WO2011006983A1 - Derives amines de dihydro-1,3,5-triazine pour le traitement du stress oxydatif - Google Patents

Derives amines de dihydro-1,3,5-triazine pour le traitement du stress oxydatif Download PDF

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WO2011006983A1
WO2011006983A1 PCT/EP2010/060290 EP2010060290W WO2011006983A1 WO 2011006983 A1 WO2011006983 A1 WO 2011006983A1 EP 2010060290 W EP2010060290 W EP 2010060290W WO 2011006983 A1 WO2011006983 A1 WO 2011006983A1
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WO
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aryl
alkoxy
alkyl
substituted
compound
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Application number
PCT/EP2010/060290
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Inventor
Didier Mesangeau
Xavier Leverve
Daniel Cravo
Original Assignee
Poxel
Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale)
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Publication date
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/53—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with three nitrogens as the only ring hetero atoms, e.g. chlorazanil, melamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the present invention relates to amino derivatives of dihydro-1,3,5-triazine for use in the treatment of oxidative stress and diseases associated therewith, particularly in hyperglycemic individuals.
  • Oxidative stress (or oxidative stress) is recognized as an important element in the onset or progression of diseases such as cardiovascular diseases, diabetic neuropathies, neurodegenerative diseases, cancers, or phenomena such as aging.
  • the oxidative stress originates in the action of prooxidant compounds, especially free radicals, which are generally reactive oxygen species (ROS), such as hydrogen peroxide (H 2 O 2 ). These compounds damage many cellular structures, such as membrane lipids, proteins, or nucleic acids.
  • ROS reactive oxygen species
  • prooxidant compounds may be responsible for triggering apoptosis, that is, for programmed cell death.
  • the pro-oxidant compounds, in particular the ROS thus seem to cause the opening of the transient pore of mitochondrial permeability (PTP), one of the early stages in the apoptosis process.
  • PTP mitochondrial permeability
  • the main source of ROS in the body is mitochondria.
  • the mitochondrion is the seat of oxidative phosphorylation, which allows the synthesis of ATP by ATP synthase thanks to the protomotor force linked to the electrochemical gradient on both sides of the mitochondrial inner membrane.
  • This gradient is created by the action of the respiratory chain, located in the mitochondrial internal membrane, which catalyzes, through several oxidation-reduction complexes, the oxidation of oxido-reduction coenzymes (such as NADH and FADH 2). ) by molecular oxygen (O 2 ).
  • the reduced coenzymes come from the oxidation of different energy substrates, such as the glucose for example.
  • the main target tissues of oxidative stress are thus generally those with significant oxidative metabolism, such as nerve tissue, vascular tissue, heart, muscle and liver.
  • oxidative metabolism in oxidative stress explains that hyperglycemic disorders, such as type II diabetes, are often the cause of oxidative stress-related diseases, due to increased metabolism. oxidative glucose that results.
  • CsA cyclosporin A
  • metformin an antidiabetic agent, to limit the production of ROS by mitochondria, and the resulting cell death, in the treatment of vascular diseases and neuropathic disorders related to diabetes mellitus. type II (Detaille et al (2005) Diabetes 54: 2179-2187, El-Mir et al (2008) J. Mol Neurosci 34: 77-87).
  • Metformin acts in particular by an inhibition of the complex I of the mitochondrial respiratory chain, both on the classical flux but also on the reverse flow of electrons, which causes a decrease in the ATP production by mitochondria, and consequently a decrease in gluconeogenesis ⁇ Le. the synthesis of glucose by the liver).
  • the present invention stems from the unexpected finding, by the inventors, that a compound of general formula (I), the compound E 0008, made it possible to reduce apoptosis, linked to oxidative stress, of endothelial cells, as well as the production of ROS by the complex I of the respiratory chain of these cells, by exclusively inhibiting the reverse electron flow, but without inhibiting mitochondrial respiration.
  • the action of this compound is therefore not accompanied by an overproduction of lactate.
  • R1, R2, R3, and R4 are independently selected from the groups:
  • cycloalkyl (C 3 -C 8) substituted or unsubstituted by (C 1 -C 5) alkyl, (C 1 -C 5) alkoxy, (C 3 -C 8) heterocycloalkyl carrying one or more heteroatoms chosen from N, O, S and substituted or unsubstituted by alkyl (C1-C5), (C1-C5) alkoxy,
  • C6-C14 substituted or unsubstituted with amino, hydroxy, thio, halogen, (C1-C5) alkyl, (C1-C5) alkoxy, (C1-C5) alkylthio, (C1-C5) alkylamino, (C6) aryl -C14) oxy, (C6-C14) aryl (C1-C5) alkoxy, cyano, trifluoromethyl, carboxy, carboxymethyl or carboxyethyl,
  • heteroaryl (C1-C13) bearing one or more heteroatoms chosen from
  • R 1 and R 2 on the one hand, and R 3 and R 4, on the other hand, being able to form with the nitrogen atom a n-membered ring (n between 3 and 8) comprising or not one or more heteroatoms chosen from N, O, S and may be substituted by one or more of amino, hydroxy, thio, halogen, (C 1 -C 5) alkyl, (C 1 -C 5) alkoxy, (C 1 -C 5) alkylthio, (C 1 -C 5) alkylamino ), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6- C14) (C1-C5) alkoxy, cyano, trifluoromethyl, carboxy, carboxymethyl or carboxyethyl,
  • R5 and R6 are independently selected from groups:
  • cycloalkyl (C3-C8) substituted or unsubstituted with amino, hydroxy, thio, halogen, (C1-C5) alkyl, (C1-C5) alkoxy, (C1-C5) alkylthio, (C1-C5) alkylamino, (C6) aryl C14) oxy, (C6-C14) aryl (C1-C5) alkoxy, cyano, trifluoromethyl, carboxy, carboxymethyl or carboxyethyl,
  • heterocycloalkyl (C3 - C8) carrying one or more heteroatoms selected from N, O, S and substituted or unsubstituted with amino, hydroxy, thio, halogen, (C1 - C5) alkyl, (C1 - C5) alkoxy, alkylthio (C1 - C5); C5), (C1-C5) alkylamino, (C6-C14) aryloxy, (C6-C14) aryl (C1-C5) alkoxy, cyano, trifluoromethyl, carboxy, carboxymethyl or carboxyethyl,
  • heteroaryl (C1-C13) carrying one or more heteroatoms chosen from N,
  • R5 and R6 being capable of forming, with the carbon atom to which they are attached, a m-ring (m between 3 and 8) comprising or not one or more heteroatoms chosen from N, O, S and which may be substituted by amino, hydroxy, thio, halogen, (C1-C5) alkyl, (C1-C5) alkoxy, (C1-C5) alkylthio, (C1-C5) alkylamino, (C6-C14) aryl, (C6-C14) aryl, (C1-C14) alkoxy ( C1-C5), cyano, trifluoromethyl, carboxy, carboxymethyl or carboxyethyl,
  • the present invention also relates to the use of a compound of general formula (I) as defined above, as well as the tautomeric, enantiomeric, diastereoisomeric and epimeric forms and the pharmaceutically acceptable salts thereof, for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of oxidative stress or pathologies associated with oxidative stress.
  • the present invention also relates to a method for preventing or treating oxidative stress or pathologies associated with oxidative stress in an individual, in which the individual is administered a prophylactically or therapeutically effective amount of a compound of general formula (I) as defined above, or a compound selected from tautomeric, enantiomeric, diastereoisomeric and epimeric forms and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • ring-shaped ring formed by R5 and R6 is meant in particular a saturated ring such as a cyclohexyl, piperidinyl or tetrahydropyranyl group.
  • polycyclic group formed by R5 and R6 is meant an optionally substituted polycyclic carbon group and in particular a steroid residue.
  • a particular group of compounds of the general formula (I) is that in which R 5 is hydrogen.
  • R 5 and R 6 form with the carbon atom to which they are attached a m-ring, (m between 3 and 8) comprising or not one or a plurality of heteroatoms selected from N, O, S and which may be substituted with one or more of the following groups:
  • R5 and R6 are independently selected from the groups:
  • the invention also relates to tautomeric forms, enantiomers, diastereoisomers, epimers and organic or inorganic salts of the compounds of general formula (I).
  • Compounds of the invention of general formula (I) defined as above having a sufficiently acidic function or a sufficiently basic function or both, may include the corresponding salts of organic or inorganic acid or organic or inorganic base pharmaceutically acceptable.
  • the compounds of general formula (I) have basic nitrogen atoms which can be monosalified or disalified by organic or inorganic acids.
  • the compound according to the invention is in the form of hydrochloride.
  • R 6 is a (C 1 -C 20) alkyl group, especially a methyl group.
  • R1 and / or R2 represents (nt) a (C1-C20) alkyl group, especially a methyl group.
  • R3 and / or R4 represents (s) a hydrogen atom.
  • R 1 and R 2 are methyl and R 3 and R 4 are hydrogen.
  • the compound of general formula (I) is (+) 5,6-dihydro-4-dimethylamino-2-imino-6-methyl-1,3,5-triazine or its hydrochloride.
  • the compound of general formula (I) is (-) 5,6-dihydro-4-dimethylamino-2-imino-6-methyl-1,3,5-triazine or its hydrochloride.
  • the "alkyl” radicals represent saturated hydrocarbon radicals, in straight or branched chain, of 1 to 20 carbon atoms, preferably of 1 to 5 carbon atoms. Mention may in particular be made, when they are linear, the methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, octyl, nonyl, decyl, dodecyl, hexadecyl and octadecyl radicals.
  • alkyl radicals When they are branched or substituted by one or more alkyl radicals, mention may be made especially of the isopropyl, tert-butyl, 2-ethylhexyl, 2-methylbutyl, 2-methylpentyl, 1-methylpentyl and 3-methylheptyl radicals.
  • alkoxy radicals according to the present invention are radicals of formula -O-alkyl, the alkyl being as defined previously.
  • Alkylthio refers to an alkyl-S- group, the alkyl group being as defined above.
  • Alkylamino refers to an alkyl-NH- group, the alkyl group being as defined above.
  • halogen atoms mention is made more particularly of fluorine, chlorine, bromine and iodine atoms.
  • alkenyl radicals represent hydrocarbon radicals, in straight or linear chain, and comprise one or more ethylenic unsaturations.
  • alkenyl radicals mention may be made especially of the allyl or vinyl radicals.
  • alkynyl radicals represent hydrocarbon radicals, in straight or linear chain, and comprise one or more acetylenic unsaturations.
  • alkynyl radicals there may be mentioned the acetylene radical.
  • cycloalkyl radical is a saturated or partially unsaturated, non-aromatic mono-, bi- or tri-cyclic hydrocarbon radical of 3 to 10 carbon atoms. carbon, such as in particular cyclopropyl, cyclopentyl, cyclohexyl or adamantyl, and the corresponding rings containing one or more unsaturations.
  • Heterocycloalkyl radicals denote mono or bicyclic systems, saturated or partially unsaturated, nonaromatic, of 3 to 8 carbon atoms, comprising one or more heteroatoms chosen from N, O or S.
  • Aryl denotes a hydrocarbon aromatic system, mono or bicyclic of 6 to 10 carbon atoms.
  • aryl radicals there may be mentioned the phenyl or naphthyl radical, more particularly substituted by at least one halogen atom.
  • arylalkyl or “aralkyl” radicals are aryl-alkyl radicals, the aryl and alkyl groups being as defined above.
  • arylalkyl radicals mention may be made especially of the benzyl or phenethyl radical.
  • Aryloxy refers to an aryl-O- group, the aryl group being as defined above.
  • Arylalkoxy refers to an aryl-alkoxy group, the aryl and alkoxy groups being as defined above.
  • Heteroaryl radicals denote aromatic systems comprising one or more heteroatoms chosen from nitrogen, oxygen or sulfur, mono or bicyclic, of 5 to 10 carbon atoms.
  • heteroaryl radicals mention may be made of pyrazinyl, thienyl, oxazolyl, furazanyl, pyrrolyl, 1,2,4-thiadiazolyl, naphthyridinyl, pyridazinyl, quinoxalinyl, phthalazinyl and imidazo [1].
  • pharmaceutically acceptable salts refers to the relatively non-toxic, inorganic and organic acid addition salts, and base addition salts, of the compounds of the present invention. These salts can be prepared in situ during the final isolation and purification of the compounds.
  • the acid addition salts can be prepared by separately reacting the purified compound in its purified form with an organic or inorganic acid and isolating the salt thus formed.
  • acid addition salts are the hydrobromide, hydrochloride, sulfate, bisulfate, phosphate, nitrate, acetate, oxalate, valerate, oleate, palmitate, stearate, laurate, borate, benzoate, lactate, phosphate, tosylate and citrate salts.
  • the acid addition salts may also be prepared by separately reacting the purified compound in its acid form with an organic or inorganic base and isolating the salt thus formed.
  • Acidic addition salts include amine and metal salts. Suitable metal salts include sodium, potassium, calcium, barium, zinc, magnesium and aluminum salts. Sodium and potassium salts are preferred.
  • Suitable basic inorganic addition salts are prepared from metal bases which include sodium hydride, sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, aluminum hydroxide, lithium hydroxide, magnesium hydroxide, zinc hydroxide .
  • Suitable base amino acid addition salts are prepared from amines which have sufficient alkalinity to form a stable salt, and preferably include amines which are often used in medicinal chemistry because of their low toxicity and acceptability.
  • ammonia ethylenediamine, N-methylglucamine, lysine, arginine, ornithine, choline, N, N'- dibenzylethylenediamine, chloroprocaine, diethanolamine, procaine, N-benzylphenethylamine, diethylamine, piperazine, tris (hydroxymethyl) -aminomethane, tetramethylammonium hydroxide, triethylamine, dibenzylamine, ephenamine, dehydroabietylamine, N-ethylpiperidine, benzylamine, tetramethylammonium, tetraethylammonium, methylamine dimethylamine, trimethylamine, ethylamine, basic amino acids
  • the compounds of general formula (I) may be prepared by application or adaptation of any method known per se of and / or to those of ordinary skill in the art, in particular those described by Larock in Comprehensive Organic.
  • the pharmaceutical compounds according to the invention may be presented in forms intended for parenteral, oral, rectal, permucosal or percutaneous administration.
  • compositions including these compounds of general formula (I) will therefore be presented in the form of solutes or injectable suspensions or multi-dose vials, in the form of naked or coated tablets, coated tablets, capsules, capsules, pills, cachets, powders, suppositories or rectal capsules, solutions or suspensions, for percutaneous use, in a polar solvent, for permselective use.
  • Suitable excipients for such administrations are derivatives of cellulose or microcrystalline cellulose, alkaline earth carbonates, magnesium phosphate, starches, modified starches, lactose for solid forms.
  • cocoa butter or polyethylene glycol stearates are the preferred excipients.
  • water, aqueous solutes, physiological saline, isotonic solutes are the most conveniently used vehicles.
  • the dosage may vary within the important limits (0.5 mg to 1000 mg) depending on the therapeutic indication and the route of administration, as well as the age and weight of the subject.
  • oxidative stress refers to a state in which the organism is confronted with excessive amounts of prooxidant compounds, such as reactive oxygen species (ROS), i.e. say to amounts exceeding the body's natural systems of struggle against these compounds. Oxidative stress is defined in particular by Cardoso Susana et al. In Radical Biology & Medicine, (2008), 45, 1395.
  • the term “diseases associated with oxidative stress” refers to all diseases whose onset or maintenance originates, at least partially, in oxidative stress.
  • the diseases associated with oxidative stress are selected from the group consisting of atherosclerosis, cardiovascular diseases, diabetic neuropathies, neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease, chronic lung (“Chronic Lung disease”) and cancers.
  • the invention aims at the prevention or inhibition of apoptosis related to oxidative stress, in particular the apoptosis of cells of nervous, vascular, cardiac, muscular or hepatic tissues.
  • the invention relates to the prevention or treatment of oxidative stress, or diseases associated with oxidative stress, which are related to a hyperglycemic disorder.
  • hyperglycemic disorder refers to all diseases affecting an individual, in which the blood glucose level of the individual in the absence of treatment is above normal, chronically. These disorders are generally observed in the obese, insulin-resistant, postprandial and type II diabetic subjects during the fasting and postprandial periods.
  • the hyperglycemic disorder is a disorder of carbohydrate homeostasis and more particularly type II diabetes.
  • the invention aims to prevent or treat microvascular diseases or neuropathies related to type II diabetes.
  • Microvascular diseases and neuropathies are well-known consequences of type II diabetes and are notably defined and evaluated from the Ewing tests (Mestivier D, American Journal of Physiology, (1997), 272; Gerritsen J, Diabetologia, (2000), 43, 561) and clinical approaches by an evaluation of neuropathy called "Michigan Score” (Ziegler Dan et al: Diabetes Care (2007), 30,664, Andrew JM Boulton, Diabetes Care, ( 2004), 27, 1458).
  • the compound of general formula (I) as defined above exerts its preventive or therapeutic activity according to the invention by inhibiting the production of reactive species of oxygen, in particular of H 2 O 2 , by the mitochondria and / or decreasing apoptosis due to oxidative stress or hyperglycemic disorder. More particularly, the compound of general formula (I) as defined above exerts its preventive or therapeutic activity according to the invention by inhibiting the reverse electron flow at the complex I of the mitochondrial respiratory chain.
  • the term "treatment” refers to the preventive, curative and palliative treatment, as well as the management of the patients, the reduction of the suffering, the improvement of the lifespan, the improvement of the quality of life, or slowing the progression of the disease. Description of figures
  • Figures 1 to 5 show the flow cytometric distribution of annexin V-labeled (FL3-H) and propidium iodide (PI) -mediated HMEC-1 cells (FL1-H) grown in a drug-free medium (control or incubated with 500 ⁇ M tBH in the absence or in the presence of CsA or E 008 at the indicated concentrations.
  • the cells at the beginning of apoptosis are in the bottom right quadrant, late apoptotic cells are in the top right quadrant, necrotic cells in the top left quadrant, and viable cells in the quadrant. from the bottom left.
  • Figure 6 shows the percentage of cell death measured by annexin V (black bars) or the Trypan blue exclusion test (hatched bars) under the conditions indicated. Each bar represents the mean ⁇
  • Figures 7 to 11 show the flow cytometric distribution of annexin V (FL3-H) and propidium iodide (PI) labeled HMEC-1 cells (FL1-H) grown in medium supplemented with , 5 mM glucose (Fig. 7) or 33 mM glucose (Fig. 8-1 1), and in the presence of CsA (Fig. 9), N-acetylcysteine (Fig. 10) or E 008.
  • the cells at the beginning of apoptosis are found in the bottom right quadrant, late apoptotic cells are in the top right quadrant, necrotic cells in the top left quadrant, and viable cells in quarter of the bottom left.
  • Figure 12 shows the percentage of cell death measured by annexin V (black bars) or by the Trypan blue exclusion test (hatched bars) under the conditions indicated. Each bar represents the mean ⁇
  • Figure 13 represents the quantification of mitochondrial levels
  • Figures 14 to 19 show the concentration of external calcium (axis of ordinates, in ⁇ M) as a function of time (abscissa axis) for HMEC-1 cells permeabilized with the control digit (Figs 14 and 17), directly exposed to 1 ⁇ M CsA (FIG 15 and 18) or incubated with 100 ⁇ M E 008 and in the presence of 5 mM succinate (FIG 14-16) or 5 mM glutamate / malate
  • Figure 20 shows the calcium retention capacity (ordinate axis, in nmol for 10 6 cells) for the above conditions, the black bars representing the conditions in the presence of succinate and the hatched bars the conditions in the presence of glutamate / malate. Each bar represents the mean ⁇ ESM for five separate experiments.
  • the star symbol ( * ) represents p ⁇ 0.01 with respect to the control cells.
  • the star symbol (#) represents p ⁇ 0.05 with respect to the condition in the presence of 100 ⁇ M E 008.
  • FIG. 21 shows the measured ROS (H 2 O 2 ) production as the relative fluorescence of Amplex Red (Y axis, arbitrary units) versus time in permeabilized HMEC-1 cells and incubated for 4 h without ( control) or with 10 mM E 008 in the presence of glutamate / malate (GM), succinate (S) or both (GMS), with the sequential addition of rotenone inhibitors (Rot) and antimycin A (AA).
  • FIG. 22 represents the intracellular fluorescence of DCF (ordinate axis, percentage of relative fluorescence units (UFR)) for living cells preincubated with 10 mM E 008 or directly exposed to rotenone or antimycin A. Results are expressed by taking basal fluorescence untreated control cells as the 100% reference.
  • the star symbol ( * ) represents p ⁇ 0.01 compared to the control cells.
  • HMEC-1 human dermal microvascular endothelial cell line (HMEC-1) (CEA Grenoble, Angioinserm EM / 0105) was used.
  • the cells were cultured to confluence in MCBD 131 culture medium supplemented with 15% heat-inactivated fetal calf serum (FCS), 2 mM L-glutamine, 50 IU / ml penicillin, 50 ⁇ g / ml. ml streptomycin, 10 ng / ml endothelial growth factor (EGF), 1 ⁇ g / ml hydrocortisone, and maintained in a humidified atmosphere (5% CO 2 ) at 37 ° C.
  • FCS heat-inactivated fetal calf serum
  • EGF endothelial growth factor
  • hydrocortisone 10 ng / ml hydrocortisone
  • E 008 can be prepared in particular according to EP 1 250 328.
  • the cells were harvested and immediately resuspended in a cold solution consisting of 20 mM Tris, pH 7.2, 40 mM KCl, 250 mM sucrose, 2 mM EGTA, and 200 ⁇ g / ml digitonin. After a 5 min incubation on ice, the cells were pelleted (10,000 rpm for 10 min) to remove contaminating cytosolic enzymatic activities.
  • HMEC-1 cells 1.5 x 10 7 cells / ml
  • a stirring oxyphrine thermostatically maintained. at 37 ° C and equipped with a Clark oxygen electrode.
  • the rate of oxygen consumption was first measured in the absence of any addition; then 2 ⁇ g / ml oligomycin, 125 ⁇ M dinitrophenol (DNP), 3.8 ⁇ M myxothiazol, and 1 mM tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD) + 5 mM ascorbate were added successively.
  • DNP dinitrophenol
  • TMPD tetramethyl-p-phenylenediamine
  • the lactate / pyruvate ratio which is proportional to the NADH / NAD + ratio, was taken as an index of the redox potential of the cells.
  • the cells were recovered by centrifugation and incubated on ice for 5 min in PCA (2.5%) / EDTA (6.25 mM). Insoluble material was removed by centrifugation at 12,000 x g for 5 min, and the resulting supernatant was neutralized with KOH / MOPS. After removal of precipitated KC10 4 by centrifugation (12,000 g for 10 min), the final extract was stored and further analyzed by HPLC. The concentrations of ATP, ADP, and AMP in the samples were calculated by comparison with known standards.
  • ROS reactive oxygen species
  • DCF-DA dichlorofluorescein diacetate dye method
  • HMEC-1 cells (1 x 10 7 ) were incubated with or without E 008 as previously described. The cells were then centrifuged and resuspended in a medium containing 250 mM sucrose, 10 mM MOPS, 1 mM Pi-Tris and 50 ⁇ g / ml digitonin (pH 7.35) and placed in a spectrofluorometer tank. in quartz, with continuous stirring then kept thermostatically at 25 ° C. After 2 min, the cells were permeabilized and 1 ⁇ M CsA or vehicle was added to the medium as indicated.
  • pulses of 5 ⁇ l of Ca 2+ at 4 mM were applied successively at intervals of two minutes until the opening of the PTP, as indicated by the release of Ca 2+ in the medium.
  • the Ca 2+ measurements were performed in fluorimetry using a PTI Quantamaster C61 spectrofluorometer. Free Ca 2+ was measured in the presence of 0.25 ⁇ M Calcium Green-5N with excitation and emission wavelengths set at 506 and 532 nm respectively.
  • Live cell calcein staining was performed after the cells (8 ⁇ 10 4 ) were cultured for 48 hours on circular glass coverslips 22 mm in diameter and exposed for 15 minutes at 37 ° C. to medium.
  • phosphate buffered saline (PBS) supplemented with 5 mM glucose, 0.35 mM pyruvate, 1 mM CoCl 2 and 1 ⁇ M calcein-acetomethoxyl ester. After incorporation, the cells were washed to remove calcein and CoCl 2 and incubated for another 20 minutes at 37 ° C in PBS / glucose / pyruvate.
  • the coverslips were then mounted on the field of an inverted microscope and the opening of the PTPs was carried out by the addition of 100 ⁇ M of tert-butyl hydroperoxide (tBH).
  • tBH tert-butyl hydroperoxide
  • the cell shots were performed using a 488 nm argon laser-speciated LEICA TCS SP2 confocal microscope and two helium-neon lasers emitting at 543 and 633 nm, respectively. Cell images were recorded every minute with a constant exposure time using a 63X / 1.20 Apo Plan water immersion objective.
  • HMEC-1 cells were preincubated either with 10 mM or with 10OmM E 008 as previously described. The cells were then washed with PBS before being exposed to 0.5 mM tBH for 45 minutes in culture medium lacking FBS and growth factors. The cells were washed again with PBS and incubated at 37 ° C for 24 hours in a complete MCDB medium. For induction of cell death by glucose, the cells were exposed to 5.5 mM glucose (control cells) or 33 mM glucose for 48 h. Cytotoxicity was evaluated either by the trypan blue exclusion test (5%) or by flow cytometry using the Annexin V-Fluoprobes kit. Study of the release of cytochrome c by Western labeling and immunohistochemistry
  • Cytochrome c was evaluated in both the mitochondrial and cytoplasmic spaces after HMEC-1 cells were fractionated with digitonin as previously described for the I complex assay. Cytosolic (15 ⁇ g) and mitochondrial ( 25 ⁇ g) were separated by SDS / PAGE (10% gel) in MES buffer and then analyzed by Western labeling. The membranes were labeled with the cloned monoclonal antibody 7H8.2C12 directed against cytochrome c (1 ⁇ g / ml), and revealed with horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-mouse antibody and chemiluminescent detection.
  • cytochrome c release For visualization of cytochrome c release by immunohistochemistry, the cells were fixed in 3.7% paraformaldehyde / PBS for 20 min, permeabilized in 0.2% Triton X-100 for 5 min and then blocked in 2. % bovine serum albumin (BSA) / PBS (blocking buffer) for 1 h. The cells were then incubated with a mouse anti-cytochrome c monoclonal antibody (clone 6H2.B4,) for 2 h, then exposed to Oregon Green labeled anti-mouse secondary antibody for 1 h at room temperature in the room. black.
  • BSA bovine serum albumin
  • HMEC-1 cells to tBH led to a consequent increase in apoptosis / late necrosis since most of the damaged endothelial cells were positive for both annexin V and propidium iodide . Similar percentages of staining were obtained with trypan blue, indicating that the dead cells were essentially necrotic. Interestingly, the deleterious effect of tBH was completely prevented by E 008, independently of the time and concentration used (10 mM or 100 ⁇ M, respectively for 4 hours or 24 hours).
  • E 008 prevents the release of TBH-related cytochrome c and a high glucose concentration
  • the cytochrome c content of the mitochondrial and cytosolic compartments was determined by Western labeling analysis.
  • the inventors have noted that although cytochrome c is strongly detected in the cytoplasm of the control cells, tBH treatment has caused a significant increase in cytosolic levels (Fig. 13). This increase was completely prevented by 1 OmM or 100 ⁇ M E 008, as well as by CsA. Neither I 1 E 008 at either concentration nor CsA altered the mitochondrial content in cytochrome c, indicating that only a very limited proportion diffused to the outside of the mitochondria. As a result, the relationship between cytotoxicity due to high glucose concentration, leakage of cytochrome c and the effect of E 008 was controlled in a different way.
  • cytochrome c in the control HMEC-1 cells, is localized in the mitochondria, which appears as a fine filamentous structure around the nucleus.
  • glucose at 33 mM induced release of cytochrome c in some endothelial cells. Remarkably, this event was prevented by E 008 at both concentrations.
  • E 008 modulates the opening of PTP in permeabilized and living HMEC-1 cells
  • rotenone or metformin inhibit the opening of the PTP only in the presence of succinate alone, a condition in which these compounds do not affect the respiratory chain.
  • E 008 strongly reduces the endothelial cell death associated with the opening of the PTP, the inventors then determined whether the preventive effects of E 008 could originate in a modulation of the activity of the respiratory chain. .
  • E 008 at 10 mM or 100 ⁇ M does not inhibit the activity of rotenone-sensitive complex I in endothelial cells (Table 1, Part A).
  • this compound even at the highest concentration, does not significantly inhibit oxyene consumption and cellular energy metabolism in intact HMEC-1 cells (Table 1, Part B).
  • metformin is recognized as an inhibitor of complex I of the respiratory chain in different cell types. This can lead to stimulation of glycolysis which is characterized by both an increase in lactate production and a decreased ATP / ADP ratio (Table 1). These adverse responses are likely responsible, at least in part, for the side effects of metformin, particularly in diabetic patients with predispositions to the development of various complications.
  • ROS production was determined to be the relative fluorescence of the Amplex Red or DCF probe in permeabilized or intact HMEC-1 cells respectively. It should be noted that permeabilized cells had to be studied during stage 4 respiration, ie in the presence of oligomycin, to detect an initial production of H 2 O 2 irrespective of the respiratory substrates.
  • Table 1 Effect of E 008 on rotenone-sensitive activity of complex I, on rate of oxygen uptake, and on energy metabolism in HMEC-1 cells.
  • A Endothelial cells were incubated for 4 or 24 hours in the absence (controls) or in the presence of E 008 at the indicated concentrations. Permeabilized cells were used for the determination of the activity of the complex I. The data are the mean ⁇ ESM of four different preparations.
  • B After incubation of HMEC-1 cells with 1 OmM of E 008, the cell respiration rate (OJ 2 ) was measured before and after the various additions shown. In addition, lactate production, lactate / pyruvate ratio, nucleotide content, and ATP / ADP ratio were determined. The results are expressed as the mean ⁇ ESM of five different preparations.
  • Table 2 Production Cl 1 H 2 O 2 in permeabilized HMEC-1 cells and incubated for 4 h without (controls) or with 10 mM E 008 in the presence of glutamate / malate, succinate, or both, with sequential addition of rotenone and antimycin A inhibitors. The results are expressed as the average of five separate experiments.
  • the star symbol ( * ) represents p ⁇ 0.01 compared with control cells fed with succinate alone or in combination with glutamate / malate.

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Abstract

La présente invention concerne des dérivés aminés de dihydro-1,3,5- triazine de formule (I) pour leur utilisation dans le traitement du stress oxydatif et des maladies qui lui sont associées, notamment chez les individus hyperglycémiques.

Description

Dérivés aminés de dihydro-1 ,3,5-triazine
pour le traitement du stress oxydatif
Domaine de l'invention
La présente invention concerne des dérivés aminés de dihydro-1 ,3,5- triazine pour leur utilisation dans le traitement du stress oxydatif et des maladies qui lui sont associées, notamment chez les individus hyperglycémiques.
Arrière plan technique
Le stress oxydatif (ou stress oxydant) est reconnu comme étant un élément important du déclenchement ou de la progression de maladies comme les maladies cardiovasculaires, les neuropathies diabétiques, les maladies neurodégénératives, les cancers, ou encore de phénomènes tels que le vieillissement.
Le stress oxydatif trouve son origine dans l'action de composés prooxydants, notamment des radicaux libres, qui sont en général des espèces réactives de l'oxygène (ROS), comme le peroxyde d'hydrogène (H2O2). Ces composés endommagent de nombreuses structures cellulaires, telles que les lipides membranaires, les protéines, ou les acides nucléiques.
II apparaît en outre que les composés pro-oxydants peuvent être responsables du déclenchement de l'apoptose, c'est-à-dire de la mort cellulaire programmée. Les composés pro-oxydants, notamment les ROS, semblent ainsi provoquer l'ouverture du pore transitoire de perméabilité (PTP) mitochondrial, une des étapes précoces dans le processus d'apoptose.
La principale source de ROS de l'organisme est la mitochondrie. La mitochondrie est le siège de la phosphorylation oxydative, qui permet la synthèse d'ATP par l'ATP synthase grâce à la force protomotrice liée au gradient électrochimique de part et d'autre de la membrane interne mitochondriale. Ce gradient est créé par l'action de la chaîne respiratoire, située dans la membrane interne mitochondriale, qui catalyse, par l'intermédiaire de plusieurs complexes d'oxydoréduction, l'oxydation de coenzymes d'oxydoréductions (comme le NADH et le FADH2) par l'oxygène moléculaire (O2). Les coenzymes réduits proviennent quant à eux de l'oxydation de différents substrats énergétiques, tels que le glucose par exemple. A l'heure actuelle, il apparaît que c'est au niveau de la chaîne respiratoire que les ROS sont produits, notamment au niveau des complexes I et III, et plus particulièrement au niveau du complexe I. De plus, il semble que ce soit lorsque le complexe I fonctionne en flux électronique inverse que cette production soit la plus importante.
Les principaux tissus cibles du stress oxydatif sont ainsi généralement ceux présentant un métabolisme oxydatif important, comme le tissu nerveux, les tissus vasculaires, le cœur, les muscles et le foie. Par ailleurs, la part importante du métabolisme oxydatif dans le stress oxydatif permet d'expliquer que les troubles hyperglycémiques, comme le diabète de type II, soient souvent à l'origine de maladies liées au stress oxydatif, du fait de l'augmentation du métabolisme oxydatif du glucose qui en découle.
Plusieurs stratégies sont envisagées à l'heure actuelle pour lutter contre le stress oxydatif et ses conséquences. L'une d'elle consiste à réaliser un apport en composés anti-oxydants, tels que la vitamine C, la vitamine E, la N-acétyl-L- cystéine, ou encore en glutathion. L'efficacité de cette approche reste toutefois encore à démontrer.
Alternativement, il est proposé d'utiliser des composés permettant de limiter l'apoptose consécutive au stress oxydatif ou la production de ROS par la mitochondrie.
Ainsi, la cyclosporine A (CsA), l'inhibiteur de référence de l'ouverture du PTP, a été proposée comme agent de neuroprotection ou de cardioprotection (Mattson & Kroemer (2003) Trends in Molecular Medicine 9:196-205). Toutefois, la CsA étant également un composé immunosuppresseur, de nombreux effets secondaires limitent son utilisation clinique.
Il a par ailleurs été proposé d'utiliser la metformine, un agent antidiabétique, pour limiter la production de ROS par la mitochondrie, et la mort cellulaire qui en découle, dans le cadre du traitement des maladies vasculaires et des troubles neuropathiques liés au diabète de type II (Détaille et al. (2005) Diabètes 54:2179-2187 ; El-Mir et al. (2008) J. Mol. Neurosci. 34:77-87). La metformine agit notamment par une inhibition du complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale, à la fois sur le flux classique mais aussi sur le flux reverse des électrons, ce qui provoque une diminution de la production d'ATP par la mitochondrie, et par voie de conséquence une diminution de la néoglucogenèse {Le. la synthèse de glucose par le foie). Toutefois, l'inhibition du complexe I semble également être à l'origine de l'acidose lactique parfois associée à l'utilisation de ce composé, notamment du fait de la stimulation de la glycolyse et de la fermentation lactique qui compense la diminution de la production énergétique mitochondriale (Owen ét al. (2000) Biochem. J. 348:607-614).
Il reste donc encore à trouver un composé permettant de lutter contre le stress oxydatif dépourvu d'effets secondaires susceptibles de limiter son utilisation.
Par ailleurs, il est connu du brevet européen EP 1250 328, des dérivés aminés de dihydro-1 ,3,5-triazine de formule générale (I) suivante :
Figure imgf000004_0001
II a pu être démontré que ces composés présentaient une activité antidiabétique dans un modèle expérimental de diabète non insulinodépendant, induit chez le rat par la Streptozotocine.
Résumé de l'invention
La présente invention découle de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, qu'un composé de formule générale (I), le composé E 0008 permettait de réduire l'apoptose, liée au stress oxydatif, de cellules endothéliales, ainsi que la production de ROS par le complexe I de la chaine respiratoire de ces cellules, en inhibant exclusivement le flux électronique inverse, mais sans inhiber la respiration mitochondriale. L'action de ce composé ne s'accompagne donc pas d'une surproduction de lactate.
Ainsi, la présente invention concerne un composé de formule générale (I) suivante :
Figure imgf000005_0001
dans laquelle :
• R1 , R2, R3, et R4 sont choisis indépendamment parmi les groupes :
- H,
- alkyle (C1 -C20) substitué ou non par halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -
C5), cycloalkyle (C3-C8), alkènyle (C2-C20) substitué ou non par halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkyne (C2-C20) substitué ou non par halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5),
- cycloalkyle (C3-C8) substitué ou non par alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), - hétérocycloalkyle (C3-C8) portant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et substitué ou non par alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5),
- aryl (C6-C14) alkyle (C1 -C20) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
- aryl (C6-C14) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
- hétéroaryle (C1 -C13) portant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi
N, O, S et substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6- C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
R1 et R2, d'une part, et R3 et R4, d'autre part, pouvant former avec l'atome d'azote un cycle à n chaînons (n compris entre 3 et 8) comprenant ou non un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et pouvant être substitué par un ou plusieurs groupements suivants : amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6- C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
• R5 et R6 sont choisis indépendamment parmi les groupes :
- H,
- alkyle (C1 -C20) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle
(C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
- alkényle (C2-C20) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-
C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
- alkynyle (C2-C20) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6- C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
- cycloalkyle (C3-C8) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6- C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
- hétérocycloalkyle (C3-C8) portant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 - C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
- aryl (C6-C14) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
- hétéroaryle (C1 -C13) portant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N,
O, S et substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6- C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
- aryl (C6-C14) alkyle (C1 -C5) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
R5 et R6 pouvant former avec l'atome de carbone sur lequel ils sont fixés un cycle à m chaînons (m compris entre 3 et 8) comprenant ou non un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et pouvant être substitué par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 - C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
ou pouvant former avec l'atome de carbone un reste polycyclique en C10-
C30 substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
R5 et R6 pouvant également représenter ensemble le groupement =0 ou =S, l'atome d'azote d'un groupe hétérocycloalkyle ou hétéroaryle pouvant être substitué par un groupe alkyle (C1 -C5), cycloalkyle (C3-C8), aryl(C6-C14), aryl(C6-C14)alkyle(C1 -C5) ou acyle(C1 -C6),
ainsi que les formes tautomères, énantiomères, diastéréoisomères et épimères et les sels pharmaceutiquement acceptables de celui-ci,
pour son utilisation dans la prévention ou le traitement du stress oxydatif ou des pathologies associées au stress oxydatif.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé de formule générale (I) telle que définie ci-dessus, ainsi que les formes tautomères, énantiomères, diastéréoisomères et épimères et les sels pharmaceutiquement acceptables de celui-ci, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement du stress oxydatif ou des pathologies associées au stress oxydatif. La présente invention concerne également une méthode de prévention ou de traitement du stress oxydatif ou des pathologies associées au stress oxydatif chez un individu, dans laquelle on administre à l'individu une quantité prophylactiquement ou thérapeutiquement efficace d'un composé de formule générale (I) telle que définie ci-dessus, ou un composé choisi parmi les formes tautomères, énantiomères, diastéréoisomères et épimères et les sels pharmaceutiquement acceptables de celui-ci.
Description détaillée de l'invention
Par « cycle à m chaînons formé par R5 et R6 », on entend en particulier un cycle saturé tel qu'un groupe cyclohexyle, pipéridinyle ou tétrahydropyrannyle.
Par « groupe polycyclique formé par R5 et R6 », on entend un groupe polycyclique carboné éventuellement substitué et en particulier un reste de stéroïde.
Un groupe particulier de composés de formule générale (I) est celui dans lequel R5 est l'hydrogène.
Un autre groupe particulier de composés de formule générale (I) est celui dans lequel R5 et R6 forment avec l'atome de carbone sur lequel ils sont fixés un cycle à m chaînons, (m compris entre 3 et 8) comprenant ou non un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et pouvant être substitué par un ou plusieurs groupements suivants:
alkyle (C1 -C5), amino, hydroxy, alkylamino(C1 -C5), alkoxy(C1 -C5), alkylthio(C1 -C5), aryl (C6-C14), aryl(C6-C14)-alkoxy(C1 -C5),
ou forment avec l'atome de carbone un reste polycyclique en C10-C30 substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy
(C1 C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle.
Un autre groupe particulier de composés de formule générale (I) est celui dans lequel R5 et R6 sont choisis indépendamment parmi les groupes :
alkyle (C1 -C20) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle.
L'invention se rapporte également aux formes tautomères, aux énantiomères, diastéréoisomères, épimères et aux sels organiques ou minéraux des composés de formule générale (I).
Les composés de l'invention de formule générale (I) définis tels que précédemment possédant une fonction suffisamment acide ou une fonction suffisamment basique ou les deux, peuvent inclure les sels correspondants d'acide organique ou minéral ou de base organique ou minérale pharmaceutiquement acceptables.
En particulier, les composés de formule générale (I) possèdent des atomes d'azote basiques qui peuvent être monosalifiés ou disalifiés par des acides organiques ou minéraux.
De préférence, le composé selon l'invention est sous forme de chlorhydrate.
De préférence, R6 est un groupe alkyle (C1 -C20), notamment un groupe méthyle.
De préférence, R1 et/ou R2 représente(nt) un groupe alkyle (C1 -C20), notamment un groupe méthyle.
De préférence, R3 et/ou R4 représente(nt) un atome d'hydrogène.
De préférence, R1 et R2 sont un groupe méthyle et R3 et R4 représentent un hydrogène.
Parmi les composés de formule générale (I) préférés, on peut citer notamment le composé E 008 de formule (la) :
CH 3 H
H3C II II
N N
CH3
(la)
ainsi que ses formes tautomères, énantiomères, diastéréoisomères et épimères et/ou sels pharmaceutiquement acceptables. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le composé de formule générale (I) est la (+) 5,6-dihydro-4-diméthylamino-2-imino-6-méthyl-1 ,3,5-triazine ou son chlorhydrate.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le composé de formule générale (I) est la (-) 5,6-dihydro-4-diméthylamino-2-imino-6-méthyl-1 ,3,5-triazine ou son chlorhydrate.
Selon la présente invention, les radicaux « alkyles » représentent des radicaux hydrocarbonés saturés, en chaîne droite ou ramifiée, de 1 à 20 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone. On peut notamment citer, lorsqu'ils sont linéaires, les radicaux méthyle, éthyle, propyle, butyle, pentyle, hexyle, octyle, nonyle, décyle, dodécyle, hexadécyle, et octadécyle. On peut notamment citer, lorsqu'ils sont ramifiés ou substitués par un ou plusieurs radicaux alkyles, les radicaux isopropyle, tert-butyle, 2-éthylhexyle, 2-méthylbutyle, 2- méthylpentyle, 1 -méthylpentyle et 3-méthylheptyle.
Les radicaux « alkoxy » selon la présente invention sont des radicaux de formule -O-Alkyle, l'alkyle étant tel que défini précédemment.
« Alkylthio » désigne un groupe alkyl-S-, le groupe alkyle étant tel que défini ci-dessus.
« Alkylamino » désigne un groupe alkyl-NH-, le groupe alkyle étant tel que défini ci-dessus.
Parmi les atomes d'halogène, on cite plus particulièrement les atomes de fluor, de chlore, de brome et d'iode.
Les radicaux « alkényles » représentent des radicaux hydrocarbonés, en chaîne droite ou linéaire, et comprennent une ou plusieurs insaturations éthyléniques. Parmi les radicaux alkényles, on peut notamment citer les radical allyle ou vinyle.
Les radicaux « alkynyles » représentent des radicaux hydrocarbonés, en chaîne droite ou linéaire, et comprennent une ou plusieurs insaturations acétyléniques. Parmi les radicaux alkynyles, on peut notamment citer le radical acétylène.
Le radical « cycloalkyle » est un radical hydrocarboné mono-, bi- ou tri- cyclique saturé ou partiellement insaturé, non aromatique, de 3 à 10 atomes de carbone, tel que notamment le cyclopropyle, cyclopentyle, cyclohexyle ou adamantyle, ainsi que les cycles correspondants contenant une ou plusieurs insaturations.
Les radicaux « hétérocycloalkyles » désignent les systèmes mono ou bicycliques, saturés ou partiellement insaturés, non aromatiques, de 3 à 8 atomes de carbone, comprenant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O ou S.
« Aryl » désigne un système aromatique hydrocarboné, mono ou bicyclique de 6 à 10 atomes de carbone. Parmi les radicaux aryles, on peut notamment citer le radical phényle ou naphtyle, plus particulièrement substitué par au moins un atome d'halogène.
Les radicaux « arylalkyles » ou « aralkyles » sont des radicaux aryl-alkyl-, les groupes aryles et alkyles étant tels que définis ci-dessus. Parmi les radicaux arylalkyle, on peut notamment citer le radical benzyle ou phénéthyle.
« Aryloxy » désigne un groupe aryl-O-, le groupe aryle étant tel que défini ci- dessus.
« Arylalkoxy » désigne un groupe aryl-alkoxy-, les groupes aryle et alkoxy étant tels que définis ci-dessus.
Les radicaux « hétéroaryles » désignent les systèmes aromatiques comprenant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi l'azote, l'oxygène ou le soufre, mono ou bicyclique, de 5 à 10 atomes de carbone. Parmi les radicaux hétéroaryles, on pourra citer le pyrazinyle, le thiényle, l'oxazolyle, le furazanyle, le pyrrolyle, le 1 ,2,4-thiadiazolyle, le naphthyridinyle, le pyridazinyle, le quinoxalinyle, le phtalazinyle, l'imidazo[1 ,2-a]pyridine, l'imidazo[2,1 -b]thiazolyle, le cinnolinyle, le triazinyle, le benzofurazanyle, l'azaindolyle, le benzimidazolyle, le benzothiényle, le thiénopyridyle, le thiénopyrimidinyle, le pyrrolopyridyle, l'imidazopyridyle, le benzoazaindole, le 1 ,2,4-triazinyle, le benzothiazolyle, le furanyle, l'imidazolyle, l'indolyle, le triazolyle, le tétrazolyle, l'indolizinyle, l'isoxazolyle, l'isoquinolinyle, l'isothiazolyle, l'oxadiazolyle, le pyrazinyle, le pyridazinyle, le pyrazolyle, le pyridyle, le pyrimidinyle, le purinyle, le quinazolinyle, le quinolinyle, l'isoquinolyle, le 1 ,3,4-thiadiazolyle, le thiazolyle, le triazinyle, l'isothiazolyle, le carbazolyle, ainsi que les groupes correspondants issus de leur fusion ou de la fusion avec le noyau phényle « Carboxyalkyle » désigne un groupe HOOC-alkyl-, le groupe alkyle étant tel que défini ci-dessus. Comme exemple de groupes carboxyakyles, on peut citer notamment le carboxyméthyle ou le carboxyéthyle.
L'expression « sels pharmaceutiquement acceptables » fait référence aux sels d'addition acide relativement non toxiques, inorganiques et organiques, et les sels d'addition de base, des composés de la présente invention. Ces sels peuvent être préparés in situ pendant l'isolement final et la purification des composés. En particulier, les sels d'addition acide peuvent être préparés en faisant réagir séparément le composé purifié sous sa forme épurée avec un acide organique ou inorganique et en isolant le sel ainsi formé. Parmi les exemples de sels d'addition acide on trouve les sels bromhydrate, chlorhydrate, sulfate, bisulfate, phosphate, nitrate, acétate, oxalate, valérate, oléate, palmitate, stéarate, laurate, borate, benzoate, lactate, phosphate, tosylate, citrate, maléate, fumarate, succinate, tartrate, naphthylate, mésylate, glucoheptanate, lactobionate, sulfamate, malonate, salicylate, propionate, méthylènebis-b-hydroxynaphtoate, acide gentisique, iséthionate, di-p-toluoyltartrate, méthanesulfonate, éthanesulfonate, benzènesulfonate, p-toluènesulfonate, cyclohexyl sulfamate et quinateslaurylsulfonate, et analogues (Voir par exemple S. M. Berge et al. « Pharmaceutical Salts » J. Pharm. Sci, 66 :p.1 -19 (1977)). Les sels d'addition acide peuvent également être préparés en faisant réagir séparément le composé purifié sous sa forme acide avec une base organique ou inorganique et en isolant le sel ainsi formé. Les sels d'addition acide comprennent les sels aminés et métalliques. Les sels métalliques adaptés comprennent les sels de sodium, potassium, calcium, baryum, zinc, magnésium et aluminium. Les sels de sodium et de potassium sont préférés. Les sels d'addition inorganiques de base adaptés sont préparés à partir de bases métalliques qui comprennent hydrure de sodium, hydroxyde de sodium, hydroxyde de potassium, hydroxyde de calcium, hydroxyde d'aluminium, hydroxyde de lithium, hydroxyde de magnésium, hydroxyde de zinc. Les sels d'addition aminés de base adaptés sont préparés à partir d'aminés qui ont une alcalinité suffisante pour former un sel stable, et de préférence comprennent les aminés qui sont souvent utilisées en chimie médicinale en raison de leur faible toxicité et de leur acceptabilité pour l'usage médical : ammoniac, éthylènediamine, N-méthyl-glucamine, lysine, arginine, ornithine, choline, N, N'- dibenzylethylenediamine, chloroprocaïne, diéthanolamine, procaïne, N-benzyl- phénéthylamine, diéthylamine, pipérazine, tris(hydroxymethyl)-aminomethane, hydroxyde de tétraméthylammonium, triéthylamine, dibenzylamine, éphénamine, dehydroabiétylamine, N-éthylpiperidine, benzylamine, tétra-méthylammonium, tétraéthylammonium, méthylamine, diméthylamine, triméthyl-amine, éthylamine, acides aminés de base, par exemple lysine et arginine, et dicyclohexylamine, et analogues.
Les composés de formule générale (I) peuvent être préparés par application ou adaptation de toute méthode connue en soi de et/ou à la portée de l'homme du métier, notamment celles décrites par Larock dans Comprehensive Organic
Transformations, VCH Pub., 1989, ou par application ou adaptation des procédés décrits dans EP 1 250 328.
Les composés pharmaceutiques selon l'invention peuvent être présentés sous des formes destinées à l'administration par voie parentérale, orale, rectale, permuqueuse ou percutanée.
Les compositions pharmaceutiques incluant ces composés de formule générale (I) seront donc présentées sous forme de solutés ou de suspensions injectables ou flacons multi-doses, sous forme de comprimés nus ou enrobés, de dragées, de capsules, de gélules, de pilules, de cachets, de poudres, de suppositoires ou de capsules rectales, de solutions ou de suspensions, pour l'usage percutané, dans un solvant polaire, pour l'usage permuqueux.
Les excipients qui conviennent pour de telles administrations sont les dérivés de la cellulose ou de la cellulose microcristalline, les carbonates alcalinoterreux, le phosphate de magnésium, les amidons, les amidons modifiés, le lactose pour les formes solides.
Pour l'usage rectal, le beurre de cacao ou les stéarates de polyéthylèneglycol sont les excipients préférés.
Pour l'usage parentéral, l'eau, les solutés aqueux, le sérum physiologique, les solutés isotoniques sont les véhicules les plus commodément utilisés.
La posologie peut varier dans les limites importantes (0,5 mg à 1000 mg) en fonction de l'indication thérapeutique et de la voie d'administration, ainsi que de l'âge et du poids du sujet. Comme on l'entend ici l'expression « stress oxydatif » désigne un état dans lequel l'organisme est confronté à des quantités excessives de composés prooxydants, tels que des espèces réactives de l'oxygène (ROS), c'est-à-dire à des quantités dépassant les systèmes naturels de lutte de l'organisme contre ces composés. Le stress oxydatif est notamment défini par Cardoso Susana et coll. Dans Radical Biology & Médecine, (2008), 45, 1395. L'expression « maladies associées au stress oxydatif » désigne l'ensemble des maladies dont le déclenchement ou l'entretien trouve son origine, au moins partiellement, dans le stress oxydatif.
De préférence, les maladies associées au stress oxydatif sont sélectionnées dans le groupe constitué de l'athérosclérose, des maladies cardiovasculaires, des neuropathies diabétiques, des maladies neurodégénératives, telles que la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson, de la maladie chronique du poumon (« Chronic Lung disease ») et des cancers.
De préférence, l'invention vise la prévention ou l'inhibition de l'apoptose liée au stress oxydatif, notamment l'apoptose de cellules des tissus nerveux, vasculaires, cardiaques, musculaires ou hépatiques.
De manière préférée également, l'invention vise la prévention ou le traitement du stress oxydatif, ou des maladies associées au stress oxydatif, qui sont liés à un trouble hyperglycémique.
Comme on l'entend ici l'expression « trouble hyperglycémique » désigne l'ensemble des maladies atteignant un individu, dans lesquelles la glycémie de l'individu en l'absence de traitement est supérieure à la normale, de façon chronique. Ces troubles sont généralement observés chez le sujet obèse, insulinorésistant en période postprandiale et chez le diabétique de type II en période de jeun et postprandiale. En particulier, le trouble hyperglycémique est un trouble de l'homéostasie glucidique et plus particulièrement le diabète de type II.
De manière particulièrement préférée, l'invention vise la prévention ou le traitement des maladies microvasculaires ou des neuropathies liées à un diabète de type II.
Les maladies microvasculaires et les neuropathies sont des conséquences bien connues du diabète de type II et sont notamment définies et évaluées à partir des tests de Ewing (Mestivier D, American Journal of Physiology, (1997), 272 ; Gerritsen J, Diabetologia, (2000), 43 ,561 ) et des approches cliniques par une évaluation de la neuropathie appelée « Michigan Score » (Ziegler Dan and al : Diabètes Care (2007), 30,664 ; Andrew J. M. Boulton, Diabètes Care ,(2004), 27, 1458).
De préférence, le composé de formule générale (I) telle que définie ci- dessus exerce son activité préventive ou thérapeutique selon l'invention en inhibant la production d'espèce réactives de l'oxygène, notamment d'H2O2, par la mitochondrie et/ou en diminuant l'apoptose liée à un stress oxydatif ou à un trouble hyperglycémique. Plus particulièrement, le composé de formule générale (I) telle que définie ci-dessus exerce son activité préventive ou thérapeutique selon l'invention en inhibant le flux électronique inverse au niveau du complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale. Dans le contexte de l'invention, le terme « traitement » désigne le traitement préventif, curatif, palliatif, ainsi que la prise en charge des patients, la réduction de la souffrance, l'amélioration de la durée de vie, l'amélioration de la qualité de vie, ou le ralentissement de la progression de la maladie. Description des figures
Figures 1, 2, 3, 4, 5 et 6
Effet de la CsA ou de l'E 008 sur l'apoptose des cellules endothéliales induite par le tBH (hydroperoxyde de tert-butyle)
Les figures 1 à 5 représentent la distribution en cytométrie de flux de cellules HMEC-1 marquée par l'annexine V (FL3-H) et l'iodure de propidium (IP) (FL1 -H) cultivées dans un milieu sans drogue (contrôle) ou incubées avec 500 μM de tBH en l'absence ou en présence de CsA ou d'E 008 aux concentrations indiquées. Les cellules en début d'apoptose se trouvent dans le quart du bas à droite, les cellules en apoptose tardive se trouvent dans le quart en haut à droite, les cellules nécrotiques dans le quart du haut à gauche, et les cellules viables dans le quart du bas à gauche. La figure 6 représente le pourcentage de mort cellulaire mesurée par l'annexine V (barres noires) ou par le test d'exclusion du bleu Trypan (barres hachurées) dans les conditions indiquées. Chaque barre représente la moyenne ±
ESM de cinq expériences indépendantes. Le symbole étoile (*) représente p < 0,01 par rapport au témoins.
Figures 7, 8, 9, 10, 11 et 12
Effet de la CsA, de la N-acétyl-cystéine, ou de l'E 008 sur l'apoptose des cellules endothéliales induite par une forte concentration en glucose
Les figures 7 à 1 1 représentent la distribution en cytométrie de flux de cellules HMEC-1 marquée par l'annexine V (FL3-H) et l'iodure de propidium (IP) (FL1 -H) cultivées dans un milieu supplémenté par 5,5 mM de glucose (Fig. 7) ou 33 mM de glucose (Fig. 8-1 1 ), et en présence de CsA (Fig. 9), de N-acétyl- cystéine (Fig. 10) ou d'E 008. Les cellules en début d'apoptose se trouvent dans le quart du bas à droite, les cellules en apoptose tardive se trouvent dans le quart en haut à droite, les cellules nécrotiques dans le quart du haut à gauche, et les cellules viables dans le quart du bas à gauche.
La figure 12 représente le pourcentage de mort cellulaire mesurée par l'annexine V (barres noires) ou par le test d'exclusion du bleu Trypan (barres hachurées) dans les conditions indiquées. Chaque barre représente la moyenne ±
ESM de quatre expériences indépendantes. Le symbole étoile (*) représente p <
0,05 par rapport aux témoins. Figure 13
Evaluation de la mort cellulaire induite par le tBH par détermination en marquage Western de la libération de cytochrome c
La figure 13 représente la quantification des niveaux mitochondriaux
(barres noires) et cytosolique (barres blanches) en cytochrome c mesurés par densitométrie (axe des ordonnées, unités arbitraires). Chaque barre représente la moyenne ± ESM de trois expériences indépendantes. Le symbole étoile (*) représente p < 0,05 par rapport aux témoins. Figures 14 à 20
Effet de la CsA ou d'E 008 sur l'ouverture du PTP dans les cellules HMEC-1 perméabilisées
Les figures 14 à 19 représentent la concentration en calcium externe (axe des ordonnées, en μM) en fonction du temps (axe des abscisses) pour des cellules HMEC-1 perméabilisées à la digitonie témoins (Fig. 14 et 17), directement exposées à 1 μM de CsA (Fig. 15 et 18) ou incubées avec 100 μM d'E 008 et en présence de 5 mM de succinate (Fig. 14-16) ou de 5 mM de glutamate/malate
(Fig. 17-19). Les impulsions de 10 μM Ca++ ajoutées toutes les deux minutes sont représentées par des flèches.
La figure 20 représente la capacité de rétention de calcium (axe des ordonnées, en nmol pour 106 cellules) pour les conditions ci-dessus, les barres noires représentant les conditions en présence de succinate et les barres hachurées les conditions en présence de glutamate/malate. Chaque barre représente la moyenne ± ESM pour cinq expériences séparées. Le symbole étoile (*) représente p < 0,01 par rapport au cellules témoins. Le symbole étoile (#) représente p < 0,05 par rapport à la condition en présence de 100 μM d'E 008. Figures 21 et 22
Effet du pré-traitement par l'E 008 sur la production d'H2O2 par des cellules HMEC-1 perméabilisées et vivantes
La figure 21 représente la production de ROS mesurée (H2O2) comme la fluorescence relative de l'Amplex Red (axe des ordonnées, unités arbitraires) en fonction du temps dans des cellules HMEC-1 perméabilisées et incubées pendant 4 h sans (témoins) ou avec 10 mM d'E 008 en présence de glutamate/malate (GM), succinate (S) ou les deux (GMS), avec l'ajout séquentiel des inhibiteurs roténone (Rot) et antimycine A (AA). La figure 22 représente la fluorescence intracellulaire du DCF (axe des ordonnées, pourcentage d'unités de fluorescence relative (UFR)) pour des cellules vivantes préincubées avec 10 mM d'E 008 ou directement exposées à la roténone ou à l'antimycine A. Les résultats sont exprimés en prenant la fluorescence basale des cellules témoins non traitées comme la référence 100%. Le symbole étoile (*) représente p < 0,01 par rapport aux cellules témoins.
Les exemples ci-après sont fournis pour illustrer l'invention et ne doivent en aucun cas être considérés comme une limite à la portée de l'invention.
EXEMPLE
Matériels et méthodes
Conditions de culture cellulaire
La lignée cellulaire endothéliale microvasculaire dermique humaine (HMEC- 1 ) (CEA Grenoble, Angioinserm EM/0105) a été utilisée. Les cellules ont été cultivées jusqu'à confluence dans le milieu de culture MCBD 131 supplémenté par 15% de sérum de veau fœtal (SVF) inactivé par la chaleur, 2 mM de L-glutamine, 50 Ul/ml de pénicilline, 50 μg/ml de streptomycine, 10 ng/ml de facteur de croissance endothélial (EGF) , 1 μg/ml d'hydrocortisone, et maintenues dans une atmosphère humidifiée (5% CO2) à 37°C. Les cellules ont été traitées à la trypsine puis récoltées par centrifugation à 1000 tpm pendant 10 min.
Dosage du complexe 1 mitochondrial isolé
Des monocouches confluentes de cellules HMEC-1 ont été incubées en absence et en présence de 10 mM ou 100 μM d'E 008, pendant 4 h ou 24 h respectivement. L'E 008 peut être préparé notamment selon EP 1 250 328. Les cellules ont été récoltées puis immédiatement remises en suspension dans une solution froide constituée de 20 mM de Tris, pH 7.2, 40 mM de KCI, 250 mM de saccharose, 2 mM d'EGTA, et 200 μg/ml de digitonine. Après une incubation de 5 min sur de la glace, les cellules ont été culottées (10 000 tpm pendant 10 min) pour éliminer les activités enzymatiques cytosoliques contaminantes. Les culots cellulaires perméabilisés ont été lavés avec précaution puis remis en suspension dans le tampon ci-dessus sans digitonine avant de déterminer la vitesse d'oxydation du NADH par fluorimétrie (excitation-émission, 340-460 nm) comme décrit précédemment (Détaille et al, 2005). Mesure de la vitesse de consommation d'oxygène dans des cellles endothéliales intactes
Après une préincubation en milieu MCDB-131 avec ou sans 10 mM d'E 008, des cellules intactes HMEC-1 (1 ,5 x 107 cellules/ml) ont été placées dans le récipient d'un oxygraphe à agitation, maintenu thermostatiquement à 37°C et équipé d'une électrode à oxygène Clark. La vitesse de consommation d'oxygène a été tout d'abord mesurée en l'absence de tout ajout ; ensuite, 2 μg/ml d'oligomycine, 125 μM de dinitrophénol (DNP), 3,8 μM de myxothiazol, et 1 mM de tétraméthyl-p-phénylènediamine (TMPD) + 5 mM d'ascorbate ont été ajoutés successivement.
Evaluation du métabolisme énergétique
Après l'ajout d'E 008, la réaction a été arrêtée par l'addition de 105 μl_ d'acide perchlorique (PCA) à 70%, et les cellules ont été détachées du fond. Le milieu externe et le lysat cellulaire ont été centrifugés à 10,000 g pendant 8 min. Après neutralisation du surnageant avec un mélange KOH (2 M) / MOPS (0,3 M), les métabolites ont été mesurés enzymatiquement sur des aliquots de cette suspension déprotéinisée. Le lactate a été dosé en ajoutant du NAD+ et de la lactate deshydrogenase (LDH) puis en mesurant l'apparition de NADH à 340 nm. Le pyruvate a été mesuré en ajoutant du NADH et de la LDH puis en mesurant l'oxydation du NADH à 340 nm. Le rapport lactate/pyruvate, qui est proportionnel au rapport NADH/NAD+, a été pris comme index du potentiel redox des cellules. Pour la détermination du contenu nucléotidique total, les cellules ont été récupérée par centrifugation et incubées sur de la glace pendant 5 min dans un mélange PCA (2,5%) / EDTA (6,25 mM). Le matériel insoluble a été éliminé par centrifugation à 12 000 g pendant 5 min, et le surnageant résultant a été neutralisé avec le mélange KOH / MOPS. Après retrait du KCIO4 précipité par centrifugation (12 000 g pendant 10 min), l'extrait final a été conservé et analysé ultérieurement par HPLC. Les concentrations d'ATP, d'ADP, et d'AMP dans les échantillons ont été calculées par comparaison avec des étalons connus.
Détection de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) La vitesse de production de H2O2 dans des cellules perméabilisées a été déterminée en utilisant l'oxydation de l'indicateur fluorogénique Amplex Red en présence de peroxydase de raifort. Typiquement, 2,5 x 107 cellules perméabilisées ont été incubées à 30 °C dans un milieu KCI supplémenté par 1 mM EDTA et oligomycine. La production de H2O2 a été démarrée en utilisant soit un mélange glutamate/malate (2,5 mM) soit du succinate (2,5 mM) comme substrats. De la roténone (2-5 μM) ou de l'antimycine A (0,25 μM) ont été ajoutées séquentiellement dans le milieu d'incubation pour inhiber les activités du complexe
1 et du complex III respectivement. La fluorescence a été enregistrée sur un fluorimètre à double rayon PTI Quantamaster C61 à une longueur d'onde d'excitation de 560 nm et d'émission à 582 nm. Par ailleurs, des aliquots de cellules témoins ou de cellules traitées ont été retirés puis analysés pour la production de ROS intracellulaires par la méthode au colorant diacétate de 2,7'- dichlorofluorescéine (DCF-DA). Cette méthode de mesure de l'oxydation cellulaire est basée sur la conversion, par les ROS, d'un composé non fluorescent (DCF- DA) en un composé fortement fluorescent (DCF). Après exposition à la metformine ou à l'E 008, les cellules (5 x 106) ont été récoltées, incubées dans
2 ml de NaCI 1 10 mM, KCI 4 mM, MgCI2 10 mM, glucose 5,5 mM, CaCI2 1 ,6 mM, NaHCO3 14 mM, HEPES-Na 20 mM, pH 7,4, puis laissées incorporer 5 μM de DCF-DA à 37°C pendant 10 min. Après incorporation, la fluorescence du DCF fluorescence est mesurée par excitation à 503 nm et émission à 521 nm.
Détermination de la transition de perméabilité dans des cellules perméabilisées
Des cellules HMEC-1 (1 x 107) ont été incubées avec ou sans E 008 comme décrit précédemment. Les cellules ont ensuite été centrifugées et remises en suspension dans un milieu contenant 250 mM de saccharose, 10 mM de MOPS, 1 mM de Pi-Tris et 50 μg/ml de digitonine (pH 7,35) puis placées dans une cuve de spectrofluorimètre en quartz, sous agitation continue puis maintenue thermostatiquement à 25 °C. Après 2 min, les cellules ont été perméabilisées et 1 μM de CsA ou un véhicule a été ajouté au milieu comme indiqué. Après stabilisation du signal, des puises de 5 μl de Ca2+ à 4 mM ont été appliqués successivement à des intervalles de deux minutes jusqu'à l'ouverture du PTP, comme indiqué par la libération de Ca2+ dans le mileu. Les mesures de Ca2+ ont été effectuées en fluorimétrie à l'aide d'un spectrofluorimètre PTI Quantamaster C61. Le Ca2+ libre a été mesuré en présence de 0,25 μM de Calcium Green-5N avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission réglées à 506 et 532 nm respectivement.
Détermination de la transition de perméabilité dans des cellules intactes
La coloration à la calcéine sur cellules vivantes a été réalisée après que les cellules (8 x 104) ont été cultivées pendant 48 heures sur des lamelles en verre circulaires de 22 mm de diamètre et exposées pendant 15 minutes à 37°C à un milieu tampon salin phosphate (PBS) supplementé par 5 mM de glucose, 0,35 mM de pyruvate, 1 mM de CoCI2 et 1 μM d'ester de calcéine-acétométhoxyl. Après incorpration, les cellules ont été lavées pour les débarrasser de la calcéine et du CoCI2 puis incubées pour encore 20 minutes à 37°C dans le milieu PBS/glucose/pyruvate. Les lamelles ont alors été montées sur le champ d'un microscope inversé et l'ouverture des PTP a été réalisée par l'ajout de 100μM d'hydropéroxyde de tert-butyl (tBH). Les prises de vue des cellules ont été effectuées à l'aide d'un microscope confocal LEICA TCS SP2 à laser argon émettant à 488 nm et deux lasers hélium-néon émettant à 543 et 633 nm, respectivement. Les images de cellules ont été enregistrées toutes les minutes avec un temps d'exposition constant à l'aide d'un objectif à immersion en eau 63X/1.20 Plan Apo.
Quantification de la mort des cellules endothéliales
Les cellules HMEC-1 ont été préincubées soit avec 10 mM soit avec 10OμM d'E 008 comme décrit précédemment. Les cellules ont ensuites ont été lavées avec du PBS avant d'être exposées à 0,5 mM de tBH pendant 45 minutes dans un milieu de culture dépourvu de SVF et de facteurs de croissance. Les cellules ont à nouveau été lavées par du PBS puis incubées à 37°C pendant 24 heures dans un mileu MCDB complet. Pour l'induction de la mort cellulaire par le glucose, les cellules ont été exposées à 5,5 mM glucose (cellules témoins) ou à 33 mM glucose pendant 48 h. La cytotoxicité a été évaluée soit par le test d'exclusion du bleu trypan (5%) soit par cytométrie de flux à l'aide du kit Annexin V-Fluoprobes. Etude de la libération du cytochrome c par marquage Western et immunohistochimie
Le cytochrome c a été évalué à la fois dans les espaces mitochondriaux et cytoplasmiques après que les cellules HMEC-1 ont été fractionnées à l'aide de digitonine comme décrit auparavant pour le dosage du complexe I. Les protéines cytosoliques (15 μg) et mitochondriales (25 μg) ont été séparées par SDS/PAGE (gel à 10%) en tampon MES, puis analysées par marquage Western. Les membranes ont été marquées par l'anticorps monoclonal clone 7H8.2C12 dirigé contre le cytochrome c (1 μg/ml), et révélées à l'aide d'un anticorps de chèvre antisouris secondaire marqué à la peroxydase de raifort et d'une détection chimioluminescente.
Pour la visualisation de la libération du cytochrome c par immunohistochimie, les cellules ont été fixées dans un mélange paraformaldéhyde 3,7% / PBS pendant 20 min, perméabilisées dans 0,2 % de Triton X-100 pendant 5 min, puis bloquées dans 2% de sérum albumine bovine (SAB) / PBS (tampon de blocage) pendant 1 h. Les cellules ont ensuites été incubées avec un anticorps monoclonal de souris anti-cytochrome c (clone 6H2.B4,) pendant 2 h, puis exposées à un anticorps secondaire anti-souris marqué à l'Oregon Green pendant 1 h à température ambiante dans le noir. Après des lavages finaux, un mélange composé de 0,2 M de Tris-HCI, pH 7.8, 90% de glycérol, et 2,3% de 1 ,4- diazobicyclo-[2.2.2]-octane (DABCO, agent antidécoloration) a été appliqué et les préparations cellulaires ont été visualisées à l'aide d'un microscope confocal avec l'objectif à immersion en eau 63X/1.20 Plan Apo. Les longeurs d'onde d'excitation et d'émission pour l'Oregon Green étaient de 488 et 525 nm, respectivement. Des images de cellules, choisies au hasard en microscopie inversée à contraste de phase, ont été numérisées à une résolution de 512 x 512 pixels. Généralement, huit champs de vue distincts ont été numérisés par lamelle de verre. Résultats
Prévention de la mort cellulaire par l'E 008 L'effet de l'E 008 sur la mort cellulaire endothéliale due au tBH (Fig. 1 -6) ou par exposition à une concentration élevée de glucose (Fig. 7-12) a été étudiée par cytométrie de flux et le test d'exclusion du bleu trypan.
L'exposition de cellules HMEC-1 au tBH a conduit à une augmentation conséquente de l'apoptose/nécrose tardive dans la mesure où la plupart des cellules endothéliales endommagées étaient positives à la fois à l'annexine V et à l'iodure de propidium. Des pourcentages semblables de coloration ont été obtenus avec le bleu trypan, indiquant que les cellules mortes étaient pour l'essentiel nécrotiques. De façon intéressante, l'effet délétère du tBH a été complètement empêché par l'E 008, de façon indépendante de la durée et de la concentration utilisée (10 mM ou 100 μM, respectivement pendant 4 heures ou 24 heures). De plus, cette réponse n'était pas différente de celle de la cyclosporine A (CsA), l'inhibiteur de référence du PTP dont les effets bénéfiques vis-à-vis de la toxicité due au stress oxydatif ont été largement documentés (Bernadi P., Biochimica et Biophysica Acta (1996), 1275, 5).
Par ailleurs, lorsque les cellules HMEC-1 ont été cultivées en présence de concentrations élevées de glucose (33 mM), une augmentation significative d'un facteur 2,5 de la mort cellulaire a été obtenue après une durée d'incubation de 48 heures. Comme cela a été démontré précédemment, l'effet délétère d'une grande concentration de glucose est complètement supprimé par la N-acétyl-cystéine (un agent anti-oxydant) et la CsA. De manière remarquable, l'E 008 permet de diminuer de manière marquée la mort cellulaire endothéliale quelle que soit la dose.
Sur la base de ces résultats prometteurs, l'impact de l'E 008 sur la voie mitochondriale contrôlant la mort cellulaire a été davantage étudié.
L'E 008 prévient la libération de cytochrome c liée au tBH et à une forte concentration de glucose
Afin de s'assurer de manière certaine de l'effet positif de l'E 008 sur la mort cellulaire, les inventeurs ont étudié la distribution subcellulaire du cytochrome c dans des cellules HMEC-1 traitées ou non par cet agent antidiabétique, puis transitoirement exposées à 500 μM de tBH. En effet, il est reconnu que la libération de cytochrome c à partir de l'espace intermembranaire mitochondrial est une étape clef du processus d'engagement de la mort cellulaire (Shahzidi and al. ; Toxicology and Oncology (2006), 25, 159, Liu Yajun, Shandong Daxue Xuebao, Yixueban (2007), 45, 336).
Le contenu en cytochrome c des compartiments mitochondrial et cytosolique a été déterminé par une analyse en marquage Western. Les inventeurs ont remarqué que bien que le cytochrome c soit fortement détecté dans le cytoplasme des cellules témoins, le traitement au tBH a provoqué une augmentation significative des niveaux cytosoliques (Fig. 13). Cette augmentation a été complètement empêchée par 1 OmM ou 100μM d'E 008, ainsi que par la CsA. Ni I1E 008 aux deux concentrations, ni la CsA n'ont modifié le contenu mitochondrial en cytochrome c, ce qui indique que seule une proportion très limitée a diffusé vers l'extrérieur de la mitochondrie. De ce fait, la relation entre la cytotoxicité due à une forte concentration en glucose, la fuite du cytochrome c et l'effet de l'E 008, a été contrôlée de façon différente, Le. par imagerie confocale à fluorescence. Il est ainsi observé que le cytochrome c, dans les cellules HMEC-1 témoins, est localisé dans la mitochondrie, qui apparaît comme une fine structure filamenteuse autour du noyau. Après 48 h d'incubation, le glucose à 33 mM a induit une libération du cytochrome c dans certaines cellules endothéliales. De façon remarquable, cet événement a été empêché par l'E 008 aux deux concentrations.
L'E 008 module l'ouverture du PTP dans les cellules HMEC-1 perméabilisées et vivantes
Comme l'E 008 produit un effet protecteur prononcé comparable à celui de la CsA, les inventeurs se sont ensuite demandé si l'E 008 modulait l'ouverture sensible à la CsA du PTP opening dans les cellules endothéliales.
Il a ainsi pu être montré qu'en présence de succinate comme substrat respiratoire, les cellules HMEC-1 perméabilisée à la digitonine, absorbent et retiennent le Ca2+ jusqu'à ce que la charge de Ca2+ atteigne une valeur seuil induisant la transition de perméabilité mitochondriale, comme déterminé par une libération rapide de Ca2+ dans le milieu (Fig 14). De plus, les inventeurs on montré que (i) cet événement avait également lieu lorsque les mitochondries de ces cellules perméabilisées avaient pour source d'énergie du glutamate/malate (Fig. 17, 20), et (ii) la CsA retardait pareillement l'ouverture du PTP dans les deux conditions expérimentales (Fig. 15, 18, 20). Il est notable que bien qu'il soit légèrement moins puissant que la CsA, l'inhibiteur de l'ouverture du PTP de référence, l'E 008 augmente de manière significative la quantité de calcium nécessaire pour l'ouverture du PTP, quelle que soit la nature des substrats respiratoires (Fig. 16, 19, 20).
Par comparaison, la roténone ou la metformine n'inhibent l'ouverture du PTP qu'en présence de succinate seul, une condition dans laquelle ces composés n'affectent pas la chaine respiratoire.
Afin de mieux juger ce dernier résultat, les inventeurs ont également analysé l'effet de l'E 008 sur la modulation sensible à la CsA du PTP in situ, l'ouverture du pore induite par le tBH étant directement déterminée dans des cellules HMEC-1 en contrôlant la perméabilité mitochondriale à la calcéine et au cobalt comme décrit précédemment (Détaille et al. (2005) Diabètes 54:2179- 2187 ; El-Mir ét al. (2008) J. Mol. Neurosci. 34:77-87).
Il apparaît que 10 mM ou 100 μM d'E 008 diminuent de manière conséquente l'effet du tBH sur le quenching de fluorescence liée à la calcéine. Ainsi, après un changement de perméabilité dû à une exposition des cellules endothéliales vivantes à du tBH seul, la fluorescence intracellulaire s'est progressivement décompartimentalisée et a subi un quenching en quelques minutes, toutefois l'hétérogénéité cellulaire et l'intensité de fluorescence ont persisté jusqu'à 10 min en présence de l'E 008. A partir de ces résultats, il convient de considérer ce composé comme un nouvel inhibiteur du PTP dans la mesure où il empêche, comme la CsA et la metformine, la transition de perméabilité mitochondriale à la fois dans les cellules endothéliales perméabilisées et intactes. Impact de l'E 008 sur la respiration mitochondriale : absence d'effet sur le complexe I de la chaine respiratoire
II a pu être démontré ces dernière années que l'inhibition du complexe I de la chaine respiratoire empêchait la mort cellulaire induite par les ROS par l'intermédiaire d'un processus dépendant de l'ouverture du PTP mitochondrial (Chauvin et al, 2001 ; Guigas et al, 2004; Détaille et al, 2005).
Comme l'E 008 diminue fortement la mort cellulaire des cellules endothéliales liée à l'ouverture du PTP, les inventeurs ont ensuite déterminé si les effets préventifs de l'E 008 pouvaient trouver leur origine dans une modulation de l'activité de la chaine respiratoire.
Contrairement à la metformine, l'E 008, à 10 mM ou 100 μM, n'inhibe pas l'activité du complexe I sensible à la roténone dans les cellules endothéliales (Tableau 1 , partie A). De plus, ce composé, même à la concentration la plus élevée, n'inhibe pas de manière significative la consommation d'oxyène et le métabolisme énergétique cellulaire dans les cellules HMEC-1 intactes (Tableau 1 , partie B).
Une conséquence majeure de cette absence d'effet est qu'aucune augmentation conséquente de la production de lactate n'a été enregistrée dans ces cellules. En parallèle, aucune modification significative du contenu en nucléotides de type adénine n'a pu être mise en évidence.
Ces dernières conclusions s'opposent fortement aux résultats obtenus à partir de plusieurs études conduites à partir de différents antidiabétiques bien connus comme la metformine et les thiazolidinediones (TZD).
Au-delà de son action protectrice sur la mort cellulaire induite par le stress oxydatif, la metformine est reconnue comme inhibiteur du complexe I de la chaine respiratoire dans différents types cellulaires. Ceci peut conduire à une stimulation de la glycolyse qui est caractérisée à la fois par une augmentation de la production de lactate et un rapport ATP/ADP diminué (Tableau 1 ). Ces réponses défavorables sont vraisemblablement responsables, au moins en partie, des effets secondaires de la metformine, notamment chez les patients diabétiques présentant des prédispositions au développement de différentes complications.
Effet de l'E 008 sur la production de ROS détectée par fluoresence dans des cellules endothéliales vivantes et après perméabilisation
Devant cette absence d'effet d'E 008 sur la respiration cellulaire versus son impact sur la transition de perméabilité mitochondriale (Fig. 14-20), les inventeurs se sont intéressés à la production de ROS. En effet, ce paramètre a été récemment identifié comme étant beaucoup plus sensible à l'ouverture du PTP qu'à l'inhibition du complexe I de la chaine respiratoire (Batandier et al, 2004).
La production de ROS a été déterminée comme étant la fluorescence relative de l'Amplex Red ou de la sonde DCF, dans des cellules HMEC-1 perméabilisées ou intactes respectivement. Il convient de noter que les cellules perméabilisée ont dû être étudiées durant la respiration de stade 4, c'est à dire en présence d'oligomycine, pour détecter une production de départ d'H2O2 quels que soient les substrats respiratoires.
Comme cela est représenté dans la Fig. 21 , Tableau 2, un unique ajout des substrats du complexe I glutamate-malate à des cellules témoins HMEC-1 perméabilisées a conduit à une production conséquente de ROS, qui a été encore augmentée par la roténone et l'antimycine ajoutées séquentiellement, bien qu'à un niveau moindre. De façon inattendue, la production basale de ROS n'a pas été exacerbée lorsque ces cellules ont été alimentée en succinate uniquement, comme c'est la cas pour pour les mitochondries isolées (Batandier et al, 2006).
Toutefois, l'ajout de roténone inhibe de manière marquée la formation d'H2O2 dans cette condition particulière, mais également lorsque le succinate est présent en même temps que le glutamate/malate, ce qui reflète de manière évidente l'existence d'un flux inverse d'électrons à travers le complexe I dans les cellules endothéliales perméabilisées. De façon particulièrement remarquable, I1E 008 ne modifie pas la production de ROS en présence de glutamate/malate mais diminue significativement la production de ROS liée au flux inverse d'électrons. Au contraire, la production de ROS liée à l'antimycine n'est pas modifiée par un pré-traitement à l'E 008. Ces résultats ont également été confirmés sur des cellules HMEC-1 vivantes pour lesquelles la production de ROS endogènes a été mesurée après avoir chargé des cellules intactes avec du DCF- DA (Fig. 22).
Par ailleurs, lorsque le succinate et le glutamate/malate sont ajoutés de manière séquentielle, la production de ROS est réduite de manière marquée par l'E 008. Ce dernier effet reflète vraisemblablement une situation physiologique car il se produit en présence d'un apport d'électron au deux sites 1 et 2, comme cela est le cas dans les cellules vivantes. Les résultats montrent que l'E 008 est capable de moduler la production intracellulaire de ROS dans les cellules HMEC-1 quiescentes. Comme la production de ROS due au flux inverse d'électrons au niveau du complexe I est également régulée par l'oxydation du glutamate/malate, la propriété unique de l'E 008 d'inhiber le flux inverse d'électron sans affecter l'activité du complexe I contribue vraisemblablement à son intérêt comme nouvel agent thérapeutique.
Tableau 1 : Effet de l'E 008 sur l'activité sensible à la roténone du complexe I, sur la vitesse de consommation de l'oxygène, et sur le métabolisme énergétique dans les cellules HMEC-1. (A) Les cellules endothéliales ont été incubées pendant 4 ou 24 h en l'absence (témoins) ou en présence de l'E 008 aux concentrations indiquées. Des cellules perméabilisées ont été utilisées pour la détermination de l'activité du complexe I. Les données sont la moyenne ± ESM de quatre préparations différentes. (B) Après l'incubation des cellules HMEC-1 avec 1 OmM d'E 008, la vitesse de respiration celulaire (JO2) a été mesurée avant et après les différents ajouts représentés. Par ailleurs, la production de lactate, le rapport lactate/pyruvate, le contenu en nucléotide, et le rapport ATP/ADP ont été déterminés. Les résultats sont exprimés comme la moyenne ± ESM de cinq préparations différentes.
(A)
E 008 E 008
Témoinsl
(1OmM - 4 h) (100μM - 24 h)
Acitivité totale J NADH
1 ,43 ± 0,034 1 ,39 ± 0,049 1 ,44 ± 0,042
(nmol NADH/min/107 cellules)
Après l'ajout de roténone (10μM)
0,39 ± 0,035 0,39 ± 0,043 0,38 ± 0,049
(nmol NADH/min/107 cellules)
Activité du complexe I sensible à la
roténone 1 ,035 ± 0,027 0,99 ± 0,033 1 ,056 ± 0,022 (nmol NADH/min/107CeIIs)
(B)
JO2 Métabolisme énergétique cellulaire (Natome 0/min/mg protéine) Témoins E 008 Témoins E 008
J lactate
Sans ajout 4,95 ±0,14 4,63 ± 0, 22 (μmolNADH/30min/mg 3,65 ± 0 27 3 81 ±0,30 protéine)
Rapport
+ Oligomycine 1,62 ±0,04 1,57 ±0, 03 1,59 ±0 11 1 65 ±0,13
Lactate/Pyruvate
Contenu en ATP
+ DNP 9,1 ±0,76 9,18±0, 41 83,9 ± 4 37 81,6 ±1,7
(nmol/mg prot)
Cotenu en ADP 17,28 i 17 38 ±
+ myxothiazol 0,92 ±0,13 0,92 ±0, 13
(nmol/mg prot) 3,07 1 ,38
+ TMPD-a 18,97 ±1,43 19,20± 1 ,11 Rapport ATP/AD P 5,09 ±0 70 4 ,8: tθ,25
Tableau 2 : Production Cl1H2O2 dans des cellules HMEC-1 perméabilisées et incubées pendant 4 h sans (témoins) ou avec 10 mM d'E 008 en présence de glutamate/malate, succinate, ou les deux, avec l'ajout séquentiel des inhibiteurs roténone et antimycine A. Les résultats sont exprimés corne la moyenne de cinq expérience distinctes. Le symbole étoile (*) représente p < 0,01 par rapport aux cellules témoins alimentées par du succinate seul ou en association avec du glutamate/malate.
Figure imgf000029_0001

Claims

Revendications 1. Composé de formule générale (I) suivante :
Figure imgf000030_0001
dans laquelle :
• R1 , R2, R3, et R4 sont choisis indépendamment parmi les groupes :
- H,
- alkyle (C1 -C20) substitué ou non par halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -
C5), cycloalkyle (C3-C8), alkènyle (C2-C20) substitué ou non par halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkyne (C2-C20) substitué ou non par halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5),
- cycloalkyle (C3-C8) substitué ou non par alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), - hétérocycloalkyle (C3-C8) portant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et substitué ou non par alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5),
- aryl (C6-C14) alkyle (C1 -C20) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
- aryl (C6-C14) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
- hétéroaryle (C1 -C13) portant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi
N, O, S et substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6- C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, R1 et R2, d'une part, et R3 et R4, d'autre part, pouvant former avec l'atome d'azote un cycle à n chaînons (n compris entre 3 et 8) comprenant ou non un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et pouvant être substitué par un ou plusieurs groupements suivants : amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6- C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
• R5 et R6 sont choisis indépendamment parmi les groupes :
-H,
-alkyle (C1 -C20) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle
(C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
-alkényle (C2-C20) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6- C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
-alkynyle (C2-C20) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6- C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
-cycloalkyle (C3-C8) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6- C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
-hétérocycloalkyle (C3-C8) portant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -
C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl
(C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
-aryl (C6-C14) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
-hétéroaryle (C1 -C13) portant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N,
O, S et substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-
C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
- aryl (C6-C14) alkyle (C1 -C5) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
R5 et R6 pouvant former avec l'atome de carbone sur lequel ils sont fixés un cycle à m chaînons (m compris entre 3 et 8) comprenant ou non un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et pouvant être substitué par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 - C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
ou pouvant former avec l'atome de carbone un reste polycyclique en C10-
C30 substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
R5 et R6 pouvant également représenter ensemble le groupement =0 ou =S, l'atome d'azote d'un groupe hétérocycloalkyle ou hétéroaryle pouvant être substitué par un groupe alkyle (C1 -C5), cycloalkyle (C3-C8), aryl(C6-C14), aryl(C6-C14)alkyle(C1 -C5) ou acyle(C1 -C6),
ainsi que les formes tautomères, énantiomères, diastéréoisomères et épimères et les sels pharmaceutiquement acceptables de celui-ci,
pour son utilisation dans la prévention ou le traitement du stress oxydatif ou des maladies associées au stress oxydatif.
2. Composé de formule générale (I) selon la revendication 1 , dans laquelle R5 est l'hydrogène.
3. Composé de formule générale (I) selon la revendication 1 , dans laquelle R5 et R6 :
- forment avec l'atome de carbone sur lequel ils sont fixés un cycle à m chaînons (m compris entre 3 et 8), comprenant ou non un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et pouvant être substitué par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle,
- ou forment avec l'atome de carbone un reste polycyclique en C10-C30 substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy
(C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6- C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle.
4. Composé de formule générale (I) selon la revendication 1 , dans laquelle R5 est un groupe alkyle (C1 -C20) substitué par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle.
5. Composé de formule générale (I) selon la revendication 1 , dans laquelle R5 et R6 sont choisis parmi des groupes alkyles (C1 -C20) substitués ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1 -C5), alkoxy (C1 -C5), alkylthio (C1 -C5), alkylamino (C1 -C5), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1 -C5), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle.
6. Composé selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle R6 est un groupe alkyle (C1 -C20).
7. Composé de formule générale (I) selon la revendication 6, dans laquelle R6 est un groupe méthyle.
8. Composé de formule générale (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle R1 et/ou R2 représente(nt) un groupe alkyle (C1 -C20).
9. Composé de formule générale (I) selon la revendication 8, dans laquelle R1 et R2 représentent un groupe méthyle.
10. Composé de formule générale (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle R3 et/ou R4 représente(nt) un atome d'hydrogène.
11. Composé de formule générale (I) selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le composé de formule générale (I) est le composé de formule (la):
Figure imgf000034_0001
ou une de ses formes tautomères, énantiomères, diastéréoisomères et épimères et/ou sels pharmaceutiquement acceptables.
12. Composé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le composé est la (+) 5,6-dihydro-4-diméthylamino-2-imino-6-méthyl-1 ,3,5-triazine ou son chlorhydrate.
13. Composé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le composé est la (-) 5,6-dihydro-4-diméthylamino-2-imino-6-méthyl-1 ,3,5-triazine ou son chlorhydrate.
14. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le composé est sous forme de chlorhydrate.
15. Composé de formule générale (I) selon l'une des revendications 1 à 14, dans lequel les maladies associées au stress oxydatif sont sélectionnées dans le groupe constitué de l'athérosclérose, des maladies cardiovasculaires, des neuropathies diabétiques, des maladies neurodégénératives, telles que la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson, de la maladie chronique du poumon (« Chronic Lung disease ») et des cancers.
16. Composé de formule générale (I) selon l'une des revendications 1 à 14, pour la prévention ou l'inhibition de l'apoptose liée au stress oxydatif.
17. Composé de formule générale (I) selon l'une des revendications 1 à 16, dans lequel le stress oxydatif est lié à un trouble hyperglycémique.
18. Composé de formule générale (I) selon l'une des revendications 1 à 17, pour la prévention ou le traitement des maladies microvasculaires ou des neuropathies liées à un diabète de type II.
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013072239A1 (fr) 2011-11-15 2013-05-23 Nestec S.A. Support de code de lisible optiquement et capsule pour préparer une boisson ayant un tel support de code produisant un signal optique lisible amélioré
WO2013072297A1 (fr) 2011-11-15 2013-05-23 Nestec S.A. Support et capsule permettant de préparer une boisson par centrifugation, système et procédé de préparation d'une boisson par centrifugation
WO2013072351A1 (fr) 2011-11-16 2013-05-23 Nestec S.A. Support et capsule pour préparation d'une boisson par centrifugation, et système et procédé de préparation d'une boisson par centrifugation
EP2853182A1 (fr) 2013-09-30 2015-04-01 Nestec S.A. Support de code et capsule pour préparer une boisson par centrifugation, système et procédé pour préparer une boisson par centrifugation
CN104739838A (zh) * 2014-09-30 2015-07-01 三峡大学 小分子抑制剂及在抑制鸟氨酸脱羧酶(odc)上的应用
WO2019008239A1 (fr) * 2017-07-05 2019-01-10 Eric Janin Iméglimine pour la prévention et/ou le traitement du carcinome hépatocellulaire

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001055122A1 (fr) * 2000-01-26 2001-08-02 Lipha Derives amines de dihydro-1,3,5-triazine et leurs applications en therapeutique
WO2004087153A2 (fr) * 2003-03-28 2004-10-14 Chiron Corporation Utilisation de petites molecules de composes pour une immunopotentialisation
FR2853650A1 (fr) * 2003-04-10 2004-10-15 Merck Sante Sas Procede de dedoublement d'amines utiles pour le traitement de desordres associes au syndrome d'insulino-resistance
EP1749552A1 (fr) * 2005-07-29 2007-02-07 Neuropharma S.A. Utilisation de la collismycine et de ses dérivés en tant qu'inhibiteurs du stress oxydatif
FR2896159A1 (fr) * 2006-01-13 2007-07-20 Merck Sante Soc Par Actions Si Combinaison de derives de triazine et d'agents sensibilisateurs a l'insuline.
WO2008024893A2 (fr) * 2006-08-23 2008-02-28 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Procédé de traitement ou de prévention d'une maladie associée au stress oxydatif
WO2010066901A2 (fr) * 2008-12-12 2010-06-17 Poxel Composés de tétrahydrotriazine pour le traitement de maladies associées à une activité ampk

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001055122A1 (fr) * 2000-01-26 2001-08-02 Lipha Derives amines de dihydro-1,3,5-triazine et leurs applications en therapeutique
EP1250328A1 (fr) 2000-01-26 2002-10-23 Lipha Derives amines de dihydro-1,3,5-triazine et leurs applications en therapeutique
WO2004087153A2 (fr) * 2003-03-28 2004-10-14 Chiron Corporation Utilisation de petites molecules de composes pour une immunopotentialisation
FR2853650A1 (fr) * 2003-04-10 2004-10-15 Merck Sante Sas Procede de dedoublement d'amines utiles pour le traitement de desordres associes au syndrome d'insulino-resistance
EP1749552A1 (fr) * 2005-07-29 2007-02-07 Neuropharma S.A. Utilisation de la collismycine et de ses dérivés en tant qu'inhibiteurs du stress oxydatif
FR2896159A1 (fr) * 2006-01-13 2007-07-20 Merck Sante Soc Par Actions Si Combinaison de derives de triazine et d'agents sensibilisateurs a l'insuline.
WO2008024893A2 (fr) * 2006-08-23 2008-02-28 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Procédé de traitement ou de prévention d'une maladie associée au stress oxydatif
WO2010066901A2 (fr) * 2008-12-12 2010-06-17 Poxel Composés de tétrahydrotriazine pour le traitement de maladies associées à une activité ampk

Non-Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDREW J.M. BOULTON, DIABETES CARE, vol. 27, 2004, pages 1458
BERNADI P., BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1275, 1996, pages 5
CARDOSO SUSANA, DANS RADICAL BIOLOGY & MEDECINE, vol. 45, 2008, pages 1395
DATABASE CA [online] CHEMICAL ABSTRACTS SERVICE, COLUMBUS, OHIO, US; 1 January 1993 (1993-01-01), ZHAO, WEIZHANG ET AL: "Antitumor activity of pyrido[2,3-d]pyrimidine antifolates", XP002563103, retrieved from STN Database accession no. 1993:594900 *
DETAILLE ET AL., DIABETES, vol. 54, 2005, pages 2179 - 2187
EL-MIR ET AL., J. MOL. NEUROSCI., vol. 34, 2008, pages 77 - 87
GAJEWSKI FELIKS ET AL: "Derivatives of diamino-1,3,5- triazine . VI. Synthesis and hypoglycemic properties of some 6-amino-2-aryl-1,2-dihydro-4-(3,5,5- trimethyl-2-pyrazolino)-1,3,5- triazines", HCAPLUS, 1 January 1984 (1984-01-01), XP002426492 *
GERRITSEN J, DIABETOLOGIA, vol. 43, 2000, pages 561
LIU YAJUN, SHANDONG DAXUE XUEBAO, YIXUEBAN, vol. 45, 2007, pages 336
MATTSON; KROEMER, TRENDS IN MOLECULAR MEDICINE, vol. 9, 2003, pages 196 - 205
MESTIVIER D, AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY, vol. 272, 1997
OWEN ET AL., BIOCHEM. J., vol. 348, 2000, pages 607 - 614
S.M. BERGE ET AL., PHARMACEUTICAL SALTS J. PHARM. SCI, vol. 66, 1977, pages 1 - 19
SHAHZIDI, TOXICOLOGY AND ONCOLOGY, vol. 25, 2006, pages 159
YAZDANPARAST R ET AL: "Protective effect of a triazine-derivative (AA3E2) on beta-amyloid-induced damages in SK-N-MC cells", TOXICOLOGY IN VITRO, ELSEVIER SCIENCE, GB, vol. 23, no. 7, 1 October 2009 (2009-10-01), pages 1277 - 1283, XP026654237, ISSN: 0887-2333, [retrieved on 20090722] *
ZIEGLER DAN, DIABETES CARE, vol. 30, 2007, pages 664

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013072239A1 (fr) 2011-11-15 2013-05-23 Nestec S.A. Support de code de lisible optiquement et capsule pour préparer une boisson ayant un tel support de code produisant un signal optique lisible amélioré
WO2013072297A1 (fr) 2011-11-15 2013-05-23 Nestec S.A. Support et capsule permettant de préparer une boisson par centrifugation, système et procédé de préparation d'une boisson par centrifugation
WO2013072326A1 (fr) 2011-11-15 2013-05-23 Nestec S.A. Support de code lisible de manière optique et capsule pour préparer une boisson ayant un tel support de code fournissant un signal optique lisible, amélioré
WO2013072351A1 (fr) 2011-11-16 2013-05-23 Nestec S.A. Support et capsule pour préparation d'une boisson par centrifugation, et système et procédé de préparation d'une boisson par centrifugation
EP2853182A1 (fr) 2013-09-30 2015-04-01 Nestec S.A. Support de code et capsule pour préparer une boisson par centrifugation, système et procédé pour préparer une boisson par centrifugation
WO2015044400A1 (fr) 2013-09-30 2015-04-02 Nestec S.A. Support de code et capsule permettant de préparer une boisson par centrifugation, système et procédé de préparation d'une boisson par centrifugation
CN104739838A (zh) * 2014-09-30 2015-07-01 三峡大学 小分子抑制剂及在抑制鸟氨酸脱羧酶(odc)上的应用
CN104739838B (zh) * 2014-09-30 2017-07-14 三峡大学 小分子抑制剂及在抑制鸟氨酸脱羧酶(odc)上的应用
WO2019008239A1 (fr) * 2017-07-05 2019-01-10 Eric Janin Iméglimine pour la prévention et/ou le traitement du carcinome hépatocellulaire
FR3068601A1 (fr) * 2017-07-05 2019-01-11 Eric Joseph Marie Fulgence Janin Utilisation de l'imeglimine pour la prevention et/ou ke traitement du carcinome hepatocellulaire
CN110891574A (zh) * 2017-07-05 2020-03-17 埃里克·雅宁 用于预防和/或治疗肝细胞癌的美格列明
US11324752B2 (en) 2017-07-05 2022-05-10 Ericare Imeglimin for preventing and/or treating hepatocellular carcinoma
CN110891574B (zh) * 2017-07-05 2023-03-21 埃里克尔公司 用于预防和/或治疗肝细胞癌的美格列明

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