) La concentración en plasma de la creatinina depende de varios factores como; la conversión de creatina a creatinina en el músculo esquelético, la liberación de la creatinina al torrente sanguíneo, etc., por lo que la elevación de la creatinina se da de forma tardía porque depende de su liberación y acumulación y 3) La creatinina sérica esta influenciada por otros factores como; el peso, la raza, la edad, el genero, el consumo de drogas, el metabolismo muscular y la ingesta proteica. En cuanto a la determinación de la TFG, esta puede ser modificada por distintos tipos de daño renal y no-renal. Por ejemplo; la hipovolemia o alteraciones del grado de vasoconstricción o vasodilatación de la arteriola aferente causan una reducción en la TFG con una consecuente elevación de la creatinina plasmática, lo que no se correlaciona con daño tubular o renal. Todos estos factores han hecho difícil la intervención temprana de los pacientes que estén desarrollando IRA y así mejorar su pronóstico (Clin Transí Sci 3,200-208; 2008). Un biomarcador es una molécula biológica que se produce endógenamente y que puede ser un indicador objetivo para detectar un proceso biológico anormal. Además de que puede ayudar a detectar si un tratamiento farmacológico está siendo una intervención terapéutica útil para reducir el daño desencadeno por un proceso patológico.
Específicamente, en la IRA un biomarcador útil será aquel que ayude a detectar en forma temprana, precisa y sencilla la principal complicación estructural de la IRA que es la necrosis tubular aguda (NTA). La NTA se caracteriza por daño tubular proximal severo debido a la perdida del borde en cepillo y de la polaridad del epitelio, con necrosis y apoptosis, así como con un desprendimiento del epitelio tubular. Por estas características, es posible encontrar un biomarcador que se pueda detectar en las células desprendidas y que aparecen en la orina, pudiendo de esta forma reflejar el daño tubular asociado a esta enfermedad.
Los biomarcadores no solo ayudarán a diferenciar la NTA de otras tipos de daño renal, sino que potencialmente pueden identificar la localización del daño tubular, la causa y el curso temporal.
Varios estudios han propuesto proteínas y marcadores bioquímicos para la detección de NTA, dentro de los que se encuentran: la N-acetil-p-D- glucosaminidasa (NAG), la lipocalina de neutrófilos asociada a la gelatinasa (NGAL), la molécula de daño renal (Kim-1), la cistatina C y la interleucina 18 (IL-18) (Am J Physiol Renal Physiol 290:F517-F529, 2006) (J Am Soc Nephrol 18:904-912, 2007) (Am Journal of Transplantation 6:1639-1645; 2006). En un reporte reciente, realizado con 90 pacientes que fueron sometidos a cirugía cardiaca, se evaluó la utilidad diagnostica de Kim-1 , NAG y NGAL. Al determinar la capacidad de estas moléculas para la detección de IRA en forma inmediata y después de 3 horas de la cirugía cardiaca, utilizando una escala de 1 , se encontró que la capacidad de Kim-1 fue 0.68 y 0.65 respectivamente, para NAG: 0.61 y 0.63 y para NGAL: 0.59 y 0.65. Para aumentar la sensibilidad de estos marcadores fue necesario combinar la determinación de estos tres marcadores, de esta forma, tanto la sensibilidad como, la detección temprana de IRA, se incrementó a 0.75 y 0.78, respectivamente (Clin J Am Soc Nephrol 5;873-882, 2009). Esto apoya la idea de que se debe continuar con la búsqueda de biomarcadores con un mayor nivel de potencial de diagnostico temprano y capaces de estratificar el daño por IRA. Se conoce que ante fenómenos como los que ocurren durante la IRA se activan mecanismos para tratar de compensar el estrés celular resultante, como lo es el aumento en la expresión de proteínas de choque térmico (Hsp) (Experíentia 18, 571-573, 1962) que ayudan a recuperar la homeostasis celular. Estas proteínas pertenecen a una familia multigénica con un peso molecular que varía entre los 10 y los 150 kDa. Estas proteínas se clasifican de acuerdo a su peso molecular en 6 subfamilias: las Hsp de 100-110 kDa, las de 90 kDa, las de 70 kDa, la de 60 kDa, la de 40 kDa y la subfamilia de Hsp's con peso molecular de 18 a 30 kDa {Ann Med. 4:261-71 , 1999). En particular la familia de las hsp70 se compone de 4 isoformas, la Grp78, la mHsp75, Hsc70 y la isoforma inducible: Hsp72. Ésta última se expresa en respuesta al estrés celular y su inducción puede llegar a ser tan alta como representar el 15% de la proteína celular total (Ce// Stress chaperones 4;309- 316, 2003). Este hecho, en conjunto con la descamación celular del túbulo proximal de la nefrona que ocurre ante un fenómeno de IRA, fue utilizado como base para nuestra invención: que es la detección urinaria de Hsp72, como un biomarcador sensible de IRA, tanto a nivel de proteína, mediante pruebas de inmunoensayo como ELISA y por un análisis de Western blot, como de RNA mensajero por una prueba de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR en tiempo real).
La técnica de ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) y el análisis por Western Blot han sido utilizados ampliamente para la detección especifica de proteínas mediante el uso de anticuerpos, en diferentes tipos de muestras {Immunology 6th edition, 2007). La prueba de PCR en tiempo real es utilizada para la deteminación cuantitativa de los niveles de RNAm de un gen específico.
Esta invención contribuye a solucionar el problema que existe actualmente en la clínica de no poder detectar desde etapas tempranas a la IRA y el grado de daño renal ocasionado por esta para asó poder intervenir oportunamente al paciente con una terapia efectiva.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método de diagnóstico no invasivo para detectar el desarrollo de insuficiencia renal aguda temprana a través de determinar los niveles del biomarcador Hsp72 en muestras de orina. Éste método es no invasivo, es confiable y de fácil realización. El método para detectar la IRA, de la presente invención, comprende la obtención de una muestra de orina de un mamífero, preferentemente el ser humano, y la medición de la concentración del biomarcador que es una proteína de choque térmico conocida como Hsp72 tanto a nivel de proteína como de RNAm.
La medición del biomarcador se puede determinar a nivel de RNAm y/o niveles de proteína mediante pruebas de inmunoensayos, entre ellos ELISA y por un análisis de Western Blot, sin que esto limite la invención. El resultado de la medición del biomarcador es entre 40 y 535 veces mayor que el control y este incremento depende de la intensidad del daño y la medición del biomarcador Hsp72 en la orina se puede detectar desde las primeras 3 horas después de inducido el daño al tejido renal. La medición de HSP72, además es capaz de estratificar la intensidad del daño ocasionado por diferentes periodos de isquemia, lo cual es importante en la practica clínica dado que permitirá detectar a los pacientes que hayan desarrollado daño renal severo, para su oportuno seguimiento y evitar o reducir la complicación de la enfermedad renal crónica.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos son para ilustrar la invención y en ningún momento son para limitarla.
Ejemplo 1. Para demostrar la utilidad de la Hsp72 como biomarcador sensible y temprano de la IRA, utilizamos el modelo de isquemia/reperfusión (l/R) renal en la rata.
Modelo de Isquemia/Reperfusión: Se utilizaron ratas macho de la cepa Wistar que se anestesiaron con pentobarbital sódico (30 mg/kg de peso i.p), y mediante una incisión abdominal, se disecaron las arterias renales y se interrumpió el flujo sanguíneo a los ríñones mediante la colocación de un clip en cada arteria renal durante 10, 20, 30, 45 y 60 minutos con el fin de evaluar distintos grados de daño renal, es decir, desde un daño renal insignificante hasta un daño renal severo. Además se incluyó un grupo de ratas que fue sometido a cirugía falsa que se utilizó como grupo control. Cada grupo estuvo conformado por 6 ratas. Al finalizar el tiempo de isquemia, los animales fueron suturados y se permitió una reperfusión renal durante 24 hr. Para determinar la utilidad de medir los niveles de RNAm de Hsp72 como biomarcador, se utilizaron 36 ratas divididas en 6 grupos; el grupo control y los grupos con isquemia bilateral de 10, 20, 30, 45 y 60 min, todos con reperfusión de 24 h. Se recolectó la orina en las condiciones que se describen posteriormente para evitar su degradación.
De forma similar y para determinar la utilidad de medir los niveles de proteína de Hsp72 como biomarcador temprano se incluyeron otras 33 ratas divididas en 11 grupos; el grupo control con cirugía falsa y los grupos con isquemia bilateral de 30 min y reperfusión de 3, 6, 9, 12, 18, 24, 48, 72, 96 y 120 h y se recolectó la orina para determinar la sensibilidad de medir los niveles de proteína de Hsp72 como biomarcador temprano mediante ELISA.
En todos los grupos se analizó la función renal mediante la determinación de la tasa de filtración glomerular y el flujo sanguíneo renal. El daño estructural se evaluó mediante microscopía de luz y morfometría. Como marcadores de daño tubular se determinaron los niveles de NAG y proteinuria. Para conocer si Hsp72 era inducida durante la isquemia, se evaluaron los niveles de RNAm y proteína de Hsp72 en el riñon. Para determinar si Hsp72 es un biomarcador sensible y temprano para detectar diferentes grados de daño renal, se cuantificaron los niveles de Hsp72 en la orina mediante ELISA y Western blot.
EJEMPLO 2. Detección de la Hsp 72 mediante RT-PCR en tiempo real.
Para la detección de los niveles de RNAm de Hsp72 se sometieron a isquemia bilateral 30 ratas macho de la cepa Wistar que se dividieron en 6 grupos, las ratas sometidas a cirugía falsa (grupo control) y el resto a isquemia bilateral de 10, 20, 30, 45 y 60 min. y reperfusión de 24 h. Una hora después de la cirugía, las ratas se colocaron en jaulas metabólicas durante 24 horas que previamente habían sido tratadas con un inhibidor de RNAsas (RNAseZap, Ambion). En el tubo donde se recolecta la orina por 24 h, se colocaron 300 μΙ de RNA later (Ambion) y las muestras se centrifugan a 3000 rpm, durante 30 min. El sedimento urinario se resuspende en buffer de fosfatos pH=7.4 y nuevamente se centrifuga a 13000 rpm durante 3 min. Se procede a extraer el RNA total por el método de Trizol (Invitrogen). La concentración del RNA se determina por medio de su absorbancia en luz UV a 260 nm y la integridad del RNA aislado se corrobora en electroforesis en un gel de agarosa al 1%. Se sintetiza cDNA a partir de 1 μg de RNA mediante una reacción de transcripción reversa (RT) a 37°C durante 60 min. Los niveles de RNAm de Hsp72 se detectan por PCR en tiempo real. Como gen control se utiliza el RNA ribosomal 18S para corregir las variaciones en la eficiencia de la reacción de amplificación.
EJEMPLO 3. Detección de la Hsp 72 mediante ELISA. Para la detección de los niveles de proteína Hsp72 se utilizaron 36 ratas y se sometieron a isquemia bilateral de 10, 20, 30, 45 y 60 min. Una hora después de la cirugía, las ratas se colocaron en jaulas metabólicas durante 24 horas y se colectó la orina, la cual debe ser utilizada inmediatamente para los ensayos de ELISA o Western blot o de lo contrario debe ser almacenada a -80 C para evitar la degradación de la Hsp72. Para la determinación de Hsp72 por ELISA se utilizó el estuche comercial Hsp70 High sensitivity ELISA Kit producido por Stressgene como se describe a continuación en forma breve:
1) Se colocan 100 μΙ de la muestra de orina en cada pozo de la placa de ELISA;
2) Se incuba la placa durante 2 h a temperatura ambiente y en agitación constante;
3) Se realizan 3 lavados de cada pozo con la solución de lavado que se proporciona en el estuche comercial.
4) Se adicionan 100 μΙ de anticuerpo primario (anti-Hsp72) y se incuba la placa nuevamente durante 60 min. Al finalizar la incubación, se realizan 3 lavados de cada uno de los pozos, como se menciona en el punto número 3.
5) Se agregan 100 μΙ de anticuerpo secundario acoplado a HRP y se incuba a temperatura ambiente por 60 min más. Al termino de la incubación se efectúan 3 lavados mas de cada pozo.
6) Se adicionan 100 μΙ de solución de revelado (incluida en el estuche comercial) y se vuele incubar a temperatura ambiente por 30 min.
7) Se agregan 100 μΙ de solución de paro de la reacción
8) La placa debe ser leída a una longitud de onda de 420 nm como se establece en las instrucciones proporcionadas.
EJEMPLO 4. Detección de la Hsp 72 mediante Western blot.
Se utilizaron las mismas orinas de las ratas que se describieron en el apartado anterior. Cada orina se diluye 1:1000 y tan solo se utilizan 10 μΙ de la orina diluida que se mezcla con 10 μΙ de buffer de carga (6% SDS, 15 % glicerol, 150 mM Tris, azul de bromofenol 3%, b-mercaptoetanol 2% pH 7.6). Las proteínas se desnaturalizan a 95°C por 5 minutos y se separan electroforéticamente en un gel SDS-PAGE al 8.5% y se transfirieren a una membrana de difloruro de polivinilo (PVDF, Amersham Pharmacia Biotech, Psicataway, NJ, USA), previamente equilibrados con buffer de transferencia 1X (190mM glicina, 2mM Tris base, SDS 0.1%, 200 mi Metanol) en un trans-blot (SD cell, BioRad) durante 60 min a 9V y se bloquean por 90 min a temperatura ambiente en TBS- T (Tris buffer en solución salina y tween) y agente bloqueante (BIORAD) al 5%. Después del bloqueo, las membranas se incuban con el anticuerpo primario anti-Hsp72 1:5000 (Stressgen) por una noche a 4°C. Después de la incubación, las membranas se lavan 3 veces cada 10 minutos con TBS-T. Posteriormente se incuban con el anticuerpo secundario IgG goat-anti-mouse conjugado a peroxidasa 1 :5000 (Santa Cruz Biotechnology Inc) durante 90 minutos a temperatura ambiente y las membranas son lavadas nuevamente durante 6 veces. La cantidad de Hsp72 es detectada utilizando el estuche comercial de quimio-luminiscencia ECL plus (GE Healthcare Life Sciences) y las bandas son escaneadas para el análisis densitométrico.
RESULTADOS
Primero evaluamos el efecto que tiene producir diferentes tiempos de isquemia bilateral (10 a 60 min) y reperfusión de 24 hr sobre la función renal. Los cinco grupos de ratas que fueron sometidas a l/R, presentaron disfunción renal, que se evidenció por la elevación progresiva de la creatinina sérica y una disminución de la TFG calculada mediante la depuración de creatinina (A) y (B) de la Figura 1. La disfunción renal se asoció con una reducción del 10 al 30% en el flujo sanguíneo renal, sin cambios en la presión arterial media como se detalla en (C) y (D) de la Figura 1. Los estudios de microscopía de luz revelaron que los diferentes periodos de isquemia bilateral y reperfusión de 24 hr produjeron daño tubular en diferentes grados, de acuerdo al tiempo de isquemia ocasionado, como se demuestra en las imágenes representativas de cada grupo (A) a la (F) de la Figura 2. Las lesiones se caracterizaron por la perdida del borde en cepillo, dilatación tubular, descamación celular y formación de cilindros. El conteo de cilindros y el análisis del porcentaje del área tubular afectada, que se muestra en (G) y (H) de la Figura 2, revelaron que mientras mayor fue el tiempo de isquemia, mayor fue el grado de daño tubular desarrollado. Es decir, hubo un incremento progresivo en el daño tubular o conteo de cilindros que fue proporcional a la intensidad del daño. El daño histológico evaluado por microscopía de luz es el estándar de oro para determinar el grado de daño renal inducido por isquemia/reperfusión. Por lo tanto, en las figuras posteriores se muestra la correlación del biomarcador de Hsp72 con el daño tubular.
Se evaluaron algunos los marcadores clásicos de daño tubular y de estrés oxidativo como la excreción urinaria de proteínas, de NAG y de H2O2 Como se observa en (A) de la Figura 3, la elevación de NAG solo fue estadísticamente significativa a partir de 30 min, es decir este marcador fue incapaz de detectar el daño renal inducido por un periodo de isquemia menor (10 ó 20 min). En cuanto al marcador de estrés oxidativo, la excreción urinaria de H2O2 se elevó desde los 10 min de isquemia, pero no fue suficientemente sensible como para diferenciar diferentes grados de isquemia, especialmente entre los 20 y 60 min de isquemia (B) de la Figura 3. Finalmente, observamos que la proteinuria fue el mejor marcador para detectar diferentes grados de daño renal (C) de la Figura 3.
Para evaluar si la Hsp72 es inducida durante diferentes periodos de isquemia, se determinaron los niveles de RNAm y de proteína de Hsp72 en el tejido renal, es decir una vez que se recolectó la orina, las ratas se sacrificaron y se obtuvo uno de los ríñones para extraer el RNAm y las proteínas. Como se puede apreciar en (A) y (B) de la Figura 4, tanto el RNAm como la proteína, se incrementaron significativamente en el tejido renal de cada uno de los grupos con l/R. También se aprecia un aumento progresivo que delimita claramente el diferente grado de daño renal inducido por diferentes tiempos de isquemia/reperfusión. Estos resultados muestran que durante un fenómeno de isquemia/reperfusión hay un aumento en la expresión de Hsp72, que interesantemente y conveniente para nuestra invención es proporcional al daño renal inducido.
Con estos resultados nos dimos a la tarea de investigar si esta proteína podía ser detectada en la orina de los animales que sufrieron daño renal por isquemia/reperfusión para desarrollar un método sensible y no invasivo. Para lo que determinamos los niveles de proteína de Hsp72 mediante la utilización de dos estrategias basada en un inmunoensayo. La primera fue por ELISA y la otra por análisis de Western blot. La determinación urinaria de Hsp72 mediante ELISA reveló que esta proteína es un excelente marcador de la IRA, ya que desde los 10 minutos de isquemia se incrementa su aparición en la orina, con una aumento progresivo dependiente del dañó renal inducido por isquemia, logrando aumentar hasta 25 veces en el grupo sometido a 60 min de isquemia, respecto al control, como se demuestra en (C) de la Figura 4. La elevación progresiva de este biomarcador correlacionó de forma significativa con el instrumento de oro para la detección del daño por isquemia, que es el análisis histopatológico. (A) de la Figura 5 muestra una correlación positiva entre la cantidad de Hsp72 en orina y la formación de cilindros con una correlación de 0.83 y una p<0.0001 y (B) de la Figura 5 muestra la correlación entre la cantidad de Hsp72 y el porcentaje de túbulos afectados, siendo esta de 0.79 con una p<0.0001.
La otra estrategia que utilizamos para detectar los niveles de proteína de Hsp72 fue su detección mediante un análisis de Western blot en las muestras de orina de los diferentes grupos. La imagen superior en (A) de la Figura 6 muestra la autoradiografía del análisis de Western blot y la gráfica inferior el análisis densitométrico de las bandas. Como se pueda apreciar, la isquemia reperfusión indujo un aumento significativo en los niveles urinarios de Hsp72 en los animales que fueron sometidos a diferentes periodos de isquemia. Al igual que en el análisis por ELISA, la detección de Hsp72 fue estadísticamente significativa desde los 10 min de isquemia y se elevó en forma proporcional al daño renal inducido. La sensibilidad para detectar diferentes grados de daño renal fue mayor con el Western blot que con el ELISA, ya que el aumento de Hsp72 en el grupo de 10 minutos de isquemia fue de 40 veces, observándose un incremento progresivo dependiendo del insulto llegando a ser de 535 veces su aumento en el grupo con daño renal severo por isquemia de 60 min. La correlación entre la cantidad de Hsp72 en la orina y la formación de cilindros se muestra en (B) de la Figura 6 siendo de 0.9476 y con una p<0.0001. Estos resultados muestran que la detección de Hsp72 es sensible para detectar los diferentes grados de daño renal, sin embargo la detección de esta proteína por un análisis de Western blot fue superior con respecto al de ELISA (ver correlaciones). Además es importante enfatizar que para el análisis de Western blot, tan solo se necesita 0.1 μΙ de orina, mientras que para el de ELISA se requieren 100 μΙ.
Para explorar si la detección de Hsp72 no sólo se limita a su cuantificación a nivel de proteína, decidimos evaluar la abundancia del RNA mensajero de Hsp72 en la orina de ratas con isquemia. La integridad del RNA extraído de orina se muestra en (A) de la Figura 7. Los niveles urinarios de RNAm de Hp72 se incrementaron en las ratas con isquemia respecto al grupo control como se aprecia en (B) de la Figura 7. Al igual que en los niveles de proteína, los niveles de RNAm en la orina incrementaron de forma proporcional al daño renal inducido. Esto se corroboró con el estándar de oro y como se muestra en (C) de la Figura 7, hubo una correlación significativa de 0.8509 entre los niveles de RNAm de Hsp72 y el número de cilindros por campo.
Finalmente para evaluar la utilidad de Hsp72 como marcador temprano de la IRA se determinó la concentración urinaria de Hsp72 en ratas con isquemia de 30 min y reperfusión que fue desde las 3 hasta las 120 horas. La Figura 8 muestra la detección de Hsp72, comparada con otros marcadores de daño tubular. Como se puede apreciar en (C) de la Figura 8 se presentó una elevación significativa de Hsp72 urinaria desde una etapa muy temprana (3 h de reperfusión), alcanzando la mayor cantidad detectada en la orina a las 18 h de reperfusión con la posterior disminución en la excreción de dicha proteína, lo que correlaciona con la regeneración tubular después de 72 horas. Estos resultados muestran la utilidad de Hsp72 como biomarcador temprano para detectar la IRA. Además el resultado de la medición del biomarcador es mayor que en el grupo control y el incremento observado depende de la intensidad del daño, resultado que se observa utilizando las tres diferentes metodologías. Es importante resaltar que Hsp72 en la orina se puede detectar desde las primeras 3 horas después de inducido el daño al tejido renal.
EJEMPLO 5. Evaluación de los niveles urinarios de Hsp72 en donadores de riñon sanos y en pacientes con IRA. Se tomaron muestras de orina de cinco donadores sanos (controles) y de nueve pacientes con IRA séptica de la unidad de terapia intensiva (UTI) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición. El diagnóstico de la IRA se definió cuando hubo un incremento del 30% o más en la creatinina sérica respecto al basal, de acuerdo con lo establecido por la clasificación de AKIN (por sus siglas en inglés Acute Kidney Injury). En los donadores sanos, se recolectó la primera muestra de orina un día previo a la nefrectomia, (consentimiento firmado). Todos los pacientes con sepsis en la UTI fueron monitoreados cada día y cuando el diagnóstico de IRA se estableció, se recolectó una muestra fresca de orina drenando la bolsa de recolección de orina. Todas las muestras se congelaron y se guardaron a - 80°C hasta que los niveles de Hsp72 fueron determinados.
Niveles urinarios de Hsp72 en donadores de riñon sanos y en pacientes con IRA. (Resultados)
Para determinar si la Hsp72 es un biomarcador sensible para detectar IRA en humanos, los niveles de esta proteína fueron determinados por análisis Western blot en la orina de sujetos normales y fueron comparados con aquellos pacientes que desarrollaron IRA en la unidad de terapia intensiva. La IRA se definió como un incremento en la creatinina sérica de al menos 0.3 mg/dL o un volumen urinario menor a 0.5 ml/kg/h por 6 horas. La tabla 1 muestra las características generales y la función renal de cinco donadores renales sanos y 9 pacientes con IRA séptica. De los pacientes con IRA 5 fueron mujeres y 4 hombres con edad entre 24 y 84 años. En el momento de la admisión a la unidad de terapia intensiva, todos los pacientes mostraron valores normales de creatinina, sin embargo, la creatinina se incrementó de 0.55 ± 0.05 a 2.30 ± 0.52 mg/dl durante su estancia mostrando el desarrollo de IRA. Los niveles urinarios de Hsp72 se muestran en la Figura 9. En la orina de donadores renales sanos la Hsp72 fue casi indetectable (33.7 ± 7.1 unidades arbitrarias), mientras que los niveles de Hsp72 se incrementaron en los pacientes con IRA (583.0 ± 85.1 unidades arbitrarias). Es de resaltarse que dos pacientes diagnosticados con IRA murieron durante su hospitalización y fueron de los que tuvieron los niveles más elevados de Hsp72 urinaria.
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BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Parámetros de función renal en ratas con cirugía falsa y con isquemia de 10, 20, 30, 45 y 60 min y reperfusión de 24h. La IRA fue evidenciada por un incremento en la creatinina sérica (A), junto con una reducción en la depuración de creatinina (B) y el flujo sanguíneo renal (C), sin cambios en la presión arterial media (D). *p<0.05 vs. control.
Figura 2. Secciones histológicas subcorticales de riñon con una tinción de PAS de cada uno de los grupos. (A-F). Conteo del número de cilindros por campo; se cuantificaron 5 campos por rata (G). Porcentaje de área tubular afectada determinada por la perdida del borde en cepillo y polaridad, así como descamación tubular. *p<0.05 vs. control. Figura 3. Determinación de marcadores de daño tubular y oxidativo. Se observa una elevación en los niveles urinarios de NAG (A), proteínas (B) y H2O2 (C), en los grupos de l/R respecto al control. *p<0.05 vs. grupo control.
Figura 4. (A) Niveles de RNAm de Hsp72 en la corteza renal de ratas sometidas a l/R. (B) Western blot que muestra la abundancia de Hsp72 en corteza renal y su sobre-expresión en respuesta a diferentes tiempos de l/R. (C) Determinación de la concentración urinaria de Hsp72. *p<0.05 vs. control.
Figura 5. (A) Correlación positiva entre la cantidad de Hsp72 en orina y la formación de cilindros. (B) Correlación entre la cantidad de Hsp72 y % de túbulos afectados con una r=0.79 una p<0.0001.
Figura 6. (A) Determinación de la concentración urinaria de Hsp72 en ratas con isquemia bilateral mediante la técnica de Western blot. (B) Correlación entre la cantidad detectada de Hsp72 y la formación de cilindros. Figura 7. (A) Electroforesis en gel de agarosa al 1% que muestra la integridad del RNA extraído de orina. (B) Niveles de RNAm de Hsp72 en la orina de ratas sometidas a l/R. *p<0.01 vs. control (0) Correlación entre los niveles de RNAm de Hsp72 en orina y la formación de cilindros.
Figura 8. Determinación de la concentración urinaria de NAG, proteínas y Hsp72 en ratas con isquemia bilateral de 30 min y diferentes tiempos de reperfusión: 3, 6, 9, 12, 18, 24, 48, 72, 96 y 120 h. *p<0.05 vs. control. Figura 9. Muestra los niveles urinarios de Hsp72 de donadores renales sanos y en pacientes con IRA.

Claims

REIVINDICACIONES Habiendo descrito suficiente mi invención, considero como una novedad y por lo tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Método de diagnóstico para detectar insuficiencia renal aguda que comprende
a. la obtención de una muestra de orina proveniente de un mamífero; y
b. la medición de la concentración de un biomarcador que es la proteína de choque térmico Hsp72.
2. Método de conformidad con la reivindicación 1 en donde el mamífero es el ser humano.
3. Método de conformidad con la reivindicación 1 en donde Hsp72 en la orina se puede detectar desde las primeras 3 horas después de inducido el daño al tejido renal.
4. Método de conformidad con la reivindicación en donde el HSP72 permite estratificar la intensidad del daño inducido durante la IRA.
5. Método de conformidad con la reivindicación 1 en donde la medición de la concentración del biomarcador se lleva acabo a través de la determinación de los niveles de RNAm
6. Método de conformidad con la reivindicación 1 en donde la medición de la concentración del biomarcador se lleva acabo a través de pruebas de inmunoensayos.
7. Método de conformidad con la reivindicación 5 en donde la prueba de inmunoensayo es ELISA.
8. Método de conformidad con la reivindicación 5 en donde la prueba de inmunoensayo es Western Blot.
9. Método de conformidad con la reivindicación 1 en donde el resultado de la medición del biomarcador es entre 40 y 535 veces mayor que el control y este incremento depende de la intensidad del daño.
PCT/MX2010/000138 2009-11-23 2010-11-23 Método de diagnóstico para detectar la lesión renal aguda a través del uso de la proteína de choque térmico de 72 kda como un biomarcador sensible WO2011062469A2 (es)

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JP2012541040A JP5755657B2 (ja) 2009-11-23 2010-11-23 感受性バイオマーカーとして熱ショックタンパク質７２を用いる、急性腎障害を検出するための診断方法
ES10831836.1T ES2549610T3 (es) 2009-11-23 2010-11-23 Método de diagnóstico para detectar la lesión renal aguda a través del uso de la proteína de choque térmico de 72 como un biomarcador sensible
CN201080062143.5A CN102762985B (zh) 2009-11-23 2010-11-23 使用热休克蛋白72作为敏感生物标志物来检测急性肾损伤的诊断方法
CA2781754A CA2781754C (en) 2009-11-23 2010-11-23 Diagnostic method for detecting acute kidney injury using heat shock protein 72 as a sensitive biomarker

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102879584A (zh) * 2012-09-26 2013-01-16 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种人血液hsp70抗体胶体金标检测试纸条及其制备方法
US9534027B2 (en) 2010-05-24 2017-01-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mutant NGAL proteins and uses thereof
US9624281B2 (en) 2012-11-21 2017-04-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mutant NGAL proteins and uses thereof

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ605698A (en) 2010-06-23 2015-03-27 Astute Medical Inc Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
PL2748605T4 (pl) 2011-08-26 2019-08-30 Astute Medical, Inc. Sposoby i kompozycje do diagnozowania i prognozowania uszkodzenia nerek i niewydolności nerek
KR101468047B1 (ko) * 2013-01-16 2014-12-02 고려대학교 산학협력단 열충격단백질군의 mRNA 발현 양상 분석을 통한 사인 추정방법
CN110431422A (zh) 2017-02-06 2019-11-08 机敏医药股份有限公司 用于肾损伤和肾衰竭的诊断和预后的方法和组合物
CN107045594B (zh) * 2017-04-25 2018-06-26 吉林大学 一种脊柱损伤测量中x射线标志物的数字化系统
CN109754394B (zh) * 2018-12-28 2021-02-23 上海联影智能医疗科技有限公司 三维医学图像处理装置及方法
WO2020125806A1 (en) 2018-12-17 2020-06-25 Shanghai United Imaging Intelligence Co., Ltd. Systems and methods for image segmentation
CN111007255A (zh) * 2019-12-10 2020-04-14 江苏三联生物工程有限公司 一种用于肾损伤标志物检测的蛋白芯片及其制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4035591B2 (ja) * 2003-01-24 2008-01-23 株式会社三重ティーエルオー 血管障害病態改善剤
US7833732B2 (en) * 2005-07-21 2010-11-16 The John Hopkins University Acute renal injury

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Immunology", 2007
AM J OF TRANPLANTATION, vol. 6, 2006, pages 1639 - 1645
AM J PHYSIOL RENAL PHYSIOL, vol. 290, pages F517 - F529
ANN MED., vol. 4, 1999, pages 261 - 71
CLIN J AM SOC NEPHROL, vol. 3, 2004, pages 1895 - 1901
CLIN J AM SOC NEPHROL, vol. 5, 2009, pages 873 - 882
CLIN TRANSL SCI, vol. 3, 2008, pages 200 - 208
EXPERIENTIA, vol. 18, 1962, pages 571 - 573
J AM SOC NEPHROL, vol. 18, 2007, pages 904 - 912
See also references of EP2506016A4

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9534027B2 (en) 2010-05-24 2017-01-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mutant NGAL proteins and uses thereof
US10588937B2 (en) 2010-05-24 2020-03-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mutant NGAL proteins and uses thereof
US11730790B2 (en) 2010-05-24 2023-08-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mutant NGAL proteins and uses thereof
CN102879584A (zh) * 2012-09-26 2013-01-16 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种人血液hsp70抗体胶体金标检测试纸条及其制备方法
US9624281B2 (en) 2012-11-21 2017-04-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mutant NGAL proteins and uses thereof
US10829525B2 (en) 2012-11-21 2020-11-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mutant NGAL proteins and uses thereof

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