WO2011027796A1 - 五炭糖輸送体 - Google Patents

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WO2011027796A1
WO2011027796A1 PCT/JP2010/064962 JP2010064962W WO2011027796A1 WO 2011027796 A1 WO2011027796 A1 WO 2011027796A1 JP 2010064962 W JP2010064962 W JP 2010064962W WO 2011027796 A1 WO2011027796 A1 WO 2011027796A1
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WO
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xylose
arabinose
transporter
hgt2
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PCT/JP2010/064962
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誠也 渡辺
茂樹 澤山
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国立大学法人京都大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a membrane transport protein (transporter) that promotes uptake of arabinose and / or xylose.
  • the woody biomass that makes up the bulk of the world's biomass is made up of lignocellulose.
  • lignocellulose In typical lignocellulosic biomass, 35-45% cellulose, 25-40% hemicellulose, 15-30% Consists of lignin.
  • cellulose and lignin have been actively studied for their energy utilization, such as a technique for converting to glucose in a short time using supercritical water.
  • Hemicellulose can be easily broken down into monosaccharides such as xylose by acid hydrolysis or enzymatic degradation.
  • xylose is converted to xylulose by xylose isomerase (XI) in one step without depending on a coenzyme.
  • XR xylose reductase
  • XDH xylitol dehydrogenase
  • XI is a xylose metabolic pathway mainly found in bacteria.
  • bacteria such as Streptomyces sp. And Actinoplanes ⁇ ⁇ ⁇ sp.
  • Can convert xylose to xylulose by XI and then convert it to ethanol through a pentose-phosphate circuit Non-patent Document 1, 2.
  • its efficiency is very low. This is thought to be caused by the formation of organic acids as by-products. For these reasons, it has not been industrially utilized.
  • KO11 strain has been developed in the United States in which two types of pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase of zymomonas bacteria used for tequila production are expressed in E. coli (Patent Documents 1 and 2).
  • This recombinant Escherichia coli can convert all monosaccharides contained in lignocellulose biomass to ethanol.
  • by-products such as lactic acid, succinic acid, fumaric acid, and acetic acid are produced during fermentation and the low resistance to fermentation inhibitors produced when saccharifying lignocellulose biomass is still not completely solved.
  • XI exists in several types of eukaryotic rumen fungi.
  • the XR-XDH pathway is a pathway mainly found in eukaryotic microorganisms, and Pichia stipitis, Candida C shehatae, Pachysolen tannophilus and the like are known to have this pathway (Non-patent Documents 3 and 4). These eukaryotic microorganisms have been used mainly to optimize fermentation conditions, but it is difficult to control anaerobic conditions, etc., and the resistance to saccharification degradation products of alcohol and lignocellulose biomass However, because it is inferior, it is not mainstream now. Instead, S. cerevisiae is a eukaryotic microorganism that has been studied the most because of its potential alcohol fermentability and alcohol resistance.
  • XR-XDH-XK which constitutively expresses three types of genes, mainly XR and XDH genes derived from P. stipitis, and now XK of S. cerevisiae. Genetically modified yeast is mainly used.
  • XI was not able to be expressed functionally in yeast cells at the beginning, research has not progressed, but recently it was successfully expressed in a rumen fungus-derived gene, and xylose fermentation was also successful. However, it has been found that the efficiency is lower than that of the XR-XDH system.
  • Another problem is that the fermentation rate of pentose is very slow compared to hexose.
  • One of the causes is metabolic delay after intracellular conversion from xylose ⁇ xylitol ⁇ xylulose ⁇ xylulose 5-phosphate.
  • Transketolase (TKL) and transaldolase (TKL) and transaldolase (PK) other than XK Improvements such as enhancing the expression of (TAL) have been made (Non-patent Document 9).
  • the second cause is the weaker ability to transport pentose sugars into cells than hexose sugars.
  • Non-patent Document 12 an Arabidopsis thaliana xylose transporter gene (accession No. # BT015354 / # BT015128) into S. cerevisiae into which the XR-XDH-XK gene was chromosomally integrated. It has been confirmed that the introduced gene is expressed accurately and membrane localization is normal by immunofluorescence using a histidine tag added to the amino acid terminal. The effect on xylose fermentation is that xylose transport capacity, consumption rate, and ethanol productivity improved by 46%, 40%, and 70%, respectively.
  • Non-patent Document 13 An attempt to directly identify the xylose transporter of the filamentous fungus Trichoderma reesei has been made by Ruohonen et al. (Non-patent Document 13).
  • a library was constructed to express the cDNA of T. reesei in S. evicerevisiae, and the above strain was integrated into the S. cerevisiae mutant KY73 lacking the major hexose transporter in the XR-XDH-XK gene.
  • a library was introduced, and colonies capable of growing using xylose as a carbon source were selected. Only one colony was isolated and Xlt1 was identified as a xylose transporter (accession No. AY818402).
  • GXF1 (accession No. AJ937350) uses a method that complements the phenotype of the S. cerevisiae hexose-deficient mutant, while GXS1 (accession No. AJ 875406) is a cell membrane of C. intermedia grown on xylose.
  • the protein was directly purified from the cDNA and cDNA was isolated from the determined partial amino acid sequence (Non-patent Document 14). Both GXF1 and GXS1 showed glucose and xylose transport capacity.
  • SUT1 gene was first isolated (accession No. U77382), and then SUT2 and SUT3 having very similar nucleotide sequences were isolated by genomic Southern hybridization using SUT1 as a probe (accession). No. AF0728080 / U77581).
  • SUT1-3 is known to be able to transport xylose in addition to hexoses, and SUT1 is the best kinetics.
  • Kondo et al. Introduced this SUT1 in the form of a plasmid into Saccharomyces yeast into which the XR-XDH-XK gene was chromosomally integrated (Non-patent Document 18). This improved the xylose consumption rate during xylose fermentation, but the final ethanol production was the same. This study is the only example that has achieved some success in the field using a technique called sugar transport gene transfer.
  • L-arabinose is a pentose that occupies 15% of the constituents in corn stover (stem), though not so much in woody biomass, and is positioned as the main pentose of lignocellulose biomass along with xylose It has been.
  • Bacteria have a metabolic pathway by L-arabinose isomerase (AraA), librokinase (AraB) and ribulose 5-phosphate 4 isomerase (AraD), so L-arabinose fermentation can be achieved by adding fermentative ability like E. coli KO11. ( Figure 2).
  • the metabolic pathways of eukaryotic microorganisms have not been elucidated, and attempts to ferment L-arabinose by S.
  • Non-patent Document 19 the pathway of this bacterium (mainly Escherichia coli and Bacillus subtilis). was hardly expressed at the beginning (Non-patent Document 19). By optimizing the codons of the introduced gene for yeast, it became possible to secure a certain level of expression (Non-patent Document 20). In addition, since GAL2 of S. cerevisiae can transport L-arabinose, it was also expressed in large quantities under the control of a constant expression promoter. Although these improvements have made it possible to ferment L-arabinose, it is always acclimatized by long-term subculture.
  • L-arabinose metabolic genes of eukaryotic microorganisms were identified through a series of studies by Penttila et al. (Non-patent Documents 21 and 22). According to this, L-arabinose is converted into L-arabinitol ⁇ L-xylulose ⁇ xylitol ⁇ xylulose ⁇ xylulose pentaphosphate (FIG. 2). Since the first and last two enzymes are XR, XDH, and XK, the new enzymes compared to the xylose metabolic pathway are L-arabinitol 4-dehydrogenase (LADH) and L-xylulose reductase (LXR).
  • LADH L-arabinitol 4-dehydrogenase
  • LXR L-xylulose reductase
  • Non-patent Document 23 the LADH / LXR gene was expressed in XR-XDH-XK transgenic S. cerevisiae (Non-patent Document 23). In contrast to bacterial genes, expression in yeast cells was not a problem, but little ethanol was produced and L-arabinitol was accumulated as a by-product.
  • KmLAT1 and PgLAT2 which are thought to be L-arabinose transporters, were identified from each yeast, and introduced as a plasmid into recombinant Saccharomyces yeast that expressed a large amount of bacterial AraA, AraB, and AraD.
  • GAL2 and PgLAT2 of S. cerevisiae were co-expressed, the Doubling time of growth when L-arabinose was used as a carbon source was accelerated. It appears that ethanol is not produced.
  • Hahn-Hagerdal et al. Identified an L-arabinose transporter gene from Candida arabinofermentas, an L-arabinose-metabolizing yeast (Patent Document 4). Fermentation experiments using S. cerevisiae were not conducted.
  • SUT4 there is another similar homolog in addition to SUT2 and SUT3 on the genome of P. stipitis, which is named SUT4.
  • SUT1-4 are shown in the molecular phylogenetic tree created using amino acid sequences of known sugar transporters of eukaryotic microorganisms (Fig. 3), and less than 40 (presumed) sugar transporters of P. stipitis. Since it is closest to the hexose transporter HXT of Saccharomyces yeast, it is possible to predict to some extent that these can transport glucose and xylose.
  • the object of the present invention is to solve the energy problem by converting monosaccharides that can be easily obtained by hydrolyzing hemicellulose occupying about 30% or more of woody and other biomass resources into ethanol with high efficiency. Is to provide one means to do.
  • the present inventor first constructed a system that expresses all (presumed) sugar transporter genes of P. stipitis in Saccharomyces yeast, and comprehensively analyzed the substrate specificity of each gene for bioethanol production. An attempt was made to clarify the pentose transporter important for yeast breeding development. As a result, it was found that a specific gene functions as a pentose transport protein in yeast.
  • the present invention provides the following genes or pentose transporters such as xylose and arabinose of the expressed proteins or their use, or use thereof, and a method for producing bioethanol.
  • Item 1 Use of HGT2 gene or an expressed protein thereof as a xylose transporter.
  • Item 2 Xylose and / or L-arabinose transporter, which is an expressed protein of a gene selected from the group consisting of HGT2 gene, XUT1 gene and HXT2.4 gene.
  • Item 3 Use of a gene selected from the group consisting of HGT2 gene, XUT1 gene and HXT2.4 gene as a xylose and / or L-arabinose transporter.
  • Item 4 At least one gene selected from the group consisting of HGT2 gene, XUT1 gene and HXT2.4 gene is introduced into yeast and cultured in the presence of biomass containing xylose and / or L-arabinose.
  • Item 5. The method for producing bioethanol according to Item 4, wherein the biomass containing xylose and / or L-arabinose is lignocellulose.
  • the uptake ability of pentose can be remarkably improved and the use of pentose can be promoted.
  • ethanol can be efficiently produced from lignocellulosic woody biomass by simultaneously introducing pentose metabolism-related enzymes into microorganisms such as yeast.
  • Non-patent document 18 shows that S. ⁇ ⁇ ⁇ cerevisiae MT8-1 into which XR-XDH-XK is integrated as a host is used as a host, and even though SUT1 is introduced, bioethanol production is not improved. It was shown that ethanol production was improved by introducing the SUT1 gene into the same host.
  • Kondo et al. In Non-Patent Document 18 are cultivated by adding all the missing amino acids directly into the medium, whereas in the present invention, auxotrophy other than adenine is complemented by inserting a plasmid. is doing. While not wishing to be bound by theory, this suggests that auxotrophy is preferably complemented by the inclusion of a plasmid.
  • Xylose metabolic pathway L-arabinose metabolic pathway of bacteria (A) and eukaryotic microorganisms (B).
  • the boldface of the molecular phylogenetic tree of the sugar transporter of eukaryotic microorganisms is that of P. stipitis that we analyzed this time. All other organisms have been subjected to functional analysis.
  • Sc Saccharomyces cerevisiae; Kl, Kluyveromyces lactis; Td, Torulaspora delbrueckii; Ci, Candida intermedia; Dh, Debaryomyces hansenii; Bc, Botrytis cinerea; Tr, Trichoderma reesei; Ca, Candida albicans.
  • cDNAs for intron-containing genes are synthesized by PCR twice. For e in the figure, the internal HindIII site (double underlined) is crushed. Subcloning of (putative) sugar transporter gene of P. stipitis. Confirmed by PCR using cDNA incorporated into pPGK plasmid as a template. The number in parentheses indicates the length of the gene base. Strains and plasmids used in this study. Substrate specificity of the (presumed) sugar transporter gene of P. stipitis. Each gene was transformed into S.
  • evicerevisiae are both expressed by the PGK promoter and are within the aureobasidin resistance gene AUR1-C when homologously recombined on the chromosome of S. cerevisiae Cut and transform at the restriction enzyme site of BsiWI.
  • Each gene was introduced as a plasmid into the S. cerevisiae KY73-XYL strain having xylose-metabolizing enzyme but not transporting ability.
  • the vertical axis represents the component concentration g / L
  • the horizontal axis represents the fermentation time h.
  • stipitis is cultured in the minimum medium containing a specific carbon source.
  • A) is glucose
  • B) is mannose
  • C) is fructose
  • D is galactose
  • E is xylose
  • F is an experimental result in a medium containing L-arabinose as a carbon source.
  • each series component in (A) to (F) is RGT2, SNF3, SUT1, SUT2 / 3/4, HXT2.1, HXT2.2, HXT2.3, HXT2.4 from the left as shown in (G).
  • each series component in (A) to (F) consists of glucose, mannose, fructose, galactose, xylose, L-arabinose, D-arabinose, L-rhamnose, maltose, cellobiose, sucrose from the left.
  • the results of experiments in a medium containing lactose and glycerol are shown. The result which shows the sugar transport ability of HGT2 and XUT1.
  • (A) shows the result of xylose transport ability.
  • (B) shows the ability to transport L-arabinose.
  • (circle) in a figure shows the transport ability of saccharide
  • ⁇ indicates the sugar transport ability when only HGT2 is expressed in the presence of xylose and L-arabinose.
  • ⁇ indicates the sugar transport ability when HGT2 and XUT1 are expressed in the presence of xylose and L-arabinose.
  • the HGT2 gene or an expressed protein thereof is preferably exemplified by those derived from P. tipstipitis (NCBI accession No. XM_001382718).
  • xylose transporters derived from other eukaryotic cells or prokaryotic cells and The HGT2 gene or its expressed protein including a variant thereof having a function as an L-arabinose transporter is widely included.
  • the SUT1 gene or an expressed protein thereof is preferably exemplified by those derived from P. stipitis (NCBI accession No. ⁇ U77382).
  • xylose transporters derived from other eukaryotic cells or prokaryotic cells and The SUT1 gene or its expressed protein including a variant thereof having a function as an L-arabinose transporter is widely included.
  • the XUT1 gene or its expressed protein is preferably exemplified by those derived from P. stipitis (NCBI accession No. XM_001385546).
  • xylose transporters derived from other eukaryotic cells or prokaryotic cells and The XUT1 gene or its expressed protein containing a variant thereof having a function as an L-arabinose transporter is widely included.
  • the HXT2.4 gene or an expressed protein thereof is preferably exemplified by those derived from P. stipitis (NCBI accession No. XM_001387720), but xylose transport derived from other eukaryotic cells or prokaryotic cells. And the HXT2.4 gene or its expressed protein including a variant thereof having a function as an L-arabinose transporter.
  • the HGT2 gene, the XUT1 gene, the SUT1 gene, the HXT2.4 gene and the like are incorporated into a host capable of expressing the gene, alone or in combination, and a protein having an amino acid sequence encoded by the gene is xylose. Used as transporter and / or L-arabinose transporter.
  • the expression conditions may be known conditions generally used when a foreign gene is incorporated into a host cell for expression.
  • the HGT2 gene, the XUT1 gene, the SUT1 gene, the HXT2.4 gene, etc. are incorporated into an ethanol-fermentable host alone or in combination, and are incorporated in the presence of biomass containing xylose and / or L-arabinose.
  • Bioethanol can be produced by fermentation. Fermentation conditions are the same as the fermentation conditions of the host not incorporating these genes, and known conditions may be used as they are.
  • Biomass used for ethanol fermentation is not particularly limited as long as it contains xylose and / or arabinose, and known biomass is widely used. As such biomass, wood, rice straw, aquatic plants and the like containing lignocellulose are used.
  • Example 1 Protein-Blast search was performed on the P. stipitis genome sequence using the Saccharomyces yeast hexose transporter (HXT) as a probe, and 38 homologous genes were selected with about 30% as the lower limit. Oligonucleotide primers were designed so that appropriate restriction enzyme sites were added to the 5 ′ and 3 ′ ends of each gene (FIG. 4). The cDNA treated with the restriction enzyme was subcloned into a pPGK plasmid containing a Phosphoglycerate kinase (PGK) promoter / terminator cassette, which is a constitutive expression promoter of Saccharomyces yeast, and URA3 as a marker gene. The results of PCR experiments using each plasmid as a template are shown in FIG.
  • PGK Phosphoglycerate kinase
  • KY73 a saccharomyces yeast mutant lacking all of the major hexose transporters HXT1-7 and GAL2, was used to examine the transport ability for the hexoses glucose, D-mannose, D-fructose, and D-galactose. This strain cannot grow on carbon sources other than maltose, and uracil is the only auxotroph that can be used.
  • the KY73 strain was transformed with a pPGK plasmid containing a P. stipitis sugar transporter gene and selected on a YNB medium plate using maltose as a carbon source.
  • a single colony was selected, and the presence or absence of growth was observed in a YNB liquid medium containing glucose, D-mannose, D-fructose, and D-galactose as carbon sources.
  • a YNB liquid medium containing glucose, D-mannose, D-fructose, and D-galactose as carbon sources.
  • Glucose SUT1, HGT2, SUT3, SUT2, XUT3, SUT4, XUT1, HXT2.2 D-Mannose: SUT1, SUT2, SUT3, SUT4, HGT2, RGT2, XUT3, XUT1 D-fructose: SUT1, SUT2, XUT3, SUT3, SUT4, HGT2 D-galactose, SUT1, SUT3
  • the growth curve is shown in FIG. As an overall trend, it can be seen that only a small part of the selected sugar transporter inheritance has the ability to transport hexose, which can simultaneously transport glucose, D-mannose and D-fructose except D-galactose. Weierstall et al. Introduced a genomic library of P.
  • SUT1 stipitis into a mutant strain Y of Saccharomyces yeast that is different from KY73 but has the same mutation to identify SUT1. Furthermore, SUT2 and SUT3 have been identified as homologs. Also in this experiment, SUT1-3 showed the strongest complementation of KY73's ability to transport hexose, which is in good agreement with this result.
  • Example 2 “D-xylose transporter” (1) Screening for xylose transporter gene The following experiment was conducted to identify a transporter for D-xylose, which is the main pentose sugar of lignocellulosic biomass.
  • the KY73 strain carrying the pPGK plasmid containing the P. stipitis sugar transporter gene was cultured in 10 mL of YNBMal (minimum medium containing maltose as a carbon source) for 30 ° C. for 3 days. Thereby, all the maltose in a culture medium is consumed. Next, 400 ⁇ L of 50% D-xylose solution is added (final concentration 2%).
  • the yeast cells are collected by centrifugation and washed twice with 30 mL of ice-cold sterile water. Next, the collected yeast cells are suspended in 400 ⁇ L of sterilized water and shaken at 37 ° C./200 rpm for 1 hour. Thereby, D-xylose transported into the cell by the introduced gene is discharged out of the cell.
  • the concentration of D-xylose in the supernatant was identified by a differential refraction system (RI) with an HPLC system connected to an AminexHPX-87H column.
  • this plasmid carries the aureobasidin resistance gene AUR1-C, which exhibits antibacterial activity against eukaryotic microorganisms, and homologous recombination occurs with the allele AUR on the Saccharomyces yeast chromosome.
  • the XR-XDH-XK gene can be stably introduced onto the chromosome using shidin resistance as a marker.
  • the strain prepared in this way is named KY73-XYL.
  • pPGK plasmids carrying HGT2, SUT1, SUT2, and SUT3, respectively, were transformed into KY73-XYL.
  • xylose taken up into cells by each gene is metabolized to ethanol.
  • the KY73-XYL strain can grow using xylose as the sole carbon source, and a fermentation experiment was conducted at a rotational speed of 150 rpm using a 200 mL baffle flask using 20 g / L xylose as the carbon source (FIG. 11). From the xylose consumption rate and the ethanol concentration produced, it can be seen that SUT1 and HGT2 are sufficient for xylose fermentation.
  • xylose fermentation was performed using Saccharomyces yeast not deficient in the hexose transporter, not the KY73 strain.
  • the pAUR-XR-XDH-XK plasmid was introduced into the MT8-1 strain (MATa ade his3 leu2 trp1 ura3) which is a host yeast (named MT8-1XYL). Genomic PCR and enzyme activity in the cell-free extract confirmed that the XR / XDH gene was normally incorporated and that the XK gene activity was increased.
  • MT8-1XYL strain is coated with pPGK, pPGK-SUT1, pPGK-SUT2, pPGK-HGT2 (all ura3 + ) plasmids and YEpM4 (leu2 + ), pHV1 (his3 + ), pTV3 (trp1 + ), respectively.
  • the YNB plate was transformed (strain name is the same as the plasmid).
  • Each transformed yeast was cultured in a YNB minimal medium containing adenine using glucose as a carbon source, and then a fermentation experiment was performed at a rotational speed of 150 rpm using a 20 mL / L xylose containing adenine as a carbon source in a 200 mL baffle flask. The results are shown in FIG.
  • Example 3 "L-arabinose transporter"
  • L-arabinose transporter In order to identify a transporter for L-arabinose, which is another major pentose of lignocellulosic biomass along with D-xylose, the following experiment was conducted. Measurement of the ability of the P. stipitis sugar transporter gene to be incorporated into cells using the KY73 strain was performed according to D-xylose.
  • Fig. 13 shows the results of measurement of intracellular L-arabinose concentration by HPLC.
  • the L-arabinose peak appears around 10.8 minutes, but the identified peak is around 11.2 minutes, which corresponds to L-arabinitol. This is thought to be because GRE3 possessed by Saccharomyces yeast acts as L-arabinose reductase and converts L-arabinose incorporated into cells into L-arabinitol.
  • the sugar transporter genes of P. stipitis in which the peak of L-arabinitol was confirmed were XUT1, HGT2, SUT3, SUT2, SUT1, and XUT3.
  • the time course of L-arabinose transport was measured for the above seven genes (FIG. 14). The highest L-arabinose transport was confirmed in HGT2 and XUT1.
  • Example 4 “Gene expression analysis by real-time PCR” So far, the analysis of sugar transport ability of sugar transporter gene translation products using mainly Saccharomyces yeast mutant KY73 has been described. On the other hand, for example, the ability of the sugar transporter gene A to transport sugar B does not necessarily coincide with the function of the gene in the metabolism of sugar B in P. stipitis. Strictly speaking, it is necessary to create a mutant strain in which each sugar transporter gene is individually disrupted and to examine the phenotype. However, here, "the expression of a transporter gene using a certain sugar as a substrate is based on that sugar as a carbon source. Based on the general knowledge that it is induced under growth, P. stipitis is cultured in various minimal media containing various sugars as carbon sources, and the amount of mRNA of the sugar transporter gene is estimated by real-time PCR. The correlation between gene function and gene expression was compared.
  • the amplification primer used for real-time PCR was designed using the Primer3 program (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm), so that amplification of 100 to 150 bp was performed from the gene to be analyzed.
  • the specific primer sequences used in this example are shown in FIG. P.
  • stipitis contains glucose, mannose, fructose, galactose, xylose, L-arabinose D-arabinose, L-rhamnose, maltose, cellobiose, sucrose, lactose, and glycerol as carbon sources at a concentration of 2% (w / v).
  • FIGS. 16 show the results of the average value of the experiment performed twice.
  • the results shown in FIG. 16 show the expression levels of various genes for each saccharide contained in the minimal medium.
  • the vertical axis of the graph in the figure represents the expression level of each gene relative to the expression level of the actin gene which is a housekeeping gene used as a control.
  • FIG. 17 summarizes the data shown in FIG. 16 for each expression gene. Based on the expression level when glucose is contained in the minimum medium at a concentration of 2% (w / v), The expression levels of various genes when cultured in a minimal medium containing the same concentration of sugar are shown.
  • the above-mentioned screening was not the most commonly expressed SUT gene group known as the hexose transporter.
  • Newly identified HGT2 gene since the expression product of the HGT2 gene is sufficiently expressed even when grown in a minimal medium containing galactose that cannot be transported, the HGT2 gene is not induced by a specific sugar but is constitutively expressed. It is thought that it is a gene. SUT1-4 and RGT2 are expressed next to HGT2, and this result is in good agreement with the complementary growth experiment using the above-mentioned KY73 strain.
  • Non-Patent Document 17 shows that expression of SUT1 is not induced in the presence of xylose, and SUT2 or SUT3 is expressed only under aerobic conditions. ing. Also in this example, the expression level of SUT2-4 was sufficiently lower than that of SUT1 in aerobic culture, which is in good agreement with conventional knowledge. On the other hand, HGT2 is more than twice as expressed as SUT2-4, suggesting that it is the most important xylose transporter of P. stipitis together with the results of protein function analysis.
  • HXT2.4 which was 670 times more induced than the experimental result with the minimum medium containing glucose.
  • this protein has not been confirmed to transport L-arabinose (at least in Saccharomyces yeast) and may have a problem in functional expression in Saccharomyces yeast.
  • XUT1 which shows the highest expression level after HXT2.4, shows sufficient L-arabinose transport ability from the above examples, suggesting that it is the most important L-arabinose transporter of P. stipitis . Therefore, HXT2.4 is also considered to be involved as an L-arabinose transporter.
  • Example 5 “Transportability of xylose in the presence of xylose and L-arabinose” Looking at the transport ability of the KY73 strain expressing HGT2 by the method according to Example 2 or 3 in the presence of xylose and L-arabinose (both at 2% (w / v) concentration), L-arabinose The xylose uptake ability is improved about 3 times compared to the absence (FIG. 18: A). However, this effect does not change even when XUT1 is expressed together with HGT2, and the additive effect of L-arabinose incorporation of HGT2 and XUT1 is maintained (FIG. 18: B).
  • yeast cells expressing HGT2, XUT1, etc. under conditions where xylose, L-arabinose, etc. are mixed shows a cooperative effect in the uptake of xylose and L-arabinose is very favorable. .

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Abstract

バイオマス資源を有効活用して五炭糖からバイオエタノールなどの有用物質を製造することを目的とする。ＨＧＴ２遺伝子またはその発現タンパク質のキシロース輸送体としての使用；ＨＧＴ２遺伝子、ＸＵＴ1遺伝子およびＨＸＴ２．４遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子の発現タンパク質であるキシロースおよび／またはＬ-アラビノース輸送体。；ＨＧＴ２遺伝子、ＸＵＴ1遺伝子およびＨＸＴ２．４遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子のキシロースおよび／またはＬ-アラビノース輸送体としての使用；およびＨＧＴ２遺伝子、ＸＵＴ1遺伝子およびＨＸＴ２．４遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を酵母に導入し、キシロースおよび／またはＬ-アラビノースを含有するバイオマスの存在下で培養することを特徴とするバイオエタノールの製造方法。

Description

五炭糖輸送体
　本発明は、アラビノース及び／又はキシロースの取り込みを促進する膜輸送タンパク質(輸送体)に関する。
　地球上のバイオマスの大部分を占める木質系バイオマスは、リグノセルロースから構成されており、典型的なリグノセルロース系バイオマスでは、35～45%のセルロース、25～40%のヘミセルロース、15～30%のリグニンで構成されている。このうち、近年、セルロースやリグニンについては、超臨界水を用いた短時間でグルコースへの変換する手法などの、盛んにそのエネルギー利用としての研究がなされている。ヘミセルロースは酸加水分解あるいは酵素分解によって容易にキシロースなどの単糖類に分解することが出来る。また、ヘミセルロースの大部分を占め、容易に調達できるキシロースを液体燃料へと効率よく変換させることは、エネルギー問題の点からも重要な課題と考えられている。
　これまで、酵母などの多くの微生物を用いて、セルロースなどのヘキソースをエタノールへと嫌気的に効率よく変換させることには成功しているが、キシロースなどのペントースは高い効率で変換できないことが知られている。
　キシロースをエタノールへと変換する経路として、図１に示したように、主に二つの経路が知られている。一つは、キシロースからキシルロースへとキシロース異性化酵素（XI）により補酵素に依存せずに一段階で変換する方法である。もう一つは、キシロース還元酵素（以下XR）によりキシロースをキシリトールへと変換させた後、キシリトールをキシリトール脱水素酵素（XDH）によりキシルロースへと変換する方法である。この時、変換には補酵素を必要とする。両方法ともキシルロースへと変換する事が出来れば、キシルロースキナーゼ（XK）によって生じたキシルロース5リン酸がペントース・リン酸回路を経由してエタノールへと容易に変換される。
　XIは主にバクテリアに見られるキシロース代謝経路である。例えば、Streptomyces sp.やActinoplanes sp.のようなバクテリアは、XIによりキシロースをキシルロースへと変換した後、ペントース・リン酸回路を通ってエタノールへと変換できることが知られている（非特許文献1、2）。しかし、その効率は非常に低い。これは、有機酸が副生成物として生成することが原因ではないかと考えられている。これらのことから、工業的に利用するには至っていない。これに替わり、大腸菌にテキーラ製造に用いられるザイモモナス細菌のピルビン酸脱炭酸酵素とアルコール脱水素酵素の2つを発現させたKO11株が米国で開発されている（特許文献1、2）。この組み換え大腸菌は、リグノセルロースバイオマスに含まれる全ての単糖をエタノールまで変換できる。一方、発酵の際に乳酸・コハク酸・フマル酸・酢酸などの副生成物ができることと、リグノセルロースバイオマスを糖化した際に出る発酵阻害物質に対する耐性が低い点がいまだ完全には解決できていない。最近になって、真核微生物であるルーメン真菌の数種類にXIが存在することが明らかとなっている。
　XR-XDH経路は主に真核微生物に見られる経路であり、Pichia stipitis、Candida shehatae、Pachysolen tannophilus等がこの経路を有すると知られている（非特許文献3，4）。これらの真核微生物を用いて主に発酵条件の最適化などに主眼に研究が行われてきたが、嫌気条件等の制御が難しく、またアルコールやリグノセルロースバイオマスの糖化分解物への耐性の面でも劣ることから、現在では主流ではない。これに替わり、S. cerevisiaeは潜在的アルコール発酵能とアルコール耐性能の高さから最も研究の進んでいる真核微生物である。
　一方、本酵母はキシロースを資化できないため、主にP. stipitis由来のXRとXDH遺伝子、さらに現在ではS. cerevisiaeの持つXKの3種類の遺伝子を構成的に発現させたXR-XDH-XK遺伝子組み換え酵母が主に使われている。XIは、当初酵母の細胞内で機能的に発現させることができなかったことから研究が進んでいなかったが、最近になってルーメン真菌由来の遺伝子でその発現に成功、キシロース発酵にも成功しているが、XR-XDHのシステムに比べて効率が悪いことが分かってきている。
　開発当初から指摘されてきたことであるが、XR-XDH-XK遺伝子組み換え酵母の問題点は大きく2つある。まず、発酵過程でキシリトール・グリセロール・酢酸などの副生成物が蓄積する。この原因としてXRとXDHの触媒反応における補酵素要求性の違いによる細胞内の酸化・還元バランスの乱れが挙げられており、酵母の補酵素リサイクルシステムの改良（非特許文献5）や、最近ではXRあるいはXDHを部位特異的変異によって人工的に異なる補酵素特異性を持つ変異体を作り出し、その遺伝子を用いてキシロース発酵を改善する試みなどもなされている（非特許文献6、7、8）。
　もう１つの問題点は、六炭糖に比べて五炭糖の発酵速度が極めて遅いことである。この原因の１つは細胞内でキシロース→キシリトール→キシルロース→キシルロース5リン酸と変換された後の代謝の遅延であり、XK以外のペントース・リン酸回路のトランスケトラーゼ（TKL）・トランスアルドラーゼ（TAL）の発現を増強するなどの改良がなされている（非特許文献9）。原因の2番目としては、六炭糖に比べて五炭糖を細胞内へ輸送する能力の脆弱さである。サッカロミセス酵母にXR-XDHやXIのみを導入することでキシロース発酵が可能になる事実は、本酵母がキシロース輸送能力（およびその輸送体）を固有に保持することを示している。そこで、主要な六炭糖輸送体であるHXT1-7およびGAL2を全て欠損させた変異体RE700株に対して、HXT1-7とGAL2を個々に導入してキシロース輸送能を持つ六炭糖輸送体がHahn-Hagerdalら（非特許文献10）やHoら（非特許文献11）によって同定されている。しかし、これらの輸送体遺伝子を構成的に発現させてもエタノール生産性に向上は見られない。
　他の生物由来の糖輸送遺伝子を導入する試みもいくつかなされている。まず、上記のHahn-Hagerdalらは、大腸菌（accession name, xylE）と、植物であるクロレラ（Hup1, accession No. X55349）とシロイヌナズナ（Stp2, accession No. NM_100608 ; Stp3,accession No. AJ002399）のキシロース輸送体遺伝子といった、植物と細菌由来のキシロース輸送体と推定される遺伝子を、S. cerevisiaeに対して同時に導入しているがうまくいっていない。異なる生物由来の遺伝子を酵母で機能的に発現させ膜に正確に局在させることは難しく、この点に関して彼らは解析を行っていない。
一方、Hectorらはシロイヌナズナ由来のキシロース輸送体遺伝子（accession No. #BT015354・#BT015128）を、XR-XDH-XK遺伝子を染色体組み込みしたS. cerevisiaeに導入した（非特許文献12）。アミノ酸末端に付加したヒスチジンタグを利用した免疫蛍光法により、導入した遺伝子が正確に発現し、また膜局在も正常であることを確認している。キシロース発酵に及ぼす影響だが、キシロース輸送能と消費速度、エタノール生産性がそれぞれ46%・40%・70%向上したとしている。糸状菌Trichoderma reeseiのキシロース輸送体を直接同定する試みがRuohonenらによってなされている（非特許文献13）。T. reeseiのcDNAをS. cerevisiae内で発現するようにライブラリを構築し、主要六炭糖輸送体を欠損させたS. cerevisiae変異株KY73にXR-XDH-XK遺伝子を染色体組み込みした株に上記ライブラリーを導入し、キシロースを炭素源として生育可能なコロニーを選抜した。わずか１つであるがコロニーが単離され、キシロース輸送体としてXlt1が同定された（accession No. AY818402）。ところが、この遺伝子を改めてKY73株に形質転換しキシロースでの生育や輸送能を調べても全く確認できなかった。結局、KY73株に何かしらの自然突然変異が起きたことでXlt1導入によるキシロース生育能が獲得されたのではないか、としている。
Goncalvesらは、キシロース資化性酵母であるCandida intermediaのcDNAライブラリから2種類の方法でキシロース輸送体を単離した。まずGXF1（accession No. AJ937350）は、S. cerevisiaeの六炭糖欠損変異体の表現型を補完する方法を用いて、一方GXS1（accession No. AJ875406）はキシロースで生育させたC. intermediaの細胞膜から直接タンパク質を精製し、決定した部分的アミノ酸配列からcDNAを単離した（非特許文献14）。GXF1とGXS1の両方でグルコースとキシロースの輸送能が見られた。続いて、両遺伝子をXR-XDH-XK遺伝子組み換え酵母で発現させキシロース発酵が行われた。しかし、GXF1は酵母細胞内で機能的に発現したもののGXS1はほとんど転写されずまた膜への局在も確認できなかった（非特許文献15）。これは、近縁の酵母由来の糖輸送遺伝子でもS. cerevisiae内で十分に発現させることは必ずしも容易でないことを示している。
　キシロース発酵性酵母Pichia stipitisのゲノム配列は2007年に解読が終了したが、それ以前にも糖輸送に関する研究はいくつかなされている。Bissonらは、P. stipitisには高親和性（Km = 0.9mM）と低親和性（Km = 380mM）の2種類のキシロース輸送システムが存在し、このうち後者はグルコースの低親和性輸送システムと同じであることを明らかにしている（非特許文献16）。一方、Weierstallらは上記S. cerevisiae RE700株との補完性を使って、P. stipitisのグルコース輸送体を同定している（非特許文献17）。この中で、まずSUT1遺伝子が単離され（accession No. U77382）、続いてSUT1をプローブとしたゲノミックサザンハイブリダイゼーションによって互いに非常に良く似たヌクレオチド配列を持つSUT2とSUT3が単離された（accession No. AF0728080・U77581）。SUT1-3は六炭糖に加えてキシロースも輸送できることが分かっており、カイネティクスで見るとSUT1が最もよい。近藤らは、このSUT1をXR-XDH-XK遺伝子を染色体組み込みしたサッカロミセス酵母にプラスミドの形で導入した（非特許文献18）。これにより、キシロース発酵の際のキシロース消費速度は向上したが最終的なエタノール生産量は同じであった。本研究は、当該分野で糖輸送遺伝子導入という手法を用いてある程度の成功を収めている唯一の例である。
　とはいえ、近藤らの例で見てもグルコースに対するキシロース消費速度は6倍以上遅くいまだ実用化のレベルには達していない。P. stipitisのSUT1の有効性はある程度示されたが、本遺伝子はそもそもグルコース輸送体として同定されたものであり、P. stipitisの持つ最も優秀なキシロース輸送体であるわけではない可能性がある。実際、SUT1は好気的・嫌気的いずれの場合でもキシロース存在下で遺伝子発現が全く誘導されず、キシロース輸送能が劣るSUT2・SUT3のほうがよく発現している（非特許文献17）。
　L-アラビノースは、木質バイオマスにはそれほど含まれていないものの、例えばコーンストーバ（茎）においては構成成分の15%を占める五炭糖であり、キシロースと並んでリグノセルロースバイオマスの主要五炭糖と位置付けられている。バクテリアは、L-アラビノース異性化酵素（AraA）リブロキナーゼ（AraB）・リブロース5リン酸4異性化酵素（AraD）による代謝経路を持つため、大腸菌KO11のように発酵能の付加でL-アラビノース発酵が可能となる（図2）。真核微生物の代謝経路が未解明だったこともあり、S. cerevisiaeによるL-アラビノース発酵の試みはこのバクテリア（主に大腸菌と枯草菌）の経路を導入したが、酵母細胞内でこれらの酵素がほとんど発現せず当初困難だった（非特許文献19）。やがて導入する遺伝子のコドンを酵母用に最適化することで、ある程度の発現量が確保できるようになった（非特許文献20）。また、S. cerevisiaeのGAL2がL-アラビノースを輸送できることから、恒常的発現プロモーター支配下での大量発現も行われた。これらの改良によりL-アラビノースの発酵は可能になったが、必ず長期間の継代培養による順化を行っている。
　一方、Penttilaらの一連の研究で真核微生物のL-アラビノース代謝遺伝子が全て同定された（非特許文献21、22）。これによると、L-アラビノースはL-アラビニトール→L-キシルロース→キシリトール→キシルロース→キシルロース5リン酸と変換される（図2）。最初の還元酵素と最後2つの酵素はそれぞれXR・XDH・XKであることから、キシロース代謝経路と比較した新規酵素はL-アラビニトール4-脱水素酵素（LADH）とL-キシルロース還元酵素（LXR）だけということになる。そこで、XR-XDH-XK遺伝子組み換えS. cerevisiaeでLADH・LXR遺伝子を発現させた（非特許文献23）。バクテリアの遺伝子とは対照的に酵母細胞内での発現は問題なかったが、エタノールはほとんど生産されずまた副生成物としてL-アラビニトールが蓄積された。
　固有にL-アラビノースを代謝できる真核微生物の持つL-アラビノース輸送体に関する研究はほとんどない。これは、S. cerevisiaeのGAL2の大量発現がある程度の効果を発揮しているためと考えられる。Knoshaugらは、L-アラビノースでよく成育できるKluyveromyces maxianusとPichia guilliermondiiの2種類の酵母のL-アラビノース輸送について研究を行った（特許文献３）。それぞれの酵母よりL-アラビノース輸送体と思われる遺伝子KmLAT1とPgLAT2を同定し、バクテリアのAraA・AraB・AraDを大量発現させた組み換えサッカロミセス酵母にプラスミドとして導入した。その結果、S. cerevisiaeのGAL2とPgLAT2を共発現させたとき、L-アラビノースを炭素源としたときの生育のDoubling timeが早くなった。エタノールは生成されていないようである。Hahn-Hagerdalらは、L-アラビノース代謝酵母であるCandida arabinofermentasからL-アラビノース輸送体遺伝子を同定した（特許文献４）。S. cerevisiaeを用いた発酵実験は行っていない。
　実は、P. stipitisのゲノム上にはSUT2・SUT3の他にもう１つ良く似たホモログがありSUT4と名づけられている。これらSUT1-4は、真核微生物の既知の糖輸送体のアミノ酸配列を用いて作成した分子系統樹で見ると（図3）、P. stipitisの持つ40個弱の（推定）糖輸送体の中で最もサッカロミセス酵母の六炭糖輸送体HXTに近いため、これらがグルコースやキシロースを輸送できることはある程度予測が可能である。一方、既知の真核微生物の糖輸送体の基質特異性を系統樹に当てはめてみると、マルトースあるいはラクトース輸送体と推定できるごく少数を除くと相互の類縁関係と糖輸送能力には全く関連性がないことが分かる。すなわち、P. stipitisのSUT以外の残りの（推定）糖輸送体について現時点ではこれ以上知るすべがない。
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　本発明の目的は、木質などのバイオマス資源のうち、約30％以上を占めるヘミセルロースを加水分解することによって容易に得ることが出来る単糖を、高効率でエタノールへと変換し、エネルギー問題を解決するための1つの手段を提供することである。
　本発明者はまずP. stipitisの持つ全ての（推定）糖輸送体遺伝子をサッカロミセス酵母で発現させる系を構築、個々の遺伝子について網羅的に基質特異性を解析する中で、バイオエタノール生産のための酵母育種開発に重要な五炭糖輸送体を明らかにすることを試みた。その結果、特定の遺伝子が酵母において５炭糖の輸送タンパク質として機能することを見出した。
　本発明は、以下の遺伝子またはその発現タンパク質のキシロース、アラビノースなどの五炭糖輸送体もしくはその使用、バイオエタノールの製造方法を提供するものである。
項１　ＨＧＴ２遺伝子またはその発現タンパク質のキシロース輸送体としての使用。
項２　ＨＧＴ２遺伝子、ＸＵＴ1遺伝子およびＨＸＴ２．４遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子の発現タンパク質であるキシロースおよび／またはＬ-アラビノース輸送体。
項３　ＨＧＴ２遺伝子、ＸＵＴ1遺伝子およびＨＸＴ２．４遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子のキシロースおよび／またはＬ-アラビノース輸送体としての使用。
項４　ＨＧＴ２遺伝子、ＸＵＴ1遺伝子およびＨＸＴ２．４遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を酵母に導入し、キシロースおよび／またはＬ-アラビノースを含有するバイオマスの存在下で培養することを特徴とするバイオエタノールの製造方法。
項５　キシロースおよび／またはＬ-アラビノースを含有するバイオマスが、リグノセルロースである上記項４に記載のバイオエタノールの製造方法。
　本発明によれば、キシロース、アラビノースなどの五炭糖の取り込み能が劣る微生物に遺伝子導入することにより五炭糖の取り込み能を格段に向上させて、五炭糖の利用を促進することができる。
　また、五炭糖の代謝関連酵素を同時に酵母などの微生物に導入することで、リグノセルロース系の木質系バイオマスからエタノールを効率よく産生することができる。
　非特許文献18において、XR-XDH-XKを染色体組み込んだS. cerevisiae MT8-1を宿主として用い、SUT1を導入してもバイオエタノールの生産量は向上しないことが示されているが、本願では、同じ宿主にSUT1遺伝子を導入することで、エタノールの生産量が向上したことが示された。形質転換法に関し、非特許文献18の近藤らは足りないアミノ酸を全て培地中に直接添加して培養しているのに対し、本発明ではアデニン以外の栄養要求性は、プラスミドを入れることで補完している。理論に拘束されることを望むものではないが、このことから、栄養要求性は、プラスミドを入れることで補完するのが望ましいと考えられる。
キシロース代謝経路。 バクテリア（A）と真核微生物（B）のL-アラビノース代謝経路。 真核微生物の糖輸送体の分子系統樹の太字は、今回解析を行ったP. stipitisのものを示す。他の生物ものは、全て機能解析済みである。Sc, Saccharomyces cerevisiae; Kl, Kluyveromyces lactis; Td, Torulaspora delbrueckii; Ci, Candida intermedia; Sp, Schizosaccharomyces pombe; Am, Amanita muscaria; Uf, Uromyces fabae; An, Aspergillus niger; Hp, Hansenula polymorpha; Cn, Cryptococcus neoformans; Dh, Debaryomyces hansenii; Bc, Botrytis cinerea; Tr, Trichoderma reesei; Ca, Candida albicans。 P. stipitisの（推定）糖輸送体遺伝子のサブクローニングに用いたプライマー配列。図中のaについて、内部のHindIIIサイト（二重下線部）をつぶしている。図中のbについて、SUT2－4は、ほとんど同じヌクレオチドサイトのため、単純なゲノミックPCRでは単離できない。そこで、SUT2-up＋SUT2-down、SUT3-up＋SUT3-down、SUT4-up＋SUT4-downのプライマーで、SUT2-4を含むゲノム断片をそれぞれに増幅。次にその断片を鋳型としてそれぞれのプライマーで遺伝子を増幅している。図中のcについて、内部のEcoRIサイト（二重下線部）をつぶしている。図中のdについて、イントロンを含む遺伝子（HGT1、LAC3、QUP3、QUP4）については、二回のPCRによってcDNAを合成している。図中のeについて、内部のHindIIIサイト（二重下線部）をつぶしている。 P. stipitisの（推定）糖輸送体遺伝子のサブクローニング。cDNAをpPGKプラスミドに組み込んだものを鋳型として、PCRにより確認したもの。括弧内の数字は遺伝子の塩基の長さを示す。 本研究で用いた菌株およびプラスミド。 P. stipitisの（推定）糖輸送体遺伝子の基質特異性。S. cerevisiae KY73株にそれぞれの遺伝子を形質転換し、（A）グルコース・（B）D-マンノース・（C）フルクトース・（D）ガラクトースを炭素源とするYNB最小培地で生育をみた。記載のない遺伝子は生育が見られなかった。なお、表示のグラフの縦軸は、ＯＤ６００の数値を表す。 （A）キシロース輸送能を持つP. stipitisの（推定）糖輸送体遺伝子の同定。各遺伝子を発現させたS. cerevisiae KY73株をマルトースで培養後にキシロースを加え、細胞内キシロースの存在の有無をHPLCで解析した。（B）は、輸送能がある遺伝子を抜粋したもの。 P. stipitisのキシロース輸送体のキシロース輸送のタイムコース。図8の実験を、キシロース添加後に30分毎にサンプリングし解析を行ったもの。数値は、キシロースとキシリトールの量を足したものとして表してある。内部のグラフはキシロース・キシリトールそれぞれのデータ。 pAUR-XR-XDH-XKプラスミドの模式図。P. stipitis由来のXR・XDH遺伝子およびS. cerevisiae由来のXK遺伝子はいずれもPGKプロモーターで発現し、S. cerevisiaeの染色体上に相同組み換えする際は、オーレオバシジン耐性遺伝子AUR1-C内にあるBsiWIの制限酵素サイトで切断し形質転換する。 P. stipitisのキシロース輸送体のサッカロミセス酵母内でのキシロース発酵。それぞれの遺伝子を、キシロース代謝酵素は持つが輸送能は持たないS. cerevisiae KY73-XYL株にプラスミドとして導入した。図の縦軸は成分濃度g/L、横軸は発酵時間hである。（A）キシロース濃度・（B）キシリトール濃度・（C）グリセロール濃度・（D）エタノール濃度。 P.stipitisのキシロース輸送体のサッカロミセス酵母内でのキシロース発酵。それぞれの遺伝子を、正常な六炭糖輸送体を持つ野生型サッカロミセス酵母にキシロース資化能を付加したMT8-1-XYL株にプラスミドとして導入した。（A）キシロース濃度・（B）エタノール濃度。ごく少量のキシロースと酢酸が副生成物として検出された（データは示さず）。 （A）L-アラビノース輸送能を持つP. stipitisの（推定）糖輸送体遺伝子の同定。各遺伝子を発現させたS. cerevisiae KY73株をマルトースで培養後にキシロースを加え、細胞内キシロースの存在の有無をHPLCで解析した。（B）は、輸送能がある遺伝子を抜粋したもの。 P. stipitisのL-アラビノース輸送体のL-アラビノース輸送のタイムコース。図13の実験を、L-アラビノース添加後に30分毎にサンプリングし解析を行ったもの。 リアルタイムＰＣＲ解析に使用するプライマー配列。図中、「遺伝子」と記載した項目には、リアルタイムPCRによる解析対象となる遺伝子を記載している。 P. stipitisを特定の炭素源を含む最小培地にて培養した際に、発現が誘導される遺伝子を示す結果。（A）はグルコース、（B）はマンノース、（C）はフルクトース、（D）はガラクトース、（E）はキシロース、（F）はL-アラビノースを炭素源として含む培地での実験結果を表す。（A）～（F）における各系列成分は、（G）に示すように、左からRGT2、SNF3、SUT1、SUT2/3/4、HXT2.1、HXT2.2、HXT2.3、HXT2.4、HXT2.5/2.6、HXT4、XUT1、XUT2、XUT3、XUT4、XUT5、XUT6、XUT7、HGT1、HGT2、QUP1、QUP2、QUP3、QUP4、LAC1、LAC2、LAC3、MAL1、MAL2、MAL3、MAL4、MAL5、MFS5、STL1、AUT1、FUC１遺伝子の発現量を示す。 P. stipitisを特定の炭素源を含む最小培地にて培養した際に、発現が誘導される遺伝子を示す結果。（A）はRGT2遺伝子、（B）はSUT１遺伝子、（C）はSUT2/3/4遺伝子、（D）はHXT2.4遺伝子、（E）はXUT１遺伝子、（F）はHGT２遺伝子の発現量を示す。（A）～（F）における各系列成分は、（G）に示すように、左からグルコース、マンノース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、L-アラビノース、D-アラビノース、L-ラムノース、マルトース、セロビオース、スクロース、ラクトース、グリセロールを含む培地にて実験した結果を示す。 ＨＧＴ２およびＸＵＴ１の糖輸能を示す結果。（A）は、キシロース輸送能の結果を示す。（B）は、Ｌ－アラビノースの輸送能を示す。なお、図中の○は、キシロースのみの存在下において、ＨＧＴ２のみを発現させた際の、糖の輸送能を示す。図中の△はキシロースおよびＬ－アラビノースの存在下において、ＨＧＴ２のみを発現させた際の、糖の輸送能を示す。図中の◇はキシロースおよびＬ－アラビノースの存在下において、ＨＧＴ２およびＸＵＴ１を発現させた際の、糖の輸送能を示す。
　本明細書において、ＨＧＴ２遺伝子またはその発現タンパク質としては、P. stipitis由来のものが好ましく例示されるが（NCBI accession No. XM_001382718）、これ以外の真核細胞もしくは原核細胞由来の、キシロース輸送体および／またはＬ-アラビノース輸送体としての機能を有するその改変体を含むＨＧＴ２遺伝子またはその発現タンパク質を広く包含する。
　本明細書において、ＳＵＴ１遺伝子またはその発現タンパク質としては、P. stipitis由来のものが好ましく例示されるが（NCBI accession No. U77382）、これ以外の真核細胞もしくは原核細胞由来の、キシロース輸送体および／またはＬ-アラビノース輸送体としての機能を有するその改変体を含むＳＵＴ１遺伝子またはその発現タンパク質を広く包含する。
　本明細書において、ＸＵＴ1遺伝子またはその発現タンパク質としては、P. stipitis由来のものが好ましく例示されるが（NCBI accession No. XM_001385546）、これ以外の真核細胞もしくは原核細胞由来の、キシロース輸送体および／またはＬ-アラビノース輸送体としての機能を有するその改変体を含むＸＵＴ1遺伝子またはその発現タンパク質を広く包含する。
　本明細書において、ＨＸＴ２．４遺伝子またはその発現タンパク質としては、P. stipitis由来のものが好ましく例示されるが（NCBI accession No. XM_001387720）、これ以外の真核細胞もしくは原核細胞由来の、キシロース輸送体および／またはＬ-アラビノース輸送体としての機能を有するその改変体を含むＨＸＴ２．４遺伝子またはその発現タンパク質を広く包含する。
　本明細書において、ＨＧＴ２遺伝子、ＸＵＴ１遺伝子、ＳＵＴ１遺伝子、ＨＸＴ２．４遺伝子などは、単独もしくは組み合わせて、該遺伝子を発現させることができる宿主に組み込み、該遺伝子がコードするアミノ酸配列を有するタンパク質をキシロース輸送体および／またはＬ-アラビノース輸送体として使用される。発現の条件は、一般的に宿主細胞に外来遺伝子を組み込んで発現させる際に使用される、公知の条件を用いればよい。
　本明細書において、ＨＧＴ２遺伝子、ＸＵＴ１遺伝子、ＳＵＴ１遺伝子、ＨＸＴ２．４遺伝子などは、単独もしくは組み合わせて、エタノール発酵可能な宿主に組み込み、これをキシロースおよび／またはＬ-アラビノースを含むバイオマスの存在下で発酵させることによりバイオエタノールを産生することができる。発酵の条件は、これらの遺伝子を組み込んでいない宿主の発酵条件と同じであり、公知の条件がそのまま用いればよい。
　エタノール発酵に用いられるバイオマスは、キシロースおよび／またはアラビノースが含まれるバイオマスであれば特に限定されず、公知のバイオマスが広く用いられる。このようなバイオマスとしては、リグノセルロースを含む木材・稲わら・水草などが用いられる。
　以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことは言うまでもない。
実施例１
　P. stipitisのゲノム配列に対して、サッカロミセス酵母のヘキソース輸送体（HXT）をプローブとしてProtein-Blastサーチを行い、約30%を下限として相同性のある遺伝子38個を選抜した。それぞれの遺伝子の5’および3’末端に適切な制限酵素部位が付加されるようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計した（図4）。制限酵素処理したcDNAは、サッカロミセス酵母の構成的発現プロモーターであるPhosphoglycerate kinase（PGK）プロモーター・ターミネーターカセットおよびマーカー遺伝子としてURA3を含むpPGKプラスミドにサブクローニングした。各プラスミドを鋳型としたPCR実験結果を図5に示す。
　ヘキソースであるグルコース・D-マンノース・D-フルクトース・D-ガラクトースに対する輸送能を調べるため、主要なヘキソース輸送体であるHXT1-7およびGAL2が全て欠損したサッカロミセス酵母変異株であるKY73を用いた。本株は、マルトース以外の炭素源で生育不能であり、用いることのできる栄養要求性はウラシルのみである。KY73株に対して、P. stipitisの糖輸送体遺伝子を含むpPGKプラスミドを形質転換し、マルトースを炭素源とするYNB培地プレート上で選抜を行った。単一のコロニーを選び、グルコース・D-マンノース・D-フルクトース・D-ガラクトースをそれぞれ炭素源とするYNB液体培地で生育の有無を観察した。その結果、各ヘキソースに対する輸送能を有する遺伝子として以下のものが同定された。
　グルコース：SUT1・HGT2・SUT3・SUT2・XUT3・SUT4・XUT1・HXT2.2
　D-マンノース：SUT1・SUT2・SUT3・SUT4・HGT2・RGT2・XUT3・XUT1
　D-フルクトース：SUT1・SUT2・XUT3・SUT3・SUT4・HGT2
　D-ガラクトース・SUT1・SUT3
生育曲線を図7に示す。全体の傾向として、選抜した糖輸送体遺伝のごく一部のもののみに六炭糖輸送能があり、それはD-ガラクトースを除くグルコース・D-マンノース・D-フルクトースを同時に輸送できることが分かる。Weierstallらは、P. stipitisのグルコース輸送体遺伝子を同定する目的で、P. stipitisのゲノムライブラリをKY73とは異なるが同様の変異を有するサッカロミセス酵母の変異株Yに導入しSUT1を同定。さらにそのホモログとしてSUT2・SUT3を同定している。本実験でも、SUT1-3で最も強くKY73のヘキソース輸送能の補完が見られており、この結果とよく一致している。
実施例２：「D-キシロース輸送体」
（１）キシロース輸送体遺伝子のスクリーニング
　リグノセルロース系バイオマスの主要五炭糖であるD-キシロースに対する輸送体を同定するために以下のような実験を行った。P. stipitisの糖輸送体遺伝子を含むpPGKプラスミドを保持するKY73株を、10mLのYNBMal（マルトースを炭素源とする最小培地）で30oC・3日間培養した。これにより、培地中のマルトースは全て消費される。次に、400μLの50%D-キシロース溶液を加える（最終濃度2%）。2時間の振騰後、酵母細胞を遠心で集め氷冷した滅菌水30mLで二度洗浄する。次に、集めた酵母細胞を400μLの滅菌水に懸濁し、37oC・200rpmで1時間振騰する。これにより、導入した遺伝子によって細胞内に輸送されたD-キシロースは細胞外に排出される。上清中のD-キシロース濃度は、AminexHPX-87HカラムをつないだHPLCシステムによる示差屈折系（RI）によって同定した。
　HPLCの溶出曲線の結果を図8に示す。キシロースの細胞内輸送が確認された遺伝子は、SUT1・HGT2・SUT2・SUT3・MAL5・XUT3・SUT4であった。溶出曲線を見ると、キシロースに相当するピーク（10分）に加えてキシリトールと思われるピーク（11.7分）も確認された。これは、サッカロミセス酵母が持つXRのホモログであるGRE3によってキシロースからキシリトールが作られたためと考えられる。次に、上記7種類の遺伝子についてキシロース輸送のタイムコースを測定した（図9）。最もキシロースを輸送したのはHGT2であり、この遺伝子はキシリトールも最も多く確認された。SUT1・SUT2・SUT3がこれに続くが、これらの遺伝子のキシロース輸送能についてはWeierstallらの以前の研究で明らかとなっている。
（２）キシロース輸送体のキシロース発酵能
　主要なキシロース輸送体であるHGT2・SUT1・SUT2・SUT3についてキシロース発酵の際の性質を調べるために以下のような実験を行った。まず、KY73株に、P. stipitis由来のXRおよびXDH遺伝子、さらにサッカロミセス酵母由来のXK遺伝子をそれぞれPGKプロモーターにつないだカセットを有する酵母染色体組み込み型プラスミドpAUR-XR-XDH-XKを導入した（図10）。本プラスミドは同時に真核微生物に対して抗菌作用を示すオーレオバシジンの耐性遺伝子AUR1-Cを保持しており、サッカロミセス酵母染色体上にある対立遺伝子AURとの間で相同組み換えが起こることによってオーレオバシジン耐性をマーカーとしてXR-XDH-XK遺伝子を染色体上に安定して導入することができる。このようにして作製した株をKY73-XYLと名付ける。
次に、KY73-XYLに対して、HGT2・SUT1・SUT2・SUT3をそれぞれ保持するpPGKプラスミドを形質転換した。これにより、各遺伝子によって細胞内に取り込まれたキシロースはエタノールまで代謝されることになる。KY73-XYL株はキシロースを唯一の炭素源として生育可能であり、20g/Lキシロースを炭素源として200mLバッフルフラスコを用いて回転速度150rpmで発酵実験を行った（図11）。キシロース消費速度および生産されたエタノール濃度から、SUT1とHGT2で十分なキシロース発酵が行われていることが分かる。次にSUT1とHGT2で比較すると、SUT1はHGT2より約2倍キシロース消費が早いものの、6日後に生産されたエタノール量で見るとHGT2はSUT1の約90%に達しており両者間ではそれほど差がない。これは、SUT1がHGT2よりキシリトールが約2.9倍、グリセロールが約4.9倍も多く蓄積することで、せっかく取り込んだキシロースを効率的にエタノール変換できていないことによると考えられる。
　次に、KY73株ではなく六炭糖輸送体の欠損していないサッカロミセス酵母を用いてキシロース発酵を行った。まず、宿主酵母であるMT8-1株（MATa ade his3 leu2 trp1 ura3）に対して、上記pAUR-XR-XDH-XKプラスミドを導入した（MT8-1XYLと名付ける）。ゲノミックPCRおよび無細胞抽出液中の酵素活性により、XR・XDH遺伝子が正常に組み込まれ、またXK遺伝子活性が上昇していることを確認した。MT8-1XYL株に、pPGK・pPGK-SUT1・pPGK-SUT2・pPGK-HGT2（いずれもura3+）プラスミドを、YEpM4（leu2+）・pHV1（his3+）・pTV3（trp1+）とともにそれぞれアデニンを塗布したYNBプレート上で形質転換した（株名はプラスミドと同じとする）。それぞれの形質転換酵母を、アデニンを含むYNB最小培地でグルコースを炭素源として培養した後に、アデニンを含む20g/Lキシロースを炭素源として200mLバッフルフラスコを用いて回転速度150rpmで発酵実験を行った。その結果を図12に示す。
　コントロールであるpPGKではキシロース消費は極めて遅く、4日後で13.7g/Lが残っており、エタノール生産も全く確認できなかった。一方、SUT1とHGT2のキシロース消費量は4日後でpPGKのそれぞれ2.7倍と2.9倍であり、エタノールが3.2g/Lと2.4g/L生成された。SUT2でも多少の向上は見られたものの、SUT1・HGT2よりははるかに低かった。この結果は、KY73-XYLを用いた個々の遺伝子のキシロース発酵実験の結果とよく一致する。
実施例３：「L-アラビノース輸送体」
　D-キシロースと並びリグノセルロース系バイオマスのもう１つの主要五炭糖であるL-アラビノースに対する輸送体を同定するために以下のような実験を行った。P. stipitisの糖輸送体遺伝子のKY73株を用いた細胞内への取り込み能の測定は、D-キシロースに準じて行った。
　HPLCによる細胞内L-アラビノース濃度測定の結果を図13に示す。L-アラビノースのピークは10.8分前後に出るが、同定されたピークは11.2分前後でありこれはL-アラビニトールに相当する。これは、サッカロミセス酵母の持つGRE3がL-アラビノース還元酵素として働き、細胞内に取り込まれたL-アラビノースをL-アラビニトールに変換したためであると考えられる。L-アラビニトールのピークが確認されたP. stipitisの糖輸送体遺伝子は、XUT1・HGT2・SUT3・SUT2・SUT1・XUT3であった。次に、上記7種類の遺伝子についてL-アラビノース輸送のタイムコースを測定した（図14）。HGT2・XUT1で最も高いL-アラビノース輸送が確認された。
実施例４：「リアルタイムPCR法による遺伝子発現解析」
　これまでは、主にサッカロミセス酵母変異株KY73を用いた糖輸送体遺伝子翻訳産物の糖輸送能解析について記載してきた。一方、例えば糖輸送体遺伝子Ａが糖Ｂを輸送する能力があることとその遺伝子がP. stipitisにおける糖Ｂの代謝において機能していることは必ずしも一致しない。厳密に言えば各糖輸送体遺伝子を個別に破壊した変異株を作製し表現型を調べる必要があるが、ここでは「ある糖を基質とする輸送体遺伝子の発現はその糖を炭素源とした生育下で誘導される」という一般的知見に基づいて、各種糖を炭素源として含む各種最小培地においてP. stipitisを培養し、糖輸送体遺伝子のmRNAの量をリアルタイムPCRによって見積もることで、タンパク質としての機能と遺伝子発現の相関について比較検討した。
　リアルタイムPCRに用いる増幅プライマーの設計はPrimer3 program（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm）を用い、解析する遺伝子から100～150bpの増幅が行われるようにした。本実施例にて用いた具体的なプライマーの配列を図15に示す。P. stipitisは、炭素源としてグルコース、マンノース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、L-アラビノースD-アラビノース、L-ラムノース、マルトース、セロビオース、スクロース、ラクトース、グリセロールをそれぞれ2%(w/v)濃度で含む最少培地で好気的培養によって生育させ、対数増殖期(OD600 = 0.6～0.8)において菌体を回収し、引き続いてRNeasy(R)Mini Kit (Qiagen)によりRNA抽出を行った。抽出した100 ngのRNAを用い、PrimerScript(R) RT reagent Kit (Perfect RealTime) (TaKaRa)を用いてcDNA逆転写を行った。リアルタイムPCRによる解析は、SYBR(R)Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time) (Bio-Rad)を用いて行った。ハウスキーピング遺伝子としてアクチン遺伝子(ACT1)を用いた。
　２回行った実験の平均値の結果を図16及び17に示す。図16に示す結果には、最小培地に含まれるそれぞれの糖に対して、各種遺伝子の発現量を示している。図中のグラフの縦軸は、コントロールとして用いたハウスキーピング遺伝子であるアクチン遺伝子の発現量を１とし、それぞれの遺伝子の発現量を相対的に表したものである。図17は、図16に示すデータを各種発現遺伝子ごとにまとめたものであり、最小培地にグルコースを２％（w/v）の濃度で含む際の発現量を基にして、その他のそれぞれの糖を同じ濃度で含む最小培地で培養した際の各種遺伝子の発現量を示している。
　グルコース・マンノース・フルクトース・ガラクトースのいずれの六炭糖を含む最小培地においても、最も大量に発現していたのはこれまで六炭糖輸送体として知られていたSUT遺伝子群ではなく、上述のスクリーニングにて新たに同定されたHGT2遺伝子であった。またHGT2遺伝子の発現産物が輸送対象とできない、ガラクトースを含む最小培地での生育下でも十分に発現していることから、HGT2遺伝子は特定の糖によって誘導されるのではなく、構成的に発現している遺伝子であると考えられる。HGT2に次いで発現しているのはSUT1～4及びRGT2であり、この結果は上記のKY73株を用いた相補的生育実験とよく一致している。
　五炭糖であるキシロースについては、非特許文献１７に示すWeierstallらの結果から、キシロースの存在下においてSUT1は発現が誘導されず、SUT2又はSUT3が好気的条件下でのみ発現することが分かっている。本実施例においても好気的培養においてSUT2～4の発現量がSUT1に比べて十分に低い結果が得られており、従来の知見とよく一致する。一方で、HGT2はこのSUT2～4の2倍以上の発現が見られており、タンパク質機能解析の結果と合わせてP.stipitisの最も主要なキシロース輸送体であることが示唆される。
　次にL-アラビノースを含む最小培地での実験において、最も顕著に発現したのはHXT2.4であり、グルコースを含む最小培地での実験結果と比べて670倍も誘導がかかった。しかしこのタンパク質は（少なくともサッカロミセス酵母内では）L-アラビノース輸送能は確認できておらず、サッカロミセス酵母内での機能的発現に問題があるかもしれない。HXT2.4に次いで高い発現量を示すXUT1は、上記の実施例から十分なL-アラビノース輸送能が見られており、P. stipitisの最も主要なL-アラビノース輸送体であることが示唆される。従って、HXT2.4もL-アラビノース輸送体として関与すると考えられる。
実施例５：「キシロース・L-アラビノース共存下におけるキシロースの輸送能」
　実施例２または３に準じた方法にてHGT2を発現させたKY73株のキシロース・L-アラビノース共存下（共に2% (w/v)濃度）での輸送能を見てみると、L-アラビノース非存在下に比べてキシロースの取り込み能が約3倍に向上する（図18：A）。但し、この効果はHGT2と共にXUT1を発現させても変わらず、またHGT2及びXUT1のL-アラビノース取り込みの加算的効果も維持される（図18：B）。
　自然界においては、実験室のようにキシロース、L-アラビノース等が単独で存在することはありえず、一般にはセルラーゼ、ヘミセルラーゼ等により生じた六炭糖等とキシロース、L-アラビノース等を同時に取り込むことになる。よって、キシロース、L-アラビノース等が混在するような条件下で、HGT2、XUT1等が発現した酵母細胞が、キシロースおよびL-アラビノースの取り込みにおいて、協同的効果が見られるという上記結果は非常に好ましい。

Claims (5)

  1. ＨＧＴ２遺伝子またはその発現タンパク質のキシロース輸送体としての使用。
  2. ＨＧＴ２遺伝子、ＸＵＴ1遺伝子およびＨＸＴ２．４遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子の発現タンパク質であるキシロースおよび／またはＬ-アラビノース輸送体。
  3. ＨＧＴ２遺伝子、ＸＵＴ1遺伝子およびＨＸＴ２．４遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子のキシロースおよび／またはＬ-アラビノース輸送体としての使用。
  4. ＨＧＴ２遺伝子、ＸＵＴ1遺伝子およびＨＸＴ２．４遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を酵母に導入し、キシロースおよび／またはＬ-アラビノースを含有するバイオマスの存在下で培養することを特徴とするバイオエタノールの製造方法。
  5. キシロースおよび／またはＬ-アラビノースを含有するバイオマスが、リグノセルロースである請求項４に記載のバイオエタノールの製造方法。
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