WO2011043465A1 - ポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測方法 - Google Patents

ポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測方法 Download PDF

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WO2011043465A1
WO2011043465A1 PCT/JP2010/067758 JP2010067758W WO2011043465A1 WO 2011043465 A1 WO2011043465 A1 WO 2011043465A1 JP 2010067758 W JP2010067758 W JP 2010067758W WO 2011043465 A1 WO2011043465 A1 WO 2011043465A1
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WO
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single nucleotide
allele
risk
polypoidal choroidal
choroidal vasculopathy
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PCT/JP2010/067758
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岳 岩田
聖 松野
Original Assignee
独立行政法人国立病院機構
参天製薬株式会社
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/16—Ophthalmology
    • G01N2800/164—Retinal disorders, e.g. retinopathy

Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting the risk of polypoidal choroidal vasculopathy. More specifically, the present invention relates to a method for predicting the risk of polypoidal choroidal vasculopathy by detecting a single nucleotide polymorphism associated with polypoidal choroidal vasculopathy, and a kit used for the predicting method.
  • Polypoidal choroidal vasculopathy (hereinafter also referred to as PCV) is a disease characterized by the formation of an abnormal vascular network in the choroid and a polypoid lesion at the end.
  • PCV Polypoidal choroidal vasculopathy has been confused for a long time with exudative age-related macular degeneration (hereinafter also referred to as AMD) accompanied by abnormal angiogenesis in the choroid.
  • AMD exudative age-related macular degeneration
  • a single nucleotide polymorphism is a substitution mutation in which one base changes to another base in the base sequence of an individual's genome. It is a polymorphism that exists at a frequency of 1% or more. Single nucleotide polymorphisms exist in introns, exons, or other genomic regions on genes.
  • a fundus test for example, a method of inspecting the fundus after intravenous injection of a fluorescent dye such as ICG is used.
  • the burden on the patient is not necessarily light, such as the mydriatic state persisting for several hours.
  • photodynamic therapy is performed for the treatment of polypoidal choroidal vasculopathy.
  • patients who have progressed in the treatment also have a risk of recurrence, and it is necessary to repeat the treatment. From the viewpoint of reducing the physical, mental and economic burdens on patients, it is extremely important to obtain early diagnosis and early diagnosis in the treatment of polypoidal choroidal vasculopathy. That is, it is an important unresolved need to receive a diagnosis of polypoidal choroidal vasculopathy at an earlier stage or to know the risk of developing polypoidal choroidal vasculopathy in the future.
  • the present inventors have focused on polymorphisms on the genome, particularly single nucleotide polymorphisms, in order to find genes associated with polypoidal choroidal vasculopathy.
  • polypoidal choroidal vasculopathy By finding a polymorphism related to polypoidal choroidal vasculopathy, it becomes possible to determine the risk of polypoidal choroidal vasculopathy based on whether or not the polymorphic choroidal vasculopathy is present. In the future, it is possible to know that there is a risk of polypoidal choroidal vascular disease in the future, or it can be used to assist in the diagnosis of early polypoidal choroidal vascular disease. That is, by knowing the risk of polypoidal choroidal vasculopathy, the sample provider can take preventive measures for the onset of polypoidal choroidal vasculopathy, and early treatment can be started with an early confirmed diagnosis. Therefore, it is significant to find polymorphisms involved in polypoidal choroidal vasculopathy.
  • An object of the present invention is to provide a method for predicting the risk of polypoidal choroidal vasculopathy by detecting a single nucleotide polymorphism associated with polypoidal choroidal vasculopathy, and a kit used for the detection method.
  • the present inventors cover known polymorphic sites present on the genome (in particular, autosome) of polypoidal choroidal vasculopathy patients (PCV patients) and non-polypoidal choroidal vasculopathy patients (non-PCV patients). Analysis, a single nucleotide polymorphism related to polypoidal choroidal vasculopathy was found, and furthermore, a risk allele and a non-risk allele that was the opposite allele in the single nucleotide polymorphism were found, and the present invention was completed.
  • the present invention [1] A nucleic acid molecule in a sample derived from a subject, which is present in the 17th position of the base sequence in at least one base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 70 or a complementary sequence thereof A step of detecting in vitro a single nucleotide polymorphism allele to be detected (detection step), and a step of determining whether at least one of the detected alleles is a risk allele (determination step) A method for predicting the risk of polypoidal choroidal vasculopathy, comprising: And [2] the nucleic acid molecule in the subject-derived sample, in at least one base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 70 or a complementary sequence thereof, in the 17th position of the base sequence
  • the present invention relates to a kit for predicting the risk of polypoidal choroidal vasculopathy, comprising a nucleic acid molecule for
  • the presence / absence and / or risk of polypoidal choroidal vasculopathy of the sample provider can be predicted. Based on this risk, the sample provider can take an early diagnosis by taking preventive measures for polypoidal choroidal vasculopathy or regularly seeing it, and can start appropriate treatment at an early stage when the disease does not progress.
  • a sample provider suspected of having polypoidal choroidal vasculopathy can be determined to have a high probability of being diagnosed with polypoidal choroidal vasculopathy, and treatment can be started at an early stage. it can.
  • the present invention relates to a method for predicting the risk of polypoidal choroidal vasculopathy based on a single nucleotide polymorphism of a gene (hereinafter sometimes referred to as SNP).
  • a step of detecting in vitro a single nucleotide polymorphism allele present in the 17th position of the base sequence in at least one base sequence selected from the group consisting of base sequences or a complementary sequence thereof (detection step); and
  • the present invention finds single nucleotide polymorphisms related to polypoidal choroidal vasculopathy (also referred to as single nucleotide polymorphisms of the present invention), further finds risk alleles and their alleles in the single nucleotide polymorphisms, and uses them In particular, it has a great feature. Therefore, using the risk allele and / or using the odds ratio calculated based on the frequency of the risk allele and its allele as an index, predicting the onset of such polypoidal choroidal vasculopathy It is also possible to test the susceptibility to polypoidal choroidal vasculopathy, and the method can also be used as a method for measuring or determining a polypoidal choroidal vasculopathy onset factor.
  • the polymorphism means that there is diversity in the sequence at a specific position of the genome in a certain biological species, and the site where the polymorphism exists (hereinafter also referred to as polymorphic site) The site on the genome where a single nucleotide polymorphism exists.
  • an allele refers to each type having different bases that can be taken at a certain polymorphic site.
  • the genotype refers to an arbitrary combination of a specific allele (also referred to as one allele) and an allele opposite to the allele (also referred to as the other allele) at a certain polymorphic site.
  • the same allele combination is called a homotype and the different allele combination is called a heterotype.
  • an allele that conflicts refers to another allele that corresponds to the specified allele that constitutes a single nucleotide polymorphism.
  • a single nucleotide polymorphism associated with polypoidal choroidal vasculopathy is defined as a single nucleotide polymorphism between a polypoidal choroidal vasculopathy patient (PCV patient) and a non-polypoidal choroidal vasculopathy patient (non-PCV patient)
  • PCV patient polypoidal choroidal vasculopathy patient
  • non-PCV patient non-polypoidal choroidal vasculopathy patient
  • the risk of polypoidal choroidal vasculopathy refers to the risk of polypoidal choroidal vasculopathy.
  • the risk of polypoidal choroidal vasculopathy in the present invention includes the possibility of developing polypoidal choroidal vasculopathy in the future and the likelihood of developing polypoidal choroidal vasculopathy.
  • risk prediction means that the presence or absence of a future risk is determined at the present time, or the magnitude of the future risk is determined at the present time.
  • the risk allele is such that the odds ratio obtained for each allele of the single nucleotide polymorphism alleles related to the polypoidal choroidal vasculopathy is greater than 1.
  • a non-risk allele is an allele whose risk ratio is 1 or less because it is a confrontation allele of a risk allele.
  • the odds ratio obtained for each allele that is, the odds ratio obtained for one allele is the ratio of the frequency of one allele to the frequency of the other allele (opposite allele) in a PCV patient group. Divided by the ratio of the frequency of the one allele to the frequency of the other allele in the group.
  • the odds ratio obtained for one allele is the reciprocal of the odds ratio obtained for the other allele. Details of the odds ratio will be described later.
  • the allele frequency means the ratio of a specific allele to the whole in a certain group.For example, the allele of each individual belonging to a certain group is determined by the method described in the examples. Can be obtained. Other matters not described in this specification include an introduction to genetic statistics (Naoya Kamatani; Iwanami Shoten, 2007) or bioinformatics second edition (written by MountMoDW, translated by Koji Okazaki et al .; Medical Science International, 2005), etc. You can refer to the book.
  • Single nucleotide polymorphisms associated with polypoidal choroidal vasculopathy extract total DNA from the blood of PCV patients diagnosed with polypoidal choroidal vasculopathy and non-PCV patients diagnosed with polypoidal choroidal vasculopathy
  • individual single nucleotide polymorphism alleles are specific to PCV patients or non-PCV patients, more specifically, statistically significant. It was found by analyzing whether or not it exists.
  • the non-PCV patient as a control may be a person who is not polypoidal choroidal vasculopathy.
  • Patients diagnosed as not having polypoidal choroidal vasculopathy and diagnosed with other diseases such as glaucoma and / or cataract may be used as controls.
  • a comparison between patients (group) with a disease used as a control and patients (group) with polypoidal choroidal vasculopathy It is preferable to use a single nucleotide polymorphism that is performed on a disease and is commonly determined to have a significant difference at a certain p value. By using such a single nucleotide polymorphism allele, the risk of polypoidal choroidal vasculopathy can be predicted.
  • single nucleotide polymorphisms associated with the polypoidal choroidal vasculopathy disclosed in the present invention can be identified by the following method.
  • Total DNA is extracted from the blood of PCV patients diagnosed with polypoidal choroidal vasculopathy and non-PCV patients diagnosed with no polypoidal choroidal vasculopathy.
  • Total DNA in blood can be extracted by any known method, but can be extracted by a known method such as a phenol extraction method (Methods in Enzymology, 152, 181 pages, 1987).
  • the type of base in the single nucleotide polymorphism in the extracted DNA sample is performed by, for example, a method using a solidified probe (microarray) described later, PCR such as TaqMan (registered trademark) method. It can be performed by an arbitrary method such as an applied method. In that case, the probe used for detection can be designed based on the target single nucleotide polymorphism and its peripheral sequence information. In designing, for example, a database of known single nucleotide polymorphisms such as dbSNP provided by the National Center for Biotechnology Information (NCBI) in the United States or SNP information provided by the HapMap project, or Genbank provided by NCBI, etc.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the probe used for detecting a single nucleotide polymorphism can be detected by either a probe complementary to the genomic sense strand or a probe complementary to the antisense strand.
  • kits that can detect a large number of single nucleotide polymorphism alleles in the same procedure by solidifying a large number of probes capable of detecting single nucleotide polymorphisms existing on the human genome. It is also possible to detect alleles in a sample efficiently. Many of such kits are configured to detect each opposing allele contained in one sample by the same operation, and can determine the genotype.
  • a microarray type single nucleotide polymorphism analysis kit (Affymetrix, Genechip Human Mapping 250K Nsp / Sty array (GeneChip (registered trademark) Human Mapping 250K Nsp / Sty Array) ].
  • alleles present in DNA derived from PCV patients and non-PCV patients are identified by the method described above, and the frequency of each allele is determined between PCV patients and non-PCV patients. And the allele frequency can be determined based on whether or not there is a significant difference in the p value described later.
  • Fisher's exact test Chi-square test
  • Cochran-Armitage test when it is necessary to correct the increase in risk of occurrence of the first type of error due to repeated comparisons, it can be corrected by a known method such as Bonferroni, Holm, or Benjamini and Hofberg. it can.
  • polypoidal choroidal vasculopathy Illustrating the case based on Bonferroni's correction, it is related to polypoidal choroidal vasculopathy by dividing the desired significance level, eg 5 ⁇ 10 -2 significance level, by the number of iterations, ie the number of polymorphic sites used in the analysis Determine the single nucleotide polymorphisms associated with polypoidal choroidal vasculopathy with a risk factor of at most 5 ⁇ 10 -2 even if the first type of error is considered at the maximum by using the significance level used for SNP selection Can do.
  • a single nucleotide polymorphism lower than the significance level set in this way can be selected as a more preferable single nucleotide polymorphism.
  • Bonferroni correction is overcorrection, and the p value is significantly reduced, so there is a possibility of overlooking single nucleotide polymorphisms related to diseases. It has also been reported to increase (Schymick JC et al., Lancet Neurology. 2007: 6: 322-8, Van Steen K et al., Nature Genetics. 2005: 37: 683-691).
  • the method by Benjamini and Hoffberg is a method for suppressing the ratio (False Discovery Rate; FDR) to be determined to be a significant level in the multiple analysis as a whole even though it is not actually significant.
  • Benjamini Y, Hochberg T: J. Royal Stat Soc B85 pp289-300, 1995 that is, when statistical analysis is performed on n single nucleotide polymorphisms, p values of single nucleotide polymorphisms not related to a disease are considered to be uniformly distributed in the range of 0 to 1. On the other hand, it is considered that the p value of single nucleotide polymorphisms related to the disease is concentrated around 0.
  • the ratio of single nucleotide polymorphisms that are truly related to a disease is ⁇
  • the ratio of single nucleotide polymorphisms that are not related to a disease is 1 ⁇ .
  • the expected value of the number of single nucleotide polymorphisms having a p value of not more than the significance level ⁇ and not related to a disease is n ⁇ (1- ⁇ ). If the number of single nucleotide polymorphisms that became significant by statistical analysis is R, the ratio of single nucleotide polymorphisms incorrectly determined, that is, FDR is n ⁇ (1- ⁇ ) / R.
  • n ⁇ (1- ⁇ ) / R ⁇ n ⁇ / R the value of n ⁇ / R can be set to a desired value by varying ⁇ .
  • the expected value of the ratio of single nucleotide polymorphisms unrelated to the disease is npi (1- ⁇ ) / i. Since this value decreases as i decreases, it can be considered that r single nucleotide polymorphisms are associated with the desired disease in order from the smallest p value, where r is the desired FDR.
  • the significance level when repeatedly analyzing 500,000 single nucleotide polymorphisms is preferably, for example, 1 ⁇ 10 ⁇ 3 , more preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 4 , and more preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 5 is more preferable, 3 ⁇ 10 ⁇ 6 is more preferable, 1 ⁇ 10 ⁇ 6 is more preferable, and 3 ⁇ 10 ⁇ 7 is more preferable.
  • the first type of error and the statistical power are inversely proportional.
  • One method of maintaining power while reducing the first type of error is to perform single nucleotide polymorphism analysis in two stages (Skol AD et al., Nature Genetics. 2006: 38: 209-213). For example, first, a large number of single nucleotide polymorphism analyzes over the entire genome are performed as a primary analysis, and then an analysis is performed using a single nucleotide polymorphism narrowed down to some extent in the primary analysis as a secondary analysis. In this case, a single nucleotide polymorphism that has a relatively low p value in any analysis may be selected.
  • a single nucleotide polymorphism that is a candidate in the first analysis is a desired p value, for example, 0.001 to What is less than 0.05 is selected, and the selected single nucleotide polymorphism may be further analyzed in consideration of multiplicity.
  • a region where SNPs related to a disease are continuously present at a relatively low p value is found in a certain region on the genome. SNPs belonging to such areas are highly related to diseases.
  • a region in which single nucleotide polymorphisms related to a disease are continuously present in this manner may have a so-called linkage disequilibrium state in which the recombination rate of genomic DNA is 0 or extremely low. High nature.
  • a region on the genome in linkage disequilibrium is called an LD block.
  • Whether or not the region is in a linkage disequilibrium state is determined by a known method based on the analysis result of the region or a database of linkage disequilibrium, for example, a database of known LD block structures provided by the HapMap project. This can be confirmed.
  • any single nucleotide polymorphism in the linkage disequilibrium state preferably any single nucleotide polymorphism, preferably the pairwise tagging method
  • a single nucleotide polymorphism determined by narrowing down by the so-called tag SNP, a plurality of single nucleotide polymorphisms in the linkage disequilibrium state can be represented.
  • the single nucleotide polymorphisms associated with the polypoidal choroidal vasculopathy of the present invention are reanalyzed, for example, by reanalysis using TaqMan (registered trademark) SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems) ⁇ . New disease-related single nucleotide polymorphisms may be found that are in linkage disequilibrium with the type.
  • the present invention in the analysis of single nucleotide polymorphisms related to polypoidal choroidal vasculopathy on autosomes, as a primary analysis, as a combination of genotypes in individual single nucleotide polymorphisms, that is, the homotype of one allele A genotype that is a heterotype and a homotype of the other allele, a homotype of one allele + a heterotype of the other allele, a homotype of one allele vs.
  • cataract patients and glaucoma patients are collectively used as a control group, and the single nucleotide polymorphism candidate related to the polypoidal choroidal vasculopathy described above is again set to the same p value for the PCV patient group and the control group.
  • the smallest p value obtained by applying three statistical models was used as the p value representing the single nucleotide polymorphism.
  • a single nucleotide polymorphism used for detection of an allele or genotype associated with polypoidal choroidal vasculopathy is a single nucleotide polymorphism associated with polypoidal choroidal vasculopathy described above when the multiplicity is adjusted by Bonferroni correction.
  • Bonferroni correction is performed on the number of single nucleotide polymorphisms that are considered as type candidates, and a significance level for selecting a suitable single nucleotide polymorphism can be set. Specifically, the desired significance level of 5 ⁇ 10 ⁇ 2 is divided by the number of repetitions of 370 times, and a single nucleotide polymorphism associated with polypoidal choroidal vasculopathy is converted to a single nucleotide polymorphism of p value of 1.35 ⁇ 10 ⁇ 4 or less. Among them, a more preferable single nucleotide polymorphism was used.
  • the quality of the detection result is confirmed in advance for the single nucleotide polymorphism used in the analysis, and the single nucleotide polymorphism detected at a reasonable quality is analyzed. It is desirable to provide. Elements used for such quality confirmation include call rate, Hardy-Weinberg equilibrium and minor allele frequency.
  • each single nucleotide polymorphism in all samples that is, the polymorphic site having a low call rate has a high rate of occurrence of typing errors and is not highly reliable. For this reason, it is desirable to analyze using a single nucleotide polymorphic site having a sufficiently high call rate.
  • a call rate as a criterion for accepting or rejecting a single nucleotide polymorphism, for example, a single nucleotide polymorphism showing a call rate of 70%, preferably 75%, more preferably 80%, still more preferably 85%, more preferably 90% or more. It is desirable to adopt a mold.
  • Hardy-Weinberg equilibrium means that in a genetically uniform population with no sufficient variation or selection pressure and a sufficient number of individuals formed by random mating, the distribution frequency of alleles at a given locus Say that it is constant. Whether or not the Hardy-Weinberg equilibrium is established can be statistically tested by several known methods such as the Chi-square test and Fisher's exact test. In general, Hardy-Weinberg equilibria are established in a sufficient number of human populations, so generally genotyping errors are detected on the assumption that Hardy-Weinberg equilibria are established in the population. The study of Hardy-Weinberg equilibrium is used for this purpose. When statistically testing the establishment of the Hardy-Weinberg equilibrium, 0.0001 is used as the significance level, for example.
  • the minor allele frequency is the frequency of the lower allele of the two alleles in the case of single nucleotide polymorphisms contained in the two alleles.
  • the threshold value can be set arbitrarily. As described above, since the concept of single nucleotide polymorphism has a minor allele frequency exceeding about 1%, it is desirable to reject single nucleotide polymorphisms having a minor allele frequency of less than 1%. In addition, in the search for polymorphisms that cause multifactor diseases such as the present invention, it is considered that a plurality of polymorphisms having relatively low relative involvement in the disease are involved. It is desirable to reject single nucleotide polymorphisms with a certain frequency, for example, less than 5%.
  • the single nucleotide polymorphism related to polypoidal choroidal vasculopathy thus obtained is a known sequence database such as Genbank provided by NCBI or a database of dbSNP or HapMap project provided by NCBI.
  • SNP ID especially dbSNP ID
  • sequence information around the single nucleotide polymorphism single nucleotide A gene having a polymorphism or a gene present in the vicinity of a single nucleotide polymorphism, and if present on a gene, distinguishing whether the position of the single nucleotide polymorphism is an intron or an exon, the function of the gene, Information such as homologous genes can be obtained, nucleic acid molecules used in the present invention can be obtained based on these information, and probes used in the present invention can be designed.
  • odds are used as an index of how strong association exists between one allele and the presence or absence of polypoidal choroidal vasculopathy.
  • the ratio can be determined. Odds is the value of the probability of an event occurring in a group divided by the probability that the event does not occur.
  • the odds ratio is the ratio of odds in two different groups.
  • the odds ratio that is a disease when having an allele that is, the ratio of the frequency of one allele to the frequency of the other allele in the PCV patient group. Is divided by the ratio of the frequency of one allele to the other frequency in the non-PCV patient group. In this case, the obtained odds ratio is referred to as the obtained odds ratio for the “one allele”.
  • the odds ratio can be approximated using an appropriate number instead of 0. .
  • an appropriate number used in place of 0 for example, a real number exceeding 0 such as 0.5 or 0.1 can be used.
  • the risk allele is determined using the odds ratio obtained for the allele.
  • the odds ratio obtained for one allele is the reciprocal of the odds ratio obtained for the other allele.
  • an allele whose odds ratio obtained for an allele is greater than 1 is called a risk allele, and an allele that opposes the risk allele is called a non-risk allele.
  • the term “allele odds ratio” refers to the odds ratio obtained for the risk allele, that is, the odds ratio of polypoidal choroidal vasculopathy when the risk allele is present.
  • the risk of polypoidal choroidal vasculopathy can be predicted by these indices.
  • a certain single nucleotide polymorphism risk allele is an allele observed more frequently in the PCV patient group than in the non-PCV patient group, that is, an allele involved in the risk of polypoidal choroidal vasculopathy.
  • the reciprocal of the odds ratio of the allele by using the reciprocal of the odds ratio of the allele, it is possible to predict the disease risk of the non-risk allele. That is, as the reciprocal of the odds ratio of the allele is smaller than 1, it can be used for predicting that the disease risk of the non-risk allele is low.
  • the risk of polypoidal choroidal vasculopathy can be predicted using a genotype in addition to or instead of an allele, that is, a genotype that is a combination of one allele and its allele.
  • the risk allele may be used as a reference as in the case of the allele, and the genotype considered to be at risk of polypoidal choroidal vasculopathy can be determined in consideration of the odds ratio.
  • the dominant type odds ratio is the odds ratio of polypoidal choroidal vasculopathy when there is at least one risk allele (ie, when the risk allele is homozygous or heterozygous), ie, the PCV patient group
  • Recessive odds ratio is the odds ratio of polypoidal choroidal vasculopathy when the risk allele is homozygous, that is, the frequency of the risk allele homotype in the PCV patient group and the non-risk
  • the ratio of the allele homozygous frequency to the sum of the heterozygous frequencies is calculated by comparing the risk allele homotypic frequency, the non-risk allele homotypic frequency and the heterozygous frequency in the non-PCV patient group. Divided by the ratio to the sum of the frequencies.
  • the genotype considered to be a risk of polypoidal choroidal vasculopathy it is determined as follows in consideration of the dominant-type odds ratio and the recessive-type odds ratio obtained as described above.
  • each single nucleotide polymorphism related to polypoidal choroidal vasculopathy when the dominant type odds ratio is larger than the recessive type odds ratio, the risk allele of the single nucleotide polymorphism is related to the dominant type odds ratio.
  • the recessive odds ratio when the recessive odds ratio is larger than the dominant odds ratio, the single nucleotide polymorphism risk allele is related to the recessive odds ratio.
  • the genotype that is considered to be at risk for polypoidal choroidal vasculopathy in the single nucleotide polymorphism is a homozygous or heterozygous risk allele, and the risk allele is a recessive type
  • the genotype considered to be at risk for polypoidal choroidal vasculopathy in the single nucleotide polymorphism is a homozygous risk allele.
  • the odds ratio can be approximately calculated using an appropriate number instead of the zero.
  • an appropriate number used in place of 0 for example, a real number exceeding 0 such as 0.5 or 0.1 can be used.
  • the sample provider may be predicted to be at risk for polypoidal choroidal vasculopathy. it can. In either case, the greater the odds ratio, the higher the risk of polypoidal choroidal vasculopathy.
  • the prediction accuracy can be improved by using the magnitude of the odds ratio. That is, there are many genotypes that are considered to be at risk for risk alleles or polypoidal choroidal vasculopathy and / or few genotypes that are not at risk for non-risk alleles or polypoidal choroidal vasculopathy.
  • the risk of illness is expected to be higher.
  • the odds ratio or the odds ratio used for predicting the risk of polypoidal choroidal vasculopathy as an index indicating the relationship between the allele or genotype and the degree of disease is a single nucleotide polymorphism determined to be statistically significant.
  • the single nucleotide polymorphism of the present invention may exist in any gene region such as an intron or exon on the genome, or may exist in any region that is not a gene on the genome.
  • the gene may be one of the causative genes for polypoidal choroidal vasculopathy.
  • the gene in the vicinity of the single nucleotide polymorphism and the single nucleotide polymorphism are linked, and the gene in the vicinity May be one of the causative genes of polypoidal choroidal vasculopathy, or the region containing the single nucleotide polymorphism or its vicinity is transcribed to mRNA, and other genes via phenomena such as RNA interference May be involved in the expression of.
  • a gene to which the single nucleotide polymorphism of the present invention belongs on the genome, or a gene present in the vicinity of the single nucleotide polymorphism of the present invention on the genome is included in the scope of the present invention.
  • intron type single nucleotide polymorphism means that a single nucleotide polymorphism exists in an intron.
  • Translational region type single nucleotide polymorphism is a region where single nucleotide polymorphism exists in the region translated into protein, and the codon containing the single nucleotide polymorphism is a codon encoding another amino acid or a stop codon. It means a change in the amino acid sequence such as mutation.
  • Silent single nucleotide polymorphism refers to one having a single nucleotide polymorphism in the translation region and not accompanied by a change in amino acid sequence.
  • Genomic single nucleotide polymorphism means that a single nucleotide polymorphism exists in a region that does not encode a gene on the genome.
  • Transcriptional regulatory polymorphism refers to a single nucleotide polymorphism present at a site considered to be involved in transcriptional regulation on an exon.
  • the single nucleotide polymorphism may exist at any position on the genome, and in any case, it may have an association with a disease.
  • the presence of single nucleotide polymorphisms in introns or untranslated regions may affect gene expression control, splicing that occurs after gene transcription, and mRNA stability. If there is a single nucleotide polymorphism in the translation region, the substitution of the base changes the codon corresponding to one amino acid to a codon corresponding to another amino acid, or changes to a stop codon. Changes may occur in the structure of the protein encoded by. These changes cause changes in the expression level and function of the gene, and in turn the expression level or function of the protein encoded by the gene, which can cause various diseases.
  • a genomic single nucleotide polymorphism When a genomic single nucleotide polymorphism is associated with a disease, the region containing the polymorphic site is actually translated and may have some influence on the expression of other genes.
  • a silent single nucleotide polymorphism When a silent single nucleotide polymorphism is associated with a disease, there is another polymorphism associated with the disease around the single nucleotide polymorphism, and the polymorphism and the silent single nucleotide polymorphism are in a linkage disequilibrium state. In some cases, an association with a disease may be observed.
  • the single nucleotide polymorphism itself is not a direct cause of polypoidal choroidal angiopathy, but a polypoidal choroidal angiopathy present in the vicinity.
  • An association between these single nucleotide polymorphisms and polypoidal choroidal vasculopathy may also be observed when in linkage disequilibrium with the true polymorphism.
  • nucleic acid molecules containing alleles associated with polypoidal choroidal vasculopathy In another aspect of the present invention, a nucleic acid molecule comprising a single nucleotide polymorphism associated with polypoidal choroidal angiopathy and a sequence complementary to a nucleic acid molecule comprising a single nucleotide polymorphism associated with polypoidal choroidal angiopathy Nucleic acid molecules are provided.
  • a nucleic acid molecule containing a nucleic acid sequence containing a single nucleotide polymorphism described in Tables 1 to 10 and / or a nucleic acid molecule containing a complementary sequence of the sequence is a nucleic acid molecule used for allele detection in the present invention.
  • the nucleic acid molecule used for allele detection in the present invention is preferably a nucleic acid molecule containing a single nucleotide polymorphism described in Table 1 or Table 2 or a fragment thereof, and at least one of the nucleic acid molecules or the nucleic acid concerned A nucleic acid molecule complementary to the molecule or a fragment thereof, more preferably a nucleic acid molecule comprising a single nucleotide polymorphism described in Table 1, or a fragment thereof, wherein at least any one of said nucleic acid molecules or said nucleic acid molecule Or a fragment thereof.
  • nucleic acid molecules containing single nucleotide polymorphisms described in Tables 1 to 10 or nucleic acid molecules complementary to the nucleic acid molecules nucleic acid molecules containing risk alleles or nucleic acid molecules complementary to the nucleic acid molecules It is desirable to be.
  • Nucleic acid molecules containing single nucleotide polymorphisms associated with these polypoidal choroidal vasculopathy, or nucleic acid molecules having a sequence complementary to the nucleic acid molecule can be used as a marker for determining the level of polypoidal choroidal vasculopathy risk. it can. Furthermore, these nucleic acid molecules can be used as a probe for detecting a risk allele or its allele in the single nucleotide polymorphism or determining a genotype. Further, when the single nucleotide polymorphism is present on an exon, these nucleic acid molecules can be used for detection of a gene transcript.
  • a more preferable nucleic acid molecule can be selected by the same method as described in the section for identifying a single nucleotide polymorphism associated with polypoidal choroidal vasculopathy.
  • Nucleic acid molecules constituting the eukaryotic genome are composed of a double strand of a sense strand and an antisense strand complementary to the sense strand. That is, a single nucleotide polymorphism is also composed of a sense strand and an antisense strand, and detecting any single nucleotide polymorphism has the same meaning, so the nucleic acid molecule of the present invention includes any of these. .
  • nucleic acid molecule in the present invention is deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid
  • a nucleic acid molecule having both of these in the same nucleic acid molecule is also included in the present invention.
  • the nucleoside defined by thymidine (T) in the sequence of the present invention can be read as uridine '(U).
  • uridine '(U) the nucleoside defined by thymidine
  • these nucleic acid molecules can be chemically modified as necessary within the range not impairing the function for use in the present invention.
  • the function in this case refers to the function of achieving the purpose of using the nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid molecule in the present invention is based on the sequence information disclosed in the present specification or the sequence information obtained by searching information such as the database ID disclosed in the present specification in a database such as dbSNP, HapMap or Genbank. Can be synthesized using a known method such as the phosphoramidite method. It is also possible to synthesize using a commercially available DNA synthesizer.
  • the nucleic acid molecule in the present invention is obtained from a sample containing human-derived DNA, by a known method such as PCR method, or for some nucleic acid molecules from a sample containing human-derived RNA, such as RT-PCR method. It can be obtained by a known method.
  • Primers necessary for acquisition can be designed by those skilled in the art based on sequence information disclosed in the present specification or sequence information that can be searched from information such as database IDs disclosed in the present specification.
  • a primer of about 10 to 30 bases having a sequence homologous to a partial sequence of the target nucleic acid molecule can be used, and when using the RT-PCR method, A reverse transcription reaction is performed using an oligo dT primer, random hexamer or the like to prepare a complementary DNA (cDNA), and the target sequence in the cDNA can be amplified by the PCR method described above.
  • the nucleic acid molecule preferably has a length of 16 to 50 bases, more preferably 23 to 27 bases, and even more preferably 25 bases, and is complementary to the above-described polymorphic site and its peripheral sequence, or a complementary sequence thereto. Desirably, the nucleic acid molecule comprises a sequence.
  • the nucleic acid molecule can be subjected to any chemical modification as long as its function is not impaired. The function in this case refers to the function of achieving the purpose of using the nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid molecule used for allele detection is: Preferably, at least one base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 70 (each corresponding to one single nucleotide polymorphism in a pair of odd-numbered and even-numbered base sequences) or A nucleic acid molecule containing a sequence having an allele corresponding to the 17th of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 70 in the complementary sequence or a partial sequence thereof, More preferably, in at least one base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 12 and SEQ ID NOs: 69 to 70, or a complementary sequence thereof, or a partial sequence thereof, the sequence numbers 1 to 12 or a nucleic acid molecule comprising at least one base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 12 and SEQ ID NOs: 69 to 70, or a complementary sequence thereof, or a partial sequence thereof
  • each set of base sequences is a base sequence containing one single nucleotide polymorphism of each other in the 17th base.
  • f SEQ ID NO: 11 and / or SEQ ID NO: 12
  • the partial sequence means a fragment of a nucleic acid sequence, and the sequence length is not limited as long as it has an allele corresponding to the 17th of the sequence.
  • a fragment of a nucleic acid sequence containing a single nucleotide polymorphism of the present invention obtained by searching a single nucleotide polymorphism of the present invention in a database of known single nucleotide polymorphisms such as dbSNP or a database of known sequence information is also a partial sequence of the present invention. include.
  • nucleic acid molecule containing any one of the above single nucleotide polymorphisms, among them, the sequence represented by the odd-numbered sequence number of the set of sequences containing each single nucleotide polymorphism, or a complementary sequence thereof, or these It is preferable to use a nucleic acid molecule comprising a single nucleotide polymorphism allele present at the 17th position of the selected nucleotide sequence in the nucleotide sequence consisting of the partial sequence of The nucleic acid molecule is preferably composed of a sequence containing the allele. These are base sequences containing risk alleles at each polymorphic site.
  • a probe capable of detecting an allele associated with polypoidal choroidal vasculopathy is provided.
  • the probe in the present invention can be prepared in the same manner as the nucleic acid molecule of the present invention described above.
  • the probe is capable of hybridizing under stringent conditions (also referred to as high stringency conditions) to a nucleic acid sequence containing each single nucleotide polymorphism allele described in Tables 1 to 10 below or a complementary sequence thereof. Anything can be used.
  • the probe of the present invention is a probe capable of detecting a risk allele and / or a non-risk allele included in at least one single nucleotide polymorphism described in Table 1 or Table 2, more preferably 1 is a probe capable of detecting a risk allele and / or a non-risk allele contained in at least one single nucleotide polymorphism described in 1.
  • a risk allele can be detected as one of preferred embodiments.
  • a probe by using both a probe capable of detecting a risk allele and a probe capable of detecting a non-risk allele, the genotype of the single nucleotide polymorphism can be determined.
  • hybridization means that a nucleic acid molecule having a certain sequence and a nucleic acid molecule complementary to at least a part of the nucleic acid molecule associate with each other through hydrogen bonds based on complementary base sequences.
  • the types of complementary nucleic acid molecules associated with the original nucleic acid molecule may be the same or different, and the types of nucleic acid molecules constituting these nucleic acid molecules may be deoxyribonucleic acid, ribonucleic acid, or the same nucleic acid It may have both in the molecule.
  • stringent conditions or high stringency conditions mean conditions under which a nucleic acid molecule having a sequence complementary to a partial sequence of the nucleic acid molecule specifically hybridizes to a nucleic acid molecule having a certain sequence.
  • a solid-phase probe consisting of a DNA molecule of 25 base length examples include, for example, 0.056M0.052- (N-Morpholino) ethanesulfonic) acid, 5% DMSO, 2.5 ⁇ Denhardt's solution, 5.77 mM EDTA, 0.0115%
  • the conditions include denaturation at 95 ° C. for 10 minutes and hybridization at 49 ° C. in the presence of Tween-20, 2.69M Tetrametyl Ammonium Chloride. It is known that such conditions may vary depending on the sequence length of nucleic acid molecules used as probes and the degree of chemical modification. Optimizing hybridization and / or washing conditions that allow specific hybridization This is possible with the ordinary creative ability of those skilled in the art.
  • allele-specific means that the allele is contained in a nucleic acid molecule containing the polymorphic site, or that a certain nucleic acid molecule contains the allele in the polymorphic site.
  • the probe in the present invention has a sequence specific to the allele of the sense strand. Any nucleic acid molecule having a complementary sequence, ie a sequence specific to the antisense strand allele, and a sequence complementary to the sequence specific to the antisense strand allele, ie a sequence specific to the sense strand allele included.
  • the probe of the present invention can also be used for detection of cDNA or mRNA containing the single nucleotide polymorphism of the present invention. When used for detection of cDNA or mRNA, the single nucleotide polymorphism that is present in the exon or in the vicinity thereof is preferably used.
  • the probe in the present invention consists of nucleic acid molecules containing allele-specific sequences or their complementary strands or partial sequences thereof described in Tables 1 to 10 below.
  • the probe in the present invention has any number of bases not derived from the sequence for the purpose of providing a spacer or stabilization at the end, as long as it can hybridize to the allele-specific sequence or its complementary strand under stringent conditions. Sequences can be added. Preferably, the sequence contributing to allele-specific hybridization in the probe of the present invention comprises only an allele-specific sequence or its complementary strand.
  • the probe can be given any label for use in detection. Any label used for the probe can be used, but in general, fluorescent labels such as FITC and Cy3, biotin, or enzyme labels such as alkaline phosphatase and horseradish peroxidase are generally used. When a biotin label is used, streptavidin or avidin that specifically binds to biotin is further subjected to a detectable label, and the labeled streptavidin or the like is used as a secondary label.
  • a labeled anti-biotin antibody can be used instead of labeled streptavidin or the like.
  • the detection sensitivity can be improved by using a labeled anti-streptavidin antibody as a tertiary label for streptavidin bound to biotin.
  • a labeled anti-streptavidin antibody as a tertiary label for streptavidin bound to biotin.
  • Any known method can be used for labeling the probe, and this method is well known to those skilled in the art.
  • Arbitrary sequences serving as the spacers described above can be added to the probe, and the spacers can be labeled.
  • Reagents for labeling probes, labeled streptavidin, labeled anti-biotin antibodies, and the like are commercially available as reagents and can be purchased and used.
  • the probe in the present invention can specifically hybridize to a nucleic acid molecule having the target allele, it is a nucleic acid having both of them in the same nucleic acid molecule regardless of whether it is deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid.
  • Molecular probes are also included in the present invention.
  • the nucleoside defined by thymidine (T) in the sequence of the present invention can be read as uridine '(U).
  • the probe in the present invention can be chemically modified as necessary as long as it can specifically hybridize to a nucleic acid molecule having the target allele under stringent conditions. Any known method can be used for chemical labeling.
  • the probe for detection can be detected by a known method by reacting with a sample in a solution state, or can be solidified on a carrier in advance.
  • the probe corresponding to each allele of several to several hundred thousand different single nucleotide polymorphisms is solidified at a predetermined position on a solid support in advance of one to ten or more probes for each single nucleotide polymorphism.
  • a so-called microarray which is a solidified probe in which a sample is reacted with this, a signal generated from the hybridized probe is scanned and analyzed using a computer.
  • the maximum number of probes to be solidified is limited by the solidification density of the probe and the area of the solidified site.
  • the nucleic acid molecule in the sample should be labeled by a known method and bound to the solidified unlabeled probe of the present invention or detected.
  • the solid layer derived from the labeled nucleic acid molecule having the allele to be detected by binding the nucleic acid molecule having the allele to the unlabeled probe of the present invention which has been solidified and then labeling by a known method. Signal can be detected.
  • Solidification can be carried out by any known method, and for example, synthetic oligo prints, spotting photolithographs and the like can be used.
  • carrier Generally used materials, for example, polymers, such as a polycarbonate and a polystyrene, glass, a silicon crystal, etc. are used.
  • a coating such as cationization may be applied to the carrier in advance before solidification.
  • blocking can be performed with a known blocking agent after solidification.
  • Any blocking agent can be used as long as it can suppress adsorption of non-specific nucleic acid to the carrier.
  • Any blocking agent can be used as long as it can suppress adsorption of non-specific nucleic acid to the carrier.
  • Anionic surfactants such as nonionic surfactants such as polyoxyethylene sorbitan monolaurate can be used.
  • each opposing allele contained in one sample can be operated by the same operation. It can also be set as the structure to detect. In such a configuration, not only the allele of the sample but also the genotype can be determined by the same operation.
  • the preferred sequence length of the probe for detection varies depending on the detection method, but it may be any one that can specifically detect the single nucleotide polymorphism allele or genotype associated with the polypoidal choroidal vasculopathy of the present invention.
  • the probe when a solid-phase probe is used for detection of an allele, the probe preferably has a length of 16 to 50 bases, more preferably 23 to 27 bases, still more preferably 25 bases, and the polymorphism described above.
  • a probe comprising a nucleic acid molecule comprising a site and its surrounding sequence or a sequence complementary thereto, and the probe for detecting an allele in a solution state is preferably 16 to 50 bases, more preferably 23 to 27.
  • the probe used for allele detection is: At least one nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 70 (each of which corresponds to one single nucleotide polymorphism in a pair of odd-numbered and even-numbered nucleotide sequences) or its complementary
  • a probe comprising a base sequence having an allele corresponding to the 17th of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 70 in the base sequence consisting of the sequence or a partial sequence thereof,
  • the base sequence consisting of at least one base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 12 and SEQ ID NOs: 69 to 70 a complementary sequence thereof, or a partial sequence thereof
  • a probe used for allele detection is: At least one nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 70 (each of which corresponds to one single nucleo
  • each set of base sequences is a base sequence containing one single nucleotide polymorphism of each other in the 17th base.
  • f SEQ ID NO: 11 and / or SEQ ID NO: 12
  • a probe containing any one of the above-mentioned single nucleotide polymorphisms among them, a sequence represented by an odd-numbered sequence number or a complementary sequence thereof among a set of sequences containing each single nucleotide polymorphism, or these It is preferable to use a probe containing a single nucleotide polymorphism allele present at the 17th position of the selected base sequence in the base sequence consisting of the partial sequence. These are base sequences containing risk alleles at each polymorphic site.
  • a method for detecting whether a sample containing nucleic acid molecules has an allele or genotype that is frequent in PCV patients.
  • Samples include nucleic acid molecules, that is, those capable of extracting genome-derived nucleic acid molecules (DNA and / or RNA), or mRNA or cDNA containing a gene present in the vicinity of the single nucleotide polymorphism of the present invention
  • Any substance can be used as long as it can be extracted, for example, blood, white blood cells, hair roots, hair, saliva, oral mucosal cells, nasal mucosal cells, skin, or tissues such as muscles or organs obtained by biopsy are used. .
  • the nucleic acid molecules constituting the eukaryotic genome are composed of complementary sense strands and antisense strands, and the single nucleotide polymorphism allele of the present invention is detected in the nucleic acid molecules contained in the sample. Can be performed by detecting either the sense strand or the antisense strand of the polymorphic site.
  • the 33-base nucleic acid sequence containing a single nucleotide polymorphism related to polypoidal choroidal vascular disease disclosed in the present invention is a base sequence consisting of two base sequences that differ only in the center (i.e., the 17th base). (That is, a pair with an odd number and an even number) and the 17th base is a polymorphic site.
  • the base sequence including the risk allele in the polymorphic site is the previous (that is, odd-numbered) sequence in the set of base sequences. Risk alleles are described in Tables 1 to 10 below.
  • the risk of polypoidal choroidal vasculopathy of the sample provider can be predicted. That is, when at least one risk allele in the single nucleotide polymorphism is present in the nucleic acid molecule in the sample, it may be predicted that there is a risk of polypoidal choroidal vasculopathy.
  • each allele that opposes a specific allele contained in one sample can be detected, and the genotype can be determined. That is, when only a certain allele is detected, it is a homotype having the allele as a homozygote, and when two alleles are detected, it is a heterotype having the two alleles as heterogeneous.
  • the genotype of the single nucleotide polymorphism contained in the nucleic acid molecule in the sample is determined, and the genes of the PCV patient group and the control group described in Tables 11 to 19 to be described later Based on the type frequency data, a genotype that is considered to be at risk of polypoidal choroidal vasculopathy is determined by the above-described method, and risk prediction may be similarly performed by comparing these genotypes. Note that the determination of the genotype of a single nucleotide polymorphism contained in a nucleic acid molecule in a sample does not necessarily require identification of the risk allele.
  • Any method can be used to detect the presence of these alleles in a sample containing nucleic acid molecules, but each can be detected by hybridizing using a probe specific for each of the aforementioned alleles and detecting the signal. Can detect alleles. By comparing the detected allele with the risk allele in the single nucleotide polymorphism disclosed in the present invention, it is possible to determine whether or not the risk allele in the single nucleotide polymorphism is present in the nucleic acid molecule in the sample.
  • the above-described nucleic acid molecule of the present invention and / or the above-described probe of the present invention is a risk in the method for detecting a single nucleotide polymorphism related to polypoidal choroidal vasculopathy and the risk predicting method for polypoidal choroidal vasculopathy of the present invention. It can be suitably used to determine genotypes that are considered to be at risk of allele or polypoidal choroidal vasculopathy.
  • a microarray in which probes corresponding to each allele to be opposed, that is, a risk allele and a non-risk allele included in a single nucleotide polymorphism, are respectively labeled, or each opposing allele is solidified
  • the solidified probe it is possible to detect each of the opposing alleles contained in the same sample. In such a configuration, not only the allele of the sample but also the genotype can be determined.
  • a solid-phase probe such as a microarray in which each opposing allele is solid-layered on the same carrier, it can be configured such that hybridization is performed by the same operation and detected by the same operation.
  • any known method can be used in addition to the method described above.
  • the following can be used.
  • the method of hybridizing using a probe include the TaqMan (registered trademark) method and the Invader (registered trademark) method, and any of these can be used. Even in the case of probes for detecting the same allele, a more preferable probe may differ depending on the method used for detection.
  • the determination of the single nucleotide polymorphism allele or genotype of the present invention does not depend on the detection method, but it is desirable to use a probe suitable for the detection method. Examples of the method that does not perform hybridization with a probe include a direct sequencing method for directly determining a base sequence.
  • allele-specific or “allele-specific” means that a nucleic acid molecule or base sequence containing the polymorphic site contains the allele, or that a certain nucleic acid molecule is In the polymorphic site, it is possible to hybridize specifically to a nucleic acid molecule having a sequence containing the allele under stringent conditions, i.e., so that alleles that are opposite to the allele can be identified. To tell.
  • the person who provided the sample is at risk for polypoidal choroidal vasculopathy.
  • a person who is predicted to be high and suspected of having polypoidal choroidal vasculopathy that provided the sample is likely to be diagnosed with polypoidal choroidal vasculopathy.
  • the magnitude of the risk of polypoidal choroidal vasculopathy can be predicted using the magnitude of the odds ratio.
  • the magnitude of the risk can be predicted using as an index the number of genotypes considered to be at risk of risk allele or polypoidal choroidal vasculopathy detected in the sample or the odds ratio thereof.
  • the number of genotypes that are considered to be at risk for the risk allele or polypoidal choroidal vasculopathy or the odds ratio of these is greater, or if these values exceed a certain threshold, the risk is determined to be higher can do.
  • nucleic acid molecules in the sample are described in Tables 1 to 10 below. Determination of any single nucleotide polymorphism allele and / or genotype determined, the single nucleotide polymorphism allele and / or genotype in the sample and the single nucleotide polymorphism disclosed in the present invention Anything that includes at least one of risk alleles and / or genotype comparisons considered to be at risk for polypoidal choroidal vasculopathy disclosed in the present invention is included.
  • the method for predicting the risk of polypoidal choroidal vasculopathy of the present invention Determining the allele and / or genotype of at least one single nucleotide polymorphism described in Tables 1 to 10 in the nucleic acid molecule in the sample, the allele and / or genotype of the single nucleotide polymorphism in the sample And comparing the genotype considered to be at risk of polypoidal choroidal vasculopathy disclosed in the present invention and / or the risk allele of the single nucleotide polymorphism disclosed in the present invention Including Preferably, in the method for predicting the risk of polypoidal choroidal vasculopathy of the present invention, at least one single nucleotide polymorphism allele and / or genotype described in Table 1 or Table 2 is determined in the nucleic acid molecule in the sample.
  • the method for predicting the risk of polypoidal choroidal vasculopathy of the present invention comprises determining the allele and / or genotype of at least one single nucleotide polymorphism described in Table 1 in the nucleic acid molecule in the sample, It is considered that there is a risk of the single nucleotide polymorphism allele and / or genotype in the sample and the risk allele of the single nucleotide polymorphism disclosed in the present invention and / or the polypoidal choroidal vascular disease disclosed in the present invention. Performing at least one of genotype comparisons.
  • the single nucleotide polymorphism used for detection is: Preferably, at least one base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 70 (each corresponding to one single nucleotide polymorphism in a set of odd-numbered and even-numbered base sequences) or In its complementary sequence, it is a single nucleotide polymorphism present at the 17th position of each base sequence, More preferably, in at least one base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 12 and SEQ ID NOs: 69 to 70, or a complementary sequence thereof, a single base present at the 17th position of each base sequence Polymorphic, More preferably, in the following at least one base sequence selected from the group consisting of base sequence
  • each set of base sequences is a base sequence containing one single nucleotide polymorphism of each other in the 17th base.
  • f SEQ ID NO: 11 and / or SEQ ID NO: 12
  • any one of the single nucleotide polymorphisms described in Tables 1 to 10 can be used. Combining determination of single nucleotide polymorphism alleles or genotypes can improve the accuracy of disease determination.
  • the single nucleotide polymorphism used in the combination is preferably the single nucleotide polymorphism described in Table 1 or Table 2, and more preferably the single nucleotide polymorphism described in Table 1.
  • kits for detecting single nucleotide polymorphisms associated with polypoidal choroidal vasculopathy is provided.
  • the kit of the present invention includes any nucleic acid molecule in a sample as long as it can detect any single nucleotide polymorphism risk allele described in Tables 1 to 10 described later.
  • the kit of the present invention is a kit capable of detecting at least one single nucleotide polymorphism risk allele and / or non-risk allele described in Table 1 or Table 2, more preferably Table 1
  • kits of the present invention in addition to any one of the above single nucleotide polymorphisms, in addition to the single nucleotide polymorphism, at least one single nucleotide polymorphism risk allele described in Tables 1 to 10 and / or Alternatively, a kit capable of detecting a non-risk allele or determining a genotype is also one aspect of the present invention.
  • kits for determining an allele or genotype of a plurality of single nucleotide polymorphisms in addition to any one of the above single nucleotide polymorphisms, preferably the risk of single nucleotide polymorphisms described in Table 1 or Table 2
  • kits capable of detecting a risk allele and / or non-risk allele of at least one single nucleotide polymorphism in Tables 1 to 10 or determining a genotype
  • one of the preferred embodiments includes the single nucleotide polymorphism of the single nucleotide polymorphism. Kits that can detect risk alleles.
  • the kit of the present invention may detect either the single-stranded polymorphic sense strand or the antisense strand, or may detect both of them. good.
  • the detection method exemplified in the section of probe is used.
  • kits for detecting a single nucleotide polymorphism associated with polypoidal choroidal angiopathy using the nucleic acid molecule of the present invention and / or the probe of the present invention described above is included in the present invention. That is, the kit of the present invention contains the nucleic acid molecule of the present invention and / or the probe of the present invention so that the allele or genotype of a single nucleotide polymorphism associated with polypoidal choroidal vasculopathy can be determined. is there.
  • a kit for detecting both the above-described risk allele and non-risk allele is also a preferred embodiment of the present invention. Using such a kit, it is also possible to determine the genotype of each allele as already described.
  • kits of the present invention By using the kit of the present invention to detect the presence of a risk allele or a genotype that is considered to be at risk of polypoidal choroidal vasculopathy in a sample, future polypoidal choroidal vasculopathy in non-PCV patients Can be diagnosed or diagnosed or aided in diagnosis of polypoidal choroidal vasculopathy in a person suspected of having polypoidal choroidal vasculopathy.
  • kits used for detection or risk prediction At least one nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 70 (each of which corresponds to one single nucleotide polymorphism in a pair of odd-numbered and even-numbered nucleotide sequences) or its complementary
  • a kit capable of determining an allele or genotype of a single nucleotide polymorphism corresponding to the 17th of each nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 70 Preferably, in the base sequence consisting of at least one base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 12 and SEQ ID
  • each set of base sequences is a base sequence containing one single nucleotide polymorphism of each other in the 17th base.
  • b SEQ ID NO: 3 and / or SEQ ID NO: 4
  • c SEQ ID NO: 5 and / or SEQ ID NO: 6
  • d SEQ ID NO: 7 and / or SEQ ID NO: 8
  • e SEQ ID NO: 9 and / or SEQ ID NO: 10
  • f SEQ ID NO: 11 and / or SEQ ID NO: 12
  • the kit capable of determining any single nucleotide polymorphism allele or genotype of any of the above, among them, a sequence represented by an odd-numbered sequence number or a complement thereof among a set of sequences containing each single nucleotide polymorphism It is preferable that the kit is capable of determining an allele of a single nucleotide polymorphism corresponding to the 17th of each base sequence included in the set of a to g in a target sequence or a base sequence composed of these partial sequences. These are base sequences containing risk alleles at each polymorphic site.
  • the single nucleotide polymorphism associated with polypoidal choroidal vasculopathy used in the present invention is used in any race as long as it has the polymorphism, but the preferred race is Mongoloid, more preferably East Asian. More preferably, it is a Japanese or a person who has Japanese as an ancestor.
  • a person who has a genotype on the genome which is considered to be at risk for the risk allele or polypoidal choroidal vasculopathy disclosed in the present invention has a high risk of developing polypoidal choroidal vasculopathy in the future.
  • Those who do not have a risk allele or a genotype that is considered to be at risk of polypoidal choroidal vasculopathy can be determined to have a low risk of developing polypoidal choroidal vasculopathy in the future.
  • those who have a risk allele disclosed in the present invention or a genotype that is considered to be at risk of polypoidal choroidal vasculopathy on the genome and who are suspected of having polypoidal choroidal vasculopathy at an early stage are difficult to detect. Since there is a possibility of developing polypoidal choroidal vasculopathy, detection of the single nucleotide polymorphism of the present invention can be used for diagnosis of polypoidal choroidal vasculopathy or for assisting diagnosis.
  • total DNA is extracted from the blood of patients diagnosed with polypoidal choroidal vasculopathy, patients diagnosed with glaucoma, and patients diagnosed with glaucoma, and a known single nucleotide sequence on the human genome is extracted.
  • the gene loci related to the disease were analyzed, and single nucleotide polymorphisms considered to be specifically related to polypoidal choroidal vasculopathy were examined.
  • Example 1 Extraction of DNA from a sample Extraction of DNA from a sample was performed according to the phenol extraction method (Methods in Enzymology, vol. 152, page 181 (1987)).
  • Leukocytes were purified by adding a sufficient amount of hypotonic hemolysis buffer containing ammonium salt and EDTA to the blood sample to which citrate had been added. After several washes, the cells were lysed with a lysis buffer containing Proteinase K and SDS. After confirming that the suspended cells were lysed and clear, phenol was added and shaken at room temperature for 1 to 3 hours. The phenol layer was discarded and only the aqueous layer was centrifuged to further separate impurities.
  • aqueous layer was dialyzed against TE buffer (10 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, Teknova), and then DNA was collected by ethanol precipitation and dissolved in TE buffer.
  • TE buffer 10 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, Teknova
  • DNA was collected by ethanol precipitation and dissolved in TE buffer.
  • 7.5 ⁇ M NH 4 OAc 10 ⁇ L, 20 mg / mL Glycogen 0.5 ⁇ L and 100% ice-cold ethanol 50 ⁇ L were added and left at -20 ° C. for 1 hour. After centrifugation at 12,000 ⁇ g for 20 minutes, the supernatant was removed.
  • Example 2 Analysis of Single Nucleotide Polymorphism Single nucleotide polymorphism analysis is performed by using a commercially available microarray single nucleotide polymorphism analysis kit (Affymetrix) capable of analyzing about 500,000 known single nucleotide polymorphisms on the human genome.
  • GeneChip Human Mapping 250K Nsp / Sty Array GeneChip (registered trademark) Human Mapping 250K Nsp / Sty Array) (hereinafter referred to as microarray) was used.
  • the total DNA (genomic DNA) extracted in Example 1 is processed according to the instructions of the kit and instrument, and applied to the microarray to analyze single nucleotide polymorphisms present in the DNA extracted from the specimen. Specifically, the following operation is performed.
  • Each 250 ng of genomic DNA is cut with Sty I (New England Biolabs) or Nsp I (New England Biolabs) restriction enzymes, respectively, according to the following procedure. That is, 5 ⁇ L of genomic DNA solution, 11.5 ⁇ L of commercially available molecular biology grade ultrapure water (AccuGENE® molecular biology-grade water, Cambrex), 2 ⁇ L of buffer solution attached to each restriction enzyme, 10 mg / mL Restriction enzyme treatment was performed by adding 0.2 ⁇ L of BSA and 1 ⁇ L of 10 U / mL restriction enzyme. The reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours and then incubated at 65 ° C. for 20 minutes to inactivate the restriction enzyme.
  • Sty I New England Biolabs
  • Nsp I New England Biolabs
  • the adapter sequence is added to the sample after the restriction enzyme treatment by the following procedure.
  • 50 ⁇ M Adaptor Nsp I or Adapter Sty I 0.75 ⁇ L corresponding to the cleaved restriction enzyme, T4 DNA ligase buffer (New England Biolabs) 2.5 ⁇ L and T4 DNA ligase (New England Biolabs) 2 ⁇ L was added and reacted at 16 ° C. for 3 hours to add an adapter sequence, and then reacted at 70 ° C. for 20 minutes to inactivate T4 DNA ligase.
  • the sample after the addition of the adapter was diluted by adding 75 ⁇ L of cooled AccuGENE water.
  • the gene to which the adapter sequence is added is amplified by PCR using the TITANIUM TM (registered trademark) DNA Amplification kit (Clontech) according to the following procedure. That is, AccuGENE water 39.5 ⁇ L, TITANIUM TM (registered trademark) taq PCR buffer 10 ⁇ L, 5 M GC-Melt (Clonetech) 20 ⁇ L, 2.5 mM dNTP (Takara Bio) 4.5 ⁇ L, 100 ⁇ M PCR primer002 (Affymetrix, GeneChip ( (Registered Trademark) 4.5 ⁇ L (included in Mapping 250K Nsp / Sty Assay Kit) and TITANIUM TM (registered trademark) taq DNA polymerase 2 ⁇ L were added and reacted.
  • TITANIUM TM registered trademark
  • the reaction temperature and time are as follows. First, after standing at 94 ° C. for 3 minutes, the reaction was carried out for 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds ⁇ 60 ° C. for 30 seconds ⁇ 68 ° C. for 15 seconds and left at 68 ° C. for 7 minutes. With this as a series of reaction operations, the same PCR reaction operation was performed three times for each sample. The PCR product was subjected to 2% agarose gel electrophoresis, and it was confirmed that a gene fragment of 200 bp to 1000 bp was amplified. Three PCR products were combined into one and purified using a DNA amplification Clean-Up kit (Clontech).
  • PCR primer 002 used as a primer for PCR reaction is as follows: 5′-attatgagcacgacagacgcctgatct-3 ′ (SEQ ID NO: 71).
  • the amplified gene is fragmented by the following procedure using GeneChip (registered trademark) Mapping 250K Nsp / Sty Assay Kit (Affymetrix) reagent. That is, the absorbance of the purified PCR product at 260 nm was measured using a spectrophotometer (Biophotometer, Eppendorf), and 90 ⁇ g of the PCR product was diluted with RB buffer (Clontech) to a total volume of 45 ⁇ L. Fragmentation buffer 5 ⁇ L and 0.05 U / ⁇ L Fragmentation Reagent 5 ⁇ L included in the kit were added to the diluted sample, reacted at 37 ° C.
  • GeneChip registered trademark Mapping 250K Nsp / Sty Assay Kit (Affymetrix) reagent. That is, the absorbance of the purified PCR product at 260 nm was measured using a spectrophotometer (Biophotometer, Eppendorf), and 90 ⁇ g of the PCR product was diluted with RB
  • Fragmentation Reagent was diluted with 10 ⁇ fragmentation buffer and AccuGENE water so that the final concentration was 0.05 U / ⁇ L Fragmentation Reagent, 1 ⁇ fragmentation buffer.
  • the fragmented product was subjected to 4% agarose gel electrophoresis to confirm that the gene was fragmented.
  • a biotin label is added to the fragmented gene by GeneChip (registered trademark) Mapping 250K Assay Kit (Affymetrix) according to the following procedure. After adding 5 ⁇ L of the fragmented sample, 14 ⁇ L of Terminal Deoxynucleotidyl Transferase buffer, 2 ⁇ L of 30 mM GeneChip DNA Labeling Reagent and 3.5 ⁇ L of Terminal Deoxynucleotidyl Transferase enzyme included in the kit, and reacting at 37 ° C. for 4 hours, then 15 minutes at 95 ° C. The enzyme was inactivated by leaving to stand as a sample for hybridization.
  • Hybridization cocktail master mix in 70 ⁇ L sample with biotin label composition is as follows; 0.056M 2- (N-Morpholino) ethanesulfonic acid, 5% DMSO, 2.5 ⁇ Denhard'ts solution (Sigma), 5.77 mM EDTA pH 8. 0, 0.115 mg / mL Herring Sperm DNA (Promega), 1 ⁇ Oligo Control Reagent 0100 (Affymetrix), 11.5 ⁇ g / mL Human Cot-1 DNA (Invitrogen), 0.0115% Tween-20, 2.69 M Tetrametyl Ammonium Chloride (Sigma) ) 190 ⁇ L was added, denatured at 95 ° C.
  • Hybrid oven GeneChip Hybridization Oven 640, Affymetrix
  • GeneChip registered trademark Human Mapping 250K Nsp / Sty Array (hereinafter also referred to as microarray)
  • temperature set to 49 ° C
  • rotation speed 60 r / min For 16 to 18 hours.
  • the sample was removed from the microarray, and Array Holding Buffer (1 mM MES, 1M NaCl, 0.01% Tween-20) was filled inside the microarray.
  • GCOS GeneChip Fluidics Station 450 of Affymetrix, Inc., GeneChip (registered trademark) Operating Software 1.4 (hereinafter GCOS), protocol: MAP500Kv1_450.
  • Primary and tertiary staining were each performed with 10 ⁇ g / mL Streptavidin-Phycoerythrin (Invitrogen) prepared with Stain Buffer, and secondary staining was performed with 5 ⁇ g / mL biotinylated Anti-Streptavidin Antibody (Vector Lab.). Detection was performed with GeneChip (registered trademark) Scanner 3000 7G using GCOS.
  • the specific protocol for the staining / washing process and the composition of the washing solution are as follows. (Dyeing and washing process protocol (FS-450 Fluidics Protocol-Mapping 500Kv1_450)) -Post Hyb Wash # 1: 6 cycles of 5 mixes / cycle with Wash Buffer A at 25 °C -Post Hyb Wash # 2: 24 cycles of 5 mixes / cycle with Wash Buffer B at 45 °C -Stain: Stain the probe array for 10 minutes in SAPE solution at 25 °C -Post Stain: Wash 6 cycles of 5 mixes / cycle with Wash Buffer A at 25 °C -2nd Stain: Stain the probe array for 10 minutes in Antibody Stain Solution at 25 °C -3rd Stain: Stain the probe array for 10 minutes in SAPE solution at 25 °C -Final Wash: 10 cycles of 6 mixes / cycle with Wash Buffer A at 30 °C The final holding temperature is 25 °C [Solution composition] ⁇ Wash A:
  • ⁇ Wash B Stringent Wash Buffer (0.6X SSPE, 0.01% Tween 20) For 1000 mL: 30 mL of 20X SSPE, 1.0 mL of 10% Tween-20, 969 mL of water Filter through a 0.2 ⁇ m filter.Store at room temperature. The pH should be 8. ⁇ Stain Buffer: (6X SSPE, 0.01% Tween 20, 1X Denhardt's solution) For 1188 ⁇ L: 360 ⁇ L of 20X SSPE, 3.6 ⁇ L of 3% Tween-20, 24 ⁇ L 50X Denhardt's solution, 800.04 ⁇ L of water
  • Genotyping analysis SNP Genotyping analysis was performed using Affymerix Power Tools ver.1.10.0 from Affymetrix. The included BRLMM genotype calling algorithm was used for analysis.
  • the False discovery rate for the 370 SNPs to be analyzed was determined by the method of Benjamini and Hochberg (Benjamini Y, Hochberg T: J Royal Stat Soc B85 pp289-300, 1995). All 370 single nucleotide polymorphisms that were candidates were included in the range where the false discovery rate was below 5%. That is, these single nucleotide polymorphisms are considered to have an extremely high probability of being related to a disease.
  • the single nucleotide polymorphism candidates related to polypoidal choroidal vasculopathy selected in this way were analyzed in more detail. That is, the patients employed in the glaucoma patient group and the patients employed in the cataract patient group were collectively used as a control group, and a comparative analysis of the PCV patient group and the control group was performed as follows.
  • the odds ratio of the allele was calculated by the following formula as an index of how strong a relationship exists between the presence or absence of the risk allele and the presence or absence of polypoidal choroidal vasculopathy.
  • the risk allele was set so that the odds ratio was greater than 1 when the odds ratio of the allele was calculated by substituting the number of detected alleles constituting the single nucleotide polymorphism into the above formula.
  • the odds ratio is a reciprocal relationship with each other, that is, if one odds ratio is smaller than 1, the other odds ratio is larger than 1. It is clear from the definition formula.
  • genotype p value The genotype p value of each SNP was calculated using Fisher's exact test for the PCV patient group versus the control group. In that case, genotype model (risk allele homotype vs heterotype vs non-risk allele homotype), dominant model (risk allele homotype + heterotype vs non-risk allele homotype), recessive model (risk allele homotype vs non-risk allele) The p value was calculated for three types of statistical models (homo type + hetero type), and the one with the lowest p value was used as the p value representing the single nucleotide polymorphism.
  • the dominant-type odds ratio and the recessive-type odds ratio were determined by the following formula based on the risk allele determined as described above.
  • the dominant odds ratio is the odds ratio of polypoidal choroidal vasculopathy when at least one risk allele is present (that is, when the risk allele is homozygous or heterozygous).
  • the recessive odds ratio is the odds ratio of polypoidal choroidal vasculopathy when the risk allele is homozygous.
  • Table 1 shows single nucleotide polymorphisms with lower p-values, that is, single nucleotide polymorphisms with p ⁇ 1.0 ⁇ 10 ⁇ 5.
  • Table 2 shows the single nucleotide polymorphisms of 1.0 ⁇ 10 ⁇ 5 ⁇ p ⁇ 1.35 ⁇ 10 ⁇ 4 for each SNP ID, chromosome number and physical position where the single nucleotide polymorphism exists, and the single nucleotide polymorphism.
  • Statistical model p-value of genotype, odds ratio of allele, and risk A sequence number corresponding to a 33-base sequence consisting of a allele and 16 bases before and after it (sequence including a risk allele) and a sequence corresponding to a 33-base sequence composed of a non-risk allele and 16 bases before and after that Enter the number (sequence containing the non-risk allele).
  • the SNP ID is the dbSNP database ID.
  • chromosome number and physical position, gene name and relative position, and sequence information including each allele are available from technical data provided by Affymetrix and public databases such as NCBI SNP and NCBI Nucleotide using dbSNP ID etc. as a key Extracted.
  • each p value is displayed in an exponential format with 10 as the base.
  • the numerical values described before and after the symbol E indicate the mantissa part and the exponent part when the p-value is displayed in the exponential format (the same applies to the tables in the examples below).
  • All of the 363 single nucleotide polymorphisms listed in Tables 1 to 10 are 370 single nucleotide polymorphisms selected in the primary analysis (that is, all FDRs calculated for the 370 single nucleotide polymorphisms are 5). And a preferred single nucleotide polymorphism is selected by secondary analysis using a population as a population) and can be used in the present invention with sufficient reliability.
  • the risk allele frequency, non-risk allele frequency, risk allele homozygous frequency, heterozygous frequency, non-risk allele homotypic frequency are shown in Tables 11 to 19 for each of the PCV patient group and the control group. Describe. Tables 20 to 28 list the genotype odds ratio of each single nucleotide polymorphism, the related genotype odds ratio, and the genotype at risk.
  • the genotype odds ratio is the dominant type odds ratio and the recessive type odds ratio determined for the single nucleotide polymorphism (that is, the genotype odds ratio of the genotype related to the single nucleotide polymorphism). Odds ratio) value is described, and the related odds ratio indicates whether the odds ratio of the genotype related to the single nucleotide polymorphism is a dominant type odd ratio or a recessive type odds ratio.
  • Example 4 Comparison of single nucleotide polymorphisms related to wet age-related macular degeneration and single nucleotide polymorphisms related to polypoidal choroidal angiopathy Genes reported to have single nucleotide polymorphisms related to age-related macular degeneration A part of single nucleotide polymorphisms present in the locus was compared with whether it was associated with each of the diseases of wet age-related macular degeneration and polypoidal choroidal vasculopathy. Staging of patients with wet age-related macular degeneration was performed according to a report by Sedon et al. (Ophthalmology 113, 260, 2006).
  • wAMD patient group 100 Japanese patients with at least one of the left and right eyes diagnosed with sedon staging system grade 5b, that is, wet age-related macular degeneration with choroidal neovascularization or scar formation, and who are not polypoidal choroidal angiopathy 100
  • An example was employed in a wet age-related macular degeneration patient group (hereinafter, wAMD patient group).
  • DNA was extracted in accordance with Example 1 from blood provided from 100 wAM patient groups with the consent obtained by the participants' voluntary intention, and single nucleotide polymorphisms were analyzed according to Example 2.
  • the control group was 190 patients with glaucoma and cataract.
  • the p value was calculated using Fisher's exact test and Cochran-Armitage test for the age-related macular degeneration patient group versus the control group.
  • the genotype model (risk allele homotype vs. heterotype vs. non-risk allele homotype), dominant model (risk allele homotype + heterotype vs. non-risk allele homotype), recessive model (risk allele homology)
  • the p value was calculated for three types of statistical models (type vs. non-risk allele homotype + heterotype). The minimum value of these four p values (that is, three by Fishcer's exact test and one by trend ⁇ ⁇ ⁇ test) was used as the p value of the single nucleotide polymorphism.
  • Example 3 On the other hand, for PCV patients, the same patient group as in Example 3 was used, and in the same manner as in the case of wet age-related macular degeneration, compared to the 190 control group used in the analysis of wet age-related macular degeneration. Analysis was performed. The odds ratio was calculated in the same manner as in Example 3.
  • Table 29 shows the SNP ID (dbSNP ID), the chromosome number and physical position where the single nucleotide polymorphism exists, the gene to which the single nucleotide polymorphism belongs or the name of the gene present in the vicinity of the single nucleotide polymorphism, relative Position (when the single nucleotide polymorphism is present on the intron of the gene indicated by the gene name, this is indicated, and when the single nucleotide polymorphism is not present on the intron of the gene, the gene and the single nucleotide (Indicates the distance between polymorphisms), risk allele bases, non-risk allele bases, statistical model used to calculate genotype p-value, genotype p-value, allele odds ratio, dominant odds Ratio, Recessive odds ratio, and a sequence number corresponding to a 33-base sequence consisting of a risk allele and 16 bases each before and after it (non-risk allele and 16 bases each before and after it) 33 base
  • Table 30 lists the risk allele frequency, non-risk allele frequency, risk allele homozygote frequency, heterozygous frequency, and non-risk allele homozygous frequency of the single nucleotide polymorphism. Furthermore, in Table 31, the genotype odds ratio of the single nucleotide polymorphism, the related genotype odds ratio, and the genotype at risk are listed. Here, the genotype odds ratio describes the value of the Dominant odds ratio and Recessive odds ratio obtained for the single nucleotide polymorphism that are large, and the related odds ratio is the single nucleotide polymorphism. Indicates whether the odds ratio of the genotype related to the type is a Dominant odds ratio or a Recessive odds ratio.
  • Example 5 Estimation of LD block structure and extraction of tag SNP
  • the LD block structure to which the single nucleotide polymorphism of the present invention belongs can be estimated as follows.
  • the LD block containing the single nucleotide polymorphism related to the polypoidal choroidal vasculopathy determined in Example 3 or Example 4 is estimated.
  • narrowing is performed by the pairwise tagging method that rejects R 2 ⁇ 0.8 and MAF ⁇ 0.2, and the single nucleotide polymorphism that represents this LD block is represented. Extract the type, ie tag SNP. R 2 is a measure of linkage disequilibrium.
  • Example 6 Reanalysis of single nucleotide polymorphism on LD block Reanalyze the tag SNP estimated in Example 5 and any single nucleotide polymorphism belonging to the LD block containing the tag SNP as follows. Can do.
  • This example illustrates a reanalysis method using TaqMan (registered trademark) SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems).
  • the patient group and the control group may be the same as or different from the patient group and the control group of Example 3 or Example 4.
  • Using blood provided by these participants as a sample for example, total DNA was extracted by the method described in Example 1, and the single nucleotide polymorphisms contained in the LD block were compared with patient groups according to the protocol of Applied Biosystems. Perform comparative analysis of groups.
  • Reagents, thermal cyclers, and detectors for the real-time PCR reaction can be those specified by Applied Biosystems.
  • StepOne® Plus® real-time PCR system is used for the thermal cycler and detector
  • StepOne® Software® V2.0.1 can be used for detection of the single nucleotide polymorphism allele in the PCR product.
  • the allele odds ratio is calculated in the same manner as in Example 3 to determine the risk allele, and the genotype p-value is calculated.
  • Example 7 Analysis of single nucleotide polymorphisms associated with polypoidal choroidal vasculopathy using samples containing genomic DNA
  • Tables 1 to 10 or 29 The frequency of alleles described in 1 is statistically different between the PCV patient group and the control group.
  • a risk allele is detected for at least one of the single nucleotide polymorphisms of the present invention in the genomic DNA of the sample, it is determined that the single nucleotide polymorphism risk allele associated with polypoidal choroidal vasculopathy is included in the sample Is done. Instead of an allele, it is also possible to determine the genotype considered to be at risk for the aforementioned polypoidal choroidal vasculopathy. Furthermore, using one sample, it is also possible to detect two or more alleles or genotypes of single nucleotide polymorphisms associated with the polypoidal choroidal vasculopathy of the present invention, which are frequently observed in diseases.
  • Example 8 Precise determination of risk of polypoidal choroidal vasculopathy in non-PCV patients and diagnostic assistance for persons suspected of polypoidal choroidal vasculopathy
  • genomic DNA provided by non-PCV patients was obtained.
  • the risk of polypoidal choroidal vasculopathy of the sample provider can be accurately determined.
  • a single nucleotide polymorphism associated with the disease disclosed in the present invention when at least one genotype that is considered to be at risk of a risk allele or polypoidal choroidal vasculopathy is detected in the sample, Determined to be at risk for polypoidal choroidal vasculopathy.
  • the risk is predicted using the sum of the number of genotypes considered to be at risk of the risk allele or polypoidal choroidal vasculopathy detected in the sample or the odds ratio thereof as an index.
  • the risk of polypoidal choroidal vasculopathy is predicted to be large or small, and when a certain threshold value is exceeded, it is determined that the risk of polypoidal choroidal vasculopathy is high.
  • diagnosis assistance for a person suspected of having polypoidal choroidal vasculopathy can be performed. If a sample provided by a person suspected of having polypoidal choroidal vasculopathy and at least one of the risk allele or genotype that is considered to be at risk of polypoidal choroidal vasculopathy is detected in the sample, polypoidal choroidal vessels There is a high probability that it should be judged as a disease. Further, a risk allele or polypoidal choroidal blood vessel detected in a sample by combining a plurality of probes for detecting a single nucleotide polymorphism associated with a disease and detecting two or more single nucleotide polymorphisms of the present invention in combination.
  • the degree to which the probability to be judged as polypoidal choroidal vasculopathy is evaluated using the sum of the number of genotypes considered to be at risk of the disease or the odds ratio thereof as an index. When a certain threshold is exceeded, it can be diagnosed as polypoidal choroidal vasculopathy.
  • the presence / absence and / or level of risk of future polypoidal choroidal vasculopathy of the sample provider is determined. be able to. Based on this risk, the sample provider will take precautionary measures for polypoidal choroidal vasculopathy and / or periodically undergo examination of the fundus, eg, ICG fluorescence imaging, etc. to diagnose polypoidal choroidal vasculopathy at an early stage Can start treatment.
  • a sample provider suspected to have polypoidal choroidal angiopathy having a genotype considered to be at risk of a single nucleotide polymorphism risk allele of the present invention or polypoidal choroidal angiopathy is polypoidal choroidal angiopathy and This is useful because there is a high probability of being diagnosed and treatment can be started early.

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Abstract

　被験者由来のサンプル中の核酸分子について、配列番号1～70で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列又はその相補的配列において、前記塩基配列の17番目に存在する一塩基多型のアレルをin vitroで検出する工程(検出工程)、及び前記検出されたアレルの少なくとも１つがリスクアレルであるか否かを判定する工程(判定工程)を含む、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクを予測する方法。本発明の方法により、サンプル中の本発明の一塩基多型のアレル又は遺伝子型を分析することにより、サンプル提供者の将来的なポリープ状脈絡膜血管症のリスクの有無及び／又は高低を判定することができる。

Description

ポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測方法
　本発明は、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測方法に関する。さらに詳しくは、ポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型を検出することによる、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測方法、及び該予測方法に用いるキットに関する。
　ポリープ状脈絡膜血管症(以下、ＰＣＶともいう)とは、脈絡膜における異常な血管網の形成と、その末端のポリープ状病巣を特徴とする疾患である。ポリープ状脈絡膜血管症は、同様に脈絡膜における血管形成の異常を伴う滲出型加齢黄斑変性(以下、ＡＭＤともいう)と長らく混同されていたが、その経過が通常の滲出型加齢黄斑変性とは異なることから、近年になって新たな疾患概念として確立された。
　ポリープ状脈絡膜血管症の診断には、インドシアニングリーン(ＩＣＧ)蛍光造影検査によって、樹枝状の血管網やポリープ状病巣などの特徴的な血管異常が認められること、及び／又は、眼底検査によって、ポリープ状病巣に一致して橙赤色の隆起病巣が観察されること、が必要とされる。しかしながら、これらの所見が揃って認められることは少なく、滲出型加齢黄斑変性との鑑別に問題が生じることがある。また、これらの所見は視神経乳頭付近又は黄斑部に散見されるが、上述の所見の他に、出血性もしくは漿液性の網膜色素上皮の剥離、又は網膜色素上皮の萎縮を生じることがある。一方で、滲出型加齢黄斑変性に特徴的に認められる、線維性瘢痕及びドルーゼンの形成頻度は低い。またさらに、ポリープ状脈絡膜血管症は、寛解－再発を繰り返すことが多いが、比較的長期間視力は維持される(以上、非特許文献１、２参照)。
　ポリープ状脈絡膜血管症の原因はいまだ解明されていないが、高血圧症などとの関連が示唆されている。治療法についても充分な知見は得られていないが、光力学的療法による治療が試みられている。しかしながら、光力学的療法によっても異常血管網は消失せず、再発の恐れが残る。
　一方、一塩基多型とは、個体のゲノムの塩基配列において、一つの塩基が別の塩基に変化する置換変異が見られ、当該変異がその生物種の集団においてある程度の頻度、一般的に約1％以上の頻度で存在するような多型である。一塩基多型は遺伝子上のイントロン、エクソン、あるいはこれら以外のゲノムの領域のいずれにも存在する。
日本ポリープ状脈絡膜血管症研究会、日本眼科学会雑誌、2005年、109巻、417-427ページ 湯沢美都子他、日本眼科紀要、2006年、57巻、321-335ページ
　一般に、ポリープ状脈絡膜血管症(ＰＣＶ)の検査として、眼底検査、例えば、ＩＣＧなどの蛍光色素を静注後に眼底を検査する方法が用いられるが、散瞳薬を投与する必要があり、検査後数時間は散瞳状態が持続することなど、患者への負担は必ずしも軽くはない。一方、前述のようにポリープ状脈絡膜血管症の治療には光力学的療法が行われるが、当該治療においても症状が進行した患者では再発の恐れが残り、繰り返し治療を行うことが必要となる。患者の身体的、精神的及び経済的な負担を軽減する観点から、ポリープ状脈絡膜血管症の治療において、早期に診察を受け早期に確定診断を得ることは極めて重要である。すなわち、より早い時期にポリープ状脈絡膜血管症の診断を受け、又は、ポリープ状脈絡膜血管症を将来発症するリスクを知ることは重要な未解決ニーズである。
　一方、ポリープ状脈絡膜血管症の支配的な原因遺伝子は未だ同定されていない。また、単一の遺伝子の変異又は多型による疾患への関与が説明できなくとも、ポリープ状脈絡膜血管症への関与が比較的穏やかな遺伝子の変異又は多型が多数存在し、それぞれが組み合わせられて作用することによってポリープ状脈絡膜血管症の発症への遺伝的要因の関与が説明できると考えられる。
　本発明者らは、ポリープ状脈絡膜血管症に関連する遺伝子を見出すため、ゲノム上の多型、特に一塩基多型に着目した。
　ポリープ状脈絡膜血管症に関連する多型を見出すことにより、当該多型を有するか否かでポリープ状脈絡膜血管症のリスクの判断が可能となり、該多型を有する者は、発症前であっても将来的にポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあることを知り、又は、初期のポリープ状脈絡膜血管症の診断の補助に用いることが可能となる。即ち、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクを知ることによりサンプル提供者はポリープ状脈絡膜血管症の発症予防措置を講ずることが可能となり、また、早期の確定診断により、早期の治療を開始することができるため、ポリープ状脈絡膜血管症に関与する多型を見出すことは、意義深い。
　本発明の課題は、ポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型を検出することにより、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクを予測する方法、及び該検出方法に用いるキットを提供することにある。
　本発明者らは、ポリープ状脈絡膜血管症患者(ＰＣＶ患者)とポリープ状脈絡膜血管症患者でない者(非ＰＣＶ患者)のゲノム(なかでも、常染色体)上に存在する公知の多型部位を網羅的に解析し、ポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型を見出し、さらに、当該一塩基多型においてリスクアレルとその対立アレルである非リスクアレルを見出し、本発明を完成した。
　即ち、本発明は、
〔１〕　被験者由来のサンプル中の核酸分子について、配列番号1～70で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列又はその相補的配列において、前記塩基配列の17番目に存在する一塩基多型のアレルをin vitroで検出する工程(検出工程)、及び
前記検出されたアレルの少なくとも１つがリスクアレルであるか否かを判定する工程(判定工程)
を含む、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクを予測する方法、
ならびに
〔２〕　被験者由来のサンプル中の核酸分子について、配列番号1～70で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列又はその相補的配列において、前記塩基配列の17番目に存在する一塩基多型のアレルをin vitroで検出するための核酸分子を含有してなる、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測キット
に関する。
　本発明の方法により、サンプル中に存在するゲノム由来の核酸分子に含まれる本発明の一塩基多型のアレルを分析することにより、サンプル提供者のポリープ状脈絡膜血管症リスクの有無及び／又はリスクの大小を予測することができる。このリスクに基づきサンプル提供者はポリープ状脈絡膜血管症の予防措置を講じ、又は定期的に診察を受けることにより早期の診断を受け、病状が進行しない早期に適切な治療を開始することができる。また、本発明の方法により、ポリープ状脈絡膜血管症が疑われるサンプル提供者は、ポリープ状脈絡膜血管症と診断されるべき蓋然性が高いと判断されることができ、早期に治療を開始することができる。
　本発明は、遺伝子の一塩基多型(以下、SNPと記載することもある)に基づいて、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクを予測する方法において、被験者由来のサンプル中の核酸分子について、特定の塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列又はその相補的配列における、前記塩基配列の17番目に存在する一塩基多型のアレルをin vitroで検出する工程(検出工程)、及び前記検出されたアレルがリスクアレルであるか否かを判定する工程(判定工程)を含む、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測方法である。本発明は、ポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型(本発明の一塩基多型ともいう)を見出し、さらに、当該一塩基多型においてリスクアレルとその対立アレルを見出し、これらを用いることに大きな特徴を有する。従って、前記リスクアレルを用い、及び／又は、前記リスクアレルとその対立アレルの存在頻度に基づき計算されたオッズ比を指標とすることにより、このようなポリープ状脈絡膜血管症発症の予測を行うことやポリープ状脈絡膜血管症へのかかり易さを試験することも可能であり、前記方法は、ポリープ状脈絡膜血管症発症因子の測定方法、又は決定方法としても使用可能である。なお、本明細書において多型とは、ある生物種におけるゲノムの特定の位置の配列に多様性が存在することを言い、多型が存在する部位(以下、多型部位ともいう)とは、一塩基多型が存在するゲノム上の部位を言う。
　また、本明細書においてアレルとは、ある多型部位において取りうる、互いに異なる塩基を有するそれぞれの型を言う。本明細書において遺伝子型とは、ある多型部位において、特定のアレル(一方のアレルともいう)と、前記アレルに対立するアレル(他方のアレルともいう)との任意の組み合わせを言う。さらに、ある多型部位において、前記組み合わせである遺伝子型には３つの型があり、同じアレルの組み合わせをホモ型とよび、異なるアレルの組み合わせをヘテロ型とよぶ。
　本明細書において、対立するアレル(対立アレルともいう)とは、ある一塩基多型を構成するアレルのうち、特定されたものに対応する他のアレルを言う。
　本明細書において、ポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型とは、ポリープ状脈絡膜血管症患者(ＰＣＶ患者)とポリープ状脈絡膜血管症患者でない者(非ＰＣＶ患者)の間で、当該一塩基多型におけるそれぞれのアレルの頻度の比が統計学的にあるｐ値で有意に異なる一塩基多型をいう。
　本発明において、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクとは、ポリープ状脈絡膜血管症に関するリスクを言う。本発明におけるポリープ状脈絡膜血管症のリスクには、将来的にポリープ状脈絡膜血管症を発症する可能性やポリープ状脈絡膜血管症へのかかり易さが含まれる。本発明において、リスクの予測とは、将来のリスクの有無を現時点で判定し、又は、将来のリスクの大小を現時点で判定することを言う。
　詳細は後述するが、本発明において、リスクアレルとは、前記ポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の各アレルのうち、前記各アレルについて求めたオッズ比が１より大となるようなアレルを言う。また、非リスクアレルは、リスクアレルの対立アレルであることから、前記オッズ比が１以下となるようなアレルを言う。ここで、各アレルについて求めたオッズ比、即ち、一方のアレルについて求めたオッズ比とは、ＰＣＶ患者群における一方のアレルの頻度と他方のアレル(対立アレル)の頻度の比を、非ＰＣＶ患者群における前記一方のアレルの頻度と前記他方のアレルの頻度の比で除したものである。即ち、一方のアレルについて求めたオッズ比は他方のアレルについて求めたオッズ比の逆数である。尚、オッズ比についての詳細は後述する。また、本明細書においてアレルの頻度(アレル頻度)とは、ある集団において、特定のアレルが全体に占める割合を意味し、例えば実施例に記載した方法によって一定集団に属する各個体のアレルを決定することにより求めることができる。その他、本明細書に記載のない事項は、遺伝統計学入門(鎌谷直之；岩波書店、2007)又はバイオインフォマティクス第２版(Mount DW著、岡崎康司ら監訳；メディカル・サイエンス・インターナショナル、2005)等の成書を参考にすることができる。
　以下に、ポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の同定方法を説明する。
　ポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型は、ポリープ状脈絡膜血管症と診断されたＰＣＶ患者、及び、ポリープ状脈絡膜血管症ではないと診断された非ＰＣＶ患者それぞれの血液から総DNAを抽出し、ヒトゲノム上の公知の一塩基多型約50万個を指標として、個々の一塩基多型のアレルがＰＣＶ患者又は非ＰＣＶ患者に特異的に、より具体的には、統計学的に有意に存在するか否かを解析することにより見出した。ここで、対照となる非ＰＣＶ患者はポリープ状脈絡膜血管症でない者であれば良い。ポリープ状脈絡膜血管症でないと診断され、かつ、他の疾患、例えば緑内障及び／又は白内障であると診断された患者を対照として用いても良い。この場合、ポリープ状脈絡膜血管症に特異的に関連する一塩基多型を見出すために、対照として用いられる疾患の患者(群)とポリープ状脈絡膜血管症の患者(群)との比較を複数の疾患について行い、共通して、あるｐ値で有意な差があると判定されるような一塩基多型を用いることが好ましい。かかる一塩基多型のアレルを用いることにより、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測が可能となる。詳細は実施例の項にて説明するが、以下のような方法により、本発明で開示されたポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型を同定することができる。
(ポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の同定)
　まず、ポリープ状脈絡膜血管症と診断されたＰＣＶ患者、及び、ポリープ状脈絡膜血管症ではないと診断された非ＰＣＶ患者それぞれの血液から総DNAを抽出する。血液中の総DNAは公知の任意の方法によって抽出することができるが、例えばフェノール抽出法(Methods in Enzymology、152巻、181ページ、1987年)などの公知の方法によって抽出することができる。
　抽出したDNAサンプル中の一塩基多型における塩基の種類、すなわち各多型部位におけるアレルの同定は、例えば後述の固層化プローブ(マイクロアレイ)を用いる方法、ＴａｑＭａｎ(登録商標)法などのPCRを応用する方法など、任意の方法で行うことができる。その際、検出に用いるプローブは、目的とする一塩基多型及びその周辺の配列情報を元に設計することができる。設計に当たっては、例えば米国の国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)が提供するdbSNPもしくはHapMapプロジェクトが提供するSNP情報のデータベースのような公知の一塩基多型のデータベース、又はNCBIが提供するGenbankのような公知の配列情報のデータベースを用い、これらのデータベースから得られる配列等の情報を参考にすることもできる。一塩基多型の検出に用いるプローブは、ゲノムのセンス鎖に相補的なプローブであっても、アンチセンス鎖に相補的なプローブであっても、いずれによっても検出できる。ヒトのゲノム上に存在する一塩基多型を検出できるプローブを大量に固層化し、同一操作で多数の一塩基多型のアレルを検出可能なキットも市販されており、このようなキットを用いて効率よくサンプル中のアレルを検出することも可能である。また、このようなキットの多くは、一つのサンプルに含まれる対立する各々のアレルを同一操作で検出する構成になっており、遺伝子型を決定することができる。このようなキットの市販品の好適例としては、マイクロアレイ型の一塩基多型分析キット〔アフィメトリックス社、ジーンチップ　ヒューマンマッピング 250K Nsp/Sty アレイ(GeneChip(登録商標) Human Mapping 250K Nsp/ Sty Array)〕が挙げられる。
　ポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型は、前述のような方法でＰＣＶ患者及び非ＰＣＶ患者由来のDNAに存在するアレルを同定しておき、各アレルの頻度をＰＣＶ患者と非ＰＣＶ患者で統計学的に比較し、アレル頻度が後述のｐ値で有意な差が生じるか否かをもって判定することができる。
　統計学的な解析には、例えばFisherの正確確率検定、カイ二乗検定、又はコクラン・アーミテージ検定(Cochran-Armitage trend test)を用いることができる。また、比較を繰り返し行うことに起因する第一種の過誤の発生リスクの増大を補正する必要がある場合は公知の方法、例えばボンフェローニ、ホルム、又はベンジャミニとホフバーグなどの方法によって補正することができる。
　ボンフェローニの補正に基づく場合を例示すると、所望の有意水準、例えば5×10-2の有意水準を繰り返し回数、即ち、解析に用いる多型部位の個数で割ってポリープ状脈絡膜血管症に関連するSNPの選択に用いる有意水準とすることにより、第一種の過誤を最大に考慮しても高々5×10-2の危険率でポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型を判定することができる。このようにして設定した有意水準を下回る一塩基多型をより好ましい一塩基多型として選択することができる。但し、本発明のような全ゲノムに亘る一塩基多型の解析において、ボンフェローニの補正は過剰補正であり、著しくｐ値が低下することから疾患に関連する一塩基多型を見落とす可能性が高まるとの報告もなされている(Schymick J C et al., Lancet Neurology. 2007：6: 322-8, Van Steen K et al., Nature Genetics. 2005： 37: 683-691)。
　一方、ベンジャミニとホフバーグによる方法は、多重解析の全体において、実際には有意でないにも関わらず有意であると誤って判定する割合(False Discovery Rate; FDR)を所望の水準に抑える手法である(Benjamini Y, Hochberg T： J. Royal Stat Soc B85 pp289-300, 1995)。すなわち、n個の一塩基多型について統計解析を行うと、疾患に関連のない一塩基多型のｐ値は0～1の範囲に一様に分布すると考えられる。一方、疾患に関連する一塩基多型のｐ値は0付近に集中すると考えられる。真に疾患に関連する一塩基多型の割合をσ、疾患に関連のない一塩基多型の割合を1-σと仮定する。ある有意水準αを考えるとき、有意水準α以下のp値であって、かつ、疾患に関連のない一塩基多型の個数の期待値はnα(1-σ)となる。統計解析によって有意となった一塩基多型の個数をRとすると、誤って判定された一塩基多型の割合、すなわち、FDRはnα(1-σ)/Rとなる。ここで、実際のσの値は不明であるとしても、常にnα(1-σ)/R≦nα/Rであるので、nα/Rの値を所望の割合とすることで、実際のFDRを所望の値以下に抑えることができる。一方、n及びRは解析によって決定される値であるので、αを変動させることによりnα/Rの値を所望の値に設定することができる。ｐ値の小さい順に一塩基多型を整列させ、それぞれのｐ値をpi (iは正の整数)とする。α＝piのとき、ｐ値がpi以下となる一塩基多型の個数はi個存在する。この中で疾患に関連のない一塩基多型の割合の期待値はnpi(1-σ)/iである。この値はiが減少するにつれて減少するので、所望のFDRとなるiをrとすると、ｐ値が小さい方から順にr個の一塩基多型が当該所望の疾患に関連すると考えることができる。
　また、学術的に望ましい多重性の補正方法は未だ確立されていないが、これらの方法で多重性の補正を行うと過剰補正になる場合には、当該補正方法によって調整される有意水準を下回らない範囲の任意の適切な水準に有意水準を設定することができる。任意の適切な水準を設定する場合、例えば50万個の一塩基多型を繰り返し解析する場合の有意水準は例えば1×10-3が好ましく、1×10-4がより好ましく、1×10-5がさらに好ましく、3×10-6がさらに好ましく、1×10-6がさらに好ましく、3×10-7がさらに好ましい。また、一般に、第一種の過誤と統計学的な検出力は反比例することが知られている。第一種の過誤を低下させつつ検出力を保つ方法としては、一塩基多型の解析を二段階に分割して実施することが挙げられる(Skol A.D. et al., Nature Genetics. 2006：38: 209-213)。例えば、まず、一次解析として、全ゲノムに亘る多数の一塩基多型解析を行い、次いで、二次解析として、一次解析である程度絞り込んだ一塩基多型を用いて解析を行う。この場合、いずれの解析においても比較的低いｐ値となるような一塩基多型を選択すればよく、好ましくは、最初の解析において候補となる一塩基多型を所望のｐ値、例えば0.001～0.05を下回るものを選択し、当該選択された一塩基多型について、多重性を考慮してさらに解析すればよい。
　また、ゲノム上の一定の領域に、比較的低いｐ値で疾患との関連を持つSNPが連続して存在する領域が見出される場合がある。このような領域に属するSNPは疾患との関連が高い。一方、このように疾患との関連を持つ一塩基多型が連続して存在する領域は、当該領域においてゲノムDNAの組み換え率が0であるか又は著しく低い、いわゆる連鎖不平衡の状態にある可能性が高い。連鎖不平衡状態にあるゲノム上の領域をＬＤブロックという。当該領域が連鎖不平衡状態にあるか否かは当該領域の解析結果に基づき公知の方法によって、又は、連鎖不平衡のデータベース、例えばHapMapプロジェクトによって提供される公知のＬＤブロック構造のデータベースを参照することにより確認することができる。連鎖不平衡状態にある一塩基多型は同じ挙動を示す蓋然性が極めて高いため、連鎖不平衡状態にある複数の一塩基多型について、任意の一つの一塩基多型、好適にはpairwise tagging法による絞込み等を行い決定した一塩基多型、いわゆるタグSNPを用いて前記連鎖不平衡状態にある複数の一塩基多型を代表することができる。さらに、本発明のポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の周辺を再解析、例えば、TaqMan(登録商標) SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems) を用いて再解析することにより、当該一塩基多型と連鎖不平衡状態にある新たな疾患関連一塩基多型が見出される場合がある。
　本発明においては、常染色体上のポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の解析において、一次解析として、個々の一塩基多型における遺伝子型の組合せとして、即ち、一方のアレルのホモ型、ヘテロ型、他方のアレルのホモ型である遺伝子型について、一方のアレルのホモ型＋ヘテロ型対他方のアレルのホモ型、一方のアレルのホモ型対ヘテロ型＋他方のアレルのホモ型、及び、一方のアレルのホモ型対ヘテロ型対他方のアレルのホモ型の３通りの統計モデル(これらは、前記一方のアレルがリスクアレルである場合、dominantモデル、recessiveモデル、genotypeモデルともいう)について、ＰＣＶ患者群対緑内障患者群(以下、比較Ａと呼ぶ)、及び、ＰＣＶ患者群対白内障患者群(以下、比較Ｂと呼ぶ)のそれぞれにFisherの正確確率検定を適用して、３通りの統計モデルを適用した場合のｐ値を求めた。次に、ポリープ状脈絡膜血管症以外の疾患に特異的に関連する一塩基多型を排除しポリープ状脈絡膜血管症に特異的に関連する一塩基多型を選択するため、比較Ａ及び比較Ｂの両者において、前述のように求めた３通りの統計モデルのｐ値のうち最小となるｐ値が比較Ａ及び比較Ｂで共通して0.01を下回る一塩基多型370個をポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の候補として選択した。さらに、二次解析として、白内障患者と緑内障患者を纏めて対照群とし、前述のポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の候補について、再度同様にＰＣＶ患者群と対照群についてｐ値を求め、３通りの統計モデルを適用して求めたｐ値のうち最小のものを当該一塩基多型を代表するｐ値とした。ポリープ状脈絡膜血管症に関連するアレル又は遺伝子型の検出に用いられる一塩基多型は、ボンフェローニ補正によって多重性の調整を行う場合には、前述のポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の候補とされた一塩基多型の個数についてボンフェローニ補正を行い、好適な一塩基多型を選択するための有意水準を設定することができる。具体的には、所望の有意水準5×10-2を繰り返し回数370回で除算し、1.35×10-4以下のｐ値の一塩基多型をポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型のうち、より好ましい一塩基多型とした。しかしながら、前述のように、ボンフェローニ補正は過剰補正であることが知られているため、上記有意水準より概ね１～2桁高い水準、例えば、ｐ値が0.01を下回る一塩基多型はポリープ状脈絡膜血管症に関連すると考えることができる。本発明においては、上述のようにして求められたｐ値が0.01を下回る一塩基多型363個は全て、候補となった一塩基多型370個について計算されたFDRが５％を下回る範囲に含まれていた。すなわち、これら363個の一塩基多型は全て好適に本発明に供することができる。
　解析にあたり、信頼性の高い結果を得るためには、解析に用いる一塩基多型に対し、予め、検出結果の品質の確認を行い、妥当な品質で検出されている一塩基多型を解析に供することが望ましい。このような品質の確認に用いられる要素としては、コールレート、ハーディー・ワインバーグ平衡及びマイナーアレル頻度がある。
　全サンプルに対する各一塩基多型の判定率、すなわちコールレートが低い多型部位はタイピングエラーが発生している率が高く、信頼性が高くない。このため、コールレートが十分に高い一塩基多型部位を用いて解析することが望ましい。一塩基多型の採否の基準とするコールレートとしては、例えば70％、好ましくは75％、より好ましくは80％、さらに好ましくは85％、さらに好ましくは90％以上のコールレートを示す一塩基多型を採用することが望ましい。
　ハーディー・ワインバーグ平衡とは、変異や淘汰圧がなく、任意交配により形成された十分な個体数を持つ遺伝的に均一な集団においては、ある遺伝子座における各対立遺伝子の分布頻度は世代を重ねても一定であることを言う。ハーディー・ワインバーグ平衡が成立しているか否かは、いくつかの公知の方法、例えばカイ二乗検定やフィッシャーの正確確率検定によって統計学的に検定することができる。十分な数のヒト集団では、通常ハーディー・ワインバーグ平衡は成立していることから、一般的には、母集団におけるハーディー・ワインバーグ平衡の成立を前提に、標本の遺伝子型判定のエラーを検出する目的でハーディー・ワインバーグ平衡の検討が用いられる。ハーディー・ワインバーグ平衡の成立を統計学的に検定する場合、有意水準としては例えば0.0001が用いられる。
　マイナーアレル頻度とは、２つのアレルに含まれる一塩基多型の場合では、２つのアレルの頻度の内、頻度が低い方のアレルの頻度のことを言う。閾値は任意に設定することが可能である。前述のように一塩基多型の概念は、マイナーアレル頻度が約1％を上回るものであるから、マイナーアレル頻度が1％を下回る一塩基多型は棄却することが望ましい。また、本発明のような多因子疾患の原因となる多型の探索においては、疾患への相対的な関与が比較的低い多型が複数個関与していると考えられるため、マイナーアレル頻度が一定頻度、例えば5％を下回る一塩基多型を棄却することが望ましい。
　このようにして得たポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型は、NCBIが提供するGenbankのような公知配列のデータベース、あるいは、NCBIが提供するdbSNP又はHapMapプロジェクトのデータベースのような公知一塩基多型のデータベースを参照することにより、データベース上のSNP ID(特に、dbSNP ID)、その一塩基多型が存在するゲノム上の物理的位置、一塩基多型の周辺の配列情報、一塩基多型が存在する遺伝子又は一塩基多型の近傍に存在する遺伝子、遺伝子上に存在する場合には一塩基多型の存在する位置がイントロン又はエクソンのいずれであるかの区別、遺伝子の機能、相同遺伝子などの情報を得ることができ、これらの情報を元に本発明において用いる核酸分子を取得し、本発明に用いるプローブなどを設計することができる。これらの情報をデータベースで検索する際の一塩基多型を特定するための情報としては、これらデータベースに収録された情報の１つ又は複数を使用することができる。
　このようにして決定されたポリープ状脈絡膜血管症と関連する一塩基多型において、一方のアレルとポリープ状脈絡膜血管症発症の有無との間にどの程度強い関連が存在するかの指標として、オッズ比を求めることができる。オッズとは、ある群においてある事象が起こる確率を当該事象が起こらない確率で割った値であり、オッズ比とは、2つの異なる群におけるオッズの比である。アレルについてオッズ比を求める場合、あるアレルを持つ場合に疾患であるオッズ比、即ち、ＰＣＶ患者群における、一方のアレルの頻度と、前記一方のアレルに対立する、他方のアレルの頻度との比を、非ＰＣＶ患者群における一方のアレルの頻度と他方の頻度との比で除したものである。このとき、求められたオッズ比を本発明では前記「一方のアレル」について求めたオッズ比と呼ぶ。
　アレルのオッズ比を求める際に、ある頻度が0になり、よってオッズ比が無限大となるような場合には、当該0の代わりに適当な数を用いてオッズ比を近似計算することができる。0の代わりに用いる適当な数としては、例えば、0.5や0.1などの0を超える実数を用いることができる。
　さらに、本発明においては、前記アレルについて求めたオッズ比を用いてリスクアレルが決定される。前述の定義から明らかなように、一方のアレルについて求めたオッズ比は他方のアレルについて求めたオッズ比の逆数となっている。アレルについて求めたオッズ比が１より大となるようなアレルを本発明ではリスクアレルと呼び、リスクアレルに対立するアレルを非リスクアレルと呼ぶ。なお、本発明において「アレルのオッズ比」と称する場合、リスクアレルについて求めたオッズ比、即ち、リスクアレルを持つ場合にポリープ状脈絡膜血管症であることのオッズ比を意味する。
　本発明においては、これらの指標により、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクを予測することができる。ある一塩基多型のリスクアレルはＰＣＶ患者群において非ＰＣＶ患者群よりも高頻度に認められるアレルであり、即ち、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクに関与するアレルである。アレルを用いてポリープ状脈絡膜血管症リスクを予測する場合、当該一塩基多型のリスクアレルを少なくとも１つ持つことによりポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると予測される。この場合、オッズ比が大きいほどリスクアレルを有するサンプル提供者のポリープ状脈絡膜血管症のリスクは高い。一方、オッズ比の定義から明らかなように、本発明においてはアレルのオッズ比の逆数を使用することにより、非リスクアレルを持つものの疾患リスクを予測することができる。即ち、アレルのオッズ比の逆数が１より小さいほど、非リスクアレルを持つものの疾患リスクが低いことの予測に用いることができる。
　本発明においては、アレルに加え、又は、アレルの代わりに遺伝子型、即ち、一方のアレルとその対立アレルとの組合せである遺伝子型を用いてポリープ状脈絡膜血管症のリスクを予測することができる。この場合にも、アレルの場合と同様にリスクアレルを基準とすればよく、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型は、オッズ比を考慮して決定することができる。
　遺伝子型のオッズ比を求めてポリープ状脈絡膜血管症のリスクを判定する場合、まず、リスクアレルを基準にdominant型オッズ比とrecessive型オッズ比の２通りのオッズ比を求める。
　本発明において、dominant型オッズ比は、リスクアレルを少なくとも１つ持つ場合(即ち、リスクアレルホモ型又はヘテロ型である場合)にポリープ状脈絡膜血管症であることのオッズ比、即ち、ＰＣＶ患者群におけるリスクアレルホモ型頻度とヘテロ型頻度の和と、非リスクアレルホモ型の頻度との比を、非ＰＣＶ患者群におけるリスクアレルホモ型頻度とヘテロ型頻度の和と、非リスクアレルホモ型の頻度との比で除したものであり、recessive型オッズ比はリスクアレルをホモに持つ場合にポリープ状脈絡膜血管症であるオッズ比、即ち、ＰＣＶ患者群におけるリスクアレルホモ型の頻度と、非リスクアレルホモ型頻度とヘテロ型頻度の和との比を、非ＰＣＶ患者群におけるリスクアレルホモ型の頻度と、非リスクアレルホモ型頻度とヘテロ型頻度の和との比で除したものである。
　次に、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型を決定する場合、上記のようにして求められたdominant型オッズ比及びrecessive型オッズ比を考慮して以下のように決定する。
　ポリープ状脈絡膜血管症に関連する各一塩基多型において、dominant型オッズ比がrecessive型オッズ比より大である場合、当該一塩基多型のリスクアレルはdominant型オッズ比に関連する。一方、同様にrecessive型オッズ比がdominant型オッズ比より大である場合、当該一塩基多型のリスクアレルはrecessive型オッズ比に関連する。リスクアレルがdominant型オッズ比に関連する場合、当該一塩基多型におけるポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型は、リスクアレルのホモ型及びヘテロ型であり、リスクアレルがrecessive型オッズ比に関連する場合、当該一塩基多型におけるポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型は、リスクアレルのホモ型である。
　尚、遺伝子型のオッズ比を求める際に、いずれかの遺伝子型の頻度が０となり、オッズ比が無限大となり、よって、算出不能となってしまうことがある。このような場合、アレルのオッズ比の場合と同様に、当該0の代わりに適当な数を用いてオッズ比を近似計算することができる。0の代わりに用いる適当な数としては、例えば、0.5や0.1などの0を超える実数を用いることができる。
　このようにして決定されたポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型がサンプル中に検出された場合、当該サンプル提供者はポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると予測されることができる。いずれの場合もオッズ比が大である程ポリープ状脈絡膜血管症のリスクは高いと予測される。
　さらに、本発明の一塩基多型の組み合わせによってポリープ状脈絡膜血管症のリスクを予測する場合にも、オッズ比の大小を用いてその予測精度を向上することができる。即ち、リスクアレルもしくはポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型を多数持ち、及び／又は、非リスクアレルもしくはポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型でない遺伝子型を少数しか持たないサンプル提供者のポリープ状脈絡膜血管症のリスクは、そうでないサンプル提供者のリスクより高く、この場合において、オッズ比がより大きいアレル又は遺伝子型をより多く持つ場合に、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクはより高いと予測される。
　好ましくは、アレル又は遺伝子型と疾患の程度の関連性を表す指標となるオッズ比又はポリープ状脈絡膜血管症のリスク予測に用いるオッズ比は、統計学的に有意であると判定された一塩基多型について算出されたオッズ比である。
　後述のように、本発明の一塩基多型はゲノム上のイントロンやエクソンなどの遺伝子領域に存在する場合、又は、ゲノム上の遺伝子でない領域のいずれにも存在する場合がある。イントロンやエクソンに存在する場合には当該遺伝子はポリープ状脈絡膜血管症の原因遺伝子の一つである可能性がある。また、本発明の一塩基多型がゲノム上の遺伝子でない領域に存在する場合は、当該一塩基多型の近傍にある遺伝子と当該一塩基多型が連鎖しており、当該近傍に存在する遺伝子がポリープ状脈絡膜血管症の原因遺伝子の一つである可能性があり、あるいは、当該一塩基多型を含む領域又はその近傍がmRNAなどに転写され、RNA干渉などの現象を介して他の遺伝子の発現に関与している可能性がある。即ち、ゲノム上で本発明の一塩基多型が属する遺伝子、又は、ゲノム上で本発明の一塩基多型の近傍に存在する遺伝子は本発明の範囲に含まれる。
　本発明において、イントロン型一塩基多型(iSNP)とはイントロンに一塩基多型が存在することをいう。翻訳領域型一塩基多型(cSNP)とは、タンパクに翻訳される領域に一塩基多型が存在するもののうち、当該一塩基多型を含むコドンが他のアミノ酸をコードするコドンや終止コドンに変異するなど、アミノ酸配列に変化を伴うものをいう。サイレント型一塩基多型(sSNP)とは、翻訳領域に一塩基多型が存在するもののうち、アミノ酸配列の変化を伴わないものをいう。ゲノム型一塩基多型(gSNP)とは、ゲノム上の遺伝子をコードしない領域に一塩基多型が存在することをいう。転写調節型多型(rSNP)とは、エクソン上の転写調節に関与すると考えられる部位に存在する一塩基多型をいう。
　このように、一塩基多型はゲノム上のどのような位置にも存在することがあり、いずれの場合も疾患との関連を有し得る。イントロンあるいは非翻訳領域に一塩基多型が存在する場合は、遺伝子発現制御に影響する場合や、遺伝子の転写後に起こるスプライシングやmRNAの安定性に影響することがある。翻訳領域に一塩基多型が存在する場合は、その塩基の置換によってあるアミノ酸に対応するコドンが別のアミノ酸に対応するコドンに変化する、あるいは、終止コドンに変化するなどの変化が生じ、これによってコードされるタンパク質の構造に変化が生じることがある。これらの変化によって遺伝子の発現量や機能、ひいては当該遺伝子がコードするタンパクの発現量又は機能に変化が生じ、種々の疾患の原因になり得る。ゲノム型一塩基多型が疾患と関連する場合は、当該多型部位を含む領域が実際には翻訳され、他の遺伝子の発現に何らかの影響を及ぼしている可能性がある。サイレント型一塩基多型が疾患と関連している場合、その一塩基多型の周辺に疾患と関連する別の多型が存在し、当該多型とサイレント型一塩基多型が連鎖不平衡状態にある場合に疾患との関連が認められることが考えられる。同様に、サイレント型一塩基多型以外の一塩基多型であっても、当該一塩基多型自体は直接的なポリープ状脈絡膜血管症の原因ではなく、周辺に存在するポリープ状脈絡膜血管症の真の原因である多型と連鎖不平衡状態にある場合にも、これらの一塩基多型とポリープ状脈絡膜血管症の関連が認められることがある。
(ポリープ状脈絡膜血管症に関連するアレルを含む核酸分子)
　本発明の別の態様では、ポリープ状脈絡膜血管症と関連する一塩基多型を含む核酸分子、及び、ポリープ状脈絡膜血管症と関連する一塩基多型を含む核酸分子に相補的な配列を有する核酸分子が提供される。
　後述の表１～１０に記載された一塩基多型を含む核酸配列を含む核酸分子及び／又は当該配列の相補的配列を含む核酸分子は、本発明でアレル検出に使用される核酸分子である。本発明でアレル検出に使用される核酸分子は、好ましくは表１又は表２に記載された一塩基多型を含む核酸分子又はその断片であって、少なくともいずれか１つの前記核酸分子もしくは当該核酸分子に相補的な核酸分子又はこれらの断片であり、より好ましくは表１に記載された一塩基多型を含む核酸分子又はその断片であって、少なくともいずれか１つの前記核酸分子もしくは当該核酸分子に相補的な核酸分子又はこれらの断片である。また、これらの表１～１０に記載された一塩基多型を含む核酸分子又は当該核酸分子に相補的な核酸分子のうち、リスクアレルを含む核酸分子又は当該核酸分子に相補的な核酸分子であることが望ましい。
　これらのポリープ状脈絡膜血管症と関連する一塩基多型を含む核酸分子、又は当該核酸分子に相補的な配列を有する核酸分子は、ポリープ状脈絡膜血管症リスクの高低を判定するマーカーとして用いることができる。さらにこれらの核酸分子は、当該一塩基多型における、リスクアレルもしくはその対立アレルを検出し、又は、遺伝子型を決定するためのプローブとして用いることができる。また、当該一塩基多型がエクソン上に存在する場合には、これらの核酸分子は遺伝子の転写物の検出に用いることができる。
　本発明において、より好ましい核酸分子は、ポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の同定の項で説明したのと同様の方法で選択することができる。
　真核生物のゲノムを構成する核酸分子はセンス鎖と、センス鎖に相補的なアンチセンス鎖の二重鎖で構成されている。即ち、一塩基多型もセンス鎖とアンチセンス鎖から構成されており、いずれの鎖の一塩基多型を検出することも同じ意味を持つから、本発明の核酸分子はこれらのいずれをも含む。
　本発明における核酸分子は、デオキシリボ核酸であるかリボ核酸であるかを問わず、これらの両方を同一の核酸分子中に持つ核酸分子もまた本発明に含まれる。尚、リボ核酸を含む核酸分子を用いる場合には、本発明の配列においてチミジン(T)で定義されたヌクレオシドはウリジン'(U)と読み替えることができる。相補鎖のヌクレオシドがチミジンとなる場合についても同様である。また、これらの核酸分子に本発明に用いるための機能を損なわない範囲で、必要に応じ化学修飾を施すことができる。この場合の機能とは、核酸分子を使用する目的を達成する機能を言う。
　本発明における核酸分子は、本明細書に開示された配列情報、又は、本明細書に開示されたデータベースID等の情報をdbSNP、HapMap又はGenbank等のデータベースで検索して得られる配列情報に基づき、公知の方法、例えばホスホロアミダイト法を用いて合成することができる。市販のDNA合成機を用いて合成することも可能である。また、本発明における核酸分子はヒト由来のDNAを含むサンプルから、PCR法などの公知の方法により、又は、一部の核酸分子についてはヒト由来のRNAを含むサンプルから、RT-PCR法などの公知の方法により取得することができる。取得に必要なプライマーは当業者であれば本明細書に開示された配列情報、又は、本明細書に開示されたデータベースのID等の情報から検索可能な配列情報に基づき設計することができる。例えばPCR法を用いる場合には、目的とする核酸分子の一部の配列と相同な配列を有するような約10～30塩基のプライマーが使用可能であり、RT-PCR法を用いる場合には、オリゴdTプライマー、又はランダムヘキサマーなどを用い、逆転写反応を行って相補DNA(cDNA)を作成し、当該cDNA中の目的の配列を前述のPCR法で増幅することによって得ることができる。
　核酸分子は、好ましくは16～50塩基、より好ましくは23～27塩基、さらに好ましくは25塩基の長さを有し、かつ、前述の多型部位とその周辺の配列、又はこれに相補的な配列を含む核酸分子であることが望ましい。なお、核酸分子には、その機能を損なわない範囲で、任意の化学修飾を施すことができる。この場合の機能とは、核酸分子を使用する目的を達成する機能を言う。
　本発明のポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の検出方法及びポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測方法において、アレル検出に用いられる核酸分子は、
好ましくは、配列番号1～70で示される塩基配列からなる群(それぞれ、奇数番目と偶数番目の塩基配列の組で１つの一塩基多型に対応する)より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列において、前記配列番号1～70で示される塩基配列の17番目に相当するアレルを有する配列を含有する核酸分子であり、
より好ましくは、配列番号1～12及び配列番号69～70で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列において、前記配列番号1～12又は配列番号69～70で示される塩基配列の17番目に相当するアレルを有する配列を含有する核酸分子であり、
さらに好ましくは、以下の、a～gの一塩基多型を含む塩基配列の組からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列において、前記a～gの組に含まれる塩基配列の17番目に相当するアレルを有する配列を含有する核酸分子である。(ここで、前述のように、a～gで示される配列番号の組において、それぞれの塩基配列の組は１つの一塩基多型の互いに対立するアレルを17番目の塩基に含む塩基配列である)
ａ：　配列番号１及び／又は配列番号２、
ｂ：　配列番号３及び／又は配列番号４、
ｃ：　配列番号５及び／又は配列番号６、
ｄ：　配列番号７及び／又は配列番号８、
ｅ：　配列番号９及び／又は配列番号１０、
ｆ：　配列番号１１及び／又は配列番号１２、ならびに
ｇ：　配列番号６９及び／又は配列番号７０
なお、本明細書において、部分配列とは、核酸配列の断片のことを意味し、前記配列の17番目に相当するアレルを有するものであれば配列長には限定はないが、例えば、好ましくは16～50塩基、より好ましくは23～27塩基、さらに好ましくは25塩基の長さを有する断片である。本発明の一塩基多型をdbSNP等の公知一塩基多型のデータベース又は公知配列情報のデータベースで検索して得られる、本発明の一塩基多型を含む核酸配列の断片も本発明の部分配列に含まれる。
　上記のいずれかの一塩基多型を含む核酸分子を用いる場合、中でも、それぞれの一塩基多型を含む配列の組のうち、奇数番目の配列番号で示される配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列からなる塩基配列において、前記選択される塩基配列の17番目に存在する一塩基多型のアレルを含む核酸分子を用いることが好ましい。また、上記核酸分子は、上記アレルを含む配列からなるものが好ましい。なお、これらはそれぞれの多型部位において、リスクアレルを含む塩基配列である。
(ポリープ状脈絡膜血管症に関連するアレルを検出可能なプローブ)
　本発明の別の態様では、ポリープ状脈絡膜血管症に関連するアレルを検出可能なプローブが提供される。本発明におけるプローブは、前述の本発明の核酸分子と同様の方法で作ることができる。
　プローブは、後述の表１～１０に記載された一塩基多型の各アレルを含む核酸配列又はその相補的配列と、ストリンジェントな条件(高ストリンジェンシーな条件ともいう)でハイブリダイズし得るものであればいかなるものでも用いられる。好ましくは、本発明のプローブは、表１又は表２に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型に含まれるリスクアレル及び／又は非リスクアレルを検出可能なプローブであり、より好ましくは表１に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型に含まれるリスクアレル及び／又は非リスクアレルを検出可能なプローブである。また、これらの表１～１０に記載されたいずれか１つの一塩基多型に含まれるリスクアレル及び／又は非リスクアレルを検出可能なプローブにおいて、好ましい態様の１つとしてリスクアレルを検出可能なプローブが挙げられる。一方、リスクアレルを検出可能なプローブと非リスクアレルを検出可能なプローブの両方を用いることにより、当該一塩基多型の遺伝子型を決定することができる。
　本明細書において、ハイブリダイズとは、ある配列を有する核酸分子と、その核酸分子の少なくとも一部分に対し相補的な核酸分子が互いに相補的な塩基配列に基づき水素結合を介して会合することを意味する。元の核酸分子と会合する相補的な核酸分子の種類は同じでも異なっても良く、これらの核酸分子を構成する核酸分子の種類はデオキシリボ核酸であってもリボ核酸であっても、又は同一核酸分子内にその両方を持つものであっても良い。
　本明細書においてストリンジェントな条件又は高ストリンジェンシーな条件とは、ある配列を有する核酸分子に、前記核酸分子の部分配列と相補的な配列を有する核酸分子が特異的にハイブリダイズする条件を意味する(Fred M. Ausuble et al., Current Protocols in Molecular Biology p.2.10.1-2.10.16; John Wiley and Sons, Inc.)。25塩基長のDNA分子からなる固層化プローブを用いる場合の具体例としては、例えば、0.056M 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid 、5％ DMSO、2.5×デンハルド液、5.77mM EDTA、0.0115％ Tween-20、2.69M Tetrametyl Ammonium Chlorideの存在下、95℃で10分変性後49℃でハイブリダイズするような条件が例示される。このような条件はプローブとして用いる核酸分子の配列長や化学修飾の程度によって異なる場合があることが知られており、特異的にハイブリダイズが可能となるようなハイブリダイズ及び／又は洗浄条件の最適化は当業者の通常の創作能力で可能である。
　本発明においてアレル特異的(又は、アレルに特異的)とは、当該多型部位を含む核酸分子において当該アレルを含むこと、又は、ある核酸分子が当該多型部位において、当該アレルを含む配列を有する核酸分子にストリンジェントな条件下で特異的に、即ち、当該アレルと対立するアレルを識別可能なようにハイブリダイズすることを言う。
　多型部位のアレルの決定は、ゲノムのセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれの多型部位を検出することによっても行うことができるため、本発明におけるプローブはセンス鎖のアレルに特異的な配列の相補的配列、すなわちアンチセンス鎖のアレルに特異的な配列、ならびにアンチセンス鎖のアレルに特異的な配列に相補的な配列、すなわちセンス鎖のアレルに特異的な配列を持つ核酸分子のいずれも含まれる。本発明のプローブは本発明の一塩基多型を含むcDNA又はmRNAの検出に用いることもできる。cDNA又はmRNAの検出に用いる場合、当該一塩基多型はエクソン又はその近傍に存在するものが好適に用いられる。
　本発明におけるプローブは、後述の表１～１０に記載された、アレル特異的な配列もしくはその相補鎖又はこれらの部分配列を含む核酸分子からなる。
　本発明におけるプローブには、アレル特異的な配列又はその相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る範囲において、末端にスペーサー又は安定化等に供する目的で当該配列に由来しない任意の数塩基の配列を付加することができる。好ましくは、本発明におけるプローブにおいてアレルに特異的なハイブリダイズに寄与する配列はアレル特異的な配列又はその相補鎖のみからなる。
　プローブには検出に用いるための任意の標識を施すことができる。プローブに施す標識は通常用いられるいかなるものでも用いうるが、一般的には例えばFITCやCy3などの蛍光標識、ビオチン、又は、アルカリホスフォターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識などが用いられる。ビオチン標識を用いる場合には、ビオチンに特異的に結合するストレプトアビジン又はアビジンにさらに検出可能な標識を施しておき、当該標識ストレプトアビジン等を二次標識として使用する。標識ストレプトアビジン等の代わりに標識抗ビオチン抗体を使用することもできる。ビオチンに結合したストレプトアビジンに対し、さらに標識抗ストレプトアビジン抗体を三次標識として使用することにより、検出感度を向上することも可能である。プローブに標識を施す方法は公知の如何なる方法でも用いられ、その方法は当業者にとって周知である。プローブに前述のスペーサーとなる任意の配列を付加し、スペーサーに標識を施すこともできる。プローブの標識化用の試薬、標識ストレプトアビジン、標識抗ビオチン抗体などは試薬として市販されており、購入して使用することもできる。
　本発明におけるプローブは、目的とするアレルを有する核酸分子に特異的にハイブリダイズし得るかぎり、デオキシリボ核酸であるかリボ核酸であるかを問わず、これらの両方を同一の核酸分子中に持つ核酸分子からなるプローブもまた本発明に含まれる。また、リボ核酸を含む核酸分子をプローブとして用いる場合には、本発明の配列においてチミジン(T)で定義されたヌクレオシドはウリジン’(U)と読み替えることができる。前記本発明の配列の相補鎖のヌクレオシドがチミジンとなる場合、又は、ｍＲＮＡの検出のために本発明のプローブを用いる場合についても同様である。また、本発明におけるプローブには、目的とするアレルを有する核酸分子にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズし得る限り、必要に応じ化学修飾を施すこともできる。化学標識を施す方法は公知のいかなる方法も用いられる。
　検出用のプローブは、溶液状態でサンプルと反応させ公知の方法で検出することも、あらかじめ担体上に固層化しておくことも可能である。数個乃至数十万個の異なる一塩基多型のそれぞれのアレルに対応するプローブを、一つの一塩基多型あたり一個乃至十数個ずつあらかじめ固体の担体上の定められた位置に固層化しておき、サンプルをこれに反応させ、ハイブリダイズしたプローブから生じるシグナルをスキャンしコンピューターを用いて解析する固層化プローブ、いわゆるマイクロアレイの形態を取ることも可能である。固層化プローブの形態を取る場合には、固層化するプローブの最大数はプローブの固層化密度と固層化部位の面積によって制限される。
　このような固層化プローブの形態を取る場合、サンプル中の核酸分子を公知の方法で標識化しておき、固層化された本発明の非標識プローブと結合させることにより、又は、検出すべきアレルを持つ核酸分子を固層化された本発明の非標識プローブと結合させた後に公知の方法で標識化することにより、標識された、前記検出すべきアレルを持つ核酸分子由来の固層上のシグナルを検出することができる。
　固層化は公知のいかなる方法によっても行うことができるが、例えば合成オリゴプリント、スポッティングフォトリソグラフなどの方法を用いることができる。また、担体の材質には制限がなく、一般的に用いられる材質、例えばポリカーボネートやポリスチレンなどの高分子、ガラス、シリコン結晶等が用いられる。また、核酸の接着力を高めるために、固層化の前に担体にあらかじめ陽イオン化などのコーティングを施しても良い。また、非特異的な核酸の担体への吸着を防ぐため、固層化を行った後に公知のブロッキング剤によりブロッキングを行うこともできる。このようなブロッキング剤には、非特異的な核酸の担体への吸着を抑制できるものであれば何でも用いられるが、例えばサケ精子ＤＮＡ、デンハルト溶液、胎盤から抽出したCot-I DNA、ドデシル硫酸ナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートなどの非イオン性界面活性剤などを用いることができる。
　また、プローブを固層化する場合には、同一担体上に対立する各々のアレルに特異的なプローブを固層化することにより、一つのサンプル中に含まれる対立する各々のアレルを同一操作で検出する構成とすることもできる。このような構成では、同一の操作によってサンプルのアレルのみならず遺伝子型を決定することも可能である。
　検出用のプローブの好適な配列長は検出方法によって異なるが、本発明のポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型のアレル又は遺伝子型を特異的に検出可能なものであればよい。例えば、アレルの検出に固層化プローブを用いる場合のプローブは、好ましくは16～50塩基、より好ましくは23～27塩基、さらに好ましくは25塩基の長さを有し、かつ、前述の多型部位とその周辺の配列、又はこれに相補的な配列を含む核酸分子からなるプローブであり、アレルの検出を溶液状態で行う場合のプローブは、好ましくは16～50塩基、より好ましくは23～27塩基、さらに好ましくは25塩基の長さの長さを有し、かつ、前述の多型部位とその周辺の配列、又はこれに相補的な配列を含む核酸分子からなるプローブである。
　本発明のポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の検出方法及びポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測方法において、アレル検出に用いられるプローブは、
配列番号1～70で示される塩基配列からなる群(それぞれ、奇数番目と偶数番目の塩基配列の組で１つの一塩基多型に対応する)より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列からなる塩基配列において、前記配列番号1～70で示される塩基配列の17番目に相当するアレルを有する塩基配列を含有するプローブであり、
好ましくは、配列番号1～12及び配列番号69～70で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列からなる塩基配列において、前記配列番号1～12又は配列番号69～70で示される塩基配列の17番目に相当するアレルを有する塩基配列を含有するプローブであり、
より好ましくは、以下の、a～gの一塩基多型を含む塩基配列の組からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列からなる塩基配列において、前記a～gの組に含まれる塩基配列の17番目に相当するアレルを有する塩基配列を含有するプローブである。(ここで、前述のように、a～gで示される配列番号の組において、それぞれの塩基配列の組は１つの一塩基多型の互いに対立するアレルを17番目の塩基に含む塩基配列である)
ａ：　配列番号１及び／又は配列番号２、
ｂ：　配列番号３及び／又は配列番号４、
ｃ：　配列番号５及び／又は配列番号６、
ｄ：　配列番号７及び／又は配列番号８、
ｅ：　配列番号９及び／又は配列番号１０
ｆ：　配列番号１１及び／又は配列番号１２、ならびに、
ｇ：　配列番号６９及び／又は配列番号７０
　上記のいずれかの一塩基多型を含むプローブを用いる場合、中でも、それぞれの一塩基多型を含む配列の組のうち、奇数番目の配列番号で示される配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列からなる塩基配列において、前記選択される塩基配列の17番目に存在する一塩基多型のアレルを含むプローブを用いることが好ましい。なお、これらはそれぞれの多型部位において、リスクアレルを含む塩基配列である。
(サンプル中のポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の検出方法及びポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測方法)
　本発明のある態様では、核酸分子を含むサンプル中に、ＰＣＶ患者において頻度が高いアレル又は遺伝子型を有するか否かの検出方法が提供される。サンプルとしては、核酸分子を含むもの、即ち、ゲノム由来の核酸分子(DNA及び／又はRNA)を抽出可能なもの、又は、本発明の一塩基多型の近傍に存在する遺伝子を含むmRNA又はcDNAを抽出可能なものであれば何でも良いが、例えば、血液、白血球、毛根、毛髪、唾液、口腔粘膜細胞、鼻腔粘膜細胞、皮膚、又は、生検によって得た筋肉もしくは臓器などの組織が用いられる。
　前述のように、真核生物のゲノムを構成する核酸分子は互いに相補的なセンス鎖とアンチセンス鎖で構成されており、サンプルに含まれる核酸分子における本発明の一塩基多型のアレルの検出は、当該多型部位のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれの塩基を検出することによっても行うことができる。
　本発明で開示された、ポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型を含む33塩基長の核酸配列は、その中央(即ち、17番目)の塩基のみが異なる2つの塩基配列からなる塩基配列の組(即ち、配列番号が奇数と偶数の組)からなり、当該17番目の塩基が多型部位である。多型部位におけるリスクアレルを含む塩基配列は、前記の塩基配列の組のうち先の(即ち、奇数番目の)配列である。また、リスクアレルは後述の表１～１０に記載されている。これらの一塩基多型の少なくとも１つについて、サンプルに含まれる核酸分子中のリスクアレルを検出することにより、サンプル提供者のポリープ状脈絡膜血管症リスクを予測することができる。即ち、サンプル中の核酸分子に当該一塩基多型におけるリスクアレルが少なくとも一つ存在する場合に、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると予測すればよい。
　また、上記で同定したポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型について、一つのサンプルに含まれる特定のアレルに対立する各々のアレルを検出し、遺伝子型を決定することができる。即ち、あるアレルのみが検出された場合は当該アレルをホモに有するホモ型であり、２つのアレルが検出された場合には当該２つのアレルをヘテロに有するヘテロ型である。これらの一塩基多型の少なくとも１つについて、サンプル中の核酸分子に含まれる当該一塩基多型の遺伝子型を決定し、後述の表１１～１９に記載されたＰＣＶ患者群及び対照群の遺伝子型頻度データを基に、前述の方法によってポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型を決定し、これらを比較することにより、同様にリスク予測を行えばよい。尚、サンプル中の核酸分子に含まれる一塩基多型の遺伝子型の決定には、リスクアレルの特定は必ずしも必要でないことから、遺伝子型の決定は、サンプル中の核酸分子に当該一塩基多型のリスクアレルが少なくとも１つ存在するか否かを判定する前後のいずれにも行うことができ、該決定された遺伝子型と、リスクアレルに基づいて決定されたポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型との比較を行って、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測を行うことができる。
　核酸分子を含むサンプル中にこれらのアレルの存在を検出するには、如何なる方法でも用いうるが、前述のそれぞれのアレルに特異的なプローブを用いてハイブリダイズし、そのシグナルを検出することによりそれぞれのアレルを検出することができる。検出されたアレルと本発明で開示された当該一塩基多型におけるリスクアレルを比較することにより、サンプル中の核酸分子に当該一塩基多型におけるリスクアレルが存在するか否かを決定できる。例えば、前述の本発明の核酸分子及び／又は前述の本発明のプローブは、本発明のポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の検出方法及びポリープ状脈絡膜血管症のリスク予測方法におけるリスクアレル又はポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型の決定に好適に用いることができる。
　また、対立する各々のアレル、即ち、ある一塩基多型に含まれるリスクアレル及び非リスクアレル、に対応するプローブにそれぞれ異なる標識を施し、又は、対立する各々のアレルを固層化したマイクロアレイなどの固層化プローブを用いることにより、同一サンプルに含まれる対立する各々のアレルを検出することができる。このような構成では、サンプルのアレルのみならず遺伝子型を決定することも可能である。また、対立する各々のアレルを同一担体上に固層化したマイクロアレイなどの固層化プローブを用いる場合には、同一操作でハイブリダイズを行い、同一操作で検出する構成とすることもできる。
　本発明の一塩基多型を検出する方法としては、上述の方法以外に公知のいかなる方法も用いられるが、例えば、次のようなものが利用可能である。プローブを用いてハイブリダイズする方法の例としてはＴａｑＭａｎ(登録商標)法、インベーダー(Invader (登録商標))法などがあり、これらのいずれも用い得る。同一のアレルを検出するためのプローブであっても、検出に用いる方法によってより好ましいプローブが異なる場合がある。本発明の一塩基多型のアレル又は遺伝子型の判定は検出方法に依存しないが、検出方法に応じて適するプローブを使用することが望ましい。また、プローブによるハイブリダイズを行わない方法としては、直接塩基配列を決定するダイレクトシークエンス法などが挙げられる。
　なお、前述のように、本明細書において「アレル特異的」又は「アレルに特異的」とは、当該多型部位を含む核酸分子又は塩基配列において当該アレルを含むこと、又は、ある核酸分子が当該多型部位において、当該アレルを含む配列を有する核酸分子にストリンジェントな条件下で特異的に、即ち、当該アレルと対立するアレルを識別可能なようにハイブリダイズすることが可能であることを言う。
　このようにしてサンプルの分析を行い、サンプル中にリスクアレル又はポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型が存在する場合、当該サンプルを提供した者はポリープ状脈絡膜血管症のリスクが高いと予測され、当該サンプルを提供したポリープ状脈絡膜血管症が疑われる者はポリープ状脈絡膜血管症と診断されるべき蓋然性が高い。ポリープ状脈絡膜血管症のリスクの大小はオッズ比の大小を用いて予測することができる。
　さらに、一つのサンプルを用いて、本発明のポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の、リスクアレル又は遺伝子型の二つ以上を検出することにより、将来的なポリープ状脈絡膜血管症のリスクの判定の精度を向上することもできる。この場合、サンプル中に検出されるリスクアレルもしくはポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型の数又はこれらのオッズ比の大小を指標にリスクの大小を予測することができる。当該リスクアレルもしくはポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型の数又はこれらのオッズ比が大であるほど、あるいは、これらの数値がある閾値を超えた場合にリスクがより高いと判定することができる。
　前述のように、本発明のポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の検出方法及びポリープ状脈絡膜血管症のリスク予測方法には、サンプル中の核酸分子に後述の表１～１０に記載されたいずれかの一塩基多型のアレル及び／又は遺伝子型の決定を行うこと、当該サンプル中の一塩基多型のアレル及び／又は遺伝子型と本発明で開示された当該一塩基多型のリスクアレル及び／又は本発明で開示されたポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型の比較を行うこと、の少なくとも１つを含むものであれば全て含まれる。
　本発明のポリープ状脈絡膜血管症のリスク予測方法は、
サンプル中の核酸分子に表１～１０に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型のアレル及び／又は遺伝子型を決定すること、当該サンプル中の一塩基多型のアレル及び／又は遺伝子型と、本発明で開示された当該一塩基多型のリスクアレル及び／又は本発明で開示されたポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型の比較を行うこと、の少なくとも１つを含むものであり、
好ましくは本発明のポリープ状脈絡膜血管症のリスク予測方法はサンプル中の核酸分子に表１又は表２に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型のアレル及び／又は遺伝子型を決定すること、当該サンプル中の一塩基多型のアレル及び／又は遺伝子型と本発明で開示された当該一塩基多型のリスクアレル及び／又は本発明で開示されたポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型の比較を行うこと、の少なくとも１つを含むものであり、
より好ましくは本発明のポリープ状脈絡膜血管症のリスク予測方法はサンプル中の核酸分子に表１に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型のアレル及び／又は遺伝子型を決定すること、当該サンプル中の一塩基多型のアレル及び／又は遺伝子型と本発明で開示された当該一塩基多型のリスクアレル及び／又は本発明で開示されたポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型の比較を行うこと、の少なくとも１つを含むものである。
　本発明のポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の検出方法及びポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測方法において、検出に用いられる一塩基多型は、
好ましくは、配列番号1～70で示される塩基配列からなる群(それぞれ、奇数番目と偶数番目の塩基配列の組で１つの一塩基多型に対応する)より選択される少なくとも１つの塩基配列又はその相補的配列において、各塩基配列の17番目に存在する一塩基多型であり、
より好ましくは、配列番号1～12及び配列番号69～70で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列又はその相補的配列において、各塩基配列の17番目に存在する一塩基多型であり、
さらに好ましくは、以下の、a～gの一塩基多型を含む塩基配列の組からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列又はその相補的配列において、各塩基配列の17番目に存在する一塩基多型である。(ここで、前述のように、a～gで示される配列番号の組において、それぞれの塩基配列の組は１つの一塩基多型の互いに対立するアレルを17番目の塩基に含む塩基配列である)
ａ：　配列番号１及び／又は配列番号２、
ｂ：　配列番号３及び／又は配列番号４、
ｃ：　配列番号５及び／又は配列番号６、
ｄ：　配列番号７及び／又は配列番号８、
ｅ：　配列番号９及び／又は配列番号１０
ｆ：　配列番号１１及び／又は配列番号１２、ならびに、
ｇ：　配列番号６９及び／又は配列番号７０
　上記のいずれかの一塩基多型を用いる場合、中でも、それぞれの一塩基多型を含む配列の組のうち、奇数番目の配列番号で示される配列又はその相補的配列において、各塩基配列の17番目に存在する一塩基多型のアレルを用いることが好ましい。なお、これらはそれぞれの多型部位において、リスクアレルを含む塩基配列である。
　サンプル中のこれらの一塩基多型の検出を行うに当たり、上記いずれか１つの一塩基多型に加えて、該一塩基多型以外に、さらに表１～１０に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型のアレル又は遺伝子型を決定することを組み合わせることにより疾患判定の精度を向上させることができる。組み合わせに用いる一塩基多型は、好ましくは表１又は表２に記載された一塩基多型であり、より好ましくは表１に記載された一塩基多型である。
(ポリープ状脈絡膜血管症に関連するアレルを検出するためのキット)
　本発明の別の態様では、ポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型を検出するためのキットが提供される。
　本発明のキットには、サンプル中の核酸分子に後述の表１～１０に記載されたいずれかの一塩基多型のリスクアレルを検出することができるものであれば全て含まれる。好ましくは、本発明のキットは、表１又は表２に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型のリスクアレル及び／又は非リスクアレルの検出が可能なキットであり、より好ましくは表１に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型のリスクアレル及び／又は非リスクアレルの検出が可能なキットである。１つの一塩基多型に含まれるリスクアレル及び非リスクアレルの両方を検出可能なキットを用いることにより当該一塩基多型の遺伝子型を決定することができる。
　本発明のキットにおいて、上記いずれか１つの一塩基多型に加えて、該一塩基多型以外に、さらに表１～１０に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型のリスクアレル及び／又は非リスクアレルの検出あるいは遺伝子型の決定が可能なキットも本発明の態様の一つである。複数の一塩基多型のアレル又は遺伝子型の決定を行うキットの場合、上記いずれか１つの一塩基多型に加えて、好ましくはさらに表１又は表２に記載された一塩基多型のリスクアレル及び／又は非リスクアレルの検出あるいは遺伝子型の決定が可能なキットであり、より好ましくはさらに表１に記載された一塩基多型のリスクアレル及び／又は非リスクアレルの検出あるいは遺伝子型の決定が可能なキットである。
　これらの表１～１０の少なくとも１つの一塩基多型のリスクアレル及び／又は非リスクアレルの検出あるいは遺伝子型の決定が可能なキットのうち、好ましい態様の一つに、前記一塩基多型のリスクアレルの検出が可能なキットが挙げられる。
　プローブの項で説明したように、本発明のキットは一塩基多型のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれの塩基を検出するものであっても良く、これらの両者を検出するものであっても良い。一塩基多型の検出方法にも制限はなく、例えばプローブの項で例示した検出方法が用いられる。
　前述の本発明の核酸分子及び／又は前述の本発明のプローブを用いてポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型を検出するためのキットは、本発明に含まれる。即ち、本発明のキットは、ポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型のアレル又は遺伝子型の決定が可能なように、本発明の核酸分子及び／又は本発明のプローブを含有するものである。
　前述のリスクアレルと、非リスクアレルの両方を検出するキットも本発明の好ましい実施態様の一つである。このようなキットを用い、既に説明したように各アレルの遺伝子型を決定することも可能である。
　本発明のキットを用いて、サンプル中にリスクアレル又はポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型が存在することを検出することにより、非ＰＣＶ患者の将来的なポリープ状脈絡膜血管症のリスクを予測し又はポリープ状脈絡膜血管症の疑いがある者のポリープ状脈絡膜血管症の診断又は診断の補助を行うことができる。
　また、前述のように、対立するアレルにそれぞれ特異的なプローブを用い、かつ、プローブの標識を異なるものとすることにより、又は、前述の固層化プローブ(マイクロアレイ)の形態とすることにより、対立するアレルを同一操作で測定するキットとすることもできる。
　一つのサンプルを用いてこれらのアレル又は遺伝子座の複数を検出する構成のキットとすることにより、将来的なポリープ状脈絡膜血管症のリスク予測や診断の精度を向上させることもできる。このような構成においても、異なる標識を施したプローブや前述のマイクロアレイの形態とすることにより、検出を同一操作で行う構成とすることもできる。
　本発明のポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の検出方法及びポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測方法において、検出又はリスク予測に用いられるキットは、
配列番号1～70で示される塩基配列からなる群(それぞれ、奇数番目と偶数番目の塩基配列の組で１つの一塩基多型に対応する)より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列からなる塩基配列において、前記配列番号1～70で示される各塩基配列の17番目に相当する一塩基多型のアレル又は遺伝子型の決定が可能なキットであり、
好ましくは、配列番号1～12及び配列番号69～70で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列からなる塩基配列において、前記配列番号1～12又は配列番号69～70で示される各塩基配列の17番目に相当する一塩基多型のアレル又は遺伝子型の決定が可能なキットであり、
より好ましくは、以下の、a～gの一塩基多型を含む塩基配列の組からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列からなる塩基配列において、前記a～gの組に含まれる各塩基配列の17番目に相当する一塩基多型のアレル又は遺伝子型の決定が可能なキットである。(ここで、前述のように、a～gで示される配列番号の組において、それぞれの塩基配列の組は１つの一塩基多型の互いに対立するアレルを17番目の塩基に含む塩基配列である)
ａ：　配列番号１及び／又は配列番号２、
ｂ：　配列番号３及び／又は配列番号４、
ｃ：　配列番号５及び／又は配列番号６、
ｄ：　配列番号７及び／又は配列番号８、
ｅ：　配列番号９及び／又は配列番号１０
ｆ：　配列番号１１及び／又は配列番号１２、ならびに、
ｇ：　配列番号６９及び／又は配列番号７０
　上記のいずれかの一塩基多型のアレル又は遺伝子型の決定が可能なキットにおいて、中でも、それぞれの一塩基多型を含む配列の組のうち、奇数番目の配列番号で示される配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列からなる塩基配列において、前記a～gの組に含まれる各塩基配列の17番目に相当する一塩基多型のアレルの決定が可能なキットであることが好ましい。なお、これらはそれぞれの多型部位において、リスクアレルを含む塩基配列である。
(好ましい人種)
　本発明で用いられるポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型は、当該多型を有する限りいかなる人種においても用いられるが、好ましい人種はモンゴロイドであり、より好ましくは東アジア人であり、さらに好ましくは日本人又は日本人を祖先にもつ人である。
　本発明により、本発明で開示されたリスクアレル又はポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型をゲノム上に持つ者は、将来的にポリープ状脈絡膜血管症を発症する危険性が高く、リスクアレル又はポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型を持たない者は、将来的にポリープ状脈絡膜血管症を発症する危険性が低いと判定することが出来る。
　また、本発明で開示されたリスクアレル又はポリープ状脈絡膜血管症のリスクあると考えられる遺伝子型をゲノム上に持つ、初期のポリープ状脈絡膜血管症の疑いがある者は、検出が困難な初期のポリープ状脈絡膜血管症を発症している恐れがあるため、本発明の一塩基多型の検出を行うことにより、ポリープ状脈絡膜血管症の診断又は診断の補助に用いることができる。
　以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、実施例は本発明をより良く理解するために例示するものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されることを意図するものではない。なお、以下の実施例では、特に詳細な説明がない一般的な分子生物学的手法については、モレキュラークローニング (Joseph Sambrook et al., Molexular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)などの成書に記載された方法及び条件が用いられ、試薬としては分子生物学グレードのものが用いられる。
　本発明では、ポリープ状脈絡膜血管症と診断された患者、緑内障であると診断された患者、及び、白内障と診断された患者それぞれの血液から総DNAを抽出し、ヒトゲノム上の公知の一塩基多型約50万個を指標として疾患に関連する遺伝子座を解析し、ポリープ状脈絡膜血管症に特異的に関連すると考えられる一塩基多型の検討を行った。
実施例１　検体からのDNAの抽出
　検体からのDNAの抽出は、フェノール抽出法(Methods in Enzymology、152巻、181ページ、1987年)に準じて実施した。クエン酸を加えた血液サンプルにアンモニウム塩及びEDTAを含む低張な溶血バッファーを十分量加えて白血球を精製した。数回の洗浄の後、Proteinase KとSDSを含む溶解バッファーで細胞を溶解させた。懸濁されていた細胞が溶解して透明になったのを確認した後、フェノールを加え、室温で1～3時間振盪した。フェノール層を廃棄し、水層のみを遠心分離してさらに不純物を分離した。水層をTE緩衝液(10mM Tris pH8.0、0.1mM EDTA, Teknova)で透析した後にエタノール沈殿法にてDNAを回収し、TE緩衝液に溶解した。このようにして得たゲノムDNA溶液20μLに7.5M NH4OAc 10μL、20mg/mL Glycogen 0.5μLと100％ 氷冷エタノール50μLを加え-20℃で1時間静置した。12,000×gで20分遠心後、上清を除いた。80％氷冷エタノール 500μLを加え12,000xgで5分遠心後、上清を除き沈殿を乾燥させた。沈殿をTE緩衝液に溶かし、濃度が50ng/μLになるよう調整した。尚、DNA濃度は分光光度計 (Biophotometer, Eppendorf)を用い、260nmの吸光度により測定した。また、一部のサンプルについては、自動核酸抽出装置(Magtration System 8Lx、プレシジョン・システム・サイエンス株式会社) を用い、装置の説明書に従ってDNAを抽出した。
実施例２　一塩基多型の分析
　一塩基多型の分析は、ヒトゲノム上の公知の一塩基多型約50万個の分析が可能な市販のマイクロアレイ型の一塩基多型分析キット(アフィメトリックス社、ジーンチップ　ヒューマンマッピング 250K Nsp/Sty アレイ(GeneChip(登録商標) Human Mapping 250K Nsp/ Sty Array)(以下、マイクロアレイと記載)を使用した。
　実施例１にて抽出した総DNA(ゲノムDNA)をキット及び機器の説明書に従って処理し、マイクロアレイ上に適用して検体から抽出したDNAに存在する一塩基多型を解析する。具体的には、以下の操作を行う。
(制限酵素処理)
　250ngずつのゲノムDNAを以下の手順によりそれぞれSty I(New England Biolabs)又はNsp I(New England Biolabs)制限酵素で切断する。即ち、ゲノムDNA溶液5μLに、市販の分子生物学グレードの超純水 (AccuGENE(登録商標) molecular biology-grade water, Cambrex)11.5μL、それぞれの制限酵素に添付された緩衝液 2μL、10mg/mL BSA 0.2μL、10U/mL 制限酵素 1μLを加え制限酵素処理を行った。反応は37℃で2時間反応させた後、65℃で20分インキュベートして制限酵素を失活させた。
(アダプター配列の付加)
　制限酵素処理が終了したサンプルに、以下の手順でアダプター配列を付加する。制限酵素処理サンプルに、切断した制限酵素に対応する50μM のAdaptor Nsp I又はAdaptor Sty I (New England Biolabs) 0.75μL、T4 DNA ligase緩衝液 (New England Biolabs) 2.5μLとT4 DNA ligase (New England Biolabs) 2μLを加え、16℃で3時間反応させてアダプター配列を付加させた後に、70℃で20分反応させてT4 DNA ligaseを失活させた。アダプター付加終了したサンプルには、冷却したAccuGENE water 75μLを加え希釈した。
(遺伝子断片の増幅と精製)
　以下の手順により、アダプター配列を付加した遺伝子をTITANIUMTM(登録商標) DNA Amplification kit (Clontech )を用いてPCR法で増幅する。即ち、希釈したサンプル5μLにAccuGENE water 39.5μL、TITANIUMTM(登録商標) taq PCR buffer 10μL、5M GC-Melt (Clonetech) 20μL、2.5mM dNTP(タカラバイオ) 4.5μL、100μM PCR primer002 (Affymetrix, GeneChip(登録商標) Mapping 250K Nsp/ Sty Assay Kitに含まれる) 4.5μL及びTITANIUMTM(登録商標) taq DNA polymerase 2μLを加えて反応させた。反応温度と時間は次の通りである。まず、94℃で3分放置後、94℃30秒→60℃30秒→68℃15秒を１サイクルとして30サイクル反応させ、68℃で7分放置した。これを１連の反応操作として、１つのサンプルにつき同じPCR反応操作を3回行った。PCR産物は2％アガロースゲル電気泳動を行い、200bpから1000bpの遺伝子断片が増幅されていることを確認した。3回分のPCR産物をひとつにまとめ、DNA amplification Clean-Up kit (Clontech)を用い精製した。精製したPCR産物は45μL RB buffer(Clontech)に溶かし回収した。尚、PCR反応のプライマーとして用いたPCR primer002の配列は以下の通りである；5'-attatgagcacgacagacgcctgatct-3'(配列番号７１)。
(増幅遺伝子の断片化)
　GeneChip(登録商標) Mapping 250K Nsp / Sty Assay Kit (Affymetrix)試薬を用いて以下の手順により増幅遺伝子を断片化する。即ち、精製したPCR産物の260nmにおける吸光度を分光光度計 (Biophotometer、Eppendorf)を用いて測定し、90μgのPCR産物を総容量45μLになるようにRB buffer(Clontech)で希釈した。希釈したサンプルにキットに含まれるfragmentation buffer 5μL及び0.05U/μL Fragmentation Reagent 5μLを加え、37℃で35分反応させた後に95℃で15分放置してFragmentation Reagentを失活させた。尚、Fragmentation Reagentは10×fragmentation bufferとAccuGENE waterによって、最終濃度が0.05U/μL Fragmentation Reagent、1×fragmentation bufferとなるよう希釈して用いた。断片化産物は4％アガロースゲル電気泳動を行い、遺伝子が断片化されていることを確認した。
(断片化遺伝子へのビオチンラベルの付加)
　断片化した遺伝子にGeneChip(登録商標) Mapping 250K Assay Kit (Affymetrix)を用いて以下の手順によりビオチンラベルを付加する。断片化サンプル50.5μLにキットに含まれるTerminal Deoxynucleotidyl Transferase buffer 14μL、30mM GeneChip DNA Labeling Reagent 2μL及び30U/μL Terminal Deoxynucleotidyl Transferase enzyme 3.5μLを加え、37℃で4時間反応させた後に、95℃で15分放置して酵素を失活させ、ハイブリダイゼーション用のサンプルとした。
(ハイブリダイゼーション)
　ビオチンラベルを付加したサンプル70μLにhybridization cocktail master mix (組成は以下の通り；0.056M 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid、5％ DMSO、2.5×Denhard'ts solution(Sigma)、5.77mM EDTA pH8.0、0.115mg/mL Herring Sperm DNA(Promega)、1×Oligo Control Reagent 0100(Affymetrix)、11.5μg/mL Human Cot-1 DNA(Invitrogen)、0.0115％ Tween-20、2.69M Tetrametyl Ammonium Chloride(Sigma))190μLを加え、95℃で10分変性後、49℃で保持した。GeneChip(登録商標) Human Mapping 250K Nsp/ Sty Array (以下、マイクロアレイともいう) に200μLのサンプルを適用し、温度49℃、回転数60r/minに設定されたハイブリオーブン (GeneChip Hybridization Oven 640, Affymetrix) で16時間から18時間ハイブリダイズさせた。サンプルをマイクロアレイから取り出し、Array Holding Buffer(1mM MES、1M NaCl、0.01％ Tween-20)をマイクロアレイ内部に充填させた。
(染色及び検出)
　ハイブリダイゼーションが終了したマイクロアレイの染色をAffymetrix社のGeneChip(登録商標) Operating Software 1.4(以下GCOS)、protocol: MAP500Kv1_450により、同社のGeneChip Fluidics Station 450を用いて行った。一次及び三次染色はそれぞれStain Bufferで調製した10μg/mL Streptavidin-Phycoerythrin(Invitrogen)、二次染色は5μg/mL biotinylated Anti-Streptavidin Antibody(Vector Lab.)で行った。検出はGCOSを用いてGeneChip(登録商標) Scanner 3000 7Gで行った。尚、具体的な染色・洗浄工程のプロトコールと洗浄液等の組成は以下の通りである。
〔染色・洗浄工程プロトコール(FS-450 Fluidics Protocol - Mapping 500Kv1_450)〕
- Post Hyb Wash #1:  6 cycles of 5 mixes/cycle with Wash Buffer A at 25℃
- Post Hyb Wash #2:  24 cycles of 5 mixes/cycle with Wash Buffer B at 45℃
- Stain:  Stain the probe array for 10 minutes in SAPE solution at 25℃
- Post Stain:  Wash 6 cycles of 5 mixes/cycle with Wash Buffer A at 25℃
- 2nd Stain:  Stain the probe array for 10 minutes in Antibody Stain Solution at 25℃
- 3rd Stain:  Stain the probe array for 10 minutes in SAPE solution at 25℃
- Final Wash:  10 cycles of 6 mixes/cycle with Wash Buffer A at 30℃
The final holding temperature is 25℃
〔溶液の組成〕
・Wash A: Non-Stringent Wash Buffer　(6X SSPE, 0.01％ Tween 20)
For 1000 mL:
　300 mL of 20X SSPE, 1.0 mL of 10％ Tween-20, 699 mL of water
　Filter through a 0.2 μm filter. Store at room temperature.
・Wash B: Stringent Wash Buffer (0.6X SSPE, 0.01％ Tween 20)
For 1000 mL:
　30 mL of 20X SSPE, 1.0 mL of 10％ Tween-20, 969 mL of water
　Filter through a 0.2 μm filter. Store at room temperature.
　The pH should be 8.
・Stain Buffer: (6X SSPE, 0.01％ Tween 20, 1X Denhardt’s solution)
For 1188 μL:
　360 μL of 20X SSPE, 3.6 μL of 3％ Tween-20, 24 μL 50X Denhardt’s solution, 800.04 μL of water
(Genotyping解析)
　Affymetrix社のAffymerix Power Tools ver.1.10.0を用いてSNP Genotyping解析を行った。解析には同梱されているBRLMM genotype calling algorithmを用いた。
実施例３　常染色体上のＰＣＶ患者と非ＰＣＶ患者の一塩基多型の対比
　疾患関連一塩基多型の比較は、クラインらの方法(Science 308巻、385ページ、2005年)に準じて以下のように行った。
(試験群の設定)
　ＰＣＶ患者として、以下の基準を充足する患者を設定した。即ち、少なくとも片眼に、眼底検査で明らかな橙赤色隆起病巣が確認され、インドシアニングリーン蛍光眼底造影検査で、特徴的なポリープ様脈絡膜病巣が確認される日本人の症例100例をＰＣＶ患者群に設定した。一方、緑内障と診断された患者、すなわち、眼底検査にて視神経乳頭に緑内障に特徴的な所見(視神経乳頭陥凹の拡大など)や網膜神経線維層欠損が認められ、視野検査によりその眼底所見に一致した視野異常が認められた原発開放隅角緑内障患者100例を緑内障患者群に設定した。また、白内障と診断された患者であって、白内障及び屈折異常以外の眼疾患を認めない患者100例を白内障患者群とした。
(一塩基多型の分析)
　参加者の自由意志で得た同意の下に提供された血液を検体とし、実施例１に記載の方法で総DNAを抽出し、実施例２に記載の方法で一塩基多型の分析を行った。統計解析言語　R ver.2.7.0を用いて、以下に述べる解析を行った。即ち、コールレートが90％未満の一塩基多型、マイナーアレル頻度が5％未満の一塩基多型、及び、有意水準0.0001でハーディー・ワインバーグ平衡が成立していないと判定される一塩基多型をいずれも棄却し、さらに、目視によって正しくコールされていることを確認することにより、実験的な信頼性が高いと考えられる一塩基多型を選択した。なお、ハーディー・ワインバーグ平衡の成立の検定はカイ二乗検定を用いて行った。
(ポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の一次解析)
　このようにして選択された一塩基多型について、ポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の候補を抽出するため、(１)ＰＣＶ患者群対緑内障患者群、(２)ＰＣＶ患者群対白内障患者群の２通りの比較解析を行った。ポリープ状脈絡膜血管症に特異的に関連する一塩基多型の候補を抽出するために、(１)及び(２)で共通して、３種の遺伝子型(一方のアレルのホモ、ヘテロ、他方のアレルのホモ)ごとに比較した際のｐ値の最小値が0.01を下回る一塩基多型370個を抽出し、これらをポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の候補とした。尚、遺伝子型のｐ値の算出にはFisherの正確確率検定を用いた。ここで、選択された370個の疾患関連一塩基多型の候補の妥当性を確認するため、該370個の解析対象SNPに対するFalse discovery rateをBenjaminiとHochbergの方法(Benjamini Y, Hochberg T： J. Royal Stat Soc B85 pp289-300, 1995) にて計算した。候補とされた370個の一塩基多型はいずれもFalse discovery rate が5％を下回る範囲に含まれていた。すなわち、これらの一塩基多型はいずれも疾患に関連する蓋然性が極めて高いと考えられる。
(ポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の二次解析)
　このように選択されたポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の候補について、さらに詳細に解析を行った。即ち、緑内障患者群に採用された患者及び白内障患者群に採用された患者をまとめて対照群とし、以下の通りＰＣＶ患者群と対照群の比較解析を行った。
(アレルのオッズ比)
　リスクアレルの有無とポリープ状脈絡膜血管症の有無の間にどの程度強い関連が存在するかの指標として、アレルのオッズ比を以下の式によって求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　ここで、リスクアレルは、当該一塩基多型を構成する２つのアレルの検出数を上記数式に代入してアレルのオッズ比を求める際に、当該オッズ比が１より大になるように設定した。尚、一方のアレルと他方のアレルを入れ替えて計算するとオッズ比は互いに逆数の関係となる、即ち、一方のオッズ比が１より小であれば他方のオッズ比は１より大であることは前記定義式より明らかである。
(遺伝子型ｐ値の算出)
　各SNPの遺伝子型ｐ値の算出は、ＰＣＶ患者群対対照群について、Fisherの正確確率検定を用いて行った。その際、genotypeモデル(リスクアレルホモ型対ヘテロ型対非リスクアレルホモ型)、dominantモデル (リスクアレルホモ型＋ヘテロ型対非リスクアレルホモ型)、recessiveモデル(リスクアレルホモ型対非リスクアレルホモ型＋ヘテロ型)の3種類の統計モデルについてｐ値の算出を行い、最も低いｐ値となるものを当該一塩基多型を代表するｐ値とした。
　以上のように解析を行い、ｐ値が0.01を下回る一塩基多型363個をポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型として選択した。さらに、ボンフェローニ補正、即ち、全体の有意水準を0.05とし、繰り返し回数370回で有意水準0.05を除して得た補正有意水準(1.35×10-4)以下のｐ値(前記一塩基多型を代表するｐ値)で遺伝子型がポリープ状脈絡膜血管症との関連を示す一塩基多型を抽出した。
(遺伝子型のオッズ比)
　さらに、これらの一塩基多型について、前述のように決定されたリスクアレルに基づき、以下の式によりdominant型オッズ比及びrecessive型オッズ比を求めた。ここで、ある一塩基多型について、いずれかの遺伝子型頻度が0であり、よっていずれかのオッズ比が無限大になってしまう場合には、当該遺伝子型頻度を0.5とおいて近似計算を行った。前述のように、本発明において、dominant型オッズ比は、リスクアレルを少なくとも１つ持つ場合(即ち、リスクアレルホモ型又はヘテロ型である場合)にポリープ状脈絡膜血管症であることのオッズ比であり、recessive型オッズ比はリスクアレルをホモに持つ場合にポリープ状脈絡膜血管症であることのオッズ比である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
(結果)
　このようにして得たポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型のうち、表１にはｐ値がより低い一塩基多型、すなわち、p＜1.0×10-5となる一塩基多型について、表２には1.0×10-5≦p≦1.35×10-4の一塩基多型について、それぞれSNP ID、一塩基多型が存在する染色体番号及び物理的位置、当該一塩基多型が所属する遺伝子又は当該一塩基多型の近傍に存在する遺伝子名、相対位置(当該一塩基多型が前記遺伝子名で表示された遺伝子のイントロン上に存在する場合はその旨を示し、一塩基多型が前記遺伝子のイントロン上に存在しない場合は当該遺伝子と当該一塩基多型の間の距離を示す)、リスクアレルの塩基、非リスクアレルの塩基、遺伝子型のｐ値を算出するのに用いた統計モデル、遺伝子型のｐ値、アレルのオッズ比、ならびに、リスクアレルとその前後各16塩基ずつからなる33塩基長の配列に対応する配列番号(リスクアレルを含む配列)及び、非リスクアレルとその前後各16塩基ずつからなる33塩基長の配列に対応する配列番号(非リスクアレルを含む配列)を記載する。尚、SNP IDにはdbSNPデータベースのIDを記載した。これらの情報のうち染色体番号及び物理的位置、遺伝子名と相対位置、各アレルを含む配列情報はアフィメトリックス社が提供する技術資料ならびにNCBI SNP及びNCBI Nucleotideなどの公共データベースからdbSNP ID等をキーとして抽出した。また、ｐ値欄において、それぞれのｐ値は10を底とする指数形式で表示される。ここで、符号Eの前後に記載された数値はそれぞれｐ値を指数形式で表示した際の仮数部と指数部を示す(以下、実施例中の表について同じ)。
　またさらに、1.35×10-4＜p＜1.0×10-2である一塩基多型を表３～１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表１～１０に記載された一塩基多型363個は、いずれも一次解析において選択された370個の一塩基多型(即ち、全て当該370個の一塩基多型について計算されたFDRが5％を下回る範囲に含まれる)を母集団として、さらに二次解析によって好ましい一塩基多型を選択したものであることから、充分な信頼性を持って本発明に供することが可能である。
　さらに、これらの一塩基多型について、ＰＣＶ患者群及び対照群それぞれについて、表１１～１９にリスクアレル頻度、非リスクアレル頻度、リスクアレルホモ型頻度、ヘテロ型頻度、非リスクアレルホモ型頻度を記載する。また、表２０～２８に、それぞれの一塩基多型の遺伝子型オッズ比、関連する遺伝子型オッズ比、及び、リスクとなる遺伝子型を記載する。ここで、遺伝子型オッズ比は、当該一塩基多型について求めたdominant型オッズ比及びrecessive型オッズ比のうち、その値が大であるもの(すなわち、当該一塩基多型に関連する遺伝子型のオッズ比)の値を記載し、関連するオッズ比は、前記一塩基多型に関連する遺伝子型のオッズ比がdominant型オッズ比であるか、recessive型オッズ比であるかを示す。
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実施例４　滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型とポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の比較
　加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の存在が報告されている遺伝子座に存在する一塩基多型の一部について、滲出型加齢黄斑変性とポリープ状脈絡膜血管症それぞれの疾患と関連するか否かの対比を行った。滲出型加齢黄斑変性患者の病期分類はセドンらの報告(Ophthalmology 113巻、260ページ、2006年)に準じて行った。少なくとも左右いずれか１眼がセドンの病期分類法でgrade 5b、即ち、脈絡膜の血管新生又は瘢痕形成を伴う滲出型加齢黄斑変性と診断され、かつ、ポリープ状脈絡膜血管症でない日本人患者100例を滲出型加齢黄斑変性患者群(以下、ｗＡＭＤ患者群)に採用した。参加者の自由意志で得た同意の下にｗＡＭＤ患者群の100例から提供された血液より実施例１に準じてＤＮＡを抽出し、実施例２に従って一塩基多型の分析を行った。対照群には緑内障患者及び白内障患者190例を設定した。
　p値の算出は、加齢黄斑変性患者群対対照群について、Fisherの正確確率検定及びコクラン・アーミテージ検定(Cochran-Armitage trend test)を用いて行った。Ficherの正確確率検定においては、genotypeモデル(リスクアレルホモ型対ヘテロ型対非リスクアレルホモ型)、dominantモデル(リスクアレルホモ型＋ヘテロ型対非リスクアレルホモ型)、recessiveモデル(リスクアレルホモ型対非リスクアレルホモ型＋ヘテロ型)の3種類の統計モデルについてｐ値の算出を行った。これら4個のp値(すなわち、Fishcerの正確確率検定によるもの3個、trend testによるもの1個)のうちの最小値を当該一塩基多型のp値とした。一方、ＰＣＶ患者については、実施例３と同じ患者群を用い、滲出型加齢黄斑変性の解析で用いたのと同じ190例の対照群に対して滲出型加齢黄斑変性の場合と同様に解析を行った。また、オッズ比は実施例３と同様に計算した。
(結果)
　C3遺伝子座上にある一塩基多型rs2241394は、本検討におけるBenjaminiとHochbergの方法により、ポリープ状脈絡膜血管症との関連が有意(FDR<0.05)であった。一方、当該一塩基多型は滲出型加齢黄斑変性との関連を示さなかった。当該一塩基多型のポリープ状脈絡膜血管症における検討結果を表２９～３１に記載する。表２９には、SNP ID (dbSNP ID)、一塩基多型が存在する染色体番号及び物理的位置、当該一塩基多型が所属する遺伝子又は当該一塩基多型の近傍に存在する遺伝子名、相対位置(当該一塩基多型が前記遺伝子名で表示された遺伝子のイントロン上に存在する場合はその旨を示し、一塩基多型が前記遺伝子のイントロン上に存在しない場合は当該遺伝子と当該一塩基多型の間の距離を示す)、リスクアレルの塩基、非リスクアレルの塩基、遺伝子型のｐ値を算出するのに用いた統計モデル、遺伝子型のｐ値、アレルのオッズ比、Dominant型オッズ比、Recessive型オッズ比、ならびに、リスクアレルとその前後各16塩基ずつからなる33塩基長の配列に対応する配列番号(リスクアレルを含む配列)及び、非リスクアレルとその前後各16塩基ずつからなる33塩基長の配列に対応する配列番号(非リスクアレルを含む配列)を記載する。また、表３０に、当該一塩基多型のリスクアレル頻度、非リスクアレル頻度、リスクアレルホモ型頻度、ヘテロ型頻度、非リスクアレルホモ型頻度を記載する。さらに、表３１に、当該一塩基多型の遺伝子型オッズ比、関連する遺伝子型オッズ比、及び、リスクとなる遺伝子型を記載する。ここで、遺伝子型オッズ比は、当該一塩基多型について求めたDominant型オッズ比及びRecessive型オッズ比のうちその値が大であるものの値を記載し、関連するオッズ比は、当該一塩基多型に関連する遺伝子型のオッズ比がDominant型オッズ比であるか、Recessive型オッズ比であるかを示す。
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実施例５　ＬＤブロック構造の推定及びタグSNPの抽出
　以下のようにして本発明の一塩基多型が属するＬＤブロック構造を推定することができる。
　HapMapプロジェクトによって決定された一塩基多型のジェノタイピングデータを用いて、実施例３又は実施例４にて決定したポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型を含むＬＤブロックを推定する。このＬＤブロック内に存在することが明らかになっている一塩基多型について、例えば、R2＜0.8、MAF＜0.2を棄却するpairwise tagging法による絞込みをおこない、このＬＤブロックを代表する一塩基多型、すなわちタグSNPを抽出する。なお、R2とは、連鎖不平衡の尺度の一つである。2つの一塩基多型S1及びS2がそれぞれ2つのアレル(1,2)で構成される場合を想定すると、取り得るハプロタイプは4通り存在する。4通りのハプロタイプのそれぞれの頻度を(h11, h12, h21, h22)とするとき (1番目の添字がS1のアレルを、2番目の添字がS2のアレルを示す)、R2は以下の式にて定義される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000035
実施例６　ＬＤブロック上の一塩基多型の再解析
　実施例５で推定したタグSNP及び当該タグSNPを含むＬＤブロックに所属する任意の一塩基多型について、以下のように再解析を行うことができる。本実施例ではTaqMan(登録商標) SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems) を用いる再解析法を例示する。
　患者群及び対照群は、実施例３又は実施例４の患者群及び対照群と同じであっても全く異なるものであっても良い。これらの参加者より提供された血液を検体とし、例えば実施例１に記載の方法で総DNAを抽出し、Applied Biosystems社のプロトコールに従って上記ＬＤブロックに含まれる一塩基多型について、患者群と対照群の比較解析を行う。リアルタイムPCR反応の試薬、サーマルサイクラー及び検出器はそれぞれApplied Biosystems社によって指定されたものを用いることができる。サーマルサイクラー及び検出器に、StepOne Plus リアルタイムPCRシステムを用いる場合、PCR産物中の一塩基多型のアレルの検出には、StepOne Software V2.0.1を使用することができる。
　得られた一塩基多型の検出結果を用い、実施例３と同様にアレルのオッズ比を計算してリスクアレルを決定し、遺伝子型ｐ値の算出を行う。
　このようにして当該ＬＤブロック内の任意の一塩基多型について疾患との関連を確認し、リスクアレル及び疾患のリスクとなる遺伝子型を決定することができる。
実施例７　ゲノムDNAを含むサンプルを用いるポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の分析
　本発明で開示されたポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型において、表１～１０又は２９に記載されたアレルの頻度は、ＰＣＶ患者群と対照群の間で統計学的に差がある。ゲノムDNAを含むサンプルに含まれるこれらの一塩基多型の少なくともいずれか一つについて、そのアレルを決定することにより、リスクアレルが存在するか否かを判定できる。サンプル中のゲノムDNAに本発明の一塩基多型の少なくとも１つについてリスクアレルが検出される場合、当該サンプル中にポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型のリスクアレルが含まれると判定される。アレルの代わりに、前述のポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型の決定を行うことも可能である。さらに、一つのサンプルを用いて、本発明のポリープ状脈絡膜血管症に関連する一塩基多型の、疾患において高頻度に認められるアレル又は遺伝子型の二つ以上を検出することも可能である。
実施例８　非ＰＣＶ患者のポリープ状脈絡膜血管症リスクの高精度な判定及びポリープ状脈絡膜血管症が疑われる者の診断補助
　前述の実施例と同様にして、非ＰＣＶ患者によって提供されたゲノムDNAを含むサンプルを用い、サンプル提供者のポリープ状脈絡膜血管症のリスクを精度よく判定することができる。具体的には、本発明で開示された疾患に関連する一塩基多型について、サンプル中にリスクアレル又はポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型の少なくとも１つが検出された場合、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると判定される。疾患に関連する一塩基多型を検出するプローブを複数組み合わせて本発明の一塩基多型の２つ以上を組み合わせて検出することにより、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測精度を向上することができる。この場合、サンプル中に検出されたリスクアレルもしくはポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型の数の和、又は、これらのオッズ比を指標にリスクを予測する。これらの数値の大小により、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクの大小が予測され、又は、ある閾値を超える場合は、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクが高いと判定される。
　さらに、同様に、ポリープ状脈絡膜血管症が疑われる者の診断補助を行うことができる。ポリープ状脈絡膜血管症が疑われる者によって提供されたサンプルを用い、サンプル中にリスクアレル又はポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型の少なくとも１つが検出された場合、ポリープ状脈絡膜血管症と判断されるべき蓋然性が高い。また、疾患に関連する一塩基多型を検出するプローブを複数組み合わせて本発明の一塩基多型の２つ以上を組み合わせて検出することにより、サンプル中に検出されるリスクアレルもしくはポリープ状脈絡膜血管症のリスクがあると考えられる遺伝子型の数の和、又は、これらのオッズ比を指標にポリープ状脈絡膜血管症と判断されるべき蓋然性がどの程度増加するかを評価する。ある閾値を超える場合は、ポリープ状脈絡膜血管症であると診断することができる。
　本発明の方法により、サンプル中の本発明の一塩基多型のアレル又は遺伝子型を分析することにより、サンプル提供者の将来的なポリープ状脈絡膜血管症のリスクの有無及び／又は高低を判定することができる。このリスクに基づきサンプル提供者はポリープ状脈絡膜血管症の予防措置を講じ、及び／又は定期的に眼底の検査、例えば、ＩＣＧ蛍光造影等の検査を受けることによって早期にポリープ状脈絡膜血管症の診断を受け、治療を開始することができる。また、本発明の一塩基多型のリスクアレル又はポリープ状脈絡膜血管症のリスクあると考えられる遺伝子型をゲノムに持つ、ポリープ状脈絡膜血管症が疑われるサンプル提供者は、ポリープ状脈絡膜血管症と診断されるべき蓋然性が高く、早期に治療を開始することができるため、有用である。

Claims (12)

  1. 　被験者由来のサンプル中の核酸分子について、配列番号1～70で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列又はその相補的配列において、前記塩基配列の17番目に存在する一塩基多型のアレルをin vitroで検出する工程(検出工程)、及び
    前記検出されたアレルの少なくとも１つがリスクアレルであるか否かを判定する工程(判定工程)
    を含む、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクを予測する方法。
  2. 　さらに、検出工程において検出されたアレルに基づき遺伝子型を決定する工程を含む、請求項１記載のポリープ状脈絡膜血管症のリスクを予測する方法。
  3. 　配列番号1～70で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列において、前記配列番号1～70で示される塩基配列の17番目に相当するアレルを有する配列を含有する核酸分子を用いて検出工程を行う、請求項１又は２記載のポリープ状脈絡膜血管症のリスクを予測する方法。
  4. 　核酸分子をプローブとして用いる、請求項３記載のポリープ状脈絡膜血管症のリスクを予測する方法。
  5. 　プローブが23～27塩基の長さである、請求項４記載のポリープ状脈絡膜血管症のリスクを予測する方法。
  6. 　プローブが固層化されてなる、請求項４又は５記載のポリープ状脈絡膜血管症のリスクを予測する方法。
  7. 　被験者由来のサンプル中の核酸分子について、配列番号1～70で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列又はその相補的配列において、前記塩基配列の17番目に存在する一塩基多型のアレルをin vitroで検出するための核酸分子を含有してなる、ポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測キット。
  8. 　核酸分子が、配列番号1～70で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列において、前記配列番号1～70で示される塩基配列の17番目に相当するアレルを有する配列を含有する核酸分子である、請求項７記載のポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測キット。
  9. 　核酸分子が、配列番号1～70で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列である、請求項８記載のポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測キット。
  10. 　核酸分子をプローブとして用いる、請求項７～９いずれか記載のポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測キット。
  11. 　プローブが23～27塩基の長さである、請求項１０記載のポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測キット。
  12. 　プローブが固層化されてなる、請求項１０又は１１記載のポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測キット。
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