JPWO2011027796A1 - 五炭糖輸送体 - Google Patents
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Abstract
Description
項1 HGT2遺伝子またはその発現タンパク質のキシロース輸送体としての使用。
項2 HGT2遺伝子、XUT1遺伝子およびHXT2.4遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子の発現タンパク質であるキシロースおよび/またはL-アラビノース輸送体。
項3 HGT2遺伝子、XUT1遺伝子およびHXT2.4遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子のキシロースおよび/またはL-アラビノース輸送体としての使用。
項4 HGT2遺伝子、XUT1遺伝子およびHXT2.4遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1種の遺伝子を酵母に導入し、キシロースおよび/またはL-アラビノースを含有するバイオマスの存在下で培養することを特徴とするバイオエタノールの製造方法。
項5 キシロースおよび/またはL-アラビノースを含有するバイオマスが、リグノセルロースである上記項4に記載のバイオエタノールの製造方法。
P. stipitisのゲノム配列に対して、サッカロミセス酵母のヘキソース輸送体(HXT)をプローブとしてProtein-Blastサーチを行い、約30%を下限として相同性のある遺伝子38個を選抜した。それぞれの遺伝子の5’および3’末端に適切な制限酵素部位が付加されるようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計した(図4)。制限酵素処理したcDNAは、サッカロミセス酵母の構成的発現プロモーターであるPhosphoglycerate kinase(PGK)プロモーター・ターミネーターカセットおよびマーカー遺伝子としてURA3を含むpPGKプラスミドにサブクローニングした。各プラスミドを鋳型としたPCR実験結果を図5に示す。
D-マンノース:SUT1・SUT2・SUT3・SUT4・HGT2・RGT2・XUT3・XUT1
D-フルクトース:SUT1・SUT2・XUT3・SUT3・SUT4・HGT2
D-ガラクトース・SUT1・SUT3
生育曲線を図7に示す。全体の傾向として、選抜した糖輸送体遺伝のごく一部のもののみに六炭糖輸送能があり、それはD-ガラクトースを除くグルコース・D-マンノース・D-フルクトースを同時に輸送できることが分かる。Weierstallらは、P. stipitisのグルコース輸送体遺伝子を同定する目的で、P. stipitisのゲノムライブラリをKY73とは異なるが同様の変異を有するサッカロミセス酵母の変異株Yに導入しSUT1を同定。さらにそのホモログとしてSUT2・SUT3を同定している。本実験でも、SUT1-3で最も強くKY73のヘキソース輸送能の補完が見られており、この結果とよく一致している。
(1)キシロース輸送体遺伝子のスクリーニング
リグノセルロース系バイオマスの主要五炭糖であるD-キシロースに対する輸送体を同定するために以下のような実験を行った。P. stipitisの糖輸送体遺伝子を含むpPGKプラスミドを保持するKY73株を、10mLのYNBMal(マルトースを炭素源とする最小培地)で30oC・3日間培養した。これにより、培地中のマルトースは全て消費される。次に、400μLの50%D-キシロース溶液を加える(最終濃度2%)。2時間の振騰後、酵母細胞を遠心で集め氷冷した滅菌水30mLで二度洗浄する。次に、集めた酵母細胞を400μLの滅菌水に懸濁し、37oC・200rpmで1時間振騰する。これにより、導入した遺伝子によって細胞内に輸送されたD-キシロースは細胞外に排出される。上清中のD-キシロース濃度は、AminexHPX-87HカラムをつないだHPLCシステムによる示差屈折系(RI)によって同定した。
主要なキシロース輸送体であるHGT2・SUT1・SUT2・SUT3についてキシロース発酵の際の性質を調べるために以下のような実験を行った。まず、KY73株に、P. stipitis由来のXRおよびXDH遺伝子、さらにサッカロミセス酵母由来のXK遺伝子をそれぞれPGKプロモーターにつないだカセットを有する酵母染色体組み込み型プラスミドpAUR-XR-XDH-XKを導入した(図10)。本プラスミドは同時に真核微生物に対して抗菌作用を示すオーレオバシジンの耐性遺伝子AUR1-Cを保持しており、サッカロミセス酵母染色体上にある対立遺伝子AURとの間で相同組み換えが起こることによってオーレオバシジン耐性をマーカーとしてXR-XDH-XK遺伝子を染色体上に安定して導入することができる。このようにして作製した株をKY73-XYLと名付ける。
D-キシロースと並びリグノセルロース系バイオマスのもう1つの主要五炭糖であるL-アラビノースに対する輸送体を同定するために以下のような実験を行った。P. stipitisの糖輸送体遺伝子のKY73株を用いた細胞内への取り込み能の測定は、D-キシロースに準じて行った。
これまでは、主にサッカロミセス酵母変異株KY73を用いた糖輸送体遺伝子翻訳産物の糖輸送能解析について記載してきた。一方、例えば糖輸送体遺伝子Aが糖Bを輸送する能力があることとその遺伝子がP. stipitisにおける糖Bの代謝において機能していることは必ずしも一致しない。厳密に言えば各糖輸送体遺伝子を個別に破壊した変異株を作製し表現型を調べる必要があるが、ここでは「ある糖を基質とする輸送体遺伝子の発現はその糖を炭素源とした生育下で誘導される」という一般的知見に基づいて、各種糖を炭素源として含む各種最小培地においてP. stipitisを培養し、糖輸送体遺伝子のmRNAの量をリアルタイムPCRによって見積もることで、タンパク質としての機能と遺伝子発現の相関について比較検討した。
実施例2または3に準じた方法にてHGT2を発現させたKY73株のキシロース・L-アラビノース共存下(共に2% (w/v)濃度)での輸送能を見てみると、L-アラビノース非存在下に比べてキシロースの取り込み能が約3倍に向上する(図18:A)。但し、この効果はHGT2と共にXUT1を発現させても変わらず、またHGT2及びXUT1のL-アラビノース取り込みの加算的効果も維持される(図18:B)。
Claims (5)
- HGT2遺伝子またはその発現タンパク質のキシロース輸送体としての使用。
- HGT2遺伝子、XUT1遺伝子およびHXT2.4遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子の発現タンパク質であるキシロースおよび/またはL-アラビノース輸送体。
- HGT2遺伝子、XUT1遺伝子およびHXT2.4遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子のキシロースおよび/またはL-アラビノース輸送体としての使用。
- HGT2遺伝子、XUT1遺伝子およびHXT2.4遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1種の遺伝子を酵母に導入し、キシロースおよび/またはL-アラビノースを含有するバイオマスの存在下で培養することを特徴とするバイオエタノールの製造方法。
- キシロースおよび/またはL-アラビノースを含有するバイオマスが、リグノセルロースである請求項4に記載のバイオエタノールの製造方法。
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