WO2011018545A2 - Modelo humanizado de psoriasis - Google Patents

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Marta Carretero Trillo
Marta GARCÍA DIEZ
José Luis JORCANO NOVAL
Fernando Larcher Laguzzi
Marcela Del Rio Nechaevsky
Álvaro MEANA INFIESTA
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Centro De Investigaciones Energéticas, Medioambientales Y Tecnológicas (Ciemat)
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Definitions

  • the present invention is within the field of biotechnology and refers to a method for inducing a psoriatic phenotype in a non-human mammal, the animal model of psoriasis obtainable by said method and its use for the identification and evaluation of the efficacy of new treatments
  • Psoriasis is a disease widely spread around the world, and affects about 2% of the population, although its distribution is not homogeneous. It is a disease characterized by the appearance of papule-squamous plaques of red color and covered by scales. They are found to a greater extent in areas of the organism subject to high friction, such as the external part of the knees and elbows or the lumbosacral area. In addition, there is usually the Koebner phenomenon, which is characterized by the appearance of plaques in areas under pressure or suffering from trauma.
  • T lymphocytes the elements with the greatest importance in the induction and progression of the inflammation underlying the disease.
  • Th1 / Th2 imbalance the elements with the greatest importance in the induction and progression of the inflammation underlying the disease.
  • Th1 / Th2 imbalance the elements with the greatest importance in the induction and progression of the inflammation underlying the disease.
  • activated T cells are, in part, responsible for the phenotypic changes observed in psoriatic skin.
  • type 1 cells seem to play a role fundamental in the pathogenesis of psoriasis (Schlaak et al. 1994.
  • TM 7 Another subpopulation of T cells, called TM 7, has recently been characterized as a distinct subpopulation of the subpopulations of TM and Th2 cells. Initially it was reported that these cells played important roles in the immunopathology of different experimental models of autoimmune mice (experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE); collagen-induced arthritis (CIA)) (Cua et al. 2003 Nature; 421: 744-748; Murphy et al. 2003. J Exp Med; 198: 1951-1957) and more recently have been identified in several human pathological conditions (contact dermatitis (RA), Crohn's disease (CD) and psoriasis) (Albanesi et al.
  • EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
  • CIA collagen-induced arthritis
  • the first approach that was carried out was the use of animals that presented spontaneous mutations and showed a phenotype with some characteristics similar to the phenotype of psoriasis in humans.
  • An example is the use of mice with scaly skin
  • mice had hyperproliferation and inflammatory infiltrate, as well as an increase of the vascularization of the zone.
  • Tc7 fsn / fsn Ttc7 (Beamer et al Blood 1995; 86:. 3220-3226), which had hyperproliferation and inflammatory infiltrate, as well as an increase of the vascularization of the zone.
  • These mice had a disadvantage that these characteristics were independent of T cells, and that in addition the antipsoriatic treatments useful in humans, did not show efficacy against said elements, demonstrating that the mechanisms involved should be different.
  • this phenotype was very complex and presented characteristics that differed from the human psoriatic phenotype, so that this animal model did not allow reproducing the disease in its entirety.
  • T were involved in the triggering and development of psoriasis (Snowden and Heaton. 1997. Br J Dermatol; 137: 130-132).
  • Another study model used today is skin xenotransplantation. This consists of transferring skin affected by psoriasis to immunodeficient animals, together with the injection of autologous lymphocytes, which allows the incorporation into the animal model of all the elements (both genetic and phenotypic) of psoriasis. This approach presents some problems such as the need to obtain large amounts of psoriatic skin for transplants.
  • a psoriatic phenotype is generated with characteristics more similar to the disease in humans than the previously described models, although it does not reflect the totality of the elements present in the disease.
  • the present invention relates to a method for inducing a psoriatic phenotype in a non-human mammal, to the animal model of psoriasis obtainable by said method and to its use for the identification and evaluation of the efficacy of new treatments.
  • Psoriasis is a complex multifactorial disease that, in order to be studied, needs to have an animal model that reproduces its characteristics and allows the analysis of the various elements that participate in its generation and development.
  • the present invention offers a solution to the generation of a suitable model for the multifactorial study of psoriasis by means of the reproduction, in an animal, of an immunological and epidermal environment similar to that present in human disease.
  • a method for the generation of a psoriatic phenotype in animals is described, which can be useful for the study of the disease since it reproduces in the animal the typical characteristics of the disease in humans such as epidermal hyperproliferation, elongation and fusion of the interpapillary epidermal ridges, focal acanthosis, parakeratosis, partial loss of the granular stratum, dermal inflammatory infiltrate and increased vascularization of the region.
  • the authors in the present invention demonstrate that the performance of the steps independently or the combination of any of them does not faithfully reproduce all the features of psoriasis. Therefore, all the steps are essential to generate a useful model of psoriasis study.
  • the process is initiated by grafting cutaneous equivalents or human dermo-epidermal substitutes generated by tissue engineering.
  • cutaneous equivalents or human dermo-epidermal substitutes generated by tissue engineering.
  • tissue engineering Through the use of human skin equivalents a better reproduction of psoriasis since the disease does not occur in nonhuman animals naturally. It also allows a better analysis of the resulting phenotype.
  • activated T lymphocytes of the TM subpopulation are applied intradermally, which have been shown to be involved in the onset, development and maintenance of the disease.
  • cytokines produced by the other subpopulation of T lymphocytes involved in the development of the disease Th17 subpopulation
  • a first aspect of the present invention refers to a method (from now on, method of the invention) to induce a psoriatic phenotype in a non-human mammal comprising: a) Performing a graft of a skin equivalent human, in the non-human mammal,
  • step b) Administer intradermally in the grafted equivalent of step a) simultaneously or sequentially:
  • psoriatic phenotype in the present invention that phenotype that presents characteristics similar to the disease of psoriasis in humans and that is characterized by presenting epidermal hyperproliferation, elongation and fusion of interpapillary epidermal ridges, focal acanthosis, parakeratosis, partial loss of the stratum granular, dermal inflammatory infiltrate and increased vascularization of the region.
  • phenotype is understood as those observable characteristics in an organism, which are determined by its genetic constitution and the environment in which it lives and develops.
  • tissue engineering is understood as the use of a combination of cells, biochemical factors and / or materials depending on their biochemical and physicochemical characteristics for the generation of tissues capable of partially or totally replacing some tissue of a tissue organism.
  • animal means any organism of the Eukaryota superreino and Metazoa kingdom.
  • mammal is used to refer to any organism of the Eukaryota super kingdom, Metazoa kingdom, Chordata phylum, Craniata subphylum, Gnathostomata superclass and Mammalia class.
  • human mammal refers to organisms of the Eukaryota super kingdom, Metazoa kingdom, phylum Chordata, Craniata subphylum, Gnathostomata superclass, Mammalia class, Primates order, Hominidae family, Homo genus and Homo sapiens species.
  • the realization of the tape-stripping technique has the function of breaking the barrier function of the skin.
  • the adhesion and removal of the adhesive tape is carried out at least 5 times. In a more preferred embodiment of this aspect of the invention, the adhesion and removal of the adhesive tape is carried out at least 10 times. In an even more preferred embodiment of this aspect of the invention, the adhesion and removal of the adhesive tape is carried out at least 15 times.
  • the equivalent of human skin has an adequate evolution within the host organism. For this, the vascularization and innervation of the grafted region must be produced. In addition, it is necessary that graft-host rejection does not occur. Therefore, it is advisable to use immunodeficient animals for the generation of the model. In addition, these immunodeficient individuals allow a better performance of the administered T lymphocytes and a better development of the psoriatic phenotype. Therefore, in another preferred embodiment of this aspect of the invention the non-human mammal is immunodeficient.
  • an immunodeficient individual is understood as an organism that presents deficiencies in the immune response characterized by a numerical and / or functional decrease of T lymphocytes. and / or B, and therefore is not able to reject xenotransplants (transplants from one species to another).
  • these equivalents are normally composed of a dermal matrix formed by one or more elements of the list comprising, but not limited to, collagen, hyaluronic acid and / or fibrin, and together, on or within which one or more cell types of The list comprising, but not limited to, keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells and / or fibroblasts.
  • the most abundant cells, and of greater relevance in the generation of these skin equivalents are the keratinocytes in the epidermis and the fibroblasts in the dermal region.
  • the equivalent is formed by a fibrin matrix, which contains human fibroblasts and keratinocytes.
  • fibroblasts and keratinocytes from both healthy individuals, without psoriasis, and from individuals with psoriasis, are capable of producing the psoriatic phenotype by carrying out the method of the invention. Therefore, in a preferred embodiment of this aspect of the invention, the fibroblasts and keratinocytes of the human skin equivalent come from a psoriasis patient. In another preferred embodiment, the fibroblasts and keratinocytes of the human skin equivalent come from a healthy individual, without psoriasis.
  • the lymphocytes that are really involved are the T lymphocytes, and more specifically those belonging to the Th1 and Th17 subpopulations. These subpopulations are defined by the profile of cytokines that produce and give rise to various immune responses.
  • the TM subpopulation is characterized by the secretion of interferon- ⁇ and interleukin-2, and the presence of the CCR5 cytokine receptor.
  • the subpopulation of Th 17 lymphocytes is characterized by the expression of interleukin-17 and interleukin-22.
  • the application of T lymphocytes of the TM subpopulation is necessary, and at least two cytokines generated by the other lymphocyte subpopulation involved, Th17 lymphocytes intradermally in the graft accomplished.
  • the cytokines produced by the Th17 lymphocytic subpopulation that have been shown to be more important in the evolution of psoriasis without the interleukins IL-17 and IL-22.
  • the administration of interleukin-22 together with the rest of the steps already generates a hyperproliferative model useful for its study.
  • the administration in addition to IL-17 generates a more complete model of psoriasis. Therefore, in a preferred embodiment of this aspect of the invention, the cytokines that are administered are interleukin-22, and interleukin-17.
  • the non-human mammal is a rodent.
  • the mammal is a mouse.
  • the Immunodeficient mice most commonly used in experimentation are those that are either nude mice, which have thymic aplasia, and therefore have deficiencies in lymphocyte development, or are mice that have severe combined immunodeficiency (SCID).
  • SCID mice non-obese diabetic mice with severe combined immunodeficiency
  • NMRI Foxn1 nu mice are mice that have thymic aplasia due to deficiencies in the development of the thymic epithelium. Due to this deficiency in thymic development, they have deficiencies in the generation of immune cells and therefore also have a diminished immune response. Therefore, in an even more preferred embodiment of the present invention, the mouse used is an immunodeficient mouse NMRI Foxn1 nu or NOD-SCID.
  • Another aspect of the present invention refers to the animal model generated by the method of the invention.
  • the animal model generated by presenting the characteristics of psoriasis in humans has a high utility both for the study of the disease, and for the search for treatments aimed at the attenuation of symptoms or the cure of the disease. This, aimed at improving the quality of life of people, clearly justifies the possible suffering produced in the animal for the generation of the model. Therefore, another aspect of the invention refers to the use of the model generated by the method of the invention for the identification of a compound or composition for the prevention or treatment of psoriasis. Another aspect of the invention refers to the use of the model to evaluate the efficacy of a preventive or therapeutic treatment against psoriasis.
  • Fig. 1 Schematic diagram of the experimental design for the generation of the animal model of psoriasis.
  • Fig. 2. Flow cytometric analysis of subpopulations of differentiated T lymphocytes in vitro.
  • PBLs peripheral blood or peripheral blood lymphocytes lymphocytes
  • the cells were cultured for 6 days under these conditions (TO), and IL-12 and anti-IL-4 were added to the culture (T1) to induce differentiation.
  • Flow cytometric analyzes were performed on the sixth day of differentiation.
  • A) Dot plots representative of surface markers in differentiated TO and T1 subpopulations in vitro.
  • B) Dot plots of intracellular cytokine staining patterns. The percentages are relative to the proportion of positive cells defined by the binding of control antibodies.
  • Fig. 3 Histological analysis of the human skin regenerated after the administration of lymphocytes and cytokines. Hematoxylin / eosin staining was carried out in sections, fixed in formalin and included in paraffin, of human grafts that were injected intradermally with lymphocytes differentiated from the TM subpopulation, and / or with recombinant IL-22 and IL-17. Tape-stripping (TS) was performed where indicated. Areas of hypogranulosis (HG) and parakeratosis (PK) were observed when the graft was injected with recombinant cytokines together with T lymphocytes and tape-stripping was applied. The arrows indicate the presence of dilated capillaries in the dermis (BV).
  • BV dermis
  • Fig. 4 Proliferative response to dermal injection and / or tape stripping in regenerated human skin.
  • the formalin-fixed sections were stained for the Ki-67 proliferation marker.
  • the proliferation index was calculated by the percentage of positive nuclei for Ki-67 per 100 nuclei of the basal layer, in several randomly selected areas.
  • Fig. 5 Immunohistochemical analysis of epidermal markers.
  • Fig. 7 Immunofluorescence analysis of the angiogenic tissue reaction. The double immunofluorescence analysis for the specific antigen of endothelial cells CD31 and the intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) is shown.
  • EXAMPLE 1 Experimental design for the generation of a humanized skin model with psoriatic phenotype.
  • T1 lymphocytes were obtained from peripheral blood from in vitro polarization directed by cytokines. These immune cells were reintroduced into the skin mature of a mouse model of humanized skin by intradermal injection together with the recombinant cytokines of the Th17 IL-17 and IL-22 subpopulation.
  • the humanized skin mouse model was generated by obtaining keratinocytes and fibroblasts by enzymatic digestion of a human skin biopsy of both a psoriatic patient ( Figure 1A) and a healthy donor ( Figure 1 B).
  • the cells were amplified in culture and assembled in a fibrin-based organotypic culture that was grafted onto the back of immunodeficient mice by a system previously characterized in our laboratory (Del Rio et al. 2002. Hum Gene Ther, 13: 959-968 ; Llames et al. 2004. Transplantation; 77: 350-355).
  • This system allows to obtain a large number of grafted mice with a significant area of skin from a single donor, being one of the main advantages of this model compared to other humanized models such as xenotransplantation (Boehcke et al. 1996. Nature ; 379: 777; Wrone-Smith and Nickoloff 1996. J Clin Invest; 98: 1878-1887).
  • the skin's barrier function was compromised using the tape-stripping technique, a well-characterized procedure to remove the superficial layers of the stratum corneum and that produces hyperproliferation without severe inflammation (Ahn et al. 1999. J Invest Dermatol; 113: 189 -195).
  • EXAMPLE 2 In vitro differentiation of subpopulations of T1 cells. The authors differentiated T cells in vitro to a type 1 phenotype by cytokine-directed activation and polarization. To this end, PBLs (peripheral blood lymphocytes) from psoriatic patients or healthy donors and obtained by density gradient separation were activated, using a combination of CD3 / CD28 antibodies conjugated with magnetic beads in the presence of IL-2. Differentiation to Th 1 and Th2 is controlled by IL-12 (p35-p40) and IL-4, respectively. Additionally, it is known that these cytokines inhibit the generation of the opposite Th subset.
  • PBLs peripheral blood lymphocytes
  • CD3 / CD28 antibodies conjugated with magnetic beads in the presence of IL-2.
  • Differentiation to Th 1 and Th2 is controlled by IL-12 (p35-p40) and IL-4, respectively. Additionally, it is known that these cytokines inhibit the generation of the opposite Th subset.
  • the authors used a well established procedure to obtain Th1 polarization directed by cytokines, culturing activated T lymphocytes for 6 days in the presence of IL-12 and anti-IL-4.
  • TO cells corresponded to activated T lymphocytes in culture in the presence of IL-2 only.
  • the proportion of CD3 + cells varied from 70% to 90% depending on the donor, with a CD4: CD8 ratio of 1, 2-1, 8.
  • the activation status was evaluated by expression on the cell surface of CD25 (IL-2R ⁇ ), HLA-DR and CD69.
  • the FAC profiles corresponding to a healthy donor are shown in Figure 2A. In this case and after 6 days of culture, a high percentage of CD4 + cells also expressed CD25 (66.61% of CD4 + T1 cells vs.
  • CD4 + TO cells 73.61% of CD4 + TO cells.
  • the proportion of CD8 + cells that jointly expressed CD25 was lower (44.71% of CD8 + T1 cells vs. 54.49% of CD8 + TO cells).
  • a high proportion of cells expressed HLA-DR under TO or T1 polarization conditions 78.64% of CD8 + T1 cells vs. 91.61% of CD8 + TO cells and 71, 82% of CD4 + T1 cells vs. 74.06% of CD4 + TO cells.
  • the early activation marker showed low levels of expression, especially under Th1 polarization conditions (6.61% of CD4 + and 2.60% of CD8 + in T1 cells vs.
  • EXAMPLE 3 Intradermal injection of differentiated T1 lymphocytes and recombinant cytokines in the humanized skin model. Histological analyzes showed that the injection of T1 lymphocytes together with recombinant IL-22 and tape-stripping induced the typical epidermal changes associated with psoriasis, including elongation and fusion of interpapillary ridges, focal acanthosis, parakeratosis and partial loss of the granular layer. . The dermis is characterized by a mild inflammatory infiltrate and an increase in vascularization with the presence of dilated capillaries.
  • the positive cells were not restricted to the basal layer, but included suprabasal cells ( Figure 4).
  • Some of the anomalies found in the psoriatic lesions were identified by immunohistochemical analysis of some markers of the differentiation of keratinocytes (expression of implicacrine, loricrin and keratin).
  • the simultaneous injection of T1 cells plus the recombinant cytokines IL-22 and IL-17 in the skin grafts together with tape-stripping is the condition that most closely resembles the immunohistochemical features of human psoriasis.
  • the entacrine appears to be overexpressed, while the expression of loricrin was reduced in the areas where the generation of a well differentiated granular layer was impeded.
  • Keratin K1 expression was also disturbed with a focal inhibition of its expression, while a clear overexpression of K6 and K17 coincided with the presence of a hyperproliferative epidermis using this condition.
  • the expression of the S100A7 antimicrobial protein (psoriasin) was also induced ( Figures 5A and B).
  • the immunofluorescence with CD31 showed the presence of dilated capillaries in the dermis of humanized skin grafts injected simultaneously with IL-22 and IL-17 plus Th1 in the presence of tape stripping, and this correlates with an increased expression of ICAM-1 in the vessels (Figure 7).
  • Table 1 Psoriatic patients participating in the study.
  • Peripheral blood was used from both psoriatic patients and HIV-seronegative donors (provided by the Transfusion Center,
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • PBMC Peripheral Blood Mononuclear CeIIs
  • Ficoll-Hypaque density gradient Pulcoll-Hypaque density gradient
  • the cells were cultured in RPMI 1640, supplemented with 10% thermally inactivated fetal bovine serum (FCS) and stimulated with
  • IL-12 was also added to the culture.
  • Th1 cells were obtained by negative selection of these cultures using the CD4 + T lymphocyte isolation kit from Miltenyi Biotec (Auburn, CA).
  • a phenotype analysis of lymphocyte subpopulations was performed, before and after the expansion of T cells, by flow cytometry (FCM) using an EPICS cytofluorimeter (Beckman Coulter, Fullerton, AC).
  • FCM flow cytometry
  • the cells were cultured, washed and suspended in phosphate buffered saline and 1% bovine serum albumin (Sigma-Aldrich). Aliquots (2x10 5 cells) were incubated in the dark at 4 ° C (30 minutes) with conjugated monoclonal antibodies and washed (human monoclonal antibodies against CD3, CD4, CD8, CD25, CD69, HLA-DR (Becton, Dickinson and Company, San Jose, CA)).
  • the non-specific fluorescence was determined using monoclonal anti-isotype antibodies.
  • monensin GolgiStop from Pharmingen
  • monensin GolgiStop from Pharmingen
  • the cells were fixed in 4% paraformaldehyde for 10 minutes and permeabilized with 0.1% saponin. .
  • the keratinocyte seeding medium was a 3: 1 mixture of Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) and H12 F12 (GIBCO-BRL) containing 10% fetal bovine serum (FCS), 0.1 nM choleric toxin, 2 nM triiodothyrosine (T3), 5 Dg / ml insulin, 0.4 Dg / ml hydrocortisone and 10 ng / ml of EGF (Sigma, St Louis, MO).
  • DMEM Dulbecco Modified Eagle Medium
  • FCS fetal bovine serum
  • T3 fetal bovine serum
  • T3 triiodothyrosine
  • T3 triiodothyrosine
  • Primary fibroblasts were grown on plastic in DMEM containing 10% FCS. Cells were grown at 37 0 C in humidified atmosphere containing 5% CO2. The culture medium was changed every 2 days.
  • NMRI-Foxn1 nu mice (6-8 weeks old) (Elevage Janvier, Le Genest Saint IsIe, France) were used. The mice were housed during the experiment in the Installation of Laboratory Animals of CIEMAT (Spanish registration number 28079-21A) in pathogen-free conditions using individually ventilated NL type cages with micro-insulators, with a maximum of six mice per cage, with 25 air changes per hour and with soft wood briquettes thermally treated as a bed. All experimental procedures were carried out in accordance with Spanish and European legislation, and according to the regulations for the protection and use of animals in scientific research. The procedures were approved by the Ethics Committee of Animal Experimentation of the authors in accordance with all internal and external biosafety and bioethics guidelines. Equivalents of human skin designed by tissue engineering and grafting
  • the biodesigned human skin equivalent is based on the use of living fibroblasts contained in a fibrin matrix as a dermal component (Meana et al. 1998. Burns; 24: 621-630). For its generation, 1.5 ml of fibrinogen solution (from blood of cryoprecipitated pig) at 5 ml of keratinocyte growth medium containing 2.5 x 10 5 of dermal fibroblasts and 250 IU of bovine aprotinin (Trasylol; Bayer, West Haven, Connecticut). Immediately afterwards, 0.5 ml of 0.025 mM C ⁇ Ca was added, with 5.5 IU of bovine thrombin (Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO).
  • the antibodies were used at final dilutions of 1: 500 and 1: 300 for the anti-keratin antibodies 1 and 17, respectively (Sigma Aldrich), 1: 1000 for the monoclonal anti-keratin antibody 6 (clone LHK6B, Neomarkers, Fremont, CA), 1: 2000 for the polyclonal anti-loricrin antibody (Babeo, Richmond, CA) and 1: 50 for the anti-myeloperoxidase antibody (MPO) (HyCuIt biotechnology bv, Uden, The Netherlands).
  • MPO anti-myeloperoxidase antibody
  • the cell proliferation was evaluated by immunoperoxidase detection of the Ki-67 antigen using a rabbit monoclonal antibody (Clone SP6, Neomarkers).
  • the biotinylated secondary antibodies specific to each case were obtained from Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA). All immunoperoxidase stains were performed with standard procedures using the Vectastain ABC kit (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). The sections were counterstained with hematoxylin and dehydrated in an aqueous solution containing increasing percentages of ethanol. Finally, the slides were incubated 15 minutes in histoclear (National Diagnostic, Atlanta, GA) and mounted. Images were taken with an Olympus Bx41 microscope with digital camera.
  • Immunofluorescence analyzes were performed in 8-10 Dm cryostat sections that were obtained from tissue regions adjacent to those mentioned in the previous paragraph and that were embedded in OCT (optimal cutting temperature) (TissueTek) medium. To analyze the vascular density, sections fixed in cold acetone were used. The slides were incubated with an anti-CD31 monoclonal antibody (PECAM-1) (clone MEC 13.3, Pharmingen) diluted 1: 100. Double immunofluorescence was performed with a polyclonal anti-ICAM-1 antibody diluted 1: 50 (Santa Cruz Biotech, Santa Clara, CA). Consecutive sections were stained with the polyclonal anti-CD3D antibody (Dako, Glostrup, Denmark). Secondary antibodies coupled to FITC or Texas Red were purchased from Jackson ImmunoResearch Laboratories.

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Abstract

La presente invención se refiere a un nuevo modelo animal humanizado de psoriasis. Dicho modelo se genera mediante el injerto de equivalentes de piel humanizada en el animal, la inyección de linfocitos T y citoquinas implicadas en la generación de la enfermedad en humanos, y la realización de la técnica de tape-stripping para generar un daño en dichos equivalentes injertados. Dicho modelo puede ser utilizado para el estudio de la enfermedad así como para la identificación y evaluación de la eficacia de compuestos frente a dicha enfermedad.

Description

Modelo humanizado de psoriasis
La presente invención se encuentra dentro del campo de Ia biotecnología y se refiere a un método para inducir un fenotipo psoriático en un mamífero no humano, al modelo animal de psoriasis obtenible por dicho método y a su uso para Ia identificación y evaluación de Ia eficacia de nuevos tratamientos.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La psoriasis es una enfermedad ampliamente extendida alrededor del mundo, y afecta a alrededor del 2% de Ia población, aunque su distribución no es homogénea. Se trata de una enfermedad caracterizada por Ia aparición de placas pápulo-escamosas de color rojo y cubiertas por escamas. Se encuentran en mayor medida en zonas del organismo sometidas a una alta fricción como, por ejemplo, Ia parte externa de rodillas y codos o Ia zona lumbosacra. Además, se suele dar el fenómeno de Koebner, que se caracteriza por Ia aparición de placas en zonas sometidas a presión o que sufren algún trauma.
En cuanto a su etiología, cada vez existen un mayor número de indicios que apuntan hacia un origen multifactorial de Ia enfermedad. Esta parece estar determinada por elementos tanto genéticos como ambientales, así como por factores inmunológicos y epidérmicos. Dentro del componente inmunológico se ha demostrado que los elementos con una mayor importancia en Ia inducción y progresión de Ia inflamación subyacente a Ia enfermedad, son los linfocitos T. Existe una estrecha relación entre el desequilibrio Th1/Th2 y Ia aparición de ciertas enfermedades autoinmunes. Está bien documentado que las células T activadas son, en parte, responsables de los cambios fenotípicos observados en Ia piel psoriática. Entre ellas, las células de tipo 1 parecen jugar un papel fundamental en Ia patogénesis de Ia psoriasis (Schlaak et al. 1994. J Invest Dermatol; 102: 145-149). Otra subpoblación de células T, denominada TM 7, se ha caracterizado recientemente como una subpoblación distinta de las subpoblaciones de células TM y Th2. Inicialmente se informó de que estas células desempeñaban papeles importantes en Ia inmunopatología de diferentes modelos experimentales de ratón autoinmune (encefalomielitis autoinmune experimental (EAE); artritis inducida por colágeno (CIA)) (Cua et al. 2003 Nature; 421 :744-748; Murphy et al. 2003. J Exp Med; 198:1951-1957) y más recientemente se han identificado en varias dolencias patológicas humanas (dermatitis de contacto (RA), enfermedad de Crohn (CD) y psoriasis) (Albanesi et al. 1999. J Immunol; 162: 494-502; Aarvak et al. 1999. J Immunol; 162: 1246-1251 ; Annunziato et al. 1999. J Leukoc BIoI; 65: 691-699; Lowes et al. 2008. J Invest Dermatol; 128: 1207-1211 ). En consecuencia, varios autores han descrito el perfil característico de las citoquinas de las subpoblaciones Th1/Th17, producido por las células T presentes en una placa psoriática, Io que proporciona grandes cantidades de IL-2, IFN-γ, IL- 22 e IL-17 y poco o nada de IL-4 y IL-10 (Schlaak et al. 1994. J Invest Dermatol; 102: 145-149; Austin et al. 1999. J Invest Dermatol; 113: 752- 759; WoIk et al. 2004. Eur J Immunol 36: 1309-1323; Blauvelt, 2008. J Invest Dermatol; 128: 1064-1067; Lowes et al. 2007. Nature; 445: 866- 873 y Nickoloff et al. 2007. Clin Dermatol; 25: 568-573).
Por otro lado, varios estudios (Sano et al. 2005. Nat Med; 11 : 43-49; Zenz et al. 2005. Nature; 137: 369-375; Danilenko. 2008. Vet Pathol; 45: 563-
575) demostraron evidencias concluyentes que indican que las rutas de señalización alteradas en los queratinocitos podrían tener un papel fundamental en Ia patogénesis de Ia enfermedad. Adicionalmente, estudios recientemente publicados de amplia asociación con el genoma revelaron que una función de barrera comprometida actúa como un factor clave en Ia susceptibilidad a Ia psoriasis (Zhang et al. 2009. Nat Genet; 41 : 205-210; de Cid et al. 2009. Nat Genet; 41 : 211-215).
A pesar de todo esto existe un gran desconocimiento respecto a esta enfermedad. Este desconocimiento se debe fundamentalmente a Ia dificultad para encontrar un modelo animal adecuado que reproduzca fielmente las características de Ia enfermedad, ya que ésta solo se da en humanos, y su generación en animales de experimentación es deficiente.
Esta incapacidad de recrear de manera fehaciente Ia enfermedad humana en modelos animales radica fundamentalmente en las diferencias arquitectónicas y funcionales entre Ia piel de humanos y otros animales.
La primera aproximación que se llevó a cabo fue el uso de animales que presentaban mutaciones espontáneas y mostraban un fenotipo con algunas características similares al fenotipo de Ia psoriasis en el ser humano. Un ejemplo es el uso de ratones con piel escamosa
(Ttc7fsn/Ttc7fsn) (Beamer et al. 1995. Blood; 86: 3220-3226), los cuales presentaban hiperproliferación e infiltrado inflamatorio, así como un aumento de Ia vascularización de Ia zona. Estos ratones presentaban como desventaja que estas características eran independientes de células T, y que además los tratamientos antipsoriáticos de utilidad en humanos, no mostraban eficacia contra dichos elementos, demostrando que los mecanismos implicados debían ser diferentes. Por otro lado, este fenotipo era muy complejo y presentaba características que diferían del fenotipo psoriático humano, por Io que este modelo animal no permitía reproducir Ia enfermedad en su totalidad.
Otros modelos utilizados para el estudio de Ia enfermedad han sido los animales genéticamente modificados. Existen modelos con alteraciones, por ejemplo, en TGF-β (Li et al. 2004. EMBO J; 23: 1770-1781 ), STAT-3 (Sano et al. 2005. Nat Med; 11 : 43-49), o VEGF (Xia et al. 2003. Blood; 102: 161-168). Mediante estos modelos animales se ha podido estudiar el papel de estos factores en el trastorno psoriático, pero en general de forma independiente, y no en un contexto adecuado. Esto supone una limitación ya que esta enfermedad es multifactorial y, por Io tanto, el estudio independiente de cada factor no conduce a resultados aplicables a Ia enfermedad en humanos, aunque contribuye a desentrañar los complejos mecanismos moleculares subyacentes a Ia patología. Dentro de estos modelos genéticos, también se engloban modelos con alteraciones en citoquinas como IL-12 o IL-23 (Kopp et al. 2001. J Invest Dermatol; 117: 618-626; Kopp et al. 2003. J immunol; 170: 5438-5444) que han servido para comprender, al menos parcialmente, Ia implicación de las mismas en el desarrollo de Ia enfermedad. Esto ha aportado algo de luz sobre el origen, y mecanismos de acción de Ia enfermedad. A pesar de ello, esta aproximación tampoco ofrece todos los datos necesarios para el conocimiento del complejo desarrollo de Ia patología.
Por otro lado, teniendo en cuenta Ia supuesta implicación del sistema inmune en el desarrollo de Ia enfermedad, también se han desarrollado otros modelos para tratar de dilucidar esta implicación. Para ello, se han realizado también diversas aproximaciones como, por ejemplo, el trasplante de médula ósea de un individuo psoriático a un individuo inmunodeprimido. Esto produjo lesiones en Ia piel del individuo receptor, las cuales presentaban un fenotipo semejante al psoriático. Esto determinó que los linfocitos T derivados del donante, eran responsables de Ia inducción de fenotipos psoriatiformes y, por tanto, que los linfocitos
T estaban implicados en el desencadenamiento y desarrollo de Ia psoriasis (Snowden and Heaton. 1997. Br J Dermatol; 137:130-132). Otro modelo de estudio utilizado en Ia actualidad es el xenotrasplante de piel. Éste consiste en transferir piel afectada por psoriasis a animales inmunodeficientes, junto con Ia inyección de linfocitos autólogos, Io que permite Ia incorporación al modelo animal de todos los elementos (tanto genéticos como fenotípicos) de Ia psoriasis. Esta aproximación presenta algunos problemas como es Ia necesidad de obtener grandes cantidades de piel psoriática para los trasplantes.
En Ia actualidad se han desarrollado algunos otros modelos que aunan en un mismo individuo varios de los elementos presentes en Ia psoriasis, y que por Io tanto, arrojan unas mejores condiciones para el estudio de esta enfermedad. Tal es, por ejemplo, el modelo de ratón inmunodeficiente, al cual se Ie administran a linfocitos T e interleuquina-12 (WO0034459A1 ).
De esta forma se genera un fenotipo psoriático con características más parecidas a Ia enfermedad en humanos que los modelos previamente descritos, si bien no refleja Ia totalidad de los elementos presentes en Ia enfermedad.
Por Io tanto, se ha tratado de generar un modelo animal que fuese útil para el estudio de Ia enfermedad y presentase todas las características del fenotipo psoriático en humanos mediante distintos mecanismos. Por desgracia, y a pesar de las múltiples aproximaciones que se han realizado, hasta Ia fecha no se ha conseguido este objetivo. Por tanto, se hace necesaria Ia consecución de un modelo que reproduzca fielmente las características de Ia psoriasis en humanos en modelos animales para poder hacer un estudio en profundidad de los diversos factores implicados en Ia patogénesis, las relaciones entre ellos, así como analizar
Ia utilidad y capacidad para prevenir o tratar Ia enfermedad de diversos compuestos.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para inducir un fenotipo psoriático en un mamífero no humano, al modelo animal de psoriasis obtenible por dicho método y a su uso para Ia identificación y evaluación de Ia eficacia de nuevos tratamientos.
La psoriasis es una enfermedad multifactorial compleja, que para poder ser estudiada, necesita disponer de un modelo animal que reproduzca sus características y permita el análisis de los diversos elementos que participan en su generación y desarrollo.
La presente invención ofrece una solución a Ia generación de un modelo adecuado para el estudio multifactorial de Ia psoriasis mediante Ia reproducción, en un animal, de un entorno inmunológico y epidérmico similar al presente en Ia enfermedad en humanos.
En Ia presente invención se describe un método para Ia generación de un fenotipo psoriático en animales, que puede ser útil para el estudio de Ia enfermedad ya que reproduce en el animal las características típicas de Ia enfermedad en humanos como son hiperproliferación epidérmica, elongación y fusión de las crestas epidérmicas interpapilares, acantosis focal, paraqueratosis, pérdida parcial del estrato granuloso, infiltrado inflamatorio dérmico y aumento de Ia vascularización de Ia región. Los autores en Ia presente invención demuestran que Ia realización de los pasos de forma independiente o Ia combinación de alguno de ellos, no reproduce fielmente todas las características de Ia psoriasis. Por Io tanto, todos los pasos son imprescindibles para generar un modelo útil de estudio de psoriasis.
El proceso se inicia mediante el injerto de equivalentes cutáneos o sustitutos dermo-epidérmicos humanos generados por ingeniería de tejidos. Mediante el uso de equivalentes de piel humana se permite una mejor reproducción de Ia psoriasis ya que Ia enfermedad no se da en animales no humanos de forma natural. Además permite un mejor análisis del fenotipo resultante. Posteriormente, se aplican de forma intradérmica en este injerto linfocitos T activados de Ia subpoblación TM , que han demostrado estar implicados en el inicio, desarrollo y mantenimiento de Ia enfermedad. También se aplican intradérmicamente, en Ia zona injertada, citoquinas producidas por Ia otra subpoblación de linfocitos T implicada en el desarrollo de Ia enfermedad (subpoblación Th17). En Ia presente invención se demuestra que para Ia generación de un fenotipo psoriático completo, resulta necesario el uso de una combinación de al menos dos de estas citoquinas. Por último se realiza Ia técnica de tape-strípping (sucesivas adhesiones y retiradas de una cinta adhesiva) sobre el injerto de piel para producir una disrupción de Ia función barrera de Ia piel. Todo este proceso genera un entorno en el injerto similar al que se produce en las regiones con placas psoriáticas en humanos, permitiendo el estudio completo de Ia enfermedad.
Por Io tanto, un primer aspecto de Ia presente invención se refiere a un método (a partir de ahora, método de Ia invención) para inducir un fenotipo psoriático en un mamífero no humano que comprende: a) Realizar un injerto de un equivalente de piel humana, en el mamífero no humano,
b) Administrar intradérmicamente en el equivalente injertado del paso a) de forma simultánea o secuencial:
• Linfocitos T humanos de Ia subpoblación Th1 , y
• al menos dos citoquinas producidas por linfocitos Th 17, y c) Aplicar y retirar al menos 1 vez una cinta adhesiva sobre el injerto del paso (a) para producir una disrupción de Ia función barrera epitelial. Se entiende por fenotipo psoriático en Ia presente invención aquel fenotipo que presenta características similares a Ia enfermedad de Ia psoriasis en humanos y que se caracteriza por presentar hiperproliferación epidérmica, elongación y fusión de las crestas epidérmicas interpapilares, acantosis focal, paraqueratosis, pérdida parcial del estrato granuloso, infiltrado inflamatorio dérmico y aumento de Ia vascularización de Ia región.
En Ia presente invención se entiende por fenotipo, aquellas características observables en un organismo, las cuales vienen determinadas por su constitución genética y el ambiente en el vive y se desarrolla.
Se entiende por equivalente de piel en Ia presente invención a aquel sustituto bicapa dermo-epidérmico humano, generado in vitro y que puede ser injertado en animales de forma que regenere permanentemente una piel arquitectónica y funcionalmente análoga a Ia humana. En Ia presente invención se entiende por ingeniería de tejidos el uso de una combinación de células, factores bioquímicos y/o materiales en función de sus características bioquímicas y fisicoquímicas para Ia generación tejidos susceptibles de reemplazar parcial o totalmente tanto estructural como funcionalmente algún tejido de un organismo.
En esta memoria se entiende por "animal" cualquier organismo del superreino Eukaryota y reino Metazoa. El término "mamífero" se utiliza para referirse a cualquier organismo del superreino Eukaryota, reino Metazoa, phylum Chordata, subphylum Craniata, superclase Gnathostomata y clase Mammalia. El término mamífero humano se refiere a organismos del superreino Eukaryota, reino Metazoa, phylum Chordata, subphylum Craniata, superclase Gnathostomata, clase Mammalia, orden Primates, Familia Hominidae, género Homo y especie Homo sapiens. La realización de Ia técnica de tape-strípping tiene como función realizar una ruptura de Ia función barrera de Ia piel. Esto se realiza para reproducir el daño que, en Ia mayoría de las ocasiones, es el elemento desencadenante para Ia formación de las placas psoriáticas. Este daño ha de ser el suficiente para desencadenar Ia respuesta, sin llegar a generar un daño que comprometa Ia integridad del injerto de piel realizado. Por ello, en una realización preferida de este aspecto de Ia invención Ia adhesión y retirada de Ia cinta adhesiva se realiza al menos 5 veces. En una realización más preferida de este aspecto de Ia invención Ia adhesión y retirada de Ia cinta adhesiva se realiza al menos 10 veces. En una realización aún más preferida de este aspecto de Ia invención Ia adhesión y retirada de Ia cinta adhesiva se realiza al menos 15 veces.
Para un correcto desarrollo del modelo, es necesario que el equivalente de piel humana tenga una evolución adecuada dentro del organismo huésped. Para ello se ha de producir Ia vascularización e inervación de Ia región injertada. Además, es necesario que no se produzca un rechazo injerto-huésped. Por ello, es aconsejable el uso de animales inmunodeficientes para Ia generación del modelo. Además estos individuos inmunodeficientes permiten una mejor actuación de los linfocitos T administrados y un mejor desarrollo del fenotipo psoriático. Por todo ello, en otra realización preferida de este aspecto de Ia invención el mamífero no humano es inmunodeficiente.
En Ia presente invención se entiende por individuo inmunodeficiente aquel organismo que presenta deficiencias en Ia respuesta inmune caracterizada por una disminución numérica y/o funcional de linfocitos T y/o B, y por tanto no es capaz de rechazar xenotrasplantes (trasplantes de una especie a otra).
Para realizar los equivalentes de piel humana, se hace necesario que en estos equivalentes se encuentren células de origen humano que Ie confieran esa característica de equivalente humano. Estos equivalentes normalmente están compuestos por una matriz dérmica formada uno o más elementos de Ia lista que comprende, aunque sin limitarnos, colágeno, ácido hialurónico y/o fibrina, y junto, sobre o dentro de Ia cual se encuentran uno o más tipos celulares de Ia lista que comprende, aunque sin limitarnos, queratinocitos, melanocitos, células de Langerhans y/o fibroblastos. Las células más abundantes, y de mayor relevancia en Ia generación de estos equivalentes de piel son los queratinocitos en Ia epidermis y los fibroblastos en Ia región dérmica. Debido a todo esto, en una realización preferida de este aspecto de Ia invención, el equivalente esta formado por una matriz de fibrina, que contiene fibroblastos y queratinocitos humanos. En Ia presente invención se demuestra que los fibroblastos y queratinocitos provenientes tanto de individuos sanos, sin psoriasis, como de individuos con psoriasis, son capaces de producir el fenotipo psoriático llevando a cabo el método de Ia invención. Por Io tanto, en una realización preferida de este aspecto de Ia invención, los fibroblastos y queratinocitos del equivalente de piel humana provienen de un enfermo de psoriasis. En otra realización preferida, los fibroblastos y queratinocitos del equivalente de piel humana provienen de un individuo sano, sin psoriasis.
En Ia evolución de Ia psoriasis en humanos se ha visto que los linfocitos que realmente se encuentran implicados son los linfocitos T, y más concretamente los pertenecientes a las subpoblaciones Th1 y Th17. Estas subpoblaciones se encuentran definidas por el perfil de citoquinas que producen y que dan lugar a diversas repuestas inmunes. La subpoblación TM se caracteriza por Ia secreción de interferón-γ e interleuquina-2, y Ia presencia del receptor de citoquinas CCR5. Por su parte Ia subpoblación de linfocitos Th 17 viene caracterizada por Ia expresión de interleuquina-17 e interleuquina-22. Para Ia generación de un entorno adecuado para Ia evolución del fenotipo psoriático, es necesaria Ia aplicación de linfocitos T de Ia subpoblación TM , y al menos dos citoquinas generadas por Ia otra subpoblación de linfocitos implicada, los linfocitos Th 17 de forma intradérmica en el injerto realizado. Las citoquinas producidas por Ia subpoblación linfocítica Th17 que se han demostrado más importantes en Ia evolución de Ia psoriasis sin las interleuquinas IL-17 e IL-22. Según los datos presentados en Ia presente memoria, Ia administración de interleuquina-22 junto al resto de los pasos ya genera un modelo hiperproliferativo útil para su estudio. Sin embargo, Ia administración además de IL-17 genera un modelo más completo de psoriasis. Por ello, en una realización preferida de este aspecto de Ia invención las citoquinas que se administran son interleuquina-22, e interleuquina-17.
Como es bien conocido, los modelos animales más extendidos para el estudio de enfermedades son aquellos realizados en roedores, principalmente ratones. Esto se debe fundamentalmente a Ia reducción de espacio que suponen estos animales frente otros de mayor tamaño, y a Ia facilidad de cría y manejo de los mismos. Por ello en una realización preferida de este aspecto de Ia invención, el mamífero no humano es un roedor. En una realización más preferida de este aspecto de Ia invención, el mamífero es un ratón.
Teniendo en cuenta que los animales inmunodeficientes presentan una mejor respuesta a los xenotrasplantes y a Ia administración de linfocitos, y a Ia mayor facilidad de manejo de ratones, se hace necesario el uso de ratones inmunodeficientes para Ia generación del modelo animal. Los ratones inmunodeficientes más utilizados en experimentación son aquellos que bien son ratones desnudos, los cuales presentan aplasia tímica, y por Io tanto presentan deficiencias en el desarrollo de linfocitos, o bien son ratones que presentan inmunodeficiencia combinada severa (SCID). Los ratones NOD-SCID (ratones diabéticos no obesos con inmunodeficiencia combinada severa) son ratones que no presentan linfocitos T ni B además de tener linfopenia e hipogammaglobulinemia, por Io que su respuesta inmune es deficiente. Por su parte, los ratones NMRI Foxn1nu son ratones que presentan aplasia tímica debido a deficiencias en el desarrollo del epitelio tímico. Por esa deficiencia en el desarrollo tímico, presentan deficiencias en Ia generación de células inmunes y por Io tanto también presentan una respuesta inmune disminuida. Por todo ello, en una realización aún más preferida de Ia presente invención el ratón utilizado es un ratón inmunodeficiente NMRI Foxn1nu o NOD-SCID.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al modelo animal generado por el método de Ia invención. El modelo animal generado al presentar las características de Ia psoriasis en humanos, tiene una elevada utilidad tanto para el estudio de Ia enfermedad, como para Ia búsqueda de tratamientos destinados a Ia atenuación de los síntomas o a Ia curación de Ia enfermedad. Esto, destinado a Ia mejora de Ia calidad de vida de las personas, justifica claramente el posible sufrimiento producido en el animal para Ia generación del modelo. Por todo ello, otro aspecto de Ia invención se refiere al uso del modelo generado por el método de Ia invención para Ia identificación de un compuesto o composición para Ia prevención o tratamiento de Ia psoriasis. Otro aspecto de Ia invención se refiere al uso del modelo para evaluar Ia eficacia de un tratamiento preventivo o terapéutico contra Ia psoriasis. A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Diagrama esquemático del diseño experimental para Ia generación del modelo animal de psoriasis. Fig. 2. Análisis por citometría de flujo de las subpoblaciones de linfocitos T diferenciados in vitro. PBLs (linfocitos de sangre periférica ó perípheral blood lymphocytes) de donantes sanos se cultivaron con Dynabeads CD3/CD28 T CeII Expander (relación 1 :1 ) y 30 U/ml de interleuquina-2 humana. La células se cultivaron durante 6 días bajo estas condiciones (TO), y se añadieron IL-12 y anti-IL-4 al cultivo (T1 ) para inducir diferenciación. Los análisis por citometría de flujo se realizaron al sexto día de diferenciación. A) Dot plots representativos de los marcadores de superficie en las subpoblaciones TO y T1 diferenciadas in vitro. B) Dot plots de patrones de tinción de citoquinas intracelulares. Los porcentajes son relativos a Ia proporción de células positivas definidas por Ia unión de anticuerpos control.
Fig. 3. Análisis histológico de Ia piel humana regenerada tras Ia administración de linfocitos y citoquinas. La tinción con hematoxilina/eosina se llevó a cabo en secciones, fijadas en formalina e incluidas en parafina, de injertos humanos que fueron inyectados intradérmicamente con linfocitos diferenciados de Ia subpoblación TM , y/o con IL-22 e IL-17 recombinantes. Se realizó tape-strípping (TS) donde se indica. Se observaron áreas de hipogranulosis (HG) y paraqueratosis (PK) cuando el injerto era inyectado con citoquinas recombinantes junto con linfocitos T y se aplicaba el tape-strípping. Las flechas indican Ia presencia de capilares dilatados en Ia dermis (BV).
Fig. 4. Respuesta proliferativa a Ia inyección dérmica y/o tape stripping en piel humana regenerada. Las secciones fijadas con formalina se tiñeron para el marcador de proliferación Ki-67. El índice de proliferación se calculó por el porcentaje de núcleos positivos para Ki-67 por cada 100 núcleos de Ia capa basal, en varias áreas seleccionadas al azar.
Fig. 5. Análisis inmunohistoquímico de marcadores epidérmicos.
Secciones consecutivas fijadas con formalina e incluidas en parafina son usadas en las figuras 3 y 4. A) Estas se tiñen para los marcadores de diferenciación involucrina y loricrina, así como para queratina-1. B) La tinción de los marcadores de hiperproliferación queratina-6 y queratina- 17, y de psoriasina (hS100A7) se realizaron también en secciones consecutivas. Fig. 6. Análisis inmunohistoquímico y de inmunofluorescencia de células dérmicas. La composición del infiltrado inflamatorio se analizó por análisis inmunohistoquímico de secciones consecutivas de tejido embebido en parafina y fijado con formalina, utilizando un anticuerpo anti- mieloperoxidasa (MPO) para detectar células de las series granulocíticas. Análisis de inmunofluorescencia en secciones congeladas para el antígeno específico de células T CD3-D indicaron Ia presencia de las células T inyectadas en las secciones de criostato obtenidas de muestras de tejido adyacentes a las obtenidas para los análisis inmunohistoquímicos.
Fig. 7. Análisis de inmunofluorescencia de Ia reacción angiogénica de tejido. Se muestra el análisis de inmunofluorescencia doble para el antígeno específico de células endoteliales CD31 y Ia molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1 ).
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar Ia naturaleza de Ia presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a Ia invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran Ia invención sin limitar el campo de aplicación de Ia misma.
EJEMPLO 1. Diseño experimental para Ia generación de un modelo de piel humanizada con fenotipo psoriático.
La contribución de los componentes (epidérmico e inmune) a Ia patogénesis de Ia enfermedad, se consideró un factor crítico para el diseño experimental presentado en este documento con el fin de imitar Ia dolencia humana tanto como fuera posible. Con este fin, el conjunto de linfocitos T1 se obtuvo de sangre periférica a partir de polarización in vitro dirigida por citoquinas. Estas células inmunes se reintrodujeron en Ia piel madura de un modelo de ratón de piel humanizada mediante inyección intradérmica junto con las citoquinas recombinantes de Ia subpoblación Th17 IL-17 e IL-22. El modelo de ratón de piel humanizada se generó obteniendo queratinocitos y fibroblastos por digestión enzimática de una biopsia de piel humana tanto de un paciente psoriático (Figura 1A) como de un donante sano (Figura 1 B). Las células se amplificaron en cultivo y se ensamblaron en un cultivo organotípico basado en fibrina que se injertó en Ia espalda de ratones inmunodeficientes mediante un sistema previamente caracterizado en nuestro laboratorio (Del Rio et al. 2002. Hum Gene Ther, 13:959-968; Llames et al. 2004. Transplantation; 77:350- 355). Este sistema permite obtener un gran número de ratones injertados con un área significativa de piel procedente de un único donante, siendo una de las principales ventajas de este modelo frente a otros modelos humanizados como puede ser el del xenotrasplante (Boehcke et al. 1996. Nature; 379:777; Wrone-Smith and Nickoloff 1996. J Clin Invest; 98: 1878- 1887). Además se comprometió Ia función barrera de Ia piel usando Ia técnica de tape-strípping, un procedimiento bien caracterizado para eliminar las capas superficiales del estrato córneo y que produce hiperproliferación sin inflamación grave (Ahn et al. 1999. J Invest Dermatol; 113: 189-195).
EJEMPLO 2. Diferenciación In vitro de las subpoblaciones de células T1. Los autores diferenciaron células T in vitro hacia un fenotipo tipo 1 mediante activación y polarización dirigida por citoquinas. Con este fin, se activaron PBLs (linfocitos de sangre periférica) procedentes de pacientes psoriáticos o de donantes sanos y obtenidos por separación mediante gradiente de densidad, usando una combinación de anticuerpos CD3/CD28 conjugados con perlas magnéticas en presencia de IL-2. La diferenciación hacia Th 1 y Th2 está controlada mediante IL-12 (p35-p40) y IL-4, respectivamente. Adicionalmente, se sabe que estas citoquinas inhiben Ia generación del subconjunto Th opuesto. Por Io tanto, los autores usaron un procedimiento bien establecido para obtener Ia polarización de Th1 dirigida por citoquinas, cultivando los linfocitos T activados durante 6 días en presencia de IL-12 y anti-IL-4. Las células TO correspondían a linfocitos T activados en cultivo en presencia de IL-2 sólo. A día 6, Ia proporción de células CD3+ variaba del 70% al 90% dependiendo del donante, con una relación CD4:CD8 de 1 ,2-1 ,8. El estado de activación se evaluó mediante expresión en Ia superficie celular de CD25 (IL-2Rα), HLA-DR y CD69. Los perfiles de FACs correspondientes a un donante sano se muestran en Ia Figura 2A. En este caso y tras 6 días de cultivo, un elevado porcentaje de células CD4+ también expresaron CD25 (66,61 % de células T1 CD4+ vs. 73,61% de células TO CD4+). La proporción de células CD8+ que expresaba conjuntamente CD25 fue menor (44,71% de células T1 CD8+ vs. 54,49% de células TO CD8+). En ambas poblaciones de células T CD4+ y CD8+, una elevada proporción de células expresaron HLA-DR bajo condiciones de polarización TO o T1 (78,64% de células T1 CD8+ vs. 91 ,61 % de células TO CD8+ y 71 ,82% de células T1 CD4+ vs. 74,06% de células TO CD4+). Por el contrario, el marcador de activación temprano mostró bajos niveles de expresión, especialmente bajo condiciones de polarización Th1 (6,61 % de CD4+ y 2,60% de CD8+ en células T1 vs. 14,52% de CD4+ y 17,62% de CD8+ en células TO). El perfil de citoquinas en las células T diferenciadas in vitro se evaluó mediante citometría de flujo en las subpoblaciones de células T CD4+ y CD8+ tras su estimulación con acetato de miristato de forbol (PMA) e ionomicina. En el día 6 de diferenciación de T1 un elevado porcentaje de células expresó IFN-γ (42,9% comparado con 21 ,69% expresando células TO en el día 6) cuando se activaron. Una proporción reducida de células expresaron IL-2 (22,39% comparado con 42,69% células TO que presentan expresión) y únicamente una pequeña proporción de células T1 y TO expresaron IL-4 e IL-10 (Figura 2B). Las células T1 también produjeron grandes cantidades de GM-CSF (factor estimulador de colonias de monocitos y granulocitos) según se evalúa mediante un ensayo ELISA específico (datos no mostrados).
EJEMPLO 3. Inyección intradérmica de linfocitos T1 diferenciados y citoquinas recombinantes en el modelo de piel humanizada. Los análisis histológicos mostraron que Ia inyección de linfocitos T1 junto con IL-22 recombinante y tape-strípping indujeron los cambios epidérmicos típicos asociados con Ia psoriasis, incluyendo elongación y fusión de las crestas interpapilares, acantosis focal, paraqueratosis y pérdida parcial de Ia capa granular. La dermis se caracteriza por un leve infiltrado inflamatorio y un aumento en Ia vascularización con Ia presencia de capilares dilatados. Cuando se añadió IL-17 recombinante a Ia combinación anteriormente mencionada, se observó una respuesta dérmica inflamatoria incluso más intensa en presencia de esta citoquina. Esta reacción se observó tanto en un contexto autólogo, donde Ia piel regenerada y las células inmunes procedían de un paciente psoriático (Figuras 1A y 3A), como, y Io que es más importante, en un contexto alogénico, donde Ia piel regenerada y las células inmunes procedían de donantes sanos no relacionados (Figuras 1 B y 3B). En este caso, y para excluir una reacción adversa por el reconocimiento alogénico, se deplecionó Ia población de linfocitos T1 de células CD8+ utilizando perlas magnéticas antes de cada inyección. En este caso, y al igual que en el caso anterior, las principales características del fenotipo psoriático estaban presentes. Por el contrario, Ia inyección de linfocitos T1 junto con IL-22 recombinante sola no indujo el fenotipo psoriático en ausencia de tape-strípping, observándose únicamente una ligera reacción de hiperplasia epidérmica. De manera similar, el tape-strípping sólo, no indujo una reacción psoriatiforme (Figura 3B). La inmunotinción con Ki-67 reveló un aumento en el número de células positivas para Ki-67 en Ia epidermis procedente de injertos de piel inyectados con IL-22 sola, células T1 más IL-22 (datos no mostrados) o tape-strípping sólo (Figura 4), que se aumentó adicionalmente cuando se administraron conjuntamente células T1 más IL-22/IL-17 en presencia de tape-stripping. En este caso, las células positivas no se restringieron a Ia capa basal, sino que incluyeron células suprabasales (Figura 4). Algunas de las anomalías encontradas en las lesiones psoriáticas se identificaron por análisis inmunohistoquímico de algunos marcadores de Ia diferenciación de queratinocitos (expresión de involucrina, loricrina y queratina). La inyección simultánea de células T1 más las citoquinas recombinantes IL-22 y IL-17 en los injertos de piel junto con tape-stripping es Ia condición que más estrechamente se parece a los rasgos inmunohistoquímicos de Ia psoriasis humana. La involucrina parece estar sobreexpresada, mientras que Ia expresión de loricrina se redujo en las áreas en las que Ia generación de una capa granular bien diferenciada estaba impedida. La expresión de queratina K1 también resultó perturbada con una inhibición focal de su expresión, mientras que una clara sobreexpresión de K6 y K17 fue coincidente con Ia presencia de una epidermis hiperproliferativa usando esta condición. Además, Ia expresión de Ia proteína antimicrobiana S100A7 (psoriasina) también estaba inducida (Figuras 5A y B).
Se observó un infiltrado inflamatorio más prominente cuando se administró simultáneamente IL-17 recombinante con injertos de piel inyectados con T1 más IL-22 en presencia de tape-stripping (Figura 3A y B). Los análisis inmunohistoquímicos para evaluar Ia composición celular del infiltrado revelaron un influjo incrementado de granulocitos y macrófagos en el punto de inyección (Figura 6). El análisis usando anticuerpos específicos anti-CD3, mostró Ia localizador) de las células T1 inyectadas en los injertos de piel humanizada (Figura 6). La inmunofluorescencia con CD31 mostró Ia presencia de capilares dilatados en Ia dermis de los injertos de piel humanizada inyectados simultáneamente con IL-22 e IL-17 más Th1 en presencia de tape- strípping, y esto correlaciona con una expresión aumentada de ICAM-1 en los vasos (Figura 7).
MATERIALES Y MÉTODOS EMPLEADOS
Pacientes
Todos los pacientes incluidos en este estudio mostraban Ia variante psoriasis vulgar de Ia enfermedad, con un inicio temprano y altas puntuaciones PASI (índice de severidad y área afectada). Algunos de ellos también mostraban algún caso de psoriasis en su historial familiar. En el momento en que se tomaron biopsias de Ia piel, Ia medicación se había interrumpido durante varios meses. Se tomaron muestras con anestesia local tanto de Ia piel asintomática como de placas psoriáticas usando una aguja de biopsia de 6 mm. Los pacientes psoriáticos se reclutaron en el Hospital Básico de Ia Defensa (Valencia, España) y firmaron un consentimiento informado. YCP: Años con psoriasis diagnosticada; PFH: Historial familiar de psoriasis; PASI: índice de severidad y área afectada; BSA: Superficie corporal afectada.
Tabla 1 : Pacientes psoriáticos participantes en el estudio.
Número de Edad Peso (Kg) YCP PFH PASI BSA
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Aislamiento de linfocitos y expansión de células T
Se usó sangre periférica tanto de pacientes psoriáticos como donantes VIH-seronegativos (proporcionados por el Centro de Transfusiones,
Madrid, España) para aislar las células mononucleares de sangre periférica (PBMC o Peripheral Blood Mononuclear CeIIs) mediante gradiente de densidades Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ).
Las células se cultivaron en RPMI 1640, suplementado con suero fetal bovino térmicamente inactivado al 10% (FCS) y fueron estimulados con
Dynabeads CD3/CD28 T CeII Expander® (relación 1 :1 ) y 30 U/ml de interleuquina-2 humana (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN) durante A-
6 días. Para Ia diferenciación a T1 se añadieron también al cultivo IL-12
(20 ng/ml) (R&D Systems Inc.) junto con anticuerpo anti-IL-4 (5 μg/ml) (BD Pharmingen, San Diego, CA). Las células Th1 se obtuvieron mediante selección negativa de estos cultivos utilizando el kit de aislamiento de linfocitos T CD4+ de Miltenyi Biotec (Auburn, CA).
Análisis por citometría de flujo
Se realizó un análisis de fenotipo de las subpoblaciones de linfocitos, antes y después de Ia expansión de células T, mediante citometría de flujo (FCM) usando un citofluorímetro EPICS (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Las células se cultivaron, lavaron y suspendieron en solución salina tamponada con fosfato y con albúmina de suero bovino al 1 % (Sigma- Aldrich). Se incubaron alícuotas (2x105 células) en oscuridad a 4°C (30 minutos) con anticuerpos monoclonales conjugados y se lavaron (anticuerpos monoclonales humanos anti CD3, CD4, CD8, CD25, CD69, HLA-DR (Becton, Dickinson and Company, San José, CA)). Se determinó Ia fluorescencia inespecífica usando anticuerpos monoclonales anti- isotipo. Para Ia tinción intracelular se añadió monensina (GolgiStop de Pharmingen) al final de las 4 h de activación de las células T. A continuación, las células se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 10 minutos y se permeabilizaron con saponina al 0,1 %. La tinción se llevó a cabo con los anticuerpos anti-IFNγ, anti-IL-2, anti-IL-4 y anti-IL-10 (conjugados con PE (ficoeritrina) o FITC (isotiocianato de fluoresceina), Pharmingen) en saponina al 0,1%. Las células se lavaron y sometieron a análisis mediante citometría de flujo por fluorescencia (FACS o Fluorescence Activated CeII Sorter).
Cultivos primarios de queratinocitos y fibroblastos humanos Los queratinocitos y fibroblastos dérmicos humanos se obtuvieron de biopsias de Ia piel realizadas en donantes por digestión enzimática (Rheinwald and Green 1975. Ce//; 3:331-343). Los cultivos se realizaron tras aprobación ética y habiendo obtenido previamente el consentimiento informado de los donantes. El estudio se llevó a cabo según Ia Declaración de Principios de Helsinki. Los queratinocitos primarios se cultivaron sobre una capa alimenticia de células 3T3-J2 irradiadas letalmente (rayos X; 50 Gy) (obsequio del Dr. J. Garlick, SUNY, Stony Brook, NY) tal como se ha descrito anteriormente (Meana et al. 1998. Burns; 24: 621-630; Del Rio et al., 2002. Hum Gene Ther, 13: 959-968). El medio de siembra de los queratinocitos fue una mezcla 3:1 de Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) y F12 de HAM (GIBCO-BRL) conteniendo suero fetal bovino al 10% (FCS), toxina colérica 0,1 nM, triiodotirosina (T3) 2 nM, insulina 5 Dg/ml, 0,4 Dg/ml de hidrocortisona y 10 ng/ml de EGF (Sigma, St Louis, MO). Los fibroblastos primarios se cultivaron sobre plástico en DMEM conteniendo FCS al 10%. Las células se cultivaron a 370C en atmósfera húmeda que contenía CO2 al 5%. El medio de cultivo se cambió cada 2 días.
Animales
Se usaron ratones Rj: NMRI— Foxn1 nu (NMRI nu) inmunodeficientes (6-8 semanas de edad) (Elevage Janvier, Le Genest Saint IsIe, France). Los ratones se alojaron durante el experimento en Ia Instalación de Animales de Laboratorio del CIEMAT (número de registro español 28079-21A) en condiciones libres de patógenos usando jaulas tipo NL individualmente ventiladas con microaislantes, con un máximo de seis ratones por jaula, con 25 cambios de aire por hora y con briquetas de madera blanda térmicamente tratadas como cama. Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con Ia legislación española y europea, y según Ia normativa de protección y uso de animales en investigación científica. Los procedimientos fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación con Animales de los autores de acuerdo con todas las directrices internas y externas de bioseguridad y bioética. Equivalentes de piel humana diseñados por ingeniería de tejidos e injertados
El equivalente de piel humana biodiseñado se basa en el uso de fibroblastos vivos contenidos en una matriz de fibrina como componente dérmico (Meana et al. 1998. Burns; 24: 621-630). Para su generación se añadieron 1 ,5 mi de disolución de fibrinógeno (procedente de sangre de cerdo crioprecipitada) a 5 mi de medio de crecimiento de queratinocitos que contenía 2,5 x 105 de fibroblastos dérmicos y 250 IU de aprotinina bovina (Trasylol; Bayer, West Haven, Connecticut). Inmediatamente después, se añadieron 0,5 mi de C^Ca 0,025 mM, con 5,5 IU de trombina bovina (Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO). La mezcla se colocó en una placa de cultivo de 6 pocilios (Corning Costar Corp., Cambridge, MA) y se dejó solidificar a 370C durante 2 horas. Los queratinocitos se sembraron sobre esta matriz y se crecieron en cultivo sumergido hasta llegar a confluencia. Los ratones fueron limpiados asépticamente y se trasplantaron siguiendo el método previamente descrito en nuestro laboratorio (Del Rio et al. 2002. Hum Gene Ther, 13: 959-968; Llames et al. 2004. Transplantation; 77: 350-355 Serrano et al. 2003. Hum Gene Ther, 14: 1579-1585). Inyección intradérmica de las subpoblaciones de linfocitos T y citoquinas recombinantes
De nueve a doce semanas tras el trasplante, las subpoblaciones de linfocitos T derivadas in vitro, (106/50μl) o las citoquinas recombinantes (200ng/50μl) diluidas en PBS estéril, se inocularon mediante inyección intradérmica en Ia piel con injerto humano estable cada dos días durante 8 días. En algunos casos, antes de Ia inyección se aplicó 15 veces Ia técnica de tape-strípping sobre Ia misma área del trasplante. Los ratones se sacrificaron por asfixia con dióxido de carbono dos días después de Ia última inyección intradérmica y se tomaron biopsias de Ia piel, las cuales se procesaron para análisis histológico e inmunohistoquímico.
Análisis histológico e inmunohistoquímico Secciones de parafina fijadas con formalina (4-6 μm) se desparafinaron por fusión durante 30-60 min. a 6O0C, se limpiaron en xileno tres veces durante 5 min. y se rehidrataron en disoluciones acuosas que contenían porcentajes decrecientes de etanol. Para determinar Ia arquitectura del tejido, las secciones se tiñeron con hematoxilina-eosina (GiII 2 Haematoxylin and Eosin Y alcoholic; Thermo Sandon, Cheshire, UK) siguiendo el procedimiento estándar.
Para Ia tinción con inmunoperoxidasa, las secciones se trataron para Ia inactivación de Ia peroxidasa endógena, se bloquearon e incubaron durante toda Ia noche a 40C con anticuerpos primarios específicos contra marcadores de epidermis y granulocitos humanos. Los anticuerpos se usaron a diluciones finales de 1 :500 y 1 :300 para los anticuerpos anti- queratinas 1 y 17, respectivamente (Sigma Aldrich), 1 :1000 para el anticuerpo monoclonal anti-queratina 6 (clon LHK6B, Neomarkers, Fremont, CA), 1 :2000 para el anticuerpo policlonal anti-loricrina (Babeo, Richmond, CA) y 1 :50 para el anticuerpo anti-mieloperoxidasa (MPO) (HyCuIt biotechnology b.v., Uden, Holanda). Para establecer el origen humano de Ia piel regenerada, se usó un anticuerpo específico frente a involucrina humana (clon SY5; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) para marcar los queratinocitos humanos. Se evaluó Ia proliferación celular mediante detección con inmunoperoxidasa del antígeno Ki-67 usando un anticuerpo monoclonal de conejo (Clon SP6, Neomarkers). Los anticuerpos secundarios biotinilados específicos para cada caso se obtuvieron de Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA). Todas las tinciones con inmunoperoxidasa se realizaron con procedimientos estándar usando el kit Vectastain ABC (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). Las secciones se contratiñeron con hematoxilina y se deshidrataron en una disolución acuosa que contenía porcentajes crecientes de etanol. Finalmente, los portas se incubaron 15 minutos en histoclear (National Diagnostic, Atlanta, GA) y se montaron. Se tomaron imágenes con un microscopio Olympus Bx41 con cámara digital. Los análisis por inmunofluorescencia se realizaron en secciones de criostato de 8-10 Dm que se obtuvieron de regiones de tejidos adyacentes a las mencionadas en el párrafo anterior y que se embebieron en medio OCT (optimal cutting temperature) (TissueTek). Para analizar Ia densidad vascular, se utilizaron secciones fijadas en acetona fría. Los portas se incubaron con un anticuerpo monoclonal anti-CD31 (PECAM-1 ) (clon MEC 13.3, Pharmingen) diluido 1 :100. Se realizó doble inmunofluorescencia con un anticuerpo policlonal anti-ICAM-1 diluido 1 :50 (Santa Cruz Biotech, Santa Clara, CA). Secciones consecutivas se tiñeron con el anticuerpo policlonal anti-CD3D (Dako, Glostrup, Denmark). Los anticuerpos secundarios acoplados a FITC o Texas Red se compraron a Jackson ImmunoResearch Laboratories.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método para inducir un fenotipo psoriático en un mamífero no humano que comprende: a) Realizar un injerto de un equivalente de piel humana, en el mamífero no humano,
b) Administrar intradérmicamente en el equivalente injertado del paso a) de forma simultánea o secuencial:
• Linfocitos T humanos de Ia subpoblación Th 1 , y
• al menos dos citoquinas producidas por linfocitos Th 17, y c) Aplicar y retirar al menos 1 vez una cinta adhesiva sobre el injerto del paso (a) para producir una disrupción de Ia función barrera epitelial.
2. Método según Ia reivindicación 1 donde en el paso (b) se administran de forma simultánea los linfocitos T humanos de Ia subpoblación Th1 y al menos dos citoquinas producidas por linfocitos Th17.
3. Método según de Ia reivindicación 1 ó 2 donde el mamífero no humano es inmunodeficiente.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde el equivalente de piel para realizar el injerto del paso (a), es una matriz de fibrina con fibroblastos y queratinocitos humanos.
5. Método según Ia reivindicación 4 donde los fibroblastos y queratinocitos del equivalente de piel humana provienen de un enfermo de psoriasis.
6. Método según Ia reivindicación 4 donde los fibroblastos y queratinocitos del equivalente de piel humana provienen de un individuo sano.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde Ia citoquinas del paso (b) son interleuquina 17 e interleuquina-22.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el mamífero no humano es un roedor.
9. Método según Ia reivindicación 8 donde el roedor es un ratón.
10. Método según Ia reivindicación 9 donde el ratón es un ratón inmunodeficiente NMRI-Foxn1nu o NOD-SCID.
11. Modelo animal no humano que muestra un fenotipo psoriático obtenible por el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Uso del modelo según Ia reivindicación 11 para Ia identificación de un compuesto o composición para Ia prevención o el tratamiento de Ia psoriasis.
13. Uso del modelo según Ia reivindicación 11 para evaluar Ia eficacia de un tratamiento preventivo o terapéutico contra Ia psoriasis.
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