WO2011055550A1 - 自己免疫疾患又はアレルギー治療剤とそのスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は,日本特許出願2009-254108(2009年11月5日出願)に基づく優先権を主張しており,この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
本発明は、自己免疫疾患又はアレルギーの治療に有効な、Neuropilin1-Fc(NP-1-Fc)、Neuropilin-1(NP-1)中和抗体、Semaphorin3A(Sema3A)中和抗体等のNP-1とSema3Aとの結合阻害物質を有効成分として含む、自己免疫疾患又はアレルギーを治療または予防するための医薬組成物または当該医薬組成物を用いる治療方法、もしくは当該阻害物質のスクリーニング方法の分野に関する。
〔1〕Neuropilin-1/Plexin-A1ヘテロ受容体とSema3Aとの結合を阻害する物質を有効成分として含有する細胞性免疫疾患の治療剤、
〔2〕該物質が、Sema3A中和抗体であることを特徴とする〔1〕記載の治療剤、
〔3〕中和抗体が配列番号1に記載の363番目から381番目のペプチド配列に結合する抗体であることを特徴とする〔1〕記載の治療剤、
〔4〕ペプチド配列がNYQWVPYQGRVPYPRPGTCである〔3〕記載の治療剤、
〔5〕該物質が、Neuropilin-1中和抗体であることを特徴とする〔1〕記載の治療剤、
〔6〕中和抗体が配列番号2に記載の265番目から857番目のペプチド配列に結合する抗体であることを特徴とする〔5〕記載の治療剤、
〔7〕中和抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする〔2〕から〔6〕のいずれかに記載の治療剤、
〔8〕中和抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする〔2〕から〔6〕のいずれかに記載の治療剤、
〔9〕該物質が、可溶型Neuropilin-1であることを特徴とする〔1〕記載の治療剤、
〔10〕可溶型Neuropilin-1が以下;
(1)配列番号2に記載の23番目から589番目のアミノ酸を含むポリペプチド、
(2)配列番号2に記載の23番目から857番目のアミノ酸を含むポリペプチド、
(3)(1)又は(2)に記載のポリペプチドを構成するアミノ酸配列のうち、1又はそれ以上のアミノ酸を欠失、付加、又は、置換したアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、Plexin-A1及びSema3Aとの結合活性を保持するポリペプチド、
(4)(1)又は(2)に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列にハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、Plexin-A1及びSema3Aとの結合活性を有するポリペプチド、又は
(5)配列番号5に記載のポリヌクレオチド配列にハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、Plexin-A1及びSema3Aとの結合活性を有するポリペプチド、
を含むポリペプチドであることを特徴とする〔9〕記載の治療剤、
〔11〕該物質が、可溶型Neuropilin-1誘導体であることを特徴とする〔1〕記載の治療剤、
〔12〕可溶型Neuropilin-1誘導体が〔10〕に記載された可溶型Neuropilin-1とFcとの融合ポリペプチドである〔1〕記載の治療剤、
〔13〕Fcが、配列番号7、8、9、又は10のいずれかに記載されたアミノ酸からなるポリペプチドを含むことを特徴とする〔12〕に記載の治療剤、
〔14〕可溶型Neuropilin-1誘導体が〔10〕に記載された可溶型Neuropillin-1にポリエチレングリコール(PEG)鎖が付加されたポリペプチドである〔1〕記載の治療剤、
〔15〕細胞性免疫疾患が、自己免疫疾患である〔1〕から〔14〕に記載の治療剤、
〔16〕自己免疫疾患が、器官特異的自己免疫疾患である〔15〕に記載の治療剤、
〔17〕器官特異的自己免疫疾患が、貧血(再生不良性貧血、溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血、突発性血小板減少症)、自己免疫性肝炎、虹彩毛様体炎、強膜炎、ブドウ膜炎、精巣炎、特発性血小板減少性紫斑病、バセドー病、橋本甲状腺炎、若年性糖尿病、炎症性腸疾患、アジソン病、脱髄性脳炎、又は、多発性硬化症である〔16〕に記載の治療剤、
〔18〕自己免疫疾患が、全身性自己免疫疾患である〔15〕に記載の治療剤、
〔19〕全身性自己免疫疾患が、アトピー性皮膚炎、慢性関節リウマチ等の関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン病、未分化結合組織症候群、抗リン脂質症候群、種々の形態の脈管炎(結節性多発性動脈炎、アレルギー性肉芽腫症及び血管炎)、ウェゲナー肉芽腫症、川崎病、過敏性血管炎、ヘノッホ-シェーンライン紫斑病、ベーチェット症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓血管炎、リウマチ性多発性筋痛、本態性(混合型)クリオグロブリン血症、乾癬、尋常性乾癬及び乾癬性関節炎、好酸球増加症を伴う又は伴わない広汎性筋膜炎、再発性皮下脂肪組織炎、再発性多発性軟骨症、リンパ腫様肉芽腫症、結節性紅斑、強直性脊椎炎、ライター症候群、又は、種々の形態の炎症性皮膚炎である〔18〕に記載の治療剤、
〔20〕細胞性免疫疾患が、遅延型アレルギー疾患である〔1〕から〔14〕に記載の治療剤、
〔21〕遅延型アレルギー疾患が、接触性皮膚炎、金属皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、シェーグレン症候群、感染アレルギー、薬剤性肺炎、又は、ギラン・バレー症候群である〔20〕に記載の治療剤、
〔22〕下記の工程(a)、(b)、および(c)を含む細胞性免疫疾患治療剤のスクリーニング方法、
(a)被験物質の存在下で、Neuropilin-1の細胞外ドメインを有するポリペプチドとSema3Aポリペプチドとを接触させる工程、
(b)被験物質存在下におけるNeuropilin-1の細胞外ドメインを有するポリペプチドとSema3Aポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルを測定し、被験物質非存在下でのNeuropilin-1の細胞外ドメインを有するポリペプチドとSema3Aポリペプチドとの相互作用から生じるシグナル(対照)と比較する工程、
(c)上記(b)の比較結果に基づいて、対照に比してシグナルを低下させる被験物質を選択する工程、
〔23〕下記の工程(a)、(b)、および(c)を含む細胞性免疫疾患治療剤のスクリーニング方法、
(a)被験物質の存在下で、Neuropilin-1及びPlexin-A1を発現する真核細胞とSema3Aポリペプチドとを接触させる工程、
(b)被験物質存在下におけるNeuropilin-1及びPlexin-A1を発現する真核細胞とSema3Aポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルを測定し、被験物質非存在下でのNeuropilin-1及びPlexin-A1を発現する真核細胞とSema3Aポリペプチドとの相互作用から生じるシグナル(対照)と比較する工程、
(c)上記(b)の比較結果に基づいて、対照に比してシグナルを低下させる被験物質を選択する工程、
〔24〕該細胞が樹状細胞である〔23〕記載の方法、
〔25〕該樹状細胞が末梢血から分画されて誘導された細胞である〔23〕又は〔24〕記載の方法、
〔26〕該樹状細胞が細胞株である〔23〕又は〔24〕記載の方法、
〔27〕該シグナルがRhoキナーゼの活性化であることを特徴とする〔23〕から〔26〕に記載の方法、
〔28〕該シグナルがmyosin-IIのリン酸化であることを特徴とする〔23〕から〔26〕に記載の方法、
〔29〕該シグナルがアクトミオシンの収縮であることを特徴とする〔23〕から〔26〕に記載の方法、
〔30〕該シグナルが該樹状細胞のtransmigrationであることを特徴とする〔24〕から〔26〕に記載の方法、
〔31〕Neuropilin-1及びPlexin-A1を発現する樹状細胞内においてRhoキナーゼの活性化を阻害する方法であって、該方法はヒト樹状細胞表面に発現するNeuropilin-1とSema3Aとの結合を阻害することによる方法、
〔32〕Neuropilin-1及びPlexin-A1を発現する樹状細胞内においてmyosin-IIのリン酸化を阻害する方法であって、該方法はヒト樹状細胞表面に発現するNeuropilin-1とSema3Aとの結合を阻害することによる方法、
〔33〕Neuropilin-1及びPlexin-A1を発現する樹状細胞内においてアクトミオシンの収縮を阻害する方法であって、該方法はヒト樹状細胞表面において発現するNeuropilin-1とSema3Aとの結合を阻害することによる方法、
を提供するものである。
NP-1(本明細書においては「NP-1受容体」とも指称され、これらの用語は同義である)、NP-1/Plexin-A1ポリペプチドのようなNP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体、又は、Sema3Aは、抗原内に含まれるエピトープ、ペプチド、またはポリペプチドに結合する抗体を調製するのに使用され得る。特に有用な抗NP-1抗体は、NP-1と「特異的に結合する」。また、特に有用な抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体は、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体と「特異的に結合する」。特に有用な抗Sema3A抗体は、Sema3Aと「特異的に結合する」。以下の2つの特性のうち少なくとも1つを示す場合、特異的に結合するとみなされる:(1)それらが、閾値レベルの結合活性を示す、および(2)それらが、関連するポリペプチド分子と有意に交叉反応しない。
本発明者は、樹状細胞の所属リンパ節への移動に関与するPlexin-A1のヘテロ受容体の一方がNP-1であり、そのリガンドがSema3Aであること、そして、Sema3AリガンドとNP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体のリガンド受容体間複合体が形成されることにより、樹状細胞中においてRhoキナーゼによるmyosin-IIのリン酸化を介したアクトミオシン収縮が生じ、樹状細胞の移動が誘導されることを明らかにした。このように樹状細胞の移動に関与するPlexin-A1を含むヘテロ二量体受容体の他方の受容体がNP-1であること、及び、リガンドがSema3Aであることを明らかにしたことに伴い、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体とSema3Aリガンドを利用して、所属リンパ節において樹状細胞により抗原を提示されて刺激された細胞傷害性T細胞やマクロファージ等をその素因とする細胞性免疫疾患の治療剤として使用され得るモジュレーターをスクリーニングすることが可能となった。
NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体を発現する細胞を用いて本発明のスクリーニングを行う手法としては、具体的には以下に例示される方法が挙げられる。すなわち、Sema3A機能のモジュレーターのうちアンタゴニストをスクリーニングする際には、まず前記の記載に従い、Sema3Aとアルカリフォスファターゼ(AP)との融合ポリペプチドSema3A-APを作製する。他方、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体を細胞表面に発現した形質転換体を作製する。次にこの細胞に対して、(i)Sema3A-APを添加した場合、及び(ii)Sema3A-AP及び被験物質を添加した場合の当該Sema3A-APの細胞への結合性を、アルカリフォスファターゼ活性により検出する。(i)の場合と比較して(ii)の場合の方が、AP活性が低い、又は、検出されない場合は、その被験物質がSema3Aのアンタゴニストであることが示唆される。
前記のNP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体を細胞表面に発現する細胞の代わりにその細胞より調製された細胞膜を用いても、前記1)と同様の手法により、本発明のスクリーニングを行うことができる。この場合は、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体に対する結合性が測定される。
先述の記載に基づき単離精製されたNP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体を用いても、本発明のスクリーニングを行うことができる。この場合も、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体に対する結合性が測定される。
上記のスクリーニング方法のほか、可溶型Neuropilin-1(NP-1)、すなわち、NP-1の細胞外ドメインのうちSema3Aとの結合に必要なドメインを含むポリペプチドを構成成分として含むSema3Aの機能モジュレーターが適宜設計され得る。NP-1の細胞外ドメインのうちSema3Aとの結合に必要なドメインを有するポリペプチドが該機能モジュレーターとして使用され得るが、該ポリペプチドから作成される誘導体も含まれる。
(i)疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(ii)中性の親水性:cys, ser, thr;
(iii)酸性:asp, glu;
(iv)塩基性:asn, gln, his, lys, arg;
(v)鎖配向に影響する残基:gly, pro; 及び
(vi)芳香族:trp, tyr, phe。
本発明はさらに、薬学的に許容される担体、および本明細書において説明するポリペプチドまたは抗体を含む薬学的組成物も含まれ得る。例えば、薬学的組成物は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドが含まれ得る。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナスエキソトキシン、もしくはジフテリア毒素などの毒素;腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、血栓性物質、もしくは抗血管新生物質、例えば、アンギオスタチンもしくはエンドスタチンなどのタンパク質、または、例えば、リンフォカイン、インターロイキン-1(「IL-1」)、インターロイキン-2(「IL-2」)、インターロイキン-4(「IL-4」)、インターロイキン-6(「IL-6」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM-CSF」)、顆粒球コロニー刺激因子(「G-CSF」)、もしくは他の増殖因子などの生体応答調節物質が含まれ得る。
抗NP-1抗体、抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、及び抗Sema3A抗体、並びに、NP-1誘導体は、NP-1、又は、NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体とSema3Aとの結合を阻害し、自己免疫疾患又はアレルギー疾患等の細胞性免疫疾患を治療、予防するのに有用であると考えられる。さらに、本発明の抗NP-1抗体、抗NP-1/Plexin-A1ヘテロ二量体受容体抗体、及び抗Sema3A抗体、並びに、NP-1誘導体のアンタゴニスト活性および結合活性は、樹状細胞中におけるRhoキナーゼ活性測定法、Myosin-IIリン酸化測定法、アクトミオシンの収縮測定法、及び、樹状細胞のtransmigration測定法、並びに、本明細書において説明する他の生物学的アッセイ法において分析することもできる。
より詳細に述べるならば、器官特異自己免疫疾患には、いくつかの形態の貧血(再生不良性貧血、溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血、突発性血小板減少症)、自己免疫性肝炎、虹彩毛様体炎、強膜炎、ブドウ膜炎、精巣炎、特発性血小板減少性紫斑病、バセドー病、橋本甲状腺炎、膵臓のランゲルハンス島のβ細胞が破壊されることにより生じる若年性糖尿病、炎症性腸疾患、副腎皮質の破壊により生じるアジソン病、脱髄性脳炎、多発性硬化症等が含まれる。
本発明が提供するNeuropilin-1-Fc、NP-1中和抗体、Sema3A中和抗体等のNP-1とSema3Aとの結合阻害物質を使用するための組成物および方法が使用され得るアレルギー疾患として、遅延型(IV型ともいわれる)アレルギー疾患が挙げられる。遅延型(IV型ともいわれる)アレルギー疾患には、金属皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、シェーグレン症候群、感染アレルギー、薬剤性肺炎、又は、ギラン・バレー症候群等が含まれる。
アレルギー性接触性皮膚炎は、皮膚と接触する抗原に対するT細胞性免疫反応と定義される。アレルゲン依存性のT細胞応答が、CLA+細胞集団にほとんど限局されているため、CLA+T細胞集団は、皮膚炎の開始に関与していると考えられている(Santamaria-Babi, L.F., et al., J Exp Med(1995)181, 1935を参照せよ)。最近のデータでは、一般的な接触過敏症アレルゲンであるニッケルに応答して増殖し、かつ1型(IFN-γ)サイトカインおよび2型(IL-5)サイトカインの両者を産生するのは、メモリー(CD45RO+)CD4+CLA+T細胞のみであり、CD8+T細胞は該当しないことが判明した。さらに、CD4、CD45RO(メモリー)、またはCD69と組み合わせてCLAを発現する細胞は、ニッケル特異的な刺激の後に増加し、かつ、ケモカイン受容体CXCR3、CCR4、CCR10を発現するが、CCR6は発現しない。Moed H., et al., Br J Dermatol(2004)51, 32を参照せよ。
アトピー性皮膚炎(AD)は、この10年間の間に、発病率が劇的に増加した、慢性的に再発する炎症性皮膚疾患である。臨床的に、ADは、慢性的な再発性経過を示す、著しくそう痒性でしばしば擦りむけた斑および丘疹を特徴とする。ADの診断は、主として、主要な臨床所見および軽微な臨床所見に基づく。Hanifin J.M., Arch Dermatol(1999)135, 1551を参照せよ。組織病理学により、急性病変における海綿状態、過錯角化、および限局的な錯角化が明らかになるのに対し、過錯角化および錯角化、アカントシス/顆粒層肥厚、ならびにリンパ球および大量の肥満細胞による真皮の血管周囲浸潤を伴う著しい表皮過形成は、慢性病変の特徴である。
変形関節炎、関節リウマチ、および傷害が原因で関節炎を起こした関節などを含む関節炎は、抗炎症性の抗体および結合ポリペプチドの治療的使用から利益を受けると思われる一般的な炎症性状態である。例えば、関節リウマチ(RA)は、身体全体に影響を及ぼす全身性疾患であり、関節炎の最も一般的な形態の一つである。これは、疼痛、こわばり、熱感、発赤、および腫脹を引き起こす、関節の内側を覆う膜の炎症を特徴とする。炎症細胞は、硬骨および軟骨を消化し得る酵素を放出する。関節リウマチの結果として、炎症を起こした関節の内層、すなわち滑膜は、硬骨および軟骨に侵入し、かつそれらを損傷して、他の生理的作用に混じって関節の劣化および重度の疼痛をもたらし得る。巻き込まれた関節は、その形状および配列を失って、疼痛および動作低下をもたらし得る。
アメリカ合衆国では、約500,000人の人々が炎症性腸疾患(IBD)に罹患しており、この疾患は、結腸および直腸(潰瘍性結腸炎)、または小腸および大腸の両方(クローン病)のいずれかを冒し得る。これらの疾患の病因は不明であるが、これらは罹患組織の慢性的な炎症を伴う。潰瘍性結腸炎(UC)は、一般に結腸と呼ばれる大腸の炎症性疾患であり、結腸の粘膜または最も内側の壁の炎症および潰瘍を特徴とする。この炎症は、結腸の頻繁な排便を引き起こし、結果として下痢を生じる。症状には、ゆるい大便、ならびに付随する腹部の有痛性痙攣、発熱、および体重減少が含まれる。UCの正確な原因は不明であるが、最近の研究により、身体の天然の防御が、身体が異物であると考える身体中のタンパク質に対抗して作用すると示唆されている(「自己免疫反応」)。おそらく、これらのタンパク質が腸中の細菌タンパク質に似ているため、それらは、結腸の内壁を破壊し始める炎症プロセスを扇動または刺激する可能性がある。結腸の内壁が破壊される間に、潰瘍が形成して、粘液、膿、および血液を放出する。この疾患は、通常、直腸領域で始まり、最終的には大腸全体に拡大し得る。炎症のエピソードが繰り返されると、瘢痕組織によって腸および直腸の壁が肥厚する。結腸組織の死滅または敗血症が、重度の疾患と共に発生し得る。潰瘍性結腸炎の症状の重症度は様々であり、かつ、それらの発症は漸進的または急激であり得る。呼吸器感染症またはストレスを含む多くの因子によって、発病が引き起こされ得る。
乾癬は、700万人を超えるアメリカ人に発症する慢性皮膚病態である。乾癬は、新しい皮膚細胞が異常に増殖した結果、古い皮膚が十分な速さで剥がれ落ちていない、炎症を起こし、隆起し、かつ鱗屑を有する皮膚部分を生じる場合に発生する。最も一般的な型である尋常性乾癬は、銀白の鱗屑で覆われた、皮膚の炎症部分(「病変」)を特徴とする。乾癬は、少数のプラークに限定されるか、または中程度から広範囲の皮膚領域を含む場合があり、頭皮、膝、肘、および胴に最も一般的に現れる。極めて目立つが、乾癬は、接触感染性疾患ではない。これらの疾患の病因は、罹患組織の慢性的な炎症に関係する。本発明のNP-1とSema3Aとの結合阻害物質は、乾癬、他の炎症性皮膚疾患、皮膚アレルギーおよび粘膜アレルギー、ならびに関連した疾患における炎症および病理学的作用を減少させる有益な治療物質としての機能を果たす可能性がある。
全身性エリテマトーデス(SLE)は、遍在する自己抗原を対象とする慢性的なIgG抗体(例えば抗dsDNA)産生を特徴とする、免疫複合体に関連した障害である。SLEの作用は、特定の器官に限局されるのではなく、全身性である。多数の染色体座位がこの疾患に関係付けられており、かつ、抗dsDNA抗体および糸球体腎炎など、疾患の様々な局面をもたらしている可能性がある。CD4+T細胞は、SLEのマウスモデルにおいて活動的な役割を果たすことが示されている(Horwitz, Lupus(2001)10, 319-20、Yellin及びThienel, Curr. Rheumatol. Rep.(2000)2, 24-37)。CD8+T細胞の役割は、明瞭に定義されていないが、狼瘡患者において「サプレッサー」CD8+T細胞機能が障害されていることを示唆する証拠がある(Filaci et al., J. Immunol.(2001) 166, 6452-7、Sakane et al, J. Immunol.(1986)137, 3809-13)。
方法
マウス
C57BL/6をバックグラウンドとするPlexin-A1-/-,Sema3K-/-,Sema6c-/-およびNP-1ノックインマウスは、先に樹立されたものである。OT-IITgマウスはW.R.Heath氏より提供された。
骨髄由来樹状細胞(BMDC)は、先に記載したようにして、骨髄細胞をGM-CSFとともに6から8日間培養することにより生成した。SVEC4-10(マウスリンパ管内皮細胞株、ATCCより)を10%FCSを含むDMEM培地で培養した。ヒトリンパ管微小血管内皮細胞(HMVEC-dLy,Lonza)は、EndothelialCellMediumBulletKit(Lonza)中で培養した。
以下の試薬を用いた:LPS,オキサゾロン(Oxazolone)(4-エトキシメチレン-2フェニル-2-オキサゾリン-5-オン),FITC-アイソマー,ブレビスタチン(Blebbistatin),ML-7(Sigma),Y-27632(Carbiochem),コラゲナーゼ-D(Roche),カルセイン-AM,CFSE(5-(および-6)-カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル),CMFDA(5-クロロメチルフルオレセインジアセテート),CMTMR(5-(および-6)-(((4-クロロメチル)ベンゾイル)アミノ)テトラメチルローダミン),ファロイジン-488,ファロイジン-546(Invitrogen),組換えヒトSema3A-Fc,マウスGM-CSF,マウスCCL19,マウスCCL21(R&D),マウスCXCL12,マウスTNFα(PeproTech)およびマウスCD40(HM40-3)(BDbioscience)。免疫組織化学実験には以下の抗体を用いた:ウサギ抗-MLC,ウサギ抗リン酸化MLC(CellSignalingTechnologies),マウス抗-B-アクチン(Sigma),ウサギ抗Plexin-A1(YoshidaYより譲渡),ビオチン化抗マウスLYVE-1(R&D),Cy3-抗ウサギIgG(Jackson),ECL-抗ウサギIgG-POD,ECL-抗マウスIgG-POD,ストレプトアビジン-POD(GEHealthcare)。フローサイトメトリ用には、FITC/APC-抗-CD4(GK1.5)(eBioscience),APC-Cy7-抗-CD8a(53-6.7),PE-抗-B220(RA3-6B2),FITC/APC-抗-CD11c(HL3),FITC/PE-抗-I-Ab(25-9-17),(BDbioscience),Alexa647-抗-CCR7(4BI2)(Biolegend),Alexa647-抗CXCR4,抗-マウスCD49a(HA31/8),抗-マウスCD49e(5H10-27)(BDbioscience),抗-マウスCD11a(M17/4),抗-マウスCD51(RMV-7)(eBioscience),抗-マウスVLA-l(MAB1997)(Chemicon),抗-マウスCD18(M18/2)および抗-マウスCD61(2C9,G2)(eBioscience)を細胞染色に用いた。抗Sema6DmAb(natsuclone)は、Sema6D欠損マウスを組換えSema6D-Fc蛋白質で免疫することにより樹立した。
CFSE-希釈アッセイ用には、OT-IIマウスから単離したCD4+T細胞をCFSEで標識した(LyonsandParich,J.ImmunolMethods1994)。簡単には、107個/mlの細胞をPBS(pH7.4)中1μMのCFSEとともに10分間インキュベーションした。2x106個の細胞をレシピエントマウスの静脈内に移入した。2時間後、完全フロインドアジュバント(CFA)中のOVA(GradeVI,Sigma)を後足蹠の皮下に注射してマウスを免疫した。マウスは72時間後に犠牲死させた。流入領域リンパ節における抗原特異的T細胞の増殖性応答は、フローサイトメトリにより分析し、これはCFSE蛍光強度の希釈により示した。
BMDCをPBS中5μMのCFSEで室温で10分間標識しし、PBSでよく洗浄した。50μlのPBS中の1x106個のDCをレシピエントマウスの後足蹠の皮下に注射した。注射の24から48時間後に膝窩リンパ節を採取し、1mg/mlコラゲナーゼDで37℃で30分間処理し、細胞を計数し、フローサイトメトリにより分析した。移動した樹状細胞のパーセンテージは、総リンパ節細胞に対する蛍光樹状細胞の比率に対応する。
BMDC(1x106)をOT-IIペプチドでパルスし,5μMのCMTMRで標識し、野生型レシピエントマウスの後足蹠に注射した。樹状細胞の移入の18時間後、5μMのCMFDAで標識した2x107個のOT-IITgマウス由来CD4+T-細胞を静脈内に移入した。1時間において、抗CD62L抗体を投与して、新たなT細胞がHEVを通ってリンパ節に流入することをブロックした。10時間後、膝窩リンパ節を切除し95%O2/5%CO2でバブリングした洗浄培地(superfusedmedium)中で37℃で維持した。CMFDAおよびCMTMRの二光子励起および第二高調波発生用には、MaiTaiTi:sapphireレーザー(Spectra-Physics,MountainView,CA)を875nmに調整した。細胞移動の四次元分析のためには、5μmのzをもつ7個のx-y切片のスペーディングを30秒ごとに取得して、30分間で深さ30μmの体積のイメージを生成した。3つの蛍光チャネルは、440,510および560nmの二色ミラーを、400/40(第二高調波シグナル),535/26(CMFDA)または600/100(CMTMR)nmの帯域通過フィルターと組み合わせて用いて分離し、0.8NA40xの浸水対物レンズを用いてノンデスキャン検出器で検出した。
担体溶液(1:1v/vアセトン:ジブチルフタレート)中の50μlの2mg/mlFITCを剃った肩の上に適用することにより、インビボで表皮樹状細胞の移出を誘導した。対照動物には、同じ量のFITCなしの担体溶液を与えた。24および48時間後にマウスを犠牲死させ、上腕リンパ節を切除し、CD11c+FITC+樹状細胞の頻度をフローサイトメトリにより評価した。上腕リンパ節に移動した内因性のDCの数は次の計算により分析した:(内因性樹状細胞の数)=(合計細胞数)x(CD11c+FITC+細胞の%)。
未コーティングトランスウエル(孔径,5.0μm;Corning)を、のCCL21またはCXCL12を含むRPMl中0.1%BSA0.6mlの入った24ウエルプレートに入れた。0.1ml溶液中1x105個の樹状細胞をトランスウエルの上部ウエルに加え、37℃で3時間インキュベーションした。下部チャンバ中の細胞を5mMPBS-EDTAで5分間で剥離し、Guavaにより計数した。インビトロ移動アッセイのためには、フィブロネクチン(10mg/ml),タイプ1コラーゲン(3.0mg/ml)またはリンパ管内皮細胞を、上部チャンバの膜上に重層した。簡単には、2x104個のSVEC4-10またはHMVEC-dLyの細胞を、2μg/mlのフィブロネクチンでコーティングしたトランスウエル挿入物の上部または下部表面に播種した。2日間培養した後、コンフルエントの層の一体性をファロイジン染色により調べた。移動アッセイは6時間行った。樹状細胞におけるミオシンIIおよびRhoの活性の阻害は、50μMのブレビスタチン(Sigma)および30μMのY-27632(Calbiochem)で37℃で30分間処理することにより行った。
末梢からの樹状細胞の流出を観察するために、腹部にオキサゾロンを適用することにより接触過敏性を誘導した。感作の6日後,オキサゾロンを耳に適用した。チャレンジの8時間後、106個のCMFDA標識BMDCを皮膚から注射した。24時間後、動物を犠牲死させ、耳の組織をパラホルムアルデヒドで固定した。ビオチン化抗LYVE-1+ストレプトアビジン-Cy3を用いてホールマウント染色を行ってリンパ管を検出し、画像は共焦点z-スタックイメージングにより取得し、末梢に保持された細胞の数を計数した。
Zigmondチャンバにおける樹状細胞の走化性を分析するため,LPSで処理した樹状細胞をフィブロネクチンコーティング(2ug/ml)カバースリップに30分間接着させた。次に、これをZigmondチャンバに入れ、溶液(0.1%BSA含有RPMI)のアリコート(0.1ml)をチャンバの片側に加え、CCL21(5ug/ml)を含む同じ溶液を反対側に加えた。画像は、温度,湿度およびCO2についての環境チャンバを備えた倒立共焦点顕微鏡(LSM5エキサイタ、HAL100,Zeiss)により、30秒ごとに記録した。イメージングには、ZeissEC-planNeofluar20x対物レンズ(0.5NA)を用いた。
LPS(500ng/ml)で12時間処理した骨髄由来樹状細胞を、2%FCSおよび対照IgG(5ug/ml)またはSema3A-Fc(5ug/ml)を含むタイプIコラーゲン(3mg/ml)(BDbioscience)に懸濁し、Zygmondチャンバの片側にキャスティングして、ステージをゲルで覆い、37℃で30分間インキュベーションして重合させた。次に、0.5%BSAおよびCCL21(5ug/ml)を含むRPMIを反対側に加えた。20分間インキュベーションした後、上述したようにして、共焦点低速度撮影ビデオ顕微鏡記録計を用いて樹状細胞の運動を1分間隔で取得した。
コラーゲンマトリクス中における樹状細胞の速度を比較するため、MetamorphオフラインソフトウエアであるTrack-pointまたはImageJManualTrackingPluginを用いて、ランダムサンプルの単一細胞の手動追跡を行った。細胞は2時間追跡した。速度および方向のパラメータを計算し、得られたデータを走化性について分析することによりプロットして可視化した。休止部分を除くことにより、移動の平均速度および瞬間速度を計算した。
1x104個のBMDCを正常ヒト皮膚リンパ管微小血管内皮細胞(HMVEC-dLy)に由来する内皮細胞単層に加えた。30分間インキュベーションした後、温度,湿度およびCO2用の環境チャンバを備えた倒立共焦点顕微鏡(LSM5エキサイタ、HAL100,Zeiss)で、30秒ごとに画像を記録した。イメージングにはZeissEC-planNeofluar20x対物レンズ(0.5NA)を用いた。3D立体イメージング用には、1x104個のCFSE標識BMDCをHMVEC-dLyの内皮細胞単層に加えた。45分間インキュベーションした後、細胞を4%PFAで固定し、ファロイジン-Alexa546で染色した。
RT-PCR分析用には、未成熟骨髄由来樹状細胞,成熟樹状細胞(CD40;1ug/ml,TNFa;50ng/ml),SVEC4-10およびHMVEC-dLyから、RNeasykits(Qiagen)を用いてRNAを単離し、DNaseI(Invitrogen)で処理してゲノムDNAを除去した。cDNAsはSuperScriptIIcDNAsynthesiskit(Invitrogen)を用いて合成した。
フィブロネクチン,ラミニン,I型コラーゲン,IV型コラーゲン,ポリ-L-リジン(PLL)でコーティングした96ウエルディッシュ(BDbioscience)をRPMI中0.5%BSAで30分間ブロッキングした。1μMのCaIcein-AMで標識した5x104個のBMDCを各ウエルに入れた。37℃で30分間インキュベーションした後、プレートを1100rpmで15秒間振盪しPBSで3回洗浄した。細胞をPBS中0.2%triton-Xで可溶化し、Arvo(PerkinEImer)を用いて460nmの蛍光強度を測定した。加えた細胞の総量の細胞溶解物の吸光度を100%とした。樹状細胞の内皮細胞への接着活性については、1μMのCalcein-AMで標識した1x105個のBMDCを24ウエルプレート中の内皮細胞単層に加えた。37℃で30分間インキュベーションした後、細胞を4%PFAで固定し、よく洗浄した。画像は、蛍光顕微鏡(NikoneclipseTE2000-E)により、NikonPlanFluor10xDIC対物レンズ(NA0.3)を用いて取得し、NIS-elementsAR3.0ソフトウエアにより接着した細胞の数を計数した。
LPS処理BMDC(2x104)をフィブロネクチンでコーティングしたガラス(10ug/ml)に37℃で30分間接着させた。非接着細胞を除去した後、樹状細胞をSema3A-Fc(5ug/ml)または対照IgG(5ug/ml)とともに10分間インキュベーションし、4%PFAで4℃で30分間固定し、ブロッキング溶液(30%正常ヤギ血清、PBS中、2%BSAを含有)とともに1時間インキュベーションし、ウサギ抗Plexin-A1またはウサギ抗pMLCと、抗ウサギCy3,ファロイジン-Alexa488で一晩染色した。画像は共焦点Z-スタックイメージング(0.5μm間隔)により、ZeissPlan-Apochromat63xoilDIC対物レンズ(1.4NA)を用いて、倒立顕微鏡(LSM5exciter,Zeiss)で取得した。
BMDCは、Sema6D-Fc(5μg/ml)および対照IgG(5μg/ml)でコーティングしたプレートで、LPS(200ng/ml)ありまたはなしで、培養した。48時間インキュベーションした後、培養上清を単離し、ELISAによりTNFαおよびpro-MMP9(R&D)をアッセイした。
8週齢の炎症を生じていないマウスから、頸部、上腕部,中心部,鼡径部および膝窩部のリンパ節を単離し、400μ/mlのコラゲナーゼDを含むHANKSで37℃で30分間消化し、消化した組織から単一細胞懸濁物を調整し,CD11c,B220,CD4,CD8a,I-Abに対する抗体で染色し、次にCD11c+B220-の集団についてゲート設定した後にフローサイトメトリで分析した。
データが基準を満たすことを確認した後に、スチューデントt検定および一元ANOVAを実施した。他の場合にはマンホィットニーU検定を行った。ANOVAが有意である場合には、事後分析としてTukey検定を用いた。分析はStatce12を用いて行った。
Plexin-A1-/-マウスにおける流入領域リンパ節への樹状細胞移動の低下
我々は先に、Plexin-A1-/-マウスが非常に低下した抗原特異的T細胞生成を示すことを報告した。しかし、Plexin-A1がどのようにして抗原特異的T細胞プライミングに関与しているかは不明であった。このメカニズムをさらに詳細に調べるため、野生型およびPlexin-A1-/-マウスにおいてOT-ll細胞を活性化した。野生型レシピエントマウスにおいては、OVAペプチドをCFAとともに皮下に適用した後、CFSEで標識したOT-ll細胞はよく増殖した(図1A)。これに対し,OT-llT-細胞をPlexin-A1-/-レシピエントマウスに移入した場合には、抗原特異的増殖応答が著しく低下した(図1A)。このことから、抗原特異的T細胞応答におけるPlexin-A1の重要性が確認された。
末梢組織からリンパ管への樹状細胞輸送に関しては、いくつかの順番の段階があり、これには、抗原取り込み、ケモカインに応答したリンパ管への間質性移動、およびリンパ管を通過する過程が含まれる。いずれの段階でPlexin-A1が必要であるかを決定するために、それぞれの移動段階を詳細に調べた。抗原取り込みに関しては、野生型とPlexin-A1-/-樹状細胞との間で有意な相違は認められなかった(図6A)。さらに、トランスウエルアッセイにおいては、樹状細胞がCCL19,CCL21またはCXCL12のいずれかに応答して移動する能力(図6B)、およびZygmondチャンバを用いる二次元アッセイにおいて、ケモカイン勾配における樹状細胞の感受性の方向(図6C)には相違がなかった。これらの知見と一致して、野生型とPlexin-A1-/-樹状細胞との間ではCCR7およびCXCR4の発現レベルは同程度であった(図6D)。
Plexin-A1は、2つのタイプのセマフォリン、すなわち、分泌性クラスIIIセマフォリンであるSema3AおよびクラスVI貫膜セマフォリンであるSema6CおよびSema6Dに対する受容体成分である。したがって、Plexin-A1-/-樹状細胞における欠損はいずれの相互作用が原因であるかを判定することとした。最初に、これらの分子の樹状細胞およびリンパ管における発現プロファイルを調べた。Sema3A受容体成分であるNP-1およびPlexin-A1、ならびにSema6Dは樹状細胞で発現されていたが、Sema3AおよびSema6Cはリンパ管で発現されていた(図8)。発現プロファイルに基づいて、樹状細胞の移動にはいずれのモードが不可欠であるかを明らかにするために、養子導入アッセイを行った。Sema3A結合部位が欠損しているNP-1sema-ノックインマウスからの樹状細胞を野生型レシピエントマウスに移入した場合には、流入領域リンパ節への移動が低下していた(図3A)。これに対し、Sema6D-/-マウス(図9)からの樹状細胞は、野生型マウスからのものと同程度の移動活性を示した(図3A)。これらの結果は、樹状細胞輸送には樹状細胞におけるNP-1-発現が必要であることを示唆する。
(A)Plexin-A1-/-マウスにおける抗原特異的T細胞の生成の低下
CFSEで標識したOT-IICD4+T-細胞を野生型(+/+)またはPlexin-A1-/-(-/-)マウスの静脈内に移入し、次にCFA中のOVA-ペプチドを足蹠の皮下に注射した。72時間後、CFSEの希釈によって抗原特異的T細胞応答を測定した。各実験について示されるデータは、3回の独立した実験の代表例である。
(B)Plexin-A1-/-樹状細胞における、流入領域リンパ節への樹状細胞輸送の低下
CMTMRで標識した野生型(+/+)またはPlexin-A1-/-(-/-)マウス由来のBMDCを野生型レシピエントマウスの足蹠に注射し、このマウスにCMFDA-標識CD4+OT-IIT-細胞(緑)を移入した。注射の24時間後、二光子顕微鏡で膝窩リンパ節への樹状細胞輸送を観察した。
(C)Plexin-A1-/-マウスにおける、移動した樹状細胞の数の低下
野生型(白棒)またはPlexin-A1-/-(黒棒)マウスからのCFSE標識BMDCを野生型レシピエントマウスの足蹠に注射した。膝窩リンパ節への樹状細胞輸送の数は、下記の式により分析した:(流入細胞の%)=(総細胞数)x(CFSE+細胞の%)/(流入細胞数)
平均+/-SD,**p<0.01,***p<0.001,マンホイットニーU検定
(D)Plexin-A1-/-マウスにおける内因性樹状細胞の移動活性の低下
野生型(白棒)およびPlexin-A1-/-(黒棒)マウスの剃った肩にFITCアイソマーをペイントした。示される時点で、上腕リンパ節から細胞を単離し、CD11c+FITC+細胞を数えた。
(A)Plexin-A1-/-マウスにおける、リンパ管に沿った樹状細胞の保持
予めオキサゾロンを注射して感作したマウスの耳組織に、野生型(+/+)またはPlexin-A1-/-(-/-)マウスからのCFSE標識骨髄樹状細胞(緑)を皮内注射した。24時間後、耳を切除し、ストレプトアビジン-Cy3(赤)をもつビオチン化抗LYVE-1抗体を用いてホールマウント染色を行い(上)、視野中の残留樹状細胞を計数した(下)。***p<0.001、マンホイットニーU検定
(B)Plexin-A1-/-樹状細胞における樹状細胞のリンパ管内皮細胞単層を通過する能力の低下
野生型(+/+)またはPlexin-A1-/-(-/-)マウスに由来するBMDCをリンパ管内皮細胞単層に適用し、樹状細胞とリンパ管内皮細胞との間の相互作用を、低速度ビデオ顕微鏡記録器により30秒ごとに記録した。黄色の点線は内皮細胞の細胞結合部を示す。白色はリンパ管内皮細胞と接触している樹状細胞を示す。赤色は野生型樹状細胞において観察された移動プロセスを示す。
(C)Plexin-A1-/-樹状細胞における移動能力の低下
CFSE標識樹状細胞を内皮細胞単層に適用し、45分間インキュベーションし、固定し、Alexa-546コンジュゲート化ファロイジンで染色した。共焦点顕微鏡画像は、0.22μmの光学切片距離(z-間隔)で取得した。野生型樹状細胞は先端から基底レベルに侵入したが、Plexin-A1-/-樹状細胞は基底レベルに到達できなかった(左)。樹状細胞移動の定量(右)。リンパ管内皮細胞単層に付着した樹状細胞の数(白棒)、およびリンパ管内皮細胞単層を越えて移動した樹状細胞の数(黒棒)を、共焦点顕微鏡により測定した。総樹状細胞に対する移動した樹状細胞のパーセンテージを計算した。平均+/-SD、***p<0.001、スチューデントt検定
(D)Plexin-A1-/-樹状細胞における、リンパ管内皮細胞単層を通過する際のケモカイン誘導性移動能力の低下
野生型(白棒)またはPlexin-A1-/-(黒棒)マウスからの樹状細胞を、リンパ管内皮細胞を重層したトランスウエル(孔径:5μm)の上部チャンバに適用し、CCL21に応答した走化性を測定した。平均+/-SD、***p<0.001、スチューデントt検定
(A)樹状細胞中で発現されたNP-1は樹状細胞移動を担う
野生型(白棒)およびNP-1-ノックイン(Sema3A結合部位が破壊されている)またはSema6D-/-(黒棒)マウスからの樹状細胞を、野生型レシピエントマウスに養子導入した。NP-1-/-ノックインマウスからの樹状細胞のみが樹状細胞移動の低下を示した。平均+/-SE,*p<0.05,マンホイットニーU検定
(B)リンパ管で発現したSema3Aは、樹状細胞移動を担う
野生型マウスからの樹状細胞を、野生型(+/+)およびSema3A-/-,Sema6C-/-またはSeiha6D-/-(-/-)マウスに養子導入した。Sema3A-/-レシピエントマウスのみが樹状細胞移動の低下を示した。データは3回の独立した実験から得た。標準誤差+/-95%信頼区間,**p<0.01,マンホイットニーU検定
(C)Plexin-A1-/-樹状細胞の場合と同様に、樹状細胞におけるNP-1の異常は移動の低下を示したがSema6Dは示さなかった
上述したように、野生型(白棒)およびNP-1ノックインまたはSema6D-/-(黒棒)マウスに由来する樹状細胞を、リンパ管内皮細胞を重層したトランスウエル(孔径5μm)の上部チャンバに適用し、CCL21に応答した走化性を測定した。平均+/-SD,**p<0.01,スチューデントt検定
(D)Sema3A-/-およびNP-1-ノックインマウスではT細胞刺激の低下が認められたが、Sema6C-/-およびSema6D-/-マウスでは見られなかった
抗原特異的T細胞刺激を調べるために,Sema3A-/-,NP-1-ノックイン,Sema6C-/-,Sema6D-/-(黒丸)および野生型(白丸)マウスをCFA中KLHで免疫し、KLHに対するCD4+T細胞応答をインビトロで調べた。平均+/-SD.**p<0.01,***p<0.001,スチューデントt検定
(A)Plexin-A1は樹状細胞の後端に局在している
樹状細胞を固定し、Alexa488コンジュゲート化ファロイジン(緑)および抗Plexin-A1ポリクローナル抗体+抗ウサギIgG-Cy3(赤)で染色した。スケールバー,10μm(上パネル)。Plexin-A1およびF-アクチンの局在は上パネルに示される細胞の蛍光強度を測定することにより定量した(下パネル)。共局在していない細胞のパーセンテージを示す(右パネル)。データは3回の独立した実験の代表例である。
(B)Sema3Aはケモカインに応答した樹状細胞の移動を増強する(左および中)
樹状細胞移動アッセイを行った。下部チャンバのCCL21の存在下で、組換えSema3A蛋白質を下部(左)または上部(中)チャンバに適用した。平均+/-SD.**p<0.01,両側スチューデントt検定
(右)組換えSema3A(黒棒、黒丸)または対照IgG(白棒、白丸)をCCL21の反対側に適用して、EZ-taxiscanを用いた二次元樹状細胞走化性アッセイを行った。移動性画分の樹状細胞の瞬間速度はMetaMorphソフトウエアにより分析した(右パネル)。***p<0.001,マンホイットニーU検定。データは3回の独立した実験の代表例である。
(C)Sema3AはMLCのリン酸化を誘導する。フィブロネクチンでコーティングしたガラス上の樹状細胞を5μg/mlのhIgG(左パネル)またはSema3A-Fc(右パネル)で処理した。10分後,細胞を固定し、抗pMLC抗体+抗ウサギIgG-Cy3(下)で染色した。共焦点顕微鏡による画像は0.2μmの光学切片距離(z-間隔)での8個のz-スタック画像からなり、z-スタック画像を1つの画像に投影した。スケールバー,10μm
(D)Sema3Aは3D-コラーゲンマトリクス中の樹状細胞移動の速度を促進する
Sema3Aの存在下または非存在下でケモカインに応答した単一の樹状細胞のタイプIコラーゲンマトリクスにおける速度を低速度顕微鏡イメージングにより分析し、単一の樹状細胞の速度をMetaMorphソフトウエアにより決定した。細胞の平均速度(左パネル)(n=64)および瞬間速度の分布(右パネル)。***p<0.001、マンホイットニーU検定。データは、3回の独立した実験の代表例である。
(E)組換えSema3Aは樹状細胞移動を促進し,これはミオシンII活性をブロックすることにより消失する
50μMのブレビスタチンまたは30μMのY-27632で37℃で30分間処理したBMDCを、3mg/mlのタイプ1コラーゲン(左パネル)およびHMVEC-dLy単層(右パネル)を重層したトランスウエル(孔径:5μm)の上部チャンバに適用し、上部チャンバにおいて、Sema3Aの存在下または非存在下におけるCCL21に応答した走化性を測定した。群間の全体的な相違は一元ANOVAにより判定した。事後的多重比較は、Tukey検定を用いて行った。*p<0.05,**p<0.01
(A)野生型(+/+)およびPlexin-A1-/-(-/-)マウスの後足蹠にCFA中100μgのキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を注射することによりマウスを免疫した。免疫の5日後、流入領域リンパ節から単離したCD4+T-細胞を、種々の濃度のKLHおよび照射したAPCで72時間刺激した。増殖アッセイ用に、最後の14時間に、2μCiの3H-チミジンで細胞をパルスした。IL-2,IFNγおよびIL-17の分泌は、CytokinePlex(BioRad)で測定した。平均+/-SD、*p<0.05,**p<0.01および***p<0.001、両側スチューデントt検定
(B)T細胞領域では移動した樹状細胞はほとんど見られなかった
野生型(+/+)またはPlexin-A1-/-(-/-)マウスからのCFSE標識樹状細胞を移入した24時間後に、膝窩リンパ節を単離し、フィコエリスリン(PE)-コンジュゲート化抗B220で染色した。移動した樹状細胞の局在は、蛍光顕微鏡により観察した。スケールバーは100μmを示す。
(C)Plexin-A1-/-マウスにおける、定常状態皮膚流入領域リンパ節における移動性樹状細胞サブセット数の低下
8週齢の非炎症性野生型マウス(白棒)またはPlexin-A1-/-マウス(黒棒)(n=4)から皮膚流入領域リンパ節を単離した。単一細胞懸濁物をCD11c,B220,CD4,CD8a,I-Ab,に対する抗体で染色し、CD11c+B220-集団についてゲート設定した後、フローサイトメトリで分析した。平均+/-S.E.M.*p<0.05、両側スチューデントt検定
(A)Plexin-A1-/-樹状細胞は、野生型樹状細胞と同じ程度に抗原を取り込んだ。野生型マウス(白丸)またはPlexin-A1-/-マウス(黒丸)からのBMDCをAPC抗CD11cで染色し、FITC-デキストランとともにt37℃で示される時間培養した(太線)。CD11c+細胞に対するFL1蛍光陽性細胞の割合をフローサイトメトリにより分析した。氷上でFITCデキストランとともに培養した細胞を対照として用いた。
(B)トランスウエルアッセイにおけるケモカインに対する正常な応答
野生型(白棒)またはPlexin-A1-/-(黒棒)マウスに由来する樹状細胞をBoydenチャンバ(孔径5μm)の上部チャンバに加え、CCL21,CCL19またはCXCL12に応答して下部チャンバに移動した樹状細胞の数を計数した。
(C)ケモカインに応答した樹状細胞の正常な方向のセンシング
野生型(+/+)またはPlexin-A1(-/-)(-/-)マウスからの樹状細胞を、フィブロネクチンでコーティングしたカバースリップに接着させ、ZigmondチャンバのCCL21勾配中に置いた。樹状細胞輸送は、共焦点低速度ビデオ顕微鏡記録計により30秒ごとに記録した。画像はNIBImageJソフトウエアにより分析した。スキャッタープロットは、CCL21勾配中で60分間移動の後の、野生型(+/+)およびPlexin-A1-/-(-/-)樹状細胞の位置を元の位置に対して示す。CCL21起源に向かって30度の円弧の内部で止まった細胞のパーセンテージを示す。
(D)CCR7およびCXCR4の発現レベルの比較
野生型(+/+,黒線)またはPlexin-A1-/-(-/-,赤線)マウス、およびアイソタイプ対照(灰色領域)からの樹状細胞におけるCCR7およびCXCR4の発現をフローサイトメトリにより測定した。
野生型(+/+)およびPlexin-A1-/-(-/-)マウスに由来するBMDCをCFSE(緑)で標識し、HMVEC-dLy単層に適用した。45分間インキュベーションした後、パラホルムアルデヒドで固定し、Alexa-546コンジュゲート化ファロイジン(赤)で染色した。共焦点顕微鏡画像は0.2μmの光学切片距離(z-間隔)で取得した。スケールバーは10μmを示す。
樹状細胞およびリンパ管におけるPlexin-A1関連遺伝子の発現をRT-PCRにより測定した。G3PDHの発現を測定して対照とした。
(A)Sema6D遺伝子の破壊
野生型Sema6Dアレル(上),Sema6D標的化コンストラクト(中)および得られたSema6D標的化アレル(下)の遺伝子構造を示す。黒ボックスはエクソンを示す。開始コドンを含む0.6-kbのフラグメントをNeoで置き換えた。ランダム・インテグレーションに対する選択を可能とするため、HSV-TK遺伝子を付加した。E,EcoRl.
(B)ゲノムPCR分析
野生型(+/+),ヘテロ接合体(+/-)およびホモ接合体(-/-)変異体マウスの尾部から単離したゲノムDNAを、示されるプライマー(矢印)を用いてPCRにより評価した。0.7kbpのフラグメントは野生型アレルを表し、1.3kbpのフラグメントは標的化アレルを表す。
(C)RT-PCR分析
脾臓から単離したcDNAを用いてRT-PCRを行い、Sema6D遺伝子の発現を測定した。
(D)野生型(+/+)およびホモ接合体(-/-)マウスからのBMDCを、フィコエリスリンとコンジュゲート化した抗CD11cおよびビオチン化抗Sema6DmAb(実線)またはアイソタイプのマッチした対照(点線)+アロフィコシアニンとコンジュゲート化したストレプトアビジンで染色した。フローサイトメトリにより、CD11c陽性細胞にゲート設定してSema6D発現を調べた。
(A)強度の値の範囲を示す3次元表面グラフの二次元描写の等高線画像
フィブロネクチンでコーティングしたガラス上のBMDCを5μg/mlのヒトIgG(下パネル)または組換えSema3A-Fc蛋白質(上パネル)で37℃で10分間刺激した。細胞を固定した後、ウサギ抗pMLC+抗ウサギCy3で染色した。画像は、共焦点顕微鏡により、0.2μmの光学切片距離(z-間隔)の8個のz-スタックイメージから取得し、z-スタック画像を1つの画像に投影し、これは3D表面のグラフを単一の値の範囲が示される2Dグラフィックで描写したものである。
(B)hIgG(白棒,白丸)またはSema3A-Fc(黒棒,黒丸)で刺激した樹状細胞の樹状突起の領域における、平均強度の頻度の分布(左軸)または蓄積された割合のパーセンテージ(右軸)。(n=80)、p<0.001,マンホイットニーU検定。データは3回の独立した実験の代表例である。
(A,B)細胞外マトリクス(A)および内皮細胞(B)に対する接着活性は、野生型とPlexin-A1-/-の樹状細胞で同程度であった。
(A)野生型(白棒)およびPlexin-A1-/-(黒棒)マウスに由来するCalcein-AM標識BMDCを、示されるように、細胞外マトリクスをコーティングしたプレート(BDbioscience)に適用した。30分間インキュベーションした後、非接着細胞を十分に除去し、接着細胞を100μlの0.2%TritonXを含む溶解バッファで可溶化し、吸光度計を用いて吸光度460nmの蛍光吸収を定量した。値は総入力細胞抽出物の蛍光吸収に対するパーセンテージとして示す。
(B)野生型(白棒)およびPlexin-A1-/-(黒棒)マウスに由来する1x105個のCalcein-AM標識BMDCをリンパ管内皮細胞(SVEC4-10)の単層に適用した。30分間インキュベーションした後、細胞を4%PFAで20分間固定し、十分に洗浄した。値は、蛍光顕微鏡の観察視野において内皮細胞に接着した細胞の数として示す。細胞は、NIS-elementsAR3.0ソフトウエアにより計数した。
(C)インテグリンの発現レベルは、野生型とPlexin-A1-/-の樹状細胞との間で相違しなかった。野生型(黒線)およびPlexin-A1-/-(赤線)マウスに由来するBMDCを、CD11c-FITCおよびビオチン化抗インテグリン抗体+APCとコンジュゲート化したストレプトアビジンで染色した。発現レベルはフローサイトメトリにより測定した。
(D,E)TNFαおよびpro-MMP9の分泌レベルは野生型とPlexin-A1-/-の樹状細胞で相違しなかった。野生型(白棒)およびPlexin-A1-/-(黒棒)マウスに由来するBMDCをLPSおよび5μg/mlのプレートにコーティングしたhIgGまたは組換えSema6D-Fcとともに48時間培養した。pro-MMP9(D)およびTNFα(E)の濃度はELISAにより測定した。
接触性皮膚炎は、ジニトロフルオロベンゼン(DNFB)およびオキサゾロンを含む様々な接触アレルゲンを用いて、マウスにおいて誘発することができる。アセトンおよびオリーブ油からなるビヒクル中のアレルゲンでマウスを局所的に感作し、次いで、オリーブ油のみに溶かしたアレルゲンを耳に攻撃接種する。耳の厚さの変化は、アレルゲンに対する免疫応答の尺度である。感作期(0日目~5日目)に、または攻撃接種期(5日目~6日目)の間にNeuropilin-1-Fcを投与する。Neuropilin-1-Fcによって耳の厚さの抑制を観察することにより、接触性皮膚炎を抑制する際のNeuropilin-1-Fcの役割が認められ得るだろう。
生体内での細胞遊走におけるPlexin-A1の役割を評価するために、オキサゾロンによって処置されたマウスの真皮内に野生型、又は、Plexin-A1のノックアウトマウスから採取して、CFSEによって標識された樹状細胞が養子移入された。その後、移入された樹状細胞の動態が観察された。
感作されたマウスの耳組織中の皮内に移入されたCFSE標識された野生型及びPlexin-A1が欠損された骨髄由来の樹状細胞の共焦点Zスタック画像分析を示す。樹状細胞を移入してから24時間後に、ビオチン化抗LYVE-1抗体とストレプトアビジン-インドカルボシアニン(赤)を用いて全載標本が染色され評価された。計測バーは50μmを表す。
図12a-1で示される視野中に留まる樹状細胞の定量化を表すグラフである。個々の記号は個々の視野を表し、赤い丸は平均値を表す。*P値は0.001より小さい(Mann-Whitney Uテスト)。
野生型及びPlexin-A1が欠損された骨髄由来の樹状細胞のリンパ管内皮細胞の単一層を超えた遊走を、低速度撮影のビデオ顕微鏡によって相互作用として30秒毎に記録し評価した図である。黄色の破線は内皮細胞の接合部を示し、白色の矢印はリンパ管内皮細胞と接触している樹状細胞を表す。赤色の矢印は野生型樹状細胞の遊走経過を示す。計測バーは50μmを表す。
野生型及びPlexin-A1が欠損された骨髄由来の樹状細胞が、内皮細胞単一層に添加され45分間インキュベートされ、固定化された後にAlexa Fluor 546結合ファロイジン(phalloidin)を用いて染色された共焦点顕微像を示す。画像は0.22μmの光学切片分離(z間隔)を用いて得られた。
総樹状細胞数に対する移動した樹状細胞数の割合によって示される樹状細胞の移動の定量化(平均値及び標準偏差値)。*P値は0.001より小さい(Student'sテスト)。
リンパ管内皮細胞が単層化された(孔径の大きさが5μmの)トランスウエルインサートを超えての、CCL21濃度勾配(gradient)に応答した野生型及びPlexin-A1が欠損された樹状細胞の遊走能を表すグラフである。*P値は0.001より小さい(Student'sテスト)。データは三回の試験の代表値である(平均値及び標準偏差値)。
Claims (33)
- Neuropilin-1/Plexin-A1ヘテロ受容体とSema3Aとの結合を阻害する物質を有効成分として含有する細胞性免疫疾患の治療剤。
- 該物質が、Sema3A中和抗体であることを特徴とする請求項1記載の治療剤。
- 中和抗体が配列番号1に記載の363番目から381番目のペプチド配列に結合する抗体であることを特徴とする請求項1記載の治療剤。
- ペプチド配列がNYQWVPYQGRVPYPRPGTCである請求項3記載の治療剤。
- 該物質が、Neuropilin-1中和抗体であることを特徴とする請求項1記載の治療剤。
- 中和抗体が配列番号2に記載の265番目から857番目のペプチド配列に結合する抗体であることを特徴とする請求項5記載の治療剤。
- 中和抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項2から請求項6のいずれかに記載の治療剤。
- 中和抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項2から請求項6のいずれかに記載の治療剤。
- 該物質が、可溶型Neuropilin-1であることを特徴とする請求項1記載の治療剤。
- 可溶型Neuropilin-1が以下;
(1)配列番号2に記載の23番目から589番目のアミノ酸を含むポリペプチド、
(2)配列番号2に記載の23番目から857番目のアミノ酸を含むポリペプチド、
(3)(1)又は(2)に記載のポリペプチドを構成するアミノ酸配列のうち、1又はそれ以上のアミノ酸を欠失、付加、又は、置換したアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、Plexin-A1及びSema3Aとの結合活性を保持するポリペプチド、
(4)(1)又は(2)に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列にハイストリンエジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、Plexin-A1及びSema3Aとの結合活性を有するポリペプチド、又は、
(5)配列番号5に記載のポリヌクレオチド配列にハイストリンエジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、Plexin-A1及びSema3Aとの結合活性を有するポリペプチド、
を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項9記載の治療剤。 - 該物質が、可溶型Neuropilin-1誘導体であることを特徴とする請求項1記載の治療剤。
- 可溶型Neuropilin-1誘導体が請求項10に記載された可溶型Neuropilin-1とFcとの融合ポリペプチドである請求項1記載の治療剤。
- Fcが、配列番号7、8、9、又は10のいずれかに記載されたアミノ酸からなるポリペプチドを含むことを特徴とする請求項12に記載の治療剤。
- 可溶型Neuropilin-1誘導体が請求項10に記載された可溶型Neuropilin-1にポリエチレングリコール(PEG)鎖が付加されたポリペプチドである請求項1記載の治療剤。
- 細胞性免疫疾患が、自己免疫疾患である請求項1から請求項14に記載の治療剤。
- 自己免疫疾患が、器官特異的自己免疫疾患である請求項15に記載の治療剤。
- 器官特異的自己免疫疾患が、貧血(再生不良性貧血、溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血、突発性血小板減少症)、自己免疫性肝炎、虹彩毛様体炎、強膜炎、ブドウ膜炎、精巣炎、特発性血小板減少性紫斑病、バセドー病、橋本甲状腺炎、若年性糖尿病、炎症性腸疾患、アジソン病、脱髄性脳炎、又は、多発性硬化症である請求項16に記載の治療剤。
- 自己免疫疾患が、全身性自己免疫疾患である請求項15に記載の治療剤。
- 全身性自己免疫疾患が、アトピー性皮膚炎、慢性関節リウマチ等の関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン病、未分化結合組織症候群、抗リン脂質症候群、種々の形態の脈管炎(結節性多発性動脈炎、アレルギー性肉芽腫症及び血管炎)、ウェゲナー肉芽腫症、川崎病、過敏性血管炎、ヘノッホ-シェーンライン紫斑病、ベーチェット症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓血管炎、リウマチ性多発性筋痛、本態性(混合型)クリオグロブリン血症、乾癬、尋常性乾癬及び乾癬性関節炎、好酸球増加症を伴う又は伴わない広汎性筋膜炎、再発性皮下脂肪組織炎、再発性多発性軟骨症、リンパ腫様肉芽腫症、結節性紅斑、強直性脊椎炎、ライター症候群、又は、種々の形態の炎症性皮膚炎である請求項18に記載の治療剤。
- 細胞性免疫疾患が、遅延型アレルギー疾患である請求項1から請求項14に記載の治療剤。
- 遅延型アレルギー疾患が、接触性皮膚炎、金属皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、シェーグレン症候群、感染アレルギー、薬剤性肺炎、又は、ギラン・バレー症候群である請求項20に記載の治療剤。
- 下記の工程(a)、(b)、および(c)を含む細胞性免疫疾患治療剤のスクリーニング方法、
(a)被験物質の存在下で、Neuropilin-1の細胞外ドメインを有するポリペプチドとSema3Aポリペプチドとを接触させる工程、
(b)被験物質存在下におけるNeuropilin-1の細胞外ドメインを有するポリペプチドとSema3Aポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルを測定し、被験物質非存在下でのNeuropilin-1の細胞外ドメインを有するポリペプチドとSema3Aポリペプチドとの相互作用から生じるシグナル(対照)と比較する工程、
(c)上記(b)の比較結果に基づいて、対照に比してシグナルを低下させる被験物質を選択する工程。 - 下記の工程(a)、(b)、および(c)を含む細胞性免疫疾患治療剤のスクリーニング方法、
(a)被験物質の存在下で、Neuropilin-1及びPlexin-A1を発現する真核細胞とSema3Aポリペプチドとを接触させる工程、
(b)被験物質存在下におけるNeuropilin-1及びPlexin-A1を発現する真核細胞とSema3Aポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルを測定し、被験物質非存在下でのNeuropilin-1及びPlexin-A1を発現する真核細胞とSema3Aポリペプチドとの相互作用から生じるシグナル(対照)と比較する工程、
(c)上記(b)の比較結果に基づいて、対照に比してシグナルを低下させる被験物質を選択する工程。 - 該細胞が樹状細胞である請求項23記載の方法。
- 該樹状細胞が末梢血から分画されて誘導された細胞である請求項23又は請求項24記載の方法。
- 該樹状細胞が細胞株である請求項23又は請求項24記載の方法。
- 該シグナルがRhoキナーゼの活性化であることを特徴とする請求項23から請求項26に記載の方法。
- 該シグナルがmyosin-IIのリン酸化であることを特徴とする請求項23から請求項26に記載の方法。
- 該シグナルがアクトミオシンの収縮であることを特徴とする請求項23から請求項26に記載の方法。
- 該シグナルが該樹状細胞のtransmigrationであることを特徴とする請求項24から請求項26に記載の方法。
- Neuropilin-1及びPlexin-A1を発現する樹状細胞内においてRhoキナーゼの活性化を阻害する方法であって、該方法はヒト樹状細胞表面に発現するNeuropilin-1とSema3Aとの結合を阻害することによる方法。
- Neuropilin-1及びPlexin-A1を発現する樹状細胞内においてmyosin-IIのリン酸化を阻害する方法であって、該方法はヒト樹状細胞表面に発現するNeuropilin-1とSema3Aとの結合を阻害することによる方法。
- Neuropilin-1及びPlexin-A1を発現する樹状細胞内においてアクトミオシンの収縮を阻害する方法であって、該方法はヒト樹状細胞表面において発現するNeuropilin-1とSema3Aとの結合を阻害することによる方法。
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