WO2011052013A1 - 核酸鎖の結合および修飾方法 - Google Patents

核酸鎖の結合および修飾方法 Download PDF

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WO2011052013A1
WO2011052013A1 PCT/JP2009/005755 JP2009005755W WO2011052013A1 WO 2011052013 A1 WO2011052013 A1 WO 2011052013A1 JP 2009005755 W JP2009005755 W JP 2009005755W WO 2011052013 A1 WO2011052013 A1 WO 2011052013A1
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nucleic acid
acid strand
strand
rna
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PCT/JP2009/005755
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English (en)
French (fr)
Inventor
加藤俊行
恩田昌明
Original Assignee
株式会社バイオダイナミクス研究所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to a method for binding a 3 'hydrosyl group of a first nucleic acid strand and a 5' phosphate group of a second nucleic acid strand, and a method for modifying the second nucleic acid strand thereby.
  • Non-Patent Document 1 the 3 'end of the RNA strand is modified using a non-radioactive isotope.
  • a non-radioactive isotope since a non-radioactive isotope is used, an experiment can be performed safely.
  • RNA biosynthesis extends from the 5 ′ end to the 3 ′ end, an extension reaction can be performed on the modified RNA strand. It becomes impossible.
  • Non-Patent Document 2 the 5 ′ end is modified with T4 polynucleotide kinase, but at the same time, the radioactive isotope [ ⁇ - 32 P] ATP must be used. Therefore, a dedicated facility is required, and a large burden is imposed on the disposal of radioactive waste. Also, a technique that is familiar with handling is necessary from the viewpoint of safety.
  • Patent Document 1 In order to solve such a problem, in recent years, by using a technique such as Non-Patent Documents 3 and 4 or Patent Document 1, a modified strand prepared in advance is bound to a target nucleic acid strand. Techniques for modifying and labeling the nucleic acid strands have been proposed.
  • Patent Document 1 a first nucleic acid chain and a second nucleic acid chain are arranged via a third nucleic acid chain, thereby binding the first nucleic acid chain and the second nucleic acid chain. .
  • RNA ligase-mediated method for the efficient creation of large, synthetic RNAs RNA 12: 2014-2019
  • Non-Patent Documents 3 and 4 or Patent Document 1 in order to bind the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand, the 3 ′ end of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand.
  • the first nucleic acid strand so that several bases of the 3′-end sequence and the 5′-end sequence, each containing 2 bases at the 5 ′ end, form a loop structure called “broken interior loop” (see Non-Patent Document 3).
  • the second nucleic acid strand must be arranged on the third nucleic acid strand, and the sequence must be configured so that base pairing between bases does not occur in the generated loop structure. . Therefore, structural restrictions are imposed on both the 3 'terminal sequence of the first nucleic acid strand and the 5' terminal sequence of the second nucleic acid strand, or at least one of the sequences.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and the first nucleic acid strand that can be completed in a short time using the first nucleic acid strand, the second nucleic acid strand, and the third nucleic acid strand. It is an object of the present invention to provide a method for binding a nucleic acid strand to a second nucleic acid strand, and a method for labeling a nucleic acid strand that can be used to safely perform experiments without using a radioisotope.
  • a method for binding a 3 ′ hydrosyl group of a first nucleic acid strand and a 5 ′ phosphate group of a second nucleic acid strand comprising: In the presence of a third nucleic acid strand that complementarily binds to at least a part of the first nucleic acid strand and at least a portion of the second nucleic acid strand, it has at least one or more ribonucleotides at the 3 ′ end.
  • the base sequence in the third nucleic acid strand having a base sequence complementary to at least one continuous base sequence containing a base and complementary to the second nucleic acid strand is the second base sequence.
  • Such a configuration can provide a simple method for binding the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand.
  • self-circulation of the RNA strand can be performed by protecting the 3 ′ end of one RNA strand as in the conventional method using T4 RNA ligase 1. There is no need to perform such processing.
  • there are disadvantages in binding RNAs using T4 DNA ligase that is, a large amount of enzyme must be used, a long reaction time is required, and further, The disadvantage that the rate is low can be solved.
  • the nucleic acid strands can be prevented from being circularized and the nucleic acid strands can be bonded to each other. This can also be used to enable 5 'end modification of nucleic acid strands.
  • the RNA ligase is T4 RNA ligase 2 derived from T4 bacteriophage.
  • the third nucleic acid strand has a base sequence in the third nucleic acid strand that is complementary to the second nucleic acid strand. It will be 10 bases or less.
  • the second nucleic acid strand is an RNA strand.
  • the first nucleic acid strand has a base sequence in which a single base is continuous for 6 bases or more.
  • the first nucleic acid strand has a 5 'end labeled with a dye, a fluorescent dye or biotin.
  • kits for use in the above-described method wherein the first nucleic acid strand having at least one or more ribonucleotides at the 3 ′ end, and EC 6.5.1.
  • a kit comprising: an RNA ligase classified as .3 and having a double-stranded nucleic acid nick repair activity; and a reaction buffer for the binding reaction.
  • the RNA ligase is T4 RNA ligase 2 derived from T4 bacteriophage.
  • the first nucleic acid strand has a base sequence in which a single base is continuous for 6 bases or more.
  • the first nucleic acid strand has a 5 'end labeled with a dye, a fluorescent dye or biotin.
  • FIG. 1 is an electrophoretogram showing a modification experiment by ligation of an oligo RNA strand according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a base sequence pairing experiment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is an electrophoretogram showing the involvement of base sequence pairing in the modification according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a stringency experiment of base sequence pairing according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is an electrophoretogram showing the stringency of base sequence pairing in the modification according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is an electrophoretogram showing a miRNA modification experiment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is an electrophoretogram showing a modification experiment by ligation of an oligo RNA strand according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a base sequence pairing experiment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is
  • FIG. 7 is an electrophoretogram showing a modification experiment with four types of homo-oligomers according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a schematic view of an oligoribonucleotide tag addition reaction experiment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is an electrophoretogram showing an oligoribonucleotide tag addition reaction experiment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is an electropherogram showing a modification experiment of 73mer RNA according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is an electrophoretogram showing an RNA pull-down experiment by biotinylation according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a schematic view of ligation using auxiliary nucleic acid strands having different strand lengths in the sequence of the pairing portion according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 is an electrophoretogram showing the relationship between the ligation speed and the chain length of the auxiliary nucleic acid chain according to one embodiment of the present invention.
  • a method for binding a first nucleic acid strand and a second nucleic acid strand using a third nucleic acid strand and a predetermined RNA ligase and a method for use in the method A kit is provided.
  • any second nucleic acid strand can be labeled or modified via the first nucleic acid strand using the method as described above. Can do.
  • the first nucleic acid strand used in the present invention may be a nucleic acid strand having any base sequence as long as at least the 3'-end base is RNA. Further, the first nucleic acid chain may be a sequence in which DNA and RNA are mixed. Moreover, the first nucleic acid chain according to the present invention may have a base sequence in which a single base is continuous for 6 bases or more.
  • the second nucleic acid strand used in the present invention may be any base sequence as long as it is a single-stranded nucleic acid sequence. That is, the second nucleic acid chain may be a DNA sequence, an RNA sequence, or a sequence in which DNA and RNA are mixed. Further, the length of the second nucleic acid chain is not particularly limited, and may be 70 mer or longer.
  • the 5 ′ terminal sequence is the 5 ′ terminal sequence of the second nucleic acid strand
  • the 3 ′ terminal sequence is the 3 ′ terminal side of the first nucleic acid strand. It forms a base pair in a complementary manner with the sequence and functions to assist the binding between the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand.
  • the third nucleic acid strand according to the present invention may be an RNA strand, a DNA strand, or a sequence in which DNA and RNA are mixed, but it is economical for those skilled in the art who carry out the method according to the present invention. In this respect, the use of a DNA strand is preferable.
  • the third nucleic acid chain according to the present invention prevents the second nucleic acid chain from being circularized when the first nucleic acid chain and the second nucleic acid chain are combined. Furthermore, by carrying out the method according to the present invention, the binding reaction between the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand is accelerated, which is another factor for preventing the self-circularization of the second nucleic acid strand. It has become.
  • the third nucleic acid strand includes at least one or more consecutive base sequences having a base at the 3 ′ end of the first nucleic acid strand, and the second nucleic acid strand, It is preferable to have at least one continuous base sequence having a base at the 5 ′ end of the nucleic acid strand and a complementary base sequence.
  • the complementary binding between the first nucleic acid strand and the third nucleic acid strand, and the complementary binding between the second nucleic acid strand and the third nucleic acid strand are strictly base paired. Preferably, it is formed.
  • the present inventors have found that the complementary reaction between the second nucleic acid strand and the third nucleic acid strand increases the speed of the binding reaction when the paired strand length is shortened ( See Example 10 below).
  • Bullard et al. Studied the substrate specificity of ligase using a double-stranded nucleic acid with a nick in one strand, but in this enzyme activity measurement experiment, the base of the nucleic acid strand on the non-nicked side was nicked.
  • Nick repair activity is delayed because all base pairs are formed with a base of a complementary nucleic acid strand (Bullard, DR and Bowater, RP 2006. Direct comparison of nickjoining activity of the nucleic acid ligases from bacteriophage T4. Biochem. J . 398: 135-144.).
  • the RNA ligase according to the present invention is preferably T4 RNA ligase 2 derived from T4 bacteriophage.
  • RNA ligase according to the present invention is T4 bacteriophage-derived T4 RNA ligase 2, vibriophage KVP40-derived ligase 2, Trypanosoma brucei RNA ligase, Deinococcus radiodurans RNA ligase RNAiol or ligase RNAi ligase RNAi ligase RNAiol or ligase RNAi ligase RNAiol ligase RNAiolase or LeiRNA Any RNA ligase classified as EC 6.5.1.3 and having a double-stranded nucleic acid repair activity is not limited to these ligases.
  • the binding between the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand is a condition of ligase reaction commonly used in the field of molecular biology as long as the RNA ligase according to the present invention functions.
  • the reaction may be carried out under any conditions within the range of conditions. For example, as described in Examples described later, a first nucleic acid strand, a second nucleic acid strand, a third nucleic acid strand, a buffer solution, and pure water are mixed, and the RNA ligase according to the present invention is added to the mixture. And then reacting at a temperature at which the ligase functions (eg, 37 ° C.) for a predetermined time (eg, 1 hour).
  • a temperature at which the ligase functions eg, 37 ° C.
  • a predetermined time eg, 1 hour
  • the second nucleic acid strand used in the present invention can be labeled or modified.
  • these labels or modifications are not particularly limited as long as they are performed by a substance or compound that can label or modify a nucleic acid.
  • the second nucleic acid strand according to the present invention can be labeled with biotin, a dye or a fluorescent dye, and the fluorescent dye may be Cy (trademark) 3, Cy (trademark) 5, FITC, etc. It may be a sign, a DIG sign, or the like.
  • the labeled or modified nucleic acid strand after the reaction can be used for the purpose of hybridization or the like as it is or after purification.
  • column separation or electrophoresis can be used. Conditions generally used in the field of molecular biology can be used for electrophoresis and column separation.
  • the second nucleic acid strand according to the present invention is labeled or modified, it is performed through the binding between the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand as described above. That is, before performing the binding reaction between the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand, as a pretreatment, the first nucleic acid strand is labeled with the predetermined label, and the labeled first
  • the second nucleic acid strand can be modified or labeled by performing a binding reaction using the above nucleic acid strand.
  • the position of the label in the first nucleic acid chain is not particularly limited, and the label can be arranged at an arbitrary position in the first nucleic acid chain.
  • it may be at the 5 'end of the first nucleic acid strand or near the 3' end that binds to the second nucleic acid strand.
  • a modification may be a label in the strand of the second nucleic acid strand.
  • RNA ligase-mediated binding method as described above, it is necessary to form a broken interior loop with the two nucleic acid strands to be bound, and structural restrictions are imposed on the sequences in the two nucleic acid strands. End up. Furthermore, when one nucleic acid strand is to be labeled by binding the nucleic acid strands, in the RNA ligase-mediated binding method, the position of the label such as a fluorescent dye in the other nucleic acid strand is positioned near the nucleic acid binding site. At present, it has not been confirmed whether it can be arranged.
  • T4 RNA ligase 2 derived from T4 bacteriophage according to an embodiment of the present invention described later was discovered and cloned in 2002 (Ho, Shuman 2002), and its properties have been studied.
  • Yin et al. (2003) examined the activity of T4 RNA ligase 2 using stem loop RNA consisting of two RNAs as a substrate.
  • Nandakumar et al. (2004) use two nucleic acid strands of 24 bases that form a 12 bp pair, and the polymerization of the nucleic acid strands is used as an indicator of the activity of T4 RNA ligase 2. Bullard et al.
  • Bacteriophage T4 RNA ligase 2 (gp24.1) exemplifies a family of RNA ligases found in all phylogenetic domains. Proc Natl Acad Sci USA.99: 12709-12714., Yin, S., Ho, CK, and Shuman, S. 2003. Structure-function analysis of T4 RNA ligase 2. J Biol. Chem. 278: 17601-17608. Biol. Chem. 279: 31337-31347., Bullard, DR and Bowater, RP 2006. Direct comparis on of nickjoining activity of the nucleic acid ligases from bacteriophage T4. Biochem. J. 398: 135-144.).
  • the 5 'end of the nucleic acid chain can be modified easily without using a radioactive isotope.
  • various fluorescent dyes, biotin, and other labels can be used for the modification.
  • oligo RNA strands themselves are cheaper and easier to obtain than before, but labeled nucleic acids such as labeled RNA are currently expensive.
  • the method according to the present invention is a useful method because it can easily label a nucleic acid chain such as an arbitrary RNA, thereby reducing the economic burden.
  • the method according to the present invention makes it possible to easily generate a nucleic acid chain labeled with a non-radioactive isotope, and to add a new base sequence to the 5 'end of the nucleic acid chain.
  • RNA can be bound to each other using the third nucleic acid strand, the auxiliary nucleic acid strand, and T4 DNA ligase, but the reaction time is long, a large amount of enzyme is required, the yield is low, etc. There was a problem.
  • a method using an auxiliary nucleic acid strand, which is a third nucleic acid strand, and T4 RNA ligase 1 has also been reported.
  • the above-described Broken interior loop structure must be provided, and RNA that can bind to it. There was a restriction on the sequence.
  • the method according to the present invention solves the problem of using a T4 DNA ligase without providing a Broken interior loop structure.
  • RNA-RNA / DNA binding as shown in # 6, it is not necessary to prepare a third nucleic acid strand, but it is necessary to form a complementary base pair for a part of the nucleic acid strands to be joined. Yes, as in # 5, there are limitations on the arrangement.
  • nucleic acid chain binding method First, typical examples of the nucleic acid chain binding method according to the present invention will be described.
  • the first nucleic acid strand and the third nucleic acid strand are base-paired in a buffer solution, and a complex of the base-paired first nucleic acid strand and third nucleic acid strand is obtained (nucleic acid strand).
  • Complex A Thereafter, the nucleic acid strand complex A and the second nucleic acid strand are base-paired in a buffer solution to obtain a complex in which the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand are base-paired to the third nucleic acid strand.
  • Nucleic acid chain complex B Nucleic acid chain complex B).
  • RNA ligase having double-stranded nucleic acid strand nick repair activity is added to the nucleic acid strand complex B in the buffer solution, and the catalytic action causes the 3 ′ hydrosyl group of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand to To the 5 'phosphate group.
  • the first nucleic acid strand, the second nucleic acid strand, and the third nucleic acid strand are mixed in a buffer.
  • This nucleic acid chain mixture is subjected to base pairing in a buffer solution to obtain a complex in which the first nucleic acid chain and the second nucleic acid chain are base paired with the third nucleic acid chain (nucleic acid chain complex B).
  • RNA ligase having double-stranded nucleic acid strand nick repair activity is added to the nucleic acid strand complex B in the buffer solution, and the catalytic action causes the 3 ′ hydrosyl group of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand to To the 5 'phosphate group.
  • nucleic acid strand complex A and the second nucleic acid strand are base-paired in a buffer solution to obtain a complex in which the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand are base-paired to the third nucleic acid strand.
  • Nucleic acid chain complex B an RNA ligase having double-stranded nucleic acid strand nick repair activity is added to the nucleic acid strand complex B in the buffer solution, and the 3 ′ hydrosyl group of the first nucleic acid strand labeled by this catalytic action and the second nucleic acid strand To the 5 'phosphate group. This labels the 5 ′ end of the second nucleic acid strand.
  • nucleic acid chain complex B (nucleic acid chain complex B).
  • RNA ligase having double-stranded nucleic acid strand nick repair activity is added to the nucleic acid strand complex B in the buffer solution, and the catalytic action causes the 3 ′ hydrosyl group of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand to To the 5 'phosphate group. This labels the 5 ′ end of the second nucleic acid strand.
  • RNA to be modified 0.1 nmol of RNA to be modified (pR21), 2 ⁇ l of buffer 1 and 0.5 nmol of acceptor RNA (AcF-1) were added, and pure water was added to make 19 ⁇ l.
  • Experiment c was performed by adding RNA to be modified (pR21), 0.1 nmol, 2 ⁇ l of buffer 1, 0.5 nmol of acceptor RNA (AcF-1), 2.7 ⁇ l of polyethylene glycol, and adding pure water to 19 ⁇ l.
  • Experiments e, f, and g were 0.1 nmol of RNA to be modified (pR21), 2 ⁇ l of buffer 1 and 5 ⁇ l of annealing solution were added, and experiment f was further added with 2.7 ⁇ l of polyethylene glycol and then with pure water. 19 ⁇ l and annealed at 65 ° C. for 5 minutes.
  • acceptor RNA (AcF-1) is ligated to the RNA strand to be modified (pR21) only in experiment g, and the RNA strand to be modified (pR21) is labeled with FITC. (FIG. 1, lane 7).
  • the 5 ′ phosphate group and 3 ′ hydroxyl group of the RNA strand to be modified (pR21) are ligated and circularized, but the acceptor RNA ( Ligation with AcF-1) was not observed (FIG. 1, lanes 2, 3, 5, 6).
  • T4 RNA ligase 2 when there was no auxiliary nucleic acid strand, the acceptor RNA (AcF-1) was not ligated with the RNA to be modified (pR21) (Experiment d, FIG. 1, lane 4).
  • T4 RNA ligase 2 and an auxiliary nucleic acid strand are essential for ligation of the acceptor RNA (AcF-1) and the RNA to be modified (pR21).
  • the RNA to be modified (pR21) is prevented from self-circulation, and the acceptor The RNA (AcF-1) and the RNA strand to be modified (pR21) can be successfully ligated.
  • each experiment in order to examine the base pairing of the 5 ′ side sequence of the RNA strand to be modified (pR21) in the ligation and the 5 ′ side sequence of the auxiliary nucleic acid strand, each experiment c, d, e, f, g, k
  • the auxiliary nucleic acid strand (DNA strand), BrR21-1 (c), BrR21-2 (d), BrR21-3 (e), BrR21-4 (f), BrR21-5 (g), BrR21-6 ( h), BrR21-7 (i), BrR21-8 (j), BrR21-F (k) were used.
  • BrR21-1, BrR21-2, BrR21-3, BrR21-4, BrR21-5, BrR21-6, BrR21-7, BrR21-8, BrR21-F are RNA strands to be modified (pR21) as shown in FIG. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 21 base pairs with respect to the 5′-side sequence.
  • RNA strand to be modified was added 0.1 ⁇ mol of RNA strand to be modified (pR21) and 2 ⁇ l of buffer 1 (500 mM Tris-HCl (pH 7.8), 100 mM MgCl 2 , 100 mM DTT, 10 mM ATP), and adding pure water to 19 ⁇ l. I made it.
  • the auxiliary nucleic acid strand used in this experiment has 8 nucleotides in the paired sequence portion based on BrR21-8 whose 8 ′ sequence in the 5 ′ side is matched with 8 nucleotides in the 5 ′ side sequence of the RNA strand to be modified (pR21).
  • T was used for U of the RNA strand (pR21) to be modified (FIG. 4).
  • auxiliary nucleic acid strand DNA strand
  • BrR21-8 a
  • BrR21-8-1T b
  • BrR21-8-2G c
  • BrR21-8-3A d
  • BrR21-8-4G e
  • BrR21-8-5G f
  • BrR21-8-6T g
  • BrR21-8 -7A h
  • BrR21-8-8G i
  • RNA (AcF-1) 1.5 nmol, auxiliary nucleic acid strand (DNA strand), BrLin-4 (experiment c), BrMir-34 (experiment d), BrMir-52 (Experiment e), BrMir-87 (Experiment f) 1.5 nmol was dissolved in 15 ⁇ l of 10 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl (pH 7.5) buffer solution, annealed at 65 ° C. for 5 minutes, and each annealed. Solutions c, d, e, and f were used.
  • Experiments c, d, e, and f are respectively two tubes (c1 and c2, d1 and d2, e1 and e2, f1 and f2, respectively), RNA to be modified, cel-lin-4 (experiment c), cel- miR-34 (experiment d), cel-miR-52 (experiment e), cel-miR-87 (experiment f) 0.1 nmol, buffer 1 (500 mM Tris-HCl (pH 7.8), 100 mM MgCl 2 , 2 ⁇ l of 100 mM DTT, 10 mM ATP) and the corresponding annealing solution c, d, e, f, 5 ⁇ l were added, and pure water was added to make 19 ⁇ l, followed by annealing at 65 ° C. for 5 minutes.
  • buffer 1 500 mM Tris-HCl (pH 7.8), 100 mM MgCl 2 , 2 ⁇ l of 100
  • RNA 2 nmol acceptor RNA (AcF-2), 2 nmol auxiliary nucleic acid strand (DNA strand: BrR21-12) were dissolved in 20 ⁇ l of 10 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl (pH 7.5) buffer solution, and 65 Annealing treatment was performed at 5 ° C. for 5 minutes, and this was used as an annealing solution d.
  • Experiments c, d, e, and f are: 0.1 nmol of RNA to be modified (pR21), buffer 1 (500 mM Tris-HCl (pH 7.8), 100 mM MgCl 2 , 100 mM DTT, 10 mM ATP) 2 ⁇ l, respectively, annealing solution 5 ⁇ l of c, d, e, and f was added, and pure water was added to make 19 ⁇ l, followed by annealing at 65 ° C. for 5 minutes.
  • Experiment a 1 ⁇ l of pure water was added, and in Experiments c, d, e, and f, 0.29 ⁇ g of T4 RNA ligase 2 (1 ⁇ l) was added, and the reaction was started at 37 ° C. After 1 hour, a, Take 12.5 ⁇ l from the reaction mixture of b, c, d, e, and f, add an equal amount of a reaction stop solution (80% formamide, 10 mM EDTA (pH 8.0), 0.025% bromphenol blue) and immediately add 80 Heat treatment at 5 ° C.
  • a reaction stop solution 80% formamide, 10 mM EDTA (pH 8.0), 0.025% bromphenol blue
  • RNA chain pR21 The ligation rates of adenosine ribonucleotide (experiment c), uridine ribonucleotide (experiment d), guanine ribonucleotide (experiment e), cytosine ribonucleotide (experiment e) and RNA chain pR21 are as shown in Table 3 below.
  • the reaction proceeds with adenine ribonucleotide, guanine ribonucleotide, and cytosine ribonucleotide homo-oligomer, but the reaction hardly proceeds with uridine ribonucleotide homo-oligomer.
  • FIG. 7 shows a stained image of ethidium bromide, but no band corresponding to the ligation product is detected in the uridine ribonucleotide homo-oligomer.
  • the ligation product is the largest in the reaction of cytosine ribonucleotide homo-oligomer, but there are many by-products.
  • many ligation products with guanine ribonucleotide homo-oligomer appear, and this seems to be because the guanine ribonucleotide chain is easily stained with ethidium bromide.
  • FIG. 9 shows the ethidium bromide stained image, and AcEx09 and AcEx14 could be added efficiently as in the case where the acceptor RNA, Ac-1, was ligated to the RNA strand (pR21).
  • 8mer Ac-1 binds to the RNA strand (pR21) and a 29mer band is seen.
  • 16mer AcEx09 binds to the RNA strand (pR21) and a 29mer band appears.
  • RNA in vitro transcription was performed using 0.1 ⁇ g / ⁇ l of template 73, 2 u / ⁇ l in a buffer containing 40 mM Tris-HCl (pH 7.9), 6 mM MgCl 2 , 2 mM permidine, 10 mM DTT, 1 mM ATP, UTP, CTP, GTP.
  • T7 RNA polymerase was added and reacted at 37 ° C. for 3 hours, followed by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation to purify 73-mer RNA.
  • Purified 73mer RNA was dephosphorylated with alkaline phosphatase and rephosphorylated with T4 polynucleotide kinase (pR73).
  • RNA strand to be modified 0.05 nmol of RNA strand to be modified (pR73), buffer 1 (500 mM Tris-HCl (pH 7.8), 100 mM MgCl 2 , 100 mM DTT, 10 mM ATP) 2 ⁇ l, annealing solution 5 ⁇ l were added, and pure Water was added to 19 ⁇ l, and annealing was performed at 65 ° C. for 5 minutes.
  • experiment a 1 ⁇ l of pure water was added, and in experiment b, 0.29 ⁇ g of T4 RNA ligase 2 (1 ⁇ l) was added, and the reaction was started at 37 ° C. After 1 hour, from the reaction solutions of a and b Take 1 ⁇ l, add an equal volume of reaction stop solution (80% formamide, 10 mM EDTA (pH 8.0), 0.025% bromphenol blue), immediately heat-treat at 80 ° C. for 5 minutes, then place on ice and quench rapidly Electrophoresis was performed using a 10% concentration denaturing acrylamide gel (1 ⁇ TBE buffer, containing 7.5 M urea) and 1 ⁇ TBE buffer as an electrophoresis solution.
  • reaction stop solution 80% formamide, 10 mM EDTA (pH 8.0), 0.025% bromphenol blue
  • FITC labeling by ligation with the acceptor RNA could be performed on the 73-nucleotide RNA chain (pR73). From the ethidium bromide staining, unreacted pR73 was estimated to be 30% or less, and 70% or more of pR73 was labeled with FITC (FIG. 10).
  • Experiments a and b are 0.2 nmol of an RNA strand (plin4-FITC) with a FITC label at the 3 ′ end of plin4, buffer 1 (500 mM Tris-HCl (pH 7.8), 100 mM MgCl 2 , 100 mM DTT, 10 mM ATP) 2 ⁇ l and 5 ⁇ l of annealing solution F were added, and pure water was added to make 18 ⁇ l, followed by annealing at 65 ° C. for 5 minutes.
  • buffer 1 500 mM Tris-HCl (pH 7.8), 100 mM MgCl 2 , 100 mM DTT, 10 mM ATP) 2 ⁇ l and 5 ⁇ l of annealing solution F were added, and pure water was added to make 18 ⁇ l, followed by annealing at 65 ° C. for 5 minutes.
  • T4 gene 24.1 was obtained from T4 phage genomic DNA and cloned into the restriction enzyme sites of BamHI and NotI of the E. coli expression vector pETBA (Biodynamics Laboratory Inc.) (this plasmid is designated as pETBT4L2).
  • Escherichia coli strain BL21 (DE3) was transformed with pETBT4L2 to obtain Escherichia coli BL21 (DE3) / pETBT4L2 retaining pETBT4L2.
  • This BL21 (DE3) / pETBT4L2 was inoculated into LB medium containing 0.1 mg / ml ampicillin, and when OD600 reached 0.5, 1 mM IPTG (Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyroside) was added, and further 3 The cells were cultured for a period of time and collected with a centrifuge. 9 ml of 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8.0 buffer was added to the cell pellet obtained from the 50 ml culture solution, and the cell pellet was resuspended, and then 1 ml of 10 mg / ml lysozyme solution was added. Stir and let stand on ice for 30 minutes. This was centrifuged to obtain a supernatant, followed by filtration with a 0.2 ⁇ m pore syringe filter to obtain a crude enzyme filtrate.
  • a resin volume of 1 ml of Proband column (Invitrogen) was equilibrated with 50 mM NaH 2 PO 4 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0 buffer solution, and the above-mentioned crude enzyme filtrate was provided thereto, followed by 10 ml of 50 mM NaH.
  • RNA strand pR21 2 ⁇ g (0.27 nmol) of RNA strand pR21 to be modified and 2 ⁇ l of buffer 1 (500 mM Tris-HCl (pH 7.8), 100 mM MgCl 2 , 100 mM DTT, 10 mM ATP) were added, and pure water was added. 19 ⁇ l.
  • buffer 1 500 mM Tris-HCl (pH 7.8), 100 mM MgCl 2 , 100 mM DTT, 10 mM ATP
  • acceptor RNA (Ac-1) 2 nmol, auxiliary nucleic acid strand (DNA strand), BrR21-6 (experiment b), BrR21-12 (experiment c), BrR21-F (experiment d) 2 nmol was dissolved in 20 ⁇ l of 10 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl (pH 7.5) buffer solution, and annealed at 65 ° C. for 5 minutes, which were designated as annealing solutions b, c, and d, respectively.
  • Experiments b, c and d are 2 ⁇ g (0.27 nmol) of RNA strand pR21 to be modified, buffer 1 (500 mM Tris-HCl (pH 7.8), 100 mM MgCl 2 , 100 mM DTT, 10 mM ATP) 5 ⁇ l, corresponding annealing 12.5 ⁇ l of solutions b, c and d were added, and pure water was added to make 19 ⁇ l, followed by annealing at 65 ° C. for 5 minutes.
  • buffer 1 500 mM Tris-HCl (pH 7.8), 100 mM MgCl 2 , 100 mM DTT, 10 mM ATP
  • Experiment a 1 ⁇ l of pure water was added, and in Experiments b, c and d, 0.29 ⁇ g of T4 RNA ligase 2 (1 ⁇ l) was added, and the reaction was started at room temperature (25 ° C.). After 10 minutes, 30 minutes Then, 1 hour later, 2.5 ⁇ l was taken from the reaction solution, and an equal amount of a reaction stop solution (80% formamide, 10 mM EDTA (pH 8.0), 0.025% bromphenol blue) was added thereto, and immediately at 80 ° C.
  • a reaction stop solution 80% formamide, 10 mM EDTA (pH 8.0), 0.025% bromphenol blue
  • Heat treatment was performed for 1 minute, then placed on ice, rapidly cooled, and electrophoresed on a 12.5% denaturing acrylamide gel (1 ⁇ TBE buffer solution containing 7.5 M urea) using 1 ⁇ TBE buffer solution as an electrophoresis solution. . After the electrophoresis, the gel was taken out from the apparatus, and the gel was stained with ethidium bromide, then irradiated with ultraviolet rays, and photographed again.
  • lanes 2, 3, and 4 are auxiliary nucleic acid strand BrR21-6 (RNA strand pR21 and 6 base pairs), and lanes 5, 6, and 7 are BrR21-12 (RNA strand pR21 and 12 base pairs).
  • Lanes 8, 9, and 10 show the results of the ligation experiment of acceptor RNA strand Ac-1 and RNA strand pR21 using BrR21-F (RNA base pR21 and 21 base pairing).
  • RNA strand pR21-6 When the auxiliary nucleic acid strand BrR21-6 was used, most of 2 ⁇ g of the RNA strand pR21 was converted into a 29-mer RNA strand ligated with the RNA strand Ac-1 in 10 minutes, and after 30 minutes, the RNA strand pR21 was all 29 mer. It has been converted to an RNA strand and the reaction is complete.
  • the auxiliary nucleic acid strand BrR21-12 about 50% of 2 ⁇ g of RNA strand pR21 was converted into a 29-mer RNA strand ligated with RNA strand Ac-1 in 30 minutes, and after 1 hour, 60% or more was 29-mer. Although converted to an RNA strand, the reaction is not complete.
  • RNA strand pR21 When the auxiliary nucleic acid strand BrR21-F was used, 2 ⁇ g of the RNA strand pR21 was converted into a 29-mer RNA strand ligated with RNA strand Ac-1 in 30 minutes, and about 50% of the RNA strand pR21 was converted even after 1 hour. It remained unreacted.
  • the present invention can be variously modified, and is not limited to the above-described embodiment, and can be variously modified without changing the gist of the invention.

Abstract

【課題】　第一の核酸鎖と第二の核酸鎖と第三の核酸鎖とを用いて、短時間で反応が終了し、且つ放射性アイソトープを使用せず安全に実験を遂行できる、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖との結合方法およびそれを利用した核酸鎖の標識方法を提供すること。 【解決手段】　第一の核酸鎖の３'ヒドロシル基と、第二の核酸鎖の５'リン酸基とを結合する方法であって、前記第一の核酸鎖の少なくとも一部と前記第二の核酸鎖の少なくとも一部とに相補的に結合する第三の核酸鎖の存在下において、少なくとも１以上のリボヌクレオチドを３'末端に有する前記第一の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との塩基対形成、および前記第二の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との塩基対形成を、同時にまたは別々に行う工程と、その工程で得られた前記第一の核酸鎖、前記第二の核酸鎖、前記第三の核酸鎖の三者の核酸鎖の混合物に、ＥＣ６．５．１．３に分類され且つ二本鎖核酸ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを添加する工程を有し、前記第三の核酸鎖は、前記第一の核酸鎖の３'末端の塩基を含む少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有し、また前記第三の核酸鎖は、前記第二の核酸鎖の５'末端の塩基を含む少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有し、且つ前記第二の核酸鎖に対して相補的となる前記第三の核酸鎖における塩基配列が、前記第二の核酸鎖の鎖長の１／２未満となるものであることを特徴とする方法。

Description

核酸鎖の結合および修飾方法
　本発明は、第一の核酸鎖の３’ヒドロシル基と、第二の核酸鎖の５’リン酸基とを結合する方法、また、これにより前記第二の核酸鎖を修飾する方法に関する。
　従来、分子生物学や遺伝子工学の分野において、ＲＮＡ等の核酸鎖を修飾または標識することは、研究開発をする上で必須となる実験手法のうちの一つであり、同時に、有力な研究手法でもある。また、研究者が頻繁に使用する実験手法であるため、常温常圧で反応を行える酵素を使用し、且つ安全に実験を行える簡便な手法が求められている。
　このような手法として、非特許文献１では、非放射性アイソトープを用いてＲＮＡ鎖の３’末端を修飾している。この手法では、非放射性アイソトープを用いているため安全に実験を行うことができるが、ＲＮＡ生合成は５’末端から３’末端に伸長するため、修飾後のＲＮＡ鎖では伸長反応を行うことができなくなってしまう。
　また、非特許文献２では、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 polynucleotide kinase）を用いて５’末端を修飾しているが、同時に、放射性アイソトープである[γ-32P]ATPを使用しなければならないため、専用の施設を必要とし、放射性廃棄物の処理に大きな負担がかかってしまい、また、安全性の面からも取り扱いに習熟した技術が必要となってしまう。
　このような問題点を解決するために、近年では、非特許文献３や４または特許文献１のような技術を用いて、目的の核酸鎖に、予め用意した修飾鎖を結合させることで、目的の核酸鎖を修飾・標識する手法が提唱されている。この特許文献１では、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖とを、第三の核酸鎖を介して並べることで、当該第一の核酸鎖と第二の核酸鎖とを結合させている。
特開２００２－１７１９８３号公報
Rosemeyer, V., Laubrock, A., and Seibl, R. 1995. Nonradioactive 3’-end-labeling of RNA molecules of different lengths by terminal deoxynucleotidyltransferase. Anal. Biochem. 224: 446-449. Matschinsky, F. M., Passonneau, J. V., and Lowry, O. H. 1968, Anal. Biochem. 196, 80-83 Bain, J.D. and Switzer, C. 1992. Regioselective ligation of oligoribonucleotides using DNA splints. Nucleic Acids Res. 20: 4372. Stark, M.R., Pleiss, J.A., Deras, M., Scaringe, S.A., and Rader, S.D. 2006. An RNA ligase-mediated method for the efficient creation of large, synthetic RNAs. RNA 12: 2014-2019
　ところで、非特許文献３や４または特許文献１の手法では、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖とを結合させるために、第一の核酸鎖の３’末端および第二の核酸鎖の５’末端の２塩基を含むそれぞれ３’末端側配列および５’末端側配列の数塩基がｂｒｏｋｅｎ　ｉｎｔｅｒｉｏｒ　ｌｏｏｐ（非特許文献３参照）と称されるループ構造を生じるように、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖とを第三の核酸鎖上で並べる必要があることに加え、当該生じたループ構造内で塩基同士の塩基対形成が起こらないように配列を構成しておく必要もある。そのため、第一の核酸鎖の３’末端側配列と第二の核酸鎖の５’末端側配列との両方、若しくは少なくとも一方の配列に、構造的な制限が課されてしまう。
　従って、目的の核酸鎖に予め用意した修飾鎖を結合させようとしたとしても、目的の核酸鎖及び／若しくは修飾鎖の塩基配列の構造的な問題によって、結合できない核酸鎖と修飾鎖の組合せが出てきてしまう。なお、このような塩基配列における構造的な制限は、その使用される酵素がＴ４　ＲＮＡリガーゼ１であることに起因する。
　本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖と第三の核酸鎖とを用いて、短時間で反応が終了できる前記第一の核酸鎖と第二の核酸鎖との結合方法、およびそれを利用して、放射性アイソトープを使用せず安全に実験を遂行できる核酸鎖の標識方法を提供することを目的とする。　
　本発明の第一の主要な観点によれば、第一の核酸鎖の３’ヒドロシル基と、第二の核酸鎖の５’リン酸基とを結合する方法であって、
　前記第一の核酸鎖の少なくとも一部と前記第二の核酸鎖の少なくとも一部とに相補的に結合する第三の核酸鎖の存在下において、少なくとも１以上のリボヌクレオチドを３’末端に有する前記第一の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との塩基対形成、および前記第二の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との塩基対形成を、同時にまたは別々に行う工程と、その工程で得られた前記第一の核酸鎖、前記第二の核酸鎖、前記第三の核酸鎖の三者の核酸鎖の混合物に、ＥＣ６．５．１．３に分類され且つ二本鎖核酸ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを添加する工程を有し、前記第三の核酸鎖は、前記第一の核酸鎖の３’末端の塩基を含む少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有し、また前記第三の核酸鎖は、前記第二の核酸鎖の５’末端の塩基を含む少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有し、且つ前記第二の核酸鎖に対して相補的となる前記第三の核酸鎖における塩基配列が、前記第二の核酸鎖の鎖長の１／２未満となるものであることを特徴とする方法、が提供される。
　このような構成によれば、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖との結合について簡便な方法を提供することができる。また、本発明によれば、ＲＮＡ同士の結合において、従来のＴ４　ＲＮＡリガーゼ１を用いて行う方法のような、一方のＲＮＡ鎖の３’末端を保護することによって当該ＲＮＡ鎖の自己環状化を防ぐような処理をする必要がなくなる。さらに、本発明によれば、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いてＲＮＡ同士の結合を行う場合の欠点、すなわち、多量の酵素を使用しなければならず、また、長い反応時間を要し、さらには、収率が低い、という欠点を解消することができる。
　また、このような構成によれば、核酸鎖自身での環状化を防ぎ、核酸鎖同士の結合を行うことができる。また、これを利用して、核酸鎖の５’末端修飾を可能にすることができる。
　また、本発明の一実施形態によれば、このような方法において、前記ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４　ＲＮＡリガーゼ２である。
　また、本発明の別の実施形態によれば、このような方法において、前記第三の核酸鎖は、前記第二の核酸鎖に対して相補的となる前記第三の核酸鎖における塩基配列が１０塩基以下となるものである。
　また、本発明のさらに別の実施形態によれば、このような方法において、前記第二の核酸鎖は、ＲＮＡ鎖である。
　また、本発明のさらに別の実施形態によれば、このような方法において、前記第一の核酸鎖は、単一塩基が６塩基以上連続する塩基配列を有するものである。
　また、本発明のさらに別の実施形態によれば、このような方法において、前記第一の核酸鎖は、色素、蛍光色素またはビオチンによって標識された５’末端を有するものである。
　本発明の第二の主要な観点によれば、上記のような方法に用いるキットであって、少なくとも１以上のリボヌクレオチドを３’末端に有する前記第一の核酸鎖と、ＥＣ６．５．１．３に分類され且つ二本鎖核酸ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼと、前記結合反応のための反応緩衝液と、を有するものであることを特徴とする、キットが提供される。
　また、本発明の一実施形態によれば、このようなキットにおいて、前記ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４　ＲＮＡリガーゼ２である。
　また、本発明の別の実施形態によれば、このようなキットにおいて、前記第一の核酸鎖は、単一塩基が６塩基以上連続する塩基配列を有するものである。
　本発明のさらに別の実施形態によれば、このようなキットにおいて、前記第一の核酸鎖は、色素、蛍光色素またはビオチンによって標識された５’末端を有するものである。
　なお、上記した以外の本発明の特徴及び顕著な作用・効果は、次の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
図１は、本発明の一実施形態に係るオリゴＲＮＡ鎖のライゲーションによる修飾実験を示す電気泳動図である。 図２は、本発明の一実施形態に係る塩基配列対合実験の概略図である。 図３は、本発明の一実施形態に係る修飾における塩基配列対合の関与を示す電気泳動図である。 図４は、本発明の一実施形態に係る塩基配列対合の厳密性実験を示す概略図である。 図５は、本発明の一実施形態に係る修飾における塩基配列対合の厳密性を示す電気泳動図である。 図６は、本発明の一実施形態に係るｍｉＲＮＡの修飾実験を示す電気泳動図である。 図７は、本発明の一実施形態に係る４種類のホモオリゴマーによる修飾実験を示す電気泳動図である。 図８は、本発明の一実施形態に係るオリゴリボヌクレオチドタグの付加反応実験の概略図である。 図９は、本発明の一実施形態に係るオリゴリボヌクレオチドタグの付加反応実験を示す電気泳動図である。 図１０は、本発明の一実施形態に係る７３ｍｅｒＲＮＡの修飾実験を示す電気泳動図である。 図１１は、本発明の一実施形態に係るビオチン化によるＲＮＡプルダウン実験を示す電気泳動図である。 図１２は、本発明の一実施形態に係る対合する部分の配列の鎖長が異なる補助核酸鎖を用いたライゲーションの概略図である。 図１３は、本発明の一実施形態に係るライゲーション速度と補助核酸鎖の鎖長との関係を示す電気泳動図である。
　上述したように、本発明によれば、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖とを、第三の核酸鎖と所定のＲＮＡリガーゼとを用いて結合する方法、およびその方法に用いるためのキットが提供される。
　また、前記第一の核酸鎖を標識または修飾しておくことで、上記のような方法を用いて、任意の前記第二の核酸鎖を前記第一の核酸鎖を介して標識または修飾することができる。
　本発明に用いる第一の核酸鎖は、少なくともその３’末端の塩基がＲＮＡであれば、どのような塩基配列の核酸鎖であっても良い。また、前記第一の核酸鎖は、ＤＮＡとＲＮＡとが混在する配列であっても良い。また、本発明に係る第一の核酸鎖は、単一の塩基が６塩基以上連続する塩基配列を有するものであっても良い。
　本発明に用いる第二の核酸鎖は、一本鎖の核酸配列であればどのような塩基配列であっても良い。つまり、前記第二の核酸鎖は、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はＤＮＡとＲＮＡとが混在する配列であっても良い。また、前記第二の核酸鎖は、その鎖長は特に制限されるものではなく、７０ｍｅｒ以上の鎖長であっても良い。
　本発明に用いる第三の核酸鎖は、その５’末端側配列が前記第二の核酸鎖の５’末端側配列と、その３’末端側配列が前記第一の核酸鎖の３’末端側配列と相補的に塩基対を形成するものであり、前記第一の核酸鎖と前記第二の核酸鎖との結合を補助するように働く。また、本発明に係る第三の核酸鎖は、ＲＮＡ鎖、ＤＮＡ鎖、またはＤＮＡとＲＮＡとが混在する配列であっても良いが、本発明に係る方法を実施する当業者にとっては、経済的な面において、ＤＮＡ鎖の使用が好ましい。
　また、本発明に係る第三の核酸鎖は、前記第一の核酸鎖と前記第二の核酸鎖とが結合する際に、前記第二の核酸鎖が環状化することを防いでいる。さらに、本発明に係る方法を実施することにより、前記第一の核酸鎖と前記第二の核酸鎖との結合反応が速くなることも前記第二の核酸鎖の自己環状化を防ぐ一因となっている。
　さらに、本発明に係る方法において、前記第三の核酸鎖は、前記第一の核酸鎖の３’末端の塩基を有する少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列と、前記第二の核酸鎖の５’末端の塩基を有する少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列とを有するものであることが好ましい。また、前記第一の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との相補的な結合、並びに、前記第二の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との相補的な結合は、厳密に塩基対の形成を成していることが好ましい。
　また、本発明者らは、前記第二の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との相補的な結合が、その対合鎖長が短くなると結合反応の速度が増加することを見いだしている（下記、実施例１０参照）。例えば、Ｂｕｌｌａｒｄらは、片鎖にニックのある二本鎖核酸を用いてリガーゼの基質特異性を研究しているが、この酵素活性測定実験で、ニックの無い側の核酸鎖の塩基はニックのある相補核酸鎖の塩基とすべて塩基対形成をしているため、ニック修復活性は遅くなる（Bullard, D.R. and Bowater, R.P. 2006. Direct comparison of nickjoining activity of the nucleic acid ligases from bacteriophage T4. Biochem. J. 398: 135-144.）。
　本発明に用いるＥＣ６．５．１．３に分類され且つ二本鎖核酸ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼとは、国際生化学分子生物学連合が制定するＥＣ番号でＥＣ６．５．１．３に分類される酵素であり、ＡＴＰ＋（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ｎ＋（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ｍ＝ＡＭＰ＋ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ＋（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ｎ＋ｍの反応を触媒する酵素であって、二本鎖核酸におけるニックを修復する活性を有するものである。また、本発明に係るＲＮＡリガーゼは、好ましくは、Ｔ４　バクテリオファージ由来のＴ４　ＲＮＡリガーゼ２である。さらに、本発明に係るＲＮＡリガーゼは、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４　ＲＮＡリガーゼ２、ビブリオファージ（ｖｉｂｒｉｏｐｈａｇｅ）ＫＶＰ４０由来のリガーゼ２、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｂｒｕｃｅｉ　ＲＮＡリガーゼ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ　ＲＮＡリガーゼ、若しくはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ　ＲＮＡリガーゼであっても良く、ＥＣ６．５．１．３に分類されるＲＮＡリガーゼであって二本鎖核酸ニック修復活性を有するものであればこれらのリガーゼに制限されることはない。
　また、本発明に係る方法において、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖との結合は、本発明に係るＲＮＡリガーゼが機能する条件であれば、分子生物学分野で常用されるリガーゼ反応の条件の範囲内のどのような条件下で反応が行われても良い。例えば、後述する実施例に記載するように、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖と第三の核酸鎖と緩衝液と純水とを混合させ、その混合液に本発明に係るＲＮＡリガーゼを加え、その後当該リガーゼが機能する温度（例えば３７℃）で所定時間（例えば１時間）反応させることによって行われる。また、本発明に係る方法の結合反応に用いられる第一の核酸鎖などの各成分の用量は、当業者によって適宜変更可能である。
　また、本発明に係る方法を用いることによって、本発明に用いられる第二の核酸鎖は、標識または修飾されることができる。この場合、これらの標識または修飾は、核酸を標識または修飾することができる物質または化合物等によってされるものであれば、特に制限されるものではない。例えば、本発明に係る第二の核酸鎖は、ビオチンや色素又は蛍光色素によって標識されることができ、蛍光色素としては、Ｃｙ（商標）３、Ｃｙ（商標）５、ＦＩＴＣ等でも良く、ビオチン標識、ＤＩＧ標識等でも良い。なお、反応後の標識または修飾された核酸鎖は、そのまま、または精製後、ハイブリダイゼーション等の目的に使用することができる。精製をする場合には、カラム分離や電気泳動の手法が使用できる。電気泳動、カラム分離の条件は分子生物学分野で通常用いられる条件を使用できる。
　本発明に係る第二の核酸鎖が標識または修飾される場合には、上述したような、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖との結合を介して行われる。すなわち、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖との結合反応を行う前に、前処理として、前記第一の核酸鎖を上記所定の標識物で標識しておき、その標識された第一の核酸鎖を用いて、結合反応を行うことで、前記第二の核酸鎖の修飾または標識を行うことができる。この場合、前記第一の核酸鎖における前記標識物の位置は特に制限されるものではなく、前記第一の核酸鎖の任意の位置に前記標識物を配置することができる。例えば、前記第一の核酸鎖の５’末端であっても良いし、前記第二の核酸鎖と結合する３’末端付近であっても良い。もちろん、このような修飾は、前記第二の核酸鎖の鎖内における標識であっても良い。
　なお、従来、ＲＮＡ鎖の結合には、ＤＮＡリガーゼを用いるＤＮＡスプリント（ＤＮＡ　ｓｐｌｉｎｔ）法が用いられていたが、反応時間が数時間に及んでしまい、また、反応収量も低く、ＤＮＡリガーゼを大量に使用しなければならないという問題点があった。この解決策として、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ１と３’末端を保護したＲＮＡとを用いるＲＮＡリガーゼ介在結合（ＲＮＡ　ｌｉｇａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｌｉｇａｔｉｏｎ）法が報告されているが、この方法は５’－ｓｉｌｙｌ－２’－ａｃｅｔｏｘｙ　ｅｔｈｙｌ　ｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ保護基を持ったＲＮＡが必要となってしまい、実用的ではない（非特許文献４）。また、このＲＮＡリガーゼ介在結合法では、上述のように、結合させる２本の核酸鎖によってｂｒｏｋｅｎ　ｉｎｔｅｒｉｏｒ　ｌｏｏｐを形成させる必要があり、当該２本の核酸鎖における配列に構造的な制限が課されてしまう。さらに、核酸鎖同士を結合させることによって一方の核酸鎖を標識させようとする場合には、ＲＮＡリガーゼ介在結合法では、他方の核酸鎖における蛍光色素など標識の位置を、核酸結合部位の近傍に配置し得るかどうか確認がとれていないのが現状である。
　ここで、後述する本発明の一実施形態に係るＴ４バクテリオファージ由来のＴ４　ＲＮＡリガーゼ２は２００２年に発見、クローニングされ（Ｈｏ、Ｓｈｕｍａｎ　２００２）、その性状が研究されてきた。Ｙｉｎら（２００３）は、２つのＲＮＡからなるステムループＲＮＡを基質としてＴ４　ＲＮＡリガーゼ２の活性を調べた。Ｎａｎｄａｋｕｍａｒら（２００４）は、１２ｂｐの対合をつくる２４塩基の２つの核酸鎖を用い、その核酸鎖の重合をＴ４　ＲＮＡリガーゼ２の活性の指標としている。Ｂｕｌｌａｒｄら（２００６）は、片鎖にニックのある２０ｂｐの二本鎖核酸を用いてリガーゼの基質特異性を研究した。この２０ｂｐの二本鎖核酸基質の作製は終夜実験でおこなわれている。この研究では二本鎖核酸のニックの修復を対象としており、ニックの無い側のある核酸鎖の長さおよび結合する５’リン酸化ＲＮＡの任意性までは知られておらず、任意のＲＮＡをその５’末端の一部の配列を用いて、５’末端修飾をする方法とは大きな隔たりがあった（ Ho, C.K. and Shuman, S. 2002. Bacteriophage T4 RNA ligase 2 (gp24.1) exemplifies a family of RNA ligases found in all phylogenetic domains. Proc Natl Acad Sci USA.99:12709-12714.、Yin, S., Ho, C.K., and Shuman, S. 2003. Structure-function analysis of T4 RNA ligase 2. J. Biol. Chem. 278: 17601-17608.、Nandakumar, J., Ho, C.K., Lima, C.D., and Shuman, S. 2004. RNA substrate specificity and structure-guided mutational analysis of bacteriophage T4 RNA ligase 2. J. Biol. Chem. 279: 31337-31347.、Bullard, D.R. and Bowater, R.P. 2006. Direct comparison of nickjoining activity of the nucleic acid ligases from bacteriophage T4. Biochem. J. 398: 135-144.）。
　本発明に係る方法を用いることで、放射性アイソトープを使用せず、簡便に核酸鎖の５’末端を修飾することができる。上述のように、修飾には、様々な蛍光色素、ビオチン、その他の標識を用いることができる。現在、オリゴＲＮＡ鎖自体は、以前に比べ、安価に、且つ容易に入手できる状況にあるが、標識ＲＮＡ等の標識核酸は価格が高いという現状がある。本発明に係る方法は、任意のＲＮＡ等の核酸鎖を容易に標識できるため、経済的負担が軽減されるなど、有用な方法である。
　本発明に係る方法により、非放射性アイソトープによって標識された核酸鎖を容易に生成することが可能となり、核酸鎖の５’末端に新たな塩基配列を付加する修飾もできることになる。
　また、本発明に係る方法と従来の核酸鎖の結合方法とを比較すると以下の表１のようにまとめることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　すなわち、＃１および＃２に示すように、ＤＮＡ同士またはＲＮＡ同士を結合させる場合、当該結合に係る２本の核酸鎖ではいずれの酵素を用いたとしても反応は遅く、また核酸鎖の自己環状化の問題も生じる。また、＃３に示すように、ＤＮＡ同士の結合は、従来から、第三の核酸鎖である補助核酸鎖とＴ４　ＤＮＡリガーゼとを用いることで良好な反応が行われることが知られていたが、ＲＮＡ同士の結合に関しては、良好な反応様式は知られていなかった。＃４に示すように第三の核酸鎖である補助核酸鎖とＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いてＲＮＡ同士の結合がおこなえるが、反応時間が長い、大量の酵素を必要とする、収率が低い等の問題があった。また、＃５に示すように、第三の核酸鎖である補助核酸鎖とＴ４　ＲＮＡリガーゼ１を用いる方法も報告されているが、上述したＢｒｏｋｅｎ　ｉｎｔｅｒｉｏｒ　ｌｏｏｐ構造を設けねばならず、結合し得るＲＮＡの配列に制限があった。一方、本発明に係る方法では、Ｂｒｏｋｅｎ　ｉｎｔｅｒｉｏｒ　ｌｏｏｐ構造を設けることなく、またＴ４　ＤＮＡリガーゼを利用する場合の問題点をも解決している。なお、＃６に示されるようなＲＮＡ－ＲＮＡ／ＤＮＡの結合では、第三の核酸鎖を用意する必要はないが、結合させる核酸鎖同士の一部について相補的な塩基対を形成させる必要があり、＃５と同様、配列における制限がある。
　また、以下に、本発明に係る方法の代表的な反応を説明するが、本発明はこれらの反応例に限定されるものではないことは言うまでもない。
　まず、本発明に係る核酸鎖の結合方法について、代表的な例を説明する。　
　１）第一の核酸鎖と第三の核酸鎖とを緩衝液中で塩基対形成させ、その塩基対合した前記第一の核酸鎖と第三の核酸鎖との複合体を得る（核酸鎖複合体Ａ）。その後、核酸鎖複合体Ａと第二の核酸鎖とを緩衝液中で塩基対形成させ、第三の核酸鎖に第一の核酸鎖および第二の核酸鎖が塩基対合した複合体を得る（核酸鎖複合体Ｂ）。そして、緩衝液中の核酸鎖複合体Ｂに二本鎖核酸鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを加え、この触媒作用により前記第一の核酸鎖の３’ヒドロシル基と、前記第二の核酸鎖の５’リン酸基とを共有結合させる。　
　２）第一の核酸鎖、第二の核酸鎖、及び第三の核酸鎖を緩衝液中で混合する。この核酸鎖混合物を緩衝液中で塩基対形成させ、第三の核酸鎖に第一の核酸鎖および第二の核酸鎖が塩基対合した複合体を得る（核酸鎖複合体Ｂ）。そして、緩衝液中の核酸鎖複合体Ｂに二本鎖核酸鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを加え、この触媒作用により前記第一の核酸鎖の３’ヒドロシル基と、前記第二の核酸鎖の５’リン酸基とを共有結合させる。
　続いて、本発明に係る核酸鎖の修飾方法について、代表的な例を説明する。　
　１）５’末端をビオチン、蛍光色素等で標識した第一の核酸鎖を用意する。この第一の核酸鎖と第三の核酸鎖とを緩衝液中で塩基対形成させ、塩基対合した第一の核酸鎖と第三の核酸鎖との複合体を得る（核酸鎖複合体Ａ）。その後、核酸鎖複合体Ａと第二の核酸鎖とを緩衝液中で塩基対形成させ、第三の核酸鎖に第一の核酸鎖および第二の核酸鎖が塩基対合した複合体を得る（核酸鎖複合体Ｂ）。そして、緩衝液中の核酸鎖複合体Ｂに二本鎖核酸鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを加え、この触媒作用によって標識した第一の核酸鎖の３’ヒドロシル基と、第二の核酸鎖の５’リン酸基とを共有結合させる。これにより前記第二の核酸鎖の５’末端が標識される。　
　２）５’末端をビオチン、蛍光色素等で標識した第一の核酸鎖を用意する。この第一の核酸鎖、第二の核酸鎖、及び第三の核酸鎖を緩衝液中で混合する。その後、この核酸鎖混合物を緩衝液中で塩基対形成させ、前記第三の核酸鎖に前記第一の核酸鎖および第二の核酸鎖が塩基対合した複合体を得る（核酸鎖複合体Ｂ）。そして、緩衝液中の核酸鎖複合体Ｂに二本鎖核酸鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを加え、この触媒作用によって前記第一の核酸鎖の３’ヒドロシル基と、前記第二の核酸鎖の５’リン酸基とを共有結合させる。これにより前記第二の核酸鎖の５’末端が標識される。
　次に、本発明の効果に関して実施例を示して説明する。しかし、本発明は以下に記載された実施例に限定されるものではなく、様々な変更及び修飾は当業者によって容易になされることが理解されるであろう。
　以下に、本実施形態による実施例を、図面を参照して詳細に説明する。なお、各実施例において、「アクセプターＲＮＡ」、「修飾対象ＲＮＡ」、「補助核酸鎖」という用語が使用されているが、それぞれ、本発明における「第一の核酸鎖」、「第二の核酸鎖」、「第三の核酸鎖」を示すものである。　
　後述する実施例１～１０は、以下の表２に記載されるＤＮＡ鎖若しくはＲＮＡ鎖を用いて実験を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
［オリゴＲＮＡ鎖のライゲーションによる修飾］　
（実験方法）　
　実験ａは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌと、緩衝液１（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ）とを２μｌ加え、純水を加えて１９μｌにした。
　実験ｂ、ｄは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１を２μｌ、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－１）０．５ｎｍｏｌを加え、純水を加えて１９μｌにした。
　実験ｃは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）、０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１を２μｌ、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－１）０．５ｎｍｏｌ、ポリエチレングリコール２．７μｌを加え、純水を加えて１９μｌにした。
　アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－１）２ｎｍｏｌ、補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖：ＢｒＲ２１－６）２ｎｍｏｌを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液２０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをアニーリング溶液とした。
　実験ｅ、ｆ、ｇは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１を２μｌ、アニーリング溶液５μｌを加え、実験ｆはさらにポリエチレングリコール２．７μｌを加えた後、純水を加えて１９μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした。
　実験ａは１μｌの純水を加え、実験ｂ、ｃ、ｅ、ｆは１．６７μｇのＴ４　ＲＮＡリガーゼ１（１μｌ）、実験ｄ、ｇは０．２９μｇのＴ４　ＲＮＡリガーゼ２（１μｌ）を加えて、３７℃で反応を開始し、１時間後、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇの反応液から２．５μｌ取り、これに反応停止液（８０％　ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０２５％　ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ）を等量加え、直ちに８０℃で５分間の熱処理をし、その後氷上に置き急冷し、１２．５％濃度の変性アクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ緩衝液、７．５Ｍ尿素を含む）で１×ＴＢＥ緩衝液を泳動液として電気泳動をした。電気泳動後は装置からゲルを取り出し、紫外線を当て撮影した。その後、ゲルを臭化エチジュウムで染色した後、紫外線を当て、再度撮影した。
（実験結果）　
　実験ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇでは、実験ｇのみにおいて修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）にアクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－１）がライゲーションし、修飾対象ＲＮＡ　鎖（ｐＲ２１）をＦＩＴＣ標識することができた（図１、レーン７）。Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ１を用いた反応（実験ｂ、ｃ、ｅ、ｆ）では、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’リン酸基と３’ヒドロキシル基がライゲーションし、環状化するが、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－１）とのライゲーションは見られなかった（図１、レーン２、３、５、６）。Ｔ４　ＲＮＡ　リガーゼ２を用いた反応でも補助核酸鎖が無い場合は、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－１）と修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）ライゲーションしなかった（実験ｄ、図１、レーン４）。アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－１）と修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）ライゲーションには、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２と補助核酸鎖が必須であり、この反応では修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の自己環状化を防ぎ、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－１）と修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）を首尾よくライゲーションできる。
［ライゲーションにおける補助核酸鎖の修飾対象ＲＮＡ鎖の塩基配列対合］　
（実験方法）
　アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－１）１ｎｍｏｌ、補助核酸鎖１ｎｍｏｌを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液１０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをアニーリング溶液とした。本実験では、ライゲーションにおける修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’側配列と補助核酸鎖の５’側配列の塩基対合を調べるために、それぞれの実験ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｋに対しそれぞれ補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖）、ＢｒＲ２１－１（ｃ）、ＢｒＲ２１－２（ｄ）、ＢｒＲ２１－３（ｅ）、ＢｒＲ２１－４（ｆ）、ＢｒＲ２１－５（ｇ）、ＢｒＲ２１－６（ｈ）、ＢｒＲ２１－７（ｉ）、ＢｒＲ２１－８（ｊ）、ＢｒＲ２１－Ｆ（ｋ）を使用した。ＢｒＲ２１－１、ＢｒＲ２１－２、ＢｒＲ２１－３、ＢｒＲ２１－４、ＢｒＲ２１－５、ＢｒＲ２１－６、ＢｒＲ２１－７、ＢｒＲ２１－８、ＢｒＲ２１－Ｆはそれぞれ、図２のように修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’側配列に対し、１、２、３、４、５、６、７、８、２１塩基対合となる。
　実験ａは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌと、緩衝液１（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ）を２μｌ加え、純水を加えて１９μｌにした。
　実験ｂは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１を２μｌ加え、純水を加えて１９μｌにした。
　実験ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１を２μｌ、それぞれのアニーリング溶液５μｌを加え、純水を加えて１９μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした。実験ａには純水、１μｌ、実験ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊは０．２９μｇのＴ４　ＲＮＡリガーゼ２（１μｌ）を加えて、３７℃で反応を開始し、１時間後、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋの反応液から２．５μｌ取り、これに反応停止液（８０％　ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０２５％　ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ）を等量加え、直ちに８０℃で５分間の熱処理をし、その後氷上に置き急冷し、１２．５％濃度の変性アクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ緩衝液、７．５Ｍ尿素を含む）で１×ＴＢＥ緩衝液を泳動液として電気泳動をした。電気泳動後は装置からゲルを取り出し、紫外線を当て撮影した。その後、ゲルを臭化エチジュウムで染色した後、紫外線を当て、再度撮影した。
（実験結果）
　塩基対合が４ヌクレオチド以下の実験ｃ、ｄ、ｅ、ｆでは、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－１）と修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）のライゲーションは見られなかった（図３、レーン３、４、５、６）。塩基対合が５塩基の実験ｇでは弱いライゲーションが見られた（図３、レーン７）。また実験ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇでは修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の自己環状化が見られる（図３、レーン３から７）。塩基対合が６ヌクレオチド以上の実験ｈ、ｉ、ｊ、ｋでは修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の自己環状化は抑えられ、首尾よくライゲーションがおこなわれ、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）をＦＩＴＣ標識することができた（図３、レーン８、９、１０、１１）。この結果は、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’側配列と補助核酸鎖の５’側配列において６ヌクレオチド対以上の対合がアクセプターＲＮＡと修飾対象ＲＮＡ鎖のライゲーションを促進することを示す。
　[補助核酸鎖の修飾対象RNA鎖の塩基配列対合の厳密性]　
（実験方法）
　アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－１）１．５ｎｍｏｌ、補助核酸鎖１．５ｎｍｏｌを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液１５μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをアニーリング溶液とした。本実験で用いる補助核酸鎖はその５’側配列８ヌクレオチドが、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’側配列８ヌクレオチドと対合するＢｒＲ２１－８を基準に、その対合配列部分の８ヌクレオチドを一箇所ずつ、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）のヌクレオチドと同じヌクレオチドのものに置換した。ただし、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）のＵに対してはＴを用いた（図４）。具体的には、それぞれの実験ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉに対しそれぞれ補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖）、ＢｒＲ２１－８（ａ）、ＢｒＲ２１－８－１Ｔ（ｂ）、ＢｒＲ２１－８－２Ｇ　（ｃ）、ＢｒＲ２１－８－３Ａ（ｄ）、ＢｒＲ２１－８－４Ｇ（ｅ）、ＢｒＲ２１－８－５Ｇ（ｆ）、ＢｒＲ２１－８－６Ｔ（ｇ）、ＢｒＲ２１－８－７Ａ（ｈ）、ＢｒＲ２１－８－８Ｇ（ｉ）である。
　それぞれの実験ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ）２μｌ、それぞれのアニーリング溶液５μｌを加え、純水を加えて１９μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした後、実験ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉに０．２９μｇのＴ４　ＲＮＡリガーゼ２（１μｌ）を加えて、３７℃で反応を開始し、１時間後、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋの反応液から２．５μｌ取り、これに反応停止液（８０％　ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０２５％　ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ）を等量加え、直ちに８０℃で５分間の熱処理をし、その後氷上に置き急冷し、１２．５％濃度の変性アクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ緩衝液、７．５Ｍ尿素を含む）で１×ＴＢＥ緩衝液を泳動液として電気泳動をした。電気泳動後は装置からゲルを取り出し、紫外線を当て撮影した。
（実験結果）
　修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’側配列８ヌクレオチドとの塩基対合において、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’端から６番目までの対合を１塩基置換により無くすと（実験ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ）、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－１）と修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）のライゲーションは阻害された（図５、レーン２から７）。実験ｈ、ｉのライゲーション反応は実験ａとほぼ同等に進み、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’端から７および８番目の不対合のライゲーションに対する影響は小さい。結果として、補助核酸鎖の５’側配列と、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’側配列の塩基対合は、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’末端から数えて１番目から６番目までの１塩基の不対合で、大きく阻害されることを示している。
［ｍｉＲＮＡの修飾］　
（実験方法）
　本実験では５’末端のヌクレオチドがＵ、Ａ、Ｃ、Ｇと異なる、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓの４種のｍｉＲＮＡ、ｃｅｌ－ｌｉｎ－４（ｐＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＵＣＡＡＧＵＧＵＧＡ、ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　＃　ＭＩＭＡＴ００００００２）、ｃｅｌ－ｍｉＲ－３４（ｐＡＧＧＣＡＧＵＧＵＧＧＵＵＡＧＣＵＧＧＵＵＧ、ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　＃ＭＩＭＡＴ００００００５）、ｃｅｌ－ｍｉＲ－５２（ｐＣＡＣＣＣＧＵＡＣＡＵＡＵＧＵＵＵＣＣＧＵＧＣＵ　ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　＃　ＭＩＭＡＴ０００００２３）、ｃｅｌ－ｍｉＲ－８７（ｐＧＵＧＡＧＣＡＡＡＧＵＵＵＣＡＧＧＵＧＵＧＣ、ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　＃　ＭＩＭＡＴ０００００６０）を修飾対象ＲＮＡ鎖とし、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－１）とのライゲーションによるＦＩＴＣ標識を試みた。
　実験ａは、修飾対象ｃｅｌ－ｌｉｎ－４を０．１ｎｍｏｌと、緩衝液１（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ）を２μｌ加え、純水を加えて１９μｌにした。
　実験ｂは、修飾対象ｃｅｌ－ｌｉｎ－４を０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００　ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ）２μｌを加え、純水を加えて１９μｌにした。
　実験ｃ、ｄ、ｅ、ｆのために、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－１）１．５ｎｍｏｌ、補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖）、ＢｒＬｉｎ－４（実験ｃ）、ＢｒＭｉｒ－３４（実験ｄ）、ＢｒＭｉｒ－５２（実験ｅ）、ＢｒＭｉｒ－８７（実験ｆ）１．５ｎｍｏｌを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液１５μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをそれぞれアニーリング溶液ｃ、ｄ、ｅ、ｆとした。
　実験ｃ、ｄ、ｅ、ｆは、それぞれ２チューブずつ（それぞれｃ１とｃ２、ｄ１とｄ２、ｅ１とｅ２、ｆ１とｆ２）、修飾対象ＲＮＡ鎖、ｃｅｌ－ｌｉｎ－４（実験ｃ）、ｃｅｌ－ｍｉＲ－３４（実験ｄ）、ｃｅｌ－ｍｉＲ－５２（実験ｅ）、ｃｅｌ－ｍｉＲ－８７（実験ｆ）を０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ）２μｌ、対応するアニーリング溶液ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、５μｌを加え、純水を加えて１９μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした。
　実験ａ、ｃ１、ｄ１、ｅ１、ｆ１には純水１μｌを加えて、実験ｂ、ｃ２、ｄ２、ｅ２、ｆ２は０．２９μｇのＴ４　ＲＮＡリガーゼ２（１μｌ）を加えて、３７℃で反応を開始し、１時間後、ａ、ｂ、ｃ１、ｃ２、ｄ１、ｄ２、ｅ１、ｅ２、ｆ１、ｆ２の反応液から２．５μｌ取り、これに反応停止液（８０％　ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０２５％　ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ）を等量加え、直ちに８０℃で５分間の熱処理をし、その後氷上に置き急冷し、１２．５％濃度の変性アクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ緩衝液、７．５Ｍ尿素を含む）で１×ＴＢＥ緩衝液を泳動液として電気泳動をした。電気泳動後は装置からゲルを取り出し、紫外線を当て撮影した。その後、ゲルを臭化エチジュウムで染色した後、紫外線を当て、再度撮影した。
（実験結果）
　補助核酸鎖とＴ４　ＲＮＡリガーゼ２を用いる方法で、５’末端のヌクレオチドがＵ、Ａ、Ｃ、Ｇと異なる４種のｍｉＲＮＡ、ｃｅｌ－ｌｉｎ－４、ｃｅｌ－ｍｉＲ－３４、ｃｅｌ－ｍｉＲ－５２、ｃｅｌ－ｍｉＲ－８７について、これらのｍｉＲＮＡの自己環状化を防ぎ、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－１）とのライゲーションによるＦＩＴＣ標識をおこなうことができた。臭化エチジュウム染色像からはすべての反応においてもとのｍｉＲＮＡ、ｃｅｌ－ｌｉｎ－４、ｃｅｌ－ｍｉＲ－３４、ｃｅｌ－ｍｉＲ－５２、ｃｅｌ－ｍｉＲ－８７はほとんどアクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－１）との反応に消費されたことがわかる。修飾対象ＲＮＡについてＴ４　ＲＮＡリガーゼ２の基質特異性により、修飾されにくいＲＮＡがあることも考えられたが、本実験では、５’末端のヌクレオチドがＵ、Ａ、Ｃ、Ｇと異なるｍｉＲＮＡでもすべて修飾できた（図６）。
［アクセプターＲＮＡの配列に対する酵素特異性］　
（実験方法）
　実験ａは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌに緩衝液１（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ）を２μｌ加え、純水を加えて１９μｌにした。
　実験ｂは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌに緩衝液１（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ）２μｌを加えた後、純水を加えて１９μｌにした。
　実験ｃのために、２ｎｍｏｌのアクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－１）、２ｎｍｏｌの補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖：ＢｒＲ２１－６）を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液２０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをアニーリング溶液ｃとした。
　実験ｄのために、２ｎｍｏｌのアクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－２）、２ｎｍｏｌの補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖：ＢｒＲ２１－１２）を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液２０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをアニーリング溶液ｄとした。
　実験ｅのために、２ｎｍｏｌのアクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－３）、２ｎｍｏｌの補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖：ＢｒＲ２１－１３）を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液２０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをアニーリング溶液ｅとした。
　実験ｆのために、２ｎｍｏｌのアクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－４）、２ｎｍｏｌの補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖：ＢｒＲ２１－１４）を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液２０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをアニーリング溶液ｆとした。
　実験ｃ、ｄ、ｅ、ｆは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ）２μｌ、それぞれアニーリング溶液ｃ、ｄ、ｅ、ｆを５μｌを加え、純水を加えて１９μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした。その後、実験ａは純水１μｌを加えて、実験ｃ、ｄ、ｅ、ｆは０．２９μｇのＴ４　ＲＮＡリガーゼ２（１μｌ）を加えて、３７℃で反応を開始し、１時間後、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆの反応液から１２．５μｌ取り、これに反応停止液（８０％　ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０２５％　ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ）を等量加え、直ちに８０℃で５分間の熱処理をし、その後氷上に置き急冷し、１２．５％濃度の変性アクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ緩衝液、７．５Ｍ尿素を含む）で１×ＴＢＥ緩衝液を泳動液として電気泳動をした。電気泳動後、ライゲーション産物で蛍光のあるバンドをゲルから切り出し、このゲル切片からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ量を計算した。
（実験結果）
　アデニンリボヌクレオチド（実験ｃ）、ウリジンリボヌクレオチド（実験ｄ）、グアニンリボヌクレオチド（実験ｅ）、シトシンリボヌクレオチド（実験ｅ）のホモオリゴマーとＲＮＡ鎖ｐＲ２１のライゲーション率は以下の表３に示すとおりで、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチドホモオリゴマーでは反応が進むが、ウリジンリボヌクレオチドホモオリゴマーではほとんど反応が進まない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　図７では臭化エチジウムの染色像を示すが、ウリジンリボヌクレオチドホモオリゴマーではライゲーション産物に相当するバンドは検出されない。４種のリボヌクレオチドホモオリゴマーではシトシンリボヌクレオチドホモオリゴマーの反応でライゲーション産物が最大であるが、副生成物が多い。図７ではグアニンリボヌクレオチドホモオリゴマーでのライゲーション産物が多く見えるが、これはグアニンリボヌクレオチド鎖が臭化エチジウムに染まりやすいためと思われる。
［オリゴリボヌクレオチドタグの付加反応］　
（実験方法）
　本実験の概略図を図８に示す。　
　実験ａは、ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌと、緩衝液１（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ）を２μｌ加え、純水を加えて１９μｌにした。
　実験ｂは、ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ）２μｌを加えた後、純水を加えて１９μｌにした。
　実験ｃ、ｄ、ｅのために、それぞれのアクセプターＲＮＡ、Ａｃ－１、ＡｃＥｘ０９、ＡｃＥｘ１４、を２ｎｍｏｌ、それぞれの補助核酸鎖、ＢｒＲ２１－６、Ｂｒ２１Ｅｘ、ＢｒＲ２１－６を２ｎｍｏｌを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液２０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをそれぞれアニーリング溶液ｃ、ｄ、ｅとした。
　実験ｃ１、ｄ１、ｅ１は、対応するアニーリング溶液ｃ、ｄ、ｅ、５μｌを加え、純水を加えて１９μｌにした。実験ｃ２、ｄ２、ｅ２、は、ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ）２μｌ、対応するアニーリング溶液ｃ、ｄ、ｅ、５μｌを加え、純水を加えて１９μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした。
　実験ａ、ｃ１、ｄ１、ｅ１には純水１μｌを加えて、実験ｂ、ｃ２、ｄ２、ｅ２は０．２９μｇのＴ４　ＲＮＡリガーゼ２（１μｌ）を加えて、３７℃で反応を開始し、１時間後、ａ、ｂ、ｃ１、ｃ２、ｄ１、ｄ２、ｅ１、ｅ２の反応液から２．５μｌ取り、これに反応停止液（８０％　ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０２５％　ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ）を等量加え、直ちに８０℃で５分間の熱処理をし、その後氷上に置き急冷し、１２．５％濃度の変性アクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ緩衝液、７．５Ｍ尿素を含む）で１×ＴＢＥ緩衝液を泳動液として電気泳動をした。電気泳動後は装置からゲルを取り出し、ゲルを臭化エチジュウムで染色した後、紫外線を当て、撮影した。
（実験結果）
　補助核酸鎖とＴ４　ＲＮＡリガーゼ２を用いる方法で、ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）について、単鎖オリゴリボヌクレオチドをその５’末端する結合することができた。図９はその臭化エチジウム染色像を示すが、ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）にアクセプターＲＮＡ、Ａｃ－１、をライゲーションしたのと同様に効率よくＡｃＥｘ０９、ＡｃＥｘ１４を付加できた。レーン４でＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）に８ｍｅｒのＡｃ－１が結合し２９ｍｅｒのバンドが見られると同様に、レーン６ではＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）に１６ｍｅｒのＡｃＥｘ０９が結合し２９ｍｅｒのバンド見られ、レーン９ではＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）に２２ｍｅｒのＡｃＥｘ１４が結合し４５ｍｅｒのバンド見られる。このことによってＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）について５’側に突き出す、９または１４ｍｅｒの単鎖オリゴリボヌクレオチドタグを付加できたことになる。
［７３　ｍｅｒ　ＲＮＡの修飾］　
（実験方法）
　プラスミド、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ　ＫＳ　ＩＩ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＣＡ）、をＥｃｏＲＶで切断し、Ｔ７プロモター配列、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧの、３’側から３番目のＧから７３塩基が続く、ＲＮＡインビトロ転写の鋳型（鋳型７３）を作製した。ＲＮＡインビトロ転写は４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２ｍＭ　ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰを含む緩衝液に０．１μｇ／μｌの鋳型７３、２ｕ／μｌ　ｏｆ　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを加え、３７℃で３時間反応させ、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿をして７３ｍｅｒ　ＲＮＡを精製した。精製７３ｍｅｒ　ＲＮＡはアルカリホスファターゼで脱リン酸化され、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで再リン酸化された（ｐＲ７３）。
　アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－１）２ｎｍｏｌ、補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖：ＢｒＲ７３）２ｎｍｏｌを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液２０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをアニーリング溶液とした。
　実験ａ、ｂは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ７３）０．０５ｎｍｏｌ、緩衝液１（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ）２μｌ、アニーリング溶液５μｌを加え、純水を加えて１９μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした。
　実験ａ、には純水１μｌを加えて、実験ｂは０．２９μｇのＴ４　ＲＮＡリガーゼ２（１μｌ））を加えて、３７℃で反応を開始し、１時間後、ａ、ｂの反応液から１μｌ取り、これに反応停止液（８０％　ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０２５％　ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ）を等量加え、直ちに８０℃で５分間の熱処理をし、その後氷上に置き急冷し、１０％濃度の変性アクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ緩衝液、７．５Ｍ尿素を含む）で１×ＴＢＥ緩衝液を泳動液として電気泳動をした。
（実験結果）
　補助核酸鎖とＴ４　ＲＮＡリガーゼ２を用いる方法で、７３ヌクレオチドからなるＲＮＡ鎖（ｐＲ７３）について、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ－１）とのライゲーションによるＦＩＴＣ標識がおこなうことができた。臭化エチジュウム染色からは未反応ｐＲ７３は概算で３０％以下であり、７０％以上のｐＲ７３がＦＩＴＣ標識された（図１０）。
［ＲＮＡ選別のためのビオチン化］　
（実験方法）
　アクセプターＲＮＡ、Ａｃ－１または５’末端をビオチン化したＡｃＢ－１を２ｎｍｏｌ、補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖：ＢｒＬｉｎ－４）２ｎｍｏｌを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液２０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをそれぞれアニーリング溶液Ｆ、Ｂとした。
　実験ａ、ｂは、ｐｌｉｎ４の３’末をＦＩＴＣ標識したＲＮＡ鎖（ｐｌｉｎ４－ＦＩＴＣ）０．２ｎｍｏｌ、緩衝液１（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ）２μｌ、アニーリング溶液Ｆを５μｌを加え、純水を加えて１８μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした。
　実験ｃ、ｄは、ＲＮＡ鎖（ｐｌｉｎ４－ＦＩＴＣ）０．２ｎｍｏｌ、緩衝液１（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ）２μｌ、アニーリング溶液Ｂを５μｌ加え、純水を加えて１８μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした。
　実験ａ、ｃには純水２μｌを加えて、実験ｂ、ｄは０．２９μｇのＴ４　ＲＮＡリガーゼ２（２μｌ）を加えて、３７℃で反応を１時間おこなった。一方、ストレプトアビジン磁気ビーズ懸濁液（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　ＭｙＯｎｅ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅ　Ｃ１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を磁石によってストレプトアビジン磁気ビーズを集め、これを緩衝液２（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２Ｍ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で洗浄した。１時間ライゲーション反応した実験ｂ、ｄからの反応液１０μｌを、もともと２０μｌ懸濁液からの洗浄済みストレプトアビジン磁気ビーズ沈殿と混ぜ、懸濁し、ときどき揺らしながら１５分間放置した。その後を磁石によってストレプトアビジン磁気ビーズを除き、液体部分を回収した（１０μｌ）。ストレプトアビジン磁気ビーズ処理前の実験ａ、ｂ、ｃ、ｄおよび磁気ビーズ処理後の実験ｂ、ｄおよび２．５μｌに対し、反応停止液（８０％　ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０２５％　ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ）を等量加え、直ちに８０℃で５分間の熱処理をし、その後氷上に置き急冷し、１０％濃度の変性アクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ緩衝液、７．５Ｍ尿素を含む）で１×ＴＢＥ緩衝液を泳動液として電気泳動をした。電気泳動後は装置からゲルを取り出し、紫外線を当て撮影した。その後、ゲルを臭化エチジュウムで染色した後、紫外線を当て、再度撮影した。
（実験結果）
　図１１ではレーン３、５が磁気ビース処理前の実験ｂ、ｄ、レーン５、６が磁気ビーズ処理後の実験ｂ、ｄを示している。実験ｂは磁気ビーズ処理前も処理後もアクセプターＲＮＡ、Ａｃ－１とｐｌｉｎ４－ＦＩＴＣがライゲーションしたバンドが同じように見られる（レーン３と５の比較）。一方、実験ｄは磁気ビーズ処理後ではアクセプターＲＮＡ、ＡｃＢ－１とｐｌｉｎ４－ＦＩＴＣがライゲーションしたバンドが消失し（レーン４と６の比較）、ビオチン化されたＡｃＢ－１結合ｐｌｉｎ４－ＦＩＴＣがストレプトアビジン磁気ビーズに捕捉されたことがわかる。これは、実験ｂのｐｌｉｎ４－ＦＩＴＣが効率的にＡｃＢ－１とライゲーションしたことを示している。
［Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２の調製］　
　Ｔ４ファージゲノムＤＮＡから　Ｔ４　ｇｅｎｅ２４．１を得て、これを大腸菌発現ベクターｐＥＴＢＡ（株式会社バイオダイナミクス研究所）のＢａｍＨＩとＮｏｔＩの制限酵素部位にクローニングした（このプラスミドをｐＥＴＢＴ４Ｌ２とする）。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）をｐＥＴＢＴ４Ｌ２にて形質転換し、ｐＥＴＢＴ４Ｌ２を保持した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴＢＴ４Ｌ２を得た。
　このＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴＢＴ４Ｌ２を０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、ＯＤ６００が０．５に達した時点で１ｍＭ　ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を加え、さらに３時間培養し、遠心機にて集菌した。５０ｍｌの培養溶液から得られた菌体ペレットに９ｍｌの５０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールｐＨ８．０緩衝液を加え菌体ペレットを再懸濁後、１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を１ｍｌ加え攪拌し、氷上で３０分間静置した。これを遠心分離し、上清を得た後、０．２μｍ孔径のシリンジフィルターでろ過をおこない、粗酵素ろ液を得た。
　樹脂量１ｍｌのＰｒｏｂａｎｄ　ｃｏｌｕｍｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を５０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４　３００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０緩衝液で平衡化をおこない、これに前述の粗酵素ろ液を供与し、続いて１０ｍｌの５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　イミダゾール、ｐＨ８．０緩衝液および１０ｍｌの５０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０緩衝液で洗浄後、５０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０緩衝液で溶出を行った。得られたＴ４　ＲＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ２溶出画分を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ　ＫＣｌ、７０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｍＭ　ＤＴＴ、０．２ｍＭ　ＥＤＴＡに対して４℃で透析を行った。得られた透析内液９１０μｌ（タンパク量：０．５３ｍｇ）に等量のグリセロールを加え酵素溶液とした。タンパク質量の測定には、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔを使用し、ＢＳＡを標準として用いた。
［ライゲーション速度と補助核酸鎖の鎖長］　
（実験方法）
　本実験では、アクセプターＲＮＡ（Ａｃ－１）とＲＮＡ鎖ｐＲ２１のライゲーションについて、ＲＮＡ鎖ｐＲ２１と対合する配列の鎖長が異なる補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖）、ＢｒＲ２１－６、ＢｒＲ２１－１２、ＢｒＲ２１－Ｆを用いて反応速度を比較した（図１２参照）。
　実験ａは、修飾対象ＲＮＡ鎖ｐＲ２１を２μｇ（０．２７ｎｍｏｌ）と緩衝液１（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ）を２μｌ加え、純水を加えて１９μｌにした。
　実験ｂ、ｃ、ｄのために、アクセプターＲＮＡ（Ａｃ－１）２ｎｍｏｌ、補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖）、ＢｒＲ２１－６（実験ｂ）、ＢｒＲ２１－１２（実験ｃ）、ＢｒＲ２１－Ｆ（実験ｄ）２　ｎｍｏｌを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液２０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをそれぞれアニーリング溶液ｂ、ｃ、ｄとした。
　実験ｂ、ｃ、ｄは、修飾対象ＲＮＡ鎖ｐＲ２１を２μｇ（０．２７ｎｍｏｌ）、緩衝液１（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ）５μｌ、対応するアニーリング溶液ｂ、ｃ、ｄを１２．５μｌを加え、純水を加えて１９μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした。
　実験ａには純水１μｌを加えて、実験ｂ、ｃ、ｄは０．２９μｇのＴ４　ＲＮＡリガーゼ２（１μｌ）を加えて、室温（２５℃）で反応を開始し、１０分後、３０分後、そして１時間後、反応液から２．５μｌ取り、これに反応停止液（８０％　ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０２５％　ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ）を等量加え、直ちに８０℃で５分間の熱処理をし、その後氷上に置き急冷し、１２．５％濃度の変性アクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ緩衝液、７．５Ｍ尿素を含む）で１×ＴＢＥ緩衝液を泳動液として電気泳動をした。電気泳動後、装置からゲルを取り出し、ゲルを臭化エチジュウムで染色した後、紫外線を当て、再度撮影した。
（実験結果）
　図１３ではレーン２、３、４が、補助核酸鎖ＢｒＲ２１－６（ＲＮＡ鎖ｐＲ２１と６塩基対合）を、レーン５、６、７が、ＢｒＲ２１－１２（ＲＮＡ鎖ｐＲ２１と１２塩基対合）を、レーン８、９、１０が、ＢｒＲ２１－Ｆ（ＲＮＡ鎖ｐＲ２１と２１塩基対合）を、用いたアクセプターＲＮＡ鎖Ａｃ－１とＲＮＡ鎖ｐＲ２１のライゲーション実験の結果を示している。
　補助核酸鎖ＢｒＲ２１－６を用いた場合、２μｇのＲＮＡ鎖ｐＲ２１の大部分が１０分間でＲＮＡ鎖Ａｃ－１とライゲーションした２９ｍｅｒのＲＮＡ鎖に変換され、３０分後にはＲＮＡ鎖ｐＲ２１がすべて２９ｍｅｒのＲＮＡ鎖に変換され、反応が終了している。補助核酸鎖ＢｒＲ２１－１２を用いた場合、２μｇのＲＮＡ鎖ｐＲ２１は３０分間で約５０％がＲＮＡ鎖Ａｃ－１とライゲーションした２９ｍｅｒのＲＮＡ鎖に変換され、１時間後は６０％以上が２９ｍｅｒのＲＮＡ鎖に変換されているが、反応が終了していない。助核酸鎖ＢｒＲ２１－Ｆを用いた場合、２μｇのＲＮＡ鎖ｐＲ２１は３０分間で少量がＲＮＡ鎖Ａｃ－１とライゲーションした２９ｍｅｒのＲＮＡ鎖に変換され、１時間後でも約５０％のＲＮＡ鎖ｐＲ２１が未反応のまま残っていた。
　以上の結果はアクセプターＲＮＡ鎖Ａｃ－１と修飾対象ＲＮＡ鎖ｐＲ２１のライゲーションに関して、用いる補助核酸鎖のＲＮＡ鎖ｐＲ２１と塩基対合する鎖長によって反応速度が変化し、塩基対合する鎖長が長いほど反応が遅いことを示している。一方、別の実験結果から、塩基対合する鎖長が短いＢｒＲ２１－６を用いた場合、酵素量０．５μｇ、室温（２５℃）反応で、少なくとも１０μｇのＲＮＡ鎖ｐＲ２１がアクセプターＲＮＡ鎖Ａｃ－１とライゲーションしている。
　その他、本発明は、さまざまに変形可能であることは言うまでもなく、上述した一実施形態に限定されず、発明の要旨を変更しない範囲で種々変形可能である。

Claims (10)

  1. 　第一の核酸鎖の３’ヒドロシル基と、第二の核酸鎖の５’リン酸基とを結合する方法であって、
    　前記第一の核酸鎖の少なくとも一部と前記第二の核酸鎖の少なくとも一部とに相補的に結合する第三の核酸鎖の存在下において、少なくとも１以上のリボヌクレオチドを３’末端に有する前記第一の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との塩基対形成、および前記第二の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との塩基対形成を、同時にまたは別々に行う工程と、その工程で得られた前記第一の核酸鎖、前記第二の核酸鎖、前記第三の核酸鎖の三者の核酸鎖の混合物に、ＥＣ６．５．１．３に分類され且つ二本鎖核酸ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを添加する工程を有し、
    　前記第三の核酸鎖は、前記第一の核酸鎖の３’末端の塩基を含む少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有し、また前記第三の核酸鎖は、前記第二の核酸鎖の５’末端の塩基を含む少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有し、且つ前記第二の核酸鎖に対して相補的となる前記第三の核酸鎖における塩基配列が、前記第二の核酸鎖の鎖長の１／２未満となるものであることを特徴とする方法。
  2. 　請求項１記載の方法において、前記ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４　ＲＮＡリガーゼ２であることを特徴とする、方法。
  3. 　請求項１記載の方法において、前記第三の核酸鎖は、前記第二の核酸鎖に対して相補的となる前記第三の核酸鎖における塩基配列が１０塩基以下となるものであることを特徴とする、方法。
  4. 　請求項１記載の方法において、前記第二の核酸鎖は、ＲＮＡ鎖であることを特徴とする、方法。
  5. 　請求項１記載の方法において、前記第一の核酸鎖は、単一塩基が６塩基以上連続する塩基配列を有するものであることを特徴とする、方法。
  6. 　請求項１記載の方法において、前記第一の核酸鎖は、色素、蛍光色素またはビオチンによって標識された５’末端を有するものであることを特徴とする、方法。
  7. 　請求項１記載の方法に用いるキットであって、
    　少なくとも１以上のリボヌクレオチドを３’末端に有する前記第一の核酸鎖と、
    　ＥＣ６．５．１．３に分類され且つ二本鎖核酸ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼと、
    　前記結合反応のための反応緩衝液と、
    　を有するものであることを特徴とする、キット。
  8. 　請求項７記載のキットにおいて、前記ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４　ＲＮＡリガーゼ２であることを特徴とする、キット。
  9. 　請求項７記載のキットにおいて、前記第一の核酸鎖は、単一塩基が６塩基以上連続する塩基配列を有するものであることを特徴とする、キット。
  10. 　請求項７記載のキットにおいて、前記第一の核酸鎖は、色素、蛍光色素またはビオチンによって標識された５’末端を有するものであることを特徴とする、キット。
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