WO2011052523A1 - 抗原性ｇｌｐ－１アナログの糖鎖付加体 - Google Patents

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WO2011052523A1
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sugar chain
glycosylated
analog
glp
amino acid
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康宏 梶原
孝 辻
由利 南部
一之 石井
健太 吉田
克成 手塚
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大塚化学株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a sugar chain adduct of an antigenic GLP-1 analog obtained by adding a sugar chain to a highly antigenic GLP-1 analog.
  • GLP-1 (glucagon-like peptide-1) is a peptide of intestinal origin that is deeply involved in the regulation of sugar homeostasis. GLP-1 is synthesized in intestinal L cells by tissue-specific post-translational processing of the glucagon precursor preproglucagon and is released into the circulation in response to a diet. This peptide is the major mediator of the enteroaxial axis and acts by binding to specific receptors.
  • GLP-1 is known to act mainly on the pancreas and promote insulin release by ⁇ cells in a glucose concentration-dependent manner. It has also been suggested that it may suppress glucagon secretion, delay gastric cavitation, and increase peripheral glucose processing.
  • GLP-1 can normalize postprandial glucose levels in non-insulin dependent diabetic patients, suggesting the possibility of GLP-1 as a therapeutic agent.
  • GLP-1 also has the effect of improving glycemic control in insulin dependent diabetic patients.
  • the insulin release promoting action of GLP-1 depends on the plasma glucose concentration, GLP-1 mediated insulin release is low at low plasma glucose concentrations, and there is an advantage that serious hypoglycemia does not occur. Therefore, it is considered that highly safe treatment of diabetes can be achieved by controlling the blood GLP-1 level as necessary.
  • the half-life of GLP-1 in blood is as extremely short as 2 to 6 minutes, and there is a problem that its potential as a therapeutic agent is limited.
  • Patent Document 1 discloses a PEGylated GLP-1 compound comprising a GLP-1 compound conjugated to at least one polyethylene glycol (PEG) molecule.
  • PEG polyethylene glycol
  • each PEG is bound to the GLP-1 compound at the Cys or Lys amino acid or at the carboxy terminal amino acid.
  • the PEGylated GLP-1 compound has an elimination half-life of at least 1 hour.
  • Patent Document 1 a physiologically active peptide with an extended half-life and delayed clearance is obtained as compared to an unPEGylated peptide.
  • PEGylated GLP-1 compounds and compositions also have diabetes, obesity, irritable bowel syndrome, and lower blood glucose, suppress stomach and / or intestinal motility, and It is disclosed that it is useful for treatment of health conditions such as suppressing intestinal excretion or suppressing food intake (eg, Non-Patent Document 1).
  • Non-patent Document 1 Since PEG is a compound that is not metabolized in vivo, if PEGylated GLP-1 compound is continuously administered, PEG accumulates in the body and there is a risk of causing harm to the body (Non-patent Document 1). .
  • Patent Document 2 describes a method of binding a modified hyaluronic acid having a molecular weight of about 200 KDa to a GLP-1 analog.
  • Patent Document 2 describes a method of binding a modified hyaluronic acid having a molecular weight of about 200 KDa to a GLP-1 analog.
  • a glycosylated peptide having a uniform length and structure is required.
  • Patent Document 3 describes a method of introducing a glycosylated amino acid at positions 26, 34, and / or 37 of GLP-1, but the type of sugar chain and the sugar chain are added. The position is not necessarily optimized.
  • the present inventors have also developed glycosylated GLP-1 having a long activity in blood and high activity by changing the type and position of sugar chain (for example, Patent Document 4).
  • exendin-4 exendin-4 (non-existing) found in saliva from Helderma as a compound having a structure similar to GLP-1, having similar activity, and high blood stability.
  • Patent Document 2 is marketed in the United States.
  • exendin-4 is a non-human sequence, it has higher antigenicity than other GLP-1 analogs, and there is concern over the emergence of neutralizing antibodies and associated decrease in drug efficacy due to long-term administration (Non-patent Document 3). ⁇ 5).
  • liraglutide obtained by binding a fatty acid to GLP-1 has been developed as one of GLP-1 analogs (see, for example, Non-Patent Documents 6 to 8).
  • the affinity for albumin is increased. Since liraglutide bound to albumin is gradually released into the blood, the half-life is about 10 hours and a long-term effect is expected. Convenience is also high because subcutaneous injection once a day is sufficient. In addition to single use, monotherapy is also possible. However, since it has a structure different from the natural type, there is concern about antigenicity as with exendin-4.
  • An object of the present invention is to improve a GLP-1 analog having high antigenicity and to provide a GLP-1 analog having reduced antigenicity without reducing its blood glucose level inhibitory activity.
  • the present inventors have reduced the blood glucose level inhibitory activity by adding a sugar chain to an antigenic GLP-1 analog such as exendin-4.
  • an antigenic GLP-1 analog such as exendin-4.
  • the present inventors have found that the antigenicity is lowered and have completed the present invention.
  • the present invention [1] A glycosylated product of an antigenic GLP-1 analog, wherein at least one amino acid of the antigenic GLP-1 analog is substituted with a glycosylated amino acid and has GLP-1 activity; [2] An antigenic GLP-1 analog glycosylation product according to [1] above, wherein the glycosylated amino acid is glycosylated Asn or glycosylated Cys Sugar chain adducts of [3] A glycosylated form of the antigenic GLP-1 analog according to [1] or [2] above, wherein in the glycosylated amino acid, the sugar chain and the amino acid are bonded via a linker.
  • a glycosylated adduct of an antigenic GLP-1 analog [4] The antigenic GLP-1 analog sugar chain adduct according to any one of [1] to [3] above, wherein the sugar chain is a sugar chain composed of four or more sugars.
  • a glycosylated adduct of an antigenic GLP-1 analog [5] An antigenic GLP-1 analog sugar chain adduct according to any one of [1] to [4] above, wherein the sugar chain is a double-stranded complex type sugar chain GLP-1 analog sugar chain adducts; [6] The sugar chain adduct of the antigenic GLP-1 analog according to [5], wherein the sugar chain is a dicialo sugar chain, a monosialo sugar chain, an asialo sugar chain, a diglucnac sugar chain, and a dimannose sugar chain
  • a sugar chain adduct of an antigenic GLP-1 analog which is a sugar chain selected from the group consisting of: [7] The antigenic GLP-1 analog sugar chain adduct according to [5] above, wherein the sugar chain comprises [Wherein R 1 and R 2 are the same or different, Indicates.
  • a sugar chain adduct of an antigenic GLP-1 analog which is a sugar chain represented by: [8] An antigenic GLP-1 analog glycosylated adduct according to any one of [1] to [7] above, wherein the antigenic GLP-1 analog is exendin-4 A glycosylated adduct of a sex GLP-1 analog; [9] The glycosylated form of the antigenic GLP-1 analog according to [8] above, wherein the site substituted with the glycosylated amino acid is at position 30 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a glycosylation of an antigenic GLP-1 analog [10] An antigenic GLP-1 analog glycosylated adduct according to [8] above, In the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, Gly at position 30 is substituted with glycosylated Cys;
  • the sugar chain is a dicialo sugar chain represented by the following formula: And In the glycosylated Cys, a glycosylated product of an antigenic GLP-1 analog in which the sugar chain and the Cys are bonded via a linker; [11] An antigenic GLP-1 analog glycosylated adduct according to any one of [1] to [7] above, wherein the antigenic GLP-1 analog is liraglutide 1 analog sugar chain adduct; [12] A glycosylated form of the antigenic GLP-1 analog according to [11] above, wherein the site substituted with the glycosylated amino acid is at position 30 in the amino acid sequence of SEQ ID NO:
  • a glycosylation of an antigenic GLP-1 analog [13] An antigenic GLP-1 analog glycosylated adduct according to [11] above, In the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, Arg at position 30 is substituted with glycosylated Cys;
  • the sugar chain is a dicialo sugar chain represented by the following formula, or Asialo sugar chain represented by the following formula
  • glycosylated Cys a glycosylated product of an antigenic GLP-1 analog in which the sugar chain and the Cys are bonded via a linker;
  • the antigenic GLP-1 analog glycosylated adduct of any one of [1] to [13] above, wherein the sugar chain is substantially uniform.
  • Analog sugar chain adducts [15] An antigenic GLP-1 analog sugar chain adduct according to any one of [1] to [13] above, wherein the sugar chain is 99% or more uniform. Analog sugar chain adducts; [16] The antigenic GLP-1 analog glycosylated adduct according to any one of [1] to [15] above, wherein the antigenic GLP-1 analog is not added with a sugar chain. An antigenic GLP-1 analog glycosylated adduct having an antigenicity of half or less; [17] The sugar chain adduct of the antigenic GLP-1 analog according to any one of [1] to [16] above, wherein the antigenic GLP-1 analog has no sugar chain added and is more antigenic.
  • the sugar chain adduct of the antigenic GLP-1 analog of the present invention can be reduced in antigenicity by adding a sugar chain without reducing blood glucose level inhibitory activity. Therefore, a safe pharmaceutical product that maintains the superiority of exendin-4, which has high blood stability and high blood glucose level inhibiting activity, and the superiority of liraglutide, which can reduce the number of administrations due to sustained release, is achieved. Can be provided. Since the added sugar chain is also easily decomposed in vivo, the accumulation thereof does not cause phytotoxicity to the living body. Moreover, since many sugar chains used in the present invention are relatively short, those having a uniform structure can be obtained without going through complicated production steps. Therefore, a high-quality antigenic GLP-1 analog sugar chain adduct at a pharmaceutical level can be obtained on a large scale and stably.
  • the HPLC chromatogram of 30th-position Cys-asialo-glycosylated liraglutide (SEQ ID NO: 8) is shown.
  • the HPLC chromatogram of the peptide (SEQ ID NO: 14) in which Arg at position 30 of liraglutide was substituted with Cys in Example 4 is shown.
  • the HPLC chromatogram of 30th-position Cys-disialoglycosylated liraglutide (SEQ ID NO: 9) is shown.
  • the result of having evaluated the antigenicity reduction effect of exendin-4 by glycosylation is shown.
  • the result of the oral glucose tolerance test (OGTT) of glycosylated liraglutide is shown.
  • Glycosylated liraglutide exhibited a higher blood glucose level inhibitory action than non-glycosylated liraglutide.
  • the result of having evaluated the blood glucose level lowering effect of sugar chain addition liraglutide using a db / db mouse is shown.
  • Glycosylated liraglutide exhibited a blood glucose level lowering action and persistence equivalent to that of non-glycosylated liraglutide.
  • GLP-1 refers to glucagon-like peptide-1 and refers to GLP-1 (7-37).
  • GLP-1 (7-37) has the following amino acid sequence. His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp- Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (SEQ ID NO: 1)
  • GLP-1 analog means a peptide structurally similar to GLP-1 and / or a peptide having a structure overlapping with GLP-1, for example: one or several amino acids in GLP-1 Peptides deleted, substituted or added; peptides in which one or several amino acids of GLP-1 are conservatively substituted; GLP-1 variants; fragments of GLP-1 having GLP-1 activity; GLP Refers to extended GLP-1 etc. having -1 activity.
  • antigenic GLP-1 analog refers to an antigenic GLP-1 analog.
  • Antigenicity means antigenicity in an individual to which the antigenic GLP-1 analog is administered, and the degree thereof is not limited. Antigenicity can be evaluated by a method known to those skilled in the art or a method analogous thereto, for example, by sensitizing a mouse with an antigenic GLP-1 analog, and then anti-GLP- (1) A method for measuring an analog antibody titer is mentioned.
  • antigenic GLP-1 analogs include exendin-4 (hereinafter sometimes referred to as “Ex-4”), liraglutide, taspoglutide (also known as BIM-51077, Giannokakis, N .: Curr. Opin.
  • exendin-4 refers to a peptide structurally similar to the peptide and / or the peptide in addition to the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • a peptide having an overlapping structure for example: a peptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the peptide; a peptide in which one or several amino acids of the peptide are conservatively substituted; A peptide variant; a fragment of the peptide having activity equivalent to exendin-4; a peptide obtained by extending the peptide having activity equivalent to exendin-4, etc., and corresponding to the GLP-1 analog Including things.
  • “liraglutide” is a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and a peptide structurally similar to the peptide and / or overlapping with the peptide.
  • a peptide having the above structure for example: a peptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the peptide; a peptide in which one or several amino acids of the peptide are conservatively substituted; the peptide A fragment of the peptide having an activity equivalent to that of liraglutide; a peptide obtained by extending the peptide having an activity equivalent to that of liraglutide, etc., which corresponds to the above GLP-1 analog.
  • BIM-51077 means a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18 as well as a peptide structurally similar to the peptide and / or overlapping with the peptide.
  • a peptide having the above structure for example: a peptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the peptide; a peptide in which one or several amino acids of the peptide are conservatively substituted; the peptide A fragment of the peptide having an activity equivalent to that of liraglutide; a peptide obtained by extending the peptide having an activity equivalent to that of liraglutide, etc., which corresponds to the above GLP-1 analog.
  • amino acid is used in its broadest sense and includes not only natural amino acids but also non-natural amino acids such as amino acid variants and derivatives.
  • amino acids herein, for example, natural proteogenic L-amino acids; D-amino acids; chemically modified amino acids such as amino acid variants and derivatives; norleucine, It will be understood that natural non-proteogenic amino acids such as ⁇ -alanine, ornithine; and chemically synthesized compounds having properties known in the art that are characteristic of amino acids.
  • unnatural amino acids examples include ⁇ -methyl amino acids (such as ⁇ -methylalanine), D-amino acids, histidine-like amino acids (2-amino-histidine, ⁇ -hydroxy-histidine, homohistidine, ⁇ -fluoromethyl-histidine and ⁇ -Methyl-histidine, etc.), amino acids with extra methylene in the side chain (“homo" amino acids) and amino acids in which the carboxylic acid functional amino acids in the side chain are replaced with sulfonic acid groups (such as cysteic acid).
  • the amino acid contained in the compound of the present invention consists only of natural amino acids.
  • the number of amino acids to be substituted is the GLP-1 analog glycosylated adduct of the present invention is GLP.
  • GLP-1 is not particularly limited as long as it retains activity, but is 1 to 9, preferably 1 to 5, more preferably about 1 to 3, or within 20% of the total length, preferably within 10% It is.
  • the amino acid to be substituted or added can be a natural amino acid, a non-natural amino acid or an amino acid analog, and is preferably a natural amino acid.
  • modified forms of GLP-1, Ex-4, and liraglutide are compounds obtained by modifying GLP-1 etc. naturally or artificially. Such modifications include, for example, alkylation, acylation (eg acetylation), amidation, carboxylation, ester formation, disulfide bond formation, glycosylation of one or more amino acid residues such as GLP-1 , Lipidation, phosphorylation, hydroxylation, binding of a labeling component, and the like. For example, a peptide in which the C-terminal is amidated is also included.
  • fragment such as GLP-1 having GLP-1 activity means that one or more amino acids are deleted from the N-terminal and / or C-terminal of the original GLP-1 and the like, and GLP-1 etc. that maintain GLP-1 activity.
  • the “elongated peptide having GLP-1 activity” means that one or more amino acids are added to the N-terminus and / or C-terminus of the original GLP-1, etc., and the GLP-1 activity (See, for example, Endocrinology, 125, 3109-14 (1989)).
  • the “glycoadduct of an antigenic GLP-1 analog” is characterized in that at least one amino acid in the antigenic GLP-1 analog is substituted with a glycosylated amino acid.
  • the “glycoadduct of an antigenic GLP-1 analog” may be referred to as “glycoadded antigenic GLP-1”.
  • the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention also includes a salt thereof.
  • the salt may be either an acid addition salt or a base addition salt.
  • Acids commonly used to form acid addition salts include inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and p-toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid, oxalic acid, p- Organic acids such as bromophenyl sulfonic acid, carboxylic acid, succinic acid, citric acid, benzoic acid and acetic acid.
  • Base addition salts include salts derived from inorganic bases such as ammonium hydroxide or alkali or alkaline earth metal hydroxides, carbonates, bicarbonates and the like. In particular, a pharmaceutically acceptable salt is preferable.
  • the “glycosylated amino acid” is an amino acid to which a sugar chain is bound, and the sugar chain and the amino acid may be bound via a linker.
  • the amino acid is bound to the reducing end of the sugar chain.
  • the type of amino acid to which the sugar chain is bound and either a natural amino acid or an unnatural amino acid can be used.
  • the glycosylated amino acid has the same or similar structure as that present as a glycopeptide (glycoprotein) in the living body
  • the glycosylated amino acid is a glycosylated Asn such as an N-linked sugar chain.
  • Glycosylated Ser such as O-linked glycan and Thrylated Thr are preferred, and Glycylated Asn is particularly preferred.
  • the amino acid of the sugar chain-added amino acid has two or more amino acids in the molecule such as aspartic acid and glutamic acid.
  • Amino acids with carboxyl groups, lysine, arginine, histidine, tryptophan, etc. amino acids with two or more amino groups in the molecule, amino acids with hydroxyl groups in molecules such as serine, threonine, tyrosine, and thiol groups in molecules such as cysteine
  • amino acids having an amide group in the molecule such as asparagine and glutamine.
  • aspartic acid glutamic acid, lysine, arginine, serine, threonine, cysteine, asparagine, and glutamine are preferable, and cysteine and lysine are particularly preferable.
  • glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention when the sugar chain structure, the structure other than the sugar chain, the sugar chain addition site, and the number of added sugar chains are the same, the glycosylated amino acid
  • the glycosylated Asn not via the linker
  • the glycosylated Cys via the linker
  • a sugar chain and an amino acid are bonded via a linker
  • those used in the art can be widely used.
  • a is an integer and is not limited as long as the desired linker function is not inhibited, but preferably represents an integer of 0 to 4
  • C 1-10 polymethylene —CH 2 —R—, wherein R is alkyl, substituted alkyl, alkenyl, substituted alkenyl, alkynyl, substituted alkynyl, aryl, substituted aryl, carbocyclic group, substituted carbocycle A group formed by removing one hydrogen atom from a group selected from the group consisting of a group, a heterocyclic group and a substituted heterocyclic group), — (CO) — (CH 2 ) a — (CO) — (In the formula A is an integer and is not limited as long as the desired linker function
  • the antigenicity of the glycosylated antigenic GLP-1 analog can be reduced.
  • the glycosylated amino acid of the glycosylated antigenic GLP-1 analog when the sugar chain and the amino acid are bound via a linker, compared to when the sugar chain and the amino acid are bound via a linker Thus, the blood stability of the glycosylated antigenic GLP-1 analog can be increased.
  • glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention can be produced by any method according to the description (for example, “description of glycosylated antigenic GLP-1 analog in which an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid”).
  • the glycosylated antigenic GLP-1 analog produced by any of the methods A to C described later is not limited, but “glycosylated antigen in which an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid” GLP-1 analog ”.
  • glycosylated antigenic GLP-1 analog in which a sugar chain to which no amino acid is bonded is bound to an amino acid on a peptide directly or via a linker;
  • a sugar-added antigenic GLP-1 analog obtained by extending a sugar chain already added by adding a sugar or a sugar chain to the resulting sugar chain; 1 or 2 in the amino group and / or carboxyl group of the glycosylated amino acid;
  • the final structure of the glycosylated antigenic GLP-1 analog obtained by binding several amino acids and further linking this with one or a plurality of GLP-1 analog fragments is consistent with the present invention Of glycosylated antigenic GLP-1 analogues.
  • the number of amino acids in the antigenic GLP-1 analog substituted with glycosylated amino acids depends on the physiological activity such as blood stability and blood glucose level suppressing activity, and the number of amino acids present in the final glycosylated antigenic GLP-1 analog. It may be appropriately adjusted depending on the number, molecular weight of the glycosylated antigenic GLP-1 analog before and after glycosylation, and the like. For example, 1 to 5 are preferably substituted, and 1 to 3 are more preferably substituted. From the standpoint of simplicity, it may be preferable to select one substitution if the desired activity is obtained with one substitution.
  • glycosylated antigenic GLP-1 analog in which one amino acid of an antigenic GLP-1 analog is substituted with a glycosylated amino acid, one or more of the amino acids other than the glycosylated amino acid are further glycosylated.
  • the blood stability increases and the blood glucose level inhibitory activity tends to decrease (however, the increased blood stability can compensate for the decreased blood glucose level inhibitory activity. ).
  • the site at which an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid is not particularly limited, but those skilled in the art can impart activity to reduce antigenicity and have stability in blood. In addition, it is possible to appropriately select a site where the blood glucose level inhibitory activity is not lower than that of GLP-1.
  • any site of the antigenic GLP-1 analog can be selected according to the desired activity.
  • the position corresponding to the X position of the amino acid sequence of the GLP-1 peptide described in SEQ ID NO: 1 in the antigenic GLP-1 analog refers to the amino acid sequences of various antigenic GLP-1 analogs. This means a position corresponding to the X position of the amino acid sequence of the GLP-1 peptide described in SEQ ID NO: 1, and such a position can be easily determined by those skilled in the art based on the surrounding amino acid sequences and the like.
  • amino acid sequences of Ex-4 and liraglutide which are antigenic GLP-1 analogs, correspond to the amino acid sequence of the GLP peptide described in SEQ ID NO: 1 as follows.
  • Ex-4 or liraglutide has no additions, substitutions or deletions in its amino acid sequence
  • the amino acids vertically aligned in the above table are the amino acids in the “corresponding positions”.
  • those skilled in the art can determine the “corresponding position” based on the amino acid sequences around each.
  • the site where amino acids are substituted with glycosylated amino acids reduces antigenicity of glycosylated antigenic GLP-1 analogs, for example, antigen recognition in antigenic GLP-1 analogs. It is preferable to be around the part. For example, it is effective to add a sugar chain to the site corresponding to position 30 of the GLP-1 peptide described in SEQ ID NO: 1.
  • substitution of an amino acid at a site close to the N-terminus of GLP-1 is also preferred.
  • sites for replacing amino acids with glycosylated amino acids for example, positions 12 and 30; positions 20 and 28; positions 16 and 24; positions 16 and 30; positions 24 and 30 respectively. And the like.
  • sites for replacing two or more amino acids with glycosylated amino acids include, for example, positions 12 and 30; positions 20 and 28; positions 16 and 24; positions 16 and 30; positions 24 and 30; Corresponding sites can be mentioned.
  • the site at which an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid is, for example, SEQ ID NO: 1 from the viewpoint of the ability to synthesize cAMP among the GLP-1 activities of glycosylated antigenic GLP-1 analogs.
  • a site corresponding to one or more sites selected from positions 16, 20, 21, 24, 28, 30 and 32 ( addition of a glycosylated amino acid to the 31st amino acid) of the GLP-1 peptide described in 1.
  • a site corresponding to one or more sites selected from positions 16, 20, 24, 28, 30 and 32 is preferably a site corresponding to one or more sites selected from positions 16, 20, 24, 28, 30 and 32.
  • the site at which an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid is one or more selected from sites other than positions 2, 3, and 6 of GLP-1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. It is a part.
  • the site at which an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid is one or more sites selected from sites other than positions 1, 4, 7, 9, 13, 15, and 23 of GLP-1, One or more sites selected from sites other than positions 1, 4, and 9.
  • the site at which an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid can also be determined from the binding site of GLP-1 to the GLP-1 receptor.
  • any combination of the above can be adopted as the site where amino acids are substituted with glycosylated amino acids. It is not limited. For example, a combination wherein one site is selected from the above preferred sites and the other site is selected from any site of the antigenic GLP-1 analog; one site is selected from the above preferred sites and the other site is Combinations selected from arbitrary sites of one or several amino acids further added to the C-terminus of the antigenic GLP-1 analog are also included in a preferred embodiment of the present invention.
  • the site where deletion, substitution or addition of amino acids other than glycosylated amino acids occurs is 1, 4, 7, 9, 13 of GLP-1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • one or more sites selected from sites other than positions 15, 22, and 23, for example, one or more sites selected from sites other than positions 1, 4, 9 and 22 (Structure-Activity Players of Glucagon-like Peptide-l, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.269, No.9, Issue of March 4, pp. 6276-6278.1994).
  • glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention examples include those obtained by adding a sugar chain to exendin-4 having the following amino acid sequence.
  • the glycosylated exendin-4 is represented, for example, by the following general formula (1).
  • Xaa 14 represents Met, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 16 represents Glu, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 20 represents Arg, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 24 represents Glu, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 28 represents Asn, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 30 represents Gly, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • At least one of Xaa 12 , Xaa 14 , Xaa 16 , Xaa 20 , Xaa 24 , Xaa 28 and Xaa 30 is glycosylated Cys or glycosylated Asn. ] (SEQ ID NO: 4) Among these, it is preferable that Xaa 24 is a glycosylated Cys.
  • glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention examples include those obtained by adding a sugar chain to liraglutide having the following amino acid sequence. His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys 20 -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp -Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly (SEQ ID NO: 3)
  • a palmitoyl group is bonded to Lys 20 via glutamic acid.
  • the sugar chain-added liraglutide is represented, for example, by the following general formula (2).
  • General formula (2) His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa 12 -Tyr-Xaa 14 -Glu-Xaa 16 -Gln-Ala-Ala-Lys 20 -Glu-Phe-Ile- Xaa 24 -Trp-Leu-Val-Xaa 28 -Gly-Xaa 30 -Gly [Wherein Xaa 12 represents Ser, glycosylated Cys, or glycosylated Asn. Xaa 14 represents Leu, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 16 represents Gly, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 24 represents Ala, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 28 represents Arg, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 30 represents Arg, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • At least one of Xaa 12 , Xaa 14 , Xaa 16 , Xaa 24 , Xaa 28 and Xaa 30 is glycosylated Cys or glycosylated Asn.
  • Xaa 24 and / or Xaa 30 are sugar chain addition Cys or sugar chain addition Asn, and it is especially preferable that Xaa 30 is sugar chain addition Cys.
  • glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention examples include those obtained by adding a sugar chain to BIM51077 having the following amino acid sequence. His-R2-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp- Leu-Val-Lys-R2-Arg-NH 2 [Wherein R2 represents ⁇ -methylalanine (also referred to as aminoisobutanoic acid, Aib). ] (SEQ ID NO: 18) Sugar chain addition BIM51077 is represented by the following general formula (3), for example.
  • Xaa 22 represents Gly, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 26 represents Lys, sugar chain addition Cys, sugar chain addition Asn, or sugar chain addition Lys.
  • Xaa 30 represents Ala, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • Xaa 34 represents Lys, sugar chain addition Cys, sugar chain addition Asn, or sugar chain addition Lys.
  • Xaa 36 represents Arg, glycosylated Cys, or glycosylated Asn.
  • At least one of Xaa 18 , Xaa 20 , Xaa 22 , Xaa 26 , Xaa 30 , Xaa 34 and Xaa 36 is glycosylated Cys or glycosylated Asn. ] (SEQ ID NO: 19)
  • sugar chain refers to a compound formed by connecting one or more unit sugars (monosaccharide and / or a derivative thereof). When two or more unit sugars are connected, each unit sugar is bound by dehydration condensation by a glycosidic bond.
  • sugar chains include monosaccharides and polysaccharides (glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, sialic acid, and complexes thereof contained in the living body.
  • sugar chains that are decomposed or derived from complex biomolecules such as degraded polysaccharides, glycoproteins, proteoglycans, glycosaminoglycans, glycolipids, and the like, but are not limited thereto.
  • the sugar chain may be linear or branched.
  • sugar chain also includes sugar chain derivatives.
  • sugar chain derivatives include sugars having a carboxyl group (for example, the C-1 position). Oxidized to carboxylic acid to produce aldonic acid (for example, D-glucose oxidized D-gluconic acid), terminal C atom to carboxylic acid uronic acid (D-glucose oxidized D-glucuron) Acid)), amino groups or sugars having amino group derivatives (for example, acetylated amino groups) (for example, N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-D-galactosamine, etc.), amino groups and carboxyl groups (Eg, N-acetylneuraminic acid (sialic acid), N-acetylmuramic acid, etc.), deoxygenated sugar (eg, 2-deoxy-D-ribone) ), Sulfated sugar including a sulfuric acid group, including but sugar chains are such phosphorylated sugar
  • the antigenic GLP-1 analog when a preferred sugar chain is added to an antigenic GLP-1 analog (when substituted with an amino acid of the antigenic GLP-1 analog in the form of a glycosylated amino acid), the antigenic GLP-1 analog Is a sugar chain that reduces the antigenicity of the glycine, preferably increases blood stability, and more preferably does not lose the blood glucose level suppressing activity. However, as long as the antigenicity is lowered, the blood stability and / or blood glucose level suppressing activity may be equivalent to those of the antigenic GLP-1 analog.
  • the sugar chain in the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention is not particularly limited, and is a sugar chain that exists as a complex carbohydrate (glycopeptide (or glycoprotein), proteoglycan, glycolipid, etc.) in vivo. Alternatively, it may be a sugar chain that does not exist as a complex carbohydrate in vivo.
  • a sugar chain that exists as a complex carbohydrate in vivo is preferable from the viewpoint that the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention is administered to a living body.
  • sugar chains include N-linked sugar chains and O-linked sugar chains that are sugar chains bound to peptides (or proteins) as glycopeptides (or glycoproteins) in vivo.
  • an N-linked sugar chain is used.
  • the N-linked sugar chain include a high mannose type, a complex type, and a hybrid type, and a complex type is particularly preferable.
  • the antigen in the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention, even if the sugar chain is a sugar chain that exists as a complex carbohydrate in the living body, the antigen can be obtained by a method other than the O-linked type and N-linked type It may be bound to a sex GLP-1 analog.
  • those having a sugar chain bound to Cys or the like via a linker are also included in the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention.
  • the sugar chain in the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention is a saccharide comprising 4 or more, for example, 5 or more, 7 or more, particularly 9 or more, 11 or more saccharides. A chain is preferred.
  • the sugar chain in the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention is a sugar chain composed of 5 to 11, 9 to 11, 9 and 11 sugars.
  • the sugar chain in the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention is a double-chain complex sugar chain.
  • the complex-type sugar chain includes two or more types of monosaccharides and has a basic structure shown below and a lactosamine structure represented by Gal ⁇ 1-4GlcNAc.
  • the double-stranded complex type sugar chain refers to one in which a single-chain sugar chain composed of 0 to 3 sugars is bonded to two mannoses at the ends of the basic structure.
  • Examples of the double-stranded complex type sugar chain include the following diasial sugar chain, Monosialo sugar chain, Asialo sugar chain, Ziglucnac sugar chain, Dimannose sugar chain, And the like, more preferably a disialo sugar chain, a monosialo sugar chain or an asialo sugar chain.
  • disialo sugar chain “monosialo sugar chain”, “asialo sugar chain”, “diglucnac sugar chain”, and “dimannose sugar chain” are represented by the above chemical formulas. Examples having different binding modes from the examples are also included, and such sugar chains are also preferably used as the sugar chains of the present invention. Examples of such sugar chains include those in which sialic acid and galactose are linked by an ( ⁇ 2 ⁇ 3) bond in a dicialo sugar chain or an asialog sugar chain.
  • the high mannose type sugar chain used in the present invention is a sugar chain in which two or more mannoses are further bonded to the basic structure of the complex type sugar chain described above. Since the high mannose type sugar chain is bulky, the stability in blood can be further increased by binding the high mannose type sugar chain to the peptide.
  • a sugar chain containing 5 to 9 mannose is preferable like a mammalian high mannose sugar chain, but may be a sugar chain containing more mannose like a high mannose sugar chain of yeast.
  • the high mannose type sugar chain preferably used in the present invention, for example, Highman North-5 (M-5) Highman North-9 (M-9) Etc.
  • preferable sugar chains include, for example, sugar chains existing as glycoproteins bound to proteins in the human body (for example, sugar chains described in “FEBS LETTERS Vol. 50, No. 3, Feb. 1975”). ) And a sugar chain having the same structure (a sugar chain having the same kind of constituent sugars and their coupling mode) or a sugar chain from which one or more sugars have been lost from the non-reducing end thereof. 5 can be mentioned.
  • the structure of the sugar chain in the glycopeptide of the present invention is uniform.
  • the structure of a sugar chain in a glycopeptide is uniform when compared between glycopeptides, the sugar chain addition site in the peptide, the type of each sugar constituting the sugar chain, the binding order, and This means that the sugars are bonded in the same manner, and the sugar chain structure is at least 90% or higher, preferably 95% or higher, more preferably 99% or higher.
  • a glycopeptide having a uniform sugar chain has a constant quality and is particularly preferred in the fields of pharmaceutical production and assay.
  • the uniform sugar chain ratio can be measured, for example, by a method using HPLC, capillary electrophoresis, NMR, mass spectrometry or the like.
  • a preferred glycosylated antigenic GLP-1 analog is, for example, the glycosylated antigenic GLP-1 analog produced in Examples 1 to 4 described later.
  • the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention can be produced by incorporating a glycosylation step into a peptide synthesis method known to those skilled in the art.
  • a method utilizing the reverse reaction of the enzyme, represented by transglutaminase can also be used.
  • transglutaminase a method utilizing the reverse reaction of the enzyme, represented by transglutaminase.
  • a large amount of sugar chain to be added is required, and purification after the final step is complicated.
  • it can be used for small-scale synthesis for assays, etc., but for large-scale production such as pharmaceutical production. It may not be a practical method.
  • WO03 / 008431 pamphlet (US2004181054 (A1)), WO2004 / 058984 pamphlet (US2006228784 (A1)), WO 2004/058824 pamphlet (US 2006009421 (A1)), WO 2004/070046 pamphlet (US 2006205039 (A1)), WO 2007/011055 pamphlet and the like, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. It is.
  • the glycosylated antigen GLP-1 analog can be produced, for example, by solid phase synthesis using a glycosylated asparagine as outlined below.
  • the hydroxyl group of a resin having a hydroxyl group (resin) is esterified with the carboxyl group of an amino acid whose amino group nitrogen is protected with a lipophilic protecting group.
  • the amino group nitrogen of the amino acid is protected with a fat-soluble protecting group, self-condensation between amino acids is prevented, and esterification occurs due to the reaction between the hydroxyl group of the resin and the carboxyl group of the amino acid.
  • a sugar chain-added asparagine in which the amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group is used, and the carboxyl group of the asparagine moiety is used.
  • step (6) is performed to obtain a peptide having a glycosylated asparagine at the N-terminus. it can.
  • any resin (resin) having a hydroxyl group usually used in solid phase synthesis may be used.
  • Amino-PEGA resin manufactured by Merck
  • Wang resin manufactured by Merck
  • HMPA-PEGA resin manufactured by Merck
  • Rink-Amido-PEGA resin manufactured by Merck
  • amino acids all amino acids can be used.
  • natural amino acids such as serine (Ser), asparagine (Asn), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine (Ile), alanine (Ala), tyrosine (Tyr), glycine (Gly), lysine (Lys), arginine (Arg), histidine (His), aspartic acid (Asp), glutamic acid (Glu), glutamine (Gln), threonine (Thr), cysteine (Cys), Examples include methionine (Met), phenylalanine (Phe), tryptophan (Trp), and proline (Pro).
  • the fat-soluble protective group examples include carbonate-based or amide groups such as 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group, t-butyloxycarbonyl (Boc) group, benzyl group, allyl group, allyloxycarbonyl group, and acetyl group.
  • Protecting groups of the system can be mentioned.
  • a fat-soluble protecting group into an amino acid, for example, when introducing an Fmoc group, it can be introduced by adding 9-fluorenylmethyl-N-succinimidyl carbonate and sodium hydrogen carbonate to carry out the reaction. The reaction is carried out at 0 to 50 ° C., preferably at room temperature, for about 1 to 5 hours.
  • amino acids can also be used as the amino acid protected with a fat-soluble protecting group.
  • Fmoc-Ser Fmoc-Asn, Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Ile, Fmoc-AIa, Fmoc-Tyr, Fmoc-Gly, Fmoc-Lys, Fmoc-Arg, Fmoc-His, Fmoc-His
  • Fmoc-Glu Fmoc-Gln, Fmoc-Thr, Fmoc-Cys, Fmoc-Met, Fmoc-Phe, Fmoc-Trp, and Fmoc-Pro.
  • dehydration condensing agents such as 1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole (MSNT), dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIPCDI), and the like can be used.
  • MSNT 1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DIPCDI diisopropylcarbodiimide
  • the use ratio of the amino acid and the dehydration condensing agent is usually 1 to 10 parts by weight, preferably 2 to 5 parts by weight, with respect to 1 part by weight of the former.
  • the esterification reaction is preferably performed, for example, by placing a resin in a solid phase column, washing the resin with a solvent, and then adding an amino acid solution.
  • the cleaning solvent include dimethylformamide (DMF), 2-propanol, methylene chloride and the like.
  • the solvent that dissolves amino acids include dimethyl sulfoxide (DMSO), DMF, and methylene chloride.
  • the esterification reaction is carried out at 0 to 50 ° C., preferably at room temperature, for about 10 minutes to 30 hours, preferably about 15 minutes to 24 hours.
  • the elimination of the lipophilic protecting group can be carried out, for example, by treatment with a base.
  • a base include piperidine and morpholine.
  • a solvent examples include DMSO, DMF, methanol and the like.
  • amidation reaction between the free amino group and the carboxyl group of any amino acid whose amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group is preferably performed in the presence of an activator and a solvent.
  • activator examples include dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (WSC / HCl), diphenylphosphoryl azide (DPPA), carbonyldiimidazole (CDI).
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • WSC / HCl 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • DPPA diphenylphosphoryl azide
  • CDI carbonyldiimidazole
  • Diethyl cyanophosphonate (DEPC), benzotriazol-1-yloxy-trispyrrolidinophosphonium (DIPCI), benzotriazol-1-yloxy-trispyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), Hydroxysuccinimide (HOSu), dimethylaminopyridine (DMAP), 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt), hydroxyphthalimide (HOP) t), pentafluorophenol (Pfp-OH), 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), O- (7-aza Benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphonate (HATU), O-benzotriazol-1-yl-1,1,3,3-
  • the activator is used in an amount of 1 to 20 equivalents, preferably 1 to 10 equivalents, more preferably 1 to 5 equivalents with respect to any amino acid in which the amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group. Is preferred.
  • the solvent examples include DMSO, DMF, methylene chloride and the like.
  • the reaction is carried out at 0 to 50 ° C., preferably at room temperature, for about 10 to 30 hours, preferably about 15 minutes to 24 hours.
  • the elimination of the lipophilic protecting group can be carried out in the same manner as described above.
  • the acid include trifluoroacetic acid (TFA) and hydrogen fluoride (HF).
  • glycosylated antigenic GLP-1 analog in which a desired position is substituted with glycosylated asparagine can be obtained.
  • the glycosylated antigenic GLP-1 analog can also be produced by a method in which a peptide chain is first synthesized and a sugar chain is added later. Specifically, a peptide containing Cys at the position where a sugar chain is to be added is produced by a solid phase synthesis method, a liquid phase synthesis method, a method of synthesizing with a cell, a method of separating and extracting naturally occurring ones, and the like. Next, the haloacetamide-conjugated complex sugar chain derivative is reacted with the peptide containing Cys obtained above to bind the sugar chain to the peptide.
  • the above reaction is usually carried out at 0 to 80 ° C., preferably 10 to 60 ° C., more preferably 15 to 35 ° C.
  • the reaction time is preferably about 30 minutes to 5 hours.
  • HPLC high performance liquid column chromatography
  • the haloacetamide-conjugated glycan derivative is, for example, a hydroxyl group bonded to the 1-position carbon of the conjugated asparagine-linked glycan, represented by —NH— (CO) — (CH 2 ) a —CH 2 X (X is The halogen atom, a is an integer, and is not limited as long as the desired linker function is not inhibited, but preferably represents an integer of 0 to 4.
  • a haloacetamide-conjugated complex sugar chain derivative and a Cys-containing peptide are reacted in a phosphate buffer at room temperature. After completion of the reaction, a glycosylated antigenic GLP-1 analog substituted with glycosylated Cys can be obtained by purification with HPLC.
  • a step of adding a fatty acid to a Lys residue is performed.
  • This step can be performed, for example, by reacting Pal-Glu (OBu) -OSu with a peptide containing Lys.
  • the fatty acid addition step may be performed before or after the sugar chain addition step.
  • Method C For example, a glycosylated amino acid is dissolved in a DMSO solution, and a DMSO solution in which glutaric acid-EDC is mixed is added to this solution, followed by stirring at room temperature for 1 day.
  • the reaction mixture is appropriately diluted and then fractionated by molecular weight exclusion gel chromatography or the like, whereby a glycosylated amino acid in which glutaric acid is bound to the ⁇ -amino group can be obtained.
  • a DMSO solution of N-hydroxysuccinimide and a DMSO solution of EDC are added to a DMSO solution of a glutaric acid-linked glycosylated amino acid, and the mixture is stirred at room temperature for 6 hours.
  • N-hydroxysuccinimidyl ester of a glycosylated amino acid can be synthesized.
  • the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention has GLP-1 activity.
  • the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention preferably has a GLP-1 activity equal to or higher than that of natural GLP-1, and more preferably, an antigenic GLP-1 having no sugar chain added thereto. Compared with one analog (hereinafter sometimes referred to as “non-glycosylated antigenic GLP-1 analog”), it has an equivalent or higher GLP-1 activity.
  • GLP-1 activity refers to a part or all of a known physiological activity of GLP-1.
  • GLP-1 has, in addition to blood glucose level inhibitory action, for example, insulin secretion associated with cAMP synthesis induction, islet protection (inhibition of apoptosis), islet proliferation, and extrapancreatic action include appetite suppression, gastrointestinal motility suppression, calcitonin It is known to have secretion enhancement, cardioprotective action during ischemia, and the like. Therefore, GLP-1 activity refers to all or part of the physiological activity related to these actions, and can be measured using techniques known to those skilled in the art.
  • the blood glucose level inhibitory activity is the measurement of the blood glucose level lowering effect in diabetic mice (db / db mice) and the blood glucose level increase inhibitory activity in the oral glucose tolerance test (OGTT: Oral Glucose Tolerance Test). It can measure using the measurement of this.
  • blood glucose level suppression includes both concepts of suppressing an increase in blood glucose level and lowering the blood glucose level.
  • the blood glucose level inhibitory action in db / db mice may be referred to as “blood glucose level lowering action”
  • the blood glucose level inhibitory action in OGTT may be referred to as “blood sugar level rise inhibitory action”.
  • the blood glucose level inhibitory activity by OGTT can be determined by measuring the suppression of an increase in blood glucose level when a mouse is forced to drink sugar. For example, first, a test compound is administered to a mouse fasted overnight, and a glucose solution is orally administered 30 minutes later. Glucose administration increases the blood glucose level in mice, reaches a maximum about 30 minutes after administration, and gradually decreases. The blood glucose level of 30 minutes after glucose administration is measured, and compared with the blood glucose level in the case of non-glycosylated antigenic GLP-1 analog administration, the blood glucose level inhibitory action of glycosylated antigenic GLP-1 analog is evaluated can do.
  • the strength of blood glucose level inhibitory activity of the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention is evaluated by comparing doses when the same level of blood glucose level inhibitory action is confirmed in OGTT. Can do. For example, when the same blood glucose level inhibitory effect is obtained when 10 non-glycosylated antigenic GLP-1 analogs are administered and when 1 glycosylated antigenic GLP-1 analog is administered, The blood glucose level inhibitory activity of GLP-1 analog is 10 times that of non-glycosylated antigenic GLP-1 analog.
  • the blood glucose level inhibitory activity using db / db mice can be determined by measuring the blood glucose level after administering the test compound to diabetic mice.
  • the blood glucose level after administration of the test compound is measured over time. For example, if the blood glucose level for 120 minutes after administration is lower than that at the time of administration, the blood glucose level lowering effect can be confirmed. Further, for example, by measuring the blood glucose level for 300 minutes after administration, the persistence of the blood glucose level lowering action can also be determined.
  • insulin secretion activity in GLP-1 activity can be measured using an in vitro cAMP synthesis ability test or the like.
  • GLP-1 increases intracellular cAMP concentration by binding to the GLP-1 receptor, and promotes insulin secretion. Therefore, for example, mouse GLP-1 receptor-expressing CHO-K1 cells are stimulated with a glycosylated antigenic GLP-1 analog, the amount of cAMP synthesized in the cells is measured, and the EC50 value is determined as non-glycosylated antigenicity. By comparing with the GLP-1 analog, the insulinotropic activity of the glycosylated antigenic GLP-1 analog can be evaluated.
  • the blood stability of the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention is preferably equivalent to or higher than that of natural GLP-1, and more preferably equivalent to non-glycosylated antigenic GLP-1 analog. Or more. Blood stability can be measured using methods known to those skilled in the art. For example, stability in plasma and resistance to DPP-IV (dipeptidyl peptidase IV) are measured, half-life, AUC (drug The blood concentration-area under the time curve) can be used as an index. Moreover, an increase in renal clearance also contributes to an increase in blood stability.
  • the stability of the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention in plasma is preferably equivalent to or higher than that of natural GLP-1, more preferably equivalent to that of non-glycosylated antigenic GLP-1 analog. Or more.
  • Resistance to DPP-IV can be determined, for example, by measuring half-life in a DPP-IV solution.
  • the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention has equivalent or better resistance to DPP-IV than the non-glycosylated antigenic GLP-1 analog.
  • the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention preferably has a blood half-life of preferably at least 1 hour, more preferably at least 3, 5, 7, 10, 15, 20 hours and even more preferably at least 24 hours.
  • the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention has a reduced antigenicity compared to the non-glycosylated antigenic GLP-1 analog.
  • the decrease in antigenicity can be achieved, for example, by sensitizing a mouse with a glycosylated antigenic GLP-1 analog or a non-glycosylated antigenic GLP-1 analog, and determining the anti-GLP-1 analog antibody titer in the blood of each mouse. It can be evaluated by measuring and comparing.
  • the antigenicity of the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention is preferably about one half or less, more preferably about one third or less, compared to the non-glycosylated antigenic GLP-1 analog. More preferably, it is reduced to about 1/4.
  • the pharmaceutical composition containing the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention as an active ingredient is effective for the treatment or prevention of diseases associated with GLP-1.
  • GLP-1 is known to have various actions, and there are various diseases associated with these actions.
  • GLP-1 has been found to cause glucose uptake by cells and a decrease in blood glucose levels by stimulating insulin release. It has also been found to suppress stomach and / or intestinal motility, suppress stomach and / or intestinal content excretion, and suppress food intake.
  • diseases associated with GLP-1 include, for example, non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM), insulin dependent diabetes mellitus, stroke (see International Publication No. WO00 / 16797 by Efendic), myocardial infarction (by Efendic) International Publication No. WO 98/08531), obesity (see International Publication No. WO 98/19698 by Efendic), functional dyspepsia, irritable bowel syndrome (International Publication No. WO 99/64060 by Efendic) (See brochure), including islet transplantation.
  • the pharmaceutical composition containing the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention as an active ingredient is particularly effective for the treatment or prevention of diabetes, and more specifically, prevention of type 1 diabetes and treatment of type 2 diabetes. It is effective for.
  • the above pharmaceutical composition is a normal pharmaceutical composition using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, moisturizers, disintegrants, surfactants, lubricants and the like that are usually used. It was formulated in the form of Examples of such a pharmaceutical composition include tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules, suppositories, injections, and the like.
  • the amount of the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention contained in the pharmaceutical composition is not particularly limited and can be appropriately selected from a wide range. It is preferable to contain 1 to 70% by weight of the glycosylated antigenic GLP-1 analog.
  • the pharmaceutical composition containing the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention as an active ingredient can further contain other active ingredients, or is used in combination with a pharmaceutical composition containing other active ingredients. You can also The pharmaceutical composition containing the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention as an active ingredient may further contain one or more different glycosylated antigenic GLP-1 analogs of the present invention as an active ingredient. It can also be used in combination with a pharmaceutical composition containing one or more different glycosylated antigenic GLP-1 analogs of the present invention as active ingredients.
  • the administration method of the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited, and it is administered by a method according to various preparation forms, patient age, sex, disease state, and other conditions.
  • Examples of the administration method in the case of tablets, pills, liquids, suspensions, emulsions, granules and capsules include oral administration.
  • it can be administered intravenously, intramuscularly, intradermally, subcutaneously or intraperitoneally alone or mixed with a normal fluid such as glucose or amino acid.
  • a suppository it is administered intrarectally.
  • the dosage of the above pharmaceutical composition may be appropriately selected according to the usage, patient age, sex, disease severity, and other conditions.
  • the glycosylated antigenic GLP- of the present invention per 1 kg body weight is used.
  • the dosage is such that one analog is 0.1 to 900 nmol, preferably 1 to 90 nmol. Since the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention is less antigenic than the non-glycosylated antigenic GLP-1 analog, it is relatively safe even when the dose is increased.
  • the number of administrations of the pharmaceutical composition may be appropriately selected according to usage, patient age, sex, disease severity, and other conditions. For example, 3 times / 1 day, 2 times / 1 day, 1 time / A less frequent number of administrations (for example, once / week, once / month, etc.) may be selected depending on the stability of the blood in one day.
  • the frequency of administration of the pharmaceutical composition is not more than once / day.
  • the sugar chain added to the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention is easily degraded in the metabolic system in the body.
  • the sugar chain has a structure that exists as a glycopeptide (or glycoprotein) in vivo. Therefore, the pharmaceutical composition containing the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention and the peptide as an active ingredient does not show any side effects or antigenicity even when administered in vivo, and allergic reaction or antibody production It has the advantage that there is little worry that the medicinal effect cannot be obtained.
  • the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention can be stably and easily supplied in large quantities, and is very useful from the viewpoint of providing a high-quality pharmaceutical product with stable quality. is there.
  • the present invention also provides a method for treating or preventing a disease associated with GLP-1, which comprises administering an effective amount of the glycosylated antigenic GLP-1 analog of the present invention.
  • Embodiments of the present invention may be described with reference to schematic diagrams, but in the case of schematic diagrams, they may be exaggerated for clarity of explanation.
  • terms such as first, second, etc. are used to represent various elements, it is understood that these elements should not be limited by those terms. These terms are only used to distinguish one element from another, for example, the first element is referred to as the second element, and similarly, the second element is the first element. Can be made without departing from the scope of the present invention.
  • Example 1 Synthesis Method of Position 30 Cys-Disialoglycosylated Exendin-4 (SEQ ID NO: 6) Ex-4 (SEQ ID NO: 10; Ex-4 shown in SEQ ID NO: 2 ) synthesized according to Synthesis Example 1 described later 12.0 mg of a 39-residue peptide in which Gly at position 30 of the amino acid sequence of the above is substituted with Cys) and 36 mg of a bromoacetylated disialo sugar chain (manufactured by Otsuka Chemical Co., Ltd.) represented by the following formula (a) The reaction was carried out at 37 ° C.
  • Example 2 Synthesis Method of Position 30 Cys-High Mannose-5 Type Glycosylated Exendin-4 (SEQ ID NO: 7) Ex-4 (SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 2 ) synthesized by Synthesis Example 1 described later 1.2 mg of a 39-residue peptide in which Gly at position 30 of the amino acid sequence of Ex-4 shown is substituted with Cys) and the bromoacetylated M5 sugar synthesized in Synthesis Example 2 described later 3.9 mg of chain was reacted at 37 ° C. for 3 hours in 0.17 mL of 35 mM sodium phosphate buffer pH 7.4, 1 mM triscarboxyethylphosphine.
  • Fmoc-Gly (0.50 mmol), MSNT (0.50 mmol) and N-methylimidazole (0.375 mmol) were dissolved in DCM (2 ml), placed in a column for solid phase synthesis, and stirred at 25 ° C. for 3 hours. .
  • Synthesis Example 2 Synthesis Method of Bromoacetylated M5 Sugar Chain 100 g of soybean powder was washed twice with 500 ml of acetone and twice with 500 ml of methanol to obtain 61.4 g of defatted soybean powder. To 43.0 g of the obtained defatted soybean powder, 430 ml of water and 4.3 g of liquefied enzyme T (manufactured by HBI) were added and reacted at 70 ° C. for 19 hours with stirring. The reaction solution was centrifuged (10000 G, 10 minutes) to separate into a supernatant and a precipitate, and 800 ml of the supernatant was obtained.
  • the solution after the reaction was filtered to remove insoluble matters, and the solution was concentrated by a rotary evaporator until the liquid volume became 400 ml.
  • the obtained liquid was subjected to ultrafiltration using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of 1K (manufactured by Minimate TFF Capsule 1K membrane Paul). After 6 hours of treatment, 230 ml of liquid that did not permeate the membrane was recovered. 20 ml of 1M Tris-HCl buffer pH 8.0, 250 mg of sodium azide, and 423.5 mg of actinase E (manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) were added to the collected liquid and reacted at 37 ° C. for 82 hours.
  • the reaction solution was filtered to remove insolubles, and then concentrated with a rotary evaporator until the liquid volume reached 100 ml.
  • the concentrated solution was divided into two halves and fractionated on a Sephadex-G25 ( ⁇ 25 mm ⁇ 100 mm) column, and only the sugar chain-containing fractions were collected and concentrated to obtain 2.22 g.
  • Distilled water (21.0 ml) and ethanol (14.9 ml) were added to the resulting sugar chain-containing fraction to dissolve, and sodium hydrogen carbonate (1.13 g) and Fmoc-OSu (2.02 g) were added and reacted at room temperature for 16 hours.
  • Fmoc-Arg Pbf
  • Fmoc-Aminoisobutyric Acid Aib
  • Fmoc-Lys Boc
  • Fmoc-Val Fmoc-Leu
  • Fmoc-Trp Boc
  • Fmoc-Trp Boc
  • Fmoc-Trp Boc
  • Fmoc-Trp Boc
  • Fmoc-Trp Boc) -Ile
  • Fmoc-Phe Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Cys (Trt), Fmoc-Ala, Fmoc-Ala, Fmoc-Gln (Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Lu , Fmoc-Tyr (tBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc
  • Example 1 Confirmation of Antigen Decreasing Action of Exendin-4 by Glycosylation Mice were sensitized with non-glycosylated exendin-4 or 30-position Cys-dicialoglycosylated exendin-4 to prevent By comparing the concentrations of exendin-4 antibody, the effect of glycosylation on the antigenicity of exendin was verified.
  • the 30-position Cys-dicialo-glycosylated exendin-4 and non-glycosylated exendin-4 (American Peptide Company) synthesized in Example 1 were sufficiently combined with Complete Freund's adjuvant (Difco Laboratories).
  • the mixture was mixed into an emulsion and administered intraperitoneally to balb / c mice (female, 7 weeks old).
  • Plasma was collected from mice 7 days after boost.
  • the concentration of anti-exendin-4 antibody in plasma was measured by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) using a commercially available anti-exendin-4 antibody (Antibodydy) as a standard product.
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • Antibody production was strongly induced in mice immunized with glycosylated non-glycosylated exendin-4, and its plasma concentration was 707 ⁇ 68.2 mg / mL.
  • the anti-exendin-4 antibody concentration in the plasma of mice immunized with position 30-Cys-dicialoglycosylated exendin-4 was about 4 minutes compared to immunization with non-glycosylated exendin-4 1 (178.8 ⁇ 22.3 mg / mL), and showed a significant antigenicity-reducing effect (p ⁇ 0.001, Student's t-test).
  • Test Example 3 Confirmation of Blood Glucose Level Reduction Effect of Glycosylated Exendin-4 Using db / db Mice 30th Position Cys-Disialo Glycosylated Exendin-4 Synthesized in Example 1 in PBS (9 nmol / 10 mL) , BKS. Cg ⁇ + Leprdb / + Leprdb / Jcl mice (10 weeks old, male) were administered intraperitoneally at a dose of 10 mL / kg. Orbital blood collection was performed 30 minutes, 60 minutes, 120 minutes, and 240 minutes before compound administration, and blood glucose levels were measured using Accu Check Aviva (Roche Diagnostics).
  • Non-glycosylated exendin-4 was highly stable in blood, showed a strong blood glucose lowering effect 30 minutes after administration, and the effect persisted until 240 minutes.
  • Cys-dicialo-glycosylated exendin-4 at position 30 shows a blood glucose level lowering action and persistence equivalent to non-glycosylated exendin-4, and the effect of glycosylation on the amino acid at position 30 of exendin-4 was not detected.
  • Test Example 4 Oral Glucose Tolerance Test (OGTT: Oral Glucose Tolerance Test) A 30-position Cys-dicialoglycosylated liraglutide produced in Example 4, GLP-1 produced in Comparative Example 2 or a liraglutide produced in Comparative Example 3 in PBS (9 nmol / 10 ml), or PBS solution was fasted overnight. C57BL / 6JJcl mice (10 weeks old, male) were intraperitoneally administered at a dose of 10 ml / kg. After 30 minutes, the glucose solution was orally administered at a dose of 1 mg / g.
  • OGTT Oral Glucose Tolerance Test
  • Orbital blood collection was performed before glucose administration, 30 minutes, 60 minutes, and 120 minutes after glucose administration, and blood glucose level was measured using Accu Check Aviva (Roche Diagnostics). The results are shown in FIG. Both the 30-position Cys-disialoglycosylated liraglutide and the non-glycosylated liraglutide exhibited higher blood glucose elevation-inhibiting action than Vehicle (PBS only) and GLP-1, but the 30-position Cys-disialoglycosylated liraglutide was non-glycosylated. Compared with sugar chain-added liraglutide, it exhibited a higher blood glucose level inhibitory action.
  • Orbital blood collection was performed 30 minutes, 60 minutes, 120 minutes, 240 minutes, 480 minutes, and 720 minutes before compound administration, and blood glucose levels were measured using Accu Check Aviva (Roche Diagnostics).
  • non-glycosylated liraglutide was also administered to db / db mice and blood glucose levels were measured over time and compared with the effect of position 30 Cys-disialoglycosylated liraglutide.
  • the results are shown in FIG.
  • the blood stability of 30th position Cys-disialoglycosylated liraglutide was high, and showed a strong blood glucose lowering action 30 minutes after administration, and the effect was sustained until 12 hours later.
  • Cys-disialoglycosylated liraglutide at position 30 showed a blood glucose level lowering action and persistence equivalent to that of non-glycosylated liraglutide, and the effect of glycosylation on the amino acid at position 30 of liraglutide was not detected.
  • SEQ ID NO: 1 is GLP-1.
  • SEQ ID NO: 2 is exendin-4.
  • SEQ ID NO: 3 is liraglutide.
  • SEQ ID NO: 4 is a general formula of glycosylated exendin-4.
  • SEQ ID NO: 5 is a general formula of glycosylated liraglutide.
  • SEQ ID NO: 6 is exendin-4 in which Gly at position 30 is substituted with dicialoglycosylated Cys.
  • SEQ ID NO: 7 is exendin-4 in which Gly at position 30 is substituted with high mannose-5-type glycosylated Cys.
  • SEQ ID NO: 8 is liraglutide in which Arg at position 30 is substituted with asialoglycosylated Cys.
  • SEQ ID NO: 9 is liraglutide in which Arg at position 30 is substituted with dicialo-glycosylated Cys.
  • SEQ ID NO: 10 is exendin-4 in which Gly at position 30 is replaced with Cys.
  • SEQ ID NO: 11 is GLP-1 peptide in which Lys at position 28 is Arg and Arg at position 30 is replaced by Cys.
  • SEQ ID NO: 12 is GLP-1 in which Lys at position 28 is Arg and Arg at position 30 is substituted with asialoglycosylated Cys.
  • SEQ ID NO: 13 is GLP-1 in which Lys at position 28 is substituted with Arg and Arg at position 30 is substituted with Cys (acm).
  • SEQ ID NO: 14 is liraglutide in which Arg at position 30 is substituted with Cys.
  • SEQ ID NO: 15 is a peptide having a protecting group synthesized in Comparative Example 1.
  • SEQ ID NO: 16 is a peptide having a protective group synthesized in Comparative Example 2.
  • SEQ ID NO: 17 is a peptide having a protecting group synthesized in Synthesis Example 1.
  • SEQ ID NO: 18 is BIM-51077.
  • SEQ ID NO: 19 is a general formula of glycosylated BIM-51077.
  • SEQ ID NO: 20 is BIM-51077 in which Lys at position 20 was replaced with Cys.
  • SEQ ID NO: 21 is BIM-51077 in which Lys at position 20 was substituted with dicialoglycosylated Cys.
  • SEQ ID NO: 22 is a peptide having a protecting group synthesized in Synthesis Example 3.

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Abstract

　【課題】本発明は、抗原性が高いＧＬＰ－１アナログを改良し、その血糖値抑制活性を低下させることなく、抗原性を低下させたＧＬＰ－１アナログを提供することを課題とする。　【解決手段】本発明は、抗原性ＧＬＰ－１アナログの少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換され、ＧＬＰ－１活性を有する、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体を提供する。

Description

抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体
　本発明は、ＧＬＰ－１アナログにのうち抗原性の高いものに糖鎖を付加した抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体に関する。
　ＧＬＰ－１（グルカゴン様ペプチド－１：ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ－１）は、糖のホメオスタシスの制御に深く関与する腸起源のペプチドである。ＧＬＰ－１は、グルカゴン前駆体のプレプログルカゴンの組織特異的な翻訳後プロセシングにより腸のＬ細胞において合成され、食事に反応して循環中へ放出される。このペプチドは、腸島軸（ｅｎｔｅｒｏｉｎｓｕｌａｒ　ａｘｉｓ）の主要メディエーターであり、特定の受容体に結合することによって作用する。
　ＧＬＰ－１は、主として膵臓に作用し、β細胞によるインスリン放出をグルコース濃度依存的に促進することが知られている。また、グルカゴンの分泌を抑制し、胃の空洞化を遅らせ、末梢のグルコース処理を高める可能性が示唆されている。
　ＧＬＰ－１の投与によりインスリン非依存型糖尿病患者において食後のグルコースレベルが正常化され得ることから、ＧＬＰ－１の治療薬としての可能性が示唆されている。また、ＧＬＰ－１はインスリン依存型糖尿病患者において血糖コントロールを改善する作用も有している。さらに、ＧＬＰ－１のインスリン放出促進作用は血漿グルコース濃度に依存しているため、低い血漿グルコース濃度ではＧＬＰ－１介在性のインスリン放出が低く、重篤な低血糖症を招かないメリットがある。従って、必要に応じ、血中ＧＬＰ－１量をコントロールすることによって、安全性の高い糖尿病治療が可能になると考えられる。しかしながら、ＧＬＰ－１の血中の半減期は、２～６分と極めて短く、その治療剤としての可能性が限定されるという問題がある。
　このような問題を解決する手段として、ＧＬＰ－１を改変する試みがなされている。例えば、特許文献１には、少なくとも１個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に共役的に結合したＧＬＰ－１化合物を含むペグ化ＧＬＰ－１化合物が開示されている。当該ペグ化ＧＬＰ－１化合物では、各ＰＥＧがＧＬＰ－１化合物に、Ｃｙｓ又はＬｙｓアミノ酸にて、もしくはカルボキシ末端アミノ酸にて結合している。当該ペグ化ＧＬＰ－１化合物は、少なくとも１時間の排出半減期を有する。
　特許文献１によれば、非ペグ化（ｕｎＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ペプチドと比べて、半減期が延長され、クリアランスが遅延化された生理活性ペプチドが得られる。また、これらのペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ＧＬＰ－１化合物及び組成物は、糖尿病、肥満、過敏性腸症候群、ならびに血糖を低下させること、胃及び／又は腸運動性を抑制すること、及び、胃及び／又は腸内容排出を抑制すること、又は食物摂取を抑制すること等、健康状態の治療に有用であることが開示されている（例えば、非特許文献１）。
　しかしながら、ＰＥＧは、生体内で代謝されない化合物であるため、ペグ化ＧＬＰ－１化合物の投与を続けると、ＰＥＧが生体内に蓄積され、生体に薬害を与える危険性がある（非特許文献１）。
　また、半減期を延長するために、ＧＬＰ－１やその改変体に糖鎖を付加する方法も提案されている（例えば、特許文献２及び３）。一方、特許文献２には、分子量２００ＫＤａ程度のヒアルロン酸修飾物をＧＬＰ－１アナログに結合させる方法が記載されている。しかしながら、このように巨大なヒアルロン酸分子を大量に製造する場合、長さや構造を均一にするのは困難であり、実際には各ヒアルロン酸の構造や長さにはかなりばらつきが生じているものと考えられる。医薬品として用いる場合には、長さや構造が均一な糖鎖付加ペプチドが必要とされる。一方、特許文献３には、ＧＬＰ－１の２６位、３４位、及び／又は３７位に糖鎖付加アミノ酸を導入する方法等が記載されているが、糖鎖の種類や糖鎖を付加する位置が、必ずしも最適化されているとはいえない。
　また、本発明者らも糖鎖の種類や付加位置を変更し、血中半減期が長く、活性の高い糖鎖付加ＧＬＰ－１を開発している（例えば、特許文献４）。
　ところで、ＧＬＰ－１に類似した構造で、同様の活性を有し、かつ、血中安定性の高い化合物として、トカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ）の唾液から発見されたエキセンディン－４（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）（非特許文献２）が米国で上市されている。しかしながら、エキセンディン－４は非ヒト型配列であるため、他のＧＬＰ－１アナログより抗原性が高く、長期投与による中和抗体の出現やそれに伴う薬効の減弱が懸念される（非特許文献３～５）。
　また、ＧＬＰ－１に脂肪酸を結合させたリラグルチドもＧＬＰ－１アナログの一つとして開発されている（例えば非特許文献６乃至８を参照）。脂肪酸を結合させると、アルブミンとの親和性が高められる。アルブミンと結合したリラグルチドは、血中に徐々に放出されるので、半減期が約１０時間となり長時間の作用が期待される。１日１回の皮下注射で足りるので利便性も高い。また、併用のみでなく単独療法も可能とされている。
　しかしながら、天然型と異なる構造を有するので、エキセンディン－４と同様に抗原性が懸念されている。特に、リラグルチドは、投与された量の約９９％がアルブミンと結合するために投与量が多くなるので、その点でも化合物の抗原性を極力低下させておく必要がある。
特表２００６－５２０８１８号公報 再表２００６－０９５７７５号公報 国際公開第２００７／０６３９０７号パンフレット 国際公開第２００８／１５５９００号パンフレット Ｂｅｎｄｅｌｅ，Ａ．ｅｔ．ａｌ．：Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，４２：１５２－１５７ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２，２６７：７４０２－７４０５ Ｓｃｈｎａｂｅｌ，Ｃ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．：Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｒｉｓｋ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，２００６，２：６９－７７ Ａｍｏｒｉ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ　ａｌ．：Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２００７，２９８：１９４－２０６ Ｗａｊｃｈｅｎｂｅｒｇ，Ｂ．Ｌ．：Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００７，２８：１８７－２１８ Ｍａｒｒｅ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．：Ｄｉａｂｅｔｉｃ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００９，２６（３）：２６８－２７８ Ｄｅａｃｏｎ，Ｃ．Ｆ．：Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｒｉｓｋ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，２００９，５：１９９－２１１ Ｌａｒｓｅｎ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．：Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００１，５０：２５３０－２５３９
　本発明は、抗原性が高いＧＬＰ－１アナログを改良し、その血糖値抑制活性を低下させることなく、抗原性を低下させたＧＬＰ－１アナログを提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、エキセンディン－４等の抗原性を有するＧＬＰ－１アナログに糖鎖を付加することによって、血糖値抑制活性を低下させることなく、抗原性を低下させることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、
〔１〕抗原性ＧＬＰ－１アナログの少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換され、ＧＬＰ－１活性を有する、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体；
〔２〕上記〔１〕に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎ又は糖鎖付加Ｃｙｓである、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体；
〔３〕上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体；
〔４〕上記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が４個以上の糖からなる糖鎖である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体；
〔５〕上記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が２本鎖複合型糖鎖である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体；
〔６〕上記〔５〕に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖、及びジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体；
〔７〕上記〔５〕に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
で表される糖鎖である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体；
〔８〕上記〔１〕～〔７〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記抗原性ＧＬＰ－１アナログがエキセンディン－４である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体；
〔９〕上記〔８〕に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、糖鎖付加アミノ酸で置換された部位が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における、３０位である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体；
〔１０〕上記〔８〕に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、
　配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、３０位のＧｌｙが糖鎖付加Ｃｙｓに置換されており、
　前記糖鎖が、下記式で示されるジシアロ糖鎖
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 であり、
　前記糖鎖付加Ｃｙｓにおいて、前記糖鎖と前記Ｃｙｓとがリンカーを介して結合している、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体；
〔１１〕上記〔１〕～〔７〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記抗原性ＧＬＰ－１アナログがリラグルチドである、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体；
〔１２〕上記〔１１〕に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖付加アミノ酸で置換された部位が、配列番号：３に記載のアミノ酸配列における３０位である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体；
〔１３〕上記〔１１〕に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、
　配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、３０位のＡｒｇが糖鎖付加Ｃｙｓに置換されており、
　前記糖鎖が、下記式で表わされるジシアロ糖鎖、又は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 下記式で表わされるアシアロ糖鎖
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 であり、
　前記糖鎖付加Ｃｙｓにおいて、前記糖鎖と前記Ｃｙｓとがリンカーを介して結合している、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体；
〔１４〕上記〔１〕～〔１３〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が実質的に均一である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体；
〔１５〕上記〔１〕～〔１３〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が９９％以上均一である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体；
〔１６〕上記〔１〕～〔１５〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、糖鎖を付加していない抗原性ＧＬＰ－１アナログに比較して抗原性が２分の１以下である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体；
〔１７〕上記〔１〕～〔１６〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、糖鎖を付加していない抗原性ＧＬＰ－１アナログより抗原性が低下し、天然型ＧＬＰ－１よりＧＬＰ－１活性が上昇している、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体；
〔１８〕上記〔１〕～〔１７〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体を有効成分として含む医薬組成物；
〔１９〕上記〔１８〕に記載の医薬組成物であって、ＧＬＰ－１に関連する疾患の治療又は予防のための医薬組成物；
〔２０〕上記〔１９〕に記載の医薬組成物であって、前記ＧＬＰ－１に関連する疾患が糖尿病である医薬組成物；
〔２１〕上記〔１〕～〔１７〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体の有効量を投与することを特徴とする、ＧＬＰ－１に関連する疾患の治療又は予防方法、に関する。
　本発明の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体は、糖鎖を付加することにより、血糖値抑制活性を低下させることなく、抗原性を低下させることができる。従って、血中安定性が高く血糖値抑制活性も高いというエキセンディン－４の優位性や、徐放性により投与回数を少なくすることができるというリラグルチドの優位性が維持された、安全な医薬品を提供することができる。
　付加される糖鎖も生体内で容易に分解されるので、その蓄積により生体に薬害を与えることはない。
　また、本発明で用いられる糖鎖には、比較的短いものが多いので、複雑な製造工程を経ずに、均一な構造のものを得ることができる。従って、大規模かつ安定に医薬品レベルの高品質な抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体を得ることができる。
３０位Ｃｙｓ－アシアロ糖鎖付加リラグルチド（配列番号：８）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 実施例４における、リラグルチドの３０位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたペプチド（配列番号：１４）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 ３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加リラグルチド（配列番号：９）のＨＰＬＣによる精製クロマトグラムを示す。 糖鎖付加によるエキセンディン－４の抗原性低下作用を評価した結果を示す。糖鎖付加及び非糖鎖付加エキセンディン－４でマウスを感作すると、糖鎖付加エキセンディン－４の抗体価は非糖鎖付加エキセンディン－４に比較して約４分の１であった。 糖鎖付加エキセンディン－４の経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）の結果を示す。糖鎖付加エキセンディン－４は、非糖鎖付加エキセンディン－４と同等の血糖値上昇抑制作用を示した。 ｄｂ／ｄｂマウスを使用して、糖鎖付加エキセンディン－４の血糖値低下作用を評価した結果を示す。糖鎖付加エキセンディン－４は、非糖鎖付加エキセンディン－４と同等の強い血糖値低下作用を示した。 糖鎖付加リラグルチドの経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）の結果を示す。糖鎖付加リラグルチドは、非糖鎖付加リラグルチドよりもさらに高い血糖値上昇抑制作用を示した。 ｄｂ／ｄｂマウスを使用して、糖鎖付加リラグルチドの血糖値低下作用を評価した結果を示す。糖鎖付加リラグルチドは、非糖鎖付加リラグルチドと同等の血糖値低下作用と持続性を示した。
　本明細書において「ＧＬＰ－１」とは、グルカゴン様ペプチド－１（ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ－１）を示し、ＧＬＰ－１（７－３７）を指す。
　ＧＬＰ－１（７－３７）は、下記のアミノ酸配列を有する。
Ｈｉｓ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ（配列番号：１）
　本明細書において、「ＧＬＰ－１アナログ」とは、ＧＬＰ－１と構造上類似したペプチド及び／又はＧＬＰ－１と重複した構造を有するペプチド、例えば：ＧＬＰ－１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；ＧＬＰ－１のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド；ＧＬＰ－１改変体；ＧＬＰ－１活性を有するＧＬＰ－１のフラグメント；ＧＬＰ－１活性を有する伸長ＧＬＰ－１等をいう。
　本明細書において、「抗原性ＧＬＰ－１アナログ」とは、ＧＬＰ－１アナログのうち抗原性を有するものをいう。抗原性は、当該抗原性ＧＬＰ－１アナログが投与される個体における抗原性を意味し、その程度は問わない。抗原性は、当業者が公知の方法又はそれに準ずる方法で評価することができ、かかる方法としては、例えば、マウスを抗原性ＧＬＰ－１アナログで感作し、当該マウスの血中の抗ＧＬＰ－１アナログ抗体価を測定する方法が挙げられる。
　抗原性ＧＬＰ－１アナログとしては、例えば、エキセンディン－４（以下、「Ｅｘ－４」と記載する場合もある。）、リラグルチド、タスポグルチド（別名ＢＩＭ－５１０７７、Ｇｉａｎｎｏｕｋａｋｉｓ，Ｎ．：Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ，２００７，８：８４２－８４８）、及びＺＰ－１０Ａ（Ｔｈｏｒｋｉｌｄｓｅｎ，Ｃ．ｅｔ　ａｌ．：Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２００３，３０７：４９０－４９６）等が挙げられるがこれらに限定されない。
　本明細書において、「エキセンディン－４」とは、特に断りがない限り、配列番号：２に記載されたアミノ酸配列からなるペプチドに加え、当該ペプチドと構造上類似したペプチド及び／又は当該ペプチドと重複した構造を有するペプチド、例えば：当該ペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；当該ペプチドのアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド；当該ペプチドの改変体；エキセンディン－４と同等の活性を有する当該ペプチドのフラグメント；エキセンディン－４と同等の活性を有する当該ペプチドを伸長したペプチド、等であって、上記ＧＬＰ－１アナログに該当するものを含む。
　また、本明細書において、「リラグルチド」とは、特に断りがない限り、配列番号：３に記載されたアミノ酸配列からなるペプチドに加え、当該ペプチドと構造上類似したペプチド及び／又は当該ペプチドと重複した構造を有するペプチド、例えば：当該ペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；当該ペプチドのアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド；当該ペプチドの改変体；リラグルチドと同等の活性を有する当該ペプチドのフラグメント；リラグルチドと同等の活性を有する当該ペプチドを伸長したペプチド、等であって、上記ＧＬＰ－１アナログに該当するものを含む。
　本明細書において、「ＢＩＭ－５１０７７」とは、特に断りがない限り、配列番号：１８に記載されたアミノ酸配列からなるペプチドに加え、当該ペプチドと構造上類似したペプチド及び／又は当該ペプチドと重複した構造を有するペプチド、例えば：当該ペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；当該ペプチドのアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド；当該ペプチドの改変体；リラグルチドと同等の活性を有する当該ペプチドのフラグメント；リラグルチドと同等の活性を有する当該ペプチドを伸長したペプチド、等であって、上記ＧＬＰ－１アナログに該当するものを含む。
　本明細書において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えば、天然タンパク原性Ｌ－アミノ酸；Ｄ－アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β－アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク原性アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。非天然アミノ酸の例として、α－メチルアミノ酸（α－メチルアラニンなど）、Ｄ－アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２－アミノ－ヒスチジン、β－ヒドロキシ－ヒスチジン、ホモヒスチジン、α－フルオロメチル－ヒスチジン及びα－メチル－ヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。抗原性ＧＬＰ－１アナログのいくつかは、非天然アミノ酸を含むことが知られる。好ましい態様において、本発明の化合物に含まれるアミノ酸は、天然アミノ酸のみからなる。
　本明細書において、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された」という場合、置換等されるアミノ酸の個数は、本発明の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体がＧＬＰ－１活性を保持する限り特に限定されないが、１～９個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個程度であるかあるいは全体の長さの２０％以内、好ましくは１０％以内である。置換又は付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸又はアミノ酸アナログであり得、好ましくは天然のアミノ酸である。
　本明細書において、「アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換された」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数及び／又は疎水性指数が類似している置換であって、そのような置換の前後で、ＧＬＰ－１活性の明らかな低下又は消失を生じない置換をいう。
　本明細書において、ＧＬＰ－１、Ｅｘ－４及びリラグルチド（以下、まとめて「ＧＬＰ－１等」という。）の「改変体」とは、ＧＬＰ－１等を天然又は人工的に改変した化合物であり、そのような改変としては、例えば、ＧＬＰ－１等の１又は複数のアミノ酸残基の、アルキル化、アシル化（例えばアセチル化）、アミド化、カルボキシル化、エステル形成、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、水酸化、標識成分の結合等が挙げられる。例えば、Ｃ末端がアミド化されたペプチドも含まれる。
　本明細書において、「ＧＬＰ－１活性を有するＧＬＰ－１等のフラグメント」とは、元のＧＬＰ－１等のＮ末端及び／又はＣ末端から１個又はそれ以上のアミノ酸が欠失し、かつＧＬＰ－１活性を維持したＧＬＰ－１等である。
　本明細書において、「ＧＬＰ－１活性を有する伸長したペプチド」とは、元のＧＬＰ－１等のＮ末端及び／又はＣ末端に１個又はそれ以上のアミノ酸が付加され、かつＧＬＰ－１活性を維持したペプチドである（例えば、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２５，３１０９－１４（１９８９）を参照）。
　本明細書において、「抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体」は、抗原性ＧＬＰ－１アナログにおいて、少なくとも１個のアミノ酸が、糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする。なお、以下において「抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体」を「糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１」ということもある。
　本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログは、その塩も含む。本明細書において、塩は、酸付加塩又は塩基付加塩のいずれであってもよい。酸付加塩を形成するために通常用いられる酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等の無機酸及びｐ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ－ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等の有機酸である。塩基付加塩としては、水酸化アンモニウム又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等の無機塩基から誘導された塩が挙げられる。特に、薬学的に許容される塩が好ましい。
　本明細書において、「糖鎖付加アミノ酸」とは、糖鎖が結合したアミノ酸であり、ここで糖鎖とアミノ酸とは、リンカーを介して結合していてもよい。糖鎖とアミノ酸との結合部位に特に制限はないが、糖鎖の還元末端にアミノ酸が結合していることが好ましい。
　糖鎖が結合するアミノ酸の種類に特に限定はなく、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のいずれを用いることもできる。糖鎖付加アミノ酸が生体内に糖ペプチド（糖たんぱく質）として存在するものと同一又は類似の構造を有するという観点からは、糖鎖付加アミノ酸は、Ｎ－結合型糖鎖のような糖鎖付加Ａｓｎ、Ｏ－結合型糖鎖のような糖鎖付加Ｓｅｒ及び糖鎖付加Ｔｈｒが好ましく、特に糖鎖付加Ａｓｎが好ましい。
　また、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとの結合容易性という観点からは、糖鎖付加アミノ酸のアミノ酸は、アスパラギン酸やグルタミン酸等の分子内に２つ以上のカルボキシル基を持つアミノ酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン等の分子内に２以上のアミノ基を持つアミノ酸、セリン、スレオニン、チロシン等の分子内に水酸基を持つアミノ酸、システイン等の分子内にチオール基を持つアミノ酸、アスパラギン、グルタミン等の分子内にアミド基を持つアミノ酸、が好ましい。特に、反応性の観点からは、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンが好ましく、特にシステイン及びリシンが好ましい。
　なお、本発明の任意の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログについて、糖鎖構造、糖鎖以外の構造、糖鎖の付加部位及び糖鎖の付加数が同一である場合に、糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎ（リンカーを介さない）の場合と糖鎖付加Ｃｙｓ（リンカーを介する）の場合で、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの血糖値上昇抑制活性に大きな違いはみられない。
　糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとしては、当該分野において用いられているものを広く使用することができるが、例えば、－ＮＨ－（ＣＯ）－（ＣＨ２）ａ－ＣＨ２－（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０～４の整数を示す。）、Ｃ１－１０ポリメチレン、－ＣＨ２－Ｒ－（ここで、Ｒは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基及び置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が１つ脱離して生ずる基である）、－（ＣＯ）－（ＣＨ２）ａ－（ＣＯ）－（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０～４の整数を示す。）等を挙げることができる。
　糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合している場合、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合と比較して、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの抗原性は低くなり得る。糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合している場合と比較して、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの血中安定性が高くなり得る。
　なお、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログは、その記載（例えば、「アミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログ」という記載）によって何ら製造方法が限定されるものではなく、後述のＡ法～Ｃ法のいずれの方法で製造した糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログであっても、「アミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログ」に含まれる。また、例えば、アミノ酸の結合していない糖鎖を、ペプチド上のアミノ酸に直接又はリンカーを介して結合させた糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログ；糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログにおいて、付加した糖鎖にさらに糖又は糖鎖を付加することですでに付加された糖鎖を伸長させた糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログ；糖鎖付加アミノ酸のアミノ基及び／又はカルボキシル基に１又は数個のアミノ酸を結合させ、さらにこれを１又は複数のＧＬＰ－１アナログのフラグメントと連結させた糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログ、なども最終的な構造が一致している限り、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログに含まれる。
　抗原性ＧＬＰ－１アナログのアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する数は、血中安定性や血糖値抑制活性等の生理活性、最終的な糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログに存在するアミノ酸の個数や糖鎖付加前後の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの分子量、等により適宜調節すればよい。例えば、１～５個置換することが好ましく、１～３個置換することがより好ましい。簡便性の観点からは、１個の置換で所望の活性が得られるのであれば、１個の置換を選択することが好ましいであろう。一般に、抗原性ＧＬＰ－１アナログの１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１個以上をさらに糖鎖付加アミノ酸で置換した場合、血中安定性は増大し、血糖値抑制活性は減少する傾向がある（但し、血中安定性が増大することで、減少した血糖値抑制活性を補償することが可能である）。
　本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログにおいて、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は特に限定されないが、当業者は、抗原性を低下させる活性を付与し、且つ、血中安定性や血糖値抑制活性がＧＬＰ－１より低下しない部位を適宜選択することができる。
　本発明の一態様において、抗原性ＧＬＰ－１アナログのアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、所望の活性に応じて抗原性ＧＬＰ－１アナログの任意の部位を選択することができる。例えば抗原性ＧＬＰ－１アナログにおいて、配列番号：１に記載のＧＬＰ－１ペプチドのアミノ酸配列の１２、１４、１６、２０、２４、２８、３０及び３２位（＝３１位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位に相当する部位であり、好ましくは、１２、２０、２４、２８及び３０位から選択される１以上の部位に相当する部位であり、特に２４及び３０位から選択される１以上の部位に相当する部位である。
　ここで、「抗原性ＧＬＰ－１アナログにおいて、配列番号：１に記載のＧＬＰ－１ペプチドのアミノ酸配列のＸ位に相当する位置」とは、種々の抗原性ＧＬＰ－１アナログのアミノ酸配列において、配列番号：１に記載のＧＬＰ－１ペプチドのアミノ酸配列のＸ位に対応する位置を意味し、かかる位置は、当業者がそれぞれの周辺のアミノ酸配列等に基づいて容易に決定することができる。
　例えば、抗原性ＧＬＰ－１アナログであるＥｘ－４及びリラグルチドのアミノ酸配列と、配列番号：１に記載のＧＬＰペプチドのアミノ酸配列は、以下のように対応している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　Ｅｘ－４やリラグルチドが、そのアミノ酸配列に付加、置換、欠失がないものであれば、上表で縦に並んだアミノ酸が「相当する位置」にあるアミノ酸である。付加、置換、欠失がある場合、当業者はそれぞれの周辺のアミノ酸配列に基づいて、「相当する位置」を決定することができる。
　本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの抗原性を低下させるという観点からは、例えば、抗原性ＧＬＰ－１アナログにおける抗原認識部位の周辺とすることが好ましい。また、例えば、配列番号：１に記載のＧＬＰ－１ペプチドの３０位に相当する部位に糖鎖を付加することが有効である。
　本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの血中安定性という観点からは、例えば、配列番号：１に記載のＧＬＰ－１ペプチドの３、４、５、６、８、１０、１２、１３、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２６、２８、３０及び３２位（＝３１位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位に相当する部位であり、好ましくは３、４、５、６、８及び２２位から選択される１以上の部位であり、特に好ましくは３、４、５及び６から選択される１以上の部位に相当する部位である。特にＧＬＰ－１のＮ末端に近い部位のアミノ酸の置換も好ましい。特に、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位の例として、例えば１２位と３０位、２０位と２８位、１６位と２４位、１６位と３０位、２４位と３０位に、それぞれ相当する部位などを挙げることができる。
　本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの血糖値抑制作用という観点からは、例えば、配列番号：１に記載のＧＬＰ－１ペプチドの１２、１４、１６、２０、２４、２８、３０及び３２位（＝３１位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位に相当する部位であり、好ましくは１２、２０、２４、２８及び３０位から選択される１以上の部位に相当する部位であり、特に２４及び３０位から選択され１以上の部位に相当する部位である。２以上のアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位の例として、例えば、１２位と３０位、２０位と２８位、１６位と２４位、１６位と３０位、２４位と３０位にそれぞれ相当する部位などを挙げることができる。
　本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログのＧＬＰ－１活性のうち、ｃＡＭＰ合成能に関する観点からは、例えば、配列番号：１に記載のＧＬＰ－１ペプチドの１６、２０、２１、２４、２８、３０及び３２位（＝３１位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位に相当する部位であり、好ましくは１６、２０、２４、２８、３０及び３２位から選択される１以上の部位に相当する部位である。
　本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるＧＬＰ－１の２、３及び６位以外の部位から選択される１以上の部位である。
　本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、ＧＬＰ－１の１、４、７、９、１３、１５及び２３位以外の部位から選択される１以上の部位、特に、１、４及び９位以外の部位から選択される１以上の部位である。
　本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、ＧＬＰ－１のＧＬＰ－１受容体への結合部位からも、決定することができる。
　本発明の一態様において、２以上のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されている場合に、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、上記のいずれの組み合わせも採用することができるがこれに限定されない。例えば、１の部位が上記の好ましい部位から選択され、他の部位が抗原性ＧＬＰ－１アナログの任意の部位から選択される組み合わせ；１の部位が上記の好ましい部位から選択され、他の部位が抗原性ＧＬＰ－１アナログのＣ末端にさらに付加された１若しくは数個のアミノ酸の任意の部位から選択される組み合わせ等もまた、本発明の好ましい一態様に含まれる。
　本発明の一態様において、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加が生ずる部位は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるＧＬＰ－１の１、４、７、９、１３、１５、２２及び２３位以外の部位から選択される１以上の部位、例えば、１、４、９及び２２位以外の部位から選択される１以上の部位であることが好ましい（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｌ，ＴＨＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　Ｖｏｌ．２６９，Ｎｏ．９，Ｉｓｓｕｅ　ｏｆ　Ｍａｒｃｈ　４，ｐｐ．　６２７６－６２７８．１９９４）。
　本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログとしては、例えば、以下のアミノ酸配列を有するエキセンディン－４に糖鎖を付加したものを挙げることができる。
Ｈ－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ＮＨ２（配列番号：２）
　糖鎖付加エキセンディン－４は、例えば、以下の一般式（１）で表わされる。
一般式（１）
Ｈ－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｘａａ１２－Ｇｌｎ－Ｘａａ１４－Ｇｌｕ－Ｘａａ１６－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｘａａ２０－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｘａａ２４－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｘａａ２８－Ｇｌｙ－Ｘａａ３０－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－ＮＨ２
［式中、Ｘａａ１２は、Ｌｙｓ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１４は、Ｍｅｔ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１６は、Ｇｌｕ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２０は、Ａｒｇ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２４は、Ｇｌｕ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２８は、Ａｓｎ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ３０は、Ｇｌｙ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１２、Ｘａａ１４、Ｘａａ１６、Ｘａａ２０、Ｘａａ２４、Ｘａａ２８及びＸａａ３０の少なくとも１つは糖鎖付加Ｃｙｓまたは糖鎖付加Ａｓｎである。］（配列番号：４）
　中でも、Ｘａａ２４が糖鎖付加Ｃｙｓであることが好ましい。
　なお、エキセンディン－４のように、本来Ｃ末端がアミド化されているペプチドについては、当該Ｃ末端のアミノ酸に糖鎖を付加した糖鎖付加アミノ酸を合成する場合、Ｃ末端をアミド化しない場合もある。
　本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログとしては、例えば、以下のアミノ酸配列を有するリラグルチドに糖鎖を付加したものを挙げることができる。
Ｈｉｓ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ２０－Ｇｌｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ（配列番号：３）
　ここで、Ｌｙｓ２０には、下記式で示されるように、グルタミン酸を介してパルミトイル基が結合している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 　糖鎖付加リラグルチドは、例えば、以下の一般式（２）で表わされる。
一般式（２）
Ｈｉｓ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｘａａ１２－Ｔｙｒ－Ｘａａ１４－Ｇｌｕ－Ｘａａ１６－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ２０－Ｇｌｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｘａａ２４－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｘａａ２８－Ｇｌｙ－Ｘａａ３０－Ｇｌｙ
［式中、Ｘａａ１２は、Ｓｅｒ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１４は、Ｌｅｕ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１６は、Ｇｌｙ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２４は、Ａｌａ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２８は、Ａｒｇ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ３０は、Ａｒｇ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１２、Ｘａａ１４、Ｘａａ１６、Ｘａａ２４、Ｘａａ２８及びＸａａ３０の少なくとも１つは糖鎖付加Ｃｙｓまたは糖鎖付加Ａｓｎである。］（配列番号：５）
　中でも、Ｘａａ２４及び／又はＸａａ３０が糖鎖付加Ｃｙｓ又は糖鎖付加Ａｓｎであることが好ましく、特に、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ｃｙｓであることが好ましい。
　また、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログとしては、例えば、以下のアミノ酸配列を有するＢＩＭ５１０７７に糖鎖を付加したものを挙げることができる。
Ｈｉｓ－Ｒ２－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｒ２－Ａｒｇ－ＮＨ２
［式中、Ｒ２は、α－メチルアラニン（アミノイソブタン酸、Ａｉｂとも呼ぶ）を示す。］（配列番号１８）
　糖鎖付加ＢＩＭ５１０７７は、例えば、以下の一般式（３）で表わされる。
一般式（３）
Ｈｉｓ－Ｒ２－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｘａａ１８－Ｔｙｒ－Ｘａａ２０－Ｇｌｕ－Ｘａａ２２－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｘａａ２６－Ｇｌｕ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－Ｘａａ３０－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｘａａ３４－Ｒ２－Ｘａａ３６－ＮＨ２
［式中、Ｒ２は、α－メチルアラニンを示し、
Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２０は、Ｌｅｕ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、糖鎖付加Ｃｙｓ、糖鎖付加Ａｓｎ、又は糖鎖付加Ｌｙｓを示す。
Ｘａａ３０は、Ａｌａ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、糖鎖付加Ｃｙｓ、糖鎖付加Ａｓｎ、又は糖鎖付加Ｌｙｓを示す。
Ｘａａ３６は、Ａｒｇ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１８、Ｘａａ２０、Ｘａａ２２、Ｘａａ２６、Ｘａａ３０、Ｘａａ３４及びＸａａ３６のすくなくとも１つは糖鎖付加Ｃｙｓまたは糖鎖付化Ａｓｎである。］（配列番号１９）
　本明細書において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖及び／又はその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類及び多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸並びにそれらの複合体及び誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解又は誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。糖鎖は直鎖型であっても分岐鎖型であってもよい。
　また、本明細書において、「糖鎖」には糖鎖の誘導体も含まれ、糖鎖の誘導体としては、例えば、糖鎖を構成する糖が、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ－１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ－グルコースが酸化されたＤ－グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ－グルコースが酸化されたＤ－グルクロン酸））、アミノ基又はアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミンなど）、アミノ基及びカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ－アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２－デオキシ－Ｄ－リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などである糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明において、好ましい糖鎖は、抗原性ＧＬＰ－１アナログに付加された場合（糖鎖付加アミノ酸の形で抗原性ＧＬＰ－１アナログのアミノ酸と置換された場合）に、抗原性ＧＬＰ－１アナログの抗原性を低下させ、好ましくは血中安定性を増大させ、かつ、より好ましくは血糖値抑制活性を消失させない糖鎖である。但し、抗原性を低下させる限り、血中安定性及び／又は血糖値抑制活性は、抗原性ＧＬＰ－１アナログと同等であればよい。
　本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログにおける糖鎖は特に限定されず、生体内で複合糖質（糖ペプチド（又は糖タンパク質）、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であってもよいし、生体内では複合糖質として存在しない糖鎖であってもよい。
　生体内で複合糖質として存在する糖鎖は、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログが生体に投与されるという観点から好ましい。かかる糖鎖としては、生体内で糖ペプチド（又は糖タンパク質）としてペプチド（又はタンパク質）に結合している糖鎖であるＮ－結合型糖鎖、Ｏ－結合型糖鎖等が挙げられる。好ましくは、Ｎ－結合型糖鎖が用いられる。Ｎ結合型糖鎖としては、例えば、高マンノース（ハイマンノース）型、複合（コンプレックス）型、混成（ハイブリッド）型を挙げることができ、特に好ましくは、複合型が良い。
　本発明で使用する好ましい複合型糖鎖としては、例えば、下記一般式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 ［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 を示す。Ａｃはアセチル基を示す。］
で表される糖鎖等が挙げられる。
　尚、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログにおいては、糖鎖が生体内で複合糖質として存在する糖鎖であっても、Ｏ－結合型及びＮ－結合型以外の方法で抗原性ＧＬＰ－１アナログに結合していてもよい。例えば、上述のとおり、糖鎖がリンカーを介してＣｙｓ等に結合しているものも、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログに含まれる。
　本発明の一態様において、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログにおける糖鎖は、４個以上、例えば５個以上、７個以上、特に９個以上、１１個以上の糖からなる糖鎖であることが好ましい。
　本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログにおける糖鎖は、５～１１個、９～１１個、９個、１１個の糖からなる糖鎖である。
　本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログにおける糖鎖は、２本鎖の複合型糖鎖である。複合型糖鎖とは、２種類以上の単糖を含み、以下に示す基本構造と、Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃで示されるラクトサミン構造を有することを特徴とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 　２本鎖複合型糖鎖とは、基本構造の末端の２つのマンノースに、それぞれ０～３糖からなる１本鎖の糖鎖が結合しているものをいう。２本鎖複合型糖鎖としては、例えば、以下に示すジシアロ糖鎖、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 モノシアロ糖鎖、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 アシアロ糖鎖、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 ジグルクナック糖鎖、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 ジマンノース糖鎖、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 等が好ましく、より好ましくはジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖である。
　また、本明細書において「ジシアロ糖鎖」、「モノシアロ糖鎖」、「アシアロ糖鎖」、「ジグルクナック糖鎖」、「ジマンノース糖鎖」には、上記化学式で示したもののほか、化学式で示した例と結合様式の異なるものも含まれ、かかる糖鎖も本発明の糖鎖として好ましく用いられる。かかる糖鎖としては、例えば、ジシアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖においてシアル酸とガラクトースが（α２→３）結合で結合しているもの等が挙げられる。
　また、本発明で用いられる高マンノース型糖鎖は、上述した複合型糖鎖の基本構造に、さらにマンノースが２個以上結合している糖鎖である。高マンノース型糖鎖は嵩高いので、ペプチドに高マンノース型糖鎖を結合させることにより血中安定性がより高くなりうる。哺乳類の高マンノース型糖鎖のように、５～９個のマンノースを含む糖鎖が好ましいが、酵母の高マンノース型糖鎖のように、より多くのマンノースを含む糖鎖であってもよい。本発明に好ましく用いられる高マンノース型糖鎖としては、例えば、
ハイマンノース－５（Ｍ－５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 ハイマンノース－９（Ｍ－９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 等を挙げることができる。
　本発明において、好ましい糖鎖としては、例えば、ヒト体内において、タンパク質と結合した糖タンパク質として存在する糖鎖（例えば、「ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲＳ　Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．３，Ｆｅｂ．１９７５」に記載の糖鎖）と、同一の構造を有する糖鎖（構成糖の種類及びそれらの結合様式が同一の糖鎖）又はこれの非還元末端から１又は複数の糖を失った糖鎖である、下記表２～５に記載の糖鎖を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　本発明の好ましい一態様において、本発明の糖ペプチドにおける糖鎖の構造は、均一である。本明細書において、糖ペプチドにおける糖鎖の構造が均一であるとは、糖ペプチド間で比較した場合に、ペプチド中の糖鎖付加部位、糖鎖を構成する各糖の種類、結合順序、及び糖間の結合様式が同一であることをいい、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の糖鎖の構造が均一であることを言う。糖鎖が均一である糖ペプチドは、品質が一定であり、特に医薬品の製造や、アッセイなどの分野において好ましい。均一な糖鎖の割合は、例えば、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、ＮＭＲ、質量分析等を用いた方法によって測定することが可能である。
　本発明において、好ましい糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログは、例えば、後述の実施例１～４において製造した糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログである。
　具体的には、
（ａ１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるエキセンディン－４において、３０位のＧｌｙがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログ（実施例１）（配列番号：６）；
（ａ２）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるエキセンディン－４において、３０位のＧｌｙがハイマンノース－５型糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログ（実施例２）（配列番号：７）；
（ａ３）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるリラグルチドにおいて、３０位のＡｒｇがアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログ（実施例３）（配列番号：８）；
（ａ４）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるリラグルチドにおいて、３０位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログ（実施例４）（配列番号：９）
（ａ５）配列番号：１８に記載のアミノ酸配列からなるＢＩＭ－５０１７７において、２０位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログ（実施例５）（配列番号：２１）
（製造方法）
　本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログは、当業者に公知のペプチド合成方法に、糖鎖付加工程を組み込むことで製造することができる。糖鎖付加に際しては、トランスグルタミナーゼに代表される、酵素の逆反応を利用する方法も用いることができるが、この場合、付加する糖鎖が大量に必要になる、最終工程後の精製が煩雑になる、糖鎖の付加位置及び付加可能な糖鎖が制限される、等の問題があるため、アッセイ用等の少量の合成には用いることが可能でも、医薬品製造等の大規模な製造には実用的な方法とは言えないことがある。
　本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの簡便な製造方法であって、かつ、糖鎖の構造が均一である糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの安定した製造方法の具体例として、以下、糖鎖付加アミノ酸として糖鎖付加Ａｓｎを使用し、固相合成、液相合成等の公知のペプチド合成方法を適用することにより糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを製造する方法（Ａ法）、抗原性ＧＬＰ－１アナログの任意のアミノ酸をＣｙｓで置換したペプチドを公知のペプチド合成方法に従って製造し、その後、Ｃｙｓに化学合成により糖鎖を付加し、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを製造する方法（Ｂ法）、を例示する。さらに、糖鎖付加Ａｓｎにリンカーの一端を結合した後、リンカーの他端にＮ－ヒドロキシコハク酸イミジル基を結合させ、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミジル基を抗原性ＧＬＰ－１アナログのＬｙｓ残基の側鎖アミノ基と反応させて、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを製造する方法（Ｃ法）を示す。これらの製造方法を参考に、当業者であれば様々な糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを製造することが可能であり、得られる糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログ及びその製造方法は、特に医薬品製造の分野において、非常に有用である。
　また、これらのＡ法～Ｃ法は、２つを組み合わせて用いることも可能である。アッセイなどに用いる少量の合成であれば、さらに、上記の方法に、転移酵素による糖鎖伸長反応を組み合わせることも可能である。なお、Ａ法は、国際公開第ＷＯ２００４／００５３３０号パンフレット（ＵＳ２００５２２２３８２（Ａ１））に、Ｂ法は、国際公開第ＷＯ２００５／０１００５３号パンフレット（ＵＳ２００７０６０５４３（Ａ１））に、それぞれ記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。また、Ａ法～Ｃ法において用いられる糖鎖構造が均一な糖鎖の製造に関しては、第ＷＯ０３／００８４３１号パンフレット（ＵＳ２００４１８１０５４（Ａ１））、第ＷＯ２００４／０５８９８４号パンフレット（ＵＳ２００６２２８７８４（Ａ１））、第ＷＯ２００４／０５８８２４号パンフレット（ＵＳ２００６００９４２１（Ａ１））、第ＷＯ２００４／０７００４６号パンフレット（ＵＳ２００６２０５０３９（Ａ１））、第ＷＯ２００７／０１１０５５号パンフレット等に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを製造する方法（Ａ法）
　糖鎖付加抗原ＧＬＰ－１アナログは、例えば、以下に概略を示す糖鎖付加アスパラギンを用いた固相合成によって製造することができる。
（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応させる。この場合アミノ酸のアミノ基窒素を脂溶性保護基で保護しているので、アミノ酸同士の自己縮合は防止され、レジンの水酸基とアミノ酸のカルボキシル基が反応してエステル化が起こる。
（２）得られたエステルの脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（３）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させる。
（４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（５）上記（３）及び（４）の工程を１回以上繰り返すことにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有するペプチドが得られる。
（６）最後に、酸でレジンを切断することにより、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを得ることができる。
　ここで、（１）において、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加アスパラギンを用い、当該アスパラギン部分のカルボキシル基とレジンの水酸基とを反応させれば、Ｃ末端に糖鎖付加アスパラギンを有するペプチドを得ることができる。
　また、（２）の後、又は、（３）と（４）を１回以上の任意の回数繰り返した後、（３）において、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加アスパラギンを用いれば、任意の箇所に糖鎖を付加することができる。
　また、（１）及び（３）のいずれかの工程で、２回以上、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加アスパラギンを用いれば、任意の２ヶ所以上に糖鎖が付加されたペプチドを得ることができる。
　糖鎖付加アミノ酸を結合させた後、脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、その直後に工程（６）を行えば、Ｎ末端に糖鎖付加アスパラギンを有するペプチドを得ることができる。
　水酸基を有する樹脂（レジン）としては、通常、固相合成で使用する水酸基を有する樹脂（レジン）であればよく、例えば、Ａｍｉｎｏ－ＰＥＧＡレジン（メルク社製）、Ｗａｎｇレジン（メルク社製）、ＨＭＰＡ－ＰＥＧＡレジン（メルク社製）等を用いることができる。
　また、Ｅｘ－４のようにＣ末端をアミド化する場合には、Ｒｉｎｋ－Ａｍｉｄｏ－ＰＥＧＡレジン（メルク社製）を用いることが好ましい。このレジンとペプチドを酸で切断することにより、ペプチドのＣ末端アミノ酸をアミド化することができる。
　アミノ酸としては全てのアミノ酸を用いることができ、例えば、天然アミノ酸である、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）を挙げることができる。
　脂溶性保護基としては、例えば９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等の、カーボネート系又はアミド系の保護基等を挙げることができる。アミノ酸に脂溶性保護基を導入するには、例えばＦｍｏｃ基を導入する場合には９－フルオレニルメチル－Ｎ－スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は０～５０℃、好ましくは室温で、約１～５時間程度行うのが良い。
　脂溶性保護基で保護したアミノ酸としては、市販のものも使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ－ＡＩａ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏを挙げることができる。
　エステル化触媒として、例えば１－メシチレンスルホニル－３－ニトロ－１，２，４－トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、前者１重量部に対して、後者が、通常１～１０重量部、好ましくは２～５重量部である。
　エステル化反応は、例えば、固相カラムにレジンを入れ、このレジンを溶剤で洗浄し、その後アミノ酸の溶液を加えることにより行うのが好ましい。洗浄用溶剤としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２－プロパノール、塩化メチレン等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。エステル化反応は０～５０℃、好ましくは室温で、約１０分～３０時間程度、好ましくは１５分～２４時間程度行うのが良い。
　この時固相上の未反応の水酸基を、無水酢酸等を用いてアセチル化してキャッピングすることも好ましい。
　脂溶性保護基の脱離は、例えば塩基で処理することにより行うことができる。塩基としては、例えばピペリジン、モルホリン等を挙げることができる。その際、溶媒の存在下で行うのが好ましい。溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール等を挙げることができる。
　遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とのアミド化反応は、活性化剤及び溶媒の存在下行うのが好ましい。
　活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリスピロリジノホスホニウム（ＤＩＰＣＩ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ－ＯＨ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、Ｏ－ベンゾトリアゾール－１－イル－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロジ－４－オキサ－１，２，３－ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ）等を挙げることができる。
　活性化剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１～２０当量、好ましくは１～１０当量、さらに好ましくは、１～５当量とするのが好ましい。
　溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。反応は０～５０℃、好ましくは室温で、約１０～３０時間程度、好ましくは１５分～２４時間程度行うのが良い。脂溶性保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。
　樹脂（レジン）からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。酸としては、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、弗化水素（ＨＦ）等を挙げることができる。
　このようにして、所望の位置を糖鎖付加アスパラギンで置換した糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを得ることができる。
糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを製造する方法（Ｂ法）
　糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログは、まずペプチド鎖を合成し、後で糖鎖を付加する方法によっても製造することができる。具体的には、糖鎖を付加したい位置にＣｙｓを含むペプチドを、固相合成法、液相合成法、細胞により合成する方法、天然に存在するものを分離抽出する方法等により製造する。
　次に、ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体を上記で得たＣｙｓを含むペプチドと反応させることにより、糖鎖をペプチドに結合させる。上記反応は、通常０～８０℃、好ましくは、１０～６０℃、更に好ましくは１５～３５℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常３０分～５時間程度である。反応終了後は、適宜、公知の方法（例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））で精製するのが良い。
　ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体は、例えば、複合型アスパラギン結合型糖鎖の１位の炭素に結合している水酸基を、－ＮＨ－（ＣＯ）－（ＣＨ２）ａ－ＣＨ２Ｘ（Ｘはハロゲン原子、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０～４の整数を示す。）で置換した化合物である。
　具体的には、ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体とＣｙｓ含有ペプチドとをリン酸緩衝液中、室温で反応させる。反応終了後、ＨＰＬＣで精製することにより糖鎖付加Ｃｙｓで置換した糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを得ることができる。
　なお、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログとして、糖鎖付加リラグルチドを製造する場合、Ｌｙｓ残基に脂肪酸を付加する工程が行われる。当該工程は、例えばＰａｌ－Ｇｌｕ（ＯＢｕ）－ＯＳｕを、Ｌｙｓを含むペプチドと反応させることによって行うことができる。脂肪酸付加工程は、糖鎖付加工程の前に行っても後に行ってもよい。
　糖鎖付加ＧＬＰ－１ペプチドを製造する方法（Ｃ法）
　本方法は、糖鎖を付加する抗原性ＧＬＰ－１アナログにＬｙｓ残基が含まれる場合に有用である。
　先ず、Ｌｙｓを含むペプチドを、固相合成法、液相合成法、細胞による合成、天然に存在するものを分離抽出する方法等により製造する。
　次に、糖鎖付加アミノ酸に、グルタル酸を結合させる。例えば、糖鎖付加アミノ酸をＤＭＳＯ溶液に溶解させ、この溶液に、グルタル酸－ＥＤＣ混合のＤＭＳＯ溶液を加え、室温で１日撹拌する。反応混合物を適宜希釈した後、分子量排除ゲルクロマトグラフィー等で分画することにより、α－アミノ基にグルタル酸を結合させた糖鎖付加アミノ酸を得ることができる。
　次いで、グルタル酸結合糖鎖付加アミノ酸のＤＭＳＯ溶液に、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミドのＤＭＳＯ溶液およびＥＤＣのＤＭＳＯ溶液を加え、室温で６時間撹拌した後、ＥＤＣを不活化することにより、グルタル酸結合糖鎖付加アミノ酸のＮ－ヒドロキシコハク酸イミジルエステルを合成することができる。
　続いて、抗原性ＧＬＰ－１アナログのＤＭＳＯ溶液に、ＤＩＰＥＡ及びグルタル酸結合糖鎖付加アミノ酸のＮ－ヒドロキシコハク酸イミジルエステルを加え、室温で２時間撹拌した後、グリシン水溶液を加えて反応を停止し、適宜精製することにより、抗原性ＧＬＰ－１アナログのＬｙｓ残基にグルタル酸リンカーを介して糖鎖付加アミノ酸を結合させることができる。
　抗原性ＧＬＰ－１アナログの所望の部位のアミノ酸をＬｙｓに置換したり、抗原性ＧＬＰ－１の野生型に含まれるＬｙｓ残基を他のアミノ酸で置換したりすることにより、所望の部位に糖鎖付加アミノ酸を結合させた糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを得ることが可能である。また、Ｃ法によれば、野生型抗原性ＧＬＰ－１アナログに含まれるＬｙｓに糖鎖付加する場合、ペプチド骨格が野生型と同一の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを得ることができる。
（活性）
　本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログは、ＧＬＰ－１活性を有する。本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログは、好ましくは天然型ＧＬＰ－１と同等又はそれ以上のＧＬＰ－１活性を有し、さらに好ましくは、糖鎖を付加していない抗原性ＧＬＰ－１アナログ（以下、「非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログ」という場合もある。）と比較して同等又はそれ以上のＧＬＰ－１活性を有する。
　本明細書において、「ＧＬＰ－１活性」とは、ＧＬＰ－１について公知の生理活性の一部又は全部をいう。ＧＬＰ－１は、血糖値抑制作用のほか、例えば、膵島作用として、ｃＡＭＰ合成誘導に伴うインスリン分泌、膵島保護（アポトーシス抑制）、膵島増殖、膵外作用として、食欲抑制、消化管運動抑制、カルシトニン分泌促進、虚血時の心保護作用等を有することが知られる。従って、ＧＬＰ－１活性とは、これらの作用に関連する生理活性の全部又は一部を指し、それぞれ、当業者に公知の手法を用いて測定することができる。
　例えば、ＧＬＰ－１活性のうち、血糖値抑制活性は、糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂマウス）における血糖値低下作用の測定や、経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ：Ｏｒａｌ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　Ｔｅｓｔ）における血糖値上昇抑制作用の測定などを用いて測定することができる。なお、本明細書において、「血糖値抑制」とは、血糖値の上昇を抑制すること及び血糖値を低下させることのいずれの概念も含む。特に、本明細書において、ｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖値抑制作用を「血糖値低下作用」、ＯＧＴＴにおける血糖値抑制作用を「血糖値上昇抑制作用」ということがある。
　ＯＧＴＴによる血糖値抑制活性は、マウスに強制的に糖を飲ませた際の血糖値上昇の抑制の測定によって判断することができる。例えば、まず、被験化合物を一晩絶食させたマウスに投与し、その３０分後にグルコース溶液を経口投与する。グルコース投与によりマウス血糖値は上昇し、投与後約３０分後に最大となり徐々に減少する。グルコース投与後３０分の血糖値を測定し、非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログ投与の場合の血糖値と比較することで、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの血糖値抑制作用を評価することができる。
　一方、ＯＧＴＴにおいて同程度の血糖値上昇抑制作用が確認されるときの投与量を比較することで、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの血糖値抑制活性の強さを評価することができる。例えば、非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを１０投与した場合と、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを１投与した場合で同じ血糖値抑制作用が得られる場合、該糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの血糖値抑制活性は、非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの１０倍である。
　ｄｂ／ｄｂマウスを用いた血糖値抑制活性は、糖尿病マウスに被験化合物を投与後の血糖値の測定によって判断することができる。被験化合物投与後の血糖値を経時的に測定し、例えば投与後１２０分の血糖値が投与時より低下していれば、血糖値低下作用を確認することができる。また、例えば投与後３００分の血糖値を測定することで、血糖値低下作用の持続性も判断することができる。
　なお、血糖値抑制活性が非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログと比較して低い場合あっても、血中安定性が増大することで、この活性の低さを補償することができる。
　例えば、ＧＬＰ－１活性のうち、インスリン分泌活性は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのｃＡＭＰ合成能試験などを用いて測定することができる。ＧＬＰ－１はＧＬＰ－１受容体と結合することにより細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させ、インシュリン分泌を促進させる。従って、例えば、マウスＧＬＰ－１受容体発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞を糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログで刺激し、細胞内で合成されるｃＡＭＰ量を測定し、ＥＣ５０値を非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログと比較することで、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログのインスリン分泌活性を評価することができる。
　本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの血中安定性は、好ましくは天然型のＧＬＰ－１と同等又はそれ以上であり、さらに好ましくは非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログと同等又はそれ以上である。血中安定性は当業者に公知の手法を用いて測定することができ、例えば、血漿中における安定性や、ＤＰＰ－ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）に対する耐性を測定し、半減期、ＡＵＣ（薬物血中濃度－時間曲線下面積）等を指標に判断することができる。また、腎クリアランスの増大も血中安定性の増大に寄与する。
　本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの血漿中における安定性は、好ましくは天然型ＧＬＰ－１と同等又はそれ以上であり、さらに好ましくは非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログと同等又はそれ以上である。
　ＤＰＰ－ＩＶに対する耐性は、例えば、ＤＰＰ－ＩＶ溶液中における半減期の測定により判断することができる。本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログは、非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログと比較して、ＤＰＰ－ＩＶに対する耐性は同等又はそれ以上である。
　また、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログは、好ましくは少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも３、５、７、１０、１５、２０時間及びさらに好ましくは少なくとも２４時間の血中半減期を有する。
　本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログは、非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログと比較して、その抗原性が低下している。抗原性の低下は、例えば、マウスを糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログ又は非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログで感作し、それぞれのマウスの血中の抗ＧＬＰ－１アナログ抗体価を測定して比較することにより、評価することができる。
　本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの抗原性は、非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログと比較して、好ましくは約２分の１以下、より好ましくは約３分の１以下、さらに好ましくは約４分の１程度に低下している。
（医薬組成物）
　次に、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを有効成分として含有する医薬組成物について説明する。
　本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを有効成分として含有する医薬組成物は、ＧＬＰ－１に関連する疾患の治療又は予防に有効である。上述の通り、ＧＬＰ－１には種々の作用が知られており、これらの作用に関連する疾患も様々である。例えば、ＧＬＰ－１が、インスリン放出を刺激することにより、細胞によるグルコース取り込み及び血糖値の低下を引き起こすことが見出されている。また、胃及び／又は腸運動性を抑制すること、胃及び／又は腸内容排出を抑制すること並びに食物摂取を抑制することも見出されている。従って、ＧＬＰ－１に関連する疾患には、例えば、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、インスリン依存性糖尿病、脳卒中（Ｅｆｅｎｄｉｃによる国際公開公報第ＷＯ００／１６７９７号パンフレットを参照）、心筋梗塞（Ｅｆｅｎｄｉｃによる国際公開公報第ＷＯ９８／０８５３１号パンフレットを参照）、肥満（Ｅｆｅｎｄｉｃによる国際公開公報第ＷＯ９８／１９６９８号パンフレットを参照）、機能性消化不良、過敏性腸症候群（Ｅｆｅｎｄｉｃによる国際公開公報第ＷＯ９９／６４０６０号パンフレットを参照）、膵島移植が含まれる。本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを有効成分として含有する医薬組成物は、特に糖尿病の治療又は予防に有効であり、より特定すれば、１型糖尿病の予防、２型糖尿病の治療に有効である。
　上記医薬組成物は、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を用いて、通常の医薬組成物の形態に製剤したものである。
　このような医薬組成物としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤等が挙げられる。
　医薬組成物中に含有される本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの量は、特に限定されず広い範囲内から適宜選択することができるが、通常、医薬組成物中に本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを１～７０重量％含有させるのが好ましい。
　本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを有効成分として含有する医薬組成物は、さらに他の有効成分を含有することもできるし、他の有効成分を含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。また、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを有効成分として含有する医薬組成物は、さらに異なる１以上の本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを有効成分として含有することもできるし、異なる１以上の本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログを有効成分として含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。
　本発明に係る医薬組成物の投与方法としては特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、疾患の状態、その他の条件に応じた方法で投与される。錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤の場合の投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。また、注射剤の場合には、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して、静脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内に投与することができる。坐剤の場合には、直腸内に投与される。
　上記医薬組成物の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、通常、体重１ｋｇに対して本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログが０．１～９００ｎｍｏｌ、好ましくは１～９０ｎｍｏｌとなる投与量である。本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログは非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログに比べ、抗原性が低いので投与量を増やしても比較的安全性が高い。
　上記医薬組成物の投与回数は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、例えば、３回／１日、２回／１日、１回／１日、さらにはその血中安定性に応じて、より頻度の少ない投与回数（例えば、１回／週、１回／月など）も選択しうる。好ましくは、上記医薬組成物の投与回数は、１回以下／１日である。
　本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログに付加された糖鎖は、体内の代謝系で容易に分解される。また、本発明の一態様において、該糖鎖は生体内で糖ペプチド（又は糖タンパク質）として結合して存在する構造を有する。従って、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログ及び該ペプチドを有効成分として含む医薬組成物は、生体内に投与しても副作用や抗原性を示すことがなく、アレルギー反応や、抗体産生により薬効が得られなくなる心配が少ないなどの利点を有する。
　さらに、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログは安定して簡便に大量に供給することが可能であり、品質の安定した、高品質の医薬品の提供という観点からも、非常に有用である。
　本発明はまた、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ－１アナログの有効量を投与することを特徴とする、ＧＬＰ－１に関連する疾患の治療又は予防方法も提供する。
　なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
　第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
　以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
　以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが何らこれらに限定されるものではない。
実施例１　３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加エキセンディン－４（配列番号：６）の合成法
　後述する合成例１により合成したＥｘ－４（配列番号：１０；配列番号：２に示すＥｘ－４のアミノ酸配列の３０位のＧｌｙがＣｙｓで置換された３９残基のペプチド）１２．０ｍｇと、下記式（ａ）で示すブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（大塚化学株式会社製）３６ｍｇを１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４、５ｍＭトリスカルボキシエチルホスフィン　１ｍＬ中、３７℃で１時間反応させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 　そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　８ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→５０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、エキセンディン－４の３０位のＧｌｙがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加エキセンディン－４を１０．６ｍｇ得た。（Ｍ：Ｃ２７１Ｈ４２２Ｎ５８Ｏ１２３Ｓ　ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　Ｍａｓｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｆｏｒ　［Ｍ＋Ｈ］＋６４９３．６３，ｆｏｕｎｄ　６４９４．３３）
実施例２　３０位Ｃｙｓ－ハイマンノース－５型糖鎖付加エキセンディン－４（配列番号：７）の合成法
　後述する合成例１により合成したＥｘ－４（配列番号：１０；配列番号：２に示すＥｘ－４のアミノ酸配列の３０位のＧｌｙがＣｙｓで置換された３９残基のペプチド）１．２ｍｇと、後述する合成例２で合成したブロモアセチル化した下記式（ｂ）で示すＭ５糖鎖３．９ｍｇを、３５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４、１ｍＭトリスカルボキシエチルホスフィン　０．１７ｍＬ中、３７℃で３時間反応させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 　そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→５０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、エキセンディン－４の３０位のＧｌｙが高マンノース型Ｍ５糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加エキセンディン－４を０．５ｍｇ得た。（Ｍ：Ｃ２３３Ｈ３６２Ｎ５４Ｏ９７Ｓ　ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　Ｍａｓｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｆｏｒ［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋５５０４．７４，ｆｏｕｎｄ　５５０６．８５）
実施例３　３０位Ｃｙｓ－アシアロ糖鎖付加リラグルチド（配列番号：８）の合成
（１）２８位Ａｒｇ，３０位Ｃｙｓ　ＧＬＰ－１（配列番号：１１）の合成
　Ｆｍｏｃ法によるによるペプチド固相合成法にて合成し、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　８ｍｌ／ｍｉｎ；Ｂ液２０→９５％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製した。
（２）２８位Ａｒｇ，３０位Ｃｙｓ－アシアロ糖鎖付加ＧＬＰ－１（配列番号：１２）の合成
　合成した２８位Ａｒｇ，３０位Ｃｙｓ　ＧＬＰ－１（７－３７）２１．９ｍｇと下記式に示すアシアロブロモアセチル糖鎖４０．３ｍｇ，水１．３ｍＬを１００ｍＭ　ＴＣＥＰ　６０μＬ，２００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ　７．５　７００μＬ中、３７℃で７時間反応させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 　そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　８ｍｌ／ｍｉｎ；Ｂ液２０→９５％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、２８位Ａｒｇ，３０位Ｃｙｓ－アシアロ糖鎖付加ＧＬＰ－１（７－３７）を２０．８ｍｇ得た。
（３）３０位Ｃｙｓ－アシアロ糖鎖付加リラグルチド（配列番号：８）の合成
　（２）で合成した２８位Ａｒｇ，３０位Ｃｙｓ－アシアロ糖鎖付加ＧＬＰ－１（７－３７）７．０ｍｇとＰａｌ－Ｇｌｕ（ＯＢｕ）－ＯＳｕ（特表２００２－５１２１７５号公報、例３３参照）５．０ｍｇをＤＩＰＥＡ４．６μＬ，ＮＭＰ３００μＬ、水２００μＬ中で５分反応させた。Ｇｌｙ水溶液（Ｇｌｙ　６ｍｇ，水１００μＬ，ＥｔＯＨ　１００μＬ）を加え、ＨＰＬＣ［カラム：Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ－ＣＮ、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　１．０ｍｌ／ｍｉｎ；Ｂ液４０→５５％　１５ｍｉｎ　６５℃　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、凍結乾燥した（４．３ｍｇ）。
　得られた凍結乾燥品の中から１．１ｍｇをＴＦＡ処理した後、再度ＨＰＬＣ同条件で精製し（図１）、リラグルチドの３０位のＡｒｇがアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換された３０Ｃｙｓアシアロ糖鎖付加リラグルチドを０．８ｍｇ得た。（ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　Ｍａｓｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｆｏｒ［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋５３７９．６８，ｆｏｕｎｄ　５３７８．４２）
実施例４　３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加リラグルチド（配列番号：９）の合成
（１）２８位Ａｒｇ，３０位Ｃｙｓ（ａｃｍ）ＧＬＰ－１（配列番号：１３）の合成
　Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて合成し、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　８ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液２０→９５％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製した。
（２）３０位Ｃｙｓリラグルチドの合成
　（１）で得られたペプチド１０．４ｍｇとＰａｌ－Ｇｌｕ（ＯＢｕ）－ＯＳｕ（特表２００２－５１２１７５号公報、例３３参照）９．０ｍｇをＤＩＰＥＡ１０．９μＬ，ＮＭＰ　６００μＬ、水３００μＬ中で１０分反応させた。Ｇｌｙ水溶液（Ｇｌｙ　２９ｍｇ，　水４００μＬ，ＥｔＯＨ　２００μＬ）を加え、ＨＰＬＣ［カラム：Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ－ＣＮ、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　１．０ｍｌ／ｍｉｎ；Ｂ液４８－５５（７ｍｉｎ）－６５（８ｍｉｎ）－１００（９ｍｉｎ），１５ｍｉｎ　６５℃　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、凍結乾燥した。
　得られたペプチド８．２ｍｇのうち５．２ｍｇをＴＦＡ処理した後、ＨＰＬＣ［カラム：Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ－ＣＮ、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　１．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液４５－４７（１ｍｉｎ）－５０（７ｍｉｎ）－９５（８ｍｉｎ），１４ｍｉｎ　６５℃　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、凍結乾燥した（３．２ｍｇ）。
　凍結乾燥品３．２ｍｇを２．５ｍＭ９０％酢酸銀水溶液（１６０μＬ）に溶解させ、室温にて２時間撹拌した。ジチオスレイトール（３．８ｍｇ）を加え、ＨＰＬＣ［カラム：Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ－ＣＮ、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　１．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液４５－４８（１ｍｉｎ）－５０（７ｍｉｎ）－９５（８ｍｉｎ），１４ｍｉｎ，６５℃　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し（図２）、凍結乾燥し、リラグルチドの３０位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたペプチド（配列番号：１４）を２．９ｍｇ得た。
（３）３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加リラグルチド（配列番号：９）の合成
　（２）で得られた３０位Ｃｙｓリラグルチド１．６ｍｇ、下記式で示されるジシアロブロモアセチル糖鎖２０．０ｍｇ、水　２５０μＬを１００ｍＭ　ＴＣＥＰ　４０μＬ，２００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ７．５　４８０μＬ中、３７℃で６時間反応させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 　９時間後、そのままＨＰＬＣ［カラム：Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ－ＣＮ、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　１．０　ｍｌ／ｍｉｎ；Ｂ液４２－４３（３ｍｉｎ）－５２（４ｍｉｎ）－６１（７ｍｉｎ）－９５（８ｍｉｎ），１４ｍｉｎ，６５℃　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し（図３）、下記式に示す、リラグルチドの３０位Ａｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換された３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加リラグルチド２．３ｍｇを得た。（ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　Ｍａｓｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｆｏｒ　［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋５９６２．１９，ｆｏｕｎｄ　５９６３．０４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 　親油性置換基のＬｙｓ（Ｋ２０）への結合部位は、下記のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
実施例５　２０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加ＢＩＭ５１０７７（配列番号：２１）の合成
　合成例３にて合成したＢＩＭ５１０７７の２０位のＬｙｓがＣｙｓで置換された３０残基のペプチド（配列番号：２０）（２．４ｍｇ，０．７２μｍｏｌ）およびグアニジン（２１６ｍｇ）を蒸留水（２４０μＬ）に溶解し、順次ＴＣＥＰ水溶液（１００ｍＭ、１００μＬ）、下記式（ａ）で示すブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（１０ｍｇ／ｍＬ，１００μＬ，４．２６μｍｏｌ）ならびに、５００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４，１００μＬ）を加えた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 　３７℃で２時間反応させた後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＢＩＭ５１０７７の２０位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＢＩＭ５１０７７ペプチド（配列番号：２１）を１．９ｍｇ得た。（ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　Ｍａｓｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｆｏｒ［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋５５７８．７２，ｆｏｕｎｄ　５５７８．７４）
比較例１　エキセンディン－４（配列番号：２）の合成
　固相合成用カラムにＲｉｎｋ－Ａｍｉｄｏ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）をＤＭＦで洗浄後、ペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を０．４５Ｍ　ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ　ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｏｍｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＳｅｒ（ｔＢｕ）－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｍｅｔ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３９残基ペプチドを得た（配列番号：１５）。
　得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８　５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、Ｅｘ－４の３９残基のペプチド（配列番号：２）が得られた。
比較例２　ＧＬＰ－１（配列番号：１）の合成
　固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（１００μｍｏｌ）を入れ、ＤＣＭ、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４－ヒドロキシメチル－３－メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）、Ｎ－エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。
　Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）とＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。
　攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮＭＰ（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５ＭＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に，固相合成用カラムに加え、続いて０．９ＭＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｖａｌ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ａｌａ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号：１６）。
　ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、３１残基のペプチド５μｍｏｌ相当の樹脂をエッペンチューブに移した。
　得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ　ｃｏｌｕｍｎ　Ｃ１８　１００×１０ｍｍ　展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液　Ｂ：０．１％ＴＦＡ　アセトニトリル：水＝９０：１０　グラジエントＡ：Ｂ＝９５：５→５：９５　１５分　流速３．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し、ＧＬＰ－１（配列番号：１）を得た。
比較例３　リラグルチド（配列番号：３）の合成
　リラグルチドの調製は特表ＪＰ２００２－５１２１７５　例３４の方法に従い下記の手順にて実施した。
　Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて合成し、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　８ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液２０→９５％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製した。
　得られたペプチド１０．４ｍｇとＰａｌ－Ｇｌｕ（ＯＢｕ）－ＯＳｕ（９．０ｍｇ）をＤＩＰＥＡ１０．９μＬ，ＮＭＰ　６００μＬ、水３００μＬ中で１０分反応させた。Ｇｌｙ水溶液（Ｇｌｙ　２９ｍｇ，水４００μＬ，ＥｔＯＨ　２００μＬ）を加え、ＨＰＬＣ［カラム：Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ－ＣＮ、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　１．０ｍｌ／ｍｉｎ；Ｂ液４８－５５（７ｍｉｎ）－６５（８ｍｉｎ）－１００（９ｍｉｎ），１５ｍｉｎ　６５℃］で精製した後、凍結乾燥した。
　得られた保護脂質化ペプチドをＴＦＡ処理した後、ＨＰＬＣ［カラム：Ｚｏｒｂａｘ　３００ＳＢ－ＣＮ、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　１．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液４５－４７（１ｍｉｎ）－５０（７ｍｉｎ）－９５（８ｍｉｎ），１４ｍｉｎ，６５℃］で精製した後、凍結乾燥することにより、リラグルチド（配列番号：３）を得た。（ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　Ｍａｓｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｆｏｒ［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋３７４９．９５，ｆｏｕｎｄ　３７５０．９７）
合成例１　エキセンディン－４の３０位がＣｙｓで置換されたペプチドの合成法
　固相合成用カラムにＲｉｎｋ－Ａｍｉｄｏ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）をＤＭＦで洗浄後、ペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を０．４５Ｍ　ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ　ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｏｍｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、
固相樹脂にＳｅｒ（ｔＢｕ）－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｍｅｔ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）
の３９残基ペプチドを得た（配列番号：１７）。
　得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８　５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％　２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、Ｅｘ－４の３０位のＧｌｙがＣｙｓで置換された３９残基のペプチドが得られた。（ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　Ｍａｓｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］＋４２３０．６０，ｆｏｕｎｄ　４２３１．２７）（配列番号：１０）
合成例２　ブロモアセチル化したＭ５糖鎖の合成法
　大豆パウダー１００ｇを、５００ｍｌのアセトンで２回、５００ｍｌのメタノールで２回洗浄し脱脂大豆パウダー６１．４ｇを得た。
　得られた脱脂大豆パウダー４３．０ｇに水４３０ｍｌ、液化酵素Ｔ（ＨＢＩ社製）４．３ｇを加え、撹拌しながら７０℃で１９時間反応させた。反応液を遠心分離（１００００Ｇ、１０分）して上清と沈殿物に分け、上清８００ｍｌを得た。さらに沈殿物に水４３０ｍｌ、液化酵素Ｔ４．３ｇを加えて再度７０℃で１９時間反応させ、反応液を遠心分離（１００００Ｇ、１０分）して上清と沈殿物に分け、上清６００ｍｌを得た。
　得られた上清を合わせ（計１４００ｍｌ）、５００ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０を１００ｍｌ、オリエンターゼＯＮＳ（ＨＢＩ社製）３．０ｇを加え、撹拌しながら５０℃で１９時間反応を行った。反応後の液をろ過して不溶物を除き、ロータリーエバポレーターにて液量が４００ｍｌになるまで濃縮した。得られた液を分画分子量１Ｋの限外ろ過膜（Ｍｉｎｉｍａｔｅ　ＴＦＦ　Ｃａｐｓｕｌｅ　１Ｋ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ポール社製）を用いて限外ろ過を行った。
　６時間の処理の後、膜を透過しなかった液２３０ｍｌを回収した。回収した液に１Ｍトリス－塩酸緩衝液ｐＨ８．０を２０ｍｌ、アジ化ナトリウム２５０ｍｇ、アクチナーゼＥ（科研製薬社製）４２３．５ｍｇを加え３７℃で８２時間反応させた。反応液をろ過して不溶物を除いた後、ロータリーエバポレーターにて液量が１００ｍｌになるまで濃縮した。濃縮液を半分ずつ２回にわけてＳｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ２５（φ２５ｍｍ×１００ｍｍ）カラムにて分画し、糖鎖含有画分のみを集めて濃縮し２．２２ｇを得た。
　得られた糖鎖含有画分に蒸留水２１．０ｍｌ、エタノール１４．９ｍｌを加えて溶かし、炭酸水素ナトリウム１．１３ｇ、Ｆｍｏｃ－ＯＳｕ　２．０２ｇを加え室温で１６時間反応させた。反応後アセトン２５０ｍｌを加え沈殿物をメンブレンフィルター（φ４７ｍｍ、保持粒子経０．５μｍ　アドバンテック東洋社製）でろ過した。膜上に残った不溶物を蒸留水に溶かして回収し、ロータリーエバポレーターにて液量が１０ｍｌ以下になるまで濃縮した。濃縮液をＳｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ２５（φ２５ｍｍ×１００ｍｍ）カラムにて分画し、糖鎖含有画分を集めて濃縮し１．３７ｇを得た。
　これをさらに蒸留水４ｍｌに溶かしてＯＤＳカラム（ワコーゲル１００Ｃ１８、φ２５ｍｍ×１５０ｍｍ）にて分画し、糖鎖含有画分のみを集めて濃縮し、粗精製糖鎖４８．６ｍｇを得た。粗精製糖鎖をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ－ＰａｃｋＯＤＳ－ＡＭ　φ２０×２５０ｍｍ、溶離液：アセトニトリル／２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液＝８２／１８、流速：８．０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、ハイマンノース型Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖鎖（Ｍ５糖鎖）１３．０ｍｇを得た。
　得られたＭ５糖鎖１１．０ｍｇに水１６５μｌを加えて溶かした。この溶液に炭酸水素アンモニウム２００ｍｇを加え室温で４１時間処理した後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品に炭酸水素ナトリウム１２．５ｍｇ、水１１０μｌを加え、予め１０μｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた無水ブロモ酢酸（アルドリッチ社製）１９．９ｍｇを加え、氷冷しながら１時間反応させた。１時間後、反応系を室温に戻しさらに１時間反応させた後、ゲルろ過にて精製を行い、以下に示すブロモアセチル化Ｍ５糖鎖（ｂ）７．９ｍｇを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
合成例３　ＢＩＭ５１０７７の２６位がＣｙｓで置換されたペプチドの合成法
　固相合成用カラムにＲｉｎｋ－Ａｍｉｄｏ－ＰＥＧＡ　ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）をＤＭＦで洗浄後、ペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を０．４５Ｍ　ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ　ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。
　Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ－Ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ　Ａｃｉｄ（Ａｉｂ），Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ａｌａ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ－Ａｉｂ，Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂上にＡｒｇ（Ｐｂｆ）－Ａｉｂ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｖａｌ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ａｉｂ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３０残基ペプチドを得た（配列番号２２）。
　得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ　ＵＧ－１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ　８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％２０ｍｉｎ　ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＢＩＭ５１０７７の２０位のＬｙｓがＣｙｓで置換された３０残基のペプチド１２ｍｇが得られた。（ＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ　Ｍａｓｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｆｏｒ［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋３３１５．６９，ｆｏｕｎｄ　３３１４．７２）（配列番号２０）
試験例１　糖鎖付加によるエキセンディン－４の抗原性低下作用の確認
　マウスに非糖鎖付加エキセンディン－４あるいは３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加エキセンディン－４を感作し、血中の抗エキセンディン－４抗体濃度を比較することにより、糖鎖付加がエキセンディンの抗原性に与える効果を検証した。
　初回免疫として、実施例１で合成した３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加エキセンディン－４及び非糖鎖付加エキセンディン－４（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と充分に混合してエマルジョンとし、ｂａｌｂ／ｃマウス（雌、７週齢）に腹腔内に投与した。
　１４日目に、Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と充分に混合することによりエマルジョン化した糖鎖付加エキセンディン－４又は非糖鎖付加エキセンディン－４を、Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌、７週齢）に皮下投与し、追加免疫とした。
　追加免疫から７日後にマウスから血漿を採取した。血漿中の抗エキセンディン－４抗体濃度は、市販の抗エキセンディン－４抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙｓｈｏｐ）を標準品としたＥｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。
　５０μｇの非糖鎖付加エキセンディン－４を９６穴ＥＬＩＳＡプレートに添加し、３７℃、２時間インキュベートした。プレートは０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４（洗浄バッファー）で３回洗浄し、０．５％ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ含有洗浄バッファーで４℃、１晩ブロッキングした。ブロッキング後のプレートを３回洗浄した後、血漿サンプルをＰＢＳで希釈することにより作製された希釈系列を添加し、３７℃、２時間インキュベートした。洗浄バッファーを用いて３回洗浄されたプレートに５０μＬのｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧを添加し、３７℃、２時間インキュベートした。プレートは洗浄バッファーを用いて３回洗浄し、１００μＬのＡＢＴＳ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加し発色させた。発色反応は２０％ＳＤＳを添加することによって停止し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。抗エキセンディン－４抗体の濃度は抗エキセンディン－４モノクローナル抗体を標準品として決定した。結果を図４に示す。
　糖鎖付加の非糖鎖付加エキセンディン－４を免疫したマウスでは抗体産生が強く誘導され、その血漿中濃度は７０７±６８．２ｍｇ／ｍＬであった。これに対し、３０位－Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加エキセンディン－４を免役したマウスの血漿中抗エキセンディン－４抗体濃度は非糖鎖付加エキセンディン－４を免疫した場合に比べて約４分の１（１７８．８±２２．３ｍｇ／ｍＬ）に低下し、有意な抗原性低下作用を示した（ｐ<０．００１，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔ）。
試験例２　糖鎖付加エキセンディン－４の経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ：Ｏｒａｌ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　Ｔｅｓｔ）
　実施例１で合成した３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加エキセンディン－４、若しくは比較例１で合成した非糖鎖付加エキセンディン－４のＰＢＳ溶液（０．９ｎｍｏｌ／１０ｍｌ）、又は比較例２で製造したＧＬＰ－１のＰＢＳ溶液（９ｎｍｏｌ／１０ｍｌ）を、一晩絶食させたＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウス（１０週齢、雄）に１０ｍｌ／ｋｇの投与量で腹腔内に投与した。
　３０分後にグルコース溶液を１ｍｇ／ｇの投与量で経口投与した。グルコース投与前、グルコース投与３０分後、６０分後、１２０分後に眼窩採血を行い、アキュチェックアビバ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて血糖値を測定した。同様に、非糖鎖付加リラグルチドもｄｂ／ｄｂマウスに投与し、経時的に血糖値を測定して３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加リラグルチドの作用と比較した。結果を図５に示す。
　３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加エキセンディン－４及び非糖鎖付加エキセンディン－４は同等の効果を示し、いずれもＶｅｈｉｃｌｅ（ＰＢＳのみ）及びＧＬＰ－１より高い血糖上昇抑制作用を示した。
試験例３　ｄｂ／ｄｂマウスを使用した糖鎖付加エキセンディン－４の血糖値低下作用の確認
　実施例１で合成した３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加エキセンディン－４のＰＢＳ溶液（９ｎｍｏｌ／１０ｍＬ）を、ＢＫＳ．Ｃｇ－＋Ｌｅｐｒｄｂ／＋Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊｃｌマウス（１０週齢、雄）に１０ｍＬ／ｋｇの投与量で腹腔内に投与した。化合物投与前、３０分後、６０分後、１２０分、２４０分後に眼窩採血を行い、アキュチェックアビバ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて血糖値を測定した。
　血糖値低下作用を、比較例１で合成した非糖鎖付加エキセンディン－４と比較した。結果を図６に示す。
　非糖鎖付加エキセンディン－４の血中安定性は高く、投与後３０分で強い血糖値低下作用を示し、その効果が２４０分後まで持続した。３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加エキセンディン－４は非糖鎖付加エキセンディン－４と同等の血糖値低下作用と持続性を示し、エキセンディン－４の３０位のアミノ酸への糖鎖付加の影響は検出されなかった。
　試験例１、２及び３の結果から、非糖鎖付加エキセンディン－４の３０位への糖鎖付加はエキセンディン－４の薬理作用に影響を与えることなく、非糖鎖付加エキセンディン－４の抗原性を低下させる有効な方法であると考えられた。
試験例４　糖鎖付加リラグルチドの経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ：Ｏｒａｌ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　Ｔｅｓｔ）
　実施例４で製造した３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加リラグルチド、比較例２で製造したＧＬＰ－１若しくは比較例３で製造したリラグルチドのＰＢＳ溶液（９ｎｍｏｌ／１０ｍｌ）、又はＰＢＳ溶液を、一晩絶食させたＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウス（１０週齢、雄）に１０ｍｌ／ｋｇの投与量で腹腔内に投与した。
　３０分後にグルコース溶液を１ｍｇ／ｇの投与量で経口投与した。グルコース投与前、グルコース投与３０分後、６０分後、１２０分後に眼窩採血を行い、アキュチェックアビバ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて血糖値を測定した。結果を図７に示す。
　３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加リラグルチド及び非糖鎖付加リラグルチドのいずれもＶｅｈｉｃｌｅ（ＰＢＳのみ）及びＧＬＰ－１より高い血糖上昇抑制作用を示したが、３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加リラグルチドは、非糖鎖付加リラグルチドに比較して、更に高い血糖値上昇抑制作用を示した。
試験例５　糖鎖付加リラグルチドのｄｂ／ｄｂマウスを使用した血糖値上昇抑制作用試験
　実施例４で製造した３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加リラグルチドのＰＢＳ溶液（９ｎｍｏｌ／１０ｍＬ）を、ＢＫＳ．Ｃｇ－＋Ｌｅｐｒｄｂ／＋Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊｃｌマウス（ｄｂ／ｄｂマウス、１０週齢、雄）に１０ｍＬ／ｋｇの投与量で腹腔内に投与した。化合物投与前、３０分後、６０分後、１２０分、２４０分、４８０分、７２０分後に眼窩採血を行い、アキュチェックアビバ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて血糖値を測定した。同様に、非糖鎖付加リラグルチドもｄｂ／ｄｂマウスに投与し、経時的に血糖値を測定して３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加リラグルチドの作用と比較した。結果を図８に示す。
　３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加リラグルチドの血中安定性は高く、投与後３０分で強い血糖値低下作用を示し、その効果が１２時間後まで持続した。３０位Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加リラグルチドは非糖鎖付加リラグルチドと同等の血糖値低下作用と持続性を示し、リラグルチドの３０位のアミノ酸への糖鎖付加の影響は検出されなかった。
配列表フリーテキスト
　配列番号：１は、ＧＬＰ－１である。
　配列番号：２は、エキセンディン－４である。
　配列番号：３は、リラグルチドである。
　配列番号：４は、糖鎖付加エキセンディン－４の一般式である。
　配列番号：５は、糖鎖付加リラグルチドの一般式である。
　配列番号：６は、３０位のＧｌｙがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換されたエキセンディン－４である。
　配列番号：７は、３０位のＧｌｙがハイマンノース－５型糖鎖付加Ｃｙｓで置換されたエキセンディン－４である。
　配列番号：８は、３０位のＡｒｇがアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換されたリラグルチドである。
　配列番号：９は、３０位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換されたリラグルチドである。
　配列番号：１０は、３０位のＧｌｙがＣｙｓで置換されたエキセンディン－４である。
　配列番号：１１は、２８位ＬｙｓがＡｒｇで、３０位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたＧＬＰ－１ペプチドである。
　配列番号：１２は、２８位のＬｙｓがＡｒｇで、３０位のＡｒｇがアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換されたＧＬＰ－１である。
　配列番号：１３は、２８位のＬｙｓがＡｒｇで、３０位のＡｒｇがＣｙｓ（ａｃｍ）で置換されたＧＬＰ－１である。
　配列番号：１４は、３０位－のＡｒｇがＣｙｓで置換されたリラグルチドである。
　配列番号：１５は、比較例１で合成された保護基を有するペプチドである。
　配列番号：１６は、比較例２で合成された保護基を有するペプチドである。
　配列番号：１７は、合成例１で合成された保護基を有するペプチドである。
　配列番号：１８は、ＢＩＭ－５１０７７である。
　配列番号：１９は、糖鎖付加ＢＩＭ－５１０７７の一般式である。
　配列番号：２０は、２０位のＬｙｓがＣｙｓで置換されたＢＩＭ－５１０７７である。
　配列番号：２１は、２０位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換されたＢＩＭ－５１０７７である。
　配列番号：２２は、合成例３で合成された保護基を有するペプチドである。

Claims (21)

  1. 　抗原性ＧＬＰ－１アナログの少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換され、ＧＬＰ－１活性を有する、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体。
  2. 　請求項１に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎ又は糖鎖付加Ｃｙｓである、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体。
  3. 　請求項１又は２に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が４個以上の糖からなる糖鎖である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が２本鎖複合型糖鎖である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体。
  6. 　請求項５に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖、及びジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体。
  7. 　請求項５に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
    で表される糖鎖である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記抗原性ＧＬＰ－１アナログがエキセンディン－４である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体。
  9. 　請求項８に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、糖鎖付加アミノ酸で置換された部位が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における３０位である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体。
  10. 　請求項８に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、
    　配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、３０位のＧｌｙが糖鎖付加Ｃｙｓに置換されており、
    　前記糖鎖が、下記式で示されるジシアロ糖鎖
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     であり、
    　前記糖鎖付加Ｃｙｓにおいて、前記糖鎖と前記Ｃｙｓとがリンカーを介して結合している、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体。
  11. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記抗原性ＧＬＰ－１アナログがリラグルチドである、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体。
  12. 　請求項１１に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖付加アミノ酸で置換された部位が、配列番号：３に記載のアミノ酸配列における３０位である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体。
  13. 　請求項１１に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、
    　配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、３０位のＡｒｇが糖鎖付加Ｃｙｓに置換されており、
    　前記糖鎖が、下記式で表わされるジシアロ糖鎖、又は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     下記式で表わされるアシアロ糖鎖
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     であり、
    　前記糖鎖付加Ｃｙｓにおいて、前記糖鎖と前記Ｃｙｓとがリンカーを介して結合している、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体。
  14. 　請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が実質的に均一である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体。
  15. 　請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が９９％以上均一である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体。
  16. 　請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、糖鎖を付加していない抗原性ＧＬＰ－１アナログに比較して抗原性が２分の１以下である、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体。
  17. 　請求項１～１６のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体であって、糖鎖を付加していない抗原性ＧＬＰ－１アナログより抗原性が低下し、天然型ＧＬＰ－１よりＧＬＰ－１活性が上昇している、抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体。
  18. 　請求項１～１７のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体を有効成分として含む医薬組成物。
  19. 　請求項１８に記載の医薬組成物であって、ＧＬＰ－１に関連する疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
  20. 　請求項１９に記載の医薬組成物であって、前記ＧＬＰ－１に関連する疾患が糖尿病である医薬組成物。
  21. 　請求項１～１７のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ－１アナログの糖鎖付加体の有効量を投与することを特徴とする、ＧＬＰ－１に関連する疾患の治療又は予防方法。
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