WO2011053090A2 - 신규한 2, 4-피리미딘 유도체 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 2, 4-피리미딘 유도체 및 이의 용도 Download PDF

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WO2011053090A2
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한정민
김형래
전동주
송종환
박경은
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서울대학교 산학협력단
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    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
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    • C07D239/60—Three or more oxygen or sulfur atoms
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    • C07D239/52—Two oxygen atoms
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links

Definitions

  • the present invention relates to a novel 2,4-pyrimidine derivative, and more particularly, to a 2,4-pyrimidine derivative which is effective for autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus,
  • the present invention relates to a composition for preventing and treating autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, and a method for screening the same.
  • Systemic lupus erythematosus (or systemic lupus erythematosus, also known as systemic lupus erythematosus, SLE) is an autoimmune disease of unknown cause, with various symptoms occurring in the skin, joints, and organs. It is a kind of rheumatoid disease that shows the progression of phosphorus. In general, 2C's are more common in people in their 40s, and appear more in women. It is known that between 4 and 250 people per 100,000 people have the disease.
  • Symptoms are very diverse, and each patient has a different appearance and course / species in the skin, pain in the joints, pain in the chest, fever and soreness. Common symptoms are the first symptoms of general boredom and fatigue, weight loss or fever, and hand or foot pain, such as rheumatoid arthritis. do. Butterflies may have a butterfly-shaped red half, which may also appear on the back of another body, arm, or hand. Falling or exposed to sun can turn white or blue and accompanied by pain. Pleurisy or pericarditis may occur when you breathe, and your chest hurts or your kidneys become inflamed, resulting in hematuria or proteinuria.
  • This disease is chronic and often requires continuous treatment, which can be accompanied by depression and strokes that cause paralysis of the limbs from mild symptoms such as headache or paralysis of the consciousness. and also to develop a severe form, which may be affective disorder gong "Anna attention occurs. lot even if it occurs snout anemia, thrombocytopenia, neutropenia, obtain white blood, especially thrombocytopenia it should be noted, because airway cause cerebral hemorrhage or the like.
  • steroids such as cortisone or prednisone or aspirin, ibuprofen (Motrin, Advil), naproxen (Naprosyn), sulindac (Clinoril), diclofenac (diclofenac; Voltaren, piroxicam (Feldene), ketoprofen (Oudis), dif lunisal (Dolobid), nabumetone (Relafen), etodolac (Lodine), oxaprazin anti-malaris such as NSAIDS (Non Steroidal Anti-Inflammatory Drugs), hydroxychloroquine (Plaqueni 1), chloroquine (Aralen), such as (oxaprozin; Daypro), indomethacin (Indocin), etc.
  • ibuprofen Motrin, Advil
  • naproxen Naprosyn
  • sulindac Clinoril
  • diclofenac diclofenac
  • Immunos up ressive agents such as azathiprine (Imuran) and cyclophosphamide (Citoxan) are administered alone or in combination. Reaction, excitement, Pathological pleasure, depression, insomnia, diabetes, glaucoma, high blood pressure
  • NSAIDS may cause predisone and may cause side effects such as cataracts, muscle weakness, vascular necrosis and osteoporosis in long-term use, and gastrointestinal disorders, indigestion, intestinal bleeding, headache, drowsiness in NSAIDS, Side effects such as hypertension, renal dysfunction, skin rashes, pigmentation, hair loss, dry skin, gastrointestinal disorders, anorexia, abdominal distension, vomiting, cramps, nausea, diarrhea, etc.
  • side effects such as anemia, leukopenia, and an increased risk of infection are present. Therefore, it is urgent to develop new therapeutic agents.
  • the present inventors studied to find a substance useful for the prevention and treatment of new SLE, and thus mimicked the function of AIMP1, a molecular anchor to the intracellular residence of gp96, thereby translocating the surface of gp96.
  • the compounds were inhibited, and these materials alleviated SLE traits in vitro and in vivo, confirming that gp69 is a potential target for regulating SLE.
  • the present invention provides a compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating SLE comprising the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a use of a compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the preparation and treatment of systemic lupus erythematosus.
  • the present invention is to prevent the systemic hemorrhagic lupus, characterized in that the compound or pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention is administered to an individual in need thereof in an effective amount. And methods of treatment. '
  • (G) A method of screening for a systemic lupus erythematosus treatment comprising the step of testing whether the screening ⁇ treats or alleviates the symptoms of systemic lupus erythematosus.
  • the present inventors have found a substance that inhibits by imitating the function of the AIMP1 molecular anchor (anchor) for my I 'stream of gp96 cell surface translocation (translocat ion) of gp96, these substances are in vitro, in We confirmed whether the SLE quality was relaxed in vivo. As a result, it was confirmed that the pyrimidine compound and salts thereof of the present invention have an effect of preventing and treating the symptoms of SLE, and confirmed that gp69 may be a potential target for treating and alleviating SLE.
  • the present invention as a compound that may be used for the prevention and treatment of SLE, and the ball pyrimidine, or a pharmaceutically acceptable salt of the compound thereof represented by the general formula (1).
  • 3 ⁇ 4 is hydrogen, straight or branched saturated or unsaturated (d-C 10 ) alkyl or halogen substituted straight or branched saturated or unsaturated (d-C 10 ) alkyl,
  • [A] is N or NO; m and n independently of each other represent an integer of 0 to 2; X may be the same or different, independently represent a saturated straight chain or branched one another or unsaturated (d - C 7) saturation of a straight or branched chain substituted with alkyl, halogen or non-saturated (d - C 7) alkyl, ( d-C 7 ) alkoxy, (Ci-C 7 ) alkylthio, (Ci-C 7 ) alkoxycarbonyl, halogen, cyano, nitro, amino, aminocarbonyl, benzyloxy or carboxylic acid.]
  • 3 ⁇ 4 is hydrogen, straight or branched saturated or unsaturated (d-C 10 ) alkyl or straight-chain or branched saturated or unsaturated (d-C 10 ) alkyl, ego; '
  • 3 ⁇ 4 is hydroxy, (d-C 7 ) alkoxy, (d-c 7 ) alkylthio, single or plurally substituted
  • 3 ⁇ 4 is each independently hydrogen, (d-C 7 ) alkyl, (d-c 7 ) alkoxy, arylalkoxy or arylalkyl unsubstituted or substituted by halogen,
  • R 4 is hydrogen, halogen, carboxyamide or pyridine.
  • 3 ⁇ 4 is hydrogen, unsubstituted or substituted by halogen (C 7 -C 10 ) arylalkyl, pyridine unsubstituted or substituted by amine group, (d -C 7 ) alkyl or R 5 is (d-C 7 ) alkyl, (C 6 ) aryl or thiophene unsubstituted or substituted by halogen, 3 ⁇ 4 can be hydroxy or (d-c 7 ) alkoxy, more preferably
  • 3 ⁇ 4 is hydrogen, benzyl, pyridine, aminopyridine, tert-butyl or [Wherein 3 ⁇ 4 is (d-C 7 ) alkyl, unsubstituted or substituted by halogen and (C 6 ) aryl or thiophene and 3 ⁇ 4 is hydroxy or (d-C 7 ) alkoxy.].
  • each of R 2 or 3 ⁇ 4 is independently hydrogen, (d-C 7 ) alkyl, (d-C 7 ) alkoxy or arylalkyl unsubstituted or substituted by halogen, more preferably hydrogen , Methyl, methoxy, tert-buroxy, trifluoromethylphenoxy.
  • 3 ⁇ 4 is hydrogen, chloro, carboxyamide or pyridine.
  • R 2 , 3 ⁇ 4, R 5 , and 3 ⁇ 4 may each include designating a plurality of compounds as long as they are allowed according to one compound or compound structure.
  • Alkyl means an aliphatic hydrocarbon group, which may be straight or branched, containing from about 1 to about 20 carbon atoms in the chain. Preferred alkyl groups contain from about 1 to about 12 carbon atoms in the chain. More preferred alkyl groups contain about 1, 2, 3, 4, 5 or 6 carbon atoms in the chain.
  • side chain is meant one or more lower alkyl groups, for example methyl, ethyl or propyl, are attached to the linear alkyl chain.
  • Alkyl is one that may be unsubstituted, or may be the same or different.
  • each substituent may be halogen, alkyl, aryl, cycloalkyl, cyano, hydroxy, alkoxy, alkylthio, amino, carboxoxy, etc.
  • alkyl is butyl or isobutyl Can be.
  • Alkoxy means an alkyl -0 group, in which the alkyl group is as previously described.
  • alkoxy groups include methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy and n-butoxy. Binding to the parent moiety is through oxygen. Preferably alkoxy may be methoxy.
  • Aryl means an aromatic hydrocarbon ring system, and examples thereof include phenyl, indenyl, indanyl, naphthyl, fluorenyl, and the like, and preferably (6C) aryl.
  • Halogen may include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom and an iodine atom, preferably a fluorine atom, a chlorine atom or a brom atom.
  • Alkyl substituted by halogen "means an alkyl group substituted by 1 to 3 halogen atom (s), for example, fluoromethyl, chloromethyl, difluoromethyl, dichloro -Methyl, dibromomethyl, trifluoromethyl, trichloromethyl, fluoroethyl, chloroethyl, trifluoroethyl, trichloroethyl, fluoropropyl, fluorobutyl, fluoronuclear chamber, etc., preferably May be (C 1 -C 6) alkyl substituted with halogen, more preferably (C 1 -C 6) alkyl substituted with chlorine or fluorine.
  • halogen atom for example, fluoromethyl, chloromethyl, difluoromethyl, dichloro -Methyl, dibromomethyl, trifluoromethyl, trichloromethyl, fluoroethyl, chloroethyl, trifluor
  • Aryl substituted by halogen 'means an aryl group substituted by one to three halogen atom (s), for example fluorofe ⁇ , difluorophenyl, trifluorophenyl , Chlorophenyl, dichlorophenyl, trichlorophenyl, bromophenyl, dibromophenyl, tribromophenyl, difluorobenzyl, dichlorobenzyl, dibromobenzyl and the like, preferably chlorophenyl.
  • halogen atom for example fluorofe ⁇ , difluorophenyl, trifluorophenyl , Chlorophenyl, dichlorophenyl, trichlorophenyl, bromophenyl, dibromophenyl, tribromophenyl, difluorobenzyl, dichlorobenzyl, dibromobenzyl and the like, preferably chlorophenyl.
  • aryl substituted by alkyl or "arylalkyl” is one means to the three alkyl substituents, an aryl substituted by eu and, for example, benzyl, ethylphenyl, propylphenyl, dimethylphenyl, di Ethylphenyl, trimethylphenyl, triethylphenyl and the like, preferably benzyl.
  • Pyridine refers to an organic compound belonging to an aromatic heterocyclic group consisting of a ring structure consisting of five atoms of five carbon atoms and one nitrogen atom.
  • the compound of the present invention is preferably (S) -methyl 2- (4,6-dimethicpyrimidin-2-yloxy) -3-methylbutanoate ((S) ) -methyl 2- (4,6-di met hoxypyr i mi di ⁇ -2-y 1 oxy) -3-met hy 1 but anoat e), methyl 2- (5_chloro-4-) Methoxy-6-methylpyrimidin-2-yloxy) propanoate (methyl 2- (5-chloro-4- me t hoxy-6-me t hy 1 py rimidi ⁇ -2-y 1 oxy) pr opanoa te), methyl 2 ⁇ (4—bromophenyl) -2— (4,6-dimethoxypyrimidine-2—yloxy) acetate (methyl 2- (4-bromophenyl) -2-2- ( 4, 6-di me t hoxypyr imidi ⁇ -2-y 1 oxy) ace t at
  • Me in the following chemical formula represents a ⁇ methyl group.
  • the preparation method according to the present invention is exemplified in Banung Formula 1, and the following preparation method does not limit the method of preparing the compound of Formula 1 according to the present invention. Unless otherwise stated, the definitions of the substituents in the following semi-formulae are the same as those in the formula (1).
  • the 2,4-pyrimidine compound represented by Chemical Formula 1 according to the present invention can be prepared, and can be synthesized by other methods.
  • X in the compound 2 is mainly alkyl sulfonyl or alkyl sulfoxide, such as methanesulfonyl, or halogen, such as chlorine, fluorine, 3 ⁇ 4 R 2 3 ⁇ 4 R 4 is
  • the compounds of the present invention or pharmaceutically acceptable salts thereof have the effect of preventing and treating SLE.
  • gp96 is a kind of heat shock protein
  • gp96 protein may be a gp96 protein known in the art, but preferably Genbank Accession No. It may be a polypeptide having the amino acid sequence shown in NM_003299, AK025459, AJ890084, X15187, NM_003299.1, M33716.1.
  • gp96 is a protein present in the ER of the HSP90 family and is responsible for chaperone function by recycling between ER and Golgi (Li, Z., Dai, J., Zheng, ⁇ ., Liu, ⁇ . & Caudi 11, M. Front. Biosci. 7, d731-751 (2002).). gp96 is known to be involved in innate, adaptive imunity (Srivastava, PK, Menoret, A., Basu, S., Binder, RJ & McQuade, KL Imunity 8, 657-665 (1998)).
  • gp96 uses CD91, TLR2 / 4 as a receptor to induce DC maturation and secrete the inflammatory cytokine TNF alpha (Binder, RJ, Han, DK & Srivastava, PK Nat. Immunol. 1, 151-155 (2000).
  • AIMPKARS-interacting multi-functional protein D "AIMP1 protein” or .
  • AIMP1 polypeptide is conventionally known as the p43 protein and is according to the present invention. It was renamed by the authors (Sang Gyu Park, et al., Trends in Biochemical Sciences, 30: 569-574, 2005).
  • AIMP1 is a protein composed of 312 amino acids, which binds to a multi-tRNA synthetase complex (Deutscher, M: P., Method Enzymol, 29, 577-583,1974; Dang CV et al. , Int. J. Biochem. 14, 539-543, 1982; Mirande, M.
  • AIMP1 is secreted from various types of cells, including prostate cancer, immune and transformed cells, the secretion of which is induced by various stimuli such as TNFa and heat shock (Park SG et al., Am. J. Pathol., 166 , 387—398, 2005; Barnett G. et al., Cancer Res. 60, 2850-2857, 2000). Secreted AIMP1 is known to act on a variety of target cells such as nucleophiles / macrophages, endothelial cells and fibroblasts.
  • the present invention and the compound or pharmaceutically acceptable salts can be applied to the prevention and treatment of SLE because it prevents, alleviates, or treats SLE traits or symptoms in vitro and in vivo.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating SLE comprising the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient.
  • Compositions of the Invention The water may have a composition comprising 0.001 to 99.999% by weight of the compound of the invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a balance of the carrier.
  • the carrier may be a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may include a pharmaceutically effective amount of a compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof alone or further include one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • pharmaceutically effective amount refers to an amount that exhibits a higher response than a negative control, and preferably an amount sufficient to treat or prevent systemic populicular lupus.
  • Pharmaceutically effective amounts of the compounds of the invention according to the invention are 0.00001 to 100 mg / day / kg body weight. However, the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed depending on various factors such as the disease and its severity, the patient's age, weight, health status, sex, route of administration and duration of treatment.
  • the present invention is a compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable It provides a use for the preparation of a system for preventing systemic lupus erythematosus and treatment of a salt.
  • the present invention also provides a method for preventing and treating systemic lupus erythematosus, characterized in that the compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered to an individual in need thereof in an effective amount. do.
  • the compound represented by Chemical Formula 1 may be any one selected from the group consisting of compounds represented by Chemical Formulas 2 to 15 and Chemical Formulas 17 to 40.
  • the compounds of the present invention can be used on their own or in the form of salts, preferably pharmaceutically acceptable salts.
  • 'pharmaceutically acceptable refers to a physiologically acceptable and normally does not cause an allergic half or similar reaction when administered to humans, and the salt is a pharmaceutically acceptable free acid.
  • Acid addition salts formed by Organic acids and inorganic acids may be used as the free acid.
  • the organic acid is not limited thereto, citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, formic acid, propionic acid, oxalic acid, trifluoroacetic acid, benzoic acid, gluconic acid, metasulfonic acid, glycolic acid, succinic acid, 4- Luenesulfonic acid, glutamic acid and -aspartic acid.
  • the inorganic acid includes, but is not limited to, hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid and phosphoric acid.
  • the compounds of the present invention or pharmaceutically acceptable salts thereof can be administered in an effective amount via several routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular.
  • the term 'effective amount' refers to an amount that shows the effect of preventing and treating systemic lupus erythematosus when administered to a patient. It may be a cell, tissue, organ, etc. derived from an animal. The subject may be a patient in need of treatment.
  • the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be administered as it is or prepared and administered in various formulations as described above, and preferably, the desired effect, namely, prevention of systemic lupus erythematosus and Can be administered until therapeutic effect is obtained.
  • the compounds of the present invention and their pharmaceutically acceptable salts can be administered by various routes according to methods known in the art. Oral or parenteral, such as oral, intramuscular, intravenous, intradermal, intraarterial, intramedullary, intradural, intraperitoneal, intranasal, intravaginal, rectal, sublingual or subcutaneous, gastrointestinal, mucosal or respiratory May be administered.
  • a method of directly applying the compound of the present invention and a pharmaceutically acceptable salt thereof to the skin, or preparing the polypeptide in an injectable formulation and injecting a predetermined amount into the lower layer of the skin with a 30 gauge thin needle or It can be administered by lightly pricking the skin. Preferably it can be applied directly to the skin.
  • the compounds of the present invention and pharmaceutically acceptable salts thereof may also be administered in a form encapsulated within or encapsulated within a molecule that induces high affinity binding to a target cell or tissue (eg, skin cells or skin tissue).
  • Compounds of the present invention and pharmaceutically acceptable salts thereof can be prepared using techniques known in the art, such as sterols (e.g.
  • lipids e.g. cationic lipids, virosomes or liposomes
  • F 1 ligands recognized by target cell specific receptors
  • Suitable coupling or crosslinking agents can include, for example, Protein A, carbodiimide, N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propiotate (SPDP) and the like.
  • the composition of the present invention may be formulated into a unit dosage form suitable for oral or parenteral administration.
  • diluents or excipients such as commonly used layering agents, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which solid preparations comprise at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, The gel is mixed with Latin and prepared.
  • lubricants such as magnesium styrate talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, suspensions, emulsions, and syrups.
  • various excipients for example, wetting agents, sweeteners, fragrances, and present agents And the like.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, ointments, creams.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used.
  • the compound of the present invention or a composition containing the same may be administered parenterally, and parenteral administration may be by subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or intrathoracic injection injection.
  • parenteral administration may be by subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or intrathoracic injection injection.
  • the compounds of Formula 15 or Formula 17 to Formula 40 are mixed in water with stabilizers or solvents to form solutions or suspensions and formulated into unit dosage forms of ampoules or vials.
  • the dosage unit may contain, for example, one, two, three or four times the individual dosage, or one, two, one third or one quarter times.
  • the individual dosage preferably contains the amount in which the effective drug is administered at one time, which usually corresponds to the total, 1/2, 1/3 or 1/4 times the daily dosage. Dosage levels for a particular patient may vary depending on the patient's weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method and excretion, drug combination and severity of disease.
  • (C) A method of screening for a systemic hemorrhagic lupus therapeutic agent comprising the step of testing whether the selected agent cures or alleviates the symptoms of systemic lupus erythematosus.
  • the screening method can be used to implement the method a variety of biochemical and molecular biological techniques known in the art. This technique is disclosed in the following literature: Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. Second (1998) and Third (2000) Editions; and Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, by John Wiley & S Inc. , New York (1987-1999).
  • the test agent is first assayed whether it is capable of regulating the binding of AIMP1 and gp96 (first assay step).
  • the test formulation Assay of the gp96 and surface translocation in the presence of to identify a modulating agent that regulates the binding of AIMP1 and gp96 More preferably, it may include the following steps:
  • test agents that change the binding capacity of AIMP1 and gp96 by measuring the separation activity of AIMP1 and gp96.
  • regulation of the binding capacity of AIMP1 and gp96 can be assayed.
  • the test agent may be assayed for AIMP1 and gp96 binding or indirectly activity that modulates the surface translocation of gp96.
  • test agent After identifying the agent that modulates the binding capacity of AIMP1 and gp96 through the first assay step, the test agent is tested for the effect of treating and alleviating the systemic lupus erythematosus. Secondary test phase).
  • agents modulating the binding capacity of AIMP1 and gp96 identified by the methods of the present invention can treat or alleviate the symptoms of systemic lupus erythematosus. If the test agent identified in the first assay step regulates surface migration of gp96, the symptoms of systemic lupus erythematosus can be treated, alleviated or alleviated.
  • an unchanged gp96 protein or AIMP1 protein or fragments, analogs, or functional equivalents thereof can be used. Fragments that can be used in these assays generally retain one or more biological activities of each of the gp96 protein or AIMP1 protein. Fusion proteins comprising such fragments or analogs can also be used for screening for test formulations.
  • the functional synonym of the gp96 protein or AIMP1 protein can be used in the screening method of the present invention because it has amino acid deletions and / or insertions and / or substitutions, but each retains the same bioactivity as the gp96 protein or AIMP1 protein.
  • the agent may be screened in a cell based assay system.
  • the reporter gene activity eg, enzyme activity
  • the reporter gene activity is measured in the presence of the test agent, which is determined by the activity of the reporter gene in the absence of the test agent. Compare.
  • the reporter gene may comprise any detectable polypeptide (reaction or reporter polypeptide) known in the art, such as a polypeptide detectable by fluorescence or phosphorescence or a polypeptide detectable by the enzymatic activity it possesses. It can be encrypted. Detectable reponse polypeptides include, for example, luciferase, alpha-glucuronidase, alpha-galactosidase, chloramphenicol acetyl transferase, green fluorescent protein, enhanced green fluorescent protein and Human secreted alkaline kinase.
  • Detectable reponse polypeptides include, for example, luciferase, alpha-glucuronidase, alpha-galactosidase, chloramphenicol acetyl transferase, green fluorescent protein, enhanced green fluorescent protein and Human secreted alkaline kinase.
  • cell-based assays described above they can also be screened by non-cell based methods.
  • methods include, for example, mobility shift DNA-binding assays, methylation and uracil interference assays, DNase and hydroxy radical footprinting assays (DNase and hydroxy 1). radical footprinting analysis, fluorescence polarization, and UV crosslinking or chemical cross-linkers.
  • Techniques for separating co-associating proteins include cleavable cross-linked dithiobis (succinimidylpropionate) and 3,3'-dithiobis (sulfosuccinimidyl-).
  • UV crosslinking or chemical crosslinking agents including propionate (McLaughlin, Am. J. Hum. Genet., 59: 561-569, 1996; Tang, Biochemistry, 35: 8216-8225, 1996; Lingner, Proc Natl.Acad.Sci. USA, 93: 10712, 1996; and Chodosh, Mol. Cell. Biol., 6: 4723-4733, 1986).
  • the binding ability of the gp96 protein and the AIMP1 protein or the adjustment of the surface translocation of gp96 can be easily confirmed through a conventional protein-protein interaction detection method.
  • This method can be useful for applications in high-throughput screening (HTS).
  • HTS high-throughput screening
  • the gp96 protein and AIMP1 protein in contact may be expressed or injected into cells, respectively, and may be in a crude, purified or partially purified state in vitro.
  • the state of the gp96 protein and the AIMP1 protein may be appropriately selected depending on the method of determining whether the interaction is inhibited.
  • Inhibition of the binding capacity of the gp96 protein and the AIMP1 protein may use methods of detecting protein-protein interactions known in the art, for example, in vitro protein-protein binding assays (in vitro pools). Down assays), electrophoretic mobility shift assays (EMSA), immunoassays for protein binding, functional assays (eg, phosphorylation assays), non-immunoprecipitation assays, immunoprecipitation western blot assays, immuno-co-localization Immuno-co-localization, cross-inking, affinity chromatography, immunoprecipitation (i mmunopr ec ipit at i on, IP), yeast two hybrids -hybrid, Y2H), fluorescence resonance energy transfer (FRET), ligation of binary proteins (bin lecular fluorescence complementation, Bi-FC), etc. can be performed by various methods known in the art.
  • the protein chip microarrays the gp96 protein or AIMP1 protein on the surface of a solid (metal, glass, etc.) and other proteins (eg, AIMP1 when gp96 is immobilized) and the candidate and protein chips.
  • Analytical methods of the present invention may be used, for example, in the case of bacterial refresher LexA or yeast GAL4.
  • Essays can be performed (KIM, MJ et al., Nat. Gent., 34: 330-336, 2003).
  • the interaction of the gp96 protein with the AIMPl protein allows for the reconstitution of transactivators that induce the expression of reporter genes under the control of a promoter having regulatory sequences bound to the LexA protein or the DNA-binding domain of GAL4.
  • the reporter gene may be a gene encoding any detectable polypeptide known in the art as described above (eg, chloramphenicol acetyltransferase (CAT), luciferase, beta-galactosidase, beta-glucosita).
  • CAT chloramphenicol acetyltransferase
  • luciferase beta-galactosidase
  • beta-glucosita alkaline phosphatase, green fluorescent protein (GFP), etc.
  • GFP green fluorescent protein
  • the reporter gene may be selected to encode a protein that enables the growth of the yeast (that is, the growth of the yeast is inhibited when the reporter gene is not expressed).
  • it may be an auxotropic gene that encodes an enzyme involved in the biosynthesis process for amino acids or nitrogen bases (e.g., ADE3, yeast gene from HI S3 or equivalent gene from another species).
  • ADE3 yeast gene from HI S3 or equivalent gene from another species.
  • the interaction of the gp96 protein expressed with this system with the AIMP1 protein, or a portion or homologue of these proteins, is inhibited or attenuated by the test agent, so that the reporter gene is not expressed or is less expressed.
  • growth of yeast under these conditions is stopped or slowed down.
  • the effect of expression of these reporter genes can be observed with the naked eye or through a device (eg microscope).
  • the coagulum comprises a group such as, for example, amino, carboxy or hydroxy
  • suitable protecting groups for amino or alkylamino groups include acyl groups, eg For example, alkanoyl groups such as acetyl, alkoxycarbonyl groups, for example mesoxycarbonyl, ethoxycarbonyl or t-butoxycarbonyl groups, arylmethoxycarbonyl groups, for example benzyloxycarbonyl, or aroyl groups, eg Benzoyl and the like.
  • the deprotection conditions for these protectors must be changed at the option of the protector.
  • acyl groups such as alkanoyl or alkoxycarbonyl groups or aroyl groups can be removed by hydrolysis using suitable bases such as alkali metal hydroxides such as lithium hydroxide or sodium hydroxide.
  • acyl groups such as t-butoxycarbonyl groups can be removed by treatment with a suitable acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid or trifluoroacetic acid, and arylmethoxycarbonyl groups such as benzyloxycarbonyl groups are catalysts.
  • a suitable acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid or trifluoroacetic acid
  • arylmethoxycarbonyl groups such as benzyloxycarbonyl groups are catalysts.
  • a catalyst such as palladium on carbon
  • a Lewis acid such as, for example, boron tris (trifluoroacetate).
  • Another suitable protecting group for the primary amino group is a phthaloyl group, which can be removed using an
  • Suitable protecting groups for hydroxy groups are acyl groups such as alkanoyl groups such as acetyl, aroyl groups such as benzoyl or arylmethyl groups such as benzyl. Deprotection conditions for the protecting group must be changed according to the selection of the protecting group.
  • acyl groups, such as alkanoyl or aroyl groups are for example suitable bases, such as alkali metal hydroxides, for example lithium, sodium hydroxide Or by hydrolysis with ammonia.
  • the arylmethyl group, for example benzyl group can be removed by, for example, a hydrogenation reaction on a catalyst such as palladium on carbon.
  • suitable protecting groups for carboxyl groups include esterification groups which can be removed by hydrolysis with bases such as sodium hydroxide, for example methyl or ethyl groups or acids such as organic acids such as trifluoride. T-butyl groups that can be removed by treatment with roacetic acid, or benzyl groups that can be removed by a hydrogenation reaction on a catalyst such as palladium on carbon. Resin can also be used as a protecting group. .
  • Protecting groups can be removed at any convenient stage in the synthesis using conventional techniques well known in the chemical arts.
  • Table 1 summarizes the chemicals that inhibit the interaction of gp96 and AIMP1 from preliminary experiments.
  • Table 2 confirms the inhibitory effect of gp96 and AIMP1 interaction of the compounds of the present invention.
  • Table 3 shows the results of the binding rate constants (K a ), separation rate constants (3 ⁇ 4) and equilibrium separation constants () for the interaction of GPM1 with various mutant gp96 genes, as determined by the SPR experiment. .
  • the numerical value represents the mean square standard deviation.
  • NC1 used as a control in the present invention is represented by the following Chemical Formula 16, 2-
  • FIG. 1-9 show that inhibition of cell surface gp96 by GPM1 reduces the maturation of dendritic cells (DC) and the number of B220 + in g P 96tm transgenic mice.
  • FIG. 1 Chemical structures of GPM1 (Formula 2) and negative control group (NC1, Formula 16) used in this study.
  • FIG. 2 GPM1 or NC1 dose dependent effects on AIMPl-gp96 interactions measured by the ELISA method described above.
  • Rodent gp96 which is a combination of two substances and biotin, was added to AIMP1 coated on microtiter wells according to the indicated concentrations, and g P 96 bound to AIMP1 was measured by streptavidin-coupled peroxidase.
  • FIG. 4 RAW24.7 cells were treated with lOuM GPM1 for 24 hours. Cell lysates were immunoprecipitated with control IgG or anti-gp96 antibodies, and immunoprecipitated proteins were immunoblotted with anti-KDELR1, anti AIMP1 and gp96 antibodies. WCL means whole cell lysate.
  • CDllb + CDllc + myeloid dendritic cells
  • CDllc + lymphoid dendritic cells
  • CDllb + CDllc— macrophage cell populations
  • CD4 + , CD8 + and the percentage occupied by CD4 and CD8 double negative cells are shown comparing GPM1 treated mice to controls.
  • FIG. 10-18 show that inhibition of cell surface gp96 by GPM1 results in renal disease and reduction of mature B cells, memory T cells and activated T cells in gp96tm transgenic mice.
  • Arbitrary units are the absorbances of autoantibodies measured at 1,500 ⁇ by diluting the serum 1: 1.
  • FIG. 12 Protein concentration (mg / ml) of urine of three different groups.
  • Figure 13 Representative kidney sections of three groups stained with hematoxylin and eosin.
  • Total IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM and IgA levels were measured by a sandwich ELISA kit from Southern Biotechnology Associates (Birmingham, AL). Numbers represent mean ⁇ standard deviation. Student t-test P values are shown comparing GPM1 treated mice to controls.
  • FIG. 19 is a heat map of preliminary screening data. 6482 chemicals
  • a modified ELISA method describing the inhibitory effects of (chemical) interaction with gp96 and AIMP1 Observed by law.
  • the value of DMS0 was set at 0%, and the degree of inhibition of each chemical was measured as a relative percentage. The degree of inhibition was expressed in the heat map from 0 (green) to 100% (red) in 10% increments.
  • Figure 20 shows the effect on the surface expression of gp96 of the derivative of the preliminary experimental selection group.
  • RAW264.7 cells were treated with 77 compounds (lOuM, 24 h) and flow cytometry analyzed the effect on surface expression of gp96.
  • FIG. 31 to 33 show increased cell surface expression of gp96 and serum levels of gp96 antibodies in human SLE patients.
  • Arbitrary unit is the absorbance of autoantibodies measured at 00 4501] 111 by diluting the serum 1: 100.
  • Student t-test P values are shown comparing SLE patients with healthy controls.
  • NZB / W F1 mice were lupus animal models with spontaneous lupus symptoms, and the efficacy of 2,4-pyrimidine derivatives was verified in this animal model.
  • Ten 25-week-old male NZB / W F1 mice were used in each group to intraperitoneally administer the control group (5% DMS0 solution) and the experimental group (30 mg / kg dose of 2,4-pyrimidine derivatives) once daily.
  • KR-S-015 Compound is methyl 2- (4, 6-dime t hoxypyr imidi ⁇ -2-y 1 oxy) -3- Methylbutanoate and 15 more effective compounds (KR-S—008, KR-S-012, KR-S-001, KR-S-024, KR-S-023, KR-S-017, KR-S-011, KR-S-007, KR-S-013, KR-S-005, KR-S-009, KR-S-006, KR-S-020, KR-S-014, KR- S-022).
  • the present inventors have found a novel substance that mimics the function of AIMP1, the molecular anchor for gp96's intracellular residence, to inhibit surface translocation of gp96, and these substances are found in vitro and in vivo. It was confirmed that the effect of preventing and treating SLE by alleviating SLE traits. Accordingly, the present invention provides a new method for screening a therapeutic agent for SLE using the above mechanism and preventing or treating SLE.
  • 1-9 show that inhibition of cell surface gp96 by GPM1 decreases the maturation of dendritic cells (DCs) and the number of B220 + in gp96tm transgenic mice. Student t-test P-values comparing GPM1 treated mice to controls are shown. 1 is a chemical structure of GPM1 (Formula 2) and negative control group (NC1, Formula 16) used in the present study.
  • the rodent g p96 bound to both substances and biotin was added to AIMP1 coated on the microtiter well according to the indicated concentration, and gp96 bound to AIMP1 was measured by strepavidin-bound peroxidase.
  • FIG. 3 shows the results of testing the binding of GPM1 to gp96 by surface plasmon resonance (SPR).
  • SPR surface plasmon resonance
  • Figure 4 is a control after crushing RAW24.7 cells in 10uM GPM1 for 24 hours
  • FIG. 5 shows excipients (PBS containing 5% DMSO) isolated from splenocytes of C57BL / 6 mice.
  • cell surface gp96 was stained and subjected to flow cytometry.
  • ⁇ 305> 6 is AIMP1 + / + or AIMP1- z eu mouse spleen cells (2XK) 5 cells) excipients, GPM1 or were fixed by treatment with NCKlOuM, 24 hours) the wild-type bone marrow-derived dendritic cells (1X10 4 cells , BMDC) and co-culture for 16 hours, TNFa secretion in BMDC was measured by ELISA.
  • the ratio (percentage) of g P 96 + MHC class 11 + cells in splenocytes extracted from gp96tm transgenic female mice treated with (n 7) was measured.
  • CDllb + CDllc + myeloid dendritic cells
  • CDllb _ CDllc + lymphoid dendritic cells
  • CDllb + CDllc macrophage
  • Arbitrary units Is the absorbance of autoantibodies measured at 00 4 5 ⁇ by diluting the serum 1: 1.
  • FIG. 13 is a representative kidney section of three groups stained with haematoxylin and eosin.
  • FIG. 14 is a photograph showing glomerular immunoglobulin deposition in kidneys treated with excipients and GPM1 by FITC-coupled goat anti-mouse Ig antibody.
  • CD4 + CD44 hlgh memory T cells
  • CD4 CD62L effect T cells
  • CD4 CD69 active T cells
  • FIG. 16 is a result of measuring the ratio of B220 + IgM + IgD + (mature B cells) in splenocytes.
  • 17 shows the results of measuring the ratio of CD4 + CD25 + Foxp3 + regulatory T cells in splenocytes.
  • Total IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM and IgA levels were measured with a sandwich ELISA kit from Southern Biotechnology Associates (Birmingham, AL). The figures represent the mean standard deviation.
  • FIG. 19 is a heat map of preliminary screening material.
  • Figure 21 shows GPMl, (S) -methyl 2- (4, 6-dimethoxypyrimidin-2-yloxy) -3-methylbutanoate ((S) -methyl 2- (4, 6-di me t hoxypy rimidi ⁇ -2-y 1 oxy) -3-met hy 1 but anoa te) synthesis process.
  • FIG. 22 shows the effect of point mutations on ATPase activity of gp96.
  • FIG. 23 shows the effect of GPM1 on the ATPase activity of gp96.
  • 25-30 shows that inhibition of cell surface gp96 by GPM1 reduced dendritic cell (DC) maturation, B220 + and MHC class ⁇ + cells, memory T cells and active T cells in lymph nodes of gp96tm transgenic mice. It shows the point to make. Student t-test P values compared to GPM1-treated mice are shown.
  • DC dendritic cell
  • + And CD4 and CD8 are the percentage of double negative cells.
  • 31 to 33 show increased cell surface expression of gp96 and serum levels of gp96 antibodies in human SLE patients. Student t-test P values are shown comparing SLE patients with healthy controls.
  • the numbers represent the percentage of cells located in the double positive quadrant.
  • Arbitrary unit is the absorbance of autoantibodies measured at 0D 450niD by diluting the serum 1: 100. Student t-test P values are shown comparing SLE patients with healthy controls.
  • FIG. 34 is a graph showing the results of experiments to mitigate the symptoms of lupus symptoms of the 2,4-pyrimidine derivative of the present invention in a lupus animal model.
  • 35 shows the amount of gp96 protein present on the cell surface after 24 hours treatment with 2,4-pyrimidine derivative ImM concentration in the HL-60 cell line using flow cytometry (FACS) method using gp96 antibody.
  • FACS flow cytometry
  • reaction solution was added to 100 ml of water, extracted with diethyl ether, dried over MgS0 4 , distilled under reduced pressure to obtain a residue, and purified by silica gel column chromatography ( ⁇ -2- (4,6-dimethoxypyrimidine-2- 4.81 g of a solid substance which is yl) -2-phenylacetic acid methyl ester (?)-2- (4,6_ dimety oxy pyrimidi ⁇ -2-y 1 oxy) -2-pheny 1 ac etic acid methyl ester (79%) was obtained.
  • the obtained compound was dissolved in a mixed solvent of methanol and water (about 3: 1), and the mixture was stirred in an ice bath.
  • Dimethylhydroxyl amine hydrochloride (0.0098 g) was dissolved in 10 ml of MC and stirred for 10 minutes while maintaining 0 ° C in an ice-bath. After stirring, EDCI HC1 0.019g (0.1 () l ⁇ ol) was slowly added thereto and stirred while maintaining the temperature for 20 minutes, followed by stirring at room temperature for 3 hours. The reaction solution was distilled under reduced pressure to remove the solvent, residue was obtained, and then purified by silica gel column chromatography.
  • 0.06 g (0.00025 mol) was dissolved in about 3 ml of MeOH, 0.5 ml of 20% NaOH was added, and the solution was heated to 50 to 60 ° C for 2 hours. After the solution was cooled to room temperature, 10 ml of water was added thereto, and the organic layer was separated with 15 ml of n-hexane, 0.5 ml of concentrated HC1 was added to the aqueous solution, extracted with 30 ml of ethyl acetate, and washed three times with brine.
  • a patient associated with the present invention is a patient who visited the rheumatology clinic of internal medicine at the Seoul National University Hospital. Human blood was obtained from 22 SLE patients and 16 healthy individuals. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated using Ficoll-Paqiie Plus (GE healthcare). Patients meet the following criteria for their disease: the 1997 update of the American Col lege of Rheumatology revised criteria for classification of SLE. This study was approved by the Institutional Review Board of Seolleong National University Hospital.
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • mice 100 (26) : 15824-15829) was bred and managed in the laboratory animal laboratory of the Institute of Pharmacy, College of Pharmacy, Seoul National University. We used age-matched 12-26 week ⁇ mice for each experimental group. To inhibit cell surface gp96 we used GPM1 compound. Dexamethasone and GPM1 were dissolved in phosphate complete saline (PBS) containing 5% DMS0. Compounds were administered intraperitoneally every 24 hours for 2 months (30 mg / kg / day). Three groups of 9 animals each were tested. All courses are published by the National Institutes of Health. The Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals, Korean National Institute of Health.
  • the tissues were ground to a sterile mesh to prepare spleen and lymph node suspensions, and erythrocytes were lysed with erythrocyte lysis supernatant (eBioscience, CA).
  • FITC fluorosane isothiocyanate
  • PE phycoerythrin
  • PerCP PerCP
  • 96-well folate (Maxisorp., F96; Nunc) was coated with PBS containing AIMP1 (pH 7.4) (500 ng / well); after washing the remainder was with PBS containing 1% BSA. Blocking for 1 hour was combined with gp96 bound to 10 ng / well of biotin in Tris buffer (25 mM Tris, 10 mM NaCl and 0.4% Triton X— 100). 6,580 compounds were added to the wells of ⁇ , respectively. summed at a concentration plate had comprising a streptavidin Taba 'HRP are combined and then washed Dean, incubated for 30 minutes at a 0.1% BSA and PBS 0.1% tween 20 is entered. after washing, the sample rate were added to the substrate to each well. absorbance was measured at 450 nm.
  • Kidney tissue sections of gp96tm transgenic mice were fixed with PBS containing 10% formaldehyde and dehydrated with an alcohol gradient. After paraffin infiltration. Tissues were cut into microtome, stained with hematoxylin and eosin (H & E), and analyzed by light microscopy. For immunofluorescence staining, the kidneys were cut in cryostats. These copper fragments were blocked with normal goat serum and stained with goat anti-mouse Ig (BD pharmingen, CA) with FITC binding, and observed by fluorescence microscopy.
  • H hematoxylin and eosin H hematoxylin and eosin
  • Human gp96 was expressed in His-tailed protein form in Escherichia coli BL21 (DE3) and purified by nickel-preferred chromatography. His tailed gp96 was fixed to the CM5 sensor chip using standard amine coupling. PBS was used as the running buffer. Carboxymethyl dextran on one side of the flowing cells was activated by injecting 0.4M EDC and 0.1M NHS at a 1: 1 ratio for 7 minutes. The protein was coupled to the surface by injecting gp96 grafted with 10 mM sodium acetate at pH 7.3 for 7 minutes. stay The active group was blocked by injecting 1.0 M ethanolamine, PH8.5 for 7 minutes.
  • GPM1 compounds were directly dissolved in PBS running buffer containing 1% DMS0 and injected at 25 ° C at a rate of 20ul / ml. Binding was determined by changes in resonance units (RU). The concentration of compound varied from ⁇ to 25 uM and each concentration was tested at least three times. All binding complexes fell to baseline in a reasonable time. Therefore, regeneration was not necessary.
  • the sensor grams were run by subtracting the binding reaction recorded from the control surface and subtracting the average buffer tank injection from the reaction point. To determine the rate constants, all data sets were fitted to a simple 1: 1 coupling with the baseline drift model using the BIAevaluation program. -
  • NZB / W F1 mice were a Lupus animal model with _ spontaneous lupus symptoms that demonstrated the efficacy of 2,4-pyrimidine derivatives in this animal model.
  • mice A 10-week-old male NZB / W F1 mouse was used in each group of 10 mice, and the control group (5% DMS0 solution) and the experimental group (30 mg / kg dose of 2,4-pyrimidine derivative) were intraperitoneally administered once daily and symptoms of lupus were observed. Percentages of live mice were analyzed, except for mice that died from deterioration.
  • primary hits ID is an identification ID on the compound library, and derivatives represent a derivative associated with the ID.
  • the effect on the interaction of gp96-AIMPl was confirmed that there is no inhibition / effect on the derivative, the effect on the cell surface gp96 level indicates the results of the above inhibitory effect.
  • GPM1 was selectively synthesized according to the method shown in FIG. 21, and pyrimidine backbone as a derivative thereof. Eggplant compounds were selected. These compounds, although they showed different inhibitory effects on the cell surface expression level of gp96 (Table 2), mainly 4,6-dimethoxypyrimidine backbone. ), Suggesting that this spine is important for activity.
  • NC1 had no effect at all, whereas GPM1 had a 50% inhibitory effect at about 30 nM (FIG. 2).
  • GPM1 dynamics binding kinetics was observed by a surface plasmon resonance (SPR) using the BIAcore 3000.
  • SPR surface plasmon resonance
  • GPM1 binding site of gp96 (Han, JM, Park, SG, Liu, B., Park, BJ, Kim, JY, Jin, CH, Song, YW, Li, Z. & Kim, S. Am. J. Pathol. 170, 2042-2054 (2007)), to show more specifically, point mutations at L707, V706, V712, L713, F714, Y731, and M738, which are located in the AIMP1 binding region in gp96, which bind to GPM1. Influence on the SPR method was observed.
  • AIMP1 promotes the interaction of KDEL recetor-l (KDELRl) and gp96, which is responsible for the recovery of proteins with KDEL motifs from the Golgi to the endoplasmic reticulum (ER). Suppress (Semenza, JC, Hardwick, .G., Dean, N. & Pelham, HR Cell 61, 1349-57 (1990)).
  • KDELRl KDEL recetor-l
  • gp96 KDEL recetor-l
  • gp96 KDEL recetor-l
  • gp96 KDEL recetor-l
  • gp96 KDEL recetor-l
  • gp96 KDEL recetor-l
  • gp96 KDEL recetor-l
  • gp96 KDEL recetor-l
  • gp96 KDEL recetor-l
  • gp96 KDEL recetor-l
  • gp96 KDEL recet
  • GPM1 increases the interaction of gp96 with KDELR1 but decreased the interaction with AIMP1 (FIG. 4 left). Under the same conditions, GPM1 did not affect the intracellular levels of gp96, KDER1 and AIMP1 (Figure 4 right) and ATPase activity of gp96 ( Figure 23). GPM1, unlike NC1, reduces the surface gp96 of live mouse splenocytes (51) 161 « « 16) (FIG. 5).
  • DCs dendritic cells
  • DCs dendritic cells
  • GMP1 significantly reduced the amount of TNF- ⁇ secreted compared to NC1 (FIG. 6). Based on these results, it seems that GPM1 acts as a functional mimicry of AIMP1 in inhibiting gp96 surface translocation by increasing the interaction of gp96 and KDELR1 by interfering with the interaction of gp96 and AIMP1.
  • GPM1 could also reduce the levels of gp96 isolated from splenocytes of gp96tm transgenic mice with chronically elevated surface levels of gp96.
  • Each group consisted of nine female live mice at age. During the two-month period of intraperitoneal administration at a dose of 30 mg / kg, two mice out of nine died of Dex-treated mice, but mice treated with GPM1 showed no particular negative effect (FIG. 24).
  • GPM1 did not affect the number of CDllb + CDllcf macrophages (results not shown) and suppressed IC0SL levels in these cells (Figure 8 right). GPM1 reduces the number of B220 + and MHC class 11 + in the spleen (FIG. 9) and lymph nodes (FIGS. 26 and 27).
  • FACS flow cytometry
  • KR-S-015 compound is (S) -methyl 2- (4,6- di me t hoxypy rimidi ⁇ -2-y 1 oxy) -3 ⁇ me t hy 1 bu t anoa te is more effective than the " 15 compounds (KR-S-008 RS-012 KR-S-001 KR-S-024 KR-S-023 KR-S-017 KR-S-011 KR-S-007 KR-S- 013 KR-S-005 KR-S-009 KR-S-006 KR-S-020 KR-S-014 KR-S- ⁇ 022).
  • GPM1 treated mice The levels of nuclear antigen specific and DNA specific autoantibodies were reduced in GPM1 treated mice (FIGS. 10 and 11). Proteinuria, a sign of renal dysfunction, was also reduced after GMP1 treatment (FIG. 12). Although excipient-treated mice suffer from glomerulonephritis phenomena such as basal membrane thickening, severe hepatic vascular cell growth and abnormal glomerular sphere structure (left column on Figure 13) and glomerular immunoglobulin deposition (left on Figure 14), treatment with Dex or GPM1 Reduced this phenomenon (FIGS. 13 and 14, discontinued).
  • SLE accumulates in activated memory cells and contributes to activation and expansion of B cells.
  • mice were lupus animal models with spontaneous lupus symptoms that demonstrated the efficacy of 2,4-pyrimidine derivatives in this animal model.
  • mice Thirty-five male NZB / W F1 mice were used in each group to intraperitoneally administer the control group (5% DMS0 solution) and the experimental group (30 mg / kg dose of 2,4-pyrimidine derivative) once daily. Percentages of live mice were analyzed, except for mice that died from worsening symptoms. As a result, in the group administered (S) -methyl 2- (4, 6-dimethyoxyra- di ⁇ -2-y 1 oxy) -3-methylbutanoate, the rate of death from lupus significantly decreased. (Fig. 34).
  • the present inventors have found that the molecular anchor for the intracellular residence of g P 96.
  • the present invention provides a novel screening for the treatment of SLE using the above, and to prevent or treat SLE.

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Abstract

본 발명은 신규한 2, 4-피리미딘 유도체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 전신성 홍반성 낭창에 효과가 있는 피리미딘 유도체, 이를 유효성분으로 포함하는 전신성 홍반성 낭창 예방 및 치료용 조성물 및 이를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 gp96의 세포내 거류에 대한 분자 닻(anchor)인 AIMP1의 기능을 모방하여 gp96의 표면 전좌(translocation)를 저해하는 신규 물질을 찾았고, 이들 물질이 in vitro, in vivo상에서 자가면역질환 중 SLE 형질을 완화하여 SLE를 예방 및 치료하는 효과가 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 상기 기작을 이용하여 SLE의 치료제를 스크리닝하고 SLE를 예방 또는 치료하는 새로운 방법을 제공한다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
신규한 2, 4-피리미딘 유도체 및：이의 용도 [기술분야】
<ι> 본 출원은 2009년 11월 2일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2009-0105153 호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
<2>
<3> 본 발명은 신규한 2,4-피리미딘 유도체에 관한 것으로， 보다 상세하게는 전 신성 흥반성 낭창 등의 자가면역질환에 효과가 있는 2, 4-피리미딘 유도체， 이를 유 효셧분으로 포함하는 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스， 다발성경화증 등의 자가면역질환의 예방 및 치료용 조성물 및 이를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
<4>
【배경기술]
<5> 전신성 홍반성 낭창 (또는 전신성 홍반성 루푸스라고도 한다; systemic lupus erythematosus, SLE)은 원인블명의 자가면역 질환으로 피부 및 관절과 여러 장기에 서 다양한 증상이 나타나면서 악화와 호전을 반복하여 만성적인 경과를 보이는 류 머티스 질환의 일종이다. 일반적으로 2C卜 40대의 연령층에 잘 생기고, 여성에게 더 많이 나타난다. 인구 10만명 당 4-250명 정도가 이 질환을 갖고 있는 것으로 알려 져 있다.
<6>
<7> 원인은 정확하게 밝혀지지 않았지만 유전이나 호르몬， 환경적 요인， 특정한 바이러스, -극심한 과로와 스트레스, 특정한 약물 등에 의하여 발생하는 것으로 알 려져 있다. 햇빛의 자외선도 중요한 원인의 하나로 추정되고 있다. 유전적인 요인 의 경우 부모 모두 이 질환에 걸린 환자라고 해서 자식이나 형제가 모두 이 질환에 걸리지는 않으며 타인에게 전염되지도 않는다.
<8>
<9> 증상은 매우 다양하여 환자마다 다른 모습과 경과를 보인다/피부에 반점이 생기고 관절에 통증이 오기도 하며， 가슴의 통증을 호소하거나 열이 나고 온몸이 쑤시는 등 환자마다 증상이 다양하다. 일반적인 증상으로 가장 처음에 느끼는 증상 은 전신권태감과 피로감이고， 체중이 줄거나 열이 나는 경우도 있으며 류머티스 관 절염처럼 손아나 발의 작은 관절이 쑤시다가 점차 관절이 붓는 증상이 나타나기도 한다. 얼굴에 나비모양 붉은 반 이 생기기도 하는데 다른 몸이나 팔， 손등에 생기 기도 한다. 머라가 빠지거나 햇빛에 노출되면 하얗거나 파랗게 변하고 통증이 동반 되기도 한다. 흉막염이나 심낭염이 발생하여 숨쉴 때 가슴아 아프기도 하고 신장에 염증이 생겨서 혈뇨나 단백뇨가 나타나기도 한다.
<10>
<11> 이 질환은 만성 질환이고 치료를 지속적으로 받아야 되는 경우가 많아서 우 울증이 동반되기도 하고 중추신경계를 침범할 경우 두통과 같은 가벼운 증상에서부 터 팔다리가 마비되거나 의식이 흔탁해지는 뇌졸중과 같은 심각한 형태로 발전하기 도 하며， 정서징 "애나 주의력장애가 생기는 경우도 있다. 빈혈， 혈소판감소증， 백혈 구감소증 둥이 발생하는 경우도 많은데， 특히 혈소판감소증은 뇌출혈 등을 일으키 기도 하므로 주의해야 한다.
<12>
<i3> SLE의 치료는 증상이 다양하므로 각 환자의 증상에 따라서 증상을 최소화하 고 염증 반웅을 줄이고 정상적인 신체기능을 유지할 수 있도록 적절한 치료를 한 다. 일반적으로 자외선에 장시간 노출되면 질환이 악화되므로 햇볕에의 노출을 삼 가고 불가피한 경우에는 자외선 차단 크림을 바른다. 또한 피로하거나 과로해도 질 환이 악화되므로 적절한 휴식과 안정이 매우 중요하다. SLE의 증상 및 치료과정에 서 나타나는 정신적 스트레스의 문제는 증상과 문제들에 대해서 친구나 가족과 대 화하는 것 등을 통해서 완화시키고 있다.
<14>
<15> "현재 SLE의 치료를 위하여 코르티코스테로이드 (corticosteroids;
cortisone) 또는 프레드니손 (prednisone)과 같은 스테로이드계통의 치료제나， 아 스피린 (aspirin) , 이부프로펜 (ibuprofen; Motrin, Advil), 나프록센 (naproxen; Naprosyn) , 수린닥 (sulindac; Clinoril), 디클로페낙 (diclofenac; Voltaren), 피 록시캄 (piroxicam; Feldene), 케토프로펜 (ketoprofen; Orudis), 디플루니살 (dif lunisal； Dolobid), 나부메톤 (nabumetone; Relafen), 에토도락 (etodolac; Lodine) , 옥사프로진 (oxaprozin; Daypro) , 인도메타신 (indomethacin; Indocin) 등과 같은 NSAIDS (Non Steroidal Anti-Inflammatory Drugs), 하이드톡시클로로퀴 논 (hydroxychloroquine; Plaqueni 1 ) , 클로로퀴논 (chloroquine; Aralen)과 같은 항 말라리.아제， 아자티프린 (Azathiprine; Imuran) , 싸이클로포스파미드 (cyclophosphamide; Cytoxan)와 같은 면역억제제 ( i mmuno s up r e s s i ve agent)가 단독 또는 병용하여 투여되고 있으나， 스테로이드의 경우 체증 증가， 과민 반응， 흥분， 병적 쾌감， 우울증， 불면증 등올 비롯하여 당뇨병, 녹내장, 고혈압의 악화
(predisone)를 초래할 수 있고, 장기간 사용시 백내장， 근육의 약화， 뼈에 있는 혈 관의 괴사， 골다공증 등의 부작용을 초래할 수 있고, NSAIDS의 경우 위장 장애， 소 화불량, 장 출혈， 두통， 졸음， 고혈압, 신장 기능 장애 등의 부작용을， 항 말라리 아제의 경우 피부 발진， 색소 변화， 탈모， 피부 건조증， 위장 장해, 식욕 부진， 복 부 팽만， 구토， 경련， 오심, 설사 등의 부작용을， 그리고， 면역억제제의 경우 빈 혈, 백혈구 감소증， 감염 위험성 증가 등의 부작용을 나타낼 수 있어 새로운 치료 제의 개발이 시급한 실정이다.
<16>
【발명의 상세한 설명】
【가술적 과제】
<17> 이에 본 발명자들은 새로운 SLE의 예방 및 치료에 유용한 물질을 탐색하기 위하여 연구한 결과， gp96의 세포내 거류에 대한 분자 닻 (anchor)인 AIMP1의 기능 을 모방하여 gp96의 표면 전좌 (translocation)를 저해하는 물질을 찾았고， 이들 물 질이 in vitro, in vivo상에서 SLE 형질을 완화하여 gp69가 SLE를 조절하는데 잠재 적인 목표가 됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
<18>
<19> 따라서 본 발명의 목적은 신규한 2,4-피리미딘 유도체 및 이의 용도를 제공 하는 것이다.
<20>
【기술적 해결방법】
<21> 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또 는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
<22>
<23> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 SLE 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
<24> ,
<25> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 전신성 홍반성 낭창 예방 및 치료제 제조를 위한 용도를 제공한다.
<26> <27> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 본 발명의 화할물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 팔요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 것을 특징으로 하는 전신성 흥반성 낭창의 예방 및 치료방법을 제공한다. '
<28>
<29> 본 발명 의 또다른 목적을 달성하기 위하여 , 본 발명은
<30> (a) 시험 제제의 존재하에서 결합돤 AIMP1 및 gp96와 시험 제제를 접촉시 키 는 단계 ;
<3i> (b) AIMP1 및 gp96의 분리 활성을 측정하여 AIMP1 및 gp96의 결합능을 변화 시 키는 시험 제제를 선별하는 단계 ; 및 -
<32> (G) 선별된 제겨 ί가 전신성 홍반성 낭창의 증상을 치료 또는 완화하는 지를 테스트하는 단계를 포함하는 전신성 홍반성 낭창 치료제를 스크리닝 방법을 제공한 다.
<33>
<34> 이하, 본 발명을 상세히 설명 한다.
<35>
<36> 본 발명자들은 gp96의 세포내 거'류에 대한 분자 닻 (anchor)인 AIMP1의 기능 을 모방하여 gp96의 표면 전좌 (translocat ion)를 저해하는 물질을 찾았고， 이들 물 질이 in vitro, in vivo상에서 SLE 형 질을 완화하는지를 확인하였다 . 그 결과， 본 발명의 피 리미딘 화합물 및 이의 염 이 SLE의 증상을 예방 및 치료하는 효과가 있음 을 확인하였고， gp69가 SLE을 치료， 완화하는데 잠재적 인 목표가 될 수 있음을 확 인하였다.
<37>
<38> 따라서， 본 발명은 SLE의 예방 및 치료를 위하여 사용될 수 있는 화합물로 서， 화학식 1로 표시되는 피리미딘 '화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제 공한다.
<39>
<40> 【화학식 1】
Figure imgf000007_0001
<42>
<43> 상기에서,
<44> ¾은 수소， 직쇄 또는 분쇄의 포화 또는 불포화 (d - C10)알킬 또는 할로겐 치환된 직쇄 또는 분쇄의 포화 또는 불포화 (d - C10)알킬，
Figure imgf000007_0002
또 이고;
<45> [A는 N 또는 NO이고; m 및 n은 서로 독립적으로 0 내지 2의 정수를 나타내 며; X는 서로 동일하거나 상이할 수 있으며， 서로 독립적으로 직쇄 또는 분쇄의 포 화 또는 불포화 (d ― C7)알킬， 할로겐으로 치환된 직쇄 또는 분쇄의 포화 또는 불 포화 (d - C7)알킬, (d - C7)알콕시， (Ci - C7)알킬티오， (Ci - C7)알콕시카르보닐， 할로겐， 시아노， 니트로, 아미노, 아미노카르보닐, 벤질옥시 또는 카르복실산이다 .]
<46> ¾는 수소， 직쇄 또는 분쇄의 포화 또는 불포화 (d - C10)알킬 또는 할로겐으로 치 환된 직쇄 또는 분쇄의 포화 또는 불포화 (d - C10)알킬，
Figure imgf000007_0003
Figure imgf000008_0001
이고; '
<47> ¾는 히드톡시， (d - C7)알콕시, (d - c7)알킬티오， 단일 또는 복수 처환된
(d - c7)알킬아미노， 모포린， 피페라진， 피페리딘， 또는 단일 또는 복수 치환된 (d - c4)하이드록시아미드이고;
<48> ， ¾는 각각 독립적으로 수소， (d - C7)알킬， (d - c7)알콕시， 아릴알콕 시 또는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 아릴알킬이고，
<49> R4는 수소， 할로겐 , 카르복시아미드 또는 피리딘이다.
<50>
<51> 바람직하게는 상기 ¾은 수소， 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 (C7 - C10)아릴알킬， 비치환되거나 아민기에 의해 치환된 피리딘， (d - C7)알킬 또는
Figure imgf000008_0002
이고， R5는 (d - C7)알킬， 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 (C6)아릴 또는 티오펜이고， ¾는 히드톡시 또는 (d - c7)알콕시일 수 있으며， 더 바람직하게
는 상기 ¾은 수소， 벤질， 피리딘， 아미노피리딘， tert-부틸 또는
Figure imgf000008_0003
일 수 있다 [상기에서 ¾는 (d - C7)알킬， 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 (C6)아릴 또는 티오펜이고， ¾는 히드록시 또는 (d - C7)알콕시이다 .].
<52>
<53> 바람직하게는 상기 R2또는 ¾는 각각 독립적으로 수소， (d - C7)알킬， (d - C7)알콕시 또는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 아릴알킬이고， 더 바람직하게는 수소， 메틸， 메록시， tert-부록시， 트리플루오로메틸페녹시일 수 있다.
<54>
<55> 바람직하게는 상기 ¾는 수소， 클로로, 카르복시아미드 또는 피리딘이다.
<56> <57> 상기 ， R2, ¾, R5, ¾은 각각 1개의 화합물 또는 화합물 구조에 따라 허용되는 한 복수개의 화합물을 지정하는 것도 포함될 수 있다.
<58>
<59> "알킬 "은 쇄 내에 약 1개 내지 약 20개의 탄소 원자를 포함하는， 직쇄 또는 측쇄일 수 있는 지방족 탄화수소 그룹을 의미한다. 바람직한 알킬 그룹은 상기 쇄 내에 약 1개 내지 약 12개의 탄소 원자를 포함한다. 보다 바람직한 알킬 그룹은 상 기 쇄 내에 약 1개， 2개， 3개， 4개， 5개 또는 6개의 탄소 원자를 포함한다. 측쇄는 하나 이상의 저급 알킬 그룹， 예를 들면， 메틸， 에틸 또는 프로필이 선형 알킬 쇄 에 부착되어 있는 것을 의미한다. "저급 알킬' '은 직쇄 또는 측쇄일 수 있는 쇄 내 에 약 1개 내지 약 6개의 탄소 원자를 갖는 그룹을 의미한다. "알킬 "은 치환되지 않을 수 있거나 또는, 동일하거나 또는 상이할 수 있는 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있고 각 치환체는 할로겐, 알킬， 아릴， 사이클로알킬， 시아노， 하이드록시， 알콕시， 알킬티오， 아미노， 카£복시 등일 수 있다. 바람직하게 알킬 은 부틸 또는 이소부틸일 수 있다.
<60>
<61> "알콕시 ''는 알킬 그룹이 앞서 기재된 바와 같은， 알킬 -0-그룹을 의미한다.
적합한 알콕시 그룹의 예로는 메톡시, 에톡시， n-프로폭시， 이소프로폭시 및 n-부 록시를 포함한다. 모 잔기에 대한 결합은 산소를 통한다. 바람직하게는 알콕시는 메톡시일 수 있다.
<62>
<63> "아릴 "은 방향족 탄화수소 고리계를 의미하며, 이의 예로는 페닐， 인데닐， 인다닐， 나프틸 및 플루오레닐 등이 있으며, 바람직하게는 (6C)아릴일 수 있다.
<64>
<65> "할로겐"은 불소 원자， 염소 원자， 브롬 원자 및 요오드 원자를 포함할 수 있고， 바람직하게는 불소 원자， 염소 원자 또는 브름 원자일 수 있다.
<66>
<67>" ' "할로겐에 의해 치환된 알킬"은 1 내지 3개의 할로겐 원자 (들)에 의해 치환 된 알킬기를 의미하며， 예를 들어， 플루오로메틸, 클로로메틸， 디플루오로메틸, 디 클로로-메틸, 디브로모메틸， 트리플루오로메틸， 트리클로로메틸， 플루오로에틸， 클 로로에틸, 트리플루오로에틸， 트리클로로에틸， 플루오로프로필， 플루오로부틸， 플 루오로핵실 등이고， 바람직하게는 할로겐으로 치환된 (C1-C6)알킬， 더욱 바람직하 게는 염소 또는 불소로 치환된 (C1-C6)알킬일 수 있다. <68>
<69> "할로겐에 의해 치환된 아릴' '은 1 내지 3개의 할로겐 원자 (들)에 의해 치환 된 아릴기를 의미하며, 예를 들어， 플루오로페 ^， 디플루오로페닐， 트리플루오로페 닐， 클로로페닐, 디클로로페닐， 트리클로로페닐， 브로모페닐， 디브로모페닐， 트리 브로모페닐， 디플루오로벤질， 디클로로벤질， 디브로모벤질 등이 있으며， 바람직하 게는 클로로페닐일수 있다.
<70>
<71> "알킬에 의해 치환된 아릴" 또는 "아릴알킬"은 1 내지 3개의 알킬 치환체에, ᅳ의해 치환된 아릴기를 의미하며， 예를 들어， 벤질， 에틸페닐, 프로필페닐， 디메틸 페닐， 디에틸페닐， 트리메틸페닐， 트리에틸페닐 등이 있으며, 바람직하게는 벤질일 수 있다.
<72>
<73> 피리딘 (pyridine)은 5개의 탄소 원자와 1개의 질소 원자가 6개의 원자로 이 루어진 고리구조를 이루고 있는 방향족 헤테로고리 계열에 속하는 유기화합물을 의 미한다.
<74>
<75> 한편, 본 발명의 화합물은 바람직하게는 하기 화학식 2의 (S)-메틸 2-(4，6-디 메특시피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸부타노에이트 ( (S)-methyl 2-(4,6- d i met hoxypyr i mi d i η-2-y 1 oxy ) -3-met hy 1 but anoat e ) , 하기 화학식 3의 메틸 2-(5_클로 로 -4-메록시—6-메틸피리미딘 -2-일옥시)프로파노에이트 (methyl 2-(5-chloro-4- me t hoxy-6-me t hy 1 py r i m i d i η-2-y 1 oxy ) pr opanoa t e ) , 하기 화학식 4의 메틸 2一 (4—브로 모페닐 )-2— (4 ,6-디메톡시피리미딘 -2—일옥시 )아세테이트 (methyl 2-(4-bromophenyl ) - 2- ( 4 , 6-d i me t hoxypyr i m i d i η-2-y 1 oxy ) ace t at e ) , 하기 화학식 5의 메틸 2-(4,6-디메 특시피리미딘 _2-일옥시 )-3-메틸부타노에이트 (methyl 2- ( 4 , 6-d i me t hoxypyr i m i d i n-2- y 1 oxy) -3-met hyl but anoat e) , 하기 화학식 6의 메틸 2-(4, 6-디메특시피리미딘 -2-일옥 시 )-2- (티오펜 -2-일)아세테이트 (methyl 2— (4， 6— dimethoxypyr imidin-2-yloxy)-2- (thiophen-2-yl)acetate), 하기、화학식 7의 2-(4，6-디메록시피리미딘 -2-일옥시 )-2- 5)| ^ ό} |] j- ( 2- ( 4 , 6-d i me t hoxypyr i m i d i η-2-y 1 oxy ) -2-pheny 1 ace t i c acid) , 하기 화 학식 8의 (10-2-(4,6-디메톡시피리미딘-2-일옥시)-2-페닐아세트산((&)-2-(4,6- d i me t hoxypyr i m i d i η-2-y 1 oxy ) -2-pheny 1 ac e t i c acid) , 하기 화학식 9의 2—(벤질옥 시) -4 , 6-디메록시피리미딘 -5-카르복사마이드 ( 2- ( benzy 1 oxy )-4,6- d i me t hoxypyr i m i d i ne-5-car boxam i de ) , 하기 화학식 10의 2-(2-클로로벤질옥시) - 4， 6-디메톡시피리미딘 ( 2— ( 2-ch 1 orobenzy 1 oxy ) -4， 6-d i methoxypyr imidine), 하기 화 학식 11의 4， 6-디메록시 -2— (피리딘 -4-일옥시)피리미딘 ( 4， 6-d i methoxy-2- ( pyr idin- 4-yloxy)pyrimidine), 하기 화학식 12의 4，6-디 -ieri-부록시 -2- (피리딘 -3-일옥시) 피리미딘 (4,6-di— ieri-butoxy-2-(pyridin-3-yloxy)pyrimidine), 하기 화학식 13의 2,4-디 -ieri—부특시— 5- (피리딘 -2—일)피리미딘 ^^-di-ieri-butoxy-S-Cpyridin-S- yDpyrimidine), 하가 화학식 14의 4,6-비스 (4-플루오로 -3- (트리플루오로메틸)페녹 시)피리미딘一 2—올 (4,6— bis(4—fluoro—3— (trifl uor omethyl) phenoxy )pyrimidin-2-ol ) , 하기, 화학식 15의 3-(4,6-디메록시피리버딘-2-일옥시)피리딘—2-아민(3-(4，6- d i me t hoxypy r i m i d i η-2-y 1 oxy ) py r i d i η-2-am i ne ) , 하기 화학식 17와 2— (4,6—디메톡시 -피리미딘 -2-일옥시) -Ν,Ν-디에틸 -3—메틸 -부틸 아미드 (2— ^-Dimethoxy-pyrimidin- ^yloxy N.N-diethyl-S-methyl-butyl amide), 화학식 18의 N-부틸 -2— (4, 6-디메특 시-피리미딘 -2-일옥시 )—3-메틸 -부틸 아미드 ( N-Buty 1-2- (4, 6-d i methoxy-pyr imidin- 2-yloxy)-3-methyl-butyl amide), 화학식 19의 2-(4，6-디메록시-피리미딘 -2-일옥 시) -3-메틸 -N-페닐—부틸 아미드 ( 2— ( 4 , 6-D i me t hoxy-pyr imidi η-2-y 1 oxy) -3-me thy 1 -N- phenyl-butyl amide), 화학식 20의 N-벤질 -2-(4，6-디메특시-피리미딘 -2-일옥시 )— 3— 메틸一부틸 아미드 ( N-Benzy 1-2-(4, 6-d i me t hoxy-pyr imidin-2-yloxy) -3-methy 1 -butyl amide), 화학식 21의 2-(4，6-디메특시-피리미딘 -2-일옥시) -N-이소프로필 -3-메틸-부 틸 아미드 (2一 (4,6— dimet hoxy-pyr imidin-2-yloxy)—N_ isopropyl -3-me t hy 1 -buty 1 amide), —학식 22의 2-(4，6_디메특시-피리미딘 -2-일옥시) -N-메톡시 -3,N-디메틸-부 틸 아미드 (2ᅳ (4,6ᅳ di me t hoxy-pyr imidin-2-yloxy) -N-me t hoxy-3 , N_d i me t hy 1—but y 1 amide), 화학식 23의 2-(4，6-디메특시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸 -1-피페리딘 -1-일 一부탄一 1—온) (2-(4, 6~d i me t hoxy-pyr imidi η-2-y 1 oxy ) -3-methy 1 - 1ᅳ p i per i d i n— l—y 1一 butan-l-one), 화학식 24의 2— (4, 6-디메톡시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸 -1-몰포린- 4一일一부탄一 1一은 (2-(4, 6-d i methoxy-pyr imidi η-2-y 1 oxy ) -3-methy 1 - 1-morpho 1 i η-4-y 1一 butan-l-one), 화학식 25의 2-(4，6-디메톡시―피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸-부틸산 (2- ( 4 , 6-d i me t hoxy-pyr imidi η-2-y 1 oxy ) -3-me t hy 1 -but y r i c acid) , 화학식 26의 2ᅳ (4,6- 디메록시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸-부틸산 메틸 에스테르 (2— (4,6-Dimethoxy- py r i m i d i η-2-y 1 oxy ) -3-me t hy 1 -bu t y r i c acid methyl ester) , 화학식 27의 ᄂ_2_(4，6ᅳ 디메톡시-피리미딘 -2-일옥시)—프로피오닉 산 메틸 에스테르 (L-2— (4,6-Dimethoxy- py r imidi η-2-y 1 oxy ) -prop i on i c acid methyl ester) , 화학식 28의 D— 2— (4,6—디메톡 시-피리미딘 -2-일옥시) -프로피오닉 산 메틸 에스테르 (D-2— (^S-Dimethoxy- pyrimidin—S—yloxy^propionic acid methyl ester) , 화학식 29의 2— (4,6一디메톡시— 피리미.딘 -2-일옥시 )-2-메틸 -프로피오닉 산 메틸 에스테르 (2-(4，6— Dimethoxy- pyr i m i d i η-2-y 1 oxy ) -2-me t hy 1 -pr op i on i c acid methyl ester) , 화학식 30의 D-3- (4, 6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시 )—부틸산 메틸 에스테르 (D-S- ^-Dimethoxy- pyrimidin— 2-yloxy)-but:yric acid methyl ester), 화학식 31의 L— 2-(4，6-디메특시- 피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸-부틸산 메틸 에스테 s(L-2-(4,6— Dimethoxy-pyrimidin- 2-yloxy)-3-methyl-butyric acid methyl ester), 화학식 32의 (4, 6-디메톡시 -피리 미딘 -2-일옥시 ) -페닐-아세트산 메틸 에스테르 ( (4, 6-Dimethoxy-pyr imidin-2-yloxy)- phenyl -acetic acid methyl ester), 화학식 33의 (4，6-디메특시-피리미딘 -2-일옥 시 ¾-0}^1 (4 , 6-Dimethoxy-pyr imi din-2-yl oxy )-phenyl-acet i c acid) , 화학 식 34의 2-(4， 6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시) -N-이소프로필 -2-페닐-아세트아미드 ( 2- (4， 6-D i met hoxy-pyr imidi η-2-y 1 oxy )—N— i sopropy 1 -2-pheny 1— ace t am ide) , 화학식 35의 N-벤질 -2-(4，6-디메톡시-피리미딘 -2-일옥시 )-2-페닐-아세트아미드 (N-Benzy卜 2- ( 4 , 6-d i me t hoxy-pyr i m i d i η-2-y 1 oxy ) -2-pheny 1-acetamide), 화학식 36의 N-부틸ᅳ 2-(4，6-디메톡시-피리미딘 -2-일옥시
Figure imgf000012_0001
dimethoxy—pyrimidin— 2— yloxy)—2— pheny卜 acetami 화학식 37의 2— (4,6—디메톡시 -피리미딘 -2-일옥시 )-N,N—디에틸 -2—페닐-아세트아미드 ^- ^-Dimethoxy- pyrimidin-S-yloxyH N-diethyl-S-phenyl-acetainide), 하학식 38의 L-2-(4,6-디메 톡시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸—부틸산 (L— 2-(4,6_Dimethoxy-pyriπlidin-2-yloxy)- 3— methy卜 butyric acid), 화학식 39의 D-2-(4,6-디메특시-피리미딘 -2-일옥시) -프로 피오닉 ^ ( D-2- ( 4 , 6-D i me t hoxy-pyr imidi η-2-y 1 oxy ) -pr op i on i c acid) 및 화학식 40 의 L-2-(4, 6-디메톡시-피리미딘 -2-일옥시) -프로피오닉
Figure imgf000012_0002
pyrimidinᅳ 2-yloxy)ᅳ propionic acid) 일 수 있다.
<76> 이 때， 하기 화학식에서 "Me"는 ^메틸기를 나타낸다.
<77>
<78> 【화학식 2]
Figure imgf000012_0003
<79>
<80> <81>
<82>
<83> 【화학식 3]
Figure imgf000013_0001
<85> 【화학식 4】
<86>
Figure imgf000013_0002
<87> 【화학식 5】
Figure imgf000013_0003
<89> 【화학식 6]
Figure imgf000013_0004
<90>
<91>
<92> 【화학식 7】
Figure imgf000014_0001
<96> 【화학식 9]
Figure imgf000014_0002
<98> 【화학식 10】
Figure imgf000014_0003
<100>
<101> 【화학식 11] //:/ O 9s9/.000SSMl><in0ZAV
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οιι> <
//:/ O/-000SSMl><i 060sonozAV
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二
【】？5 <
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<125> 【화학식 20】
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【화학식 23]
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【화학식 24]
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【화학식 25]
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【화학식 26]
Figure imgf000018_0003
【화학식 28]
Figure imgf000018_0004
【화학식 29]
Figure imgf000019_0001
<148> 【화학식 30】
Figure imgf000019_0002
<150> 【화학식 31]
<151>
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<152> 32]
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<154>
<155>
Figure imgf000019_0005
<157>
<158> 【화학식 34]
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Figure imgf000020_0002
Figure imgf000021_0001
<174> 【화학식 40】
Figure imgf000021_0002
<176>
<177> 본 발명에 따른 제조방법을 반웅식 1에 예시하였으며, 하기의 제조방법이 본 발명에 따른 화학식 1 화합물을 제조하는 방법을 한정하는 것은 아니며， 하기의 제 조방법의 변형은 당업자에게 자명할 것이며， 달리 언급이 없는 한 하기 반웅식의 치환체의 정의는 화학식 1에서의 정의와 동일하다.
<178> 반웅식 1에 도시된 바와 같이 알콜. (화합물 1)과 2，4-피리미딘 (화합물 2)을
DMF 매질 내에서 K2C03 등의 염기를 사용하여 반웅시킴으로서 본 발명에 따른 화학 식 1로 표시되는 2, 4-피리미딘 화합물을 제조할 수 있으며， 그 외의 다른 방법으로 도 합성할 수 있다. 여기에서 화합물 2의 X는 주로 메탄설포닐 등의 알킬 설포닐 또는 알킬 설폭시드， 또는 염소, 불소 등의 할로겐이고， ¾ R2 ¾ R4는 상기 화학식
1에서 정의한 바와 같다.
<179>
<180> [반웅식 1]
Figure imgf000021_0003
<182> ：화합물 1> <화합물 2> <화학식 1>
<183>
<184> 본 발명의 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 세포내에서
AIMP1의 기능을 모방하여 gp96의 표면 전좌 (translocation)를 저해하고， in vitro, in vivo상에서 SLE 형질 또는 증상을 예방, 완화， 치료하는 효과를 나타낸다. 따라 서， 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 SLE를 예방 및 치료 하는 효과를 가진다.
<185>
<186> 본 발명쎄서 "gp96", "gp96 단백질" 또는 "gp96 폴리펩티드"는 열층격 단백 질 (heat shock protein)의 일종으로， gp96 단백질은 당업계에 알려진 gp96 단백질 일 수 있으나， 바람직하게는 Genbank Accession No. NM_003299, AK025459, AJ890084, X15187, NM_003299.1, M33716.1에 표시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩 티드일 수 있다.
<187>
<i88> gp96은 HSP90 계열의 ER에 존재하는 단백질로 ER과 Golgi 사이를 recycling 하면서 chaperone 기능을 담당한다 (Li, Z., Dai, J. , Zheng, Η., Liu, Β. & Caudi 11 , M. Front .Biosci . 7， d731-751( 2002) .) . gp96는 innate, adaptive imunity에 관련되어 있다는 것이 알려져 있으며 (Srivastava, P.K.， Menoret , A., Basu, S. , Binder, R.J. & McQuade, K.L. Imunity 8, 657-665(1998).) gp96가 세 포 표면에 노출이 되는 경우 dendritic cell (DC) maturation과 같은 면역 활성 작 용을 유도한다 (Hi If , N. , Singh-Jasuja, Η. , Schwarzmaier , P., Gouttefangeas , C, Rammensee, H.G. & Schild, H. Blood 99， 3676-3682(2002).). gp96은 CD91, TLR2/4를 receptor로 하여 DC maturation을 유도하고 염증성 사이토카인 TNF alpha 를 분비하게 만든다 (Binder, R.J. , Han, D.K. & Srivastava, P.K. Nat . Immunol . 1, 151-155(2000). , Vabulas, R.M., Braedel, S.， Hilf , N. , Singh-Jasuja, H., Herter , S. , Ahmad-Nejad, P., Kirschning, C.J., Da Costa, C. , Rammensee , H.G. , Wagner , H. & Schild, H. J.Biol.Chem. 277， 20847-20853(2002).) . 최근 gp96 tansgenic mouse의 경우 루프스와 같은 자가면역 증상을 나타내며 (Liu, B., Dai, J., Zheng, H. , Stoilova, D. , Sun, S. & Li， Z. Proc.Natl .Acad. Sci .USA 100， 15824-15829(2003).) 류마티스 관절염 부위에서 발현이 크게 증가하는 것으로 알려 져 있다 (Huang, Q.Q. , Sobkoviak, R.， Jockheck-Clark, A.R. , Shi, B., Mandelin, A.M. 2nd, Tak, P.P. , Haines, G.K. 3rd, Nicchitta, C.V. & Pope, R.M. J. Immunol . 182, 4965-4973(2009)).
<189>
<i90> 본 발명에서 "AIMPKARS-interacting multi-functional protein D", "AIMP1 단백질" 또는. "AIMP1 폴리펩티드"는 종래에 p43 단백질로 알려진 것으로서 본 발명 자들에 의해 재명명 된 것이다 (Sang Gyu Park, et al . , Trends in Biochemical Sciences, 30:569-574， 2005) . 상기 AIMP1은 312개의 아미노산으로 이루어진 단백 질로서, 다중 tRNA 합성효소 복합체 (mult-tRNA synthetase complex)에 결합하여 (Deutscher, M: P. , Method Enzymol, 29， 577-583,1974； Dang C. V. et al . , Int. J. Biochem. 14， 539-543, 1982； Mirande, M. et a\ ., EMB0 J. I, 733-736, 1982； Yang D. C. et al . , Curr. Top Cell. Regul.26, 325-335, 1985) 상기 다중 -tRNA 합 성효소의 .촉매적 활성 (catalytic activity)을 증진시키는 단백질이다 (Park S. G. et al., J. Biol . Chem. 274, 16673-16676, 1999) . AIMP1은 전립선 암， 면역 및 형질전환 세포를 포함하는 다양한 형태의 세포로부터 분비되며 이의 분비는 TNFa 및 열 쇼크와 같은 다양한 자극에 의해 유도된다 (Park S. G. et al . , Am. J. Pathol., 166, 387—398， 2005； Barnett G. et al. , Cancer Res. 60， 2850-2857, 2000). 분비된 AIMP1은 탄핵구 /마크로파지， 내피세포 및 섬유아세포와 같은 다양 한 표적세포에 작용하는 것으로 알려져 있다.
<191>
<192> 본 발명와 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 염은 in vitro, in vivo상에 서 SLE 형질 또는 증상을 예방， 완화， 치료하므로 SLE의 예방 및 치료에 적용할 수 있다. 따라서， 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 SLE 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성 ᅳ 물은 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 0.001 내지 99.999중 량% 및 잔량의 담체를 포함하는 조성을 가질 수 있다. 상기 담체는 약학적으로 허 용 가능한 담체일 수 있다.
<193> 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으 로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 전신성 흥반성 낭창을 치료 또는 예방하기에 층분한 양을 말한다. 본 발명에 따른 본 발명 의 화합물의 약학적으로 유효한 양으로는 0.00001 내지 100 mg/day/kg 체중이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증정도， 환자의 연령， 체중， 건강상태, 성별， 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화 될 수 있다.
<194>
<195> 한편 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능 한 염의 전신성 흥반성 낭창 예방 및 치료제 제조를 위한용도를 제공한다.
<196> 또한 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능 한 염을 이를 필요로 하는개체에 유효—량으로 투여하는 것을 특징으로 하는 전신성 홍반성 낭창의 예방 및 치료 방법을 제공한다. 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 화학식 2 내지 화학식 15 및 화학식 17 내지 화학식 40으로 기재된 화합물로 이루 어진 군에서 선택된 어느하나일 수 있다.
<197>
<198> 본 발명의 화합물은 그 자체 또는 염， 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용가능한'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때 , 통상적으로 알레르기 반 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기 산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나， 구연산， 초산， 젖산, 주석산， 말레인산， 푸마르산， 포름산， 프로피온산， 옥살산， 트리플로오로아 세트산, 벤조산， 글루콘산， 메타술폰산， 글리콜산, 숙신산， 4-를루엔술폰산， 글루 탐산 및 -아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니 나， 염산, 브롬산， 황산 및 인산을 포함한다.
<199>
<200> 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 유효량으로 경구， 경피， 피하， 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때， 전신성 흥반성 낭창의 예방 및 치료효과를 나타내는 양을 말하며， 상기 '개체 (subject)'란 동물， 바람직하게는 포유동물， 특 히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포， 조직, 기관 등일 수 도 있다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자 (patient)일 수 있다.
<201>
<202> 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 그 자체를 그대로 투여하거나 상술한 바와 같은 여러 제형으로 제조되어 투여될 수 있으며 , 바람직하 게는 원하는 효과 즉， 전신성 흥반성 낭창 예방 및 치료효과가 도출될 때까지 투여 될 수 있다. 본 발명의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은 당업계에 공지 된 방법에 따라 다양한 경로로 투여될 수 있다. 즉， 경구 또는 비경구, 예컨대 구 강， 근육내， 정맥내, 피내, 동맥내， 골수내， 경막내, 복강내, 비강내， 질내， 직장 내， 설하 또는 피하 투여되거나， 위장관, 점막 또는 호흡기로 투여될 수 있다. 예 ' 컨대， 본 발명의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 피부에 직접적으로 도포하는 방법 또는 상기 폴리펩티드를 주사용 제형으로 제조하여 이를 30 게이지 의 가는 주사 바늘로 피부 아래층에 일정량을 주입하거나 주사 바늘로 피부를 가볍 게 단자 (prick)하는 방법으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 피부에 직접 도포될 수 있다. 또한 본 발명의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은 표적 세포나 조직 (예: 피부 세포나 피부 조직)에 고친화성 결합을 유발하는 분자와 결합되거나 상기 분자 내에 캡술화된 형태로 투여될 수도 있다. 본 발명의 화합물 및 이의 약 학적으로 허용가능한 염은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 스테롤 (예: 콜레스테 를)， 지질 (예: 양이온 지질， 비로좀 또는 리포좀) 또는 표적 세포 특이적 결합제 ( 여 1: 표적세포 특이적 수용체에 의해 인지되는 리간드)와 결합될 수 있다. 적합한 커플링제 또는 가교제로는 예컨대 단백질 A, 카보디이미드， N-숙신이미딜 -3- (2-피 리딜디티오)프로피오테이트 (SPDP) 등을 포함할 수 있다.
<203>
<204> 본 발명의 화합물 또는 이를 포함하는 조성물을 임상적으로 투여되는 경우에 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여에 적합한 단위투여형의 약제학적 제 형으로 제제화시켜 사용할 수 있다. 일반적인 의약품의 형태로 제제화할 경우에는 보통 사용하는 층진제， 증량제， 결합제， 습윤제, 붕해제， 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제， 환제， 산제， 과립제， 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 화합물에 적 어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분， 탄산칼슘， 수크로스 또는 락토오스， 젤 라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현_탁제， 내용액제， 유 제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물， 리퀴드 파라핀 이외 에 여러 가지 부형제， 예를 들면 습윤제， 감미제， 방향제， 본존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액， 비수성용제， 현탁제， 유제, 동 결건조제제， 연고제， 크림제가 포함된다. 비수성용제， 현탁용제로는 프로필렌글리 콜， 폴리에틸렌 글리콜， 올리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸올레이트와 같은 주 사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
<205>
<206> 또한, 본 발명의 화합물 또는 이를 포함하는 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며， 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사， 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방 식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 화학식 1 내 지 화학식 15 또는 화학식 17 내지 화학식 40의 화합물을 안정제 또는 완층제와 함 께 물에서 흔합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다. 투약 단위는， 예를 들면 개별 투약량의 1， 2, 3 또는 4배 로， 또는 1/2， 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며， 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2， 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체증， 연 령， 성별， 건강상태， 식이, 투여시간， 투여방법 및 배설 그리고 약제 흔합 및 질환 의 중증도에 따라 변화시킬 수 있다.
<207>
<208> 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌
(Remington' s Pharmaceutical Science, 15th Edit ion, 1975.. Mack Publishing Company, East on, Pennsylvania 18042, Chapter 87： Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
<209>
<210> 한편, 본 발명은
<2ii> (a) 시험 제제의 존재하에서 결합된 AIMP1 및 gp96와 시험 제제를 접촉시키 는 단계 ;
<2i2> (b) AIMP1 및 gp96의 분리 활성을 측정하여 AIMP1 및 gp96의 결합능을 변화 시키는 시험 제제를 선별하는.단계; 및
<213> (c) 선별된 제제가 전신성 흥반성 낭창의 증상을 치료 또는 완화하는 지를 테스트하는 단계를 포함하는 전신성 흥반성 낭창 치료제를 스크리닝하는 방법을 제 공한다.
<214>
<215> 상기 스크리닝 방법은 당업계에 공지된 다양한 생화학적 및 분자생물학적 기 술이 상기 방법을 실시하는데 이용될 수 있다. 상기 기술은 다음의 문헌에 개시되 어 있다: Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, N.Y. , Second(1998) and Third(2000) Editions; and Ausubel et al . , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & S이 Inc. , New York( 1987-1999).
<216>
<2i7> 바람직하게는, 상기 시험 제제가 먼저 AIMP1 및 gp96의 결합을 조절하는 능 력이 있는지 어세이한다 (1차 어세이 단계). 구체적으로 1차 단계에서는 시험 제제 의 존재 하에서 gp96와 표면 전좌를 어세이 (assay)하여 AIMP1 및 gp96의 결합을 조 절하는 조절 제제 (modulating agent)를 규명 (identify)한다. 보다 바람직하게는 다 음의 단계를 포함할수 있다:
<2i8> (a) 시험 제제의 존재하에서 결합된 AIMP1 및 gp96와 시험 제제를 접촉시키 는 단계 ;
<2i9> (b) AIMP1 및 gp96의 분리 활성을 측정하여 AIMP1 및 gp96의 결합능을 변화 시키는 시험 제제를 선별하는 단계.
<220>
<22i> 1차 어세이 단계에서는 AIMP1 및 gp96의 결합능에 대한 조절이 어세이될 수 있다. 예컨대， 시험 제제는 AIMP1 및 gp96 결합 또는 간접적으로 gp96의 표면 전좌 를 조절하는 활성이 있는지에 대하여 어세이될 수 있다.
<222>
<223> 이후, 상기 1차 어세이 단계를 통하여 AIMP1 및 gp96의 결합능을 조절하는 제제를 규명한 후， 상기 시험 제제가 전신성 흥반성 낭창의 치료 및 완화 (경감) 효 과를 보이는 지를 테스트한다 (2차 시험 단계).
<224>
<225> 위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 규명된 AIMP1 및 gp96의 결합능을 조절하는 제제는 전신성 홍반성 낭창의 증상을 치료 또는 완화할 수 있 다. 만약， 상기 1차 어세이 단계에서 규명된 시험 제제가 gp96의 표면 이동을 조절 한다면， 전신성 홍반성 낭창의 증상을 치료, 경감또는 완화할 수 있다.
<226>
<227> 상기 1차 및 2차 단계 모두， 변하지 않은 (intact) gp96 단백질 또는 AIMP1 단백질 또는 이들의 단편， 아날로그， 또는 기능적 동등물을 사용할 수 있다. 이들 어세이에 사용될 수 있는 단편은 일반적으로 gp96 단백질 또는 AIMP1 단백질의 각 각의 생물학적 활성을 하나 이상 보유한다. 또한 상기 단편 또는 아날로그를 포함 하는 융합 단백질이 시험 제제를 위한 스크리닝에 사용될 수 있다. gp96 단백질 또 는 AIMP1 단백질의 기능적 동둥물은 아미노산 결실 및 /또는 삽입 및 /또는 치환을 가지기는 하나 각각 gp96 단백질 또는 AIMP1 단백질와 동일한 생체활성을 보유하는 것이므로 본 발명의 스크리닝 방법을 실시하는데 사용될 수 있다.
<228>
<229> 당업계에 통상적으로 실시되고 있는 다양한 어세이들이 gp96 단백질과 AIMP1 단백질의 결합능 또는 gp96의 표면 전좌를 조절하는 제제를 규명하는데 사용될 수 있다. 바람직하게， 상기 제제는 세포 기반 어세이 시스템 (cell based assay system)으로 스크리닝될 수 있다. 예컨대， 스크리닝하기 위한 전형적인 세포 기반 어세이에서 (즉， 2차 시험 단계에서)， 시험 제제의 존재 하에서 리포터 유전자 활성 (예: 효소 활성)을 측정하고， 이를 시험 제제의 부재 하에서의 리포터 유전자의 활 성과 비교한다. 상기 리포터 유전자는 당업계에 공지된 임의의 검출가능한 폴리펩 티드 (반응 또는 리포터 폴리펩티드)， 예컨대， 형광 또는 인광 (phosphorescence)에 의해 검출가능한 플리펩티드나 그것이 보유하고 있는 효소 활성에 의해 검출가능한 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 검출가능한 반웅 폴리펩티드 (detectable reponse polypeptide)는, 예컨대, 루시퍼라제, 알파-글루쿠로니다제 (glucuronidase) , 알파- 갈락토시다제， 클로람페니콜 아세틸 전이효소， 녹색 형광 단백질， 강화된 녹색 형 광 단백질 및 인간 분비된 알칼린 인산화효소일 수 있다.
<230>
<231> 상기 기재한 세포 -기반 어세이 이외에， 비 -세포 기반 방법에 의해서도 스크 리닝될 수 있다. 상기 방법은， 예컨대， 모빌리티 쉬프트 DNA 결합 어세이 (mobility shift DNA-binding assays), 메틸화 및 우라실 간섭 어세이 (methyl ati on and uracil interference assays) , DNase 및 히드톡시 라디칼 풋프린팅 분석 (DNase and hydroxy 1 radical footprint ing analysis) , 형광 편광 (fluorescence polarization) 및 UV 교차결합 (crossl inking) 또는 화학적 가교제 (cross— 1 inkers)를 포함한다. 일 반적인 개요는 Ausubel 등의 문헌에 개시되어 있다 (Ausubel et al . , supra, chapter 12， DNA-Protein Interaction). 핵산 및 DNA/RNA 결합 단백질을 포함하는 공동-결합된 단백질 (co-associating protein)을 분리하는 기술은， 절단가능한 가교 게 디티오비스 (dithiobis)(succinimidylpropionate) 및 3，3'-디티오비스 (sulfosuccinimidyl-propionate)를 포함하는 UV 교차결합 또는 화학적 가교제를 포 함한다 (McLaughlin, Am. J. Hum. Genet . , 59 :561-569, 1996； Tang, Biochemistry, 35:8216-8225, 1996； Lingner, Proc. Natl. Acad. Sci . U.S.A. , 93： 10712, 1996； and Chodosh, Mol . Cell. Biol., 6:4723-4733, 1986) .
<232>
<233> 아울러， gp96 단백질과 AIMP1 단백질의 결합능 또는 gp96의 표면 전좌의 조 절은 통상의 단백질-단백질 상호작용 검출방법을 통하여 간편하게 확인할 수 있다. 이러한 방법은 HTS(high-throughput screening)에의 적용에 유용하게 사용될 수 있 다. 이 때, 접촉하는 gp96 단백질과 AIMP1 단백질은 각각 세포내에서 발현되거나 주입된 형태일 수 있으며, 시험관내에서 미정제되거나, 정제 또는 부분정제된 상태 로 시혈물질 또는 후보물질과 접촉될 수 있으며, 이 때의 gp96 단백질과 AIMP1 단 백질의 상태는 상호작용 저해 여부의 측정방법에 따라 적절하게 선택될 수 있다.
<234>
<235> gp96 단백질과 AIMP1 단백질의 결합능의 저해는 당업계에 공지된 단백질-단 백질 상호작용의 검출 방법을 이용할 수 있으며， 예를 들어， 시험관 내 단백질-단 백질 결합 어세이 (시험관 내 풀 -다운 어세이)， EMSA(electrophoretic mobility shift assays), 단백질 결합을 위한 면역어세이， 기능적 어세이 (인산화 어세이 등 )， 비면역침전 어세이， 면역침전 웨스턴 블럿 어세이， 면역-공동-위치화 어세이 (immuno— co— localization), 교차결합 (cross— 1 inking)， 친화크로마토그래피 (affinity chromatography) , 면역침강법 ( i mmunopr ec i p i t at i on , IP) , 이스트 투 하 이브리드 (yeast two-hybrid, Y2H), 형광공명에너지전이 (fluorescence resonance energy transfer, FRET) , ᅵ 분할 단백질의 재결합 (bin lecular fluorescence complementation, Bi-FC) 등 당업계에 공지된 다양한 방법으로 수행될 수 있다.
<236>
<237> 아울러， 단백질 칩에 의해 gp96 단백질 또는 AIMP1 단백질을 고체 (금속, 유 리등) 표면에 마이크로어레이 (microarray)시키고 다른 단백질 (예를 들어， gp96을 고정화한 경우 AIMP1) 및 후보물질과 단백질 칩과 배양한 다음 gp96 단백질과 AIMP1 단백질의 결합능의 저해를 형광 분석기， SPR(Surface Plasraon Resonance), MALDI (matrix assisted laser desorpt ion/ionizat ion)-T0F(t ime~of-f 1 ight ) - MSCmass spectrometry) , SELD I (surf ace— enhanced laser desorpt ion/ionizat ion)- TOF-MS와 같은 질량분석기 등)올 이용하여 대량 (High Throughput)으로 신속하게 분 석할 수 있다. 또한, 단백질 칩이외의 화합물 라이브러리를 고정화시킨 화합물 칩 을 이용하여 gp96 단백질과 AIMP1 단백질의 결합능을 상기와 같이 분석할 수 있다.
<238>
<239> 본 발명의 분석방법은 예를 들어， 박테리아 리프레서 LexA또는 효모 GAL4의
DNA-결합 도메인 및 효모 GAL4 단백질의 트랜스엑티베이션 (transactivaton) 도메인 에 각각 융합된， gp96 단백질， AIMP1 단백질， 또는 이들 단백질의 일부 또는 상동 체 (homologues)를 발현하는 효모를 이용하여 효모 -2 하이브리드 어세이를 수행할 수 있다 (KIM, M. J. et al., Nat. Gent., 34 :330-336, 2003) . gp96 단백질과 AIMPl 단백질의 상호작용은 LexA 단백질 또는 GAL4의 DNA-결합 도메인에 결합된 조절 서 열을 가지고 있는 프로모터의 통제 하에서 리포터 유전자의 발현을 유도하는 트랜 스액티베이터를 재구성하게 한다. <240>
<241> 상기 리포터 유전자로는 위에서 기재한 바와 같이 당업계에 공지된 임의의 검출가능한 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 (예: CAT(chloramphenicol acetyltransferase), 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제， 베타-글루코시타제， 알칼린 포스파타제 및 GFP(green fluorescent protein) 등 를 사용할 수 있다. 만약 gp96 단백질과 AIMP1 단백질 또는 이들 단백질의 일부 또는 상동체의 상호작용 (결합능) 은 시험 제제에 의해 촉진되거나 강화되는 경우， 상기 리포터 유전자의 발현은 정 상 조건에 비해 더욱 증가된다. 반대로， 상기 상호작용이 시험 제제에 의해 저해되 거나 약화되는 경우， 상기 리포터 유전자는 발현되지 않거나 정상 조건에 비해 덜 발현된다.
<242>
<243> 또한 리포터 유전자로는 효모의 성장을 가능하게 하는 단백질 (즉 , 상기 리포 터 유전자가 발현되지 않을 때 효모의 성장이 억제된다)을 암호화하는 것으로 선택 될 수 있다. 예를 들면， 아미노산 또는 질소 염기를 위한 생합성 과정에 관계 있는 효소를 암호화하는 영양요구성 (auxotropic) 유전자 (예: ADE3, HI S3 둥의 효모 유전 자 또는 다른 종 유래의 동등 유전자)일 수 있다. 이 시스템에서 발현된 gp96 단백 질과 AIMP1 단백질， 또는 이들 단백질의 일부 또는 상동체의 상호작용은 시험 제제 에 의해 억제되거나 약화되는 경우， 리포터 유전자는 발현되지 않거나 덜 발현된 다. 따라서, 상기 조건 하에서 효모의 성장은 정지되거나 느려진다. 이러한 리포터 유전자의 발현에 의한 효과는 육안이나 장치 (예: 현미경)를 통하여 관찰될 수 있 다.
<244>
<245> 참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다 (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor , N.Y. (1982)； Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)； Deutscher, M. , Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc. , San Diego, CA(1990)).
<246>
<247> 본 발명의 화합물의 합성을 위해서는그 원료물질을 이용하여 적절한 반웅을 통한 화학적 합성방법이 이용될 수 있다. 이러한 방법을 위하여 반응과정 중， 특정 의 치환기는 원치 않는 반응을 방지하기 위하여 보호기를 필요로 할 수도 있음을 이해할 것이다. 당업자는 언제 이러한 보호기가 필요하며， 이러한 보호기를 어떻게 적소에 배치하고 후에 제거하는지를 숙지하고 있을 것이다. 보호기는 예를 들어 문 헌 ['Protective Groups in Organic Synthesis' Theodora Green, John Wiley &. Sons 발행]에서와 같은 일반적안 문헌 중 하나에서 찾을 수 있다. 보호기는 해당 보호기의 제거에 적절하도록 문헌에 기재되어 있는 바와 같이 또는 당업자에게 주 지되어 있는 바와 같은 임의의 편리한 방법에 의하여 제거할 수 있으며， 이러한 방 법은 분자 내에서 다른 위치의 기에 대한 방해를 최소로 하는 보호기의 제거를 실 시할 수 있도록 선택해야 한다.
<248>
<249> 따라서， 반.응물이 예를 들어 아미노， 카르복시 또는 히드록시와 같은 기를 포함할 경우， 본 명세서에서 언급한 특정의 반웅에서 기를 보호하는 것이 바람직하 다.아미노 또는 알킬아미노 기에 대한 적절한 보호기의 예로는 아실기, 예를 들어 알카노일기， 예컨대 아세틸， 알콕시카르보닐기， 예를 들어 메특시카르보닐 , 에톡시 카르보닐 또는 t-부록시카르보닐기， 아릴메톡시카르보닐기， 예를 들어 벤질옥시카 르보닐， 또는 아로일기， 예를 들어 벤조일 등이 있다. 이러한 보호기에 대한 탈보 호 조건은 보호기의 선택에 따라 반드시 변경시켜야 한다. 따라서， 예를 들어， 아 실기， 예컨대 알카노일 또는 알콕시카르보닐 기 또는 아로일기는 적절한 염기， 예 컨대 알칼리 금속 수산화물， 예를 들어 수산화리튬 또는 수산화나트륨을 사용한 가 수분해에 의하여 제거할 수 있다. 또한， 아실기， 예컨대 t-부록시카르보닐기는 염 산, 황산 또는 인산 또는 트리플루오로아세트산과 같은 적절한 산으로의 처리에 의 하여 제거할 수 있으며， 아릴메톡시카르보닐기, 예컨대 벤질옥시카르보닐기는 촉 매， 예컨대 탄소상 팔라듐과 같은 촉매상에서의 수소화에 의하여， 또는， 예를 들어 붕소 트리스 (트리플루오로아세테이트)와 같은 루이스산으로의 처리에 의하여 제거 할 수 있다. 1차 아미노기에 대한 또다른 적절한 보호기의 예로는 프탈로일기이며， 이는 알킬아민， 예를 들어 디메틸 아미노프로필아민을 사용하여 또는 히드라진을 사용한 처리에 의하여 제거할 수 있다.
<250>
<251> 히드록시기에 대한 적절한 보호기의 예로는 아실기， 예를 들어 알카노일기， 예컨대 아세틸， 아로일기， 예를 들어 벤조일 또는 아릴메틸기， 예를 들어 벤질이 다. 상기 보호기에 대한 탈보호 조건은 보호기의 선택에 따라 반드시 변경시켜야 할 것이다. 따라서， 예를 들어, 아실기， 예컨대 알카노일 또는 아로일 기는， 예를 들어， 적절한 염기， 예컨대 알칼리 금속 수산화물， 예를 들어 리튬， 수산화나트륨 또는 암모니아를 사용한 가수분해에 의하여 제거될 수 있다. 또는, 아릴메틸기， 예 컨대 벤질기는， 예를 들어 촉매， 예컨대 탄소상 팔라듐 상에서의 수소화반웅에 의 하여 제거할 수 있다.
<252>
<253> 카르복시기에 대한 적절한 보호기의 예로는， 염기, 예컨대 수산화나트륨을 사용한 가수분해에 의하여 제거할 수 있는 에스테르화기， 예를 들어 메틸 또는 에 틸 기 또는， 산, 예를 들어 유기산， 예컨대 트리플루오로아세트산을 사용한 처리에 의하여 제거할 수 있는 t-부틸기， 또는， 촉매， 예컨대 탄소상 팔라듐 상에서의 수 소화 반응에 의하여 제거할 수 있는 벤질기 등이 있다. 수지를 보호기로서 사용할 수도 있다. .
<254>
<255> 보호기는 화학 분야에서 주지되어 있는 통상의 기법을 사용하여 합성에서 임 의의 편리한 단계에서 제거할 수 있다.
<256>
<257> 한편， 본 발명에서 언급된 표에 대한 설명은 다음과 같다.
<258>
<259> 표 1은 예비 실험에서 나온 gp96과 AIMP1의 상호작용을 저해하는 화학물질을 요약한 것이다.
<260> 표 2는 본 발명의 화합물의 gp96과 AIMP1의 상호작용 저해 효과를 확인한 것 이다.
<26i> 표 3은 GPM1과 다양한 돌연변이 gp96희 상호작용에 대한 결합속도상수 (Ka), 분리속도상수 (¾) 및 평형분리상수 ( )가 방법에서 기술한 것처럼 SPR 실험에 의하 여 결정된 결과이다.
<262> 표 4는 부형제 (n=9), GPMl(n=9) 및 덱사메타손 (n=7) 처리 생쥐에서 분리한 총 비장세포의 수이다. 수치는 평균士표준편차를 나타낸다.
<263>
<264> 한편， 본 발명에서 대조군으로 사용된 NC1은 하기 화학식 16과 같으며， 2-
(4,6-디메록시피리미딘-2-일옥시)-3-페닐프로파노익산(2-(4,6-^111 110 1^1^(10- 2一 y 1 oxy ) -3-pheny 1 propano ic ac i d )이다.
<265>
Figure imgf000033_0001
<268>
<269> 본 발명에 기재된 도면에 대해서 다음과 같이 설명한다.
<270>
<271> 도 1 내지 9는 GPM1에 의한 세포표면 gp96의 억제는 gP96tm 형질전환 생쥐에 서 수지상세포 (DC)의 성숙과 B220+의 수를 감소시킨다는 점을 나타낸다. (도 1) 본 연구에 사용된 GPM1(화학식 2)과 음성대조군 (NC1, 화학식 16)의 화학적 구조. (도 2) 전술한 ELISA 방법에 의해 측정된 AIMPl-gp96간 상호작용에 대한 GPM1 또는 NC1 용량 의존적 효과. 마이크로타이터 웰에 코팅된 AIMP1에 두 물질과 바이오틴이 결 합된 설치류 gp96를 표시된 농도에 따라 첨가하고， AIMP1에 결합한 gP96은 스트렙 아비딘이 결합된 과산화효소로 측정하였다. (도 3) GPM1의 gp96에의 결합이 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 시험되었다. 표시된 농도의 GPM1이 고정된 gp96에 투여 되고 그 결합은 Biocore 3000으로 측정되었다. 웅답 자료는 기준 표면과 버퍼 투여 로부터 나온 자료를 이용하여 보정되었다. 각 농도는 3회 측정되었다. (도 4) RAW24.7 세포를 lOuM GPM1에 24시간동안 처리하였다. 세포 파쇄물은 대조군 (control) IgG 또는 항 -gp96 항체와 면역침강 되었고， 면역침강된 단백질은 항- KDELR1, 항 AIMP1 및 gp96 항체와 면역블롯 되었다. WCL은 전세포용해질 (whole cell lysate)을 의미한다. (도 5) C57BL/6 생쥐의 비장세포를 분리하여 부형제 (5% DMS0 가 함유된 PBS), GPM1 또는 NC1을 10uM로 24시간 동안 처리한 후, 세포 표면 gp96 을 염색하여 유세포분석을 하였다. (도 6) AIMP1+/+ 또는 AIMP1_/ᅳ 생쥐 비장세포
(2X105 세포)를 부형제， GPM1.또는 NCKlOuM, 24시간)로 처리하여 고정한 후 야생형 골수 유래 수지상세포 (1X104 세포， BMDC)와 16시간동안 공배양하였다. BMDC에서의 TNFa 분비는 ELISA로 측정되었다. (도 7) 30mg/kg의 용량으로 부형제 (대조군 )(n=9), GPMl(n=9) 및 덱사메타손 (n=7)을 처리한 gp96tm 형질전환 암컷 생쥐로부터 적출한 비장세포에서 gp96MHC class II세포가 차지하는 백분율이다. (도 8) 30mg/kg의 용량으로 부형제 (대조군) (n=9) 및 GPMl(n=9)을 처리한 gp96tm 형질전환 암컷 생쥐로부터 적출한 비장세포에서 CDllb+CDllc+(골수성 수지상세포)， CDllb"
CDllc+(임파구성 수지상세포) 및 CDllb+CDllc— (대식세포) 세포군의 세포표면 IC0SL 분포 (도 9) 30mg/kg의 용량으로 부형제 (n=9), GPMl(n=9) 및 덱사메타손 (n=7)을 처 리한 gp96tm 형질전환 암컷 생쥐로부터 적출한 비장세포에서 B220+, MHC class II+,
CD4+, CD8+및 CD4와 CD8 이중 음성 세포가 차지하는 백분율이다. GPM1 처리 생쥐와 대조군을 비교한 스튜던트 t-검정 (student t-test) P값이 표시되어 있다.
<272>
<273> 도 10 내지 18은 GPM1에 의한 세포 표면 gp96의 억제가 gp96tm 형질전환 생 쥐에서의 신장질환과 성숙 B세포， 기억 T세포 및 활성화된 T 세포의 감소를 일으킨 다는 점을 나타낸다. 대조군 (n=9), GPMl(n=9) 및 덱사메타손 (n=7) 처리군 간의 핵 항원 특이적 (도 10) 그리고 이중 가닥 DNA 특이적 항체 (도 11)의 혈청 내 수준이 비교되었다. 임의 단위 (arbitrary units)는 혈청을 1:1이로 회석하여 01)450^로 측정 한 자가항체의 흡광도이다. (도 12) 3개의 다른 그룹의 뇨 (urine)의 단백질 농도 (mg/ml)이다. (도 13) 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 3개 그룹의 대표적인 신장 (kidney) 절편이다. (도 14) 사구체 면역글로불린 침착이 FITC가 결합된 염소 항- 생쥐 Ig 항체에 의하여 부형제와 GPM1가 처리된 신장에서 나타난다. 세 그룹에서 분리한 비장세포에서 CD4+CD44high (기억 T세포) , CD4+CD62LlOT (효과 T세포) 및 CD4+CD69+(활성 T세포)의 수 (도 15)， 비장세포에서 B220+IgM+IgD+ (성숙한 B 세포)의 수 (도 16)， 그리고 CD4+CD25+Foxp3+ 조절 T세포 (도 17). (도 18) ELISA에 의해 측정 된 대조군 (n=9), GPMl(n=9), 및 Dex 처리된 (n=7) 군으로부터 혈청 Ig 수준. 총 IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM 및 IgA 수준이 Southern Biotechnology Associates(Birmingham, AL)의 샌드위치 ELISA 킷에 의해 측정되었다. 수치는 평균 土표준편차를 나타낸다. GPM1 처리 생쥐와 대조군을 비교한 스튜던트 t-검정 (student t-test) P값이 표시되어 있다.
<274>
<275> 도 .19는 예비 스크리닝 자료의 히트 맵 (heat map)이다. 6482개의 화학물질
(chemical)의 gp96과 AIMP1의 상호작용에 대한 저해효과가 기술된 변형된 ELISA 방 법에 의하여 관찰되었다. DMS0의 값을 0%으로 잡고， 각 화학물질의 저해정도가 상 대적인 백분율로 측정되어， 저해 정도는 히트 맵에서 10% 단위로 0(녹색)에서 100% (빨강)까지 나타내었다.
<276>
<277> 도 20은 예비실험 선발군의 유도체의 gp96의 표면 발현에 대한 효과를 나타 낸다. 77개 화합물 (lOuM, 24시간)로 RAW264.7 세포를 처리하고 유세포분석으로 gp96의 표면 발현에 대해 미치는 효과를 분석하였다. 본 발명자는 대조군 대비 5% 의 변화를 절단값 (cut-off value)으로 잡았다. 77개의 화합물 중， 8개의 화합물이 gp96의 표면 발현을 10% 이하로 억제하였으며， 12개의 화합물이 gp96+ 세포를 20% 이상으로 증가시켰다.
<278>
<279> 도 21은 GPMl, (S)-메틸 2-(4，6-디메록시피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸부타노에 이트 ((S)-methyl 2- ( 4 , 6-d i me t hoxypyr i m i d i η-2-y 1 oxy ) -3~me t hy 1 but anoat e ) 합성 과정올 나타낸다. (S)-메틸 2-하이드록시 -3-메틸부타노에이트 ((S)-Methyl 2- hydroxy-3-methylbutanoate)(2) . α-하이드록시 산 (409mg, 3.46mmol)을 를루엔 (28ml)과 메탄올 (17ml)에 녹인다. 농축된 염산액 (0.7ml)을 더한 후 반응물을 환류 장치에서 밤새 가열한다. 반응물을 실온까지 넁각시킨 후 진공상태에서 농축시킨 다. 잔여물을 포화된 탄산수소나트륨 용액 (35ml)로 중화시키고， 에틸 아세테이트 (3 X 35ml)로 추출한다. 결합된 유기층은 건조시키고 (MgS04), 필터한 후 농축 시킨다. 쿠겔로르 (Kugelrohr) 증류법으로 정제하면 α-하이드록시 에스테르 ( a -hydroxy ester)를 무색 오일의 형태로 얻게 된다. 하이드록시 에스테르 (409mg, 89% 수율)는 그대로 하얀 고체가 된다: H NMR(300mHz, CDC13): 4.05(1H, d, J=3.7Hz), 3.78(3H, s), 3.13 1H, br, OH), 2.07(1H, m), 1.02(3H, d, J=6.8Hz), 0.88C3H, d, J=6.8Hz); m/z(LC) 133.11(M+).
<280>
<28i> (S)-메틸 2-(4，6-디메록시피리미딘 -2-일옥시 )-3—메틸부타노에이트 (4). 아르 곤 환경에서， Ν,Ν-디메틸포름아마이드 (N,N-dimethylformamide(5ml)에 (S)-메틸 2- 하이드록시 -3-메틸부타노에이트 ((S)-methyl 2-hydroxy-3-methy 1 but anoat e , 409mg, 3.09mmol), 2-클로로 -4 ,6-디메톡시피리미딘 ( 2-ch 1 or o-4 , 6-d i me t hoxypyr i m i d i ne , 540mg, 3.09mmol), 소듐 p一를루엔설피네이트 (sodium p-toluenesulf inate, 79mg, 0.77mmol) 및 탄산칼륨 (potassium carbonate, 641mg, 4.64隱 ol)이 들어가 있는 잘 저어진 현탁액을 120°C로 3시간동안 가열하였다 (변환 후 TUXthin layer chromatography) 수행). 반응물은 잔공상태에서 농축되고， 잔여물은 물 (5ml)과 디 클로로메탄 (5ml)사이에 남았다. 유기층은 분리되고, 수용액 층은 다클로로메탄 (3ml)으로 추출되었다. 결합된 유기층은 물 (2ml)로 세척한 후 MgS04로 물을 제거하 고 필터 및 농축하였다. 원하는 결과물은 결정화되고， 진공 상태에서 건조하면 676mg(4, 81% 수율)의 백색 결정을 얻게 된다: NMR(300MHz, CDC13): 5.70(1H, s), 4.92(1H, d, J=5.5Hz), 3.93(6H, t, J=9.2, 7.3Hz), 3.72(3H, s), 2.30(1H, m), 1.1K3H, d, J=6.8Hz), 1.08C3H, d, J=6.8Hz); m/z(LC)271.18(M+) .
<282>
<283> 도 22는 gp96의 ATPase 활성에 대한 점돌연변이의 효과를 나타낸다. (a) gp96의 ATPase 활성에 대한 gp96 점돌연변이의 효과를 ATPase 어세이 킷 (Innova Bioscience, Cambridge, UK)으로 측정하였다. 1단위 (unit)는 l im 의 기질을 1분 에 촉매할 수 있는 효소의 양이다. 효소의 활성 계산은 제조자의 설명서에 의하였 다.
<284>
<285> 도 23은 gp96의 ATPase 활성에 대한 GPM1의 효과를 나타낸다. (a) ATPase 활 성에 대한 GPM1의 용량 의존적 효과. gp96의 단독 활성은 0.02066 ±0.00334 unit/ml이며 GPM1은 시험한 농도 범위 (0에서 lOOuM, p-0.071) 내에서는 gp96의 ATPase활성에 거의 영향을 미치지 아니하였다.
<286>
<287> 도 24는 30mg/kg/일의 용량으로 부형제 (n=9), GPMl(n=9) 및 덱사메타손 (n=9) 을 처리한 gp96tm 형질전환 암컷 생쥐의 생존율이다.
<288>
<289> 도 25 내지 30은 GPM1에 의한 세포 표면 gp96의 억제는 gp96tm 형질전환 생 쥐의 림프절의 수지상세포 (DC) 성숙， B220+ 및 MHC class Π+ 세포， 기억 T세포 및 활성 T세포를 감소시킨다. (도 25) 30mg/kg의 용량으로 부형제 (n=9), GPMl(n=9) 및 덱사메타손 (n=7)을 처리한 gp96tm 형질전환 암컷 생쥐의 림프절 세포에서
IC0SL+CDllb+CDllc+ 세포 수의 백분율. 30mg/kg의 용량으로 부형제 (n=9), GPMl(n=9) 및 덱사메타손 (n=7)을 처리한 gp96tm 형질전환 암컷 생쥐의 림프절세포에서 B220+( 도 26)， MHC class II+(도 27), 및 CD4+, CD8+및 CD4와 CD8 이중 음성 세포 (도 28) 의 백분율. (도 29) 부형제 (n=9), GPMl(n=9) 및 텍사메타손 (n=7)을 처리한 생쥐의 림프절 세포에서 CD4CD44 ， CD4 CD62L 및 CD4 CD69의 백분율. (도 30) 부형제 (n=9) , GPMl(n=9) 및 덱사메타손 (n=7)을 처리한 생쥐의 림프절 세포에서 CD4+CD25+Foxp3+ 조절 T세포 수의 꽥분율. GPM1 처리 생쥐와 대조군을 비교한 스튜던 트 t-검정 (student t-test) P값이 표시되어 있다.
<290>
<29i> 도 31 내지 33은 인간 SLE 환자에서 증가된 gp96의 세포표면 발현과 gp96 항 체의 혈청 수준 (serum level)을 나타낸다. (도 31) 건강한 대조군 (n=6) 또는 SLE 환자 (n=12)의 말초혈액단핵세포 (PBMC)의 표면에 gp96 및 HLA-DR가 나타났는지를 유 세포 분석을 통해 조사되었다. 슷자는 이중 양성 사분면 (double positive quadrant)에 위치한 세포의 백분율을 나타낸다. (도 32) 대조군 (n=6) 또는 SLE 환 자 (n=12)의 말초혈액단핵세포에서 gp96+HLA-DR+의 수가 정적으로 (statically) 분석 되었다 (ρ=0· 0005). (도 33) 건강한 대조군 (η=10) 또는 SLE 환자 (η=10)에서 총 항- gp96 자가항체의 혈청 수준. 임의 단위 (arbitrary unit)는 혈청을 1:100로 희석하 여 004501]111로 측정한 자가항체의 흡광도이다. SLE 환자와 건강한 대조군을 비교한 스 튜던트 t-검정 (student t-test) P값이 표시되어 있다.
<292>
<293> 도 34는 루프스 동물모델에서 본 발명의 2, 4-피리미딘 유도체의 루프스 증상 완화 효과를 실험한 결과 그래프이다. NZB/W F1 마우스는 자발적인 루프스 증세가 나타나는 루프스 동물모델로서 이 동물모델에서의 2，4-피리미딘 유도체 효능을 검 증하였다. 25주령 male NZB/W F1 마우스를 각 군당 10마리씩 사용하여 대조군 (5% DMS0 용액)과 실험군 (30mg/kg 용량의 2, 4-피리미딘 유도체)를 매일 1회 복강투여 하고 루프스 증세 악화로 인해 죽는 마우스를 제외한， 살아있는 마우스의 비율을 분석한 결과， (S)-methyl 2- ( 4 , 6-d i me t hoxypyr i m i d i η-2-y 1 oxy ) -3-me t hy 1 but anoat e 를 투여한 군에서 루프스로 인해 죽는 비율이 유의미하게 감소하는 결과를 얻었다. 따라서 일반적으로 사용되는 동물모델에서도 2，4-피리미딘 유도체의 루프스에 대한 증세 완화 효과를 확인할수 있다.
<294>
<295> 도 35는 HL-60 세포주에 각 2 ,4-피리미딘 유도체 ImM 농도로 24시간 처리 후 세포 표면에 존재하는 gp96 단백질의 양을 gp96 항체를 이용하여 FACS 방법으로 분 석하였다. KR-S-015 화합물이 methyl 2- ( 4 , 6-d i me t hoxypyr i m i d i η-2-y 1 oxy ) -3- methylbutanoate 이며 이 보다 더 좋은 효과를 보이는 화합물은 15종류 (KR-S—008, KR-S-012, KR-S-001, KR-S-024, KR-S-023, KR-S-017, KR-S-011, KR-S-007, KR-S- 013, KR-S-005, KR-S-009, KR-S-006, KR-S-020, KR-S-014, KR-S-022)가 나왔다. ester (KR-S— 010)나 acid (KR-S-009)에 비해 amide (KR-S-001, KR-S-005, KR-S- 006, KR-S-007, KR-S-008)형태가 더 우수한 것으로 평가되며 ester 형태에서는 중 간치환체가 isoproply (KR-S-009, KR-S-010) 보다 methyl (KR-S-011, KR-S-012, KR-S-023, KR-S-024)가 더 나은 것으로 평가되었다.
<296>
【유리한 효과】
<297> 본 발명자들은 gp96의 세포내 거류에 대한 분자 닻 (anchor)인 AIMP1의 기능 을 모방하여 gp96의 표면 전좌 (translocation)를 저해하는 신규 물질을 찾았고， 이 들 물질이 in vitro, in vivo상에서 SLE 형질을 완화하여 SLE를 예방 및 치료하는 효과가 있음을 확인하였다. 따라서， 본 발명은 상기 기작을 이용하여 SLE의 치료제 를 스크리닝하고， SLE를 예방 또는 치료하는 새로운 방법을 제공한다.
<298>
【도면의 간단한 설명】
<299> 도 1 내지 9는 GPM1에 의한 세포표면 gp96의 억제는 gp96tm 형질전환 생쥐에 서 수지상세포 (DC)의 성숙과 B220+의 수를 감소시킨다는 점을 나타낸다. GPM1 처리 생쥐와 대조군을 비교한 스튜던트 t-검정 (student t-test) P값아표시되어 있다. <300> 도 1은 본 연구에 사용된 GPM1(화학식 2)과 음성대조군 (NC1, 화학식 16)의 화학적 구조이다.
<30i> 도 2는 AIMPl-gp96간 상호작용에 대한 GPM1 또는 NC1 용량 의존적 효과를
ELISA 방법으로 측정한 결과미다. 마이크로타이터 웰에 코팅된 AIMP1에 두 물질과 바이오틴이 결합된 설치류 gp96를 표시된 농도에 따라 첨가하고， AIMP1에 결합한 gp96은 스트렙아비딘이 결합된 과산화효소로 측정하였다.
<302> 도 3은 GPM1의 gp96에의 결합을 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 시험한 결 과이다. 표시된 농도의 GPM1이 고정된 gp96에 투여되고 그 결합은 Biocore 3000으 로 측정되었다. 웅답 자료는 기준 표면과 버퍼 투여로부터 나온 자료를 이용하여 보정되었다. 각 농도는 3회 측정되었다.
<303> 도 4는 RAW24.7 세포를 10uM GPM1에 24시간동안 처리하여 파쇄한 후 대조군
(control) IgG또는 항 -gp96 항체와 면역침강을 한 결과이다. 면역침강된 단백질은 항 -KDELR1, 항 AIMP1 및 gp96 항체와 면역블롯 되었다. WCL은 전세포용해질 (whole cell lysate).을 의미한다.
<304> 도 5는 C57BL/6 생쥐의 비장세포를 분리하여 부형제 (5% DMSO가 함유된 PBS),
GPM1 또는 NC1을 lOuM로 24시간 동안 처리한 후， 세포 표면 gp96을 염색하여 유세 포분석을 한 결과이다.
<305> 도 6은 AIMP1+/+ 또는 AIMP1— zᅳ 생쥐 비장세포 (2XK)5 세포)를 부형제， GPM1 또 는 NCKlOuM, 24시간)로 처리하여 고정한후 야생형 골수 유래 수지상세포 (1X104 세 포， BMDC)와 16시간동안 공배양 한 후 BMDC에서의 TNFa 분비를 ELISA로 측정한 결 과이다.
<306> 도 7은 30mg/kg의 용량으로 부형제 (대조군) (n=9), GPMl(n=9) 및 덱사메타손
(n=7)을 처리한 gp96tm 형질전환 암컷 생쥐로부터 적출한 비장세포에서 gP96+MHC class 11+세포가 차지하는 비율 (백분율)을 측정한 결과이다.
<307> 도 8은 30mg/kg의 용량으로 부형제 (대조군) (n=9) 및 GPMl(n=9)을 처리한 gp96tm 형질전환 암컷 생쥐로부터 적출한 비장세포에서 CDllb+CDllc+(골수성 수지상 세포)， CDllb_CDllc+(임파구성 수지상세포) 및 CDllb+CDllc (대식세포) 세포군의 세 포표면 IC0SL분포를 측정한 결과이다.
<308> 도 9는 30mg/kg의 용량으로 부형제 (n=9), GPMl(n=9) 및 덱사메타손 (n=7)을 처리한 gp96tm 형질전환 암컷 생쥐로부터 적출한 비장세포에서 B220+, MHC class
11+， CD4+, CD8+및 CD4와 CD8 이중 음성 세포가 차지하는 백분율을 측정한 결과이 다.
<309>
<3io> 도 10 내지 18은 GPM1에 의한 세포 표면 gp96의 억제가 gp96tm 형질전환 생 쥐에서의 신장질환과 성숙 B세포， 기억 T세포 및 활성화된 T 세포의 감소를 일으킨 다는 점을 나타낸다. GPM1 처리 생쥐와 대조군을 비교한 스튜던트 t-검정 (student t-test) P값이 표시되어 있다.
<3ΐι> 도 10은 대조군 (n=9), GPMl(n=9) 및 덱사메타손 (n=7) 처리군 간의 핵 항원 특이적 항체의 혈청 내 수준을 비교 측정한 결과이다.임의 단위 (arbitrary units) 는 혈청을 1:1이로 희석하여 0045^로 측정한 자가항체의 흡광도이다.
도 11은 대조군 (n=9), GPMl(n=9) 및 덱사메타손 (n=7) 처리군 간의 이중 가닥 특이적 항체의 혈청 내 수준을 비교 측정한 결과이다.임의 단위 (arbitrary units)는 혈청을 1:1이로 희석하여 0D450M^측정한 자가항체의 홉광도이다.
<313> 도 12는 3개의 다른 그룹의 뇨 (urine)의 단백질 농도 (mg/ml)이다.
<314> 도 13은 해마톡실린과 에오신으로 염색한 3개 그룹의 대표적인 신장 (kidney) 절편이다.
<315> 도 14는 사구체 면역글로불린 침착이 FITC가 결합돤염소 항 -생쥐 Ig항체에 의하여 부형제와 GPM1가 처리된 신장에서 나타나는 사진이다.
<316> 도 15는 세 그룹에서 분리한 비장세포에서 CD4+CD44hlgh (기억 T세포)，
+ low + + _
CD4 CD62L (효과 T세포) 및 CD4 CD69 (활성 T세포)의 수를 측정한 결과이다.
<3i7> 도 16은 비장세포에서 B220+IgM+IgD+ (성숙한 B 세포)의 비율을 측정한 결과 이다.
<318> 도 17은 비장세포에서 CD4+CD25+Foxp3+조절 T세포의 비율을 측정한 결과이다.
<319> 도 18은 대조군 (n=9), GPMl(n=9), 및 Dex 처리된 (n=7) 군으로부터 혈청 Ig 수준. 총 IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM 및 IgA 수준을 Southern Biotechnology Associates(Birmingham, AL)의 샌드위치 ELISA 킷으로 측정한 결과이다. 수치는 평 균士표준편차를 나타낸다.
<320>
<32i> 도 19는 예비 스크리닝 자료의 히트 맵 (heat map)이다.
<322>
<323> 도 20은 예비실험 선발군의 유도체의 gp96의 표면 발현에 대한 효과를 나타 낸다.
<324>
<325> 도 21은 GPMl, (S)-메틸 2-(4, 6-디메특시피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸부타노에 이트 ((S)-methyl 2- ( 4 , 6-d i me t hoxypy r i m i d i η-2-y 1 oxy ) -3-me t hy 1 but anoa t e ) 합성 과정을 나타낸다.
<326>
<327> 도 22는 gp96의 ATPase 활성에 대한 점돌연변이의 효과를 나타낸다.
<328>
<329> 도 23은 gp96의 ATPase 활성에 대한 GPM1의 효과를 나타낸다.
<330>
<33i> 도 24는 30mg/kg/일와 용량으로 부형제 (n=9), GPMl(n=9) 및 텍사메타손 (n=9) 을 처리한 gp96tm형질전환 암컷 생쥐의 생존율이다. <332>
<333> 도 25 내지 30은 GPM1에 의한 세포 표면 gp96의 억제는 gp96tm 형질전환 생 쥐의 림프절의 수지상세포 (DC) 성숙， B220+ 및 MHC class Π+ 세포， 기억 T세포 및 활성 T세포를 감소시키는 점을 나타낸다. GPM1 처리 생쥐와 대조군올 비교한 스튜던 트 t-검정 (student t-test) P값이 표시되어 있다.
<334> 도 25는 30mg/kg의 용량으로 부형제 (n=9), GPMl(n=9) 및 덱사메타손 (n=7)을 처리한 gp96tm 형질전환 암컷 생쥐의 림프절 세포에서 ICOSL+CDllb+CDllc+ 세포 수 - 의 백분율이다.
<335> 도 26은 30mg/kg의 용량으로 부형제 (n=9), GPMl(n=9) 및 덱사메타손 (n=7)을 처리한 gp96tm 형질전환 암컷 생쥐의 림프절세포에서 B220+ 세포의 백분율이다.
<336> 도 27은 30mg/kg의 용량으로 부형제 (n=9), GPMl(n=9) 및 덱사메타손 (n=7)을 처리한 gp96tm 형질전환 암컷 생쥐의 림프절세포에서 MHC class 11+ 세포의 백분율 이다.
<337> 도 28은 30mg/kg의 용량으로 부형제 (n=9), GPMl(n=9) 및 텍사메타손 (n=7)을 처리한 gp96tm 형질전환 암컷 생쥐의 림프절세포에서 CD4+, CD8+및 CD4와 CD8 이 중 음성 세포의 백분율이다.
<338> 도 29는 부형제 (n=9), GPMl(n=9) 및 덱사메타손 (n=7)을 처리한 생쥐의 림프 절 세포에서
Figure imgf000041_0001
의 백분율이다.
<339> 도 30은 부형제 (n=9), GPMl(n=9) 및 덱사메타손 (n=7)을 처리한 생쥐의 림프 절 세포에서 CD4+CD25+Foxp3+ 조절 T세포 수의 백분율이다.
<340>
<34i> 도 31 내지 33은 인간 SLE환자에서 증가된 gp96의 세포표면 발현과 gp96항 체의 혈청 수준 (serum level)을 나타낸다. SLE 환자와 건강한 대조군을 비교한 스 튜던트 t-검정 (student t-test) P값이 표시되어 있다.
<342> 도 31은 건강한 대조군 (n=6) 또는 SLE환자 (n=12)의 말초혈액단핵세포 (PBMC) 의 표면에 gp96 및 HLA-DR가 나타났는지를 유세포 분석을 통해 조사한 결과이다. 숫자는 이중 양성 사분면 (double positive quadrant)에 위치한 세포의 백분율을 나 타낸다.
<343> 도 32는 대조군 (n=6) 또는 SLE 환자 (n=12)의 말초혈액단핵세포에서 gp96+HLA-DR+의 수를 분석한 결과이다 (p=0.0005) . <344> 도 33은 건강한 대조군 (n=10) 또는 SLE 환자 (n=10)에서 총 항 -gp96 자가항체 의 혈청 수준을 측정한 결과이다. 임의 단위 (arbitrary unit)는 혈청을 1:100로 희 석하여 0D450niD로 측장한 자가항체의 흡광도이다. SLE 환자와 건강한 대조군을 비교 한 스튜던트 t-검정 (student t-test) P값이 표시되어 있다.
<345>
<346> 도 34는 루프스 동물모델에서 본 발명의 2,4-피리미딘 유도체의 루프스 증상 완화 효과를 실험한 결과 그래프이다.
<347>
<348> 도 35는 HL-60 세포주에 각 2, 4-피리미딘 유도체 ImM 농도로 24시간 처리 후 세포 표면에 존재하는 gp96 단백질의 양을 gp96 항체를 이용하여 유세포측정 (FACS) 방법으로 분석한 결과 그래프이다.
<349>
【발명의 실시를 위한 형태】
<350> 이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
<351> 단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<352>
<353> <실시예 1>
<354> 본 발명의 유기화합물의 제조
<355>
<356> <1-1> 2-(2-클로로벤질옥시) -4,6-디메톡시피리미딘 (2-(2-chlobenzyloxy)-
4,6-dimethoxypyrimidine)의 합성
<357> 2-클로로벤질 알콜 (2-chlorobenyl alcohol) 2.85 g (0.02 mol)과 4，6-디메
특시피리미딘 -2-일 메틸 설폰 (4,6-dimethoxypyrimidin-2-yl methyl sulfone) 4.36 g (0.02 mol)을 DMF (W V— dimethyl formamide) 100 ml에 녹이고 K2C03 3.3 g (1.2 eq)를 가하고 95°C를 유지하면서 하룻밤 교반했다. 반웅액을 물 100ml에 가하고 디 에틸 에테르 (diethyl ether)로 추출하고 MgS04로 건조한 후 감압 증류하여 잔사를 얻고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Si 1 ilea gel column chromatography)로 정제하 여 노란색 고체물질 4.7 g (81%)을 얻었다： NMR (CDC13) ； 3.73 (s, 6H), 5.20
(s, 2H), 6.22 (s, 1H), 7.07-7.20 (m, 4H).
<358> <359> <l-2> 2-(4, 6-디메록시피리미딘 -2-일옥시 )-2-페닐아세트산 (2— (4,6-
Dimethoxypyr imi di η-2-y 1 oxy )-2-pheny 1 acet i c acid)의 합성
<360> 2—페틸아세트산 메틸 에스테르 (2-Phenyl acetic acid methyl ester) 3.30 g
(0.02 raol)과 4,6-디메톡시피리미딘 -2-일 메틸 설폰 4.36 g (0.02 mol)을 DMF 100 ml에 녹이고 K2C03 3.3 g (1.2 eq)를 가하고 95 °C를 유지하면서 하룻밤 교반했다. 반웅액을 물 100 ml에 가하고 디에틸 에테르로 추출하고 MgS04로 건조한 후 감압 증 류하여 잔사를 얻고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 2-(4，6—디메톡시피 리미딘 -2-일옥시) -2-페닐아세트산 메틸 에스테르 ( 2- ( 4， 6-D i me t hoxypyr imidi n-2- yl oxy )-2— phenyl acetic acid methyl ester)인 고체물질 4.87 g (80%)을 얻었다. 얻 어진 화합물을 메탄올 (methanol)과 물 (약 3:1) 흔합용매에 녹이고 얼음 조 (ice bath)로 넁각시킨 다음 LiOH.H200.96 g을 넣고 30분간 교반시킨다. 얼음 조를 제거 하고 실온에서 2시간 반응시킨 다음 감압 농축하여 메탄올을 제거하고 소량의 디에 틸 에스테르로 추출한다. 물 층에 묽은 염산을 넣어 PH 7 정도로 중화하면 고체가 생성된다. 여과하고 건조시켜 2-(4， 6-디메록시피리미딘 -2-일옥시 )-2-페닐아세트산
(4.41 g, 95%)을 얻었다: NMR (CDC13) ； 3.73 (s, 6H), 5.85 (s, 1H), 6.22 (s, 1H), 7.19-7.37 (m, 5H), 12.34 (s, 1H).
<361>
<362> <l-3> (]«-2-(4,6-디메특시피리미딘-2-일옥시)-2-페닐아세트산( ?)-2-(4,6- dimethyoxypyr imi din-2-y loxy)-2-pheny 1 acet i c acid)의 합성
<363> ?)-2-페닐아세트산 메틸 에스테르 ( ?)-2-phenyl acetic acid methyl ester)
3.30 g (0.02 mol)과 4，6-디메톡시피리미딘 -2-일 메틸 설폰 4.36 g (0.02 mol)을 DMF 100 ml에 녹이고 K2C033.3 g (1.2 eq)를 가하고 95°C를 유지하면서 하룻밤 교 반했다. 반웅액을 물 100 ml에 가하고 디에틸 에테르로 추출하고 MgS04로 건조한 후 감압 증류하여 잔사를 얻고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (^-2-(4，6- 디메톡시피리미딘 -2-일옥시 )-2-페닐아세트산 메틸 에스테르 ( ?)-2-(4，6_ d i me t y oxy py r i m i d i η-2-y 1 oxy ) -2-pheny 1 ac e t i c acid methyl ester)인 고체물질 4.81 g (79%)을 얻었다. 얻어진 화합물을 메탄올과 물 (약 3:1) 흔합용매에 녹이고 얼음 조 (ice bath) 로 넁각시킨 다음 LiOH.H20 0.96 g을 넣고 30분간 교반시킨다. 얼음 조를 제거하고 실온에서 2시간 반웅시킨 다음 감압 농축하여 메탄올을 제거하 고 소량의 디에틸 에스테르로 추출한다. 물 층에 묽은 염산을 넣어 pH 7 정도로 중 화하면 고체가 생성된다. 여과하고 건조시켜 (세― 2-(4,6-디메록시피리미딘 -2-일옥 시) -2-페닐아세트산 ((ff)-2-(4,6-dimethyoxypyrimi(lin-2-yloxy)-2-phenylacetic acid) (4.45 g, 96%)을 얻었다: NMR (CDC13) ； 3.73 (s, 6H), 5.85 (s, 1H), 6.22 (s, 1H), 7.19-7.37 (m, 5H), 12.34 (s, 1H).
<364>
<365> <l-4> 2- (벤질옥시) -4,6-디특시피리미딘-5-카르복사마이드(2-(Benzyloxy)-
4,6~dimethyoxypyrimidine~5ᅳcarboxamide)의 합성
<366> 벤질 알콜 (benzyl alcohol) 2.16 g (0.02 mol)과 5-카르복사아미드 -4， 6-디메 톡시피리미딘 _2-일 메틸 설폰 (5-carboxamide-4,6-dimethoxypyrimidin—2-yl methyl sulf one) 5.52 g (0.02 mol)을 DMF 100ml에 녹이고 K2C03 3.3g (1.2 eq)를 가하고
95°C를 유지하면서 하룻밤 교반했다. 반웅액을 물 100ml에 가하고 디에틸 에테르로 추출하고 MgS04로 건조한 후 감압 증류하여 잔사를 얻고 실리카겔 컬럼 크로마토그 래피로 정제하여 노란색 고체물질 4.34 g (75%)을 얻었다: NMR (CDC13) ； 3.73 (s, 6H), 5.20 (s, 2H), 7.37-7.48 On, 5H), 7.85 (s, 2H) .
<367>
<368> <1-5> 4,6-디메록시 -2- (피리딘 -4-일옥시)피리미딘 (4,6-Dimethoxy-2-
(pyridin-4-yloxy)pyrimidine)의 합성
<369> 4-하이드록시피리딘 (4— Hydroxypyridine) 1.88 g (0.02 mol)과 4,6-디메톡시 피리미딘 -2-일 메틸 설폰 4.36 g (0.02 mol)을 DMF 100 ml에 녹이고 K2C03 3.3g
(1.2 eq)를 가하고 95°C를 유지하면서 하룻밤 교반했다. 반웅액을 물 100 ml에 가 하고 디에틸 에테르로 추출하고 MgS04로 건조한 후 감압 증류하여 잔사를 얻고 실리 카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 고체물질 3.73 g (80%)을 얻었다: NMR (CDC13) ； 3.73 (s, 6H), 5.49 (s, 1H), 6.85-8.42 (m, 4H).
<370>
<37i> <1-6> 3-(4,6-디메톡시피리미딘 -2-일옥시)피리딘 -2-아민 (3-(4,6-
Dimethoxypyrimidin-2— yloxy)pyridin-2— amine)의 합성
<372> 3-아미노 -4-하이드록시피리딘 (3-amino— 4— hydroxypyridine) 2.18 g (0.02 mol)과 4,6-디메톡시피리미딘 -2-일 메틸 설폰 g (0.02 mol)을 DMF 100 ml에 녹이고 K2C03 3.3g (1.2 eq)를 가하고 95°C를 유지하면서 하룻밤 교반했다. 반응액을 물 100 ml에 가하고 디에틸 에테르로 추출하고 MgS04로 건조한 후 감압 증류하여 잔사 를 얻고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 고체물질 4.02 g (81%)을 얻었 다: H NMR (CDCls) ； 3.73 (s, 6H), 5.49 (s, 1H), 6.51 (s, 2H), 6.75-7.50 (m, 3H).
<373>
<374> <l-7> (S)-메틸 2-(4, 6-디메록시피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸부타노에이트
((S)-methyl 2-(4,6-dimethoxypyrimidin-2-yloxy)-3-methylbutanoate)≤] 합성
<375> (S)—메틸 2-하이드록시 -3-메틸부타노에이트 ((S)-methyl 2-hydrtoxy-3- methylbutanoate) 2.62 g (0.02 mol)과 4, 6-디메록시피리미딘 -2-일 메틸 설폰 4.36 g (0.02 mol)을 DMF 100 ml에 녹이고 K2C033.3 g (1.2 eq)를 가하고 95°C를 유지하 면서 하룻밤 교반했다. 반웅액을 물 100 ml에 가하고 디에틸 에테르로 추출하고 MgS04로 건조한 후 감압 증류하여 잔사를 얻고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정 제하여 무색 고체물질 3.51 g (65%)을 얻었다: NMR (CDC13) ； 1.01 (d, 6H) , 2.97 On, 1H), 3.67 (s, 3H)， 3.73 (s, 6H), 4.51 (d, 1H), 6.13 (s, 1H).
<376>
<377> <1-8>메틸 2-(4-브로모페닐) -2-(4,6-디메특시피리미딘— 2-일옥시)아세테이트
(methyl 2-(4-bromophenyl)-2-(4,6-dimethoxypyrimidin-2-yloxy)acetate)≤ 합성
<378> 2- (4-브로모페닐 ) -2- (4 ,6-디메록시피리미딘 -2-일옥시 )아세테이트 (2-(4-
Br omopheny l)-2-(4,6-dimet hoxypy r i m i d i η-2-y 1 oxy )acetate) 4.88 g (0.02 mol)과 4，6-디메톡시피리미딘— 2-일 메틸 설폰 4.36 g (0.02 mol)을 DMF 100 ml에 녹이고 2C03 3.3g (1.2 eq)를 가하고 95°C를 유지하면서 하룻밤 교반했다. 반응액을 물
100 ml에 가하고 디에틸 에테르로 추출하고 MgS04로 건조한 후 감압 증류하여 잔사 를 얻고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 고체물질 5.59 g (73%)을 얻었 다: H 匿 (CDC13) ； 3.67 (s, 3H), 3.73 (s, 6H), 5.81 (s, 1H), 6.22 (s, 1H) ,
7.08-7.36 On, 4H).
<379>
<380> <l-9>메틸 2-(4,6-디메록시피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸부타노에이트 (methyl
2一 ( 4 , 6-d i methoxypyr imidi η-2-y 1 oxy)-3-methy 1 but anoat e )의 합성
<38i> 메틸 2-하이드록시 -3-메틸부타노에이트 (methyl 2-hydrtoxy-3- methylbutanoate) 2.62 g (0.02 mol)과 4,6-디메록시피리미딘 -2-일 메틸 설폰 4.36 g (0.02 mol)을 DMF 100 ml에 녹이고 K2C03 3.3g (1.2 eq)를 가하고 95°C를 유지하 면서 하룻밤 교반했다. 반응액을 물 100 ml에 가하고 디에틸 에테르로 추출하고 MgS04로 건조한 후 감압 증류하여 잔사를 얻고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정 제하여 고체물질 3.40 g (63%)을 얻었다: H證 (CDCls) ； 1.01 (d, 6H), 2.97 (m, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.73 (s, 6H), 4.51 (d, 1H), 6.13 (s, 1H).
<382>
<383> <1-10>메틸 2-(4，6-디메톡시피리미딘 -2-일옥시 )-2- (티오펜 -2-일)아세테이트
(methyl 2-(4,6-dimethoxypyrimidin-2-yloxy)-2-(thiophen-2-yl)acetate)≤1 합성
<384> 메틸 2- (티오펜 -2-일)아세테이트 (methyl 2— (thiophen-2-yl)acetate) 3.70 g
(0.02 mol)과 4,6—디메특시피리미딘 -2-일 메틸 설폰 4.36 g (0.02 mol)을 DMF 100 ml에 녹이고 K2C033.3g (1.2 eq)를 가하고 95°C를 유지하면서 하룻밤 교반했다. 반 응액을 물 100 ml에 가하고 디에틸 에테르로 추출하고 MgS04로 건조한후 감압 증류 하여 잔사를 얻고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 고체물질 4.28 g
(66%)을 덛었다: H 醒 (CDC13) ； 1.30 (d, 3H), 3.73 (s, 6H), 4.12 (d, 2H),
5.81 (s, 1H), 6.22(s, 1H), 6.60-6.91 (m, 3H).
<385>
<386> <1-11> 4, 6-디 -ieri-부록시 -2- (피리딘 -3-일옥시)피리미딘 (4,6— Di— ieri- butoxy-2ᅳ (pyridin-3-yloxy)pyrimidine)의 합성
<387> 3-하이드록시피리딘 (3-hydroxypyridine) 1.90 g (0.02 mol)과 4,6-디 -feri- 부톡시피리미딘 -2-일 메틸 설폰 (4,6-di-ieri-butoxypyrimidin-2-yl methyl sulfone) 6.05 g (0.02 mol)을 DMF 100 ml에 녹이고 K2C03 3.3g (1.2 eq)를 가하고
95 °C를 유지하면서 하룻밤 교반했다. 반응액올 물 100 ml에 가하고 디에틸 에테르 로 추출하고 MgS04로 건조한 후 감압 증류하여 잔사를 얻고 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피로 정제하여 고체물질 4.51 g (7 을 얻었다: NMR (CDC13) ； 1.43 (s, 18H), 5.49 (s, 1H), 7.38-8.56 (m, 4H).
<388>
<389> <1-12>2-(4,6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시) -Ν,Ν-디에틸 -3-메틸 -부틸아미드
(2-(4,6-Dimethoxy-pyrimidin-2-yloxy)-NfN-diethyl-3-methyl-butyl amide)의 합성 (KR-S-001)
<390> 2-(4,6—디메특시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸-부틸산 (2-(4,6-Dimethoxy- pyr i m i d i η-2-y 1 oxy ) -3-me t hy 1 -but y r i c acid) 0.02g(0.078画 ol )를 넣고 하이드록시 벤조트리아졸 (Hydroxybenzotriazole, HOBT) 0.15g(0.1이瞧 ol)과 디에틸 아민 (Diethyl amine) 0.0085g(0.117mmol )올 메틸렌 클로라이드 (MC) 10ml에 녹이고 ice- bath에서 0°C를 유지하면서 10분 교반했다. 교반 후 EDCK l-ethyl-3-(3- dimethylarainopropyl) carbodi imide) HC1 0.019g(0.1이醒 ol )을 서서히 넣어 주고 20분 동안 온도를 유지하면서 교반 시킨 후 상온으로 온도를 올려 3시간동안 교반 시켰다. 반응액을 감압 증류하여 용매를 제거하고 잔사를 얻은 다음 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하여 목적물 0.012g(49%)을 얻었다: NMR (300MHz,
CDCls) δ： 1.15(m, 12H), 2.31(m, 1H), 3.41(m, 2H), 3.45(m, 2H), 3.93(s, 6H),
5.22(d, 1H), 5.71(s, 1H) .
<391>
<392> <1-13> N-부틸 -2-(4,6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸 -부틸 아미드 (N-
Butyl-2-(4,6-dimethoxy-pyrimidin-2-yloxy)-3-methyl-butyl amide)의 합성 (KR-S- 002)
<393> 2-(4，6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸-부틸산 (2-(4,6-Dimethoxy- pyrimidin-2-yloxy)-3-methyl-butyric acid) 0.02g(0.078mmol )를 넣고 HOBT 0.15g(0.1()lmmol)과 부틸 아민 (butyl amine) 0.0085g(0.117画 ol )을 MC 10ml에 녹이 고 ice-bath에서 0°C를 유지하면서 10분 교반했다. 교반 후 EDCI HC1 0.019g(0.101隱 ol)을 서서히 넣어 주고 20분 동안 온도를 유지하면서 교반 시킨 후 상온으로 온도를 올려 3시간동안 교반시켰다. 반응액을 감압 증류하여 용매를 제거 하고 잔사를 얻은 다음 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분라 정제하여 목적물
0.015g(62¾)을 얻었다. : H NMR (300MHz, CDC13) δ： 1.08(m, 3H), 1.23(m, 6H),
1.30(m, 2H), 1.43(m, 2H), 2.34(m, 1H), 3.26(m, 2H), 3.91(s, 6H), 5.33(d, 2H), 5.74(s, 1H), 6.27(s, 1H).
<394>
<395> <1-1 > 2-(4,6-디메특시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸 -N-페닐 -부틸 아미드 (2-
(4,6-Dimethoxy-pyrimidin-2-yloxy)-3-methyl-N-phenyl-butyl amide)의합성 (KR-S- 003)
<396> 2-(4，6-디메특시-피리미딘 -2-일옥시 )-3_메틸-부틸산 (2-(4,6-Dimethoxy- pyr i m i d i η-2-y 1 oxy ) -3-me t hy 1 -but y r i c acid) 0.02 (0.078隱01)를 넣고 HOBT 0.15g(0.101mmol)과 아닐린 (aniline) 0.011g(0.117mmol )을 MC 10ml에 녹이고 ice- bath에서 0°C를 유지하면서 10분 교반했다. 교반 후 EDCI HC1 0.019g(0.1이醒 ol )을 서서히 넣어 주고 20분 동안 온도를 유지하면서 교반 시킨 후 상온으로 온도를 올 려 3시간동안 교반시켰다. 반응액을 감압 증류하여 용매를 제거하고 잔사를 얻은 다음 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하여 목적물 0.017g(66%)을 얻었 다.: H NMR (300MHz, CDC13) δ： 1.13(m, 6H), 2.45(m, 1H), 3.92(s, 6H), 5.38(d, 1H), 5.76(s, 1H), 7.11(t, 1H), 7.32(t, 2H), 7.52(d, 2H), 7.98(s, 1H).
<397>
<398> <1-15> N-벤질 -2-(4,6-디메톡시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸 -부틸 아미드 (N-
Benzyl-2-(4,6-dimethoxy-pyrimidin-2-yloxy)-3-methyl-butyl amide)의합성 (KR-S- 004)
<399> 2-(4，6-디메록시-피리미딘— 2-일옥시 )-3—메틸—부틸산 2-(4，6— Dimethoxy- pyr i m i d i η-2-y 1 oxy ) -3-me t hy 1 -but y r i c acid 0.02g(0.078隱 ol )를 넣고 HOBT 0.15 (0.101隱01)과 벤질 아민 (benzyl amine) 0.0125g(0.117薩 ol )을 MC 10ml에 녹 이고 ice-bath에서 0°C를 유지하면서 10분 교반했다. 교반 후 EDCI HC1 0.019g(0.101mmol)을 서서히 넣어 주고 20분 동안 온도를 유지하면서 교반 시킨 후 상온으로 온도를 을려 3시간동안 교반시켰다. 반웅액을 감압 증류하여 용매를 제거 하고 잔사를 얻은 다음 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하여 목적물
0.02g(74%)을 얻었다.: H 賺 (300MHz, CDC13) δ： 1.10(m, 6H), 2.42(m, 1H), 3.89(s, 6H), 4.45(d, 2H), 5.34(d, 1H), 5.76(s, 1H), 7.15(s, 1H), 7.25(m, 6H).
<400>
<40i> <l-16>2-(4,6-디메특시-피리미딘 -2-일옥시 )-N-이소프로필 -3-메틸 -부틸아미
H.(2-(4,6-dimethoxy-pyrimidin-2-yloxy)-N-isopropyl-3-methyl-butyl amide)의합 성 (KR-S-005)
<402> 2-(4，6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시 )-3—메틸-부틸산 2-(4,6-Dimethoxy—
pyrimidin-2-yloxy)-3-methyl-butyric acid) 0.02g(0.078隱 ol )를 넣고 HOBT 0.15g(0.101mmol)과 이소프로필 아민 (isopropyl amine) 0.006g(0.117mmol )을 MC 10ml에 녹이고 ice-bath에서 0°C를 유지하면서 10분 교반했다. 교반 후 EDCI HC1 0.019g(0.101mmol)을 서서히 넣어 주고 20분 동안 온도를 유지하면서 교반 시킨 후 상온으로 온도를 올려 3시간동안 교반시켰다. 반웅액을 감압 증류하여 용매를 제거 하고 잔사를 얻은 다음 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하여 목적물
0.01g(4 )을 얻었다.: H NMR (300MHz, CDC13) δ： 1.07(m, 9H), 1.12(m, 3H), 2.37(m, 1H), 4.07(s, 6H), 4.11(m, 1H), 5.28(d, 1H), 5.74(s, 1H), 6.07(d, 1H).
<403>
<404> <1-17>2-(4，6-디메특시-피리미딘-2-일옥시) -메특시-3^-디메틸-부틸아미
^.(2-(4,6-dimethoxy-pyrimidin-2-yloxy)-N-methoxy-3,N-dimethyl-butyl amide)의 합성 (KR-S-006)
<405> 2-(4，6-디메톡시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸-부틸산 2-(4,6-Dimethoxy- pyrimidin-2-yloxy)-3-methyl-butyric acid) 0.02g(0.078誦 ol )를 넣고 HOBT 0.15g(0.101mmol)과 N,0_디메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드 (N, 0-
Dimethylhydroxyl amine hydrochloride) 0.0098g(0.117隱 ol )을 MC 10ml에 녹이고 ice-bath에서 0°C를 유지하면서 10분 교반했다. 교반 후 EDCI HC1 0.019g(0.1()l瞧 ol)을 서서히 넣어 주고 20분 동안 온도를 유지하면서 교반 시킨 후 상온으로 온도를 을려 3시간동안 교반시켰다. 반응액을 감압 증류하여 용매를 제거 하고 잔사를 얻은 다음 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하여 목적물
0.011g(47%)을 얻었다.: H NMR (300MHz, CDC13) δ： l.lKd, 6H), 1.68(s, 1H), 2.34(m, 1H), 3.89(d, 6H), 5.39(s, 1H), 5.68(s, 1H).
<406>
<407> <1-18> 2-(4,6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸 -1-피페리딘 -1-일-부탄-
1一온) (2-(4>6-dimethoxy-pyrimidin-2-yloxy)-3-methyl-l-piperidin-l-yl-butan-l- one)의 합성 (KR-S-007)
<408> 2-(4，6-디메록시-피리미딘 -2—일옥시 )-3-메틸-부틸산 (2-(4,6-Dimethoxy- pyr i m i d i η-2-y 1 oxy ) -3-me t hy 1 -but y r i c acid) 0.02g(0.078隱 ol )를 넣고 HOBT 0.15g(0.1()lmmol)과 피페리딘 (piperidine) 0.0125g(0.117mmol )을 넣고 MC 10ml에 녹이고 ice-bath에서 0°C를 유지하면서 10분 교반했다. 교반 후 EDCI HC1 0.019g(0.101mmol)을 서서히 넣어 주고 20분 동안 온도를 유지하면서 교반 시킨 후 상온으로 온도를 올려 3시간동안 교반시켰다. 반웅액을 감압 증류하여 용매를 제거 하고 잔사를 얻은 다음 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하여 목적물
0.011g(43%)을 얻었다. : H 證 (300MHz, CDC13) δ： l.lKd, 6H), 1.52(m, 6H),
2.34(m, 1H), 3.34(m, 4H), 3.89(s, 6H), 4.62(s, 1H) , 6.08(s, 1H) . <409>
<4io> <1-19> 2-(4, 6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸 -1-몰포린 -4-일 -부탄 -1- 은 (2一 (4 , 6-dimethoxy^-pyr imi din-2-y 1 oxy )-3-methy 1 -1-morpho 1 i η-4-y 1 -but an- 1-one ) 의 합성 (KR-S-008)
<4ii> 2-(4，6-디메톡시-피리미딘— 2-일옥시 )-3-메틸-부틸산 2— (4,6-Dimethoxy—
pyrimidin-2-yloxy)-3-methyl-butyric acid) 0.02g(0.078mmol )를 넣고 HOBT 0.15g(0.101mmol)과 몰포린 (morpholine) 0.0125g(0.117誦 ol )올 MC 10ml에 녹이고 ice-bath에서 0°C를 유지하면서 10분 교반했다. 교반 후 EDCI HC1 0.019g(0.101mmol)을 서서히 넣어 주고 20분 동안 온도를 유지하면서 교반 시킨 후 상온으로 온도를 올려 3시간동안 교반시켰다. 반웅액을 감압 증류하여 용매를 제거 하고 잔사를 얻은 다음 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하여 목적물
0.013g(5 >)을 얻었다. : H NMR (300MHz, CDC13) δ： l.lKd, 6H) , 1.68(s, 1Η), 2.34(m, 1H), 3.89(d, 6H), 5.39(s, 1H), 5.68(s, 1H).
<412>
<4i3> <l-20> 2-(4,6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸-부틸산 (2-(4,6- dimethoxy-pyr imi din-2-y 1 oxy )-3-methy 1 -butyr i c acid)의 합성 (KR-S-009)
<4i4> 2-(4， 6-디메톡시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸-부틸산 메틸 에스테르 ^-( e-
Dimethoxy— pyr imidin—2— yloxy)— 3—methyl—butyric acid methyl ester) lg(3.7mmol ) 를 MeOH/H20(3:l) 40ml에 녹이고 LiOH 0.233g(5.55mmol )을 넣은 다음 상온에서 5시 간 동안 교반시켰다. 반웅액을 감압 증류시키고 2N HC1용액으로 pH 3~4에 맞춘 후 EA와 물로 3번 추출하고 유기층을 MgS04로 건조시켜 용매를 감압하여 제거하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적물 0.66g(70%)을 얻었다.: H NMR (300MHz, CDC13) δ： 1.13(m, 6H), 2.56(s, 1H), 347(m, 4H), 3.67(m, 4H) , 3.89(s,
6H), 4.62(s, 1H) 6.08(s, 1H).
<415>
<4i6> <1-21> 2-(4, 6-디메톡시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸-부틸산 메틸 쎄스테르
(2-(4 , 6-Dimethoxy-pyr imi din-2-yloxy)-3-methy l-butyr i c acid methyl ester)의 합 성 (KR-S-010)
<4i7> 2-하이드록시 -3-메틸 -1-부틸산 메틸 에스테르 (2-Hydroxy-3-methyl-l-butyric acid methyl ester) 1.4g(0.01mol )과 2-클로로 -4,6-디메특시-피리미딘(2—(11101"0- 4 , 6-d i me t hoxy-py r i m i d i ne ) 1.74g(0.01mol )을 DMF (디메틸 푸마레이트， Dimethyl fumarate) 20ml에 녹이고 K2C03 2g(1.5eq)를 가하고 소듐 메탄 설피네이트 (sodium methane sulfinate) 0.26g(0.25eq) 넣고 120°C로 5시간동안 교반시켰다. 반응액을 상온으로 온도를 내리고 감압 증류하여 얻은 잔사쎄 cold water와 MC로 3번 추출하 고 MC층을 MgS04로 건조시켜 용매를 감압하여 제거하고실리카겔 컬텀 크로마토그래 피로 정제하여 목적물 1.7g(63%)을 얻었다.: H NMR (300MHz, CDC13) δ： 1.08(m, 6H), 2.28(m, 1H), 3.71(s, 3H), 3.89(s, 6H), 4.89(d, 1H), 5.71(s, 1H).
<418>
<4i9> <1-22>L— 2-(4,6-디메특시-피리미딘 -2-일옥시) -프로피오닉 산메틸에스테르
(L一 2一 (4,6一 Dimethoxy一 pyrimidin一 2一 yloxy)一 propionic acid methyl ester)의 /합성 (KR-S-011)
<420> L-메틸 락테이트 (L— methyl lactate) 0.46g(0.005mol )과 2-클로로 -4,6-디메록 시-피리미딘 (2-Chloro-4,6-dimethoxy-pyrimidine) 0.88g(0.005mol )을 DMF 20ml에 녹이고 K2C03 0.52g (0.75 eq)를 가하고 소듐 메탄 설피네이트 (sodium methane sulfinate) O.lg 넣고 120°C로 5시간동안 교반시켰다. 반웅액을 상온으로 온도를 내리고 감압 증류하여 얻은 잔사에 cold water와 에틸아세테이트 (ethylacetate, EA)로 3번 추출하고 소금물로 2번 씻어주었다. 유기층을 MgS04로 건조시켜 용매를 감압하여 제거하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적물 0.66g(54%)을 얻었다. : H NMR (300MHz, CDC13) δ： 1.63(d, 3H), 3.73(s, 3H), 3.89(s, 6H),
5.22(q, 1H), 5.72(s, 1H).
<421>
<422> <l-23>D"2-(4,6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시) -프로피오닉 산메틸에스테르
(D-2-( , 6-Dimethoxy-pyr imidin-2-y 1 oxy)-propioni c acid methyl ester)의 합성 (KR-S-012)
<423> D-메틸 락테이트 (D-methyl lactate) 0.46g(0.005mol )과 2-클로로 -4，6-디메록
시-피리미딘 (2-Chloro— 4,6-dimethoxy-pyrimidine) 0.88g(0.005mol )을 DMF 20ml에 녹이고 K2C03 0.52g (0.75 eq)를 가하고 소듐 메탄 설페이트 (sodium methane sulfate) O.lg 넣고 120°C로 5시간동안 교반시켰다. 반웅액을 상온으로 온도를 내 리고 감압 증류하여 얻은 잔사에 cold water와 에틸아세테이트로 3번 추출하고 소 금물로 2번 씻어주었다. 유기층을 MgS04로 건조시켜 용매를 감압하여 제거하고 실리 카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적물 0.56g(46%)올 얻었다.: H MR (300MHz, CDCls) δ： 1.63(d, 3H), 3.73(s, 3H), 3.89(s, 6H), 5.22(q, 1H) , 5.72(s, 1H) .
<424>
<425> <l-24> 2-(4,6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시 )-2-메틸 -프로피오닉 산메틸 에
Figure imgf000052_0001
acid methyl ester)의 합성 (KR— S-013)
<426> 메틸 2-하이드록시 이소부티레이트 (methyl 2-hydroxy isobutyrate)
0.52g(0.005mo 1 )과 2-클로로 -4， 6—디메톡시 -피리미딘 (2_chl oro-4， 6— dimethoxy— pyrimidine) 0.88g(0.005mol )을 DMF 20ml에 녹이고 K2C030.52g (0.75 eq)를 가하 고 소듐 메탄 설페이트 O.lg 넣고 120°C로 5시간동안 교반시켰다. 반웅액을 상온으 로 온도를 내리고 감압 증류하여 얻은 잔사에 cold water와 에틸아세테이트로 3번 추출하고 소금물로 2번 씻어주었다. 유기층을 MgS04로 건조시켜 용매를 감압하여 제 ᅳ 거하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적물 0.14g(l )을 얻었다.: H 醒 (300MHz, CDCI3) δ： 1.72(s, 6H), 3.66(s, 3H), 3.93(s, 6H), 5.7(s, 1H).
<427>
<428> <l-25> D~3-(4, 6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시) -부틸산 메틸 에스테르 (D— 3-
(4 , 6-Dimethoxy-pyr imi din-2-y loxy)-butyr i c acid methyl ester)의 합성 (KR— S一 014)
<429> D-메틸 3-하이드록시 부티레이트 (D-Methyl 3-hydroxy butyrate)
.0.52g( 0.005rao 1 )과 2-클로로 -4， 6-디메톡시-피리미딘 ( 2-Ch 1 oro-4， 6-dimethoxy- pyrimidine) 0.88g(0.005mol)을 DMF 20ml에 녹이고 K2C030.52g (0.75 eq)를 가하 고 소듐 메탄 설페이트 O.lg 넣고 120°C로 5시간동안 교반시켰다. 반웅액을 상온으 로 온도를 내리고 감압증류하여 얻은 잔사에 cold water와 에틸아세테이트로 3번 추출하고 소금물로 2번 씻어주었다. 유기층을 MgS04로 건조시켜 용매를 감압하여 제 거하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적물 0.15g(12%)을 얻었다.: H NMR (300MHz, CDC13) δ： 1.43(d, 2H), 1.63(d, 3H), 3.73(s, 3H), 3.89(s, 6H), 5.22(q, 1H), 5.72(s, 1H).
<430> <43i> <l-26>L-2-(4,6-디메특시-피리미딘 -2-일옥시 )— 3-메틸-부틸산메틸에스테르
(L-2-(4, 6-Dimethoxy-pyr imidin-2-yloxy)-3-methyl-butyr i c acid methyl ester)의 합성 (KR-S-015)
<432> L-2-하이드록시 -3-메틸-부틸산 메틸 에스테르 (2— Hydroxy— 3-methyl-butyric acid methyl ester) 0.7g(0.0053mol )과 2-클로로 -4,6-디메톡시-피리미딘 (2- Chloro-4,6-diraethoxy-pyrimidine) 0.9g(0.0053mol )을 DMF 20ml에 녹이고 K2C03
0.6g올 가하고 소듐 메탄 설페이트 O.lg 넣고 12CTC로 5시간동안 교반시킨다. 반응 액을 상온으로 온도를 내리고 감압 증류하여 얻은 잔사에 cold water와 에틸아세테 이트로 3번 추출하고 소금물로 2번 씻어주었다. 유기층을 MgS04로 건조시켜 용매를 감압하여 제거하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적물 0.5g(33%)을 얻었다. : H NMR (300MHz, CDC13) δ： l.lKm, 7H), 3.71(s, 3H) 3.89(s, 6H),
4.91(d, 1H), 5.71(s, 1H).
<433>
<434> <l-27> (4, 6-디메톡시-피리미딘 -2-일옥시) -페닐-아세트산 메틸 에스테르
( (4 , 6-Dimethoxy-pyr imi din-2-y loxy)-pheny 1-acet i c acid methyl ester)의 합성 (KR-S-016)
<435> 하이드록시페닐 아세트산 메틸 에스테르 (Hydroxyphenyl acetic acid methyl ester) 2.3g(0.0138mol )과 2-클로로 -46-디메톡시-피리미딘 (2_Chloro-4,6- dimethoxy-pyrimidine) 2.4g(0.0138niol )을 DMF 30tnl에 녹이고 K2C03 2.9g (1.5 eq) 를 가하고 소듐 메탄 설피네이드 (sodium methane sulfinate) 0.36g(0.25eq) 넣고 120°C로 5시간동안 교반시켰다. 반웅액을 상온으로 온도를 내리고 감압 증류하여 얻은 잔사에 cold water와 MC로 3 번 추출하고 MC층을 MgS04로 건조시켜 용매를 감 압하여 제거하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적물 2.4g(57%)을 얻 었다.: H NMR (300MHz, CDC13) δ : 3.72(s, 3H), 3.87(s, 6H), 5.75(s, 1H),
6.06(s, 1H), 7.35(m, 3H), 7.59(m, 2H).
<436>
<437> <l-28> (4,6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시) -페닐-아세트산 ((4,6-Dimethoxy- pyrimidin-2-yloxy)-phenyl-acet ic acid)의 합성 (KR-S-017)
<438> MeOH/H20(3: ) 40ml에 (4,6-디메톡시―피리미딘 -2-일옥시) -페닐-아세트산 메 틸 °ll tfl ( ( 4 , 6-D i me t hoxy-py r i m i d i η-2-y 1 oxy ) -pheny 1 ~ac e t i c acid methyl ester) 1 3.7議01)을 넣고 LiOH 0.233 (5.55誦01)을 넣고 상온에서 5시간 동안 교 반시킨다. 반웅액을 감압 증류시키고 2N HC1용액으로 pH 3~4에 맞춘다. 에틸아세 테이트와 ¾0로 3번 추출하고 MgS04로 건조시켜 용매를 감압하여 제거하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적물 0.66g(54¾)을 얻었다.: H NMR (300MHz, CDCls) δ： 3.45(s, 1H), 3.79(s, 6H), 5.65(s, 1H), 6.01(s, 1H), 7.24(m, 5H).
<439>
<440> <l-29> 2-(4, 6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시) -N-이소프로필 -2-페닐-아세트아 미드 (2一(4 , 6-Dimethoxy-pyr imi din-2-y 1 oxy)-N- i sopropy 1 -2-pheny 1 -acet ami de ) ^\합 성 (KR-S-018)
<44i> (4,6-디메특시-피리미딘-2-일옥시)-페닐-아세트산((4，6-1)^ 1; « - py r i m i d i η-2-y 1 oxy ) -pheny 1 -ace t i c acid) 0.02g(0.069mmol )을 넣고 ΙΪΟΒΤ 0.15g(0.090腿 ol)과 이소프로필 아민 (isopropyl amine) 0.006g(0.104mmol)을 MC 10ml에 녹이고 ice-bath에서 0°C를 유지하면서 10분 교반했다. 여기에 EDCI HC1 0.017g(0.090瞧 ol)을 서서히 넣어 주고 20분 동안 온도를 유지한 다음 상온으로 온 도를 올려 3시간동안 교반시켰다. 반웅액을 감압 증류하여 용매를 제거하고 잔사를 얻은 다음 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적물 0.003g(13%)을 얻었 다.: H證 (300MHz, CDCI3) δ： 1.25(m, 6H), 1.60(m, 6H), 4.07(s, 6H) , 4.11(m,
1H), 5.2(s, 1H), 5.74(s, 1H), 6.37(s, 1H), 6.53(s, 1H), 7.37(m, 3H) , 7.56(m, 2H).
<442> -
<443> <1-30： -벤질-2—(4,6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시 )-2-페닐 -아세트아미드 (N-
Benzyl— 2-(4,6-dimethoxy-pyrimidin-2~yloxy)-2-phenyl-acetamide)의 합성 (KR—S- 019)
<444> (4,6-디메특시-피리미딘 -2-일옥시) -페닐-아세트산 ((4,6-Dimethoxy- pyr i m i d i η-2-y 1 oxy ) -pheny 1 -ace t i c acid) 0.02g(0.069隱 ol )을 넣고 H0BT 0.15g(0.090隱 ol)과 벤질 아민 (tenzyl amine) 0.0111g(0.104隱 ol )을 MC 10ml에 녹 이고 ice-bath에서 0°C를 유지하면서 10분 교반했다. 여기에 EDCI HC1 0.017g(0.090mmol)을 서서히 넣어 주고 20분 동안 온도를 유지한 다음 상온으로 온 도를 을려 3시간동안 교반시켰다. 반응액을 감압 증류하여 용매를 제거하고 잔사를 얻은 다음 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적물 0.010g(38%)을 얻었 다.: H NMR (300MHz, CDC13) δ： 1.25(s, 1H), 1.60(s, 2H), 3.86(s, 6H), 4.47(m,
1H), 5.12(s, 1H) , 5.74(s, 1H), 6.37(s, 1H), 6.53(s, 1H), 7.00(t, 1H) 7.37(m, 8H), 7.56(m, 2H).
<445>
<446> <1-31^-부틸-2-(4,6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시 )-2-페닐-아세트아미드 (N-
Butyl-2-(4,6-dimethoxy-pyrimidin-2-yloxy)-2-phenyl-acetamide)^| 합성 (KR一 S— 020)
<447> (4,6-디메톡시—피리미딘-2-일옥시)-페닐-아세트산((4，6-1)11^1;1^^- pyr i mi di η-2-y 1 oxy )-pheny 1 -acet i c acid) 0.02g(0.069隱 ol )을 넣고 HOBT 0.15g(0.090瞧 ol)과 부틸 아민 (butyl amine) 0.0076g(0.104mmol)을 MC 10ml에 녹이 고 ice-bath에서 0°C를 유지하면서 10분 교반했다. 여기에 EDCI HC1 0.017g(0.090mmol)을 서서히 넣어 주고 20분 동안 온도를 유지한 다음 상온으로 온 도를 을려 3시간동안 교반시켰다. 반웅액을 감압 증류하여 용매를 제거하고 잔사를 얻은 다음 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적물 0.023g(96¾>)을 얻었 다.: H NMR (300MHz, CDC13) δ： 1.08(m, 3H), 1.30(m, 2H), 1.43(m, 2H) 2.34(m,
1H), 3.26(m, 2H) 3.86(s, 6H), 4.47(m, 1H), 5.12(s, 1H), 5.74(s, 1H)， 6.37(s, 1H), 6.53(s, 1H), 7.37(m, 3H), 7.56(m, 2H).
<448>
<449> <l-32> 2-(4，6-디메톡시-피리미딘 -2-일옥시) -N,N-디에틸 -2-페닐-아세트아미
드 (2-(4,6— Dimethoxy-pyrimidin— 2-yloxy)— N,N-diethyl-2—phenyl-acetamide)의합성 (KR-S-021)
<450> (4,6-디메톡시-피리미딘-2-일옥시)-페닐—아세트산((4，6-1^111^ « - pyrimidin-2-yloxy)-phenyl-acetic acid 0.02g(0.069圆 ol )을 넣고 H0BT 0.15g(0.090mmol)과 디에틸 아민 (Diethyl amine) 0.0076g(0.104mmol )을 MC 10ml에 녹이고 ice-bath에서 0°C를 유지하면서 10분 교반했다. 여기에 EDCI HC1 0.017g(0.090mmol)을 서서히 넣어 주고 20분 동안 온도를 유지한 다음 상온으로 온 도를 올려 3시간동안 교반시켰다. 반웅액을 감압 증류하여 용매를 제거하고 잔사를 얻은 다음 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적물 0.010g(4 )을 얻었 다. : H NMR (300MHz, CDC13) δ： 0.98(1:， 3Η), 1.13(1:， 3Η) , 1.64(s, 1H)， 3.26(m,
2H) 3.41(s, 1H), 3.86(s, 6H), 5.74(s, 1H), 6.37(s, 1H), 7.37(m, 3H) , 7.56(m 2H).
<451>
<452> <l-33> L— 2-(4,6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸-부틸산 (L-2-(4,6-
Dimethoxy-pyr imidin-2-yloxy)-3-methyl-butyr i c acid)의 합성 (KR-S-022)
<453> L-2-(4, 6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸 -부틸산 메틸 에스테르 (2-
( 4 , 6-D i me t hoxy-py r i m i d i η-2-y 1 oxy ) -3-me t hy 1 -but y r i c acid methyl ester)
.、 0.06g(0.00025mol)를 약 3ml의 MeOH에 녹이고 20% NaOH 0.5ml를 가한 후 용액을
50~60°C로 2시간 가열한다. 용액을 상온으로 식힌 후 lqml의 물을 가하고 n-hexane 15ml로 유기층 (organic layer) 분리 후 수용액에 0.5ml의 진한 HC1을 가하고 에틸 아세테이트 30ml로 추출하고 염수 (brine)로 3번 씻었다. 에틸아세테이트 층을 분리 하여 MgS04로 건조시켜 용매를 감압하여 제거하여 목적물 0.04g(71%)을 얻었다.:
H NMR (300MHz, CDC13) δ： l.ll(m, 6H), 3.84(s, 6H), 4.89(d, 1H), 5.73(s, 1H), 10.19(s, 1H).
<454>
<455> <l-34> D~2-(4, 6-디메특시-피리미딘 -2-일옥시) -프로피오닉 산 (D— S- ^-
Dimethoxy—pyrimidin 一 yloxy)—propionic acid)의 합성 (KR— S—023)
<456> D-2-(4, 6-디메특시-피리미딘 -2-일옥시) -프로피오닉 산 메틸 에스테르 (2-
(4,6— Dimethoxyᅳ pyrimidinᅳ 2ᅳ yloxy)ᅳ propionic acid methyl ester)
0.06g(0.00025mol)를 약 3ml의 MeOH에 녹이고 20% NaOH 0.5ml를 가한 후 용액을 50 ~60°C로 2시간 가열했다. 용액을 상온으로 식힌 후 10ml의—물을 가하고 n-hexane 15ml로 유기층 (organic layer) 분리 후 수용액에 0.5ml의 진한 HC1을 가하고 에틸 아세테이트 30ml로 추출하고 염수 (brine)로 3번 씻었다. 에틸아세테이트층을 MgS04 로 건조시켜 용매를 감압하여 제거하여 목적물 0.04g (기 ¾)을 얻었다.: H NMR (300MHz, CDCI3) δ： 1.63(d, 3H), 3.89(s, 6H)， 5.22(q, 1H), 5.72(s, 1H),
10.19(s, 1H).
<457>
<458> <l-35> L-2-(4, 6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시) -프로피오닉 산(1^-2-(4，6-
Dimethoxy-pyrimidin-2-yloxy)-propionic acid)의 합성 (KR—S—024)
<459> L-2-(4, 6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시) -프로피오닉 산 메틸 에스테르 (2-
( 4 , 6-D i me t hoxy-py r i m i d i η-2-y 1 oxy ) -p r op i on i c acid methyl ester) 0.08g(0.0003mol)를 약 3ml의 MeOH에 녹이고 20% NaOH 0.5ml를 가한 후 용액을 50 ~ 60°C로 2시간 가열했다. 용액을 상온으로 식힌 후 10ml의 물을 가하고 n-hexane 15ml로 유기층 (organic layer) 분리 후 수용액에 0.5ml의 진한 HC1을 가하고 에틸 아세테이트 30ml로 추출하고 염수 (brine)로 3번 씻었다. 에틸아세테이트층을 MgS04 로 건조시켜 용매를 감압하여 제거하여 목적물 0.06g(87%)을 얻었다.: H NMR (300MHz, CDC13) δ： 1.63(d, 3H), 3.89(s, 6H), 5.22(q," 1H), 5.72(s, 1H), 10.19(s, 1H).
<460>
<461> <비교예 1>
<462> 2-( .6-디메톡시피리미딘 -2-일옥시 )-3-페닐프로피온산 (2-(4.6-
Dimethoxypyrimidin-2-yloxy)-3-phenylpropionic acid)의 합성
<463>
<464> 2-(4，6-디메톡시피리미딘 -2-일옥시 )-3-페닐프로피온산 메틸 에스테르 (2-
( 4 , 6-D i me t hoxypy r i m i d i η-2-y 1 oxy ) -3-pheny 1 r op i on i c acid methyl ester) 3.58 g (0.02 mol)과 4，6-디메록시피리미딘 -2-일 메틸 설폰 4.36 g (0.02 mol)을 DMF 100 ml에 녹이고 K2C03 3.3 g (1.2 eq)를 가하고 95°C를 유지하면서 하¾ᅳ밤 교반했다. 반웅액을 물 100 ml에 가하고 디에틸 에테르로 추출하고 MgS04로 건조한 후 감압 증 류하여 잔사를 얻고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 2-(4，6-디메특시피 리미딘 -2-일옥시 )-2-페닐프로피온산 메틸 에스테르 (2-(4,6-dimethoxypyrimidin-2- yloxy)-2-phenylpropionic acid methyl ester)인 고체물질 5.16 g (81%)을 얻었다. 얻어진 화합물을 메탄올과 물 (약 3:1) 흔합용매에 녹이고 얼음조 (ice bath) 로 넁 각시킨 다음 LiOH.H20 0.96 g을 넣고 30분간 교반시켰다. 얼음 조를 제거하고 실온 에서 2시간 반응시킨 다음 감압 농축하여 메탄올을 제거하고 소량의 디에틸 에스테 르로 추출하였다. 물 층에 묽은 염산을 넣어 PH 7 정도로 중화하면 고체가 생성된 다. 여과하고 건조시켜 2-(4， 6-디메특시피리미딘 -2-일옥시 )-2-페닐프로피온산 4.35 g (88%)을 얻었다: NMR (CDCls) ； 3.08 (dd, 1H) 3.33 (dd, 1H), 3.73 (s, 6H), 4.95 (d, 1H), 6.13 (s, 1H) 7.12-7.26 (m, 5H), 12.34 (s, 1H).
<465>
<466> <실시예 2>
<467> 본발명의 화합물의 효과확인 <468>
<469> <실험 방법 >
<470> 1. 인간혈액 (Human blood)
<471> 본 발명과 관련된 환자는 국립서울대학교병원의 내과의 류마티스 진료소에 둥록된 환자이다. 인간 혈액은 22명의 SLE 환자와 16명의 건강한 개인에게서 얻었 다. 말초혈액단핵세포 (PBMC)는 Ficoll-Paqiie Plus (GE healthcare)를 사용하여 분리 하였다. 환자는 그들의 질병에 대하여 다음과 같은 기준을 만족하는 자이다: 1997 갱신된 _미국 류마티스 협회의 개정 SLE 분류기준 (the 1997 update of the American Col lege of Rheumatology revised criteria for classification of SLE) . 이 연구 는 국립서을대학교병원의 기관심사위원회의 승인을 받았다.
<472> '
<473> "2. 약물투여' (Drug administration)
<474> gp96 m 암컷 형질전환 생쥐 (Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 December 23；
100(26)： 15824-15829)는 서울대학교 약학대학 종합약학연구소 실험동물실에서 사 육， 관리 되었다. 본 발명자는 나이를 맞춘， 12-26주^ 생쥐를 각 실험군에 사용하 였다-. 세포 표면 gp96을 억제하기 위하여 우리는 GPM1 화합물을 사용하였다. 덱사 메타손과 GPM1은 5% DMS0가 함유된 인산 완층 식염수 (PBS)에 녹였다. 화합물은 복 강내로 2개월간 24시간마다 투여돠었다 (30mg/kg/day). 각각 9마리로 이루어진 3개 그룹이 시험되었다. 모든 과정은 국립보건연구원에서 발행된. 실험.동물 관리와 이용 어】 관한 지침 (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Korean National Institute of Health)에 따라 실시되었다.
<475>
<476> 3. 유세포분석 (Flow cytometry)
<477> 조직을 멸균된 메시 (mesh)로 갈아 비장과 림프절 세포 현탁액을 준비하고， 적혈구는 적혈구 용해 완층액 (eBioscience, CA)으로 용해시켰다. 표면 염색을 위하 여 항체는 플루오로세인 이소티오시아네이트 (FITC), 피코에리트린 (PE), PerCP 또는 APC가 결합되었다. 사용된 항체는 CD4(RM4-5, H129.12), CD8(53— 6,7)， B220(RA3- 6B2), CDllb(Ml/70), CDllc(HL3), CD44(IM7), CD62L(MEL-14) , CD69(H1.2F3) , CD25(PC61.5), IgM(ll/41), IgD(ll-26C.2a) (BD Pharmingen, CA), MHC class IKM5/114.15.2), Foxp3(FJK-16s)(eBioscience, CA), 및 gp96(Santacruz, CA)이다. 염색 후 세포는 세척되고 CellQuest 프로그램을 사용하는 FACScan 유세포 분석기 (BD Bioscience, Mountain View, CA)로 분석되었다. <478>
<479> 4. 수지상세포성숙어세이 (DC maturation assay)
<480> 야생형 생쥐의 골수유래 미성숙 수지상세포 (1X104)를 야생형 또는 ΑΙΜΡ1_/— 생쥐의 고정된 GPM1 또는 NC-1처리된 비장세포 (2X105)로 16시간 동안 자극하였다. 배양 상등액은 Pierce Biotechnology Inc. ( ockford, IL)의 EL ISA ¾ '을 사용한 TNF α 어세이를 위하여 회수하였다.
<481>
<482> 5. 화학물질 스크리닝을 위한 ELISA 어세이 (ELISA assay for chemical screening)
<483> 96-웰 폴레이트 (Maxisorp.， F96; Nunc)를 AIMP1을 포함하는 PBS(pH 7.4)로 코팅하였다 (500ng/well).;" 세척 후 나머지 부분은 1% BSA를 포함하는 PBS로 1시간동 안 블톡 (block) 시켰다. 트리스 버퍼 (25mM 트리스， 10mM NaCl 및 0.4% 트리톤 X— 100)에서 10ng/웰의 바이오틴이 결합된 gp96을 결합시켰다. 6，580 화합물이 각각 웰에 ΙΟΟηΜ의 농도로 더해지고 플레이트는 세척 후 HRP가 결합된 스트렙타바'딘을 포함하는， 0.1% BSA와 0.1% 트윈 20이 들어간 PBS로 30분간 인큐베이션 시켰다. 플 레이트를 세척 후 각 웰에 기질을 넣었다. 흡광도는 450nm에서 측정되었다.
<484>
<485> 6. 조직학 (Histology)
<486> gp96tm 형질전환 생쥐의 신장 조직 절편은 10%포름알데하이드가 들어간 PBS 로 고정하고， 알코올그라디언트 (alcohol gradient)로 탈수하였다. 파라핀 침투 후. 조직은 마이크로틈 (microtome)으로 잘라져 헤마톡실린과 에오신 (H&E)으로 염색 후 광학현미경으로 분석되었다. 면역형광 염색을 위하여， 신장은 저온유지장치에서 잘 라졌다. 이들 넁동절편은 일반 염소 혈청으로 블록 (block)되고 FITC가 결합된 염소 항 생쥐 Ig(BD pharmingen, CA)로 염색되어, 형광현미경으로 관찰 되었다.
<487>
<488> 7. 표면플라즈몬공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR)
<489> 인간 gp96은 대장균 (Escherichia coli) BL21(DE3)에서 His 꼬리가 붙은 단백 질 형태로 발현되고， 니켈 선호 크로마토그래피로 정제되었다. His 꼬리가 붙은 gp96은 표준 아민 커플링을 이용하여 CM5 센서 칩에 고정되었다. PBS가 러닝버퍼로 사용되었다. 흐르는 세포의 한쪽에 있는 카르복실 메틸 덱스트란은 0.4M의 EDC와 0.1M의 NHS를 1:1의 비율로 7분간 주사하여 활성화 되었다. 단백질은 pH 7.3의 10mM 소듐 아세테이트로 회석된 gp96을 7분간 주사하여 표면에 커플링되었다. 남아 있는 활성 그룹은 1.0M의 에탄올아민, PH8.5를 7분간 주사하여 블록 (block)시켰다.
GPM1 화합물은 직접 1% DMS0를 포함하는 PBS 러닝버퍼에 녹여 20ul/ml의 속도로 25 °C에서 주사되었다. 결합은 공명단위 (RU)의 변화에 의하여 결정되었다. 화합물의 농도는 ΙΟηΜ에서 25uM까지 변화하였으며 각 농도는 적어도 3번 실험하였다. 모든 결합 복합체는 합리적인 시간내에 기준선까지 떨어졌다. 따라서 재생 (regeneration)과정은 필요하지 않았다. 센소그램 (sensor gram)은 기준 표면 (control surface)에서 기록된 결합반웅올 빼고， 반웅점에서 평균 버퍼 탱크 주 사를 빼어 진행되었다. 속도상수를 결정하기 위하여， 모든 자료 세트는 BIAevaluation 프로그램을 이용하여 기¾선 표류 모델과 단순 1:1 결합에 맞도록 하였다. -
<490>
<491> 8. 루프스동물모델의 생존율측정
<492> NZB/W F1 마우스는 _자발적인 루프스 증세가 나타나는 루프스 동물모델로서 이 동물모델에서의 2，4-피리미딘 유도체 효능을 검증하였다.
<493> 25주령 male NZB/W F1마우스를 각 군당 10마리씩 사용하여 대조군 (5% DMS0 용액)과 실험군 (30mg/kg 용량의 2，4-피리미딘 유도체)를 매일 1회 복강투여하고 루프스 증세 악화로 인해 죽는 마우스를 제외한， 살아있는 마우스의 비율올 분석하 였다.
<494>
<495> 9. 통계적 분석 (Statistical analysis)
<496> 스튜던트 t—검정 (student t-test)이 통계적 분석을 위하여 사용되었다. 0.05 보다 작은 P값은 통계적으로 유의한 차이를 의미하는 것이다.
<497>
<498> <실 결과 >
<499> gp96의 세포막 전좌에 영향을 미칠수 있는 화합물을 찾기 위하여， 본 발명자 들은 gp96의 AIMP1과의 상호작용을 스크리닝 목표로 삼았다. 이러한 스크리닝을 위 하여 한국 화합물 은행에 기탁되어 있는 150， 000개의 서로 다른 화합물을 대표하는 다른 파마코포어 (pharmacophore)를 가지는 6, 482개의 화합물을 선별하고 상기 두 단백질의 상호작용을 저해할 수 있는 화합물을 찾았다. 이러한 스크리닝을 위하여 실험방법에 기재한 것과 같은 재조합 AIMP1 및 gp96 단백질을 사용한 변형된 ELISA 방법을 셋업하였다. 시험한 각각의 화합물은 두 단백질의 상호작용에 다른 효과를 나타내었다 (도 19). 그리고, 본 발명자들은 0·1μΜ의 농도에서 대조군에 비해서 95%이상 상호작용을 저해하는 12 화합물을 선별하였다 (표 1). 본 발명자들은 이 12 초기검색 화합물로부터 유래된 1251개의 추가 화합물을 확보하고 이들의 gp96- AIMP1 상호작용에 대한 저해활성을 다시 테스트하였다. 그들 중, 77 화합물은 저해 효과를 보였고, 1174화합물은 효과를 보이지 않았다 (표 1).
<500>
<501> [표 1】
<502>
Figure imgf000061_0001
<503> 상기 표에서 "primary hits ID"는 화합물 라이브러리 상의 식별용 ID이며, derivatives는 상기 ID와 관련된 유도체를 나타낸다. gp96-AIMPl의 상호작용에 대 한 효과는 상기 유도체에 대한 저해 /효과 없음을 확인한 것이며, 세포 표면 gp96 수준에 대한 효과는 상기에서 저해 효과가 나타나는 것을 대상으로 한 결과를 나타 낸다.
<504>
<505> gp96 및 AIMP1의 상호작용올 저해하는 화합물은 이들의 결합부위에 따라서 gp96의 표면 전좌를 증진하거나 또는 억제할 것으로 예측되었다. 따라서, 본 발명 자들은 실험방법에 기재한 바와 같이 gp96의 표면 발현에 대한 상기 77 화합물의 효과를 확인하였다. 77개의 화합물 (compounds) 증에서 12개의 화합물은 전체 세포 에서 gp96+ 세포의 비율을 20%이상으로 증가시키는 반면， 8개는 gp96+ 세포를 10% 이하로 감소시켰다. 나머지 57개의 화합물은 이들 사이의 범위의 효과를 나타내었 다 (도 20 및 표 1). 그 증， 하나의 화합물 [(S)-methyl 2-(4,6- dimethoxypyrimidine-2-yloxy)-3-methylbutanoate)]을 선별하였고， (GPM1으로 명 명， Fig. la; Teague, S.J. , Davis, A.M. , Leeson, P.D. & Oprea, T. Angew. Chem. Int. Ed. 38, 3743-3748(1999)), 도 21에서 보여준 방법에 따라 GPM1을 선택적으로 합성하였고， 이의 유도체로서 피리미딘 백본을 가지는 화합물을 선별하였다. 이 들 화합물은， 비록 그들이 gp96의 세포 표면 발현 수준 (level)에 있어 상이한 억제효 과를 보여주었지만 (표 2)， 주로 4,6-디메록시피리미딘 (4,6-dimethoxypyrimidine) 척추 (backbone)를 가지고 있어 이 척추가 활성에 있어 중요하다는 것을 암시하였 다.
<506>
<507> 【표 2]
Figure imgf000062_0001
<508>
<509> 한편， 화학식 16의 2-(4， 6-디메톡시피리미딘 -2-일옥시 )-3-페닐프로파노익산
(2-(4,6-dimet hoxypy r i m i d i ne-2-y 1 oxy ) -3-pheny 1 p r o ano i c acid)는 gp96과 AIMP1의 상호작용에 있어 4%의 억제효과만을 보여주었다. 이는 4,6-디메록시피리미딘 척추 에 부착되는 화학 소량체 (chemical moiety) 역시 중요하다는 것을 암시한다. 우리 는 따라서 이를 음성대조군 (NC1)으로 사용하였다 (도 1 아래). <510>
<5ii> 우리는 gp96과 AIMP1의 상호작용에 있어서 GPM1과 NCI의 용량 의존적 효과를
ELISA를 통하여 비교하였다. NC1은 전혀 효과가 없는 반면, GPM1은 약 30nM에서 50% 억제효과를 보였다 (도 2ᅳ). 우리는' GPM1의 gp96 또는 AIMP1와의 결합역학 (binding kinetics)을 BIAcore 3000을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR)으로 관찰 하였다. GPM1은 87.9nM의 에서 gp96과 결합함을 보여주었으나 (도 3 및 표 3)
AIMP1과는 명백한 결합을 보여주지 않았다. 이는 GPM1의 gp96에 대한 우월적 선호 도를 암시한다. gp96의 GPM1 결합 부위 (Han, J.M. , Park, S.G. , Liu, B. , Park, B.J. , Kim, J.Y. , Jin, C.H. , Song, Y.W. , Li, Z. & Kim, S. Am. J. Pathol. 170， 2042-2054 (2007))를 더 구체적으로 보여주기 위하여， gp96내의 AIMP1 결합지역에 위치하는 L707, V706, V712, L713, F714, Y731 및 M738에 점 돌연변이를 일으키고 이 돌연변이가 GPM1과의 결합에 어떤 영향을 미치는지를 SPR 방법으로 관찰하였다. V706A/L707A 돌연변이를 제외하고， 모든 돌연변이는 gp96의 일반 ATPase 활성은 유 지하면서 (표 3) 각기 다른 정도로 GPM1 선호도가 감소되었으며 (도 22)， 이는 gp96 의 C 말단 지역이 GPM1과의 상호작용에 관련이 있음을 암시하는 것이다.
<512> - <513> 【표 3】
Figure imgf000063_0001
<514>
<515>
<5i6> AIMP1은 gp96처럼 KDEL 모티프를 가진 단백질을 골지에서 소포체 (ER)로 회수 하는 작용을 하는 KDEL recetor-l(KDELRl)과 gp96의 상호작용을 촉진하여 gp96의 표면전좌 (surface translocat ion)를 억제한다 (Semenza, J.C. , Hardwick, .G. , Dean, N. & Pelham, H.R. Cell 61， 1349-57 (1990)). GPM1이 기능적으로 AIMP1의 이러한 작용을 모방할 수 있는지를 알아보기 위하여， 우리는 GPM1 존재 및 부존재 에서 gp96과 KDELR1 또는 AIMP1의 공면역침전을 하여 GPM1이 어떻게 gp96의 AIMP1 뿐만 아니라 KDELR1과 상호작용하는지를 시험하였다. GPM1의 첨가에 의하여 gp96의 KDELR1과의 상호작용은 증가하였으나 AIMP1과의 상호작용은 감소하였다 (도 4 좌측 ). 동일한 조건에서, GPM1은 gp96, KDER1 및 AIMP1의 세포내 수준 (도 4 우측)과 gp96의 ATPase 활성에는 영향을 미치지 아니하였다 (도 23). GPM1은 NC1과 달리, 생 쥐 비장세포(51)161«« 16)의 표면 gp96을 감소시킨다 (도 5). gp96의 표면 발현 증가 는 수지상 세포 (DCs) 성숙 (maturation)의 촉진효과로도 알 수 있다 (Han, J.M., Park, S.G., Liu, B., Park, B.J., Kim, J.Y. , Jin, C.H. , Song, Y.W., Li, Z. & Kim, S. Am. J. Pathol. 170, 2042-2054 (2007)). 따라서 우리는 수지상세포 (DCs) 를 GPM1 또는 NCI로 전처리 된 AIMP1— /_ 비장세포와 함께 배양하고 분비된 TNF-α를 통하여 수지상세포의 성숙을 측정하는 수지상세포 성숙 어세이 (DC maturation assay)를 실시하였다. 이 어세이에서， GMP1은 NC1에 비하여 분비된 TNF- α의 양을 현저히 감소시켰다 (도 6). 이러한 결과를 바탕으로 보면 gp96과 AIMP1의 상호작용 을 방해하여 gp96과 KDELR1의 상호작용을 증가시켜 gp96의 표면 전좌를 억제하는데 있어， GPM1은 AIMP1의 기능적 모조품 (functional mimicry) 역할을 하는 것으로 보 인다.
<517> -
<518> 우리는 GPM1이 만성적으로 gp96의 표면 수준이 증가된 gp96tm 형질전환 마우 스의 비장세포에서 분리한 gp96의 수준도 감소시킬 수 있는지 검사하였다. 우리는 5% DMS0가 포함된 인산완층식염수 (phosphate-buffered saline)와 글루코코르티코이 드 계열의 면역억제제인 텍사메타손 (dexamethasone, Dex)을 각각 음성 및 양성 대 조군으로 하여 GPM1의 효과와 비교하였다. 각 그룹은 나이를 맞춘 9마리의 암컷 생 쥐로 구성되었다. 30mg/kg의 용량으로 복강내 투여한 2개월 기간 동안， Dex를 처리 한 생쥐는 9마리 중 2마리가 죽었으나 GPM1을 처리한 생쥐는 특별한 부정적 효과를 보이지 않깠다 (도 24). 2개월 후， 우리는 부형제 (vehicle), Dex 또는 GPM1이 처리 된 생쥐로부터 MHC class 11+ 비장세포와 림프절을 분리하여 유세포분석을 통하여 gp96+의 비율을 측정하였다. 대조군 (control), Dex 및 GPM1이 처리된 군의 gp96+MHC class II 세포의 비율은 각각 57, 25 및 41%였으며 이는 GPM1의 gp96 표면 전좌 억 제 효과를 말해준다 (도 7 및 결과미도시). Dex는 세포 생존력에 부정적 효과를 현 저히 미 쳤으나 GPM1은 비장세포 수에 영향을 주지 아니하였다 (표 4) .
【표 4】
Figure imgf000065_0001
우리는 또한 유세포 분석을 통하여 수지상세포의 성숙도를 알 수 있는 마커 중 하나로 알려진 IC0SL의 표면 수준을 측정하는 방법으로 수지상세포의 성숙정도 를 관찰하였고 CDllb+CDllc+ 골수성 수지상세포에서 IC0SL의 수준이 현저 히 떨어지 는 것을 발견하였다 (도 8 좌측) . 우리는 또한 일관된 결과를 림프절에서 관찰하였 다 (도 25) . GMP1을 처 리 한 생쥐의 CDllb— CDllc+ 임파구성 수지상세포 ( lymphoid DCs) 에서는 IC0SL 수준 변화를 거의 찾아볼 수 없었는데 (도 8 중단) 이는 증가된 표면 gp96의 수준이 이들 세포의 IC0SL 수준에는 거의 영향을 미치지 아니하기 때문인 것으로 보인다 . 그러나 GPM1은 CDllb+CDllcf 대식세포의 수에는 영향을 미 치지 않으 면서 (결과미도시 )， 이들 세포의 IC0SL 수준은 억제한다 (도 8 우측) . GPM1은 비장 ( 도 9)과 림프절 (도 26 및 27)에서 B220+와 MHC class 11+의 수를 줄인다 . 우리는 또한 HL-60 세포주에 각 2 ,4-피 리미딘 유도체 ImM 농도로 24시간 처 리 후 세포 표면에 존재하는 gp96 단백질의 양을 gp96 항체를 이용하여 유세포 분 석 (FACS) 방법으로 분석하였다. KR-S-015 화합물이 (S)-methyl 2-(4,6- d i me t hoxypy r i m i d i η-2-y 1 oxy ) -3~me t hy 1 bu t anoa t e 이며 이 '보다 더 좋은 효과를 보 이는 화합물은 15종류 (KR-S-008 R-S-012 KR-S-001 KR-S-024 KR-S-023 KR-S-017 KR-S-011 KR-S-007 KR-S-013 KR-S-005 KR-S-009 KR-S-006 KR-S-020 KR-S-014 KR-S- ~ 022)가 나왔다 . ester (KR-S— 010)나 acid (KR-S-009)에 비해 amide (KR-S-001 , KR- S-005, KR-S-006, KR-S-007, KR-S-008)형 태가 더 우수한 것으로 평가되며 ester 형 태에서는 중간치환체가 isoproply (KR-S-009, KR-S-010) 보다 methyl (KR-S-011 , KR-S-012 , KR-S-023, KR-S-024)가 더 나은 것으로 평가되 었다 (도 35) . <527> 우리는 또한 루푸스 유사 (lupus-like) 표현형이 GPM1의 전신투여 (systemic administration)에 의하여 위축되는지 여부를 관찰하였다. 핵 항원 특이적 그리고 DNA 특이적 자가항체 (autoantibody )의 수준이 GPM1 처리된 생쥐에서 줄어들었다 (도 10 및 11). 신장기능 이상의 신호인 단백뇨 역시 GMP1 처리 후 줄어들었다 (도 12). 비록 부형제 처라한 생쥐는 기저막 비후, 심각한 혈관간 세포 증가 및 비정상적 사 구체 구조 (도 13 좌측 컬럼) 및 사구체 면역글로불린 침착 (도 14 좌측)과 같은 사 구체신염 현상으로 고통받지만， Dex 나 GPM1의 처리는 이러한 현상을 감소시켰다 ( 도 13 및 14， 중단).
<528>
<529> SLE가 활성화된 기억세포로 축적되고 B 세포의 활성화와 확장에 기여하는
CD4+ T 세포의 비정상적 활성화와 고감마글로불린혈증 (hypergammaglobulinemia)에 연관되어 있다 (Singer, G.G. , Carrera, A.C. , Marshak-Rothstein, A., Martinez, C. & Abbas, A. K. Curr. Opin. Immunol . 6， 913-920 (1994)； Wake land, E.K. , Wandstrat, A.E., Liu, K. & Morel, L. Curr. Opin. Inmunol . 11， 701-707 (1999)； Chatham, W.W. & Kimberly, R.P. Lupus 10， 140-147 (2001)； Jevnikar , A.M. , Grusby, M.J. & Glimcher, L.H. J. Exp. Med. 179, 1137-1143 (1994)； Lang, T.J. , Nguyen, P., Papadimitr iou, J.C. & Via, C.S. J. Immunol . 171, 5795-5801
(2003)). 우리는 GPM1 처리 생쥐의 비장과 림프절에서 CD4+ 기억세포와 활성화된
+ + h ί ch + 1 ow
CD4 T 세포의 수가 줄어든 것을 발견하였다 (CD4CD44 , CD4 CD62L ， and CD4+CD69+ 세포; 도 15 및 도 29). GPM1의 처리는 성숙한 B 세포의 수도 감소시켰다
(B220+IgM+IgD+; Fig. 2g). 말초 면역 관용 (peripheral immune tolerance) 유지와 적웅 면역반웅 (adaptive immune response) 조절의 수단이 되는 조절 T세포의 빈도는 SLE 환자의 PBMCs에서 낮아지며， SLE 관련 표현형과 음의 상관관계가 있다 (Barreto, M.， Ferreira, R.C. , Lourenco, L. , Moraesᅳ Fontes, M.F. , Santos , E. , Alves, M. , Carvalho, C. , Martins, B. , Andrei a, R. , Viana, J.F. , Vasconcelos, C. , Mota-Vieira, L. , Ferreira, C. , Deraengeot , J. & Vicente, A.M. BMC Immunol . 10， 5 (2009)； La Cava, A. Lupus 17， 421-425 (2008)). 우리는 GPM1 처리한 생쥐 의 비장 (도 17)과 림프절 (도 30)에서 CD4+CD25+Foxp3+ 조절 T세포 수의 증가를 관찰 하였다. Gp96tm 형질전환 생쥐가 고감마글로불린혈증을 보이는 것을 발견하였다. GPM1 처리는 총 혈청의 IgGl, IgG2b, IgG3, IgM 및 IgA 수준을 감소시킨다 (도 18). 이 러 한 모든 결과는 분자 상호작용과 gp96의 표면 전좌에 대한 GPM1의 효과가 세포 수준과 시험관 외 수준에서 반영하는 것을 일관되게 암시 한다.
<530>
<53 i> 우리는 또한 생쥐에서의 gp96의 표면 발현 증가와 SLE 표현형의 연관성 이 인 간의 경우에도 관찰이 되는지 시험하였다. 만라서 우리는 건강한 대조군 (n=7)과 SLE 환자 (n=12)로부터 혈액의 말초혈액단핵세포 (PBMC)를 분리하여 gp96의 표면 수 준을 분석하였다. 혈액의 말초혈액단핵세포의 세포 표면 gp96과 gp96+HLA-DR+의 수 는 SLE 환자군에서 증가하였다 (도 31 및 32) . 우리는 또한 건강한 대조군 (n=10)과 SLE 환자 (n=10)간의 혈청내 항 -gp96 항체의 수준을 비교하였다 . 항 -gP96 항체의 수 준은 SLE 환자의 혈청에서 증가하였다 (도 33) . 이 러 한 결과는 세포 표면 gp96의 증 가가 인간 SLE의 임상적 암시가 될 수 있다는 가능성을 암시 한다. 종합적으로， 이 러 한 결과는 gp96의 세포표면 수준은 화학적으로 통제될 수 있다는 것을 보여주며， -' gp96이 SLE-유사 자가면역 현상을 위축시 키 기 위한 잠재적 대상으로서 gp96을 암시 한다 .
<532>
<533> 우리는 또한 2 ,4-피 리 미딘 유도체의 효능을 루프스 동물모델을 통하여 확인 하였다. NZB/W F1 마우스는 자발적 인 루프스 증세가 나타나는 루프스 동물모델로서 이 동물모델에서의 2 , 4-피 리미딘 유도체 효능을 검증하였다.
<534> 25추령 male NZB/W F1 마우스를 각 군당 10마리씩 사용하여 대조군 (5% DMS0 용액 )과 실험군 (30mg/kg 용량의 2 ,4-피 리미딘 유도체 )를 매일 1회 복강투여하고 루프스 증세 악화로 인해 죽는 마우스를 제외 한 , 살아있는 마우스의 비율을 분석하 였다 . 그 결과， (S)-methyl 2- ( 4 , 6-d i me t hoxypy r i ra i d i η-2-y 1 oxy ) -3- methylbutanoate를 투여 한 군에서 루프스로 인해 죽는 비율이 유의미하게 감소하는 결과를 얻었다 (도 34) .
<535>
<536> 따라서 일반적으로 사용되는 동물모델에서도 2，4_피 리미딘 유도체의 루프스 에 대한 증세 완화 효과를 확인할 수 있었다 .
<537>
【산업상 이용가능성】
<538> 이상 살펴본 바와 같이， 본 발명자들은 gP96의 세포내 거류에 대한 분자 닻
(anchor)인 AIMP1의 기능을 모방하여 gp96의 표면 전좌 (translocat ion)를 저해하는 신규 물질을 찾았고， 이들 물질이 in vitro, in vivo상에서 SLE 형 질을 완화하여 SLE를 예방 및 치료하는 효과가 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 상기 을 이용하여 SLE의 치료제를 스크리닝하고, SLE를 예방 또는 치료하는 새로운 을 제공한다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】 .
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염
<화학식 1>
Figure imgf000069_0001
상기에서,
¾은 수소， 직쇄 또는 분쇄의 포화 또는 불포화 Cd c10)알킬 또는 할로겐 으로 치환된 직쇄 또는 분쇄의 포화 또는 블포화 (d - c10)알킬，
Figure imgf000069_0002
또는 이고;
[A는 N 또는 NO이고 ; m 및 n은 서로 독립적으로 0 내지 2의 정수를 나타내 며; X는 서로.동일하거나 상이할 수 있으며， 서로 독립적으로 직쇄 또는 분쇄의 포 화 또는 불포화 (d - C7)알킬， 할로겐으로 치환된 직쇄 또는 분쇄의 포화 또는 불 포화 (Ci - C7)알킬， (d - C7)알콕시， (d - C7)알킬티오， (d - C?)알콕시카르보닐， 할로겐， 시아노， 니트로， 아미노， 아미노카르보닐， 벤질옥시 또는 카르복실산이다 .]
R5는 수소， 직쇄 또는 분쇄의 포화 또는 불포화 (d - C10)알킬 또는 할로겐 으로 치환된 직쇄 또는 분쇄의 포화 또는 불포화 (d - C10)알킬，
Figure imgf000069_0003
Figure imgf000070_0001
¾는 히드록시， (d - C7)알콕시 , (d - c7)알킬티오， 단일 또는 복수 치환된 (Ci - C7)알킬아미노， 모포린， 피페라진， 피페리딘， 또는 단일 또는 복수 치환된 (Ci - C4)하이드록시아미드이고; ， ¾는 각각 독립적으로 수소, (d - C7)알킬， (d - C7)알콕시， 아릴알콕 시 또는 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 아릴알킬이고,
R4는 수소， 할로겐， 카르복시아미드 또는 피리딘이다.
【청구항 2】
, 제 1항에 있어서， 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허 용되는 염:
<화학식 1>
Figure imgf000070_0002
상기에서，
¾은 수소， 벤질， 피리딘， 아미노피리딘， tert-부틸 또는
Figure imgf000070_0003
[상기에서 ¾는 (d - c7)알킬， 비치환되거나 할로겐에 의해 치환된 (c6)아릴 또는 티오펜이고， ¾는 히드록시 또는 (d - c7)알콕시이다.]
R2 또는 ¾는 각각 독립적으로 수소， 메틸, 메록시， tert-부록시 또는 트리 플루오로메틸페녹시이고，
R4는 수소, 클로로, 카르복시아미드 또는 피리딘이다. 【청구항 3】
게 1항에 있어서 , 상기 화합물은 (S)-메틸 2-(4,6-디 메톡시피리미딘 -2-일옥 시 )-3-메틸부타노에 이트 ( (S)-methyl 2-(4,6-dimethoxypyr imidin-2-yloxy)-3- methylbutanoate) , 메틸 2-(5-클로로 -4-메톡시 -6-메틸피리미딘 -2—일옥시 )프로파노 에 이트 (methyl 2- ( 5-ch 1 or ο-4-me t hoxy-6-me t hy 1 pyr i m i d i η-2-y 1 oxy ) r opanoat e ) , 메 틸 2-(4-브로모페닐 )-2-(4，6-디메톡시피 리미딘 -2-일옥시 )아세테이트 (methyl 2-(4- bromophenyl )-2-(4,6-dimethoxypyr imidin-2-yloxy)acetate)， 메틸 2_(4'6—디 메톡시 피리미딘— 2-일옥시 )-3—메틸부타노에 이트 (methyl 2- ( 4 , 6~d i me t hoxypyr i m i d i n-2- yloxy)-3-methylbutanoate) , 메틸 2-(4，6-디 메톡시피 리미딘 -2-일옥시 )-2- (티오펜—
2-일 )아세테이트 (methyl 2- ( 4 , 6-d i me t hoxypyr i m i d i η-2-y 1 oxy ) -2- ( t h i ophen-2- yDacetate) , 2- ( 4， 6-디 메톡시피 리미딘 -2-일옥시 ) -2-페닐아세트산 ( 2- ( 4， 6- diraet hoxypyr imidin-2-yl oxy ) -2-pheny 1 acet ic acid) , (R)— 2— (4，6一디 메톡시피리미딘 -2-일옥시 )-2-페닐아세트산 ((R)-2-(4,6— dimethoxypyrimidin-2-yloxy)-2- phenyl acet ic acid) , 2- (벤질옥시 ) -4，6-디 메특시피 리미딘 -5-카르복사마이드 (2- ( benzy 1 oxy ) -4 , 6-d i me t hoxypyr i m i d i ne-5~car boxam i de ) , 2一 (2一클로로벤질옥시 )-4,6- 디 메록시피 리미딘 ( 2- ( 2-ch 1 orobenzy 1 oxy ) -4， 6-d i me t hoxypyr imidine) , 4， 6-디메톡시 -2- (피 리딘_4-일옥시 )피 리미딘 (4,6-dimethoxy_2-(pyridin—4-yloxy)pyrimidine) , 4 , 6-디 - ί er ί-부록시 -2- (피 리딘 -3-일옥시 )피리미딘 ( 4， 6-d i - 1 er ί-but oxy-2- (pyridin-
3- yloxy)pyrimidine), 2,4-디 -ieri-부록시 -5- (피 리딘— 2-일 )피리미딘 (2,4-di-teri- but oxy-5- ( pyr i d i η-2-y 1 ) py r i m i d i ne ) , 4，6_비스 (4-플루오로 -3- (트리플루오로메틸 ) 페녹시 )피 리미딘 -2-올 (4,6-bis(4-f luoro-3-(tri f luoromethyl )phenoxy)pyrimidin-2- ol ) , 3-(4，6-디 메톡시피 리 미딘 -2-일옥시 )피리딘 -2-아민 (3-(4,6- d i met hoxypyr imidi η-2-y loxy)pyr idin-2-amine) , 2- ( 4， 6-디 메톡시-피 리미딘 -2-일옥 시 ) -N， N-디에 틸 -3-메틸 -부틸 아미드 ( 2- ( 4， 6-D i me t hoxy-pyr imidi η-2-y 1 oxy )-N,N- diethyl-3-methyl-butyl amide)， N-부틸— 2-(4，6_디 메특시 -피 리미 딘— 2—일옥시 )-3-메 틸 -부틸 아미드 (N-Butyl-2-(4,6-dimethoxy-pyrimidin-2-yloxy)-3-methyl-butyl amide) , 2-(4，6-디 메톡시 -피 리미딘— 2-일옥시 )— 3-메틸 -N-페닐—부틸 아미드 (2-(4,6— D i me t hoxy-pyr imidi η-2-y 1 oxy ) -3-me t hy 1 -N-pheny 1 -but y 1 amide) , Nᅳ벤질ᅳ 2 (4， 6ᅳ디 메록시-피 리미딘 -2-일옥시 ) -3—메틸 -부틸 아미드 ( N-Benzy 1 -2- ( 4， 6-d i me t hoxy¬ pyr i m i d i η-2-y 1 oxy ) -3-me t hy 1 -but y 1 amide) , 2— (4 ,6-디메톡시 -피 리미딘 -2-일옥시 )― N-이소프로필 -3-메틸 -부틸 아미드 (2-(4,6-dimethoxy-pyrimidin-2-yloxy)-N- isopropyl-3-methyl-butyl amide), 2-(4，6-디메톡시-피리미딘 -2-일옥시) -N-메톡시- 3， N-디메틸 -부틸 아미드 ( 2- ( 4， 6-d i me t hoxy-py r imidi η-2-y 1 oxy ) -N-methoxy-3， N- dimethyl-butyl amide), 2-(4, 6-디쩨록시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸 -1-피페리딘— 1—일—부탄— 1—온) ( 2一 ( 4， 6-d ime t hoxy-pyr imidi n— 2— y 1 oxy )一 3— me t hy 1 - 1-p i per i d i n— 1_ yl-butan-l-one), 2-(4, 6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸 -1-몰포린 -4-일 -부탄 一 1一온 ( 2一 ( 4， 6-d i met hoxy-pyr imidi η-2-y 1 oxy )—3—me thyl- 1-morpho 1 in-4-y 1 -but an— 1ᅳ one), 2-(4，6-디메톡사-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메틸-부틸산 (2-(4,6-dimethoxy— pyrimidin-2-yloxy)-3-methyl-butyric acid), 2— (4,6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시 )— 3_메틸-부틸산 메틸 에스테르 (2-(4,6-Dimethoxy— pyritniclin-2-yloxy)-3-me1;hyl- butyric acid methyl ester), L-2-(4, 6-디메톡시-피리미딘 -2-일옥시) -프로피오닉 산 메틸 에스테르 (L—2— (4, 6_Dimethoxy—pyrimidin—2—yloxy)— propionic acid methyl ester), D-2-C4, 6-디메톡시-피리미딘 -2-일옥시) -프로피오닉 산 메틸 에스테르 (D-2- ( 4 , 6-D i me t hoxy-py r imidi η-2-y 1 oxy ) -pr o i on i c acid methyl ester) , 2— (4,6—디메톡 시-피리미딘 -2—일옥시 )-2-메틸 -프로피오닉 산 메틸 에스테르 (^(^S-Dimethoxy- pyrimidin—S—yloxy)一 2一 methyl— propionic acid methyl ester) , D一 3一 (4, 6一디메톡入 1一 피리미딘_2-일옥시)—부틸산 메틸 에스테르 (D-3-(4,6— Dimethoxy-pyrimidin-2— yloxy)-butyric acid methyl ester), L-2-(4,6-디메특시-피리미딘 -2-일옥시 )-3-메 틸-부틸산 메틸 에스테르 (L-S- ^-Dimethoxy-pyrimidin—S-yloxy^S—methyl- butyric acid methyl ester), (4, 6-디메톡시-피리미딘 -2—일옥시) -페닐-아세트산 메 틸 °11 ^ fl Ξ. ( ( 4 , 6-D i me t hoxy-pyr i m i d i η-2-y 1 oxy ) -pheny 1 -ac e t i c acid methyl ester), (4,6-디메특시-피리미딘-2-일옥시)_페닐-아세트산((4，6_1)^1 1^ — py r i m i d i η-2-y 1 oxy ) -pheny 1 -ace t i c acid), 2-(4，6-디메록시-피리미딘 -2-일옥시 )-N- 아소프로필 -2-페닐-아세트아미드 (2-(4,6-Dime1:hoxy-pyrimidin-2-yloxy)— N— isopropyl-2-phenyl-acetamide) , N-벤질 -2-(4，6-디메특시-피리미딘 -2-일옥시 )-2-페 닐—아세트아미드 ( N-Benzy 1 -2- ( 4， 6一 d i me t hoxy-pyr imidi η-2-y 1 oxy ) -2-pheny 1 - acetamide), N-부틸 -2-(4，6-디메록시-피리미딘— 2-일옥시 )-2-페닐-아세트아미드 (N- Butyl— 2— (4， 6-d i me t hoxy-pyr imidi η-2-y 1 oxy ) -2-pheny 1 -acetamide) , 2— ( 4， 6—디메톡 시-피리미딘 -2-일옥시) -Ν,Ν-디에틸— 2-페닐—아세트아미드 (2— (4,6-Dimethoxy- pyrimidi η-2-y 1 oxy )— N , N~d i ethyl -2-pheny 1 -acetamide) , L—2- ( 4， 6一디메톡시一피리미 딘 -2-일옥시 )— 3-메틸-부틸산 (L-2-(4,6-Dimethoxy-pyrimidin-2-yloxy)-3-methyl- butyric acid), D-2-(4, 6-디메톡시-피리미딘 -2-일옥시) -프로피오닉 산 (D-2-(4,6- D i met hoxy-pyr imidi η-2-y 1 oxy ) -prop i on i c acid) 및 L_2— (4， 6一디머 1톡시一피리미딘一 2— 일옥시 )一프로피오닉 산 (L— 2— (4，'6— Dimethoxy— pyrimidin— 2— yloxy)— propionic acid)로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 화합물 .
【청구항 4】
제 1항 내자 제 3항중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 전신성 홍반성 낭창 예방 및 치료용 약학적 조성물 .
【청구항 5】
제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 전신성 흥반성 낭창 예방 및 치료제 제조를 위 한 용도 .
【청구항 6】
제 1항 내지 제 3항증 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 것을 특징으로 하는 전신성 흥 반성 낭창의 예방 및 치료방법 .
【청구항 7】
(a) 시험 제제의 존재하에서 결합된 AIMP1 및 gp96와 시험 제제를 접촉시 키 는 단계 ;
(b) AIMP1 및 gp96의 분리 활성을 측정하여 AIMP1 및 gp96의 결합능을 변화 시 키는 시험 제제를 선별하는 단계 ; 및
(c) 선별된 제제가 전신성 홍반성 낭창의 증상을 치료 또는 완화하는 지를 테스트하는 단계를 포함하는 전신성 흥반성 낭창 치료제를 스크리닝하는 방법 .
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